JPH0228192A - 新規オリゴ糖及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、糖鎖の研究やビフィズス菌の増殖促進剤に利
用可能な新規オリゴ糖及Ｖ製造方法に関するものである
。

〔従来の技術〕

最近、動物細胞表層に存在している糖タンパク質、糖ペ
プチドや糖脂質が、生体内でｍ要な生理学的機能を持っ
ているということが明らかになりつつある。例えば、ｍ
胞表面のスフィンゴ糖脂質のいくつかは、血液型の特異
性に関与し、また臓器・組織の特異性にも関係している
。

さらに、細胞や組織の発生・分化において細胞間認識部
位として重要な役割を演じている。ある峠のタンパク質
では、糖鎖構造の変化でその糖タンパク質の老朽化を感
知し、その代謝回転をルＩ整する機能が知られている。

また、細胞表面にある糖ダ１は、〃ン化に伴ってその構
造が大きく変化するため、〃ン細胞と正常細胞を区別す
るための重要なマーカーとなる。このように、糖鎖のも
つ生理学的機能が明らかにされるにつれ、その研究はま
すます盛んになって米でいる。

一方、ビフィズス菌は、人間の腸内に／Ｆ：をする有用
菌であり、それらが人間に及（ｒす生理学的及び栄養学
的な各種の有効性が報告されている。例えば、腸内腐敗
の抑制作用、ビタミンＢ及びＢ２の合成作用やタンパク
貿代謝に対する作用等が知られている。そのようなこと
から、ビフィズス菌の増殖を促進する物質について多く
の研究がなされている。最近では、腸内におけるビフィ
ズス菌の生育に重要な因子は、糖類て゛あるとの認識が
高まり、種々のオリゴ環をビフィズス菌の増殖促進因子
として利用する研究が嵜んになって来ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、上述した様な現況に鑑み、オリゴ環につ
いて鋭意研究している過程で、新規オリゴ環を見出し、
分離・精製後、その構造を解析し本発明を完成するに至
った。

以下に、本発明の詳細な説明する。

〔発明の構成〕

本発明における新規オリゴ環は、下記式（１）で示され
るＯ−β−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→６）−〇−β−Ｄ−ｆｆラク）ビ
ラ／シル−（１→４）−Ｄ−グルコース及び、下記式（
２）で示されるＯ−β−Ｄ−７７’ラクトピラノシルー
（１→４）−（〇−β−２−７セトアミドー２−デオキ
シ−Ｄ−グルコビラ７シルー（ｌ→６）ＬＤ−グルコー
スである。

また、これら２秤類の新規オリゴ環の製造方法は、Ｎ−
アセチルキトオリゴ糖と乳糖との渭、合物にβ−Ｎ−ア
セチルへキソサミニグーゼを作用させることを特徴とす
るものである。

Ｎ−アセチルグルコサミンと７（、糖の結合したオリゴ
環は、特開昭５９−１１１９０にみられるＯ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−（１→４）−（０−β−２−アセ
ト７ミドー２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→２））−Ｄ−グルコースが知られているが、このオリ
ゴ環は　Ｎ−７セチルグルコサミン残基が乳糖のグルコ
ース残基の２位の炭素原子と結合している。ｔχで、本
発明の２種類のオリゴ環とはｈη造上異なる７ 次に、本発明の構造について説明する。

（イ）オリゴ環の畢今度 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖、セロオリゴ環及びラミナリ
オリゴ糖を標準物質として、トーヨーパールＨＷ−４０
によってグルロ過ヲ行った結果、本発明に係わる２種類
のオリゴ環は、標準オリゴ環の３糖類両分に一致した溶
出位置を示したことがら３種類であると推定した。

（ロ）枯成糖 これらのオリゴ環にそれぞれβ−Ｎ−アセナルへキソサ
ミニグーゼを加え、４０°Ｃで反応させ、そのときに生
成した糖を経（時変化をおって高速液体クロマトグラフ
ィーで分析した結果、生成糖とそのモル比は、８．２４
及び４８時間のいずれにおいてらＮ−７セチルグルフサ
ミン：ラクトース＝１：１であることがら、これら２種
類のオリゴ環は両者とも１分子のＮ−アセチルグルコサ
ミンと１分子のラクトースからなる３糖類であることが
確認された。

（ハ）α結合、β結合の区別 これらのオリゴ糖は、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダ
ーゼによってＮ−７セチルグルフサミンとラクトース（
二分角ＩＦされることから、β−結合であることが確認
された。また、表−Ｉに示した”Ｃ−Ｎ　Ｍ　Ｒの解析
結果もβ−結合であるということを裏付けている。

（ニ）糖の結合様式 これら２種類のオリゴ糖についてそれぞれメチル化分析
を行った結果、式（１）のオリゴ糖では、３．４．６−
トリー〇−メチル−２（メチルアセトアミド）−Ｄ−グ
ルシトール、２．３．４−トリー〇−メチルーＤ−７ラ
クチトール、及び２．３．６〜トリー〇−メチル−Ｄ−
グルシトールの３種のフルジトールアセテートが検出さ
れたことから、Ｎ−７セチルグルコサミンがラクトース
のがラクトース残基の６位の炭素原子と結合しているこ
とが確認された。

また、式（２）のオリゴ糖は、２．３、・１１６−チト
ラー○−メチルーＤ−ガラクチトール、３．４．６−ト
リー〇−メチル−２（メチルアセトアミド）−Ｄ−グル
シトール、及Ｖ２．３−ジー○−メチルーＤ−グルシト
ールの３種のアルク）−ルアセテートが検出されたこと
から、Ｎ−アセチルグルコサミンがラクトースのグルコ
ース残基の６位の炭素原子と結合していることが確認さ
れた。また、表−１に示した１３Ｃ−ｐＪＭＲＬ：ｒ）
解析結果ら、上記結果をうまく藷、明するものであった
。。

以上述べた構造解析結果から、本発明に係わる２種類の
オリゴ糖は、それぞれ式（１）に示した〇−β−２−７
セトアミドー２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシル−（
１→６）−〇−β−Ｄ−７７ラクトビラノシルー（１→
４）−Ｄ−グルコース及び、式（２）で示した０−β−
Ｄ４ラクトピラノシル−（１→４　）−＋Ｏ−β−２−
７セトアミドー２−デオキシ−Ｄ−グルコビラノシルー
（１→６）ｉＤ−グルコースであると同定し得る。

次に、これらオリゴ糖の性質を示す。

（Ａ）溶解性 これらオリゴ糖は、いずれら水に易溶であるが、アセト
ン・クロロホルム・ヘキサン等には不溶である。

（Ｂ）呈色反応及び紫外吸収 ７エ／−ルー硫酸法及びアルカリ性硝酸銀反応に対して
陽性を示し、２１０〜２２０　ｎ　ｍにＮ−７セチルグ
ルコサミン残基のア七ドアミド基に由来する紫外吸収を
示す。

（Ｃ）色調 これらオリゴ糖を乾燥粉末化したらのは、いずれも白色
を示ｒ。

（Ｄ＞酸性、塩基性及び中性の区別 これらオリゴ糖は、いずれら中性を示す。

以下、本発明に係わるオリゴ糖の製造方法について説明
する。

本発明では、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖と乳糖の’ｔ？
？：合物を基質とし、β−Ｎ−アセチルへキソサミニグ
ーゼを作用させるが、ここで用いるＮ−アセチルキトオ
リゴ糖は、Ｎ−７セチルキトビオース、Ｎ−７セチルキ
トトリオース、Ｎ−７セチルキトテトラオース、Ｎ−７
セチルキトベンタオース、Ｎ−７セチルキトヘキサオー
スなどをそれぞれ単品で用いても、またこれらの混合物
、さらには単糖であるＮ−７セチルグルコサミンを含む
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖混合物のいずれであっても良
い、また、ここで用いる基質は、Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖を１〜３０重量％及び乳糖を２〜４０庫量％含む混
合物として使用し、　（１１−１は、３〜８に！を持し
てβ−Ｎ−アセチルへキソサミニグーゼを１０〜６０℃
の温度で作用させる。このときに添加するβ−Ｎ−アセ
チルヘキソサミニダーゼの酵素量は、１〜２００単位／
１ｆｉ１が良い。また、反応時間は、これら糖転移オリ
ゴ糖の収量が最も高くなる時間を適宜選択するのが好ま
しく、通常は３〜７２時間である。また、本発明で用い
るβ−Ｎ−７セチルヘキンサミニグーゼは、Ｎ−アセチ
ルキトオリゴ糖を加水分解して中成するＮ−７セチルグ
ルコサミン残基を乳糖へ転移する作用を有するものであ
れば何れの起源のものであってもよい。例えば、微生物
由来のβ−Ｎ−７セチルへキソサミニダーゼが」二げら
れる。また、β−Ｎ−アセチルグルコサミニグーゼやβ
−Ｎ−アセナル〃ラクトサミニグーゼであっても、上述
の作用を示す酵素であればよい。

本発明では、上記の酵素反応によってＮ−７セチルグル
フサミンがラクトースに転移し、本発明に係わる２種類
のオリゴ糖を含む２Ｒ１合物が生成する。この反応液を
９０°Ｃ以上で１〜２分間加熱することにより酵素反応
を１ヒめ、これを活性炭カラムに通液して反応液中のオ
リゴ糖のみを吸着させる。この吸着処理は、上記反応混
合物中の分解により生成したｌｌ糖を除去し、オリゴ糖
両分のみを得るために行なわれる。オリゴ糖を吸着させ
た活性炭カラムは、十分量の水で洗浄して単糖を完全に
除去し、続いて吸着したオリゴ糖を５〜４０％エタノー
ル水溶液を用いて溶出する。このようにして得られる溶
出液には本発明の目的とするオリゴ糖のほか乳糖やＮ−
アセチルキトオリゴ糖なども含有しているので、本発明
ではさらに次のような工程を用いてｖｉ製する。

上記溶出液を減圧濃縮した後、これをゲルロ過削である
バイオデルＰ−２やバイオデルＰ−４カラムに）ｒ１開
し水で溶出する６本発明のオリゴ糖は、フェノール−硫
酸法と２１０〜２２０ｎｍに紫外吸収を示すことから、
これらの検出法でいずれら陽性になる両分を集める。こ
の溶出両分は、減圧濃！ａ後、トーヨーパールＩ−Ｉ　
Ｗ−４０カラムに展開し、さらに精製を行う。上記の検
出法で陽性となる両分を集め、凍結乾燥し、本発明に係
わる２種類のオリゴ糖を含む混合物を＋３る７これらの
オリゴ糖は、さらに分取用の高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて分離、精製して本発明の２種類のオリゴ糖を
得ることができる。

本発明の方法において、特にビフィズス菌の増殖促進剤
として利用する場合には、式（１）及び式（２）のオリ
ゴ糖のはかＮ−アセチルキトオリゴ糖や乳糖を含んだ混
合物を粉末乾燥化して適用することも可能である。

〔発明の効果〕

本発明の新規オリゴ糖は、ＷＩ額の研究やビフィズス菌
の増殖促進剤として利用することのできるものである。

〔実施例〕 以下に実施例をあげてさらに具体的に説明するが、かか
る説明が何ら限定されるものではないことは勿論のこと
である。

Ｎ−７セチルキトビオ一ス１０ｇと乳糖９ｇを５０＋ａ
Ｍ酢酸援衝液（ｐ）（４，０）　４０鴫１に溶解し、メ
カルディア・オリエンタリスＩ　Ｆ’　０１２８０６か
ら′Ａ製したβ−Ｎ−アセチルへキソサミニダーゼ２　
、０００４’ｌｔ位を加え、２５°Ｃで２０時間反応さ
せた。酵素反応を加熱して停止上させ、これに水６０ｍ
　ｌを加え希釈した。

この溶１１００ｍｌをあらかじめ水で平衡化しｒこ活性
炭−セライ）　ｌｌ：１　）カラム（直径４ｃｍ、高さ
５０ｃｍ）に通液して、オリゴ糖を吸着させた。

このカラムを２．５１７ツトルの水で洗浄した後、吸着
したオリゴ糖を２０％エタノール水溶液２．５リツトル
で溶出した。得られた溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥し
て白色のオリゴ糖粉末８ｇを得た。

次に、このオリゴ糖（１，ＯＲ）を水１０＋ｏｌに溶解
後、あらかじめ水で平衡化したバイオデル　Ｐ−２カラ
ム（直径５ｃＩＩ１．高さ１８４ｃ鰺）に通し、デルロ
過ヲ行った。このとき、カラムは、ジャケットを用いて
５５°Ｃに保った。オリゴ糖を水を用い、流速１２０＋
ｉ　Ｉ　／　Ｉｔ”／で溶出し、溶出液を１０ｍ１づつ
分取した。

糖をフェノール−硫酸法と２１５ｎ翔における吸光度の
測定によって検出し、目的とするオリゴ糖両分を集めた
。なお、この操作は、８回繰り返した。溶出液を減圧濃
！２！後、凍結乾燥して白色のオリゴ糖粉末３．６ｇを
得た。

オリゴ糖（０，９ｇ）を水１０ｕ＋ｌに溶解し、水で平
衡化したトーヨーバールＨＷ−４０Ｓカラム（１０径５
ｃＩ＠、高さ１８４ｃ＋ａ）に展開した。オリゴ糖を水
を用い、流速８０ｍ　ｌ　７時で溶出した。）容量層を
１０　ｍ　ｌづつ分取し、上述の方法で糖を検出し、目
的とするオリゴ糖を集めた。なお、この操作は、４回繰
り返した。オリゴ糖両分を減圧濃縮後、凍結乾燥して白
色のオリゴ糖粉末１．４ｇを得た。

さらに、このオリゴ糖画分に混在している式（１）と式
（２）のオリゴ糖を分離するため、下記の条件にて高速
液体クロマトグラフィーを行った。

カラム：Ｙ　Ｍ　Ｃ−Ｐ　ａｃｋ　Ｐ　Ａ　−４３（２
０Ｘ　２５０＋Ｉ１ｍ）移動相：アセトニル：水＝６５
：３５〜７０：３０流速：９．！ｌｈｌ／分 検出：示差屈折計 サンプル％ｌ：５０−１００＋ｎｇ この分ｇｌｔ操作により式（１）のオリゴ糖０．　ｚｇ
と式（２）のオリゴ糖０．２．を得た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示され、Ｒ＿１がＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｒ
   ＿２が水素であるＯ−β−２−アセトアミド−２−デオ
   キシ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｏ−β−Ｄ
   −ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース及
   び、Ｒ＿１が水素、Ｒ＿２がＮ−アセチルグルコサミン
   残基であるＯ−β−Ｄ−ガクトピラノシル−（１→４）
   −｛Ｏ−β−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グ
   ルコピラノシル−（１→６）｝−Ｄ−グルコース。
2. （２）Ｎ−アセチルキトオリゴ糖と乳糖との混合物に糖
   転移能を有するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを
   作用させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   のオリゴ糖の製造方法。