JPH0227989A - ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの生産方法 - Google Patents
ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの生産方法Info
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- JPH0227989A JPH0227989A JP17775488A JP17775488A JPH0227989A JP H0227989 A JPH0227989 A JP H0227989A JP 17775488 A JP17775488 A JP 17775488A JP 17775488 A JP17775488 A JP 17775488A JP H0227989 A JPH0227989 A JP H0227989A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は下記の塩基配列のＤＮＡ断片
５°端ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴ棋３°
端（上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開
始コドンを、ＧＡＴＧＧＡＧＧはリポソーム結合部位を
表す、） を５゛端に有する、第１図記載の塩基配列のヒトリゾチ
ーム遺伝子を含み、微生物内で発現可能な発現プラスミ
ド、該プラスミドを保持しヒトリゾチームを生産する微
生物、および該微生物を培養することを特徴とするヒト
リゾチームの製造方法に関する。
端（上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開
始コドンを、ＧＡＴＧＧＡＧＧはリポソーム結合部位を
表す、） を５゛端に有する、第１図記載の塩基配列のヒトリゾチ
ーム遺伝子を含み、微生物内で発現可能な発現プラスミ
ド、該プラスミドを保持しヒトリゾチームを生産する微
生物、および該微生物を培養することを特徴とするヒト
リゾチームの製造方法に関する。
〈従来技術〉
ヒトリゾチームは、ヒトの涙、唾液、鼻粘膜。
乳すンパ腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、
Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸量
のβ−１，４結合を加水分解するムラミダーゼとしての
酵素活性を有していることが知られている。ヒト乳由来
のりゾチームは１３０個のアミノ酸からなり、そのアミ
ノ酸配列は既に知られている（船津ら「溶菌酵素」５５
〜５８頁 講談社サイエンティク（１９７７）） ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非アレル
ギー性の抗炎産薬として利用することができる。ヒトリ
ゾチームはヒトの乳、尿等から単離することができるが
、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすには効
率が悪く実用的ではない。
Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸量
のβ−１，４結合を加水分解するムラミダーゼとしての
酵素活性を有していることが知られている。ヒト乳由来
のりゾチームは１３０個のアミノ酸からなり、そのアミ
ノ酸配列は既に知られている（船津ら「溶菌酵素」５５
〜５８頁 講談社サイエンティク（１９７７）） ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有し、食
品等の防腐剤あるいは医薬品としては抗菌剤、非アレル
ギー性の抗炎産薬として利用することができる。ヒトリ
ゾチームはヒトの乳、尿等から単離することができるが
、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすには効
率が悪く実用的ではない。
一方、微生物内で遺伝子を増巾させ、遺伝子由来の産物
を大量に生産させる、いわゆる遺伝子組換え技術は、ヒ
トホルモンやヒト由来の酵素の生産にきわめて有用であ
る。遺伝子産物の生産性を高めるためには、■遺伝子の
コピー数の増大、■５ＲＮＡの安定性の増大、０ｍＲＮ
Ａからの蛋白合成活性（翻訳活性）の増大が有効である
ことが知られている。翻訳活性の増大において、構造遺
伝子のＤＮＡ塩基配列とりボゾーム結合部位近傍のＤＮ
Ａ配列が特に重要であることが知られている。ヒトリゾ
チームに関して、組換えＤＮＡ技術による生産について
既に報告されている（特開昭６１−７８３８３、特開昭
６３−５２８７６ ）が、より生産性の高い発現プラス
ミドの構築、生産微生物の創製、製造方法の開発が望ま
れている。
を大量に生産させる、いわゆる遺伝子組換え技術は、ヒ
トホルモンやヒト由来の酵素の生産にきわめて有用であ
る。遺伝子産物の生産性を高めるためには、■遺伝子の
コピー数の増大、■５ＲＮＡの安定性の増大、０ｍＲＮ
Ａからの蛋白合成活性（翻訳活性）の増大が有効である
ことが知られている。翻訳活性の増大において、構造遺
伝子のＤＮＡ塩基配列とりボゾーム結合部位近傍のＤＮ
Ａ配列が特に重要であることが知られている。ヒトリゾ
チームに関して、組換えＤＮＡ技術による生産について
既に報告されている（特開昭６１−７８３８３、特開昭
６３−５２８７６ ）が、より生産性の高い発現プラス
ミドの構築、生産微生物の創製、製造方法の開発が望ま
れている。
く課題解決の手段〉
本発明者らはヒトリゾチームの生産を高めるために、ヒ
トリゾチーム遺伝子の塩基配列のコドン選択と、ヒトリ
ゾチーム遺伝子上流のりボゾーム結合部位配列について
種々研究を行つた。その結果、発現プラスミドが、第１
図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子を含み、しか
もその５”端に下記の塩基配列のりボゾーム結合部位〜
ヒトリゾチームの翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片
５′端ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡτ＾ＴＧ
３°端を保持する時、該発現プラスミドで形質転換され
た微生物が効率良くヒトリゾチームを生産することを見
い出した。
トリゾチーム遺伝子の塩基配列のコドン選択と、ヒトリ
ゾチーム遺伝子上流のりボゾーム結合部位配列について
種々研究を行つた。その結果、発現プラスミドが、第１
図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子を含み、しか
もその５”端に下記の塩基配列のりボゾーム結合部位〜
ヒトリゾチームの翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片
５′端ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡτ＾ＴＧ
３°端を保持する時、該発現プラスミドで形質転換され
た微生物が効率良くヒトリゾチームを生産することを見
い出した。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
１、ヒトリゾチーム遺伝子の作成
本発明のりボゾーム結合部位〜ヒトリゾチームの翻訳開
始部位をコードするＤＮＡフラグメントは第１図の配列
を有する。
始部位をコードするＤＮＡフラグメントは第１図の配列
を有する。
その様な配列を存する２本鎖ＤＮＡは、例えば、該２本
鎖をいくつかのフラグメントに分け、それらを化学的に
合成し、連結することにより、合成できる。この時、各
フラグメントをいくつかのブロックに分け、各ブロック
形成後、それらを連結することにより、より容易に合成
できる。各フラグメントは、１９〜３１塩基からなり、
各フラグメントの塩基配列は、少くともＩＯ塩基づつが
重複することが好ましい。
鎖をいくつかのフラグメントに分け、それらを化学的に
合成し、連結することにより、合成できる。この時、各
フラグメントをいくつかのブロックに分け、各ブロック
形成後、それらを連結することにより、より容易に合成
できる。各フラグメントは、１９〜３１塩基からなり、
各フラグメントの塩基配列は、少くともＩＯ塩基づつが
重複することが好ましい。
このようなフラグメントの具体例は第２図に記載のＵ１
〜Ｕ１６、ＬＬ−Ｌ１６フラグメントである。フラグメ
ントの合成は、例えば、面相法ホスホアミダイド法を利
用したＭｏｄｅｌ ３８０ ＤＮＡシンセサイザー（ア
プライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社製〕等により容易に行える０合成した
フラグメントを例えば、（Ｕｌ〜Ｕ４、Ｌｌ−Ｌ４）、
（Ｕ４〜Ｕ８、Ｌ４〜Ｌ８）、（Ｕ８〜Ｕ１２、Ｌ８〜
Ｌ１２）、（Ｕ１２〜Ｕ１６、Ｌ１２〜Ｌ１６）の４ブ
ロツクに分ける。Ｕ２〜Ｕ４およびＬ１〜Ｌ３の５°末
端をリン酸化し、未処理のＵ１断片、Ｌ４断片とを反応
させ、反応により生じたＵｌ〜Ｕ４およびＬｌ〜Ｌ４の
結合物を抽出、精製し、該ＤＮＡ断片結合物を回収する
。同様にして各プロνりを合成し、連結する。
〜Ｕ１６、ＬＬ−Ｌ１６フラグメントである。フラグメ
ントの合成は、例えば、面相法ホスホアミダイド法を利
用したＭｏｄｅｌ ３８０ ＤＮＡシンセサイザー（ア
プライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社製〕等により容易に行える０合成した
フラグメントを例えば、（Ｕｌ〜Ｕ４、Ｌｌ−Ｌ４）、
（Ｕ４〜Ｕ８、Ｌ４〜Ｌ８）、（Ｕ８〜Ｕ１２、Ｌ８〜
Ｌ１２）、（Ｕ１２〜Ｕ１６、Ｌ１２〜Ｌ１６）の４ブ
ロツクに分ける。Ｕ２〜Ｕ４およびＬ１〜Ｌ３の５°末
端をリン酸化し、未処理のＵ１断片、Ｌ４断片とを反応
させ、反応により生じたＵｌ〜Ｕ４およびＬｌ〜Ｌ４の
結合物を抽出、精製し、該ＤＮＡ断片結合物を回収する
。同様にして各プロνりを合成し、連結する。
フラグメントの合成、精製、５“−水酸基のリン酸化及
びフラグメントの連結はそれ自体公知の方法（例えば特
開昭６３−２２１９０）に従って行う事ができる。
びフラグメントの連結はそれ自体公知の方法（例えば特
開昭６３−２２１９０）に従って行う事ができる。
２、リボゾーム結合部位〜ヒトリゾチームの翻訳開始部
位を有するＤＮＡ断片の作成 本発明のりボゾーム結合部位〜ヒトリゾチームの翻訳開
始部位をコードするＤＮＡフラグメントは下記の配列で
示される。
位を有するＤＮＡ断片の作成 本発明のりボゾーム結合部位〜ヒトリゾチームの翻訳開
始部位をコードするＤＮＡフラグメントは下記の配列で
示される。
５゛端ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴυ」−
３゛端（上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻
訳開始コドンを、ＧＡＴＧＧＡＧＧはリポソーム結合部
位を表す、 ＡＴＧより下流はヒトリゾチームをコード
するＤＮＡ配列の一部を表す、） 該リボゾーム結合部位〜ヒトリゾチームの翻訳開始部位
をコードするＤＮＡフラグメントは、その上流にバチラ
ス チェリンゲンシス アイザワイＩＰＬ株の上流の塩
基配列（Ｏｅｄａら Ｇｅｎｅ ５３ １１３−１１
９ （１９８７））を有することが好ましい、そのよう
なりＮＡ断片の具体例を下記に示す。
３゛端（上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻
訳開始コドンを、ＧＡＴＧＧＡＧＧはリポソーム結合部
位を表す、 ＡＴＧより下流はヒトリゾチームをコード
するＤＮＡ配列の一部を表す、） 該リボゾーム結合部位〜ヒトリゾチームの翻訳開始部位
をコードするＤＮＡフラグメントは、その上流にバチラ
ス チェリンゲンシス アイザワイＩＰＬ株の上流の塩
基配列（Ｏｅｄａら Ｇｅｎｅ ５３ １１３−１１
９ （１９８７））を有することが好ましい、そのよう
なりＮＡ断片の具体例を下記に示す。
ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ ＡＧＴＣＡＡＡＴＴＧ Ｔ
ＡＧＴＡ＾丁ＧＡＡ ＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＴ
ＣＡＴ＾＾ＴＧ＾＾ＴＴＧＧＴＡＴ ＣＴＴＡＡＴ＾＾
ＡＡ ＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡ Ｔ
ＡＴＧＡＡＡＧＴＴ ＴＴ上記の２本ｇＤＮＡは、例え
ば下記に示した２１〜３１塩基からなるフラグメント（
ＨＬＹ−３７〜４１、Ｓ−５，Ｄ−５） を化学的に
合成し、各々のフラグメントを連結して得られる。
ＡＧＴＡ＾丁ＧＡＡ ＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＴ
ＣＡＴ＾＾ＴＧ＾＾ＴＴＧＧＴＡＴ ＣＴＴＡＡＴ＾＾
ＡＡ ＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡ Ｔ
ＡＴＧＡＡＡＧＴＴ ＴＴ上記の２本ｇＤＮＡは、例え
ば下記に示した２１〜３１塩基からなるフラグメント（
ＨＬＹ−３７〜４１、Ｓ−５，Ｄ−５） を化学的に
合成し、各々のフラグメントを連結して得られる。
フラグメントの合成、精製、５°−水酸基のリン酸化及
びフラグメントの連結は上記ｌと同様に行う事ができる
。
びフラグメントの連結は上記ｌと同様に行う事ができる
。
＋１ＬＹ−３７ＧＡ丁ＣＣＴＣ丁ＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴ
ＴＧＴ）ＩＬＹ−３８ＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴ
ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＨＬＹ−３９＾ＧＴ＾＾ＴＧＡ
ＡＡ＾＾ＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＴ＋１ＬＹ−４０
ＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＩＩＴＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴ
ＴＨＬＹ−４１＾ＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴ＾＾
ＴＡＡＡＡＧ＋１ＬＹ−４２ＣＴＣＣＡＴＣＴ（：ＴＴ
ＴＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＣＣ５−５ＡＧＡＴＧＧＡＧＧ
ＴＡＡＣＴＴ＾＾＾＾ＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴｔＴＤ−５
ＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＴＴＡＣ
３、ヒトリゾチーム遺伝子の調製 上記２のようにして作成した本発明のリボゾーム結合部
位〜ヒトリゾチームの翻訳開始部位をコードするＤＮＡ
フラグメントを上記ｌのようにして作成したヒトリゾチ
ーム遺伝子と結合する。このようなりＮＡ断片の作成の
具体的な例を以下に挙げる。上記２のようにして作成し
たヒトリゾチーム遺伝子を含む断片をｐＵｃＩ８に挿入
したｐＬＹ−６１を作成する。続いてこのｐＬＹ−６１
を制限酵素Ｔａｑｌで消化し、得られたヒトリゾチーム
遺伝子を含む断片を常法により単離し、上記の合成りＮ
ＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し５ａｕ３
Ａ＋で消化したフラグメントを発現プラスミドｐＭＹ１
２−６Ａｍｐ−１に挿入した。ｐＬＹ−８５を５ａｕ３
Ａｒで切断することにより調製することができる。（第
３図）４、 組換えプラスミドの作成 前記３の様にして作成したヒトリゾチーム遺伝子を宿主
内で増殖可能なプラスミドベクター又は宿主内で増殖、
発現が可能な樟に構成されたプラスミドベクターの適当
な挿入部位に組込む。
ＴＧＴ）ＩＬＹ−３８ＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＡＴＴ
ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＨＬＹ−３９＾ＧＴ＾＾ＴＧＡ
ＡＡ＾＾ＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＴ＋１ＬＹ−４０
ＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＩＩＴＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴ
ＴＨＬＹ−４１＾ＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴ＾＾
ＴＡＡＡＡＧ＋１ＬＹ−４２ＣＴＣＣＡＴＣＴ（：ＴＴ
ＴＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＣＣ５−５ＡＧＡＴＧＧＡＧＧ
ＴＡＡＣＴＴ＾＾＾＾ＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴｔＴＤ−５
ＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＴＴＡＣ
３、ヒトリゾチーム遺伝子の調製 上記２のようにして作成した本発明のリボゾーム結合部
位〜ヒトリゾチームの翻訳開始部位をコードするＤＮＡ
フラグメントを上記ｌのようにして作成したヒトリゾチ
ーム遺伝子と結合する。このようなりＮＡ断片の作成の
具体的な例を以下に挙げる。上記２のようにして作成し
たヒトリゾチーム遺伝子を含む断片をｐＵｃＩ８に挿入
したｐＬＹ−６１を作成する。続いてこのｐＬＹ−６１
を制限酵素Ｔａｑｌで消化し、得られたヒトリゾチーム
遺伝子を含む断片を常法により単離し、上記の合成りＮ
ＡフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し５ａｕ３
Ａ＋で消化したフラグメントを発現プラスミドｐＭＹ１
２−６Ａｍｐ−１に挿入した。ｐＬＹ−８５を５ａｕ３
Ａｒで切断することにより調製することができる。（第
３図）４、 組換えプラスミドの作成 前記３の様にして作成したヒトリゾチーム遺伝子を宿主
内で増殖可能なプラスミドベクター又は宿主内で増殖、
発現が可能な樟に構成されたプラスミドベクターの適当
な挿入部位に組込む。
組込み操作そのものは分子生物学の分野で公知の常法に
従って行うことができる。
従って行うことができる。
本発明によるヒトリゾチーム遺伝子の増殖はｐＢＲ３２
２，ｐＵｃ１８ （例えばＪ、 ｎｅｓｓ’ｒ、ｎｇら
、Ｇｏｎｅ」ＬｉＯ２（１９８５）参照）等の公知の種
々のプラスミドベクターを用いて行うことができる。ま
たプラスミドＤＮＡの単離精製も分子生物学の分野で公
知の常法に従って行う事ができる。
２，ｐＵｃ１８ （例えばＪ、 ｎｅｓｓ’ｒ、ｎｇら
、Ｇｏｎｅ」ＬｉＯ２（１９８５）参照）等の公知の種
々のプラスミドベクターを用いて行うことができる。ま
たプラスミドＤＮＡの単離精製も分子生物学の分野で公
知の常法に従って行う事ができる。
本発明の遺伝子によるヒトリゾチームの直接発現は宿主
細胞によって適宜の方法をとり得るが大腸菌に於いては
ｌａｃプロモーター（例えばＦｕｌｌｅｒ。
細胞によって適宜の方法をとり得るが大腸菌に於いては
ｌａｃプロモーター（例えばＦｕｌｌｅｒ。
Ｇｅｎｅ、 １９．４３〜５４ （１９８２）参照）、
ｔｒｐプロモーター（例えばＷｉｎｄａａｓ ら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋刊、 ６６８９〜
６６５７（１９８２）参照）、ｔａｃプロモーター（例
えばＢｏｙｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃｉ。
ｔｒｐプロモーター（例えばＷｉｎｄａａｓ ら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋刊、 ６６８９〜
６６５７（１９８２）参照）、ｔａｃプロモーター（例
えばＢｏｙｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 ８０．２１〜２５（１９８３）参照）、ＰＩ
Ｉプロモーター（例えばｄｅＨａｓｅｔｈら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋旦７７３〜７８７ （
１９８３）参照） 、ＰＬプロモーター（例えばＤｅｒ
ｏ−ら、Ｇｏｎｅ、 １７．４５〜５４（１９８２）参
照）及びＩｐｐプロモーター（例えばＮａｋａｓｕｒａ
ら、ＥガＢＯＪ、 １．７７１〜７７５（１９８２）参
照）等を有する公知の種々の発現ベクター（例えば中村
、化学と生物３ｊＱ、 ４７〜５８（１９８２）及びＭ
ａｎｉａｔｉｓらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｇ ４
０３〜４３３（１９８２）参照）を用いて行うことがで
きる。 これらの発現ベクターのうちの一具体例はｐＭ
Ｙ１２−６Ａｍｐ−１である（例えば特開昭６３−２２
１９０） 、また発現組換えプラスミドのうち好ましい
具体例は本発明の目的にかなうように作成されたｐＬＹ
−８５である。ｐＬＹ−８５はｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−
１のＢａｍＨＩ切断部位に３で調製した５ａｕ３ＡＩ断
片（約０．５ｋｂｐ）を挿入することにより造成できる
。
Ｉプロモーター（例えばｄｅＨａｓｅｔｈら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋旦７７３〜７８７ （
１９８３）参照） 、ＰＬプロモーター（例えばＤｅｒ
ｏ−ら、Ｇｏｎｅ、 １７．４５〜５４（１９８２）参
照）及びＩｐｐプロモーター（例えばＮａｋａｓｕｒａ
ら、ＥガＢＯＪ、 １．７７１〜７７５（１９８２）参
照）等を有する公知の種々の発現ベクター（例えば中村
、化学と生物３ｊＱ、 ４７〜５８（１９８２）及びＭ
ａｎｉａｔｉｓらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｇ ４
０３〜４３３（１９８２）参照）を用いて行うことがで
きる。 これらの発現ベクターのうちの一具体例はｐＭ
Ｙ１２−６Ａｍｐ−１である（例えば特開昭６３−２２
１９０） 、また発現組換えプラスミドのうち好ましい
具体例は本発明の目的にかなうように作成されたｐＬＹ
−８５である。ｐＬＹ−８５はｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−
１のＢａｍＨＩ切断部位に３で調製した５ａｕ３ＡＩ断
片（約０．５ｋｂｐ）を挿入することにより造成できる
。
５、形質転換
（１）宿主菌
本発明のヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ発現組換えプ
ラスミドを宿主細胞へ導入することにより菌体内でヒト
リゾチームを生産する微生物を得ることができる。宿主
細胞の大腸菌の具体例はＥ。
ラスミドを宿主細胞へ導入することにより菌体内でヒト
リゾチームを生産する微生物を得ることができる。宿主
細胞の大腸菌の具体例はＥ。
ｃｏｌｉ２９４ （例えばＢａｃｈｍａｎｎ Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。
ｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡＪ３．４１７４〜４１７
８（１９７６）参照）である、ヒトリゾチーム遺伝子を
組込んだ組換えプラスミドによる形質転換は上記の宿主
に限定されるものではなく、公知の種々のＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２株誘導体（例比誘導体ｃｈｍａｎｎ、 Ｒａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 Ｒｅｖ。
８（１９７６）参照）である、ヒトリゾチーム遺伝子を
組込んだ組換えプラスミドによる形質転換は上記の宿主
に限定されるものではなく、公知の種々のＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ１２株誘導体（例比誘導体ｃｈｍａｎｎ、 Ｒａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 Ｒｅｖ。
皿、５２５〜５５７（１９７２）参照）を使用すること
ができる。これらのＥ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２株誘導体
の多くのものは公認の微生物機関、例えばＡｓ＋ｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ（＾ＴＣＣ）、に寄託されており、そこから分譲が可
能である（例えば＾ＴＣＣカタログ参照）。
ができる。これらのＥ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２株誘導体
の多くのものは公認の微生物機関、例えばＡｓ＋ｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ（＾ＴＣＣ）、に寄託されており、そこから分譲が可
能である（例えば＾ＴＣＣカタログ参照）。
また分子生物学の分野で公知の如く、適当なベクターを
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。
選べばより広範囲の細菌種より適当な宿主を選択する事
も可能である。
（２）形質転換
形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行う事ができる（例えばＣｏｈｅｎ らＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
、影１．２１１０〜２１１４（１９７２）及びＭａｎｉ
ａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
法に従って行う事ができる（例えばＣｏｈｅｎ らＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
、影１．２１１０〜２１１４（１９７２）及びＭａｎｉ
ａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
２４９〜２５３（１９８２） ”） 。
（３）形質転換体
形質転換の一興体例は、Ｅ、ｃｏｌｉ ２９４をｐＬ
Ｙ−８５で形質転換させて得た形質転換体である。これ
をＥ、ｃｏ Ｉ ｉ ２９４ （ｐＬＹ−８５）と命
名し、工業技術院微生物技術研究所に微工研菌寄第１０
１１７号として寄託した。
Ｙ−８５で形質転換させて得た形質転換体である。これ
をＥ、ｃｏ Ｉ ｉ ２９４ （ｐＬＹ−８５）と命
名し、工業技術院微生物技術研究所に微工研菌寄第１０
１１７号として寄託した。
６、 ヒトリゾチームの生産、単離および定量この樺に
して得た形質転換体を、分子生物学および醗酵中の分野
で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチームが生
産される。この場合培養を適当な誘導条件で行えばヒト
リゾチーム生産を有利に行なうことができる。
して得た形質転換体を、分子生物学および醗酵中の分野
で公知の方法に従って培養すれば、ヒトリゾチームが生
産される。この場合培養を適当な誘導条件で行えばヒト
リゾチーム生産を有利に行なうことができる。
培養後のヒトリゾチームの単離は例えば大腸菌の場合、
菌体を超音波などの方法で破砕し、遠心分離することに
よりヒトリゾチームからなる凝集体を濃縮・回収して行
なう、この凝集体を可溶化還元後、適当な酸化還元系（
例えばタルタチオンまたはミスライン）の酸化型及び還
元型の混合物により再生し、活性なヒトリゾチームを得
ることができる。
菌体を超音波などの方法で破砕し、遠心分離することに
よりヒトリゾチームからなる凝集体を濃縮・回収して行
なう、この凝集体を可溶化還元後、適当な酸化還元系（
例えばタルタチオンまたはミスライン）の酸化型及び還
元型の混合物により再生し、活性なヒトリゾチームを得
ることができる。
得られたヒトリゾチームは公知のラジオイノムアッセイ
（例えばＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｗ、 Ｐｈａｒｍ、
Ｂｕｌｌ。
（例えばＹｕｚｕｒｉｈａらＣｈｅｗ、 Ｐｈａｒｍ、
Ｂｕｌｌ。
ｆｉ２８０２〜２８０６（１９７９）及びＹｕｚｕｒｉ
ｈａらＣｈｅｓ＋。
ｈａらＣｈｅｓ＋。
Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、 ２６９０８〜９１４（１９
７８） ） 、酵素活性測定法（例えば５ｉｄｈａｎら
、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ。
７８） ） 、酵素活性測定法（例えば５ｉｄｈａｎら
、Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ。
４５、１８１７〜１８２３（１９８１）及びＭｏｒｓｋ
ｙ Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｓ。
ｙ Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｓ。
月唄エフ７〜８５（１９８３）） 、Ｓ Ｄ Ｓ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動のクマジーブリリアントブ
ルーＲ−２５０による発色、逆相ＨＰＬＣ等を用いて検
出、定量することができる。
アクリルアミドゲル電気泳動のクマジーブリリアントブ
ルーＲ−２５０による発色、逆相ＨＰＬＣ等を用いて検
出、定量することができる。
前述したようにＤＮＡ技術によるヒトリゾチームの生産
に関しては報告されているが（特開昭６１−７８３８３
等）本発明により多量のヒトリゾチームを生産すること
が可能になったため回収、精製操作も容易となった。
に関しては報告されているが（特開昭６１−７８３８３
等）本発明により多量のヒトリゾチームを生産すること
が可能になったため回収、精製操作も容易となった。
実施例
ヒト ゾチーム の
第１図に示した塩基配列の遺伝子を設計した。
設計の手順は下記の通りである。
（１）コドンの選定
ヒトリゾチーム構造遺伝子のコドンを第１図に示した通
りに選ぶ。
りに選ぶ。
（２）構造遺伝子の５゛端に翻訳開始コドンＡＴＧを付
加し、３°端に２個の翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧ
Ａ）を付加する。
加し、３°端に２個の翻訳終止コドン（ＴＡＡ及びＴＧ
Ａ）を付加する。
（３）ＢａｍＨＩ認識配列の粘着末端に相当する配列を
５°端に５ａｕ３Ａ＋認識配列の粘着末端に相当する配
列を３”端に付加する。
５°端に５ａｕ３Ａ＋認識配列の粘着末端に相当する配
列を３”端に付加する。
ＤＮＡフーグメントの八
第１図の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子をフラグメン
トＵ−１〜Ｕ−１６、Ｌ−１−Ｌ−１６にわけた（第２
図）、これらのフラグメントおよび前記のＳ−５，Ｄ−
５ＨＬＹ−３７〜ＨＬＹ−４２の各フラグメントを固相
法ホスホアミダイド法を利用したＭｏｄｅｌ ３８０
ＤＮＡシンセサイザー〔アブライドバイオシステムズ（
ＡＧｌｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社ｉ！１］に
より合成した。ＤＮＡの合成およびその精製は例えば特
開昭６３−２２１９０に記載されている方法に準じた。
トＵ−１〜Ｕ−１６、Ｌ−１−Ｌ−１６にわけた（第２
図）、これらのフラグメントおよび前記のＳ−５，Ｄ−
５ＨＬＹ−３７〜ＨＬＹ−４２の各フラグメントを固相
法ホスホアミダイド法を利用したＭｏｄｅｌ ３８０
ＤＮＡシンセサイザー〔アブライドバイオシステムズ（
ＡＧｌｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社ｉ！１］に
より合成した。ＤＮＡの合成およびその精製は例えば特
開昭６３−２２１９０に記載されている方法に準じた。
各フラグメントは、表１に示した量を取得した。
１ン びフラグメントの
上記の化学合成した３２個のフラグメントを第３図に示
した如＜Ａ−Ｄの４つのブロックに分け、各ブロックを
連結し、Ａ−Ｂ・ＣおよびＤブロックを連結して全体の
ヒトリゾチーム遺伝子を合成した。３２個のフラグメン
トのうち両端にあたるＵｌ、Ｌ−４、Ｕ−５、Ｌ−８、
Ｕ−９、Ｌ−１２、Ｕ−１３，Ｌ−１６を除り２４個の
フラグメントをＡ−Ｄの各ブロックごとにまとめて、そ
の５°端の水酸基をリン酸化し、ひきつづいて連結反応
を行った。リン酸化及び連結反応の詳細をブロックＡの
場合について述べれば下記の通りである。まずＵ−２，
Ｕ−３，Ｕ−４，Ｌ−１，Ｌ−２、Ｌ−３断片各１０μ
ｇを６６ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７゜５）１０ｍＭＭｇ
Ｃ１＊、１＠ＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン、３．６単
位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造）を含む、５
０ｇ２反応液で３７℃、１時間反応させ、５°末端をリ
ン酸化した。
した如＜Ａ−Ｄの４つのブロックに分け、各ブロックを
連結し、Ａ−Ｂ・ＣおよびＤブロックを連結して全体の
ヒトリゾチーム遺伝子を合成した。３２個のフラグメン
トのうち両端にあたるＵｌ、Ｌ−４、Ｕ−５、Ｌ−８、
Ｕ−９、Ｌ−１２、Ｕ−１３，Ｌ−１６を除り２４個の
フラグメントをＡ−Ｄの各ブロックごとにまとめて、そ
の５°端の水酸基をリン酸化し、ひきつづいて連結反応
を行った。リン酸化及び連結反応の詳細をブロックＡの
場合について述べれば下記の通りである。まずＵ−２，
Ｕ−３，Ｕ−４，Ｌ−１，Ｌ−２、Ｌ−３断片各１０μ
ｇを６６ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７゜５）１０ｍＭＭｇ
Ｃ１＊、１＠ＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン、３．６単
位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造）を含む、５
０ｇ２反応液で３７℃、１時間反応させ、５°末端をリ
ン酸化した。
反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈澱でＤＮＡを回収した。このＵ−２〜Ｕ−４，
Ｌ−１〜Ｌ−３断片各３μｇと未処理のＵ−１，Ｌ−４
断片各３ｐ８とを６６５Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）
、１１０５ＭＭｇＣ１、１ｍＭＡＴＰ、 １ｍＭス
ペルミジン、２４５０単位Ｔ４リガーゼ（全酒造）を含
む２００μ！反応液中で１６°Ｃ１越夜で反応させた０
反応により生じたＵ−１〜Ｌ−４断片の結合物をフェノ
ール：クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱によ
り約１８μｇの精製ＤＮＡ断片として回収した。
ノール沈澱でＤＮＡを回収した。このＵ−２〜Ｕ−４，
Ｌ−１〜Ｌ−３断片各３μｇと未処理のＵ−１，Ｌ−４
断片各３ｐ８とを６６５Ｍ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）
、１１０５ＭＭｇＣ１、１ｍＭＡＴＰ、 １ｍＭス
ペルミジン、２４５０単位Ｔ４リガーゼ（全酒造）を含
む２００μ！反応液中で１６°Ｃ１越夜で反応させた０
反応により生じたＵ−１〜Ｌ−４断片の結合物をフェノ
ール：クロロホルム混液で抽出後、エタノール沈澱によ
り約１８μｇの精製ＤＮＡ断片として回収した。
同様にしてＵ−５〜Ｕ−８，Ｌ−５〜Ｌ−８よりブロッ
クＢを、Ｕ−９〜Ｕ−１２，Ｌ−９〜Ｌ１２よりブロッ
クＣを、Ｕ−１３〜Ｕ−１６゜Ｌ−１３〜Ｌ−１６より
ブロックＤを合成した。
クＢを、Ｕ−９〜Ｕ−１２，Ｌ−９〜Ｌ１２よりブロッ
クＣを、Ｕ−１３〜Ｕ−１６゜Ｌ−１３〜Ｌ−１６より
ブロックＤを合成した。
各ブロックの連結物１７７ｇを６６＋ｓＭ トリス塩酸
（ｐＨ１゜５）、１０＋ｉＭ ＭｇＣｈ 、１ｍＭ
ＡＴＰ、 １ｍＭスペルミジン、３．６単位Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（全酒造）を含む５０〃！反応
液で３７℃、１時間反応させ、５°末端をリン酸化した
。
（ｐＨ１゜５）、１０＋ｉＭ ＭｇＣｈ 、１ｍＭ
ＡＴＰ、 １ｍＭスペルミジン、３．６単位Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（全酒造）を含む５０〃！反応
液で３７℃、１時間反応させ、５°末端をリン酸化した
。
反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後エタノ
ール沈澱でＤＮＡを回収した。このＡ。
ール沈澱でＤＮＡを回収した。このＡ。
Ｂ、Ｃ，Ｄの連結物断片５．５５ｇを６６１１Ｍトリス
塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ｍＭＭｇＣ１ｇ 、１ｓＭ
ＡＴＰ、 １ｍＭスペルミジン、１７５０単位Ｔ４リガ
ーゼ（全酒造）を含む７５０μ１反応液中で１６℃、越
夜で反応させた。
塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ｍＭＭｇＣ１ｇ 、１ｓＭ
ＡＴＰ、 １ｍＭスペルミジン、１７５０単位Ｔ４リガ
ーゼ（全酒造）を含む７５０μ１反応液中で１６℃、越
夜で反応させた。
反応により生じたＡ−Ｄパート断片の結合物をフェノー
ル：クロロホルム混合液で抽出後、エタノール沈澱によ
り約２２μｇの精製ＤＮＡ断片として回収した。
ル：クロロホルム混合液で抽出後、エタノール沈澱によ
り約２２μｇの精製ＤＮＡ断片として回収した。
この全長遺伝子を含む連結反応物を１０ｍＭ トリス塩
酸（ｐＨ７，５） 、 ５０ｍＭＮａＣ１、１１０５
ＭＭｇＣ１、１ｓ＋ＭＤＴＴ、３０単位の制限酵素５ａ
ｕ３ＡＩ存在下、５０ｕＥ反応液中、３７℃、４時間で
反応し、切断した。
酸（ｐＨ７，５） 、 ５０ｍＭＮａＣ１、１１０５
ＭＭｇＣ１、１ｓ＋ＭＤＴＴ、３０単位の制限酵素５ａ
ｕ３ＡＩ存在下、５０ｕＥ反応液中、３７℃、４時間で
反応し、切断した。
反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈澱でＤＮＡを回収した。
ノール沈澱でＤＮＡを回収した。
プラスミドｐＵｃ１Ｂ、６ｕｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−）
ＩＣＩ（ｐＨ７，５） 、５０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｈ及び１０単位の制限限酵素ＢａｍＨＩを含
む５０μｌの反染液中で３７℃、２時間インキエベート
した後フェノール抽出、エタノール沈澱を行った。
ＩＣＩ（ｐＨ７，５） 、５０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｈ及び１０単位の制限限酵素ＢａｍＨＩを含
む５０μｌの反染液中で３７℃、２時間インキエベート
した後フェノール抽出、エタノール沈澱を行った。
エタノール沈澱でＤＮＡを回収後、６０μ！のＩＭＴｒ
ｉｓ塩酸（ｐＨ１８，ｏ）及び２単位のアルカリ性フォ
スファクーゼで６５℃、１時間処理し５゛末端のリン酸
基を除去した。その後、フェノール：クロロホルム混合
液で抽出後、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。
ｉｓ塩酸（ｐＨ１８，ｏ）及び２単位のアルカリ性フォ
スファクーゼで６５℃、１時間処理し５゛末端のリン酸
基を除去した。その後、フェノール：クロロホルム混合
液で抽出後、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。
このベクターＤＮＡ０’、４μｇと前述のヒトリゾチー
ム全長遺伝子を含む連結反応混合物の１／１０！ｉとを
混合し、２０ａＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、
１０ｍＭＭｇＣ１ｇ、０．４ｍＭＡＴＰ、 ＩＯｓＭＤ
ＴＴ、及び５２５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む３０
μ２の反応溶中で１６℃、越夜反応させた。
ム全長遺伝子を含む連結反応混合物の１／１０！ｉとを
混合し、２０ａＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、
１０ｍＭＭｇＣ１ｇ、０．４ｍＭＡＴＰ、 ＩＯｓＭＤ
ＴＴ、及び５２５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む３０
μ２の反応溶中で１６℃、越夜反応させた。
次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、 ｃｏ目２９４株を
形質転換し、アンピシリン抵抗性（５０μｇ／ｄ）、の
形質転換体を得た。これらの形質転換体よりプラスミド
ＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って
、ｐＵｃ１８のＢａｍＨ１部位に合成ヒトリゾチーム遺
伝子が第３図で示される様に挿入された組換えプラスミ
ド（以下このプラスミドをｐＬＹ６１と呼ぶ）を含む形
質転換体を選び出した。
形質転換し、アンピシリン抵抗性（５０μｇ／ｄ）、の
形質転換体を得た。これらの形質転換体よりプラスミド
ＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って
、ｐＵｃ１８のＢａｍＨ１部位に合成ヒトリゾチーム遺
伝子が第３図で示される様に挿入された組換えプラスミ
ド（以下このプラスミドをｐＬＹ６１と呼ぶ）を含む形
質転換体を選び出した。
ボゾーム 人 とヒ ゾチーム の１持
上記８種の合成オリゴヌクレオチド（ＨＬＹ−３７〜４
２、 Ｓ−５，０−５）をアニーリングし、次いでクロ
ーニングした。まずＨＬＹ−３８，ＨＬＹ−３９゜ＨＬ
Ｙ−４０，ＨＬＹ−４１，ＨＬＹ−４２゜３−５各１０
ｔｔｇを６６ｍＭＴｒｉｓ塩ａ！ （ｐＨ１７，５＞、
１０ｍＭＭｇＣ１ｔ 、１ｍＭＡＴＰ、 １ｍＭスペ
ルミジン、１５単位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造）を含む５０μ２反応液で３７°Ｃ，１時間反応さ
せ、５゜末端をリン酸化した。
２、 Ｓ−５，０−５）をアニーリングし、次いでクロ
ーニングした。まずＨＬＹ−３８，ＨＬＹ−３９゜ＨＬ
Ｙ−４０，ＨＬＹ−４１，ＨＬＹ−４２゜３−５各１０
ｔｔｇを６６ｍＭＴｒｉｓ塩ａ！ （ｐＨ１７，５＞、
１０ｍＭＭｇＣ１ｔ 、１ｍＭＡＴＰ、 １ｍＭスペ
ルミジン、１５単位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造）を含む５０μ２反応液で３７°Ｃ，１時間反応さ
せ、５゜末端をリン酸化した。
反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後エタノ
ール沈澱でＤＮＡを回収した。このＨＬＹ−３８〜ＨＬ
Ｙ４２．Ｓ〜５断片３μｇと未処理のＨＬＹ３７．Ｄ−
５断片３μｇとを６６ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）
、１（１＋＋ＭＭｇｃ１ｇ 、１μＭ ＡＴＰ、
１１Ｍスペルミジン、１７５０単位Ｔ４リガーゼ（宝
酒造）を含む２００μｌ反応液中で１６°Ｃ２越夜で反
応させた０反応により生じたＨＬＹ３７〜ＨＬＹ４２゜
Ｓ−５，Ｄ−５断片の結合物をフェノール：クロロホル
ム混合液で抽出後、エタノール沈澱により約２４μｇの
精製ＤＮＡ断片として回収した。
ール沈澱でＤＮＡを回収した。このＨＬＹ−３８〜ＨＬ
Ｙ４２．Ｓ〜５断片３μｇと未処理のＨＬＹ３７．Ｄ−
５断片３μｇとを６６ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５）
、１（１＋＋ＭＭｇｃ１ｇ 、１μＭ ＡＴＰ、
１１Ｍスペルミジン、１７５０単位Ｔ４リガーゼ（宝
酒造）を含む２００μｌ反応液中で１６°Ｃ２越夜で反
応させた０反応により生じたＨＬＹ３７〜ＨＬＹ４２゜
Ｓ−５，Ｄ−５断片の結合物をフェノール：クロロホル
ム混合液で抽出後、エタノール沈澱により約２４μｇの
精製ＤＮＡ断片として回収した。
続いて上で調製した合成りＮＡ断片と連結するヒトリゾ
チーム遺伝子は以下のようにして調整した（第３図）、
先に得られたｐＬＹ−６１７２０μｇを１０蛾ｈトリス
塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ＩＩＭＭｇＣｈ −５０＋
ｗＭＮａＣＩ、１ｍＭＤＴＴ存在下、４００単位の制限
酵素Ｔａｑｌを加え８００ｐｌ中で６５℃、１時間反応
させ生じた６６２ｂｐの断片を５％ポリアクリルアミド
′ゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを切出し、
該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールでｆＩ！Ａ縮
し、フェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタノー
ル沈澱により約６０μｓのＤＮＡを回収した。このＤＮ
Ａ１．８μｇと先はどのＨＬＹ３７〜４２．Ｓ−５，Ｄ
−５結合物９μｇを６６ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５
）、６．６ｍＭＭｇＣ１ｇ 、１０■ＭＤＴＴ、１ｆｆ
ｉＭＡＴＰ、１３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下で
、１２０μｌの反応液中１６°Ｃ１越夜で反応させた。
チーム遺伝子は以下のようにして調整した（第３図）、
先に得られたｐＬＹ−６１７２０μｇを１０蛾ｈトリス
塩酸（ｐＨ７，５） 、１０ＩＩＭＭｇＣｈ −５０＋
ｗＭＮａＣＩ、１ｍＭＤＴＴ存在下、４００単位の制限
酵素Ｔａｑｌを加え８００ｐｌ中で６５℃、１時間反応
させ生じた６６２ｂｐの断片を５％ポリアクリルアミド
′ゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを切出し、
該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールでｆＩ！Ａ縮
し、フェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタノー
ル沈澱により約６０μｓのＤＮＡを回収した。このＤＮ
Ａ１．８μｇと先はどのＨＬＹ３７〜４２．Ｓ−５，Ｄ
−５結合物９μｇを６６ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，５
）、６．６ｍＭＭｇＣ１ｇ 、１０■ＭＤＴＴ、１ｆｆ
ｉＭＡＴＰ、１３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下で
、１２０μｌの反応液中１６°Ｃ１越夜で反応させた。
この反応で生じた結合物を１抛−トリス塩酸（ｐＨ７，
５）、５０＋５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｈ 、１
ｍＭＤ Ｔ Ｔ、 １６単位の制限酵素５ａｕ３ＡＩ存
在下、４０μ１反応液中、３７°Ｃ１３時間で反応し、
切断した０反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽
出後、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。この断片を
２０μ！中前記の条件で５．５単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼと３７°Ｃ１１時間反応させ、５°末端を
すべてリン酸化した。この４８８ｂｐの断片を５％ポリ
アクリアミドゲル電気泳動により分離回収した。この断
片中には先の合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾ
チーム遺伝子が存在する。
５）、５０＋５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｈ 、１
ｍＭＤ Ｔ Ｔ、 １６単位の制限酵素５ａｕ３ＡＩ存
在下、４０μ１反応液中、３７°Ｃ１３時間で反応し、
切断した０反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽
出後、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。この断片を
２０μ！中前記の条件で５．５単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼと３７°Ｃ１１時間反応させ、５°末端を
すべてリン酸化した。この４８８ｂｐの断片を５％ポリ
アクリアミドゲル電気泳動により分離回収した。この断
片中には先の合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾ
チーム遺伝子が存在する。
ベク − ＬＹ−８５の
このＤＮＡ断片を大腸菌用発現ベクターｐＭＹ１２−６
Ａｍｐ−１に組みこみ、大腸菌でヒトリゾチームを発現
させるプラスミドｐ ＬＹ−８５を構築した。先ずｐＭ
Ｙｌ ２−６Ａ２−６Ａ １．５μｇを５０５Ｍ ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ａＭ
ＭｇＣｈ 、１０ｓＭＤ Ｔ Ｔ、 ６０単位の制限酵
素ＢａｎＨ１の存在下、６０μ１反応液中、３７℃、１
２時間反応させた。エタノール沈澱でＤＮＡを回収後、
６０μｉ！１Ｍトリス塩酸（ｐＨ１８，０）及び２単位
のアルカリ性フォスファターゼで６５°Ｃ，１時間処理
し、５゛末端のリン酸基を除去した。その後、フェノー
ル：クロロホルム混合液で抽出後、エタノール沈澱でＤ
ＮＡを回収した。このベクター０．１μｇと先はどの４
８８ｂｐ断片を３００μｉ反応液中３５０単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを含む反応液で１６℃、越夜で反応させた
。この反応液を使ってカルシウム処理した大腸菌２９４
株を形質転換した。
Ａｍｐ−１に組みこみ、大腸菌でヒトリゾチームを発現
させるプラスミドｐ ＬＹ−８５を構築した。先ずｐＭ
Ｙｌ ２−６Ａ２−６Ａ １．５μｇを５０５Ｍ ）リ
ス塩酸（ｐＨ７，５）、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ａＭ
ＭｇＣｈ 、１０ｓＭＤ Ｔ Ｔ、 ６０単位の制限酵
素ＢａｎＨ１の存在下、６０μ１反応液中、３７℃、１
２時間反応させた。エタノール沈澱でＤＮＡを回収後、
６０μｉ！１Ｍトリス塩酸（ｐＨ１８，０）及び２単位
のアルカリ性フォスファターゼで６５°Ｃ，１時間処理
し、５゛末端のリン酸基を除去した。その後、フェノー
ル：クロロホルム混合液で抽出後、エタノール沈澱でＤ
ＮＡを回収した。このベクター０．１μｇと先はどの４
８８ｂｐ断片を３００μｉ反応液中３５０単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを含む反応液で１６℃、越夜で反応させた
。この反応液を使ってカルシウム処理した大腸菌２９４
株を形質転換した。
アンピシリン耐性菌を５０ｍｇ／ ｌアンピシリンを含
むし寒天培地（１０ｇ／ ｌポリペプトン、５ｇ７Ｎイ
ーストエキストラクト、５ｇ／ｌ ＮａＣ１，１，５％
寒天）上で選択した。得られたコロニーよりプラスミド
ＤＮＡをアルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（１９Ｂ２）ＣＮ３ ）により抽出、精製し、各種
制限酵素で切断して切断パターンを解析しヒトリゾチー
ム遺伝子がＡＰＬプロモーターと同一方向に組み込まれ
た形質転換体を選びだした。この形質転換体を大腸菌２
９４（ｐＬＹ−８５）と命名した。
むし寒天培地（１０ｇ／ ｌポリペプトン、５ｇ７Ｎイ
ーストエキストラクト、５ｇ／ｌ ＮａＣ１，１，５％
寒天）上で選択した。得られたコロニーよりプラスミド
ＤＮＡをアルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（１９Ｂ２）ＣＮ３ ）により抽出、精製し、各種
制限酵素で切断して切断パターンを解析しヒトリゾチー
ム遺伝子がＡＰＬプロモーターと同一方向に組み込まれ
た形質転換体を選びだした。この形質転換体を大腸菌２
９４（ｐＬＹ−８５）と命名した。
ヒ ｉゾチームの
Ｅ、 ｃｏｉｌ ２９４（ｐＬＹ−８５）を５１１１の
修正し培地（１０ｇ／ ｉ、ポリペプトン、 ５ｇ／
ｊ！イーストエキストラクト、 ５ｇ／ ｆｆ１Ｎａｃ
ｌ、５０ａ＋ｇ／ｊ！アンピシリン）に接種し、３０℃
で一夜培養した。培養液１１１１を新たな上記培地１０
０ｄに加え、３０℃で１〜６時間培養した後、４１゛Ｃ
で誘導し、さらに２〜ｌＯ時間培養を継続したのち菌体
を遠心分離した。
修正し培地（１０ｇ／ ｉ、ポリペプトン、 ５ｇ／
ｊ！イーストエキストラクト、 ５ｇ／ ｆｆ１Ｎａｃ
ｌ、５０ａ＋ｇ／ｊ！アンピシリン）に接種し、３０℃
で一夜培養した。培養液１１１１を新たな上記培地１０
０ｄに加え、３０℃で１〜６時間培養した後、４１゛Ｃ
で誘導し、さらに２〜ｌＯ時間培養を継続したのち菌体
を遠心分離した。
ヒト１ゾチームの
大腸菌２９４（ｐＬＹ−８５）株で生産されたヒトリゾ
チームの検出定量は逆相ＨＰＬＣにより行った。
チームの検出定量は逆相ＨＰＬＣにより行った。
比較例としてリボゾーム結合部位とＡＴＧ間の塩基数、
配列の異なるｐＬＹ−８０，ｐＬＹ−８３でそれぞれ形
質転換された大腸菌でのヒトリゾチームの生産量を測定
した。
配列の異なるｐＬＹ−８０，ｐＬＹ−８３でそれぞれ形
質転換された大腸菌でのヒトリゾチームの生産量を測定
した。
大腸菌２９４ （ｐＬＹ−８５）株及び大腸菌２９４
（ｐＬＹ−８０） 。
（ｐＬＹ−８０） 。
２９４ （ｐＬＹ−８３）株を１００１１修正り培地で
３０°Ｃで撮優培養しＯＤａ＊ｏが１．０〜１．８に達
した時から３〜６時間培養した。培養液を遠心集望し、
−８０°Ｃで凍結させた０次に室温で融解させた菌体を
５０ａＭＮａｔｌｌＰＯａ−ＮａＨｚＰＯａ （ｐＨ６
，２）に懸濁し、超音波により破砕した。破砕液を１０
倍容量の６．６Ｍグアニジン塩酸バッフｆ −（ｐＨ８
，５３，３％（Ｗ／Ｖ）ＤＴＴを含む）に懸濁した後Ｈ
ＰＬＣによりヒトリゾチーム量を測定した。
３０°Ｃで撮優培養しＯＤａ＊ｏが１．０〜１．８に達
した時から３〜６時間培養した。培養液を遠心集望し、
−８０°Ｃで凍結させた０次に室温で融解させた菌体を
５０ａＭＮａｔｌｌＰＯａ−ＮａＨｚＰＯａ （ｐＨ６
，２）に懸濁し、超音波により破砕した。破砕液を１０
倍容量の６．６Ｍグアニジン塩酸バッフｆ −（ｐＨ８
，５３，３％（Ｗ／Ｖ）ＤＴＴを含む）に懸濁した後Ｈ
ＰＬＣによりヒトリゾチーム量を測定した。
ＨＰＬＣによる測定は逆相系担体（ＹＭＣ−ＰａｃｋＡ
Ｐ−３０３山村化学研究社製）を用い０．１２％ＴＦＡ
を含むＯ，１ＭＮａｃ１水溶液中アセトニトリルの直線
濃度勾配による分析条件で行った。
Ｐ−３０３山村化学研究社製）を用い０．１２％ＴＦＡ
を含むＯ，１ＭＮａｃ１水溶液中アセトニトリルの直線
濃度勾配による分析条件で行った。
結果を表２に示した。
表２
ｐＬＹ−８５ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡ↑
３７．６発明の効果 第１図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子の上流に
下記の塩基配列のりボゾーム結合部位〜ヒトリゾチーム
の翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片 ５°端ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧ
３’端を連結することにより、ヒトリゾチームの発現
量が増加し、容易に効率よく調製することが可能となっ
た。
３７．６発明の効果 第１図記載の塩基配列のヒトリゾチーム遺伝子の上流に
下記の塩基配列のりボゾーム結合部位〜ヒトリゾチーム
の翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片 ５°端ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＴＡＴＧ
３’端を連結することにより、ヒトリゾチームの発現
量が増加し、容易に効率よく調製することが可能となっ
た。
第１図はｐＬＹ−８５に挿入されているヒトリゾチーム
遺伝子の全塩基配列を示す、上段は塩基配列を下段はア
ミノ酸配列を示す、塩基配列中、塩基番号４番目から３
９３番目までのｓＩ域がヒトリゾチームをコードする領
域である。塩基番号１番目から３番目のＡＴＣは翻訳開
始コドンを表す。 第２図はフラグメントＵ−１〜Ｕ−１６、Ｌ−１〜Ｌ−
１６の塩基配列を示している。上段はＵ−１−Ｕ−１６
を、下段はＬ−１−Ｌ−１６の塩基配列を示す６例えば
、フラグメントＵ−１は←Ｕ１→で示される範囲の塩基
配列を有する。 第３図はヒトリゾチーム遺伝子の構築方法および発現プ
ラスミドＦＬＹ−８５の構築方法を示している。 ：ｅａ、ｒＡ １）田
遺伝子の全塩基配列を示す、上段は塩基配列を下段はア
ミノ酸配列を示す、塩基配列中、塩基番号４番目から３
９３番目までのｓＩ域がヒトリゾチームをコードする領
域である。塩基番号１番目から３番目のＡＴＣは翻訳開
始コドンを表す。 第２図はフラグメントＵ−１〜Ｕ−１６、Ｌ−１〜Ｌ−
１６の塩基配列を示している。上段はＵ−１−Ｕ−１６
を、下段はＬ−１−Ｌ−１６の塩基配列を示す６例えば
、フラグメントＵ−１は←Ｕ１→で示される範囲の塩基
配列を有する。 第３図はヒトリゾチーム遺伝子の構築方法および発現プ
ラスミドＦＬＹ−８５の構築方法を示している。 ：ｅａ、ｒＡ １）田
Claims (7)
- （１）下記の塩基配列のＤＮＡ断片 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
コドンを、ＧＡＴＧＧＡＧＧはリボゾーム結合部位を表
す。） を５′端に有する、第１図記載の塩基配列のヒトリゾチ
ーム遺伝子を含み、微生物菌体内でヒトリゾチームを発
現することを特徴とする発現プラスミド - （２）発現プラスミドｐＬＹ−８５
- （３）特許請求の範囲第１項又は第２項記載のプラスミ
ドにより形質転換されヒトリゾチームを生産する微生物 - （４）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする
特許請求の範囲第３項記載の微生物。 - （５）Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ｐＬＹ−８５）
- （６）特許請求の範囲第３項、第４項又は第５項記載の
微生物を培養することを特徴とするヒトリゾチームの製
造法 - （７）下記の塩基配列のＤＮＡ断片 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
コドンを、ＧＡＴＧＧＡＧＧはリボソーム結合部位を表
す。） を５′端に有する、第１図記載の塩基配列のヒトリゾチ
ーム遺伝子
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17775488A JPH0227989A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17775488A JPH0227989A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0227989A true JPH0227989A (ja) | 1990-01-30 |
Family
ID=16036542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17775488A Pending JPH0227989A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | ヒトリゾチーム遺伝子の微生物内発現によるヒトリゾチームの生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0227989A (ja) |
-
1988
- 1988-07-15 JP JP17775488A patent/JPH0227989A/ja active Pending
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