JPS6232917B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
本発明は固定化微生物膜に関し、詳しくは所要
の２枚の多孔質膜の間に封入固定された微生物膜
に関し、その目的は、例えばその用途の一つとし
て該微生物膜を電気化学的センサーと組み合わせ
て微生物電極として使用し得る等の効果を有する
固定化微生物膜を提供するにある。 固定化微生物膜と電気化学的センサーとを組み
合わせた、いわゆる微生物電極としては、すでに
種々の型式のものが開発されている。 例えば活性汚泥菌をニユートリエント培地で培
養したのち集菌して、コラーゲン・フイブリル液
と混合し、膜状に成型、風乾後グルタルアルデヒ
ド溶液に浸漬して架橋反応を起こさせ強度を大き
くした固定化微生物膜を作成し、これを溶存酸素
電極の感応面に密着固定化させて製作したBOD
センサーが開発されている（昭51年度日本発酵工
学会大会講演要旨集Ｐ−127、特願昭51−第
121942号、特開昭53−第47895号）。 このような微生物電極用の固定化微生物膜は、
一般的にコラーゲン、ポリアクリルアミド、寒天
などを用いて固定化、製膜する方法が用いられる
が、これらの方法はその製膜操作において過酷な
条件下で処理されるために微生物の活性の低下を
起すと云う欠点がある。 従つて、微生物の活性の低下を極力少くし、か
つ強度も十分な微生物膜を調製するためには、微
生物の種類に応じて、その都度、実験によつて至
適な製膜条件を実験によつて定め、調製時にその
条件をコントロールしなければならないと云う面
倒さがある。しかもこのような綿密な注意と手間
をかけても、微生物の活性低下は避けることがで
きず、特に感受性の強い微生物で、この傾向が著
しく、十分な活性を有する微生物膜の調製は困難
とされていた。 これに対して本発明者らは電気化学的センサー
の表面に微生物を塗布し、多孔質膜で覆つて固定
する方法あるいは多孔質膜を通して微生物懸濁液
を過するなどの方法で多孔質膜の表面に微生物
を付着させ、この膜を電気化学的センサーの表面
に、微生物が付着した面が内側になるように密着
させて固定化させる方法を完成して特許を出願し
た。（特願昭52−第113625号、 「BODの測定
方法」） 本発明者の上記の方法は、従来の微生物膜の欠
点である微生物の活性低下が全く認められず、活
性の良好な微生物電極が得られたが、次のような
欠点を有していた。その一つは安定性の点で、微
生物電極の感受面である多孔質膜面に強い圧を加
えると被覆されている微生物が周辺部へ移動し、
測定試料の濃度と微生物電極の出力電流値の関係
が変化し、微生物電極としての性能が低下するこ
とである。 その二は、この固定化微生物の保存性とそれに
基づく安定性の点である。すなわち通常固定化微
生物膜を保存するには乾燥状態で保存している
が、乾燥に対して耐性の弱い菌は保存中に活性が
低下することである。また保存していた微生物電
極の使用のため固定化微生物を電気化学的センサ
ー面に密着させて微生物電極を組み立てゝ作動を
開始させたとき、微生物電極の性能が安定化して
測定可能な程度に達するまでに１〜２日と云う長
時間を要することである。その理由は乾燥状態で
保存されていた微生物が水分を吸収して活性が安
定化するのに時間を要することを示している。 このような本発明者らの先行技術である単に多
孔質膜で覆つて固定化する固定化微生物膜の欠点
は膜の菌体が上下方向ないしは水平方向に移動し
易くそのために均一性と安定性を欠くことに起因
するものと考え、種々研究の結果、本発明を完成
するにいたつた。 すなわち本発明の要旨は測定対象の各有機化合
物、無機化合物、酸素、水、炭酸ガスを水溶液ま
たはガス状で自由に通過せしめるが微生物菌体を
通過させない多孔質膜２上に所要の厚さを有する
ドーナツ状のリング・スペーサー３を接着し、該
スペーサー３の内空部に活性を有する微生物菌体
５を封入保持し、スペーサーの反対面に多孔質膜
２を接着してなる、上記多孔質膜２面間とスペー
サー３内側面より構成された内空部に封入固定さ
れた固定化微生物膜である。 本発明の固定化微生物膜１の構造の一例を第１
図の正面図Ａ及び平面図Ｂで示す。第１図におい
て２は多孔質膜、３はリング状スペーサー、４は
メツシユ状スペーサー、５は封入された微生物菌
体である。 多孔質膜２は測定対象の炭素源、Ｌ−アミノ酸
等の各種の有機化合物、アンモニア等の無機化合
物あるいは微生物の活性保持に必要な酸素、水及
び炭酸ガス等の物質は水溶液又はガス状で自由に
通過せしめるが、微生物菌体を通過させない多孔
質の膜で例えばアセチルセルロース膜、セロフア
ン膜、紙、多孔質テフロン膜、シリコーン膜等
が用いられ、これらはアセチルセルロース膜（日
本ミリポア社製、タイプHA、厚さ150μｍ、孔
径0.45μｍ）、セロフアン膜（テクニコン社製、
タイプＣ、文献によれば湿状態孔径0.45μｍ）、
紙（No.5C）、多孔質テフロン膜（日本ミリポア
社、タイプFH、孔径0.5μｍ）、及びシリコーン
膜（ラジオメーター社、タイプD606）として市
販されている。この他エチルセルロース、ポリビ
ニルアルコール、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等の
殆んどのプラスチツクフイルムをこの目的に適し
たフイルムに製造することによつて使用すること
が可能である。 リング状スペーサー３は図に示すような厚さを
有する平面図で同心円状の内円部が中空のリング
状のものすなわちドーナツ状のものが好ましく用
いられるが、単に円形に限定されず正多角形でも
よく要は、厚さを有してその上、下両面に多孔質
膜２を接着して微生物菌体を多孔質膜面とリング
スペーサー内側面によつて構成された内空部に保
持し外部へ漏出しないように封入すると同時に、
その内空部に微生物菌体を保持して、菌体自体に
直接に外圧が加わらないような形状であればよ
く、素材としては例えばガラスまたはポリ塩化ビ
ニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピ
レン等のプラスチツクスが用いられる。メツシ
ユ・スペーサー４は２枚の多孔質膜面とリング・
スペーサー３の内側面によつて形成される中空部
のスペースを保持させると同時にスペース内部に
微生物菌体を保持して菌体が移動しないように固
定する役目をなし、素材としては例えばリング・
スペーサー３と同様な素材でつくられ、格子状、
簀の子状ないしは網状で菌体を移動しないように
保持する。しかしセンサーの使用上、固定化微生
物膜面にあまり圧力が加わらない場合にはメツシ
ユ・スペーサー４は用いなくてもよい。５は封入
された微生物菌体で通常は培養液から遠心分離等
で分離し生理食塩水で洗浄した洗浄菌体が用いら
れるが目的によつて有機溶媒ないしは界面活性剤
処理菌体あるいは凍結乾燥菌体等の活性を有する
菌体を用いる場合がある。 第２図に本発明の固定化微生物膜１を用い、セ
ンサーとして例えば溶存酸素電極６を組み合わせ
て製作したBOD測定用の微生物電極の構造の説
明図を示す。図中、溶存酸素電極６の感応面に本
発明の微生物膜１が密着され、ナイロンネツト７
で押えて輪ゴム８で溶存酸素電極６に固定してい
る状態を示す。尚ここにはセンサーとして酸素電
極と組み合わせた溶存酸素電極を例として示した
がセンサーとしてはこの他に炭酸ガス電極と組み
合わせたアミノ酸センサー、酸素電極と組み合わ
せたアルコールセンサー、又は酸素電極と組み合
わせたアンモニアセンサー等の種々のセンサーと
の組み合わせが考えられ、本発明の固定化微生物
膜は、これらのすべてのセンサーとの組み合わせ
が可能である。このようにして構成された微生物
電極は第３図の測定装置の系統の説明図で示され
たような測定システムに組み込まれて廃水中の
BOD測定用等に用いられる。第３図中、６は溶
存酸素電極で固定化微生物膜１を密着させて溶存
酸素微生物電極を構成する。この微生物電極はフ
ローセル９内に取りつけられ、一定温度に調節さ
れた恒温水槽１０内に設置して一定温度に保持さ
れる。フローセル９内は撹拌子１２とマグネチツ
ク・スターラー１１によつて撹拌され均一状態に
保たれる。このフローセル９内には常にバツフア
ー液１３の一定量を流し、同時に空気又は場合に
より窒素ガス等の不活性ガス１４を送り込み、バ
ツフアー液は酸素又は該不活性ガスによつて飽和
されているようにし記録計における平衡電流値は
安定化した値を示すようになる。すなわち例え
ば、溶存酸素電極の場合は１４より酸素が送られ
固定化微生物膜をとおしてバツフアー液中に溶存
酸素が拡散してゆき溶存酸素電極は一定の指示値
を示す。このときサンプル液１５をフローセル９
内に注入すると、例えばBOD測定の場合はサン
プル内に含まれている有機物質（汚濁物質）は固
定化微生物膜内へと拡散していき固定化微生物膜
内の微生物によつて資化代謝され、微生物は酸素
を消費し、固定化微生物膜を通して溶存酸素電極
に到達する酸素の一部が消費され、溶存酸素電極
６の指示値は減少する。この指示値の減少量はサ
ンプル１５中の有機化合物の量、すなわちサンプ
ルのBODに対応するので試料中のBOD量を測定
することができる。通例JIS法ではBODの測定の
ため５日間の培養測定を必要とするが本発明の固
定化微生物膜を用いる電気化学的測定法を用いれ
ば10〜30分と云う短時間でBODを測定できると
云う特徴がある。 このようなBOD測定装置を排水モニターとし
て使用し、１週間程度連続作動させると固定化微
生物膜の表面に汚染物質が付着しBOD指示特性
が変化する。これを防止するために固定化微生物
膜表面に水ジエツトを吹きつけたり、ガーゼで拭
つたりなどして汚染物質を除去する必要がある
が、従来の固定化微生物膜のように単に膜をもつ
て微生物を被覆固定した方式では、この操作によ
つて電極面の菌が移動して電極の特性が変化して
しまうことが屡々であつた。しかし、本発明によ
る固定化微生物膜は微生物が限定された空間内に
しつかりと固定保持されているので、微生物膜を
溶存酸素電極の感受面に取付けた後に表面を拭う
等の方法で汚水の除去を行なつても電極の特性が
変化する虞れはなく、安定性の面から従来の膜に
比較して遥かに優れた効果が得られた。又、
BOD測定用の固定化微生物膜は、通常製作後乾
燥状態で室温保存しているが、この保存していた
固定化微生物膜を、例えば溶存酸素電極に取り付
けて作動状態にしたとき、菌の活性が回復して安
定したBODの指示特性を示すために１〜２日を
要していた。これに対して本発明の固定化微生物
膜は、使用開始の１〜２日前に水又は栄養培地に
浸して室温に放置することによつて微生物の活性
を回復、安定化させ、その後に例えば溶存酸素電
極に取付けて作動させると１〜２時間と云う短時
間で、BOD指示特性が安定化を示し、保存性の
面からも従来品に較べて優秀性を示した。 本発明の固定化微生物膜は乾燥に対する耐久性
の弱い菌に特に適する。例えばアンモニア・セン
サー用に硝化細菌菌体を固定化した微生物膜を用
いてそれを保存のため乾燥状態にした場合、従来
の単に膜で掩うだけの微生物膜では活性が速やか
に低下したが本発明の固定化微生物膜は調製後、
硫安溶液中に保存させることにより１ケ月以上に
及んで活性を保持させることができた。 以上述べたように、本発明の固定化微生物膜は
長期の使用期間でも活性低下が少なく、機械的衝
撃や圧力に対して安定で、又長期保存後にセンサ
ーに装着したときに短時間に安定化し、また液中
で保存できるために乾燥に対して弱い微生物を用
いた固定化微生物膜でも、長い期間保存できる微
生物電極用の微生物膜が得られるのでその実用的
価値は極めて大きい。 以下本発明の固定化微生物膜をセンサーと組み
合わせた微生物電極の使用例の一例を示す。本実
施例は単なる応用の一例であり、ここに示された
ような測定法とは別の測定並びに、測定用として
ではなく固定化微生物として種々の利用が可能で
あることはもちろんである。 以下％は特記なき限りｇ／dl％を示す。 実施例 １ （BOD測定用微生物電極への応用） 雑食性の酵母トリコスポロン クタネウム
（Trichosporon cutaneum）CBS2466をグルコー
ス１％、ポリペプトン１％、酵母エキス１％、食
塩0.5％の培地50mlに接種し、30℃で10時間通気
培養した後、遠心分離して得た湿菌体を直径５
mm、厚さ0.2mmのNo.5C紙の両面に塗布した。つ
ぎに、１枚の多孔質アセチルセルロース膜（ミリ
ポアフイルター社HA型）の上にリング・スペー
サーとして外径15mm、内径5.5mm、厚さ0.25mmの
ドーナツ状のリングビニールシートの両面に接着
剤を塗布して接着し、その中空部に上記酵母の菌
体を塗布した紙を置き、別の１枚の多孔質アセ
チルセルロース膜をかぶせて接着し、第１図に示
すような固定化微生物膜を製作して室温（15〜25
℃）で１ケ月保存した。１ケ月後にこの固定化微
生物膜をとり出し、次の手順でBOD測定用微生
物電極を組立て、廃水サンプル中のBOD測定を
行なつた。まず、200mlの三角フラスコ中に100ml
の水道水を注入し、これにこの中に保存しておい
た固定化微生物膜を浮遊させ、室温（20℃）で40
時間放置した。このようにして、乾燥状態から活
性状態に回復させた固定化微生物膜を第２図に示
すように溶存酸素電極に取付け、第３図に示すよ
うな測定システムに組込み、水槽の温度を30℃に
保ちつゝ250ml／minの空気とともに、バツフア
液として0.01Mのリン酸バツフア液（PH７）を一
定流量（１ml／min）でフローセルに流した。こ
のようにして微生物電極を作動させたのち、標準
被検液として、日本工業規格で定められているグ
ルコース・Ｌ−グルタミン酸標準液（グルコース
とＬ−グルタミン酸の等量混合液）をBOD値
360ppmに希釈した溶液を流量0.2ml／minでの注
入をくり返したときの微生物電極の出力電流の変
化を調べた。このときの注入のサイクルタイムは
１時間とし、注入時間は20分とした。第４図は、
このときの微生物電極の出力電流の変化の時間的
経過を表わしたもので、図中Ａ，Ｃ，Ｅはグルコ
ース・Ｌ−グルタミン酸標準液を注入しないとき
の電流値（BOD 0ppmに対応する電流値を示
し、以下ベースラインとよぶ）、Ｂ，Ｄ，Ｆは
BOD値360pmのグルコース、Ｌ−グルタミン酸
標準液に対する平衡出力電流値をμＡで示し、横
軸の数値は時間を示す。図から本法による固定化
微生物膜を用いた微生物電極では、３時間程度の
短時間でベースラインおよびサンプルに対する兵
衡電流値が安定化し、実際の測定に使用できるこ
とが分かる。 これに対して、従来法の固定化微生物膜を用い
た場合、乾燥保存後構造上水中に浮遊させて安定
化させることができない（微生物が多孔質膜から
はく離してしまう）ので、微生物電極に組立てた
後実際の測定に使用するまでに、第５図に示すよ
うに１〜２日間予備的に作動させて、指示特性が
安定化するのを待たねばならぬという問題点があ
る（第５図の数値は第４図と同じで上のA′、
C′、E′はBOD標準液を注入しないときのカーブ
で下のB′、D′、F′はBOD360ppmのサンプルを注
入したときのカーブでそれぞれ電流値が安定化し
て行く過程を示す。）。第６図は本発明による
BOD測定装置にグルコース、Ｌ−グルタミン酸
標準液のBOD120(A)、240(B)、360(C)ppmの液をそ
れぞれ25分間注入したときの応答曲線を示す。第
７図は、その結果をたて軸に微生物電極の出力電
流の電流減少値を、横軸に標準液のBOD値をと
つて表わしたものである。図から、本発明による
固定化微生物膜を用いた微生物電極は良好な直線
性を示すことが判る。つぎに、発酵工場の未処理
廃水を本装置で測定してBODを求め、同時に日
本工業規格に定められているJIS法（工場排水試
験方法JIS Ｋ 0102〔1972〕）に従つてBOD値を
測定した。その結果を第８図にプロツトした。図
から判るように廃水の測定結果（縦軸）とJIS法
で得られたBOD値（横軸）とがよく一致してい
ることを示している。本装置を長期間連絡作動さ
せると、微生物電極の感受面などにスライム等の
汚染物質が付着して次第に微生物電極の指示特性
が変化してくる。このため、７〜10日に１度程度
は装置の配管、フローセルを掃除すると同時に、
微生物電極の感受面、すなわち、固定化微生物膜
の表面を水ジエツトで洗つたり、ガーゼでぬぐつ
たりして付着しているスライム等を除去する必要
がある。本発明による固定化微生物膜を用いた微
生物電極は、このような洗浄操作によつて特性の
変化は起らず、極めて安定であつた。これに比べ
て、従来法の微生物電極では、ガーゼでぬぐつた
りすると微生物電極面の微生物が移動して、特性
が変つてしまうことが度々起こつた。 実施例 ２ （アンモニア測定用微生物電極への応用例） 表１、Ａに示す培地を2000ml容の三角フラスコ
に移し、炭酸カリウム50％溶液でPHを8.3に調整
後121℃で20分間殺菌した。ただし、硫酸マグネ
シウムと塩化カルシウムは沈澱生成を防止するた
め、上記と同一条件で別殺菌し、それぞれ放冷後
に混合した。このような培地にニトロソモナスヨ
ウロパエア（Nitrosomonas europaea）
ATCC19718の培養液10mlを接種、室温（30℃前
後）で25日間静置培養した。培養中にPHが低下
し、指示薬クレゾール・レツドの色が赤から黄に
変化したときは、殺菌した50％炭酸カリウム溶液
を指示薬がもとの色にもどるまで滴下してPHを一
定に保つた。次に容積５の曝気槽に表１、Ａの
培地を1500ml張込み、炭酸カルシウム粉末15ｇを
加えたのちに1Nの炭酸カリウム溶液でPHを8.0に
調節後、先に培養したニトロソモナス・ヨウロパ
エアの培養液1000mlを加え、散気管を通して1/2
VVMで空気を吹込みつつ、好気的に室温（20〜
30℃）で培養した。
の２枚の多孔質膜の間に封入固定された微生物膜
に関し、その目的は、例えばその用途の一つとし
て該微生物膜を電気化学的センサーと組み合わせ
て微生物電極として使用し得る等の効果を有する
固定化微生物膜を提供するにある。 固定化微生物膜と電気化学的センサーとを組み
合わせた、いわゆる微生物電極としては、すでに
種々の型式のものが開発されている。 例えば活性汚泥菌をニユートリエント培地で培
養したのち集菌して、コラーゲン・フイブリル液
と混合し、膜状に成型、風乾後グルタルアルデヒ
ド溶液に浸漬して架橋反応を起こさせ強度を大き
くした固定化微生物膜を作成し、これを溶存酸素
電極の感応面に密着固定化させて製作したBOD
センサーが開発されている（昭51年度日本発酵工
学会大会講演要旨集Ｐ−127、特願昭51−第
121942号、特開昭53−第47895号）。 このような微生物電極用の固定化微生物膜は、
一般的にコラーゲン、ポリアクリルアミド、寒天
などを用いて固定化、製膜する方法が用いられる
が、これらの方法はその製膜操作において過酷な
条件下で処理されるために微生物の活性の低下を
起すと云う欠点がある。 従つて、微生物の活性の低下を極力少くし、か
つ強度も十分な微生物膜を調製するためには、微
生物の種類に応じて、その都度、実験によつて至
適な製膜条件を実験によつて定め、調製時にその
条件をコントロールしなければならないと云う面
倒さがある。しかもこのような綿密な注意と手間
をかけても、微生物の活性低下は避けることがで
きず、特に感受性の強い微生物で、この傾向が著
しく、十分な活性を有する微生物膜の調製は困難
とされていた。 これに対して本発明者らは電気化学的センサー
の表面に微生物を塗布し、多孔質膜で覆つて固定
する方法あるいは多孔質膜を通して微生物懸濁液
を過するなどの方法で多孔質膜の表面に微生物
を付着させ、この膜を電気化学的センサーの表面
に、微生物が付着した面が内側になるように密着
させて固定化させる方法を完成して特許を出願し
た。（特願昭52−第113625号、 「BODの測定
方法」） 本発明者の上記の方法は、従来の微生物膜の欠
点である微生物の活性低下が全く認められず、活
性の良好な微生物電極が得られたが、次のような
欠点を有していた。その一つは安定性の点で、微
生物電極の感受面である多孔質膜面に強い圧を加
えると被覆されている微生物が周辺部へ移動し、
測定試料の濃度と微生物電極の出力電流値の関係
が変化し、微生物電極としての性能が低下するこ
とである。 その二は、この固定化微生物の保存性とそれに
基づく安定性の点である。すなわち通常固定化微
生物膜を保存するには乾燥状態で保存している
が、乾燥に対して耐性の弱い菌は保存中に活性が
低下することである。また保存していた微生物電
極の使用のため固定化微生物を電気化学的センサ
ー面に密着させて微生物電極を組み立てゝ作動を
開始させたとき、微生物電極の性能が安定化して
測定可能な程度に達するまでに１〜２日と云う長
時間を要することである。その理由は乾燥状態で
保存されていた微生物が水分を吸収して活性が安
定化するのに時間を要することを示している。 このような本発明者らの先行技術である単に多
孔質膜で覆つて固定化する固定化微生物膜の欠点
は膜の菌体が上下方向ないしは水平方向に移動し
易くそのために均一性と安定性を欠くことに起因
するものと考え、種々研究の結果、本発明を完成
するにいたつた。 すなわち本発明の要旨は測定対象の各有機化合
物、無機化合物、酸素、水、炭酸ガスを水溶液ま
たはガス状で自由に通過せしめるが微生物菌体を
通過させない多孔質膜２上に所要の厚さを有する
ドーナツ状のリング・スペーサー３を接着し、該
スペーサー３の内空部に活性を有する微生物菌体
５を封入保持し、スペーサーの反対面に多孔質膜
２を接着してなる、上記多孔質膜２面間とスペー
サー３内側面より構成された内空部に封入固定さ
れた固定化微生物膜である。 本発明の固定化微生物膜１の構造の一例を第１
図の正面図Ａ及び平面図Ｂで示す。第１図におい
て２は多孔質膜、３はリング状スペーサー、４は
メツシユ状スペーサー、５は封入された微生物菌
体である。 多孔質膜２は測定対象の炭素源、Ｌ−アミノ酸
等の各種の有機化合物、アンモニア等の無機化合
物あるいは微生物の活性保持に必要な酸素、水及
び炭酸ガス等の物質は水溶液又はガス状で自由に
通過せしめるが、微生物菌体を通過させない多孔
質の膜で例えばアセチルセルロース膜、セロフア
ン膜、紙、多孔質テフロン膜、シリコーン膜等
が用いられ、これらはアセチルセルロース膜（日
本ミリポア社製、タイプHA、厚さ150μｍ、孔
径0.45μｍ）、セロフアン膜（テクニコン社製、
タイプＣ、文献によれば湿状態孔径0.45μｍ）、
紙（No.5C）、多孔質テフロン膜（日本ミリポア
社、タイプFH、孔径0.5μｍ）、及びシリコーン
膜（ラジオメーター社、タイプD606）として市
販されている。この他エチルセルロース、ポリビ
ニルアルコール、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等の
殆んどのプラスチツクフイルムをこの目的に適し
たフイルムに製造することによつて使用すること
が可能である。 リング状スペーサー３は図に示すような厚さを
有する平面図で同心円状の内円部が中空のリング
状のものすなわちドーナツ状のものが好ましく用
いられるが、単に円形に限定されず正多角形でも
よく要は、厚さを有してその上、下両面に多孔質
膜２を接着して微生物菌体を多孔質膜面とリング
スペーサー内側面によつて構成された内空部に保
持し外部へ漏出しないように封入すると同時に、
その内空部に微生物菌体を保持して、菌体自体に
直接に外圧が加わらないような形状であればよ
く、素材としては例えばガラスまたはポリ塩化ビ
ニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピ
レン等のプラスチツクスが用いられる。メツシ
ユ・スペーサー４は２枚の多孔質膜面とリング・
スペーサー３の内側面によつて形成される中空部
のスペースを保持させると同時にスペース内部に
微生物菌体を保持して菌体が移動しないように固
定する役目をなし、素材としては例えばリング・
スペーサー３と同様な素材でつくられ、格子状、
簀の子状ないしは網状で菌体を移動しないように
保持する。しかしセンサーの使用上、固定化微生
物膜面にあまり圧力が加わらない場合にはメツシ
ユ・スペーサー４は用いなくてもよい。５は封入
された微生物菌体で通常は培養液から遠心分離等
で分離し生理食塩水で洗浄した洗浄菌体が用いら
れるが目的によつて有機溶媒ないしは界面活性剤
処理菌体あるいは凍結乾燥菌体等の活性を有する
菌体を用いる場合がある。 第２図に本発明の固定化微生物膜１を用い、セ
ンサーとして例えば溶存酸素電極６を組み合わせ
て製作したBOD測定用の微生物電極の構造の説
明図を示す。図中、溶存酸素電極６の感応面に本
発明の微生物膜１が密着され、ナイロンネツト７
で押えて輪ゴム８で溶存酸素電極６に固定してい
る状態を示す。尚ここにはセンサーとして酸素電
極と組み合わせた溶存酸素電極を例として示した
がセンサーとしてはこの他に炭酸ガス電極と組み
合わせたアミノ酸センサー、酸素電極と組み合わ
せたアルコールセンサー、又は酸素電極と組み合
わせたアンモニアセンサー等の種々のセンサーと
の組み合わせが考えられ、本発明の固定化微生物
膜は、これらのすべてのセンサーとの組み合わせ
が可能である。このようにして構成された微生物
電極は第３図の測定装置の系統の説明図で示され
たような測定システムに組み込まれて廃水中の
BOD測定用等に用いられる。第３図中、６は溶
存酸素電極で固定化微生物膜１を密着させて溶存
酸素微生物電極を構成する。この微生物電極はフ
ローセル９内に取りつけられ、一定温度に調節さ
れた恒温水槽１０内に設置して一定温度に保持さ
れる。フローセル９内は撹拌子１２とマグネチツ
ク・スターラー１１によつて撹拌され均一状態に
保たれる。このフローセル９内には常にバツフア
ー液１３の一定量を流し、同時に空気又は場合に
より窒素ガス等の不活性ガス１４を送り込み、バ
ツフアー液は酸素又は該不活性ガスによつて飽和
されているようにし記録計における平衡電流値は
安定化した値を示すようになる。すなわち例え
ば、溶存酸素電極の場合は１４より酸素が送られ
固定化微生物膜をとおしてバツフアー液中に溶存
酸素が拡散してゆき溶存酸素電極は一定の指示値
を示す。このときサンプル液１５をフローセル９
内に注入すると、例えばBOD測定の場合はサン
プル内に含まれている有機物質（汚濁物質）は固
定化微生物膜内へと拡散していき固定化微生物膜
内の微生物によつて資化代謝され、微生物は酸素
を消費し、固定化微生物膜を通して溶存酸素電極
に到達する酸素の一部が消費され、溶存酸素電極
６の指示値は減少する。この指示値の減少量はサ
ンプル１５中の有機化合物の量、すなわちサンプ
ルのBODに対応するので試料中のBOD量を測定
することができる。通例JIS法ではBODの測定の
ため５日間の培養測定を必要とするが本発明の固
定化微生物膜を用いる電気化学的測定法を用いれ
ば10〜30分と云う短時間でBODを測定できると
云う特徴がある。 このようなBOD測定装置を排水モニターとし
て使用し、１週間程度連続作動させると固定化微
生物膜の表面に汚染物質が付着しBOD指示特性
が変化する。これを防止するために固定化微生物
膜表面に水ジエツトを吹きつけたり、ガーゼで拭
つたりなどして汚染物質を除去する必要がある
が、従来の固定化微生物膜のように単に膜をもつ
て微生物を被覆固定した方式では、この操作によ
つて電極面の菌が移動して電極の特性が変化して
しまうことが屡々であつた。しかし、本発明によ
る固定化微生物膜は微生物が限定された空間内に
しつかりと固定保持されているので、微生物膜を
溶存酸素電極の感受面に取付けた後に表面を拭う
等の方法で汚水の除去を行なつても電極の特性が
変化する虞れはなく、安定性の面から従来の膜に
比較して遥かに優れた効果が得られた。又、
BOD測定用の固定化微生物膜は、通常製作後乾
燥状態で室温保存しているが、この保存していた
固定化微生物膜を、例えば溶存酸素電極に取り付
けて作動状態にしたとき、菌の活性が回復して安
定したBODの指示特性を示すために１〜２日を
要していた。これに対して本発明の固定化微生物
膜は、使用開始の１〜２日前に水又は栄養培地に
浸して室温に放置することによつて微生物の活性
を回復、安定化させ、その後に例えば溶存酸素電
極に取付けて作動させると１〜２時間と云う短時
間で、BOD指示特性が安定化を示し、保存性の
面からも従来品に較べて優秀性を示した。 本発明の固定化微生物膜は乾燥に対する耐久性
の弱い菌に特に適する。例えばアンモニア・セン
サー用に硝化細菌菌体を固定化した微生物膜を用
いてそれを保存のため乾燥状態にした場合、従来
の単に膜で掩うだけの微生物膜では活性が速やか
に低下したが本発明の固定化微生物膜は調製後、
硫安溶液中に保存させることにより１ケ月以上に
及んで活性を保持させることができた。 以上述べたように、本発明の固定化微生物膜は
長期の使用期間でも活性低下が少なく、機械的衝
撃や圧力に対して安定で、又長期保存後にセンサ
ーに装着したときに短時間に安定化し、また液中
で保存できるために乾燥に対して弱い微生物を用
いた固定化微生物膜でも、長い期間保存できる微
生物電極用の微生物膜が得られるのでその実用的
価値は極めて大きい。 以下本発明の固定化微生物膜をセンサーと組み
合わせた微生物電極の使用例の一例を示す。本実
施例は単なる応用の一例であり、ここに示された
ような測定法とは別の測定並びに、測定用として
ではなく固定化微生物として種々の利用が可能で
あることはもちろんである。 以下％は特記なき限りｇ／dl％を示す。 実施例 １ （BOD測定用微生物電極への応用） 雑食性の酵母トリコスポロン クタネウム
（Trichosporon cutaneum）CBS2466をグルコー
ス１％、ポリペプトン１％、酵母エキス１％、食
塩0.5％の培地50mlに接種し、30℃で10時間通気
培養した後、遠心分離して得た湿菌体を直径５
mm、厚さ0.2mmのNo.5C紙の両面に塗布した。つ
ぎに、１枚の多孔質アセチルセルロース膜（ミリ
ポアフイルター社HA型）の上にリング・スペー
サーとして外径15mm、内径5.5mm、厚さ0.25mmの
ドーナツ状のリングビニールシートの両面に接着
剤を塗布して接着し、その中空部に上記酵母の菌
体を塗布した紙を置き、別の１枚の多孔質アセ
チルセルロース膜をかぶせて接着し、第１図に示
すような固定化微生物膜を製作して室温（15〜25
℃）で１ケ月保存した。１ケ月後にこの固定化微
生物膜をとり出し、次の手順でBOD測定用微生
物電極を組立て、廃水サンプル中のBOD測定を
行なつた。まず、200mlの三角フラスコ中に100ml
の水道水を注入し、これにこの中に保存しておい
た固定化微生物膜を浮遊させ、室温（20℃）で40
時間放置した。このようにして、乾燥状態から活
性状態に回復させた固定化微生物膜を第２図に示
すように溶存酸素電極に取付け、第３図に示すよ
うな測定システムに組込み、水槽の温度を30℃に
保ちつゝ250ml／minの空気とともに、バツフア
液として0.01Mのリン酸バツフア液（PH７）を一
定流量（１ml／min）でフローセルに流した。こ
のようにして微生物電極を作動させたのち、標準
被検液として、日本工業規格で定められているグ
ルコース・Ｌ−グルタミン酸標準液（グルコース
とＬ−グルタミン酸の等量混合液）をBOD値
360ppmに希釈した溶液を流量0.2ml／minでの注
入をくり返したときの微生物電極の出力電流の変
化を調べた。このときの注入のサイクルタイムは
１時間とし、注入時間は20分とした。第４図は、
このときの微生物電極の出力電流の変化の時間的
経過を表わしたもので、図中Ａ，Ｃ，Ｅはグルコ
ース・Ｌ−グルタミン酸標準液を注入しないとき
の電流値（BOD 0ppmに対応する電流値を示
し、以下ベースラインとよぶ）、Ｂ，Ｄ，Ｆは
BOD値360pmのグルコース、Ｌ−グルタミン酸
標準液に対する平衡出力電流値をμＡで示し、横
軸の数値は時間を示す。図から本法による固定化
微生物膜を用いた微生物電極では、３時間程度の
短時間でベースラインおよびサンプルに対する兵
衡電流値が安定化し、実際の測定に使用できるこ
とが分かる。 これに対して、従来法の固定化微生物膜を用い
た場合、乾燥保存後構造上水中に浮遊させて安定
化させることができない（微生物が多孔質膜から
はく離してしまう）ので、微生物電極に組立てた
後実際の測定に使用するまでに、第５図に示すよ
うに１〜２日間予備的に作動させて、指示特性が
安定化するのを待たねばならぬという問題点があ
る（第５図の数値は第４図と同じで上のA′、
C′、E′はBOD標準液を注入しないときのカーブ
で下のB′、D′、F′はBOD360ppmのサンプルを注
入したときのカーブでそれぞれ電流値が安定化し
て行く過程を示す。）。第６図は本発明による
BOD測定装置にグルコース、Ｌ−グルタミン酸
標準液のBOD120(A)、240(B)、360(C)ppmの液をそ
れぞれ25分間注入したときの応答曲線を示す。第
７図は、その結果をたて軸に微生物電極の出力電
流の電流減少値を、横軸に標準液のBOD値をと
つて表わしたものである。図から、本発明による
固定化微生物膜を用いた微生物電極は良好な直線
性を示すことが判る。つぎに、発酵工場の未処理
廃水を本装置で測定してBODを求め、同時に日
本工業規格に定められているJIS法（工場排水試
験方法JIS Ｋ 0102〔1972〕）に従つてBOD値を
測定した。その結果を第８図にプロツトした。図
から判るように廃水の測定結果（縦軸）とJIS法
で得られたBOD値（横軸）とがよく一致してい
ることを示している。本装置を長期間連絡作動さ
せると、微生物電極の感受面などにスライム等の
汚染物質が付着して次第に微生物電極の指示特性
が変化してくる。このため、７〜10日に１度程度
は装置の配管、フローセルを掃除すると同時に、
微生物電極の感受面、すなわち、固定化微生物膜
の表面を水ジエツトで洗つたり、ガーゼでぬぐつ
たりして付着しているスライム等を除去する必要
がある。本発明による固定化微生物膜を用いた微
生物電極は、このような洗浄操作によつて特性の
変化は起らず、極めて安定であつた。これに比べ
て、従来法の微生物電極では、ガーゼでぬぐつた
りすると微生物電極面の微生物が移動して、特性
が変つてしまうことが度々起こつた。 実施例 ２ （アンモニア測定用微生物電極への応用例） 表１、Ａに示す培地を2000ml容の三角フラスコ
に移し、炭酸カリウム50％溶液でPHを8.3に調整
後121℃で20分間殺菌した。ただし、硫酸マグネ
シウムと塩化カルシウムは沈澱生成を防止するた
め、上記と同一条件で別殺菌し、それぞれ放冷後
に混合した。このような培地にニトロソモナスヨ
ウロパエア（Nitrosomonas europaea）
ATCC19718の培養液10mlを接種、室温（30℃前
後）で25日間静置培養した。培養中にPHが低下
し、指示薬クレゾール・レツドの色が赤から黄に
変化したときは、殺菌した50％炭酸カリウム溶液
を指示薬がもとの色にもどるまで滴下してPHを一
定に保つた。次に容積５の曝気槽に表１、Ａの
培地を1500ml張込み、炭酸カルシウム粉末15ｇを
加えたのちに1Nの炭酸カリウム溶液でPHを8.0に
調節後、先に培養したニトロソモナス・ヨウロパ
エアの培養液1000mlを加え、散気管を通して1/2
VVMで空気を吹込みつつ、好気的に室温（20〜
30℃）で培養した。
【表】
その際、表１、Ｂに示す培地を200ml/日連続的
に供給し、かつ曝気槽内の培養液はオーバフロー
口を設けることによつて常に2500mlに保つた。ま
た培養中にPHが低下したので1N炭酸カリウムを
添加してPHを常に8.0に保つた。 このようにして３ケ月培養し硝化細菌を炭酸カ
ルシウム粉末の表面に付着させ、生育させた。 しかるのちにこの培養液５mlを直径47mmのミリ
ポアフイルターで過してその表面に炭酸カルシ
ウム粉末とともにその表面に生育している硝化細
菌を付着させた。なお、ミリポアフイルターには
あらかじめ外径15mm、内径5.5mm、厚さ0.2mmのド
ーナツ状のビニールリングを接着しておき、これ
を接着した面に硝化菌が付着するようにした。し
かるのちにビニールリング上に付着している硝化
菌及び炭酸カルシウムを除去したのちに、接着剤
を塗布してから、別のミリポアフイルターを重ね
て圧着し、ビニールリング周辺にそつて切取り、
第１図に示すように硝化細菌を封入して固定化微
生物膜を得た。このようにして製作した固定化微
生物膜を、容積200mlの三角フラスコ中に表１、
Ａの培地100mlをそゝいだものの中に浮遊させ紙
栓をして室温で保存した。保存中に固定化微生物
によつて培地中のアンモニアが酸化され硝酸が生
成するため、保存用培地のPHが低下する。この場
合は添加してある指示薬（クレゾール・レツド）
の色が赤から黄に変化するので1N炭酸カリウム
を加えPHを元の値にもどした。このようにして１
ケ月保存した固定化微生物膜をとり出し、第２図
に示すように溶存酸素電極に取付け、第３図に示
すような測定システムに組込み、水槽１０の温度
を30℃に保ちつゝ、バツフア液として0.05M/
の炭酸ソーダと0.05M/のリン酸第１カリウム
の等量混合液を調製して3.9ml/minで同流量の空
気とともにフローセル９に流した。微生物電極
（(6)＋(1)）の出力電流が安定したのち、被検液を
流量0.8ml/minで10分間バツフア液のライン中に
注入して、微生物電極の出力電圧の変化を記録し
た。このようにして、30分に１回の割合で、硫安
をそれぞれ10(C)、20(B)、30(A)ppm含むサンプル
を注入した。第９図はその結果を示したもので、
たて軸に微生物電極の出力電流（μＡ）、横軸に
時間をとつて表わしたものである。図から、サン
プルを注入したとき６分程度で微生物電極の出力
電流値がサンプル中のアンモニア濃度に対応した
平衡電流値を示すこと、サンプルの注入を中止す
ると出力電流値がすみやかに以前のレベルにもど
ることが分かる。第１０図はたて軸に微生物電極
の出力電流の減少値（μＡ）、横軸にサンプル中
のアンモニア濃度（ppm）をとつて両者の関係
をプロツトしたもので、両者がよい直線関係を示
すこと、すなわちアンモニアの測定装置として好
ましい特性をもつことを示している。 製作した固定化微生物膜は、乾燥状態で保存す
ると１日以内に失活し、この固定化微生物は上述
のように測定システムに組込んで作動させても全
くアンモニアに応答を示さなかつた。固定化微生
物膜の液中保存は、本発明による製作法によつて
可能となつた。
に供給し、かつ曝気槽内の培養液はオーバフロー
口を設けることによつて常に2500mlに保つた。ま
た培養中にPHが低下したので1N炭酸カリウムを
添加してPHを常に8.0に保つた。 このようにして３ケ月培養し硝化細菌を炭酸カ
ルシウム粉末の表面に付着させ、生育させた。 しかるのちにこの培養液５mlを直径47mmのミリ
ポアフイルターで過してその表面に炭酸カルシ
ウム粉末とともにその表面に生育している硝化細
菌を付着させた。なお、ミリポアフイルターには
あらかじめ外径15mm、内径5.5mm、厚さ0.2mmのド
ーナツ状のビニールリングを接着しておき、これ
を接着した面に硝化菌が付着するようにした。し
かるのちにビニールリング上に付着している硝化
菌及び炭酸カルシウムを除去したのちに、接着剤
を塗布してから、別のミリポアフイルターを重ね
て圧着し、ビニールリング周辺にそつて切取り、
第１図に示すように硝化細菌を封入して固定化微
生物膜を得た。このようにして製作した固定化微
生物膜を、容積200mlの三角フラスコ中に表１、
Ａの培地100mlをそゝいだものの中に浮遊させ紙
栓をして室温で保存した。保存中に固定化微生物
によつて培地中のアンモニアが酸化され硝酸が生
成するため、保存用培地のPHが低下する。この場
合は添加してある指示薬（クレゾール・レツド）
の色が赤から黄に変化するので1N炭酸カリウム
を加えPHを元の値にもどした。このようにして１
ケ月保存した固定化微生物膜をとり出し、第２図
に示すように溶存酸素電極に取付け、第３図に示
すような測定システムに組込み、水槽１０の温度
を30℃に保ちつゝ、バツフア液として0.05M/
の炭酸ソーダと0.05M/のリン酸第１カリウム
の等量混合液を調製して3.9ml/minで同流量の空
気とともにフローセル９に流した。微生物電極
（(6)＋(1)）の出力電流が安定したのち、被検液を
流量0.8ml/minで10分間バツフア液のライン中に
注入して、微生物電極の出力電圧の変化を記録し
た。このようにして、30分に１回の割合で、硫安
をそれぞれ10(C)、20(B)、30(A)ppm含むサンプル
を注入した。第９図はその結果を示したもので、
たて軸に微生物電極の出力電流（μＡ）、横軸に
時間をとつて表わしたものである。図から、サン
プルを注入したとき６分程度で微生物電極の出力
電流値がサンプル中のアンモニア濃度に対応した
平衡電流値を示すこと、サンプルの注入を中止す
ると出力電流値がすみやかに以前のレベルにもど
ることが分かる。第１０図はたて軸に微生物電極
の出力電流の減少値（μＡ）、横軸にサンプル中
のアンモニア濃度（ppm）をとつて両者の関係
をプロツトしたもので、両者がよい直線関係を示
すこと、すなわちアンモニアの測定装置として好
ましい特性をもつことを示している。 製作した固定化微生物膜は、乾燥状態で保存す
ると１日以内に失活し、この固定化微生物は上述
のように測定システムに組込んで作動させても全
くアンモニアに応答を示さなかつた。固定化微生
物膜の液中保存は、本発明による製作法によつて
可能となつた。
第１図は本発明の固定化微生物膜の構成を示す
説明図、Ａ正面図、Ｂ平面図、第２図は固定化微
生物膜とセンサーとを組み合わせた微生物電極の
構成を示す説明図、第３図は上記微生物電極を用
いた測定装置の系統説明図、第４図は実施例１の
本発明の微生物膜を用いた微生物電極による
BOD標準水の測定結果を示すグラフ、第５図は
同じく従来法の微生物膜を用いた微生物電極によ
る測定結果を示すグラフ、第６図は同じく本発明
の装置にBOD標準液を注入したときの応答曲線
を示すグラフ、第７図は本発明の方法による標準
液の測定の電流減少値と該標準液のBODの直線
関係を示すグラフ、第８図は同じく本発明の方法
とJIS法によるBODの測定結果の一致性を示すグ
ラフ、第９図は実施例２の本発明の装置を用いて
アンモニア標準液を測定したときの応答曲線を示
すグラフ、第１０図は同じく標準液の測定の電流
減少値と該標準液のアンモニア濃度との直線関係
を示すグラフ。
説明図、Ａ正面図、Ｂ平面図、第２図は固定化微
生物膜とセンサーとを組み合わせた微生物電極の
構成を示す説明図、第３図は上記微生物電極を用
いた測定装置の系統説明図、第４図は実施例１の
本発明の微生物膜を用いた微生物電極による
BOD標準水の測定結果を示すグラフ、第５図は
同じく従来法の微生物膜を用いた微生物電極によ
る測定結果を示すグラフ、第６図は同じく本発明
の装置にBOD標準液を注入したときの応答曲線
を示すグラフ、第７図は本発明の方法による標準
液の測定の電流減少値と該標準液のBODの直線
関係を示すグラフ、第８図は同じく本発明の方法
とJIS法によるBODの測定結果の一致性を示すグ
ラフ、第９図は実施例２の本発明の装置を用いて
アンモニア標準液を測定したときの応答曲線を示
すグラフ、第１０図は同じく標準液の測定の電流
減少値と該標準液のアンモニア濃度との直線関係
を示すグラフ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 測定対象の各有機化合物、無機化合物、酸
素、水、炭酸ガスを水溶液またはガス状で自由に
通過せしめるが、微生物菌体を通過させない多孔
質膜２上に所要の厚さを有するドーナツ状のリン
グ・スペーサー３を接着し、該スペーサー３の内
空部に活性を有する微生物菌体５を封入保持し、
スペーサーの反対面に多孔質膜２を接着してな
る、上記多孔質膜２面間とスペーサー３内側面よ
り構成された内空部に封入固定された固定化微生
物膜。 ２ 上記多孔質膜２面間とスペーサー３内側面よ
り構成された内空部にさらにスクリーン状のメツ
シユスペーサー４を挿入して、活性菌体５をさら
に移動させないようにした請求範囲第１項の固定
化微生物膜。 ３ 測定対象の各有機化合物、無機化合物、酸
素、水、炭酸ガスを水溶液またはガス状で自由に
通過せしめるが、微生物菌体を通過させない多孔
質膜２上に所要の厚さを有するドーナツ状のリン
グ・スペーサー３を接着し、該スペーサー３の内
空部に活性を有する微生物菌体５を封入保持し、
スペーサーの反対面に多孔質膜２を接着してな
る、上記多孔質膜２面間とスペーサー３内側面よ
り構成された内空部に封入固定された固定化微生
物膜又は上記多孔質膜２面間とスペーサー３内側
面より構成された内空部にさらにスクリーン状の
メツシユスペーサー４を挿入して、活性菌体５を
さらに移動させないようにした固定化微生物膜を
所要の電気センサーに密着して組み合わせて微生
物電極を構成し、該微生物電極を用いて溶液中の
特定の有機化合物または無機化合物を定量する、
有機または無機化合物の電気化学的定量法。 ４ 微生物として雑食性の酵母の菌体を用い、該
電気化学的センサーとして溶存酸素電極を組み合
わせて微生物電極を構成し、溶液中のBODを測
定する請求範囲第３項の電気化学的定量法。 ５ 微生物として硝化菌の菌体を用い、該電気化
学的センサーとして溶存酸素電極を組み合わせて
微生物電極を構成し、溶液中のアンモニア量を定
量する請求範囲第３項の電気化学的定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6187479A JPS55153593A (en) | 1979-05-19 | 1979-05-19 | Fixed bacterium membrane |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6187479A JPS55153593A (en) | 1979-05-19 | 1979-05-19 | Fixed bacterium membrane |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55153593A JPS55153593A (en) | 1980-11-29 |
| JPS6232917B2 true JPS6232917B2 (ja) | 1987-07-17 |
Family
ID=13183704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6187479A Granted JPS55153593A (en) | 1979-05-19 | 1979-05-19 | Fixed bacterium membrane |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55153593A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0445324A (ja) * | 1990-06-11 | 1992-02-14 | Kubota Corp | 循環式給湯システム |
-
1979
- 1979-05-19 JP JP6187479A patent/JPS55153593A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0445324A (ja) * | 1990-06-11 | 1992-02-14 | Kubota Corp | 循環式給湯システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS55153593A (en) | 1980-11-29 |
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