JPH0228320B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH0228320B2
JPH0228320B2 JP56152807A JP15280781A JPH0228320B2 JP H0228320 B2 JPH0228320 B2 JP H0228320B2 JP 56152807 A JP56152807 A JP 56152807A JP 15280781 A JP15280781 A JP 15280781A JP H0228320 B2 JPH0228320 B2 JP H0228320B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
guanase
reaction
xanthine
hydrogen peroxide
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP56152807A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS5856699A (ja
Inventor
Nobumoto Chikasawa
Setsuo Fujii
Toshiharu Muraoka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maruho Co Ltd
Original Assignee
Maruho Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Maruho Co Ltd filed Critical Maruho Co Ltd
Priority to JP56152807A priority Critical patent/JPS5856699A/ja
Priority to EP82108856A priority patent/EP0075894A1/en
Priority to CA000412233A priority patent/CA1203154A/en
Priority to US06/424,182 priority patent/US4550076A/en
Publication of JPS5856699A publication Critical patent/JPS5856699A/ja
Publication of JPH0228320B2 publication Critical patent/JPH0228320B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 (A) 発明の背景 本発明は、体液中のグアナーゼ活性の迅速定量
法に関する。
グアナーゼ（guanase）は、生体内のヌクレオ
シド代謝系において、グアニンをキサンチンに変
換する化学反応を触媒する重要な酵素である。高
等動物では、本酵素により生成せしめられたキサ
ンチンは、キサンチンオキシダーゼの作用で尿酸
に酸化されるが、下等動物（昆虫など）では、さ
らにアラントインにまで分解された後、尿として
排出される。
今日、診断医学の進歩と共に血清等の体液の病
理学的検査が重視されるようになり、肝疾患にお
いてもトランスアミナーゼ（GOT、GPT）、ア
ルカリフオスフアターゼ及びγ−グルタミル・ト
ランス・ペプチダーゼ（γ−GTP）の検査が広
く行われている。これらの中、トランスアミナー
ゼ及びアルカリフオスフアターゼは、肝臓以外の
組織中に広く分布しているため肝疾患のみの指標
となりにくい。この点、後者のγ−GTPは肝疾
患に対し特異的であることが知られているので診
断的価値が高い（Szasz、G.、Rosenthal、P.＆
Fritzsche、W.；Dt.Med.Wschr.、94、pp.1911
〜1917（1969））。このγ−GTPも、胆道障害を鋭
敏に反映するため慢性肝炎、肝硬変及び閉塞性黄
疽に対しては有力な指標となるが、急性肝炎に際
しては殆んど変動しない（藤沢 洌：癌と化学療
法、５、suppl.、373〜379（1978））ので、急性
肝炎の指標としては役立たない。しかるに、グア
ナーゼ活性は急性ウイルス性肝炎に際して特異的
に上昇し、慢性肝炎や肝硬変時には殆んど変動し
ないことが知られている（Whitehouse、J.L.、
Knights、E.M.、Santoz、C.L.＆ Hue、A.C.：
Clin.Chem.、10、p.632（1964）：Bel、A.etal.：
Presse.Med.、78、pp.495〜499（1970））ので、本
酵素活性の検定は急性ウイルス肝炎の診断上有力
な手懸りを与える。
さらに、今日大きな社会問題と化している輸血
後肝炎は、その大部分がnon−Ａ及びnon−Ｂ型
ウイルスにより発生するため適当なスクリーニン
グ法が未だ見つかつていない。しかし最近グアナ
ーゼ活性を指標としてスクリーニングすると前記
急性ウイルス性肝炎の発生を相当予防できるとい
う成績が得られているので、予防医学上も本酵素
測定の意義が増大している。
ところで、本酵素に対する診断的意義が高まる
につれ、その測定手段の能率化（自動化）に対す
る要望も高まつているが、後述するように適当な
自動化手段はこれまで存在しなかつた。それは、
本酵素のヒト血清正常値が低いため、その測定に
長時間を要するという事実である。即ち、今目の
検査技術においては、短時間内に多量の試料を処
理する必要上、高度に自動化された自動分析装置
の導入が活発に行われているが、本装置によれ
ば、１つの試料毎に、平行して多種の検査を同時
に10〜15分以内に完了するように構成されている
ため、ある特定のデータ（この場合ではグアナー
ゼのデータ）を得るために全体の測定時間を延長
するのは実際上不可能であり、仮にできたとして
も、それでは折角高価な自動機械を導入した意味
がないことになる。この理由から、グアナーゼの
測定は要望されながらも日常検査として普及する
には至らない。本発明は従来本酵素測定手段とし
て用いられて来た公知方法を改良することによつ
て、精度に影響を与えることなしに測定所要時間
を飛躍的に短縮し、延いてはこれによりグアナー
ゼの測定を自動化する途を啓こうとするものであ
る。
ところで、従来から知られているグアナーゼの
代表的な測定方法としては以下記載の諸方法があ
る。
ラウシユ−ノリス法（Roush.A.＆ Norris、
E.R.Arch.Biochem、29、pp.124〜129
（1950））：本法はグアニンとキサンチンの吸光
度の相違を利用し、グアニンの減少量を測定す
るものである。ヒユー−フリー法（Hue、A.
＆ C.Free、A.H；Clin.Chem.11、pp.708〜
715（1965））は本法の改良法で、試料中のキサ
ンチンオキシダーゼの影響を除くため、ホウ酸
塩緩衝液を用いて測定する。吸光強度（分子吸
光係数）（ε）＝0.535×104 カルツカー法（Kalcker、H.M.；J.Biol.
Chem.167、pp.429〜444、445〜459（1957））： 本法はグアニンより生成したキサンチンにキ
サンチンオキシダーゼを作用させ、生成する尿
酸量を吸光値（290nm）の変化により追跡する
方法である。ε＝1.23×104 アンモニア定量法 (1) エリス・ゴールドバーグ法（Ellis、
Graham ＆ Goldberg、David M.；
Biochem.Med.、６、pp.380〜391（1972））：
本法ではグアニンよりキサンチンを生成する
際に傍生するアンモニア量を測る。アンモニ
アの測定は、グルタメート・デヒドロゲナー
ゼの存在下にα−ケトグルタール酸と
NADH（還元型ニコチン酸アミドアデニンジ
ヌクレオチド）を反応させ、消費される
NADH量の変化を追跡する。ε＝0.622×104 (2) 伊藤ら法（伊藤進、香川正博、神原勉、及
び村上剛；臨床病理、23、pp.733〜736
（1975））：本法ではアンモニア量をインドフ
エノール反応を利用して定量する。ε＝1.96
×104 過酸化水素定量法 本法では、カルツカー法で傍生する過酸化水
素量を測る。これには過酸化水素測定手段によ
り以下の２法がある。
(1) フリツツら法（Heintz Fritz、Reckel
Sylvia ＆ Kalden Joachim.R.、
Enzyme、24、pp.247〜254（1979））：本法で
は過酸化水素にエタノールの存在下でカタラ
ーゼを作用させ、生成するアセトアルデヒド
にさらにNAD（酸化型ニコチン酸アミドアデ
ニンジヌクレオチド）及びアセトアルデヒド
ロゲナーゼを作用させることにより生成する
NADH量の変化を追跡する。ε＝0.622×104 (2) 杉浦ら法（加藤憲二、足立哲夫、伊藤吉
将、平野和行及び杉浦衛：日本薬学会編、生
体成分の分析化学シンポジウム講演要旨集、
pp.41〜44（1979））： 本法では過酸化水素に３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）と
ジメチルアニリン（DMA）とペルオキシダ
ーゼとを反応させ、生成するインダミン色素
量を比色法により定量する。ε＝3.37×104 ラジオアイソトープ法（Van Bennekom、
C.A.、Van Laarhoven、J.P.、De.Bruyn C.
H.M.M.＆ Oei、T.L.、J.Clin、Biochem.16、
pp.245〜248（1978））：本法は 14Cをラベルした
グアニンを用い、生成したキサンチンを電気泳
動で分離し、その放射能をシンチレーシヨンカ
ウンターで測る方法である。この方法は感度が
高いが、危険な 14Cを用いるので特殊な設備や
専門技術者が必要であり、このため一般検査法
としては利用しにくい。
以上のように多くの方法があるが、ヒト血清中
のグアナーゼ活性は通常１〜2IU／（1IU＝37
℃で１分間当り1μmolの基質を分解する活性）に
過ぎないので、15分程度の反応時間内に測定を完
了するためにはε値が２×104以上であることが
要求される。この条件を満足する方法は前(2)の
杉浦ら法だけであるが、この方法は、血清中に存
在するカタラーゼの作用を排除できないため真の
グアナーゼを測定できないという本質的な欠点を
有する。即ち、阻害剤として加えられるアジ化ナ
トリウム（ナトリウムアジド）は、完全にはカタ
ラーゼ活性を阻害しないため、本法のように長時
間に亘つて過酸化水素とカタラーゼが共存する条
件下ではその影響を無視できない。さらに、本法
では過酸化水素を安定化させるためグアナーゼ反
応（基質の分解反応）をPH6.2で行つているが、
グアナーゼの至適PHは8.0附近であるから、上記
PHでは至適PH時の60％程度の活性しかなく、この
ことが反応時間を延長させる原因となつている。
(B) 発明の内容 本発明者は上記従来測定手段における問題点を
解決し、これらを自動測定法に適合せしめるべく
鋭意努力した結果、15分以内に定量が可能で、し
かも精度及び試薬の安定度共に優れた測定手段を
創出することができた。本発明方法は必須の工程
として以下の３段階を含む。
() グアナーゼ反応段階（キサンチン生成段
階）基質グアニンの緩衝溶液（PH７〜９）に試
料溶液を加え、10〜30分間インキユベイトして
試料中のグアナーゼにより基質をキサンチンと
アンモニアとに分解する工程。
() 過酸化水素生成段階：（）の反応液にキ
サンチンオキシダーゼの緩衝溶液（PH７〜９）
を加え、キサンチンを尿酸と過酸化水素とに分
解する工程。
() 発色反応段階：の溶液にMBTH、アニ
リン誘導体及びペルオキシダーゼを同時に作用
させ、インダミン色素を生成させる工程。
以上の各工程は下記の化学式により具体的に示
される。
以上の発明において、最重要なことは(i)工程が
（）グアナーゼ反応、（）過酸化水素生成反応
及び（）発色反応の３ステツプから構成されて
いる点及び(ii)第ステツプのグアナーゼ反応がPH
７〜９、好ましくは約PH８の近辺で行われること
である。前述の杉浦ら法はこのグアナーゼ反応を
次の過酸化水素生成反応と同時的に行わせるた
め、生成した過酸化水素の安定化を図る目的でグ
アナーゼの至適PHを離れたPH6.2で行つている関
係で反応に長時間を要し、しかもカタラーゼの影
響を受けて正確な測定が期待できない。これに反
し、本発明では反応をステツプととに分割し
て行うため、第工程をグアナーゼの至適PHであ
るPH８附近で行うことが、これにより反応時間を
15分以内に短縮することが可能となり、延いては
本定量に自動分析装置を適用するのを可能ならし
める最大の理由となる。
次に、本定量手段を臨床化学検査のルーテイン
にのせるため必要なもの一つの条件は、発色液の
安定化と検量線の直線化である。即ち、第段階
で使用されるミルク起源のキサンチンオキシダー
ゼは、普通のオキシダーゼと異つて直接過酸化水
素を生成させることはなく、中間で一旦スーパ
ー・オキサイド・ラジカル（O2）を生成させた
後、溶媒中で後者を過酸化水素に変換させる機能
を持つ。従つて、中間のスーパー・オキサイド・
ラジカルが過酸化水素に変化する際、電子受容体
が存在するとこれに電子を供与する（つまり電子
受容体を還元する。）。このため、過酸化水素生成
反応系と発色反応系とが併存すると（換言すれば
過酸化水素生成反応と発色反応とを同時に行う
と）、ペルオキシダーゼの作用で折角生成した色
素が還元され褪色し、この結果、検量線に曲がり
を生じるようになる。しかしこの欠点を避けるた
めステツプとステツプを分割すると、血清中
のカタラーゼなどの作用を受けて真のグアナーゼ
値を測定できなくなるという懸念が生まれる。そ
こで種々研究の結果、発明者は基質反応液中にカ
タラーゼ阻害剤を加えることによつて試料中のカ
タラーゼによる悪影響を実質的に回避できること
を見出した。故に、第段階の過酸化水素生成反
応がカタラーゼ阻害剤の存在下に行われることも
目的上必要な条件である。なお、生体試料分析技
術上の常識として、本反応も可及的急速に進行す
るのが望ましいが、第段階がグアナーゼの至適
PH域内で行われるため、充分な量のキサンチンが
生成しているので、通常１分以内の短い反応時間
で足りる。
本発明の定量法は原則として自動分析装置を利
用して行われる。今日数社から自動臨床化学分析
装置が市販されているが、これらはいづれも間欠
的に回転するエンドレスチエーン又はデイスクに
一定の間隔で多数の試料管を取りつけ、これらの
試料管に一定量づつの試料（血液標本）及び試薬
を加えて37℃で一定時間インキユベイトした後、
測定ステイシヨンで分光々度計を用いて計測し、
この計測結果をデータ処理装置を介してプリント
アウトするか又は／及び必要に応じたCRTデイ
スプレイに画像として表示する一方、測定の終つ
た試料管を洗浄、乾燥して次の試料採取に備える
過程を自動的に反復するように構成されている。
この操置では前述のように、採取された単位試料
毎にアルカリフオスフアターゼ、グルタミン酸オ
ギザロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ、ロイシンアミノペ
プチダーゼ、トリグリセライド、グルコースなど
多数の項目について平行的に測定を行い、試料の
採取より測定の完了まで15〜30分間のサイクルで
終らせるように設計されているので、多数の項目
中の１項目についてのみ測定時間を変更するよう
なことは操作的に不可能である。従つて、現存の
各社のカタログにもグアナーゼの測定については
記載されていない。しかるに本発明では、前記各
条件を採用したことによりグアナーゼの測定を自
動化することが可能となつた。故に、測定を自動
分析機を利用して行うことは発明の重要な目的の
一つである。しかしながら、発明の本質はグアナ
ーゼの測定を迅速かつ正確化することであつて、
この利点は手動分析でも当然顕われるものである
から、自動分析機の利用自体は発明の必須の構成
ではない。
第段階のキサンチン生成段階（グアナーゼ反
応段階）では、基質グアニンを溶かしたアルカリ
溶液とマクイルバイン緩衝液（リン酸二ナトリウ
ム−クエン酸）及びカタラーゼ阻害剤（例えばア
ジ化ナトリウム）を用時混合して基質緩衝液とす
る。緩衝液のPHは７〜９の領域内、殊にグアナー
ゼの最高活性域であるPH８附近であるのが好まし
い。このPHではグアナーゼ反応は37℃の恒温槽内
で15分以内に完了する。阻害剤としてはシアン化
合物、アジド化合物又はフツ素化合物等の酵素の
鉄ポルフイリン活性中心に可逆的に結合する化合
物が使用されるが、グアナーゼへの影響を考慮し
てアジ化ナトリウムのようなアジ化化合物を用い
るのが好ましい。
第段階の過酸化水素生成反応では、キサンチ
ンオキシダーゼの硫酸アンモニウム懸濁液と第
段階で用いたと同様の緩衝液が第段階の反応液
に添加され、短時間（例えば１分間）放置され
る。カタラーゼ阻害剤は本段階で加えられてもよ
い。
第段階ではMBTH及びアニリン誘導体のハ
ロゲン水素酸塩（例えば塩酸塩）がペルオキシダ
ーゼと共にマクイルバイン緩衝液（PH3.0）中に
用時混合され、第段階の反応液に加えられる。
反応はこの場合も１分以内に終了する。アニリン
誘導体としてはＮ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，
Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピ
ルアニリンの如きＮ，Ｎ−ジ−低級アルキルアニ
リンが好ましい。
以下、本発明の基礎となつた実験事実につき記
載する。
実験１（発色液の安定性とPHとの関係） 0.1mlのマクイルバイン緩衝液（PH3.5〜7.0の間
でPH0.5刻みに変化させたもの）、0.3mlの150mM
のジエチルアニリン（DEA）、0.15mlの5mM
MBTH、0.3mlの8mUキサンチンオキシダーゼ、
0.3mlの15Uペルオキシダーゼ及び0.4mlの蒸留水
を混合した溶液に50μのヒト血清を加え、37℃
で10分間放置し、１分間毎に590nmにおける吸光
度の変化を追跡した。結果は第１図に示される。
図示の如く発色液のPHが増加する程、かつ時間が
経過する程吸光度は増大する。PH4.0以上では吸
光線に曲りが見られPH3.5以下が好ましい。
実験２（過酸化水素生成反応と発色反応とを同時
に行つた場合の発色状況） 50μのヒト血清に0.45mlの0.3mMのグアニン
緩衝溶液（PH8.0）を加え、37℃で15分間インキ
ユベイトした後、反応液に0.5mMのMBTH及び
30mMのDEAを含む緩衝溶液（PH4.0）並びに
0.2Uのキサンチンオキシダーゼ（X.O）及び5U
のペルオキシダーゼ（POX）を含む酵素液0.5ml
を加え、37℃で５分間インキユベートし、発色状
況を590nmにおける吸光度とにより測定した。結
果を第２図に示す。各点の上下を挾む短線は12回
の測定における標準偏差を示す（変動係数（CV）
＝1.4％）。図示の如く吸光線に弯曲が見られる
が、これはスーパーオキサイドラジカルの作用に
よるインダミン色素の褪色に因るもので、本法が
定量法として望ましくないことを物語つている。
実験３（本発明法） 50μのキサンチン溶液に0.4mlの0.3mMグアニ
ン緩衝溶液（PH8.0）を加え、37℃で13分間イン
キユベイト後、0.3mlの0.2UX.Oを加え、再び37
℃で１分間インキユベイトし、さらに1.0mlの
0.5nM MBTH、30mMのDEA及び50UのPOXを
含むPH3.0の緩衝溶液を加え、もう一度37℃で１
分間インキユベイト後、直ちに570nmにおける吸
光度を測定した。結果を第３図に示す。CV＝0.7
％（回数12）、相関係数（γ）0.9999（ε＝3.33×
104）。この図から本方法では検量線が直線状で充
分実用に耐えることが判る。
実験４（アニリン誘導体の種類と発色率の関係） ０〜0.25mMの過酸化水素0.1mlと0.4mlの
0.3mMグアニン緩衝溶液（PH8.0）の混液に1.0ml
の0.5mM MBTH、10mMのDMA又はDEA及び
50UのPOX緩衝溶液（PH3.0）を加え、37℃で１
分間インキユベート後、さらに1.5mlの1.5N硫酸
を加え、直ちに590nmにおける吸光度を測つた。
結果を第４図に示す。図示の如く過酸化水素の量
が増加するにつれ吸光度が増加するが、変化はい
づれも直線的で、DMAの方が僅かに吸光度が大
きい以外差異は認められない。
実験５（グアナーゼ活性と酵素量との関係） ラツト肝臓より抽出した粗グアナーゼ液を標本
としてグアナーゼ活性と酵素量との相関を調べ
た。粗グアナーゼ量は前記伊藤らの方法に基き測
定した。
また、グアナーゼ活性は粗グアナーゼ液にヒト
血清を加えたものを試料として実験３の方法に従
つて測定した。結果を第５図に示す。
図示の如く、グアナーゼ活性と酵素量との間に
は明らかな相関々係が認められる。各点の上下を
挾む短線は12回測定時の標準偏差値を示す（CV
＝1.4％、γ＝0.9999）。
〔処方例〕
本発明に基く500検体用処法の例を以下に示す。
緩衝液Ａ KH2PO40.215ｇ及びK2HPO43.998ｇ／100検
体／パツク これを５包、各レトルトパツクと
する。
緩衝液Ｂ クエン酸（１水塩）4.096ｇ、
Na2HPO41.564ｇMBTH26.96mg及び
DEA1.393ｇ／100検体／パツク これを５包、
各レトルトパツクとする。
3mMグアニン グアニン13.62mg、NaN321.94mgを30mlの
12mM NaOHに溶かし、バイアル瓶中に封入。
１瓶。
12mM NaOH NaN321.94mgを30mlの12mM NaOH溶液に
溶かし、バイアル瓶中に封入。１瓶。
10U／mlキサンチンオキシダーゼ キサンチンオキシダーゼを上記濃度となるよ
ううに3.2M（NH4）2SO4溶液26mlに懸濁し、バ
イアル瓶中に封入。１瓶。
12500Uペルオキシダーゼ 12500U／バイアルの凍結乾燥ペルオキシダ
ーゼ粉末を10ml容バイアル瓶中に封入（100検
体用）。５瓶。
0.5mMキサンチン 0.5mMのキサンチン溶液10mlをバイアル瓶
中に封入。１瓶。
以上の各包装物は未開封のまま冷所に貯蔵され
れば長期に亘り安定である。
〔作業用試薬の調製〕
以上の各包装物は次のように１日分の試薬を予
製するのに使用する。
基質緩衝溶液 緩衝液Ａの１パツクの内容物を蒸留水に溶か
し、全量を200mlとする。この稀釈液の45mlを
採り、これに3mMグアニン５mlを加える（試
薬）。
無基質緩衝溶液（盲検用） の緩衝液Ａの稀釈液に12mM NaOH5mlを
加える（試薬）。
キサンチンオキシダーゼ溶液 10U／mlキサンチンオキシダーゼ懸濁液５ml
にの緩衝液Ａの稀釈液45mlを加える（試薬
）。
発色液 緩衝液Ｂの１パツクの内容物を蒸留水に溶か
し、全量を250mlとし、これにペルオキシダー
ゼの１瓶を溶かす（試薬）。
〔測定操作手段〕
血清サンプル50μに試薬0.4mlを加え、37℃
で13分間インキユベイトする。この反応液に試薬
0.2mlを加えて37℃１分間放置後、さらに試薬
１mlを加えて37℃で１分間保つ。終了後、直ち
に570nmにおける吸光度又は570nmと700nmとに
おける吸光度の差を測定し、予め定められた検量
線からサンプル中のグアナーゼ活性を求める。な
お、測定が自動分析機を用いて行われる場合は、
検量線の各点に対応するデータは予め附属のコン
ピユーター中に入力されているので、即時デジタ
ルの数字として自動的に印字されることができ
る。
前述のように、本発明分析法はマニユアルで行
つても従来のグアナーゼ測定法に比し検査所要時
間を著しく短縮しうるという利点があるが、その
効果は自動分析機の利用により最高度に発揮され
る。現在、国内でも数社からこの種自動分析機が
販売されており、例えば日立製作所製706D型機
では同時に12の項目について分析する能力があ
る。これらの自動分析装置では、試薬をセツト
し、測定項目、サンプル番号、分析法、測光波
長、デイスペンサー番号、試験管番号、正常範
囲、較正値などの諸項目を予め操作ボタンにより
入力し、後はスタートボタンを押すだけで自動的
に分析が行われ、結果が印字される。従つて、発
明方法を臨床検査のルーテインにのせるには最も
好ましい。
本発明方法においても、血清中のグアナーゼ以
外の成分や試薬の純度や力価（殊に酵素類の）の
已むを得ない変動による影響を避けるため、グア
ニンを含まない試料について盲検を行つてブラン
ク値を決定し、このブランク値を観測値から控除
して正確な値を定めるのが理想的である。上述の
自動分析装置はこのための対照機能を備えている
ので、試薬はこの目的のため利用される。
以上詳述したように、本発明は従来測定に長時
間を要したグアナーゼの測定所要時間を著しく短
縮することにより本測定を臨床検査用自動分析装
置により行うことを可能とし、ひいては本測定を
日常臨床検査の項目中に取り入れることを可能と
したものであつて、肝疾患の診断及び治療の面で
医療上重要な貢献をするものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明における発色液の安定性とPHと
の関係を示すグラフ、第２図は過酸化水素生成反
応と発色反応とを同時に行つた場合の発色状況を
示すグラフ、第３図は本発明に従つてグアナーゼ
反応と、過酸化水素生成反応と発色反応とを別々
に行つた場合における発色状況を示すグラフ、第
４図はアニリン誘導体の種類による発色状況の変
化を示すグラフ及び第５図はグアナーゼの活性と
酵素量との相関を示すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 体液試料中にグアニンを加え、このグアニン
    を該試料中のグアナーゼによりキサンチンに酸化
    させ、このキサンチンをキサンチンオキシダーゼ
    により尿酸に分解させる際に副生する過酸化水素
    をペルオキシダーゼの存在下に３−メチル−２−
    ベンゾチアゾリノンヒドラゾン及びアニリン誘導
    体と反応させてインダミン色素に変化させ、この
    色素の570〜600nmにおける吸光度を測定するこ
    とにより前記試料中のグアナーゼを定量する方法
    において、 (イ) 反応を（）キサンチン生成反応、（）過
    酸化水素生成反応及び（）発色反応の３段階
    に分けて行わせること、及び (ロ) キサンチン生成反応をPH７〜９の領域内で行
    わせること、及び (ハ) 過酸化水素生成反応をカタラーゼ阻害剤の存
    在下に行わせること、 を特徴とするグアナーゼの迅速定量法。
JP56152807A 1981-09-25 1981-09-25 グアナ−ゼの迅速定量法 Granted JPS5856699A (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP56152807A JPS5856699A (ja) 1981-09-25 1981-09-25 グアナ−ゼの迅速定量法
EP82108856A EP0075894A1 (en) 1981-09-25 1982-09-24 A rapid assaying method for guanase
CA000412233A CA1203154A (en) 1981-09-25 1982-09-27 Rapid assaying method for guanase
US06/424,182 US4550076A (en) 1981-09-25 1982-09-27 Rapid assaying method for guanase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP56152807A JPS5856699A (ja) 1981-09-25 1981-09-25 グアナ−ゼの迅速定量法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS5856699A JPS5856699A (ja) 1983-04-04
JPH0228320B2 true JPH0228320B2 (ja) 1990-06-22

Family

ID=15548579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP56152807A Granted JPS5856699A (ja) 1981-09-25 1981-09-25 グアナ−ゼの迅速定量法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US4550076A (ja)
EP (1) EP0075894A1 (ja)
JP (1) JPS5856699A (ja)
CA (1) CA1203154A (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6117519A (ja) * 1984-07-04 1986-01-25 Maruho Kk 輸血用血液の選別方法
JPH0335967U (ja) * 1989-08-22 1991-04-08
DE69314363T2 (de) * 1992-02-03 1998-02-19 Lifescan Inc Verbesserter oxidativer Kupplungsfarbstoff zur spektrophotometrischen Quantitativen Analyse von Analyten
US7312197B2 (en) * 2003-02-24 2007-12-25 University Of Maryland, Baltimore Method of modifying glucose activity using polypeptides selectively expressed in fat tissue
US7299082B2 (en) 2003-10-31 2007-11-20 Abbott Diabetes Care, Inc. Method of calibrating an analyte-measurement device, and associated methods, devices and systems
US7699964B2 (en) * 2004-02-09 2010-04-20 Abbott Diabetes Care Inc. Membrane suitable for use in an analyte sensor, analyte sensor, and associated method
US8165651B2 (en) 2004-02-09 2012-04-24 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte sensor, and associated system and method employing a catalytic agent
US7885698B2 (en) 2006-02-28 2011-02-08 Abbott Diabetes Care Inc. Method and system for providing continuous calibration of implantable analyte sensors
AU2014374361B9 (en) 2013-12-31 2019-07-04 Abbott Diabetes Care Inc. Self-powered analyte sensor and devices using the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2600526C3 (de) * 1976-01-08 1981-06-19 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur quantitativen Bestimmung von mit Sauerstoff unter Oxidaseeinwirkung H↓2↓O↓2↓ bildenden Substanzen und Reagens zu seiner Durchführung

Also Published As

Publication number Publication date
CA1203154A (en) 1986-04-15
EP0075894A1 (en) 1983-04-06
US4550076A (en) 1985-10-29
JPS5856699A (ja) 1983-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3791988A (en) Diagnostic test for glucose
US5516700A (en) Automated urinalysis method
Shephard et al. Falsely low estimation of triglycerides in lipemic plasma by the enzymatic triglyceride method with modified Trinder's chromogen
JPH0228320B2 (ja)
Mamoru et al. A new colorimetric method for determination of serum glucose
CA2272746C (en) Measurement of bilirubin albumin binding
JPS584918B2 (ja) グルタメ−ト−オキザロアセテ−ト−トランスアミナ−ゼ及びグルタメ−ト−ピルベ−ト−トランスアミナ−ゼの測定法
Powell et al. Assay of urinary N-acetyl-beta-glucosaminidase in a centrifugal analyzer.
JPH0771514B2 (ja) １，５−アンヒドログルシトールの定量法
Rehak et al. Calorimetric enzymic measurement of uric acid in serum.
US4816394A (en) Quantitative analysis of 3α-hydroxysteroid and reagent useful therefor
US4675281A (en) Quantification of hydroperoxides using prostaglandin H synthase
JPH0698036B2 (ja) アミノ酸の選択的定量法
EP0245528B1 (en) Quantitative analysis of 3 alpha-hydroxysteroid and reagent useful therefor
WO1997039352A1 (en) Assays for detection of purine metabolites
JPS6017347A (ja) 一種以上の酵素を利用する検定方法
US6030802A (en) Liquid reagent set for L-lactate determination
JP3614951B2 (ja) 酵素活性を測定する方法及び試薬
JPS60102199A (ja) グアナ−ゼ活性自動分析測定用試薬および測定法
JPS63233799A (ja) ビタミンｅ欠乏症の検査のためのピルビン酸キナーゼ活性の測定方法
JPS60238000A (ja) 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法
JPH04229198A (ja) 歯周疾患検査方法
JPH0362400B2 (ja)
Orfanos et al. A fluorometric micromethod for estimation of carnosinase in dried blood samples
JPH02297065A (ja) フルクトサミン測定用試薬