JPH02285252A - 微生物センサーの操作方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物センサーの新規な操作方法に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

酵素や微生物等の生体触媒は、従来の物理化学センサー
にない高度な分子識別機能を有しており、近年、これら
の生体触媒と電気化学デバイス（電極）を組み合せた、
いわゆるバイオセンサーの開発が各方面で活発に行われ
ている。

例えば、グルコースセンサーでは膜状担体に酵素を固定
化し、該膜状担体内で測定対象物であるグルコースと酵
素とを反応させ、反応生成物の過酸化水素或いは反応で
消費される酵素の濃度を検出してグルコース渡度に換算
することが行なわれている。また、特公昭５　Ｂ−３０
５３７号公報には、微生物を膜状担体に固定化し、該固
定化微生物と排水中の汚濁物質との反応の際に消費され
・る酸素の濃度を測定することによりＢＯＤ　（生物化
学的酸素要求量）を求めるＢＯＤセンサーが開示されて
いる。

これらのグルコースセンサーや、ＢＯＤセンサーは膜状
担体に酵素や微生物を固定化し、この固定化膜と電気化
学デバイスとが密着した構造をとっている。しかしこの
場合、測定物質の移動の大部分が膜状担体内の拡散によ
るため、物質移動速度が非常に小さくなり、電極が安定
な値を示すまでにかなりの時間を要するという問題があ
った。

また、これらのバイオセンサーに使用されている生体触
媒を分子識別素子として利用するためには、生体触媒の
有する機能を失うことなく固定化（不溶化）する必要が
ある。生体触媒の固定化法としては、（１）共有結合法
、（２）架橋法、（３）包括法、（４）吸着法等の方法
があるが、一般にその操作は煩雑であり、また各生体触
媒に対して不変的な固定化方法はなく適切な固定化法を
見い出すまでにかなりの検討が必要である。更に、これ
らの固定化法では、未だ、固定化の際に生体触媒自身が
化学的又は物理的変性を受けることを避は得ず、その活
性が減じてしまうということが頻繁に発生していた。

一方、生体触媒として、特定の微生物自身を使用すれば
、煩雑な方法によらずに比較的容易に固定化することが
できる。例えば排水の浄化に使われる活性汚泥等の微生
物は、その代謝過程で粘着性物質を細胞外に放出する。

従って、これらの微生物はその粘着性物質の持つ粘着性
により、多孔質担体へ容易に付着固定化でき、分子識別
素子としてセンサーに利用できる。

しかしながら、斯かる粘着性物質による付着固定化では
微生物の多孔質担体への付着量が少なく、微生物反応生
成物量が少なくなる結果、生体触媒と測定対象物との反
応により生じた化学変化をとらえる電気化学デバイスで
は、その変化を充分に検出することができないため、そ
のままでは微生物センサーに供することができないとい
う問題があった。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実状において本発明者らは鋭意研究を行なった結
果、多孔質担体に微生物を付着固定化した後、基質とし
て測定対象物を含有する溶液を使用し、多孔質担体表面
にて微生物を一定量以上に増殖させてから微生物センサ
ーとして使用すれば、生体触媒と測定対象物との反応に
より生ずる化学変化を容易に検出できることを見出し、
本発明を完成した。

すなわち、本発明は微生物を付着固定化するための多孔
質担体とこれら微生物の作用により生成又は消費される
物質を定量する電気化学デバイスとを具備する微生物セ
ンサーを使用するに当り、多孔質担体に微生物を付着固
定化し、測定対象物を含有する溶液を通液して、固定化
微生物を多孔質担体１ｏｌｉ当り、乾燥微生物重量で０
．１　ｍｇ以上、になるまで増殖させてから使用するこ
とを特徴とする微生物センサーの操作方法を提供するも
のである。

本発明方法において使用される、微生物を固定化するた
めの担体としては多、孔質担体が用いられ、本発明の微
生物センサーは第１図に示す如く、固定化微生物売てん
容器に微生物固定化担体である該多孔質担体を充てんし
た部分と、電気化学デバイス部分とが分離した構造をと
っている。本発明の如く、多孔質担体を用いると、膜状
担体に比して、はるかに担体内の液移動速度が大きくな
るため、少ない微生物量によっても測定が可能となり、
かつ後の微生物の増殖に要する時間も短縮することが可
能となる。

多孔′質担体に使用される多孔質材料としては、表面又
は内部に微生物が浸入できる程度、すなわち直径的０．
１μｍ以上の孔を多数有する無機物質又は有機物質であ
れば、特にその材質については限定されるものではない
。具体的には、例えば多孔質ガラス、多孔質セラミック
、活性炭、多孔質ポリマー、海綿体組織状物（多孔スポ
ンジなど）、ステンレス金網の成型体などが挙げられる
。

本発明方法では、微生物センサーとして使用する前に多
孔質担体に固定化した微生物を増殖させる。

ここで微生物の増殖のための基質としては、測定対象物
を含有した溶液を使用する必要がある。

測定対象物以外の基質を与えた場合には、与えた基質に
適した酵素を誘導する微生物が増殖することから、斯か
る微生物の増殖後に測定を行なうと、誘導された酵素が
測定対象物に適さなくなり、充分な化学変化が起こらず
、結果として測定対象物濃度の測定ができなくなる。

また、微生物の増殖は多孔質担体１　　ｍｌ当り、乾燥
微生物重量で０．１　ｍｇ以上、好ましくは１　ｍｇ以
上になるまで行なわれる。増殖した微生物量が０、１　
ｍｇ以下である場合は、微生物センサーとして使用した
時に、充分な反応生成物量又は酸素消費などの化学変化
を与えることができないため、電気化学デバイスで検出
することが不可能となる。

次に本発明の微生物センサーについて、その一実施例を
示す第１図を用い、電極として酸素電極を使用するＢＯ
Ｄ測定を例にとり説明する。

第１図中、１は固定化微生物売てん容器であり、微生物
固定化担体１１がその中に充てんされている。２は電極
であり、その測定結果は記録計７に記録される。この微
生物センサーを用いて測定試料８のＢＯＤ値を測定する
には、次の如くすれば良い。すなわち、まず、微生物懸
濁液９が微生物固定化担体を充てんした固定化微生物売
てん容器１を＠環する様に切り換えバルブ５．６を操作
し、ポンプ４を用いて微生物懸濁液を送液し、微生物固
定化担体１１に微生物を付着固定化させる。

ＢＯＤセンサーとして用いる場合、通液する微生物懸濁
液は、好気性微生物を含むものであればよく、活性汚泥
処理槽内の懸濁液、あるいは河川水等でもよい。微生物
固定化操作としては、上記の様に微生物懸濁液を樹脂を
充てんした容器内に通液する方法でもよいが、微生物懸
濁液内に微生物固定化担体を添加し、所定時■振とう、
あるいは撹拌して吸着させた後とり出し固定化微生物売
てん容器に充てんしてもよい。

微生物固定化後、切り換えバルブ６を切り換えて、測定
試料８のみを通液し、微生物を増殖させる。通液は、予
め、別の実験で必要な微生物量に増殖するのに要する時
間を確認してあき、その時間まで行なう。

次に切り換えバルブ５．６を操作し、緩衝液を通液する
。固定化微生物売てん容器１を通過してくる液の溶存酸
素濃度が安定し、一定のベースラインが得られるまで通
液する。また、微生物に悪影響を与えない場合は緩衝液
の代りにイオ”ン交検水を使用してもよい。　　　　　
　　　　７゛また、固定化微生物売てん容器１、測定用
フローセル３、測定試料８、緩衝液１０は恒温漕内に設
置し、測定試料８および緩衝液１０へはエアレーション
しておくことが好ましい。

次に、切り換えバルブ６を切り換え測定試料を一定量通
液し溶存酸素濃度の減少量や減少速度を測定し、あらか
じめ作成しておいた検量線によりＢＯＤ値を求める。

１回の測定に要する時間は、固定化させる微生物の種類
や微生物の固定化量、あるいは微生物固定化担体光てん
量や通液速度等の操作条件によるが、例えば活性汚泥処
理槽中の微生物を吸着させ、固定化微生物売てん容器と
して２．５ｍｌの容器を用いた場合、操作条件として、
測定試料注入量０．５ｍｊ！、通液速度５ｍｊ２／ｍｉ
ｎにおいて５〜１０分で１回の測定を行うことができる
。また、ＢＯＤ値５００以上の高濃度試料においても１
０分以内でベースラインにまでもどり１０分以内で測定
することが可能であった。

また、第２図に示す微生物センサーは、本発明の他の一
実施例であり、これによれば測定試料を一定量注入し、
測定をおこなうことができる。すなわち、まず、測定試
料をポンプ４によって試料ループ１３に一定量充てんす
る。この時緩衝液は通液されておりベースラインが得ら
れる。次に切り換えバルブ１４〜１７を操作し、測定試
料を緩衝液で押し出し固定化微生物売てん容器１に注入
し、溶存酸素濃度の変化を測定するものである。

本発明の方法を用いれば、ＢＯＤだけでなく微生物固定
化担体に付着させる微生物の種類や、これらの微生物に
よる反応によって消費される物質あるいは生成される物
質を定量する適当な電気化学デバイスを組み合せること
により種々の微生物センサーを容易に製作することが可
能である。

例えば、シュードモナス　フルオレッセンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕａｒｅｓｅｎｓ）の様にグルコ
ースを選択的に資化する微生物を吸着固定化し酸素電極
と組み合わせればグルコースセンサーとして使用するこ
とができる。この時、微生物の増殖にはグルコースを含
有する液を与えてやれば良い。また、アンモニア性窒素
を酸化して硝酸性窒素に変換するニトロソモナス（Ｎ　
１ｔｒｏａｏａ＋ｏｎａｓ）やニトロバクタ−（Ｎｉｔ
ｒｏｂａｃｔａｒ　）等の硝化菌を吸着固定化し酸素電
極と組み合わせればアンモニアセンサーとして、あるい
はグルタミン酸脱炭酸酵素活性を存する大腸菌と炭酸ガ
ス電極とを組み合わせることによってアミノ酸センサー
としても使用できる。

これらは本発明の微生物センサーとしての一例でありこ
の他にも目的に合った種々の微生物センサーを製作する
ことができる。

また、第１図の例では固定化微生物の増殖は微生物セン
サーのライン中に組み込んだ後に行うが、別のラインで
固定化して増殖させた後、本微生物センサーに組み込む
ことも可能である。

〔発明の効果〕

本発明方法では、微生物を分子識別素子として用いる微
生物センサーにおいて、あらかじめ多孔質担体に微生物
を付着固定化してから測定対象物を含有する溶液を通液
して、測定対象物に適した酵素を誘導する微生物を増殖
させているため、微生物固定化量が少ない場合において
も、適当な電気化学デバイスで容易、迅速にかつ再現性
良く測定対象物濃度を測定することができる。更には、
目的に合致した種々の微生物を使用するについて従来の
如くの煩雑な固定化法や高価な担体を必要としないとい
う利点を有する。

したがって、本発明の微生物センサーによれば、水中の
ＢＯＤのほか、種々の物質、例えば糖類、アルコール類
、有機酸類等を迅速かつ容易に測定することが可能とな
る。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本
発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

実施例１ 第１図に示したシステムを用い、ＢｏＤセンサーを製作
した。電極としては酸素電極を用いた。

容積２．５ｍｌの固定化微生物売てん容器内に、−辺３
　ｍｍ立方体のポリウレタン系スポンジを充てんし、ま
ず切り換えバルブ５．６を微生物懸濁液９が、９→６→
４→１→５→９のラインで循環する様に操作する。そし
て、微生物懸濁液をポンプ４を使って２．５　ｍｌ／ａ
＋ｉｎの流量で３０分通液し微生物を付着固定化させる
。本実施例では、微生物懸濁液として活性汚泥処理水を
用いた。

次に測定試料８から切り換えバルブ６を経てポンプ４で
４日間連続して２．５ｍＡ／ｍｉｎで通液し、微生物を
増殖させた。

尚、別のカラムで同様の通液実験を行ったところ、微生
物付着量は下記第１表の如くであった。

以下余白 第１表の結果より、４日間の通液により、微生物は充分
使用し得る範囲まで増殖することがわかったため、本実
施例における通液時間は４日間とした。

４日間通液後、緩衝液１０が固定化微生物売てん容器１
を通って測定用フローセル３へ流れる様に切り換えバル
ブを操作し酸素濃度が安定し一定のベースラインが得ら
れるまで緩衝液を通液する。

ＢＯＤが既知の試料溶液を調製し、まずＢＯＤ値と溶存
酸素濃度減少量の関係を示す検量線を作成する。操作方
法としては、まず緩衝液を２．５ａ＋１！／ｍｉｎで通
液しておく。そして、切り換えバルブ６を切り換えて０
．２ｍｌだけ測定試料を通液し、もう−度切り換えバル
ブ６を切り換えて緩衝液を通液する。本実施例では、測
定用フローセル３、固定化微生物売てん容器１１測定試
料８、緩衝液１０はすべて２０℃に保持した。

第３図にＢＯＤ値が１２０．２４０，５６０■／ｌの既
知試料を測定した時の溶存酸素濃度の逆数と既知試料の
ＢＯＤ値の逆数との関係を示した。

これかられかるように各々の逆数は直線関係にあり、こ
のグラフを検量線として本実施例の未知試料の溶存酸素
減少量からＢＯＤ値を算出した。

下記第２表に、数種の未知試料を本実施例の微生物セン
サーを用いて測定したＢＯＤ値と、ＪＩＳＫＯ１０２に
規定されているＢＯＤ測定法を用いて測定したＢＯＤ値
を示す。

この結果から明らかなように、本発明の微生物センサー
による測定値とＪＩＳ法により測定した値はよく一致し
ている。ＪＩＳ法によるＢＯＤの測定は、５日間という
長い時間を必要とし、測定操作も煩雑であり熟練も必要
とされるが、本発明の方法を用いることにより、ＢＯＤ
を迅速にかつ容易にしかも精度よく測定することができ
る。

実施例２ 第１図に示したシステムを用い、多孔質担体として平均
粒径０．５　ｍｍの球状多孔質ポリスチレンビーズを用
い、微生物として河川底泥中に存在する微生物を使用し
た他は実施例１と同様の操作により河川水のＢＯＤ値の
測定を行なった。

尚、微生物の付着固定化及び増殖は、河川底泥と河川水
とをよく撹拌混合し、底泥を沈降させた後、微生物を含
有する上澄液を実施例１と同様の方法でポリスチレンビ
ーズカラムに通液し、更に７日間河川水を通液させるこ
とにより行なった。

付着固定化直後の微生物量は乾燥微生物重量で０、０２
　ｍｇ／　ｍｌであったが、７日間増殖後の微生物量は
乾燥微生物重量で０．６　ｍｇ／　ｍｌであった。

下記第３表に、数種の河川水を本実施例の微生物センサ
ーを用いて測定したＢＯＤ値と、ＪＩＳに０１０２に規
定されているＢＯＤ測定法を用いて測定したＢＯＤ値を
示す。

この結果から明らかなように、本発明の微生物センサー
による測定値とＪＩＳ法により測定した値はよく一致し
ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法における微生物センサーの一実施
例を示す図面である。 第２図は、本発明方法における微生物センサーの他の一
実施例を示す図面である。 第３図は第１図に示す本発明方法における微生物センサ
ーにより測定した溶存酸素濃度の逆数と、試料のＢＯＤ
値の逆数の関係を示す図面である。 以上 ｒｌの浄書 第１図 １固定化微生物充てん容器 ２電甑 ３測定用フロー七ル ４−ンプ ５．６切シ換えパルプ ７記録計 ８測定試料 ９微生物懸濁液 １０緩衝液又はイオン交換水 １１微生物固定化担体 １２エアーｄンデ １　／ＢＯＤ　（ｔ／　ｍ９ ０．０１ 手 続 補 正 書（方式） ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 （１）第１図を別紙の如く訂正する。 １゜ 事件の表示 平成１年特許願第１０６９０７号 ２゜ 発明の名称 微生物センサーの操作方法 ３゜ 補正をする者 事件との関係　　出願人 名称　（０９１）花王株式会社 ４、代理人 住　所　東京都中央区日本橋人形町１丁目３番６号（〒
１０３）平成１年７月２５日 （発送） イ；Ｎ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、微生物を付着固定化するための多孔質担体とこれら
   微生物の作用により生成又は消費される物質を定量する
   電気化学デバイスとを具備する微生物センサーを使用す
   るに当り、多孔質担体に微生物を付着固定化し、測定対
   象物を含有する溶液を通液して、固定化微生物を多孔質
   担体１ｍｌ当り、乾燥微生物重量で０．１ｍｇ以上にな
   るまで増殖させてから使用することを特徴とする微生物
   センサーの操作方法。