JPH0362400B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、還元型補酵素の定量方法に関するも
のである。 生体試料中の酵素活性や物質の量又は濃度を測
定することは疾病の診断や治療効果あるいは疾病
の機序を知る上で非常に重要である。 血清又は尿などの体液成分の内で、乳酸脱水素
酵素（LDH）クレアチンホスホキナーゼ（CPK）
α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−HBD）の
ような脱水素酵素の活性測定、又はこれら脱水素
酵素を介在させて他の酵素の活性測定を行なう場
合や、コレステロール、トリグリセライド、グル
コースなどを、夫々の物質に特異的に作用する脱
水素酵素を介在させて、コレステロール、トリグ
リセライド、グルコースなどを定量する場合には
脱水素酵素の作用を発揮させるため補酵素として
NAD又はNADPが用いられており、脱水素酵素
の作用によつて生成したNADH又はNADPHを
定量することによつてなされている。 NADH又はNADPHの定量方法は、340nｍに
おける吸光度を測定するか、あるいはテトラゾリ
ウム塩とNADH又はNADPHを反応させて有色
ホルマザンを生成せしめて可視部で比色定量する
方法が行われている。 しかし、340nｍの吸収を測定する場合は試料
中の340nｍ付近に吸収を有する物質によつて影
響を受けるため試料盲検を立てる必要があり測定
装置も紫外部測定のための特別仕様が必要であ
る。又テトラゾリウム塩を使用する可視部発色法
では還元型補酵素とテトラゾリウム塩との反応に
より生じた有色ホルマザンの水に対する溶解性が
低く、且つ染着性が強いため色素が析出沈殿した
りセルやチユーブを染色汚染し測定上のトラブル
となることが多かつた。更にテトラゾリウム塩を
使用する可視部発色法のような還元型補酵素の還
元性を利用し有色物質として測定する方法では試
料中の還元性不純物、例えばアスコルビン酸、尿
酸などの影響を受けて誤差を生ずることが多く、
これらの問題の解決が切望されていた。 本発明者らはこれらの問題を解決すべく鋭意研
究の結果、酸化型グルタチオンを含むPH３〜10の
媒体中にグルタチオン還元酵素存在下、還元型補
酵素を反応させて酸化型グルタチオンを還元型グ
ルタチオンに定量的に変化させ、これにチオール
基（−SH基）発色剤を用いて定量的に発色させ
ることによりアスコルビン酸や尿酸の影響を全く
受けることなく還元型補酵素の比色定量ができる
ことを見出だし本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明は、還元型補酵素を定量するに
あたり、グルタチオン還元酵素存在下、酸化型グ
ルタチオンと還元型補酵素をPH３〜10で作用さ
せ、定量的に還元され生成した還元型グルタチオ
ンをチオール基発色剤で発色させて比色測定する
ことを特徴とする還元型補酵素の定量方法であ
る。 本発明の反応を反応式で示すと次のとおりであ
る。 (1) 酸化型グルタチオン＋還元型補酵素 グルタチオン還元酵素 ――――――――――――→ pH3〜10 還元型グルタチオン＋酸化型補酵素 (2) 還元型グルタチオン チオール基発色剤 ――――――――――→ 発色→測定 (1)式の酵素反応及び(2)式の発色反応は、反応自
体は各々自体公知の反応であるが、これらの反応
の組み合せについては本願出願前にはその例はな
く、又、前段の酵素反応の公知例はいずれもグル
タチオン還元酵素の活性度の測定に関するもので
あり従つて用いる還元型補酵素の量は本発明で用
いるその量と比較して多量である。 即ち、本発明で用いる還元型補酵素の代表例の
１つであるNADPHについて、この点を述べる
と、臨床病理、臨時増刊特集第33号102頁、103頁
（日本臨床病理学会）によれはその使用量は0.1ｍ
MOlであるが、本発明で用いるNADPHの量は、
実施例１に従えば、コレステロール標準液（200
mg／dl）で0.034ｍMolであり、その濃度は1/3と
なる。 本発明は、還元型補酵素を定量する発明である
ので、そのような場合通常低濃度で使用する還元
型補酵素と酸化型グルタチオンとの反応性につい
て研究の結果、充分に定量性有る反応が進行する
こと及び(1)式のこの酵素反応と(2)式の発色反応を
組み合せて反応させてもその定量性は何らの影響
をも受けないことを見出し、完成するに至つたも
のである。 チオール基発色剤としては、SH基に対する反
応の特異性が高いこと、SH基と化学量論的に反
応し、しかもその反応速度が充分大きいこと、又
当量点とか反応量をなんらかの方法で鋭敏に検知
しうることなどの性質を有する諸試薬が用いられ
る。 例えば、５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）、Ｎ−（１−アニリノナフチル−４）マレイ
ミド、β−ヒドロキシエチル−２，４−ジニトロ
フエニルジスルフイド、２，2′−ジチオピリジン
などが挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。又、チオール基発色剤としては、ベンズ
イミダゾリルマレイミドのようなケイ光発色剤も
含まれる。 本発明の方法に用いられるPH３〜10の媒体とし
ては、0.01〜1Mのトリス緩衝液、リン酸塩緩衝
液、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液など通常用
いられている緩衝液がすべて使用できる。 酸化型グルタチオンの濃度は特に限定されない
が好ましくは0.1ｍＭ〜300ｍＭである。 グルタチオン還元酵素は１検体当り、好ましく
は１〜100国際単位（IU）であるが、より好まし
くは５〜20IUである。 本発明の方法を用いて血清中の酵素活性を測定
する場合を例示すると、LDH活性度の測定では、
基質として乳酸チリウム0.1M、NAD0.2〜0.5％
を含有するPH9.0の0.1Mトリス緩衝液（基質緩衝
液）0.5〜２mlをとり37℃恒温槽中３分間予備加
温したのち血清20〜50μ加えて混和后37℃恒温
槽中10分間放置する。ついで酸化型グルタチオン
５ｍＭ、グルタチオン還元酵素10000IU／を含
む0.1M酢酸緩衝液（PH4.5）１〜３mlを加えて37
℃５分間反応させたのち、５，5′−ジチオビス
（２−ニトロ安息香酸）の0.5％エタノール溶液
0.5〜３mlを加え混和して410nｍの吸光度を測定
する。LDH標準血清を用いて同様に操作して作
成した検量線から試料中のLDH活性を求めれば
よい。 また血清中の物質の濃度を求める場合を例示す
ると、トリグリセライドの測定ではPH7.5のトリ
ス緩衝液100ml中リポプロテインリパーゼ
15000u、グリセロキナーゼ2500u、グリセロール
−３−リン酸脱水素酵素2000u、NAD500mg、
ATP・170mgを含む試液２mlを血清20μに加え
て混和したのち37℃恒温槽中10分間加温する。つ
ぎに前記LDH活性度測定で用いた酸化型グルタ
チオンとグルタチオン還元酵素を含む酢酸緩衝液
１mlを加えて37℃５分間反応させた后、５，5′−
ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）の0.5％エタ
ノール溶液0.5mlを加えて発色させ410nｍの吸光
度を測定する。この方法によれば血清中のアスコ
ルビン酸や尿酸などの還元性物質の影響を全く受
けない。 本発明の方法は上記の使用例に限定されるもの
ではなく還元型補酵素即ちNADH又はNADPH
を測定して酵素活性度や物質量を測定する方法の
すべてに適用され得るものである。 以下に実施例を述べる。 実施例 １ 血清中の総コレステロール定量試液 試 薬 (1) コレステロールエステルヒドロラーゼ・トリ
ス緩衝液（CEH溶液） PH7.0の0.01Mトリス緩衝液100ml中コレステ
ロールエステルヒドロラーゼ100uを含有する。 (2) コレステロールデヒドロゲナーゼ・NADP
トリス緩衝液（CDH・NADP溶液） PH9.0の0.1Mトリス緩衝液100ml中NADP200
mg、コレステロールデヒドロゲナーゼ100uを
含有する。 (3) 酸化型グルタチオン・グルタチオン還元酵
素・トリス緩衝液（GSSG・GR溶液） PH8.4の0.1Mトリス緩衝液100ml中酸化型グ
ルタチオン0.2ｇ、グルタチオン還元酵素1300u
を含有する。 (4) DTNB溶液 ５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
0.5ｇをエタノール100mlに溶解する。 測定方法 血清20μlをとりCEH溶液１mlを加えて37℃恒
温槽中５分間放置后CDH・NADP溶液１mlを加
えて37℃５分間放置する。ついでGSSG・GR溶
液１mlを加えて37℃５分間放置后DTNB溶液２
mlを加え試薬盲検を対照として410nｍにおける
吸光度を測定する。別にコレステロール200mg／
dlを含む標準液を用いて同一操作を行い吸光度を
測定する。 次式から血清中の総コレステロール濃度を算出
する。 Es／Estd×200＝総コレステロールmg／dl Es：血清試料を用いたときの吸光度。 Estd：コレステロール標準液（コレステロール
200mg／dl）を用いたときの吸光度。 実施例 ２ 試 薬 (1) NADH標準液 NADHを蒸留水又はイオン交換水に溶解し
て、NADH0.5mg／ml、１mg／ml、1.5mg／ml、
２mg／mlの濃度の溶液を調製する。 (2) 酸化型グルタチオン・グルタチオン還元酵
素・トリス緩衝液（GSSG・GR溶液） 実施例１に同じ。 (3) DTNB溶液 実施例１に同じ。 測定方法 NADH標準液各々50μlをとりGSSG・GR溶液
２mlを加え37℃恒温槽中５分間放置后DTNB溶
液２mlを加えて混和し試薬盲検を対照として
410nｍにおける吸光度を測定する。吸光度と
NADH濃度による検量線を作成する。 このときの検量線を第１図に表わす。検量線か
ら明らかなように検量線は直線を示し定量性が良
い。 又、結果を表１に示す。

【表】 実施例 ３ NADH定量におけるアスコルビン酸および尿
酸の影響 試 薬 (1) NADH溶液 NADH200mgを蒸留水に溶かして100mlとす
る。 (2) GSSG・GR溶液 実施例１に同じ。 (3) DTNB溶液 実施例１に同じ。 (4) アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸を蒸留水に溶解してアスコル
ビン酸100mg／dl、200mg／dlの濃度の溶液を調
製する。 (5) 尿酸溶液 尿酸100mgと炭酸チリウム60mg／dlをとり蒸
留水を加えて加温して溶かし全量100mlとする。
この10ml、20mlを夫々とり水を加えて100mlと
し尿酸10mg／dl、20mg／dlの濃度の溶液を調製
する。 測定方法 実施例２に同じ。アスコルビン酸、尿酸の影響
をみる場合は夫々の溶液をNADH溶液と同時に
同容量添加して操作し液量補正を行つた吸光度か
らNADH濃度を算出する。 結果を表２に示す

【表】

【表】 測定結果から明らかなように本発明の方法では
アスコルビン酸や尿酸の影響を全く受けない。 実施例 ４ NADHの定量 試 薬 (1) NADH標準液 NADHを蒸留水又はイオン交換水に溶解し
て、NADH1mg／、２mg／、５mg／、７
mg／、10mg／の濃度の溶液を調製する。 (2) GSSG・GR溶液 実施例１に同じ。 (3) BIPM試薬 Ｎ−〔ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）フエニ
ル〕マレイミドの５ｍmolをエタノール１に
溶解する。 測定方法 NADH標準液50μをとりGSSR・GR溶液３
mlを加え37℃恒温槽中５分間放置后BIPM試液
0.5mlを加えて５〜10分后の365nｍのケイ光を測
定する。励起波長は315nｍである。 このときの検量線を第２図に示す。検量線は直
線で定量性はよい。 実施例 ５ NADPHの定量 試 薬 (1) NADPH標準液 NADPH0.5mg／ml、１mg／ml、1.5mg／ml、
２mg／mlの濃度の溶液を調製する。 (2) GSSG・GR溶液 実施例１に同じ。 (3) DTNB溶液 実施例１に同じ。 測定方法 NADPH標準液を各々50μlとり以下実施例２と
同様に操作する。 このときの検量線を第３図に示す。検量線は直
線で定量性はよい。 結果を表３に示す。

【表】 実施例 ６ 血清中のα−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−
HBD）の活性度測定 試 薬 (1) 基質発色試液 PH8.5の0.1Mトリス緩衝液１中α−ヒドロ
キシ酪酸0.15M、NAD500mg、酸化型グルタチ
オン１ｇ、DTNB0.1ｇ、グルタチオン還元酵
素7000uを含む。 測定方法 基質発色試液２mlをとり37℃恒温槽中３分間放
置后血清50μlを加え混和し37℃恒温セルに入れ
410nｍにおける２分后から１分間の吸光度変化
を測定する。別にα−HBD標準血清を用いて同
様に操作して作成した検量線から血清中のα−
HBD活性度を求める。 実施例 ７ 血清中の総コレステロール定量試液 試 薬 (1) コレステロールエステルヒドロラーゼ・トリ
ス緩衝液（CEH溶液） 実施例１に同じ。 (2) コレステロールデヒドロゲナーゼ・NADト
リス緩衝液（CDH・NAD溶液） 実施例１に同じ。 (3) 酸化型グルタチオン・グルタチオン還元酵
素・トリス緩衝液（GSSG・GR溶液） 実施例１に同じ。 (4) HEDD溶液 β−ヒドロキシエチル−２，４−ジニトロフ
エニルジスルフイド0.5ｇをエタノール100mlに
溶解する。 測定方法 実施例１のDTNB溶液の代りにHEDD溶液を
用い、測定波長を408nｍとし、以下実施例１に
準ずる。 実施例 ８ 血清中の総コレステロール定量試液 試 薬 (1) コレステロールエステルヒドロラーゼ・トリ
ス緩衝液（CEH溶液） 実施例１に同じ。 (2) コレステロールデヒドロゲナーゼ・NADト
リス緩衝液（CDH・NAD溶液） 実施例１に同じ。 (3) 酸化型グルタチオン・グルタチオン還元酵
素・トリス緩衝液（GSSG・GR溶液） 実施例１に同じ。 (4) 2PDS溶液 ２，2′−ジチオピリジン0.5ｇをエタノール
100mlに溶解する。 測定方法 実施例１のDTNB溶液の代りに2PDS溶液を用
い、測定波長を281nｍとし以下実施例１に準じ
る。 実施例 ９ 血清中の総コレステロール定量試液 試 薬 (1) コレステロールエステルヒドロラーゼ・トリ
ス緩衝液（CEH溶液） 実施例１に同じ。 (2) コレステロールデヒドロゲナーゼ・NADト
リス緩衝液（CDH・NAD溶液） 実施例１に同じ。 (3) 酸化型グルタチオン・グルタチオン還元酵
素・トリス緩衝液（GSSG・GR溶液） 実施例１に同じ。 (4) BIPM溶液 ベンズイミダゾリルマレイミド0.01ｇをエタ
ノール100mlに溶解する。 測定方法 実施例１のDTNB溶液の代りにBIPM溶液を
用い、測定はケイ光分光光度計を用いて励起波長
315nｍ、ケイ光波長365nｍで測定し、以下は実
施例１に準じる。 実施例 10 グリココール酸の定量 試 薬 (1) グリココール酸溶液 グリココール酸を生理食塩水に溶解して、グ
リココール酸50uM／1100uM／1150uM／
1200uM／１の濃度の溶液を調製する。 (2) 3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素・
NADトリス緩衝液（3α−HSD・NAD溶液） PH7.2の0.05Mトリス緩衝液100ml中NAD145
mg、3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素
（3α−HSD）12.3uを含有する。 (3) 酸化型グルタチオン・グルタチオン還元酵
素・トリス緩衝液（GSSG・GR溶液） PH7.2の0.05Mトリス緩衝液100ml中、酸化型
グルタチオン184mg、グルタチオン還元酵素
2050uを含有する。 (4) DTNB溶液 ５，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
200mgをエタノール100mlに溶解する。 測定方法 グリココール酸溶液200ulをとりGSSG−GR溶
液1.9ml及び3α−HSD・NAD溶液1.9mlを加えて、
37℃恒温槽中10分間放置後DTNB溶液0.1mlを加
えて混和し試薬盲検を対照として405nｍにおけ
る吸光度を測定する。吸光度とグリココール酸濃
度による検量線を作成する。 このときの検量線を第４図に示す。第４図から
明らかなように検量線は直線を示し定量性が良
い。 又、結果を表４に示す。

【表】 以下に比較例を示す。 比較例 １ 血清総コレステロールの定量 試 薬 (1) 緩衝液 0.15Mトリス緩衝液（PH7.0）中ｐ−クロル
フエノール0.1％、トリトンＸ−100 (2) 発色試液 ｐ−クロルフエノール0.1％、トリトンＸ−
100 0.2％、コレステロールオキシダーゼ15u／
dl、コレステロールエステルヒドロラーゼ
20u／dl、ペルオキシダーゼ300u／dl、４−ア
ミノアンチピリン0.02％、の濃度になるように
0.15Mトリス緩衝液（PH7.0）に溶解する。 (3) 標準液 コレステロール200mg／dl 測定方法 血清10μlをとり発色試液（発色剤を緩衝液に溶
解したもの）3.0mlを加えて混和し37℃の恒温槽
中５分間放置后盲検を対照として波長505nｍの
吸光度を測定する。 別にコレステロール200mg／dlを含む標準液を
用いて同一操作を行つて得た吸光度から実施例１
の算出式に従つて血清中の総コレステロール濃度
を算出する。 実施例１と比較例１の方法による血清総コレス
テロールの測定結果の比較を表５に示す。 又、このときの相関図を第５図に示す。これら
の結果から明らかなように実施例１と比較例１の
方法による測定値は相関係数0.994と非常に良い
相関を示しており、実用上本発明の方法が全く問
題ないことを示している。

【表】

【表】 比較例 ２ 血清中のα−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性
度 測 定 試 薬 (1) 基質緩衝液 0.1Mトリス緩衝液（PH8.5）中α−ヒドロキ
シ酪酸を含む。 (2) 基質発色試薬 α−ケト酪酸20ｍＭ、NAD0.15％、ニトロ
テトラゾリウムブルー0.05％、フエナジンメト
サルフエート0.01％の濃度になるように0.1M
トリス緩衝液（PH8.5）に溶解する。 (3) 1N塩酸 (4) 標準血清 測定操作 基質発色試液（発色剤を基質緩衝液に溶解した
もの）0.5mlをとり37℃恒温槽中３分間放置后血
清50μを加えて混和し更に37℃恒温槽中20分間
放置する。ついで0.1N塩酸（1N塩酸を10倍希
釈）5.0mlを加えて混和后試薬盲検を対照として
560nｍにおける吸光度を測定する。別にα−
HBD標準血清を用いて同様に操作して作成した
検量線から血清中のα−HBD活性度を求める。 実施例６と比較例２の方法による血清α−
HBD測定結果の比較を表６に示す。ただし表中
のｕはRosalki単位を示す。 又、このときの相関図を第６図に示す。これら
の結果より明らかなように実施例６と比較例２の
方法による測定値は相関係数0.9997と非常に良い
相関を示しており、実用上本発明の方法が全く問
題ないことがわかる。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２に於ける検量線、第２図
は、実施例４に於ける検量線、第３図は、実施例
５に於ける検量線、第４図は、実施例10に於ける
検量線、第５図は、比較例１に於ける相関図、第
６図は、比較例２に於ける相関図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 還元型補酵素を定量するにあたり、グルタチ
   オン還元酵素存在下、酸化型グルタチオンと還元
   型補酵素をPH３〜10で作用させ、定量的に還元さ
   れ生成した還元型グルタチオンをチオール基発色
   剤で発色させて比色測定することを特徴とする還
   元型補酵素の定量方法。 ２ 還元型補酵素がNADH（還元型ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド）又はNADPH（還元
   型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
   酸）である特許請求の範囲第１項記載の定量方
   法。