JPH0430794A - ストレプトキナーゼをコードする遺伝子の単離および発現方法、得られるヌクレオチド配列、組換体ｄｎａおよび形質転換微生物 - Google Patents
ストレプトキナーゼをコードする遺伝子の単離および発現方法、得られるヌクレオチド配列、組換体ｄｎａおよび形質転換微生物Info
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- JPH0430794A JPH0430794A JP2201600A JP20160090A JPH0430794A JP H0430794 A JPH0430794 A JP H0430794A JP 2201600 A JP2201600 A JP 2201600A JP 20160090 A JP20160090 A JP 20160090A JP H0430794 A JPH0430794 A JP H0430794A
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- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はバイオテクノロジーおよび遺伝子工学に関する
。更に詳細には、本発明はストレプトキナーゼをコード
する新規なヌクレオチド配列の遺伝子・を単離・クロー
ニングする方法、および異種の宿主生物の形質転換に用
いられるところの該遺伝より得られる組換体ＤＮＡに関
する。
。更に詳細には、本発明はストレプトキナーゼをコード
する新規なヌクレオチド配列の遺伝子・を単離・クロー
ニングする方法、および異種の宿主生物の形質転換に用
いられるところの該遺伝より得られる組換体ＤＮＡに関
する。
（従来技術とその問題点）
ストレプトキナーゼは原核生物由来のプラスミノーゲン
活性化因子（ブラスミノーゲンアクチベーター）であっ
て、四通、多くの異なった血清型の溶血性ストレプトコ
ッカスにより培地中に分泌される。細菌を起源とする蛋
白質であって、それらに対する抗原応答が検出されてい
る（１）ｙｋｅｗｉｃ７゜。
活性化因子（ブラスミノーゲンアクチベーター）であっ
て、四通、多くの異なった血清型の溶血性ストレプトコ
ッカスにより培地中に分泌される。細菌を起源とする蛋
白質であって、それらに対する抗原応答が検出されてい
る（１）ｙｋｅｗｉｃ７゜。
Ｍ、Ｓ、ｅＬ ａｌ、、 Ｉ！１８５およびＭｃＧｒａ
Ｌｂ、に、Ｇ、ｅＬ ａｌ、。
Ｌｂ、に、Ｇ、ｅＬ ａｌ、。
１９８５）。それらの分子量は約４７，０００ダルトン
である。
である。
ストレプトコッカスの病原性における機能は正確には解
明されていないが、ストレプトキナーゼは恐らく感染部
の周囲のフィブリンバリアーの生成を除去したり防いだ
りすることに寄り、していると考えられる。
明されていないが、ストレプトキナーゼは恐らく感染部
の周囲のフィブリンバリアーの生成を除去したり防いだ
りすることに寄り、していると考えられる。
スト１ブｉ・キナーゼとヒ］・の血漿中のプラスミノー
ゲンとの相互反応により、この蛋白質は、プラスミノー
ゲンを、蛋白質加水分解法ｆ１を有していてフィブリン
凝固物を可溶性物に分解することのできるプラスミンに
変換することができるものである。
ゲンとの相互反応により、この蛋白質は、プラスミノー
ゲンを、蛋白質加水分解法ｆ１を有していてフィブリン
凝固物を可溶性物に分解することのできるプラスミンに
変換することができるものである。
現在、スＩ・レブトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織
プラスミノーゲンアクチベーターは、心筋炎、使塞、肺
動脈、静脈の血栓塞栓症、他の血栓症なとのような１１
七界で最も大きな死亡原因である障害において血栓溶解
剤として用いられている。
プラスミノーゲンアクチベーターは、心筋炎、使塞、肺
動脈、静脈の血栓塞栓症、他の血栓症なとのような１１
七界で最も大きな死亡原因である障害において血栓溶解
剤として用いられている。
スＩ・レプトキナーゼは、その起源により、分子的な不
均一さの故に、物理化学的、免疫学的差異のみならず基
質特異性にも差異があるが、その機能においてはすべて
密接に関連している。
均一さの故に、物理化学的、免疫学的差異のみならず基
質特異性にも差異があるが、その機能においてはすべて
密接に関連している。
ストレプトコッカスの工業的生産に用いられている株は
、その収率が低いのとその天然宿主の病＃；（性に加え
、デオキシリボヌクレアーゼ、ストレプトコッカス溶血
素、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼなどの池の産生物
を培地に分泌するので、所望の蛋白質の精製が困難にな
る。他方、これらの宿１．から遺伝子学的に改良された
株を得ることは、遺伝Ｔ−転移のための方法が開発され
ていないために不可能であった。
、その収率が低いのとその天然宿主の病＃；（性に加え
、デオキシリボヌクレアーゼ、ストレプトコッカス溶血
素、ヒアルロニダーゼ、プロテアーゼなどの池の産生物
を培地に分泌するので、所望の蛋白質の精製が困難にな
る。他方、これらの宿１．から遺伝子学的に改良された
株を得ることは、遺伝Ｔ−転移のための方法が開発され
ていないために不可能であった。
これらの欠点が、原核生物および真核生物を用いて、ス
トレプトキナーゼ蛋白質をコードする単離された異なっ
た遺伝子−のクローニングがいろいろと試みられてきて
いる理由である。
トレプトキナーゼ蛋白質をコードする単離された異なっ
た遺伝子−のクローニングがいろいろと試みられてきて
いる理由である。
西独特、１丁第２／１０４９：ｌ （国際特許分類・Ｃ
１２ＮＩ’、＋７００）には、Ｃ型ストレプＩ・コツカ
ス属のストレプ１−コッノＪス・エクイシミリス（Ｓｔ
ｒｅ ＋ｔｏｃｏｃｅｕｓ凹児ヨエ佳見）の株１１４６
＾１１１来のスＩ・レプトキナーゼをコー１−する遺伝
ｆ−について、大腸菌（ｌ：、ｃｏｌｉ）を宿１ごとし
て用いて、クローニングと発現を行ない、培養世代によ
っては０．１〜１．８■ＩＱ（培地）のレベルで目的物
が培地中に分泌されたことが記載されている。
１２ＮＩ’、＋７００）には、Ｃ型ストレプＩ・コツカ
ス属のストレプ１−コッノＪス・エクイシミリス（Ｓｔ
ｒｅ ＋ｔｏｃｏｃｅｕｓ凹児ヨエ佳見）の株１１４６
＾１１１来のスＩ・レプトキナーゼをコー１−する遺伝
ｆ−について、大腸菌（ｌ：、ｃｏｌｉ）を宿１ごとし
て用いて、クローニングと発現を行ない、培養世代によ
っては０．１〜１．８■ＩＱ（培地）のレベルで目的物
が培地中に分泌されたことが記載されている。
この萌（ＬＮｒ（ＳＫＣと命名された）をコードする配
列は、その径、転写および翻訳に関りＪる隣接帯域のも
°り造およびシグナルペプチドも含めて決定された（Ｍ
、＋ｌｋ（！、Ｉｆ、（！ｌ ａｌ、、 ｌ！＋８５）
。
列は、その径、転写および翻訳に関りＪる隣接帯域のも
°り造およびシグナルペプチドも含めて決定された（Ｍ
、＋ｌｋ（！、Ｉｆ、（！ｌ ａｌ、、 ｌ！＋８５）
。
Ｇ型およびＡ型スＩ・レプトコッカス山来のスＩ・レプ
Ｉ・キナーゼをコードする逍ｆバｆ−のヌクレオチド配
列もその後決定された（Ｗａｉｔｅｒ、Ｆ、＋！Ｌ ａ
ｌ、。
Ｉ・キナーゼをコードする逍ｆバｆ−のヌクレオチド配
列もその後決定された（Ｗａｉｔｅｒ、Ｆ、＋！Ｌ ａ
ｌ、。
＋９８５）。特に、ストレプ］・コツカスバイオジェネ
ス（Ｓ ｔ ｒｅ ＋ ｔｏｃｏｃｃｕ ｓ 歴ル朋亜
）のＭ型株／ＩｆＪ由来のＡ型ストレプトキナーゼの遺
伝／（ＳＫＡ遺伝ｆ）について、大腸菌、１Ｍ１０４１
株およびス］・レプｉ・コツカスサングイス（ＳＬｒｅ
Ｌｏｃｏｃｃｕｓ ７）チャリス５７１ （ＣＩ＋ａ
ｌｌｉｓ ５７Ｅ）のそれぞれを用いて、クロニングと
発現を行なったことが報告されている（山＋ａｕｇ、１
’、Ｔ、ｅＬ ａｌ、、 １９８９）。そして、それぞ
れ、０．６４＋ｇ／αおよび４０μｇＩＱの蛋白収率を
得ている。
ス（Ｓ ｔ ｒｅ ＋ ｔｏｃｏｃｃｕ ｓ 歴ル朋亜
）のＭ型株／ＩｆＪ由来のＡ型ストレプトキナーゼの遺
伝／（ＳＫＡ遺伝ｆ）について、大腸菌、１Ｍ１０４１
株およびス］・レプｉ・コツカスサングイス（ＳＬｒｅ
Ｌｏｃｏｃｃｕｓ ７）チャリス５７１ （ＣＩ＋ａ
ｌｌｉｓ ５７Ｅ）のそれぞれを用いて、クロニングと
発現を行なったことが報告されている（山＋ａｕｇ、１
’、Ｔ、ｅＬ ａｌ、、 １９８９）。そして、それぞ
れ、０．６４＋ｇ／αおよび４０μｇＩＱの蛋白収率を
得ている。
大ＩＩ＆ｌ ｉ２！ｆの場合には、回収蛋白質の９４％
が細胞周辺腔中に得られ、６％が細胞質ゾル中に得られ
たのに対し、ストレプトコッカスサングイス（Ｓ。
が細胞周辺腔中に得られ、６％が細胞質ゾル中に得られ
たのに対し、ストレプトコッカスサングイス（Ｓ。
７）の場合には全部の酵素が細胞外に得られた。更に、
大腸菌中でストレプトキナーゼを産生ずる多くのクロー
ンは不安定であり、成る場合には、Ｓにへ遺伝が除かれ
てしまったり、遺伝子産物の致死活性のために宿主細胞
が死んでしまったりする。
大腸菌中でストレプトキナーゼを産生ずる多くのクロー
ンは不安定であり、成る場合には、Ｓにへ遺伝が除かれ
てしまったり、遺伝子産物の致死活性のために宿主細胞
が死んでしまったりする。
ストレプトコッカスサングイス（互、 憇胆四神）の場
合には、得られる蛋白質分子は天然のストレプトキナー
ゼより約３，０００ダルトン小さく、Ｃ末端から３２個
のアミノ酸が欠落していることが検知されたが、しかし
、生物活性は影響されない（Ｉｌｕａｎｇ。
合には、得られる蛋白質分子は天然のストレプトキナー
ゼより約３，０００ダルトン小さく、Ｃ末端から３２個
のアミノ酸が欠落していることが検知されたが、しかし
、生物活性は影響されない（Ｉｌｕａｎｇ。
’ｒ、１．ｅＬ ＋Ｉ１．． ｌ！Ｊ８９）。
次いで、単離されたＳＫＣ遺伝子を大腸菌中でクローニ
ングと発現を行なうことの困難性についての決定的な結
果が得られた。即ち、得られた遺伝子は宿主の正常な生
理と干渉することが分かった。
ングと発現を行なうことの困難性についての決定的な結
果が得られた。即ち、得られた遺伝子は宿主の正常な生
理と干渉することが分かった。
そのことは、この遺伝を保持する細胞が粘液性を示すこ
と、細胞周辺腔へのストレプトキナーゼの輸送が不安定
であること、ＳＫＣ遺伝子を保有して該蛋白質の九度の
発現をするためのプラスミドが構造的に不安定であるこ
と、また、大腸菌のプラスミドを用いて更なる血清型の
ストレプトコッカス由来のストレプトキナーゼ遺伝子の
クローニングの際に種々の問題に遭遇すること、ならび
にＳにＣ遺伝子自信の発現−分泌シグナルの制御下に異
種遺伝子の発現を試みたが不成功に終わったことにより
明らかである（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｊ、ｅＬａｔ、、１ｆ１
８０）。
と、細胞周辺腔へのストレプトキナーゼの輸送が不安定
であること、ＳＫＣ遺伝子を保有して該蛋白質の九度の
発現をするためのプラスミドが構造的に不安定であるこ
と、また、大腸菌のプラスミドを用いて更なる血清型の
ストレプトコッカス由来のストレプトキナーゼ遺伝子の
クローニングの際に種々の問題に遭遇すること、ならび
にＳにＣ遺伝子自信の発現−分泌シグナルの制御下に異
種遺伝子の発現を試みたが不成功に終わったことにより
明らかである（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｊ、ｅＬａｔ、、１ｆ１
８０）。
もっと最近では、フィリップスペトロリアム社（Ｐｌ＋
１ｌｌｉｐｓ ｆ’ｅｔｒｏｌｅｕａ） ［東独特許
第２５７６４６号（国際特許分類： Ｃｌ２Ｎ＋５１０
０）およびＩｌａｇｇｅｎｓｏｎ、 Ｍ。
１ｌｌｉｐｓ ｆ’ｅｔｒｏｌｅｕａ） ［東独特許
第２５７６４６号（国際特許分類： Ｃｌ２Ｎ＋５１０
０）およびＩｌａｇｇｅｎｓｏｎ、 Ｍ。
Ｊ、ｅｔ ａ１１１９８ｆｌ）が、アルコールオキシダ
ーゼの調ｆｆｉ遺伝子の配列の制御下にメタノール資化
酵母（チロＩ・ローフ酵母ビヒアバストリス（Ｐｉｃｂ
ｉａ７）中でストレプトキナーゼの発現を行ない、連続
発酵法によりＩ約物を７７〜２５０ｍ Ｑ ／ ｇ （
培地）の収率で得、その際の中間細胞密度は４６ ｇ
／ Ｑであった。この系に用いた発１）ｌベクターにお
いては、米国オクラホマ大学のＪ、Ｊ、ｌ’ｅｒｒｅｔ
ｔｉ博士より、１１°１１しされたプラスミドｐＭＦ５
に含まれたＳＫＣ遺伝子が用いられている。
ーゼの調ｆｆｉ遺伝子の配列の制御下にメタノール資化
酵母（チロＩ・ローフ酵母ビヒアバストリス（Ｐｉｃｂ
ｉａ７）中でストレプトキナーゼの発現を行ない、連続
発酵法によりＩ約物を７７〜２５０ｍ Ｑ ／ ｇ （
培地）の収率で得、その際の中間細胞密度は４６ ｇ
／ Ｑであった。この系に用いた発１）ｌベクターにお
いては、米国オクラホマ大学のＪ、Ｊ、ｌ’ｅｒｒｅｔ
ｔｉ博士より、１１°１１しされたプラスミドｐＭＦ５
に含まれたＳＫＣ遺伝子が用いられている。
この系は、グルコースまたはグリセロールにより抑制す
ることができ、またメタノールにより誘導することがで
き、制御可能性の点において魅力のあるものだが、しか
し、その応用はこの宿主のみに限定される。
ることができ、またメタノールにより誘導することがで
き、制御可能性の点において魅力のあるものだが、しか
し、その応用はこの宿主のみに限定される。
（問題を解決するための手段および作用）本発明の目的
は、Ｃ型ストレプトコッカスエクイシミリス（兆堡世μ
凄工些凹ｕｉｓｉｍｉｌ■）＾ＴＣＣ−！１５４２株山
来のストレプトキナーゼに対応する活性部分を含有する
生物学的に活性なストレプトキナーゼをコードするこれ
まで知られていない遺伝Ｔ・変異体を表わす新規なヌク
レオチド配列を含む発現ベクターを用いて、異種の種々
の宿主系にてストレプトキナーゼを高収率で得ることで
ある。
は、Ｃ型ストレプトコッカスエクイシミリス（兆堡世μ
凄工些凹ｕｉｓｉｍｉｌ■）＾ＴＣＣ−！１５４２株山
来のストレプトキナーゼに対応する活性部分を含有する
生物学的に活性なストレプトキナーゼをコードするこれ
まで知られていない遺伝Ｔ・変異体を表わす新規なヌク
レオチド配列を含む発現ベクターを用いて、異種の種々
の宿主系にてストレプトキナーゼを高収率で得ることで
ある。
この新規な遺伝子はＳＫＣ−２と命名されたが、ＳＫＣ
がコードするものと同じ分子量の蛋白質をコードする。
がコードするものと同じ分子量の蛋白質をコードする。
これは、大腸α１および酵母類のベクターにおいて安定
であるという基本的特性を有しており、細胞の成長や生
存性に対して悪影響はみられない。
であるという基本的特性を有しており、細胞の成長や生
存性に対して悪影響はみられない。
それ故、１−記の両方の宿主をそれぞれ用いて、これま
で報告されている収率より高い収率で目的とする蛋白τ
ｌを得ることが可能になる。に記のことは、このストレ
プトキナーゼ 性を有し、これ迄知られているものとは異なるストレプ
トキナーゼであることを示している。
で報告されている収率より高い収率で目的とする蛋白τ
ｌを得ることが可能になる。に記のことは、このストレ
プトキナーゼ 性を有し、これ迄知られているものとは異なるストレプ
トキナーゼであることを示している。
本発明によれば， ＳＫＣ−２遺伝子に相当し、その発
現物が約１１７，０００ダルトンの蛋白であるところの
新規なヌクレオチド配列の単離および発現方法が提供さ
れる。この蛋白はストレプトキナーゼに属し、それは繊
維素溶解活性によって特徴づけられるものである。
現物が約１１７，０００ダルトンの蛋白であるところの
新規なヌクレオチド配列の単離および発現方法が提供さ
れる。この蛋白はストレプトキナーゼに属し、それは繊
維素溶解活性によって特徴づけられるものである。
本発明はまた此の遺伝子に１１１するものであり、その
配列は次式のものに相当する。
配列は次式のものに相当する。
（以下余白）
＾ ＡＧＡＣＣＧＴ
ＣＣＡ ＡＧＴｒＧＴ
ｒＡＧＣＧＴｒＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴ
ＡＧＴＣＴＴＡＭＴＴＴＩＴ
ＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＧＡＣＣ：
ＴＧＣＴ
ＡＡＧＴＣＣＡＭＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴｒＴＧ（
７＾ＣＴＧＡＴＡＧＴＧＧＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡＴ
ＡＣＴ
八＾へＧＧＣＴＡＴｒＣＭＧＡＡＣＡＡＴｒＧ＾ＴＣＧ
ＣＴ＾ＡＣＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＧＡＣＴＡ
ＣＴＩＴＧＡＧＧＴＣＡ＾ＧＡＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＡ
ＡＡＡＡＣＣＴＧＴｒＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＡＴＡＣＴ
ＧＴＡＣＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴＧ
ＡＴＧＡＣＧＡｍ ＡＡＧＣＴＡＴＴＧＭＭＣＡＣ丁＾ＧＣＴＡＴＣＧＧＴ
ＧＡＣ＾ＴＡＣＧＡη丁＾工ＧＡＡＣＧＴ
工ＧＡＣＡＴＴＴＴＣＣ
ＧＴ＾ＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＭＴＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧ
ＴＴＴＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＭＡＴＣＧＧＧＡ
ＡＣＡＡＧＣ；ＴＴＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡへ
ＡＴＣＴＧＧ丁ＣＴＧ 八ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡ
ＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＧ 八ＧＡＡ
ＡＴＡＴｒＡＣＧＴＣＣＴＴＡＣＧＴＴＧ＾Ｔ
ＡＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＡ
ＧＣＴＣＴｒＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＧｋＡＣＧＴＡＪＩ
Ｃ：■へＧへＣｎＣＡＧＡＧＡｍＡＴＡＣＧＡＴＣＣＴ
ＣＧＴＧＡＴＭＧＧＣＴＡＡＡＣＴＡＣＴＣＴＡＣＭＣ
ＡＡＴＣＴＣＧへＴＧＣＴＴｒｒＧＧＴＡＴＴＡＴＧＧ
ＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＡＧＡ
ＧＧＡＴ０ａ９ ＴＡＴＣＡＴ八ＡＣＣＧへｒｒＡＴ
ＴＧＣＴＡＧＣＴＡＴＣ
ＡＴＩＴＡＧＣＣＴＡＴＧ＾ＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡ
Ｔ Ａ
ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡ
Ｃ２Ｉ７ ＣＴＡＴＡＣＣＴＧＡ工ＡＡＣＣＣＴＡＡＣＧＡＣＡＡ
ＡＴ＾Ａこの遺伝子は、Ｃ型ストレプトコッカスエクイ
シミリス ０５４２）のゲノムから遺伝子増幅により得られ、その
際、次の配列をそれぞれ有するＳＫ１．Ｓに２およびＳ
に３と命名された合成オリゴヌクレオチドをポリメラー
ゼとして用いるポリメラーゼチエイン反応（１＋Ｏｌｙ
ｍｅｒｎｓｅ （：ｌ＋ａｌｌ＋ ｒｅ；＋ｃＬｌｏｎ
） （以下１１ｃＩ＋と略記する）を利用する。
ＣＣＡ ＡＧＴｒＧＴ
ｒＡＧＣＧＴｒＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴ
ＡＧＴＣＴＴＡＭＴＴＴＩＴ
ＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＧＡＣＣ：
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ＣＴ＾ＡＣＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＧＡＣＴＡ
ＣＴＩＴＧＡＧＧＴＣＡ＾ＧＡＣＣＡＴＡＴＡＡＡＧＡ
ＡＡＡＡＣＣＴＧＴｒＧＡＴＧＴＧＧＡＡＴＡＴＡＣＴ
ＧＴＡＣＡＧＴＴＴＡＣＴＣＣＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴＧ
ＡＴＧＡＣＧＡｍ ＡＡＧＣＴＡＴＴＧＭＭＣＡＣ丁＾ＧＣＴＡＴＣＧＧＴ
ＧＡＣ＾ＴＡＣＧＡη丁＾工ＧＡＡＣＧＴ
工ＧＡＣＡＴＴＴＴＣＣ
ＧＴ＾ＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＭＴＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧ
ＴＴＴＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＭＡＴＣＧＧＧＡ
ＡＣＡＡＧＣ；ＴＴＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡへ
ＡＴＣＴＧＧ丁ＣＴＧ 八ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡ
ＣＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＧ 八ＧＡＡ
ＡＴＡＴｒＡＣＧＴＣＣＴＴＡＣＧＴＴＧ＾Ｔ
ＡＡＡＡＡＧＣＧＡＧＣＡ
ＧＣＴＣＴｒＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＧｋＡＣＧＴＡＪＩ
Ｃ：■へＧへＣｎＣＡＧＡＧＡｍＡＴＡＣＧＡＴＣＣＴ
ＣＧＴＧＡＴＭＧＧＣＴＡＡＡＣＴＡＣＴＣＴＡＣＭＣ
ＡＡＴＣＴＣＧへＴＧＣＴＴｒｒＧＧＴＡＴＴＡＴＧＧ
ＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＡＧＡ
ＧＧＡＴ０ａ９ ＴＡＴＣＡＴ八ＡＣＣＧへｒｒＡＴ
ＴＧＣＴＡＧＣＴＡＴＣ
ＡＴＩＴＡＧＣＣＴＡＴＧ＾ＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡ
Ｔ Ａ
ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡ
Ｃ２Ｉ７ ＣＴＡＴＡＣＣＴＧＡ工ＡＡＣＣＣＴＡＡＣＧＡＣＡＡ
ＡＴ＾Ａこの遺伝子は、Ｃ型ストレプトコッカスエクイ
シミリス ０５４２）のゲノムから遺伝子増幅により得られ、その
際、次の配列をそれぞれ有するＳＫ１．Ｓに２およびＳ
に３と命名された合成オリゴヌクレオチドをポリメラー
ゼとして用いるポリメラーゼチエイン反応（１＋Ｏｌｙ
ｍｅｒｎｓｅ （：ｌ＋ａｌｌ＋ ｒｅ；＋ｃＬｌｏｎ
） （以下１１ｃＩ＋と略記する）を利用する。
ＳＫＩ ５’．、、ＴＧＧＭＴＴＣ八ＴＧ八ＡＡへ
ＡＴへＡＣＴＴＡＴＣＴ．、、３ＳＫ２ ５’．、
、ＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡＧＧＧＴ
ＴＡＴＣ．、、３’Ｓに３ ５’．、、ＧＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＡ
・・・３。
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、ＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡＧＧＧＴ
ＴＡＴＣ．、、３’Ｓに３ ５’．、、ＧＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＡ
・・・３。
これらは、本発明における新規な特徴を示す。
これら３種のプライマーは遺伝子には無い制限ｒｆｌ１
位をそれぞれ有しており、これらが発現ベクターによる
１１゛「接のクローニングを可能にする．一方。
位をそれぞれ有しており、これらが発現ベクターによる
１１゛「接のクローニングを可能にする．一方。
５′端にハイブリダイズするＳＫ２は＾ＴＧを有してお
り，これが１訳開始部位として作用し、またＳＫＣ−２
のシグナルペプチドを除去する．これらの３種のオリゴ
ヌクレオチドは、Ｍａｌｋｅ ｅＬ ａｌ、＋９８５が
開示したＳＫＣ配列から合成され、成熟蛋白質をコドす
る遺伝ｆ−またはシグナルペプチドを含む完全遺伝ｒの
正確な断片の境界がこれらによってマクされる。
り，これが１訳開始部位として作用し、またＳＫＣ−２
のシグナルペプチドを除去する．これらの３種のオリゴ
ヌクレオチドは、Ｍａｌｋｅ ｅＬ ａｌ、＋９８５が
開示したＳＫＣ配列から合成され、成熟蛋白質をコドす
る遺伝ｆ−またはシグナルペプチドを含む完全遺伝ｒの
正確な断片の境界がこれらによってマクされる。
この方法のもう一つの特徴は、中陰された遺伝子を、細
菌および酵母の両ｔのいずれを用いても、高い発現能を
もって発現することができることである。
菌および酵母の両ｔのいずれを用いても、高い発現能を
もって発現することができることである。
本発明は又、ＳＫＣ−２遺伝ｒを含む組換体１）Ｎ八に
関する。その例は、細菌での発現に適したへフタ−１＋
ｌ：Ｋ（＋；ｌ （第１図参照）、ならびに酵母での発
現に適した１）円：ＳＫＣ−４および１＋Ｉ’ｌＳＫＣ
−ｒｉ（第ご３図参照）である。更に詳細には、大腸１
２１１での発現のためには。
関する。その例は、細菌での発現に適したへフタ−１＋
ｌ：Ｋ（＋；ｌ （第１図参照）、ならびに酵母での発
現に適した１）円：ＳＫＣ−４および１＋Ｉ’ｌＳＫＣ
−ｒｉ（第ご３図参照）である。更に詳細には、大腸１
２１１での発現のためには。
シグナルペプチドを含むかまたは含まないＳに（ニー２
遺伝了を、１〜リブトフアンプロモーターの制御Ｆで１
１つファージ゛［４の転写終始シグナルイ・１きて、ク
ローニングする。ＭＬすての発現のためには、ギューバ
国発明ｎ１１１願第７ ／ ！Ｊ ０号に記数されてい
る発現ベクターを用いる。その発現ベクターにおいては
、細胞外発現変ｙ６体として、ビヒアバストリス（Ｐｉ
ｃｌ…Ｉ匣鉄吐見）のアルコールオキシダーゼ遺伝子プ
ロモーター（＾０ｘ１）により制御されるスフローゼイ
ンベルターゼ（ＳＵＣ２）のシグナルペプチドの後にＳ
ＫＣ−２が位置しており、且つ該発現ベクターは、サツ
カロマイセスセレビシェ（Ｓａｅｃｌ＋ａｒｏ＋ｗｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセラルデヒドー３
−フオスフエートデヒドロギナーゼ（ＧＡＰｔ）の終Ｊ
１．シグナルを含んでいる。この発現ベクターをｌ）円
；ＳＫｉニー４と命名する。 ＳＫＣ−２の細胞内発現
のためにはベクターｐＰＩｓＫｃ−６を用い、このベク
ターはへ〇ＸＩプロモーターの後に５ＵＣ２のシグナル
ペプチドを含まない。このベクターは、ＳＫＣ−２遺伝
子を発現ベクターｐＮ＾０（キューバ国ハナバ、ＣＩＧ
Ｂ、 Ｍｕｚｉ。
遺伝了を、１〜リブトフアンプロモーターの制御Ｆで１
１つファージ゛［４の転写終始シグナルイ・１きて、ク
ローニングする。ＭＬすての発現のためには、ギューバ
国発明ｎ１１１願第７ ／ ！Ｊ ０号に記数されてい
る発現ベクターを用いる。その発現ベクターにおいては
、細胞外発現変ｙ６体として、ビヒアバストリス（Ｐｉ
ｃｌ…Ｉ匣鉄吐見）のアルコールオキシダーゼ遺伝子プ
ロモーター（＾０ｘ１）により制御されるスフローゼイ
ンベルターゼ（ＳＵＣ２）のシグナルペプチドの後にＳ
ＫＣ−２が位置しており、且つ該発現ベクターは、サツ
カロマイセスセレビシェ（Ｓａｅｃｌ＋ａｒｏ＋ｗｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセラルデヒドー３
−フオスフエートデヒドロギナーゼ（ＧＡＰｔ）の終Ｊ
１．シグナルを含んでいる。この発現ベクターをｌ）円
；ＳＫｉニー４と命名する。 ＳＫＣ−２の細胞内発現
のためにはベクターｐＰＩｓＫｃ−６を用い、このベク
ターはへ〇ＸＩプロモーターの後に５ＵＣ２のシグナル
ペプチドを含まない。このベクターは、ＳＫＣ−２遺伝
子を発現ベクターｐＮ＾０（キューバ国ハナバ、ＣＩＧ
Ｂ、 Ｍｕｚｉ。
から人手できる）（第３図参照）に挿入することにより
得られる。サツカロマイセスセレビシェ（Ｓ、ｃｃｒｃ
ｖｉｓｉａｃ）のｌｌｌ３３遺伝子は上記の両ベクター
において選択マーカーとして用いられる。上記した発現
部分（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）には
、組込みのために、ビヒアパストリス（Ｐｉｃｂｉａ７
）の＾Ｏｘ遺伝子の５′および３′配列が隣接している
。
得られる。サツカロマイセスセレビシェ（Ｓ、ｃｃｒｃ
ｖｉｓｉａｃ）のｌｌｌ３３遺伝子は上記の両ベクター
において選択マーカーとして用いられる。上記した発現
部分（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）には
、組込みのために、ビヒアパストリス（Ｐｉｃｂｉａ７
）の＾Ｏｘ遺伝子の５′および３′配列が隣接している
。
本発明は又、大ｌ！Ｉ菌ｗ３目Ｏ株をベクターｐＥＫＧ
３で形質転換して得られる微生物、ビヒアパストリス（
Ｐｉｃｌ＋ｉａ ｐｆｉ旦匣旦）の変異株Ｍ＋）−３６
（キューバ国発明者証願第７／９０号に記載されている
）を発現ベクターｐｒ’１ＥｓＫｃ−４およびｐｌ’１
ｓＫｃ−６で形質転換して得られる微生物にも関する。
３で形質転換して得られる微生物、ビヒアパストリス（
Ｐｉｃｌ＋ｉａ ｐｆｉ旦匣旦）の変異株Ｍ＋）−３６
（キューバ国発明者証願第７／９０号に記載されている
）を発現ベクターｐｒ’１ＥｓＫｃ−４およびｐｌ’１
ｓＫｃ−６で形質転換して得られる微生物にも関する。
これらの微生物は、ストレプトキナーゼを高度の発現能
で産生ずることができ、かつ形質転換された株は高い生
存性（発現物が細胞の生長に悪影瞥を与えない）と高い
安定性を有するものである。
で産生ずることができ、かつ形質転換された株は高い生
存性（発現物が細胞の生長に悪影瞥を与えない）と高い
安定性を有するものである。
上記の形質転換された大腸菌株は、ＩＩｓＫ−Ｍと命名
され、 ＳＫＣ−２遺伝子の発現を３５０１Ｉｇ／ Ｑ
（培地）以上の高収率で行なう。
され、 ＳＫＣ−２遺伝子の発現を３５０１Ｉｇ／ Ｑ
（培地）以上の高収率で行なう。
また、上記の形質転換されたビヒアパストリス（Ｐｉｃ
ｌ＋ｉａ ＄）の２種の株はそれぞれＭＳに旧とＭＳＫ
−ＭＧと命名され、それぞれ細胞内的および細胞外的に
、１．０〜１．２ｇ／ｌ（培地）の高い収率でストレプ
トキナーゼを産生ずる。
ｌ＋ｉａ ＄）の２種の株はそれぞれＭＳに旧とＭＳＫ
−ＭＧと命名され、それぞれ細胞内的および細胞外的に
、１．０〜１．２ｇ／ｌ（培地）の高い収率でストレプ
トキナーゼを産生ずる。
本発明の方法によれば、これまでに報告されたどの発現
能よりも高い発現能でもってストレプトキナーゼが産生
されるのみならず、得られる産生物は、複数のコストの
かかる精製を特に必要とせずに、ヒトおよび動物への投
ｉｊに適した好ましい純１１にすることができる。
能よりも高い発現能でもってストレプトキナーゼが産生
されるのみならず、得られる産生物は、複数のコストの
かかる精製を特に必要とせずに、ヒトおよび動物への投
ｉｊに適した好ましい純１１にすることができる。
（実施例）
次に述べる実施例により本発明を更に詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、次の実施例では宿主系としてイー、コリ（Ｅ、ｅ
ｏｌｉ）およびビヒアパストリス（Ｐｉｃｌ＋１ａｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）を用いたが、他の真核生物および原核生
物も本発明に用いることができる９ 実施例Ｉ Ｃ型ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｃｒｅ ＋
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄ）のゲノムＤ Ｎ Ａを単離する
ために、株＾’ｒｃｃ −９５４２をＳＫ遺伝子のクロ
ニングのための源として用いた。ストレプトコッカスエ
クイシミリスの細胞をブレインハートインフユージョン
メディアム（口ｒａｉ口１ｌｅａｒｖｎｒｕｓｕｉｏｎ
Ｍｅｄｉｕｍ） （Ｇ１１（ＣＯ）で、３７℃で１２
時間回転数２４０ｒ、ｐ、＋ａ、で成長させ、その際イ
ノキュラＬ、（ｉｎｏｃｕ ｌｕｍ）として作用するＯ
ｉｊ培養物（ｐｒｅｃｕ ｌ ｕ＋ｒｃＳ） （３００
＋ｍ Ｑのエルレンマイヤーフラスコで１２時間成長さ
せたもの）５ｗ Ｑを用いた。３．００Ｏｒ、１１．Ｌ
の遠心分離により＃１１胞を集め、８１ＩＩＱのライス
（ｌｙｓｒ＋） （グルコース４．５ｇ、１シ旧＾１．
８６ｇおよびトリス塩酸１．５１ ｇを５，００軸Ｃ無
菌水に溶解したものでｐＨ＝ ８ ）に再懸濁させ、リ
ゾチーム８ｏを１゜ＩｌｇＺ−悲の濃度で加え、懸濁液
を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を
１・分に破砕するために、！’１００７ｔαのプロナー
ゼ【ベーリンガー社（Ｉｌｏｃｌ＋ｒｉｕｇｃｒ））、
１ｌｌＱのｌｕｍ５ｌ）Ｓおよび２００７ｚ’１２の
Ｅｌ）Ｔ＾（０，５Ｍ ｐＨ＝８）を加え、懸濁液をゆ
るやかに撹拌しながら５０℃で２時間インキュへ−Ｉ・
した。
ｏｌｉ）およびビヒアパストリス（Ｐｉｃｌ＋１ａｐａ
ｓｔｏｒｉｓ）を用いたが、他の真核生物および原核生
物も本発明に用いることができる９ 実施例Ｉ Ｃ型ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｃｒｅ ＋
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄ）のゲノムＤ Ｎ Ａを単離する
ために、株＾’ｒｃｃ −９５４２をＳＫ遺伝子のクロ
ニングのための源として用いた。ストレプトコッカスエ
クイシミリスの細胞をブレインハートインフユージョン
メディアム（口ｒａｉ口１ｌｅａｒｖｎｒｕｓｕｉｏｎ
Ｍｅｄｉｕｍ） （Ｇ１１（ＣＯ）で、３７℃で１２
時間回転数２４０ｒ、ｐ、＋ａ、で成長させ、その際イ
ノキュラＬ、（ｉｎｏｃｕ ｌｕｍ）として作用するＯ
ｉｊ培養物（ｐｒｅｃｕ ｌ ｕ＋ｒｃＳ） （３００
＋ｍ Ｑのエルレンマイヤーフラスコで１２時間成長さ
せたもの）５ｗ Ｑを用いた。３．００Ｏｒ、１１．Ｌ
の遠心分離により＃１１胞を集め、８１ＩＩＱのライス
（ｌｙｓｒ＋） （グルコース４．５ｇ、１シ旧＾１．
８６ｇおよびトリス塩酸１．５１ ｇを５，００軸Ｃ無
菌水に溶解したものでｐＨ＝ ８ ）に再懸濁させ、リ
ゾチーム８ｏを１゜ＩｌｇＺ−悲の濃度で加え、懸濁液
を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞を
１・分に破砕するために、！’１００７ｔαのプロナー
ゼ【ベーリンガー社（Ｉｌｏｃｌ＋ｒｉｕｇｃｒ））、
１ｌｌＱのｌｕｍ５ｌ）Ｓおよび２００７ｚ’１２の
Ｅｌ）Ｔ＾（０，５Ｍ ｐＨ＝８）を加え、懸濁液をゆ
るやかに撹拌しながら５０℃で２時間インキュへ−Ｉ・
した。
次に、フェノール、フェノール−クロロホルム、および
クロロホルムで処理し、ゲノムＩ） Ｎ Ａを無水アル
コールとＮ１１４＾Ｃ（７，５Ｍ）により沈殿させた。
クロロホルムで処理し、ゲノムＩ） Ｎ Ａを無水アル
コールとＮ１１４＾Ｃ（７，５Ｍ）により沈殿させた。
得られた収率は３０抛Ｑエルレンマイアー培養フラスコ
当り１００μｇであった。ストレプトキナーゼをフード
する遺伝子の存在はサザーンブロット法（ＭａｎｉａＬ
ｉｓ ｅｔ ａｌ、１９８２）により確認した。
当り１００μｇであった。ストレプトキナーゼをフード
する遺伝子の存在はサザーンブロット法（ＭａｎｉａＬ
ｉｓ ｅｔ ａｌ、１９８２）により確認した。
実施例２
細菌でサブクローニングするために、Ｃ型ストレプトコ
ッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅ ＬＯＣＯＣＣＩＪＳ
西現王国伏見）株Ａ’ｌ’ＣＣ−９５４２のゲノムＤＮ
ＡＩμｇを取り、ＳにＣ−２遺伝子をコードする遺伝子
をＰｃｌ１（Ｒａｎｄ＋＋ＩＩ ｅＬ ａｌ、、１９８
８）により増幅した。その際シグナルペプチドのある遺
伝子をクローニングするためにはオリゴヌクレオチドＳ
ＫＩおよびＳに２を用い、シグナルペプチドの無い遺伝
子をクローニングするためにはＳＫ２およびＳに３を用
いた。
ッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅ ＬＯＣＯＣＣＩＪＳ
西現王国伏見）株Ａ’ｌ’ＣＣ−９５４２のゲノムＤＮ
ＡＩμｇを取り、ＳにＣ−２遺伝子をコードする遺伝子
をＰｃｌ１（Ｒａｎｄ＋＋ＩＩ ｅＬ ａｌ、、１９８
８）により増幅した。その際シグナルペプチドのある遺
伝子をクローニングするためにはオリゴヌクレオチドＳ
ＫＩおよびＳに２を用い、シグナルペプチドの無い遺伝
子をクローニングするためにはＳＫ２およびＳに３を用
いた。
各反応において、各オリゴヌクレオチドを１θＯｐｍｏ
Ｉ、’ｒ；＋（ｌポリメラーゼ（Ｔａｑ ｐｏｌｙ＋
＊ｅｒａｓｅｅ） ［米国パーキンエルマー社（１’ｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）］を２単位および各ｄＮＴＩ）
を２００７ｚｍｏｌを用いた。反応は、１０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび１００μｇ／ｍＱゼラチン中で行なった。
Ｉ、’ｒ；＋（ｌポリメラーゼ（Ｔａｑ ｐｏｌｙ＋
＊ｅｒａｓｅｅ） ［米国パーキンエルマー社（１’ｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）］を２単位および各ｄＮＴＩ）
を２００７ｚｍｏｌを用いた。反応は、１０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび１００μｇ／ｍＱゼラチン中で行なった。
３０回の増幅サイクルを行ない、各サイクルにおいて、
インキュベートは９５℃で１分間行なって変性させ、５
２℃で４５秒間行なってオリゴヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせ、７０℃で８０秒行なって延長（ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏ口）させた。増幅は５ｚ以」二の効率で行なわれ
た。
インキュベートは９５℃で１分間行なって変性させ、５
２℃で４５秒間行なってオリゴヌクレオチドをハイブリ
ダイズさせ、７０℃で８０秒行なって延長（ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏ口）させた。増幅は５ｚ以」二の効率で行なわれ
た。
細菌（大腸菌）でクローニングするために、これ迄報告
されていない遺伝子構造、すなわち、大腸菌のトリゾ］
・ファンプロモーターとバクテリオファージＴ４の終止
シグナルを有しているものを用いた。Ｉ’ＣＩ？で増幅
した断片をｌｌａｍｌｌｌで消化し、ベクターｐｔｒｉ
ｐ−Ｎｃｏｌ−３ｌ−１１ａｍ＋ｌｌｌ （ＩＥｓＬｒ
ａｄａ ｅＬ ａｌ、。
されていない遺伝子構造、すなわち、大腸菌のトリゾ］
・ファンプロモーターとバクテリオファージＴ４の終止
シグナルを有しているものを用いた。Ｉ’ＣＩ？で増幅
した断片をｌｌａｍｌｌｌで消化し、ベクターｐｔｒｉ
ｐ−Ｎｃｏｌ−３ｌ−１１ａｍ＋ｌｌｌ （ＩＥｓＬｒ
ａｄａ ｅＬ ａｌ、。
＋９８８）に組込んだ。この遺伝子構造体を、大腸α１
（Ｅ、ｃｏｌｉ）株１！旧Ｏｆ （（ｒｒｌ−＋ｍＲ−
）、堕ケ４４、ａｒａ−１４、餅−２、１ａｃＹＩ 、
ｐノ乙ｓ１〜２、 □２０、 （Ｓｌ、ｒ ） 、
、ｑｌ−！’ｉ 、ｍＬＩ−５、ｇｌ−１，ｒｅｃＡ
Ｉ３１の細胞にＩ）ａｇｃｒ＋、 （！Ｌ ａｌ。
（Ｅ、ｃｏｌｉ）株１！旧Ｏｆ （（ｒｒｌ−＋ｍＲ−
）、堕ケ４４、ａｒａ−１４、餅−２、１ａｃＹＩ 、
ｐノ乙ｓ１〜２、 □２０、 （Ｓｌ、ｒ ） 、
、ｑｌ−！’ｉ 、ｍＬＩ−５、ｇｌ−１，ｒｅｃＡ
Ｉ３１の細胞にＩ）ａｇｃｒ＋、 （！Ｌ ａｌ。
（Ｉｆ）７’ｌ）および１ｌａｎａｌ＋ａｎ ｅｔ ａ
ｌ、 （Ｉｆ）８３）の方法に従って感染させたところ
、ＤＮＡｇ当り１０゛以」二の度数で形質転換体を得た
。
ｌ、 （Ｉｆ）８３）の方法に従って感染させたところ
、ＤＮＡｇ当り１０゛以」二の度数で形質転換体を得た
。
得られたコロニーを１．０培地（ｌａｇ／ｌトリプトフ
ァン、５ｇ／（ＩＭＰＩエキストラクトおよび１０ｇＩ
Ｑ塩化ナトリウム）および５０ｐｇ／ｙａＱのアンピシ
リンのプレートに移し、Ｍａ旧ａＬｉｓ ｅＬ ａｌ、
（目）８２）の方法に従って、ハイブリダイズしたが、
その後プローブとしてｄ＾゛１ピ゛（英国、＾ｍｅｒｓ
ｈａｍｌｉ）で標識した＋’ｃｏによる増幅で得られた
断片および大腸菌のｌ）ＮΔ−ポリメラーゼのフレノウ
断片（Ｋｌｅｎｏｗｒｒ＋ｔｇ１１（＋ｎＬ）（Ｍａｎ
ｉａＬｉｓ ｅＬ ａｌ、、１０８２）を用い、ホアッ
トマン５４１ フィルター（Ｗｌ＋ａｔｍａｎ ＋５１
ｒｉ １ｔｅｒｓ）により３７℃で行なった。反応は
＋５１）１＾と加熱により終止させた。コロニーの４１
が陽性コロニーであり、制限分析により調べたところ１
０以上の制限Ｍ素で同じ消化パターンを有していた。更
に、該陽性クローンを、２重鎖ＤＮＡシーフェンシング
（Ｓａｎｇｅｒ （！Ｌ ａｌ、、 １９７７）により
、プロモーターの３′端にハイブリダイズする１７塩基
のオリコヌクＬ／ ：ｔ チト（５′−ＡＴＬ：ＡＴＣ
ＧＡＡＣＴＡＧ’ｒＴＡＡ・３ ’ ）を用イて調べた
結果、これが望み通りＳＫＣ−２遺伝子に結合している
ことが分かった。
ァン、５ｇ／（ＩＭＰＩエキストラクトおよび１０ｇＩ
Ｑ塩化ナトリウム）および５０ｐｇ／ｙａＱのアンピシ
リンのプレートに移し、Ｍａ旧ａＬｉｓ ｅＬ ａｌ、
（目）８２）の方法に従って、ハイブリダイズしたが、
その後プローブとしてｄ＾゛１ピ゛（英国、＾ｍｅｒｓ
ｈａｍｌｉ）で標識した＋’ｃｏによる増幅で得られた
断片および大腸菌のｌ）ＮΔ−ポリメラーゼのフレノウ
断片（Ｋｌｅｎｏｗｒｒ＋ｔｇ１１（＋ｎＬ）（Ｍａｎ
ｉａＬｉｓ ｅＬ ａｌ、、１０８２）を用い、ホアッ
トマン５４１ フィルター（Ｗｌ＋ａｔｍａｎ ＋５１
ｒｉ １ｔｅｒｓ）により３７℃で行なった。反応は
＋５１）１＾と加熱により終止させた。コロニーの４１
が陽性コロニーであり、制限分析により調べたところ１
０以上の制限Ｍ素で同じ消化パターンを有していた。更
に、該陽性クローンを、２重鎖ＤＮＡシーフェンシング
（Ｓａｎｇｅｒ （！Ｌ ａｌ、、 １９７７）により
、プロモーターの３′端にハイブリダイズする１７塩基
のオリコヌクＬ／ ：ｔ チト（５′−ＡＴＬ：ＡＴＣ
ＧＡＡＣＴＡＧ’ｒＴＡＡ・３ ’ ）を用イて調べた
結果、これが望み通りＳＫＣ−２遺伝子に結合している
ことが分かった。
選択されたクローンを１）１ミにＧ−３（第３図参照）
と命名し、これを発酵にかけて産物物の同定を行なった
。
と命名し、これを発酵にかけて産物物の同定を行なった
。
クローンｐｌＥＫＧ３のプラスミドをＣｓＣｌグレディ
エントを用いて精製し、ＳＫＣ−２遺伝子の配列を決定
したが、その際プラスミドは２ｇ用い、また下記に示す
オリゴヌクレオチドをブライマーとして用いた。
エントを用いて精製し、ＳＫＣ−２遺伝子の配列を決定
したが、その際プラスミドは２ｇ用い、また下記に示す
オリゴヌクレオチドをブライマーとして用いた。
５ＳＫ−０１５° 、、ＧＭＴＣ八八ＧへへＡＴＴＡＧ
ＴＣ，、，３ＳＳに−０２５°、、、ＧＴＧＧＣＧＣＧ
ＡＴＧＣＣＡＣ，、，３’ＳＳに−０３５’、、、ＧＣ
ＡＡＣＣＡＴＴＡＣＴＧＡＴＣＧ、、、３’５ＳＫ−０
４５’、、、ＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣ，、
，３’ＳＳに−Ｑ５ ５’、、、ＣＴＡＧＣＴＡＴＣ
ＧＧＴＧＡＣＡＣ，、，３’ＳＳに−０６５’、、、Ｃ
ＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧ、、、、：ｌ’５３に−
Ｑ７ ５’、、、ＧＴＴＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＣ
，、、、：］’ＳＳに−０８５’、、、ＣＣＡＧＴＴＭ
ＧＧＴＡＴＡＧＴＣ，、，３’５Ｓ１−Ｑ９ ５’、、
、ＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧ、、、３゜その具
体的な方法はサンガー等［Ｓａ＋＋ｇｅｒ ｅｔ ａｌ
。
ＴＣ，、，３ＳＳに−０２５°、、、ＧＴＧＧＣＧＣＧ
ＡＴＧＣＣＡＣ，、，３’ＳＳに−０３５’、、、ＧＣ
ＡＡＣＣＡＴＴＡＣＴＧＡＴＣＧ、、、３’５ＳＫ−０
４５’、、、ＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣ，、
，３’ＳＳに−Ｑ５ ５’、、、ＣＴＡＧＣＴＡＴＣ
ＧＧＴＧＡＣＡＣ，、，３’ＳＳに−０６５’、、、Ｃ
ＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧ、、、、：ｌ’５３に−
Ｑ７ ５’、、、ＧＴＴＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＣ
，、、、：］’ＳＳに−０８５’、、、ＣＣＡＧＴＴＭ
ＧＧＴＡＴＡＧＴＣ，、，３’５Ｓ１−Ｑ９ ５’、、
、ＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧ、、、３゜その具
体的な方法はサンガー等［Ｓａ＋＋ｇｅｒ ｅｔ ａｌ
。
（１０７７）） （１） 方法に従い、（１＾１°１）
１およびＳ”ｄＡＴ＋’（英国、＾ｍｅｒｓｌ＋ａｎ＋
ｌＪ：）を用いた。
１およびＳ”ｄＡＴ＋’（英国、＾ｍｅｒｓｌ＋ａｎ＋
ｌＪ：）を用いた。
第２図に、ＳＫＣ−２の塩基配列から銹導されたアミノ
酸配列と、ＳＫＣ（Ｍａｌｋｅ ｅｔ ａｌ、ＩＩ１８
６）ならびに、ＳＫＡおよび５ＫＧ（Ｗａｔｅｒ、Ｆ、
ｅＬ ａｌ、、ＩＩ）８９）の各遺伝子によってコード
される各アミノ酸配列とを比較して示す。
酸配列と、ＳＫＣ（Ｍａｌｋｅ ｅｔ ａｌ、ＩＩ１８
６）ならびに、ＳＫＡおよび５ＫＧ（Ｗａｔｅｒ、Ｆ、
ｅＬ ａｌ、、ＩＩ）８９）の各遺伝子によってコード
される各アミノ酸配列とを比較して示す。
プラスミドｐｌＥにＧ３を種々のイー、コリ（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）株（讐３１１０、ＪＭ−１０１，１１ミ３９２お
よびＭＣ−１０６１）に移植し、ストレプ］・キナーゼ
の発現を比較したところ、株Ｗ３１１０（Ｆ−と１１７
坦史１シ埠可１（距状Ｋ Ｂ１１？島Ｂ連Ｙ ｔｏｎ＾
）が最も良好な結果を示した。従って、これを選んで発
酵にかけたところ、細胞の全蛋白質含有量が２０％以上
という高い収率が得られ、３５０〜４００ａｇ／ Ｑ
（培地）のストレプトキナーゼを得た。
ｌｉ）株（讐３１１０、ＪＭ−１０１，１１ミ３９２お
よびＭＣ−１０６１）に移植し、ストレプ］・キナーゼ
の発現を比較したところ、株Ｗ３１１０（Ｆ−と１１７
坦史１シ埠可１（距状Ｋ Ｂ１１？島Ｂ連Ｙ ｔｏｎ＾
）が最も良好な結果を示した。従って、これを選んで発
酵にかけたところ、細胞の全蛋白質含有量が２０％以上
という高い収率が得られ、３５０〜４００ａｇ／ Ｑ
（培地）のストレプトキナーゼを得た。
実施例３
酵ＩｕでＳＫＣ−２をサブクローニングするために、ビ
ヒアパストリス（１”１ｃｂｉａ匹Ｕ虹且）の株Ｍｒ’
３６を宿主として用いた。細胞内発現および細胞外発現
のための変異体をプラスミドｐＮ＾０およびｐＰＳ７
（第３図参照）から作成したが、細胞外発現のためには
スクロースインベルターゼのシグナルペプチドを用い、
細胞内外のどちらの場合にも、遺伝子のサブクローニン
グは、プロモーターとしてはアルコールオキシダーゼ（
＾（）Ｘ）プロモーターを用い、３′端でのターミネー
タ−としてはニス、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）のグリセラルデハイド３−フオスフエートデヒド
ロギナーゼ遺伝子の終止シグナルを用いて、また酵母の
ゲノムの相同性による組込のために＾Ｏｘ遺伝の非コー
ド３′−領域（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ３ ’ ｒｅｇ
ｉｏｎ）を用い、更にまた株ＭＰ３６ｂｉｓ−での選択
のためにヒスチジン３をコードする遺伝子を用いた。
ヒアパストリス（１”１ｃｂｉａ匹Ｕ虹且）の株Ｍｒ’
３６を宿主として用いた。細胞内発現および細胞外発現
のための変異体をプラスミドｐＮ＾０およびｐＰＳ７
（第３図参照）から作成したが、細胞外発現のためには
スクロースインベルターゼのシグナルペプチドを用い、
細胞内外のどちらの場合にも、遺伝子のサブクローニン
グは、プロモーターとしてはアルコールオキシダーゼ（
＾（）Ｘ）プロモーターを用い、３′端でのターミネー
タ−としてはニス、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）のグリセラルデハイド３−フオスフエートデヒド
ロギナーゼ遺伝子の終止シグナルを用いて、また酵母の
ゲノムの相同性による組込のために＾Ｏｘ遺伝の非コー
ド３′−領域（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ３ ’ ｒｅｇ
ｉｏｎ）を用い、更にまた株ＭＰ３６ｂｉｓ−での選択
のためにヒスチジン３をコードする遺伝子を用いた。
ベクター【）円シＳＫＣ−４（蛋白質の細胞外発現のた
めのプラスミド）はＳＫＣ−２遺伝子を挿入したベクタ
ー構造体ｐＰＳ７−Ｎｃｏｌ−３ｌヌクレアーゼ−フォ
スファターゼから得られた。該ＳＫＣ−２遺伝子は、
ｒ”ｃＲによりｐｌＥＫＧ３から得られ、その際、プラ
イマーとしては、オリゴヌクレオチドＳＫ２と、また遺
伝子の５′端とハイブリダイズし■っ＾ＴＧ（細菌での
発現のために挿入してあったもの）を除く新しいプライ
マーとを用いて増幅したものである。細胞内発現の場合
には、ＳＫＣ−２のバンドを挿入したベクターｐＮ＾０
Ｎｅｏ ｌ −ＥｃｏＲＩ −５ｌヌクレアーゼ−’７
オス７ｙターゼからｐｒ’ｌｓに（ニー６を得た。該Ｓ
Ｋ（ニー２は、ｒ’ＣＲにより、プライマーとしてＳＫ
２およびＳＫ３を用いて増幅したちのである。こうして
、ストレプトキナーゼしかつ５′端に＾１にを有する正
確な遺伝子が得られる（第コ３図参照）。両プラスミド
でもって、フレラグ等（（：ｒｒ＋ｇｇ，、１．ｅｔ
ａｔ．、 Ｎ１８５）の方法により株剛）：１６１＋ｉ
ｓ−を形質転換した。
めのプラスミド）はＳＫＣ−２遺伝子を挿入したベクタ
ー構造体ｐＰＳ７−Ｎｃｏｌ−３ｌヌクレアーゼ−フォ
スファターゼから得られた。該ＳＫＣ−２遺伝子は、
ｒ”ｃＲによりｐｌＥＫＧ３から得られ、その際、プラ
イマーとしては、オリゴヌクレオチドＳＫ２と、また遺
伝子の５′端とハイブリダイズし■っ＾ＴＧ（細菌での
発現のために挿入してあったもの）を除く新しいプライ
マーとを用いて増幅したものである。細胞内発現の場合
には、ＳＫＣ−２のバンドを挿入したベクターｐＮ＾０
Ｎｅｏ ｌ −ＥｃｏＲＩ −５ｌヌクレアーゼ−’７
オス７ｙターゼからｐｒ’ｌｓに（ニー６を得た。該Ｓ
Ｋ（ニー２は、ｒ’ＣＲにより、プライマーとしてＳＫ
２およびＳＫ３を用いて増幅したちのである。こうして
、ストレプトキナーゼしかつ５′端に＾１にを有する正
確な遺伝子が得られる（第コ３図参照）。両プラスミド
でもって、フレラグ等（（：ｒｒ＋ｇｇ，、１．ｅｔ
ａｔ．、 Ｎ１８５）の方法により株剛）：１６１＋ｉ
ｓ−を形質転換した。
陽ｆ１クローンをサザーンプロット法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ（！Ｉｄ１．，＋！１８２）により調べ、正しい組込
みを有しているものから最も生産性の高いものを選択し
て用いた。
ｓ（！Ｉｄ１．，＋！１８２）により調べ、正しい組込
みを有しているものから最も生産性の高いものを選択し
て用いた。
ビー、バストリス（ １’ 、 巳旦虹見）を用いて細
胞外に組換体ストレプトキナーゼを発現させたところそ
の発現能は１〜１。２ｇＩＱＣＩ／ｆ地のＪ−Ｙｉ？）
であり、細胞内発現のベクター構成体の場合にはその発
現能は１．Ｏｇ／（１ （培地）であった。
胞外に組換体ストレプトキナーゼを発現させたところそ
の発現能は１〜１。２ｇＩＱＣＩ／ｆ地のＪ−Ｙｉ？）
であり、細胞内発現のベクター構成体の場合にはその発
現能は１．Ｏｇ／（１ （培地）であった。
細胞外発現の場合には、分子量が６１， ０００ダルト
ン以１．の糖蛋白質が得られ、ウェスターンプロットに
より調べたところ、エンドグリコシダーゼ１１で消化す
ると天然ストレプトキナーゼの分子量（こ減少すること
が確認された．これは次のようにして行なった。クエン
酸ナトリウム溶液中ＩＩＩ１ｇｌＱ濃度の試料（０．
０５モル、ｐＨ ＝ ５ 、 ５）をとり、Ｓｌ）Ｓ（
最終濃度ｏ，ｏ２％）を加え、１００℃で１０分加熱し
た。次いで，周囲温度に放置、冷却し、２０ミリ１１１
位（＋ＩｌｌＪ）のエンドグリコシダーゼＩ＋（（！Ｉ
Ｉ（Ｉｌｌ Ｉ＋）を加えて３７℃で１６時間放置した
。その終り頃に、１００℃で５分間加熱し、ｌｏｍＵの
ｃｎｄｏ Ｉｆを加え、その後、３０℃で１２時間イン
キュベートしてから、１２．’Ｊポリアクリルアミドゲ
ルにかけ、もとの糖蛋白試料と比較した。
ン以１．の糖蛋白質が得られ、ウェスターンプロットに
より調べたところ、エンドグリコシダーゼ１１で消化す
ると天然ストレプトキナーゼの分子量（こ減少すること
が確認された．これは次のようにして行なった。クエン
酸ナトリウム溶液中ＩＩＩ１ｇｌＱ濃度の試料（０．
０５モル、ｐＨ ＝ ５ 、 ５）をとり、Ｓｌ）Ｓ（
最終濃度ｏ，ｏ２％）を加え、１００℃で１０分加熱し
た。次いで，周囲温度に放置、冷却し、２０ミリ１１１
位（＋ＩｌｌＪ）のエンドグリコシダーゼＩ＋（（！Ｉ
Ｉ（Ｉｌｌ Ｉ＋）を加えて３７℃で１６時間放置した
。その終り頃に、１００℃で５分間加熱し、ｌｏｍＵの
ｃｎｄｏ Ｉｆを加え、その後、３０℃で１２時間イン
キュベートしてから、１２．’Ｊポリアクリルアミドゲ
ルにかけ、もとの糖蛋白試料と比較した。
細胞外および細胞内ベクターの両方の場合において、ビ
ヒアパスｉ・リス（ｌ’ｉｅ１山１匹ＳＬＯＩ’旦）ニ
産生したストレプトキナーゼ のプラスミノーゲンへの親和＋′ｌも変１っず、臨床医
薬として有用な変異体であった。
ヒアパスｉ・リス（ｌ’ｉｅ１山１匹ＳＬＯＩ’旦）ニ
産生したストレプトキナーゼ のプラスミノーゲンへの親和＋′ｌも変１っず、臨床医
薬として有用な変異体であった。
実施例４
ＳＫＣ−２遺伝子の産生物の生理活ｆ１を調べるために
、細菌およびＭｌすのそれぞれから得られた純粋の組換
ストレプトキナーゼを用いて、急性および亜急性毒性試
験をラットについて行なった。その結果、ヒトおよび動
物の治療に使用するに１−分の補足な結果が得られた。
、細菌およびＭｌすのそれぞれから得られた純粋の組換
ストレプトキナーゼを用いて、急性および亜急性毒性試
験をラットについて行なった。その結果、ヒトおよび動
物の治療に使用するに１−分の補足な結果が得られた。
そのｉｎ ｖｉｖｏ繊維素溶解活性を動物について臨床
試験をした結果、犬の冠状動脈および大腿動脈での血餅
を溶解し、この種の蛋白質についてこれまで報告されて
いるのと同様の血液パラメーターを維持した。
試験をした結果、犬の冠状動脈および大腿動脈での血餅
を溶解し、この種の蛋白質についてこれまで報告されて
いるのと同様の血液パラメーターを維持した。
ＳＫＣ−２ｉｆｉ伝子の産生物は、アガロース−フィブ
リンのプレート（＾５Ｌｒｕｐ ｅｔ ａｔ、、１９５
２）、クロモジェニック基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
５ｕｂｓｔｒａｔｅ） （ＦｒｊｂｅｒｇｅｒｅＬ
ａｌ、、１９８２）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ血餅溶解（
ＷｅｓｔｌｕｎｄｅＬ ａｌ、、１９８５）について測
定したところ、５０，０００〜１００、０００１υ７■
の比活性を示した。
リンのプレート（＾５Ｌｒｕｐ ｅｔ ａｔ、、１９５
２）、クロモジェニック基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
５ｕｂｓｔｒａｔｅ） （ＦｒｊｂｅｒｇｅｒｅＬ
ａｌ、、１９８２）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ血餅溶解（
ＷｅｓｔｌｕｎｄｅＬ ａｌ、、１９８５）について測
定したところ、５０，０００〜１００、０００１υ７■
の比活性を示した。
実施例５
ＳＫＣ−２遺伝子の塩基配列から演鐸されるアミノ酸配
列を確認するために、高速逆相液体グロマトグラフィ−
（ＩＩＰＬｃ−Ｒｒ’）による分析［Ｃ８４，６Ｘ２５
０ｍカラム（米国ベーカー社）］を行なった。分析にお
いては、バッファー＾１トリフルオロ醋酸（ＴＦ＾）（
ＰＩｅｒｃｅ社、米国）の１１蒸留水溶液〕とバッファ
ー口（ＴＦ＾の０．５％アセトニトリル溶液（Ｌｉｃｈ
ｒｏｓｏｌｖ） （メルク社、西独）を用い、５分はバ
ッファー１３ｏｚで５５分でバッファー８９０％までと
なる勾配を用い、流速は０，８■Ｑ／分とした。
列を確認するために、高速逆相液体グロマトグラフィ−
（ＩＩＰＬｃ−Ｒｒ’）による分析［Ｃ８４，６Ｘ２５
０ｍカラム（米国ベーカー社）］を行なった。分析にお
いては、バッファー＾１トリフルオロ醋酸（ＴＦ＾）（
ＰＩｅｒｃｅ社、米国）の１１蒸留水溶液〕とバッファ
ー口（ＴＦ＾の０．５％アセトニトリル溶液（Ｌｉｃｈ
ｒｏｓｏｌｖ） （メルク社、西独）を用い、５分はバ
ッファー１３ｏｚで５５分でバッファー８９０％までと
なる勾配を用い、流速は０，８■Ｑ／分とした。
高純度のものを用いて、ＳＫＣ−２遺伝子について得ら
れた塩基配列より演鐸されたアミノ酸配列が正しいかど
うかについて、質量スペクトログラフィーにより調べた
。そのために、得られた蛋白質を異種の酵素およびその
組合せにより消化した。
れた塩基配列より演鐸されたアミノ酸配列が正しいかど
うかについて、質量スペクトログラフィーにより調べた
。そのために、得られた蛋白質を異種の酵素およびその
組合せにより消化した。
用いた酵素は、キモトリプシン、エンドブロテイナーゼ
Ｇｌｕｅ−Ｃ、エンドプロテイナーゼ１．ｙｓ−Ｃおよ
びトリプシンである。
Ｇｌｕｅ−Ｃ、エンドプロテイナーゼ１．ｙｓ−Ｃおよ
びトリプシンである。
異種の酵素で種々の消化によって得られたペプチドの質
量スペクトログラフ分析から、蛋白質のアミノ酸配列地
図を重畳によって作成したところ、ＳＫＣ−２遺伝子の
塩基配列と得られたアミノ酸配列はｌｏｏｍ符号してい
た。
量スペクトログラフ分析から、蛋白質のアミノ酸配列地
図を重畳によって作成したところ、ＳＫＣ−２遺伝子の
塩基配列と得られたアミノ酸配列はｌｏｏｍ符号してい
た。
株の寄託
大腸菌株Ｗ−３１１０に基づきかつプラスミドＩ）ＩＥ
にに３を含有するイー、コリ（Ｅ、朋旦） ＩＩＳＫ−
Ｍ［ｐｌ二ＫＧ３）株は１９９０年６月１１日にオラン
ダ国バールンのセントラルビューロープアシメルカルチ
ャーズ（Ｌｌｌ（＋Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖ
ｏｏｒ Ｓｃｌ＋１ｓｎｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢ
Ｓ）にＣｌｌ５２４３．！ＪＯの番号で寄託されている
。
にに３を含有するイー、コリ（Ｅ、朋旦） ＩＩＳＫ−
Ｍ［ｐｌ二ＫＧ３）株は１９９０年６月１１日にオラン
ダ国バールンのセントラルビューロープアシメルカルチ
ャーズ（Ｌｌｌ（＋Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖ
ｏｏｒ Ｓｃｌ＋１ｓｎｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢ
Ｓ）にＣｌｌ５２４３．！ＪＯの番号で寄託されている
。
同様に、ビヒアバス！・リス（１”ｉｃｌ＋ｉａ 巳払
凹圏）株Ｍ＋’−３（ｉに基づきかつグラスミ１０円Ｅ
ＳＫＣ−４を含有するビヒアバストリス（Ｐｉｃｌ＋ｉ
ａ ：）ＭＳＫ−Ｍ４（１＋円シミＳＫＣ−４株は、１
９９０年６ノ目１［１にオランダ国Ｃｌｌ５に０口５２
４４．りＯの番号で寄託されている。
凹圏）株Ｍ＋’−３（ｉに基づきかつグラスミ１０円Ｅ
ＳＫＣ−４を含有するビヒアバストリス（Ｐｉｃｌ＋ｉ
ａ ：）ＭＳＫ−Ｍ４（１＋円シミＳＫＣ−４株は、１
９９０年６ノ目１［１にオランダ国Ｃｌｌ５に０口５２
４４．りＯの番号で寄託されている。
次に、本発明で略記引用された参考文献を列挙する。
（１）＾５Ｌｒｕｐ、 Ｔ、、 ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ
ｔｚ、 Ｓ、、 １９５２．＾ｒｃｂ。
ｔｚ、 Ｓ、、 １９５２．＾ｒｃｂ。
１３ｉｏｃｌｕシー、ｎ１ｏｐｌ＋ｙｓ、４０：４６−
３５１；（２）ｌｌｕｒｎｅＬＬ、 Ｎ、Ｎ、’、１
９８１． ＾ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
目２ ： １９５−２０３； （３）Ｃｒｃｇｇ、 Ｊ、Ｍ、、 Ｂａｒｒｉｎｇ
ｅｒ、 Ｋ、、Ｉ、、 １ｌｅｓｓｌｅｒ、 八
。
３５１；（２）ｌｌｕｒｎｅＬＬ、 Ｎ、Ｎ、’、１
９８１． ＾ｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
目２ ： １９５−２０３； （３）Ｃｒｃｇｇ、 Ｊ、Ｍ、、 Ｂａｒｒｉｎｇ
ｅｒ、 Ｋ、、Ｉ、、 １ｌｅｓｓｌｅｒ、 八
。
Ｙ、、 ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ、 Ｋ、Ｒ，、１９８５
，Ｍｏ１． Ｃｏ１１゜口ｉｏ１．５ ： ３３７６−
３３８５；（４）Ｄａｇｃｒｔ、 Ｍ、、 ａｎｄ
１Ｅｂｒｌｉｃｂ、 Ｓ、１）、、 １９７４
．Ｇｅｎｅ６ ： ２３−２８・ （５）Ｉ）ｙｋｅｗｉｃｚ、 Ｍ、Ｓ、 、 ＭｃＧｒ
ａｔｈ、 Ｋ、Ｇ、＋ １ｌａｒｒｉｓ、に。
，Ｍｏ１． Ｃｏ１１゜口ｉｏ１．５ ： ３３７６−
３３８５；（４）Ｄａｇｃｒｔ、 Ｍ、、 ａｎｄ
１Ｅｂｒｌｉｃｂ、 Ｓ、１）、、 １９７４
．Ｇｅｎｅ６ ： ２３−２８・ （５）Ｉ）ｙｋｅｗｉｃｚ、 Ｍ、Ｓ、 、 ＭｃＧｒ
ａｔｈ、 Ｋ、Ｇ、＋ １ｌａｒｒｉｓ、に。
ε、、 ８ｔｕｄ ＰａＬｔ、ｅｒｓｏｎ、 １
１．、 ＋９８５． ＩｎＬ、 ＾ｒＣＩ＋。
１．、 ＋９８５． ＩｎＬ、 ＾ｒＣＩ＋。
Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ、Ｉ＋ｕ＋＋ｕｎ、７８ ：
３８（ｉ−３ＥｌＯ・（６）Ｅｓｖｒａｄａ、 Ｍ、
Ｐ、、 １ｌｅｒｎａｎｄｃｚ、 ０．、 ａｎｄ ｄ
ｅ １ａＦｕｃｎｔｅ、 Ｊ、、 Ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ ｙ ロｉｏｔａｃｎｏｌｏｇｉａ ５（
７）Ｆｒｉｂｅｒｇｃｒ、 Ｐ、、 １Ｕ８２．
Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 １．ａ＋＋ 、 Ｉｎｖｅ
ｓｔ４２、 Ｓｕ（λｐｌ、 ＋６２：４！１〜５
４（８）Ｉｌａｎａｌ＋ａｎ、 Ｉ）、、 ｌり８３
． Ｊ、 ＭＯＩ、 Ｂｉｏｌ、 １６６：５５７
５８０゜ （１））由＋ａｎｇ、 Ｔ、Ｔ１Ｍａｌｋｔ＋、
Ｉｔ、、 ａｎ（ｌ Ｆ（！ｒｒ＋＋＋、ｔｉ、
Ｊ。
３８（ｉ−３ＥｌＯ・（６）Ｅｓｖｒａｄａ、 Ｍ、
Ｐ、、 １ｌｅｒｎａｎｄｃｚ、 ０．、 ａｎｄ ｄ
ｅ １ａＦｕｃｎｔｅ、 Ｊ、、 Ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ ｙ ロｉｏｔａｃｎｏｌｏｇｉａ ５（
７）Ｆｒｉｂｅｒｇｃｒ、 Ｐ、、 １Ｕ８２．
Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 １．ａ＋＋ 、 Ｉｎｖｅ
ｓｔ４２、 Ｓｕ（λｐｌ、 ＋６２：４！１〜５
４（８）Ｉｌａｎａｌ＋ａｎ、 Ｉ）、、 ｌり８３
． Ｊ、 ＭＯＩ、 Ｂｉｏｌ、 １６６：５５７
５８０゜ （１））由＋ａｎｇ、 Ｔ、Ｔ１Ｍａｌｋｔ＋、
Ｉｔ、、 ａｎ（ｌ Ｆ（！ｒｒ＋＋＋、ｔｉ、
Ｊ。
Ｊ、、 Ｈ２Ｏ２，Ｍｏ１ｃｃ、 Ｍｉｃｒｏｂ、
３（２） ： ｌ！＋７７−２０５（ｔｏ）＋＋Ｉ
ｋｅ、 Ｉｆ、、 ａｎｄ Ｆｅｒｒ＋４＋電１
． Ｊ、Ｊ、、 目）８４゜１”ｒｏｅ、ＮａＬＩ
、 ＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｌｌ５Ａ、 ８１
： ３５５７−３５６１；（目）Ｍａｌｋｃ、 Ｉ
ｌ、 、 Ｒａａ、 １４． 、 ｐｕｌ（目’（＋ｒ
ｒｅ１．ｔｉ、 Ｊ、、１． 。
３（２） ： ｌ！＋７７−２０５（ｔｏ）＋＋Ｉ
ｋｅ、 Ｉｆ、、 ａｎｄ Ｆｅｒｒ＋４＋電１
． Ｊ、Ｊ、、 目）８４゜１”ｒｏｅ、ＮａＬＩ
、 ＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｌｌ５Ａ、 ８１
： ３５５７−３５６１；（目）Ｍａｌｋｃ、 Ｉ
ｌ、 、 Ｒａａ、 １４． 、 ｐｕｌ（目’（＋ｒ
ｒｅ１．ｔｉ、 Ｊ、、１． 。
１９８５、 Ｇｅｎｅ ３４ ： ３５７−３６２；
（１２）Ｍａ旧ａＬｉｓ、 １１１’ｒｉｓｃＬ、 １
：、Ｆ、、＋ｔｎｔｌ＋ｔｎｔｌ Ｓａｇｌｌ＋ｒｒｏ
＋ｋ。
（１２）Ｍａ旧ａＬｉｓ、 １１１’ｒｉｓｃＬ、 １
：、Ｆ、、＋ｔｎｔｌ＋ｔｎｔｌ Ｓａｇｌｌ＋ｒｒｏ
＋ｋ。
Ｊ、 ｌり８２． Ｃ０Ｉ（Ｉ Ｓｐｒｉｎｇ
１ｌａｒｂｏｒ １．ａｂｏｒａｔｒｙ。
１ｌａｒｂｏｒ １．ａｂｏｒａｔｒｙ。
（ＪＳ＾；
（＋３）ＭｃＧｒａｔｌ＋、 Ｋ、ＧｌＺｅｒｒｒｅｎ
、 １１．、＾１６ｘａｎｄｅｒ。
、 １１．、＾１６ｘａｎｄｅｒ。
Ｊ、、 Ｋａｐｌａｎ、 Ｋ、、 ａｎｄＰａｌ、Ｌｃ
ｒｓｏｎ、 Ｉｉ、Ｊ、、 Ｉり８５゜Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｃ１１ｎ、Ｉｓ＊ｕｎｏ＋、７６ ： ４５３−４５
７・（１４）Ｍｕｌｌｅｒ、Ｊ、、Ｒｅ１ｎｅｒｔ、Ｉ
Ｉ、、ａｎｄ Ｍａｌｋｅ、１１．。
ｒｓｏｎ、 Ｉｉ、Ｊ、、 Ｉり８５゜Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｃ１１ｎ、Ｉｓ＊ｕｎｏ＋、７６ ： ４５３−４５
７・（１４）Ｍｕｌｌｅｒ、Ｊ、、Ｒｅ１ｎｅｒｔ、Ｉ
Ｉ、、ａｎｄ Ｍａｌｋｅ、１１．。
１９８９，１ｌｏｕｒｎａｌ ｏｒ Ｉ３ａｃｔｃｒ
ｉｏｌｏｇｙ、 Ａｐｒ、： ２２０２２２０８゜ （１５）Ｒａｎｃｌ、１１１． Ｋ、、 Ｇａ１ｒ
ｏｎｄ、 ０．１１．、 Ｓｔ、ｏｒｆｅｌ、
Ｓ、。
ｉｏｌｏｇｙ、 Ａｐｒ、： ２２０２２２０８゜ （１５）Ｒａｎｃｌ、１１１． Ｋ、、 Ｇａ１ｒ
ｏｎｄ、 ０．１１．、 Ｓｔ、ｏｒｆｅｌ、
Ｓ、。
５ｃｂａｒｌ’、Ｓ、、Ｉｌｉｇｕｃｂｉ、Ｒ，，１ｌ
ｏｒｎ、Ｇ、ＴｌＭｕｌｌｉｓ、 に、１３．、
ａｎｄ Ｅｒ１ｉｃｂ、 Ｉｆ、Ａ、、 ＋９８８
゜５ｃｉｅｎｃｅ ２３９ ： ４８７−４９１；（１
６）Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、、 Ｎ１ｃｋｌｅｒ、
Ｓ、、 ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ、 Ａ。
ｏｒｎ、Ｇ、ＴｌＭｕｌｌｉｓ、 に、１３．、
ａｎｄ Ｅｒ１ｉｃｂ、 Ｉｆ、Ａ、、 ＋９８８
゜５ｃｉｅｎｃｅ ２３９ ： ４８７−４９１；（１
６）Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、、 Ｎ１ｃｋｌｅｒ、
Ｓ、、 ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ、 Ａ。
Ｋ、、 ＋９７７、 Ｐｒｏｃ、 ＮａＬｌ、＾
ｃａｄ、Ｓｅｉ、 ＵＳＡ ７４ ：５’１６３−５
４６７； （１７）Ｔｏｓｂｉｎ、 Ｉｆ、、 ５Ｌａｌ＋ｅ
ｌ ｉｎ、 ■、、 ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、
Ｊ、。
ｃａｄ、Ｓｅｉ、 ＵＳＡ ７４ ：５’１６３−５
４６７； （１７）Ｔｏｓｂｉｎ、 Ｉｆ、、 ５Ｌａｌ＋ｅ
ｌ ｉｎ、 ■、、 ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、
Ｊ、。
＋９７９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ７６ ： ４３５０４３’、）４； （１８）ＷａｌＬｅｒ、 Ｆ、、 Ｓｉｅｇｅｌ、
Ｍ、、 ａｎｄ Ｍａｌｋｅ、 Ｉｆ、。
ＳＡ７６ ： ４３５０４３’、）４； （１８）ＷａｌＬｅｒ、 Ｆ、、 Ｓｉｅｇｅｌ、
Ｍ、、 ａｎｄ Ｍａｌｋｅ、 Ｉｆ、。
Ｉ！１８９． ＮＩＨ二Ｉ、＾ｃｉｄｓ ｌ？ｅｓ、
１７（３）：１２６２；および（１９）ＷｃｓＬＩｕｎ
ｄ、 １．、Ｅ、、 ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、
Ｌ、０．、 １９８５゜Ｔｂｒｏｗ＋ｂｏｓｉｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ３７：２１３−２２３゜
１７（３）：１２６２；および（１９）ＷｃｓＬＩｕｎ
ｄ、 １．、Ｅ、、 ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、
Ｌ、０．、 １９８５゜Ｔｂｒｏｗ＋ｂｏｓｉｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ３７：２１３−２２３゜
第１図はＳＫＣ−２遺伝子を組込んだプラスミドｐＥに
に−３であり、大腸菌のトリゾ［・ファンプロモーター
を有しており、また該遺伝子の３′端にはバクテリオフ
ァージＴ４の終止シグナルを持っていて、発現に対して
＾い安定性を示す。第２図はＳＫＣ−２、ＳＫＣ，ＳＫ
ＧおよびＳＫＡ （７）各遺伝子（７）塩基配列より演
鐸されるアミノ酸配列（１文字式略記号により表示した
もの）の比較を示す。第３図は、ビヒアバストリス（Ｐ
ｉ ｃ ｌ＋ ｉ ａ ７ ）での細胞外および細胞内
の発現にそれぞれ適合したプラスミＦｐＰＩＥＳＫＣ−
４ｔ’３Ｊ： ＴｊフラスミＦｐＰＩＳＫＣ−６ヲ示ｔ
。 特許出願人 セントロデインへニエリアヘネティカ
イ ビオテクノロヒア 代理人 弁理士 片 桐 光 油筒１図 匡で バクテリオファージＴ４ターミネータ−第２図 ０発 ０発 ０発 ０発 ０発 ０発 ０発 アナイセル カストロ ラミーレス エミリオ アマ−ブレ ムニョース・ムニョ ース ワルツリード ブラー ボ マルテイーネス マガリイス カンボス ソマビツラ アリシタ ペドラーサ フエルナンデス ホセ デ へスース デ ラ フエンテ ガ ルシア ルイス サトウルニ ノ エレラ マルチイ ネス キューバ国、シ ブト ９、エン ルベニール １０（ キューバ国、シ。 バケリート、カ キューバ国、シ トウーブレ、ヴ キューバ国、シ エントレ 冴 キューバ国、シ ブト あ、エン キューバ国、シ ブト あ、エン キューバ国、シ１ ントレ ３ ア− ラダラド デ ラ ハバナ、ラウトン、アトレ ボウサ
イ アギレラ、カツレ ボエコテ アビラ、モロー
ン、レパルトツレ フランク パイース ８ ラダラド デ ラ ハバナ、１０ デ オクイーヴオ
ラ、サン ベニ−グツ ７１０ウダツド デ ラ ハバ
ナ、コヒーマル、イ ５、カツレ ホタ １−エへ０５ ウダツド デ ラ ハバナ、プラーヤ、アトレ ３１
イ ３３、カッレ ２８ ９６８ウダツド デ ラ
ハバナ、ブラーヤ、アトレ ３１ イ ３３、カツレ
１８４ ３１１２ウダツド デ ラ ハバナ、ブラー
ヤ、エイ ３ アー ア、カツレ ９６
に−３であり、大腸菌のトリゾ［・ファンプロモーター
を有しており、また該遺伝子の３′端にはバクテリオフ
ァージＴ４の終止シグナルを持っていて、発現に対して
＾い安定性を示す。第２図はＳＫＣ−２、ＳＫＣ，ＳＫ
ＧおよびＳＫＡ （７）各遺伝子（７）塩基配列より演
鐸されるアミノ酸配列（１文字式略記号により表示した
もの）の比較を示す。第３図は、ビヒアバストリス（Ｐ
ｉ ｃ ｌ＋ ｉ ａ ７ ）での細胞外および細胞内
の発現にそれぞれ適合したプラスミＦｐＰＩＥＳＫＣ−
４ｔ’３Ｊ： ＴｊフラスミＦｐＰＩＳＫＣ−６ヲ示ｔ
。 特許出願人 セントロデインへニエリアヘネティカ
イ ビオテクノロヒア 代理人 弁理士 片 桐 光 油筒１図 匡で バクテリオファージＴ４ターミネータ−第２図 ０発 ０発 ０発 ０発 ０発 ０発 ０発 アナイセル カストロ ラミーレス エミリオ アマ−ブレ ムニョース・ムニョ ース ワルツリード ブラー ボ マルテイーネス マガリイス カンボス ソマビツラ アリシタ ペドラーサ フエルナンデス ホセ デ へスース デ ラ フエンテ ガ ルシア ルイス サトウルニ ノ エレラ マルチイ ネス キューバ国、シ ブト ９、エン ルベニール １０（ キューバ国、シ。 バケリート、カ キューバ国、シ トウーブレ、ヴ キューバ国、シ エントレ 冴 キューバ国、シ ブト あ、エン キューバ国、シ ブト あ、エン キューバ国、シ１ ントレ ３ ア− ラダラド デ ラ ハバナ、ラウトン、アトレ ボウサ
イ アギレラ、カツレ ボエコテ アビラ、モロー
ン、レパルトツレ フランク パイース ８ ラダラド デ ラ ハバナ、１０ デ オクイーヴオ
ラ、サン ベニ−グツ ７１０ウダツド デ ラ ハバ
ナ、コヒーマル、イ ５、カツレ ホタ １−エへ０５ ウダツド デ ラ ハバナ、プラーヤ、アトレ ３１
イ ３３、カッレ ２８ ９６８ウダツド デ ラ
ハバナ、ブラーヤ、アトレ ３１ イ ３３、カツレ
１８４ ３１１２ウダツド デ ラ ハバナ、ブラー
ヤ、エイ ３ アー ア、カツレ ９６
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ストレプトキナーゼをコードする遺伝子の単離およ
び発現方法にして、遺伝子として、Ｃ型のストレプトコ
ッカスエクイシミリス （￥Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ￥￥ｅｑｕｉｓｉｍｉ
ｌｉｓ￥）のＡＴＣＣ−９５４２株から単離されたＳＫ
Ｃ−２と命名された新規な遺伝子であって、合成オリゴ
ヌクレオチドＳＫ１、ＳＫ２およびＳＫ３をプライマー
とする遺伝子増幅により得られる遺伝子を用いることを
特徴とし、かつ、該遺伝子の細菌中でのクローニングは
シグナルペプチドの存在または不存在外で行なうことが
でき、その発現は酵母中にて細胞内的または細胞外的に
行なうことができ、かつ形質転換微生物は高度の発現能
を高い安定性をもって示すことを特徴とする方法。 ２、上記のＳＫＣ−２の断片が、合成オリゴヌクレオチ
ドＳＫ１、ＳＫ２およびＳＫ３をプライマーとする遺伝
子増幅により得られ、該ＳＫ１、ＳＫ２およびＳＫ３が
各々次式： ＳＫ１【遺伝子配列があります】 ＳＫ２【遺伝子配列があります】 ＳＫ３【遺伝子配列があります】 で表わされることを特徴とする請求項１の方法。 ３、シグナルペプチドの存在または不存在下にＳＫＣ−
２遺伝子を、宿主細胞でのその形質転換および発現のた
めに適したプロモーターの制御下でＤＮＡ分子中でクロ
ーニングすることを特徴とする請求項１の方法。 ４、上記細胞が細菌である請求項３の方法。 ５、上記細胞が酵母である請求項３の方法。 ６、次式： 【遺伝子配列があります】 に対応することを特徴とする、ストレプトキナーゼをコ
ードするＳＫＣ−２遺伝子のヌクレオチド配列。 ７、細菌中での発現のためのトリプトファンプロモータ
ーおよびＴ４ターミネーターの間に挿入されたＳＫＣ−
２遺伝子を含有するベクタープラスミドｐＥＫＣ３であ
ることを特徴とする組換体ＤＮＡ。 ８、酵母発現ベクターｐＰＳ−７およびｐＮＡＯのそれ
ぞれにＳＫＣ−２遺伝子を挿入することによって得られ
、発現産生物が細胞内的または細胞外的に得られるとこ
ろの、ベクタープラスミドｐＰＥＳＫＣ−４およびｐＰ
ＩＳＫＣ−６であることを特徴とする組換体ＤＮＡ。 ９、ストレプトキナーゼの高度の発現能を示し、かつ良
好な生存性と細胞安定性を維持することを特徴とする形
質転換微生物。 １０、大腸菌Ｗ３１１０株を宿主としてプラスミドｐＥ
ＫＣ３で形質転換することによって得られ、３５０ｍｇ
／ｌ（培地）より大きいストレプトキナーゼ発現能を高
い安定性をもって示すことを特徴とする請求項９の形質
転換微生物ＨＳＫ−Ｍ。 １１、ピヒアパストリス（￥Ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ￥）ＭＰ−３６変異株を宿主として細胞外発現
できるようにプラスミドｐＰＥＳＫＣ−４で形質転換す
ることによつて得られ、１．２ｇ／ｌ（培地）より大き
いストレプトキナーゼ発現能を示すことを特徴とする９
項記載の形質転換微生物ＭＳＫ−Ｍ４。 １２、ピヒアパストリス（￥ｐｉｃｈｉａ￥￥ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ￥）ＭＰ−３６変異株を宿主として細胞内発現
できるようにプラスミドｐＰＩＳＫＣ−６で形質転換す
ることによって得られ、１．０ｇ／ｌ（培地）より大き
い発現能を示すことを特徴とする９項記載の形質転換微
生物ＭＳＫ−Ｍ６。 １３、細菌または酵母中でＳＫＣ−２遺伝子を発現する
ことにより得られる産生物。 １４、次式： 【遺伝子配列があります】 で表わされるヌクレオチド配列を包含する組換体ＤＮＡ
。 １５、請求項１４に定義される組換体ＤＮＡの発現産生
物。 １６、請求項１４に定義される組換体ＤＮＡの発現によ
って得られるストレプトキナード活性を有する発現産生
物と、少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤、担
体または賦形剤とを含有してなる医薬組成物。
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|---|---|
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