JPH06505802A

JPH06505802A - 遊離自在リガンドを用いた特異的結合アッセイ方法

Info

Publication number: JPH06505802A
Application number: JP4507845A
Authority: JP
Inventors: オブザンスキー，デイビツド・マイクル; サイモンズ，ドナルド・マツクス; ツエン，スーザン・イエン−テイー
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1991-03-12
Filing date: 1992-03-12
Publication date: 1994-06-30
Also published as: DE69214942T2; EP0579676B1; IE920778A1; CA2106003A1; US5332679A; EP0579676A1; WO1992016841A1; DE69214942D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称遊離自在リガンドを用いた特異的結合アッセイ方法技術分野本発明は、特異的結合アッセイ、より詳細には非免疫・可逆的結合置換系を用いたイムノアッセイおよびＤＮＡプローブアッセイに関する。前記系においては、遊離自在リガンド（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ　ｌｉｇａｎｄ）　、該遊離自在リガンドに対する結合パートナ−１関心のある被検体（ａｎａｌｙｔｅ）　、分析的に検出可能なレポーター、および該被検体に対する少なくとも一つの結合パートナ−をまず不溶性相に結合させて不溶性相に結合されたレポーター標識複合体を形成し、次いで遊離自在リガンドを該レポーター標識複合体の一部と共に置換するディスプレーサ−・リガンド（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ　ｌｉｇａｎｄ）を添加することにより、遊離したレポーターを自由液体媒質中で分析的に検出できそして検体中の被検体濃度に関連付けることができるようになっている。

背景技術近年、アビジン−ビオチン複合体の使用は、広範囲にわたる様々な生物分析的応用、例えばアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティーサイトケミストリー、セルサイトメトリー、プロッティング技術、診断例えばイムノアッセイおよび遺伝子プローブアッセイ、ハイブリドーマ技術、バイオアフィニティーセンサー、ドラッグデリバリ−１およびクロスリンキング、固定化技術（Ｗｉｌｃｈｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７１：　ｌ〜３１　（１９８８）　）などに有用な極めて融通性のある系としてよく知られてきている。

ビオチン−アビジン系の有用性はビオチン−アビジン相互作用の高親和性（１０ ”Ｉ−’）で特徴付けられ、それがこの非共有結合性相互作用の例外的安定性の理由となっている。遊離ビオチンまたは（蛍光、放射性同位元素、高電子密度− マーカー、酵素、または固定マトリックスなど多（のレポーター基のいずれかを含有する）誘導体型のビオチン、または低または高分子量分子にカップリングされたビオチンは依然としてアビジンまたはストレプトアビジンにより認識される。

ビオチン−アビジン系にはその酵素標識イムノアッセイにおける用途を含めい（つかのよ（知られた応用分野がある。これらすべてにおいて、検出シグナルはレポーター標識アビジンまたはストレプトアビジンを用いることにより、あるいは天然のアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン化レポーターを用いることにより得られる。

１９８１年１１月３日にＰａｒｉｋｈらに交付された米国特許Ｎｏ。

４、２９８．６８６は生物学的物質の定量的測定方法を開示している。特に、可溶性ビオチン標識複合体を用いた酵素イムノアッセイが開示されており、そこではビオチンを抗体分子と共有結合的に結合し、モして固相に固定されたアビジンを用いて分離過程を行っている。

１９８０年１０月１４日にＨｅｖｅｙらに交付された米国特許Ｎｏ。

４、２２８．２３７は非競合的および競合的結合法において関心のあるリガンドを測定するためにビオチン−アビジン系を用いることを開示している。特にＨｅｖｅｙらは、測定すべきリガンドを該リガンドに対する特異的結合性物質を含む不溶性相と接触させる特異的結合法に酵素標識アビジンおよびビオチン標識試薬を用いた、関心あるリガンドの測定方法を開示している。その特異的結合反応の後、不溶性相または液相の酵素活性を測定しそれによって媒質中のりガント量に関連づけている。

１９８１年６月２日にＢｕｎｔｉｎｇに交付された米国特許Ｎｏ。

４、２７１．１４０は、第２レセプターを第２レセプターに結合させそしてその第ルセブターをリガンドまたは別のレセプターを可逆的に結合できるようにした二重レセプター特異的結合アッセイに、非共有結合的結合系を用いることを開示している。

１９８７年４月２１日にＦｏｒｒｅｓｔらに交付された米国特許Ｎｏ、４．６５９．６７８は液体検体中の抗原を検出するためのイムノアッセイを開示しており、そこでは、検体中に含まれる抗原と二辺上の抗体試薬との間で複合体を形成させ、その複合体を非共有結合的結合により固体支持体に結合させることによって該支持体に結合するようになった複合体量を測定しており、またこの方法は少なくとも一つのモノクローナル抗体を用いている。その発明に有用な高親和性結合系の一例としてビオチン−アビジン系が記載されている。

診断アッセイの場合、アビジン−ビオチン系には多くの制約がある。一つの制約は、一般にレポーター標識アビジンまたはストレプトアビジンの塩基度からくる、非特異的結合の生起によるものである。典型的には、非特異的に結合した成分は、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース紙の架橋デキストラン、ガラスピーズ、プラスチックチューブまたはミクロタイタープレートを包含し得る固体支持体系から洗浄除去することはできない。測定すべき成分が極めて低い濃度で存在する場合、生じるシグナルノイズは特に厄介である。

通常、非特異的結合を最小限に抑えるためにアビジンに代えてストレプトアビジンが用いられる。

アビジン−ビオチン系のもう一つの制約は、その使用が、固体支持体に結合されている状態での関心のある被検体の測定に一般に限られることである。レポーターが酵素である場合には、その複合体が固相に結合されたままで測定することに実際上の問題が生じ得る。自由溶液中で酵素標識免疫複合体を測定することの利点は、自由溶液中での反応は拡散がさほど制限されずまたさほど立体的に障害されないため、それが固体支持体に結合させたときよりも自由溶液中での方がはるかに速かに基質と反応する点である。この状況は、イムノアッセイを自動化診断システムで行う場合に大変有益である。さらに、固相に結合された分析的検出可能な基の測定を要するイムノアッセイは、特別なタイプの固体支持体例えば無色で透明なものの使用を必要とするという点で制約を受けることがある。

前のバラグラフに記載したような、固体支持体に結合したレポーター標識免疫複合体の測定に伴う諸問題は、標識免疫複合体を支持体から自由溶液中に遊離させようとする努力を促した。一つのアプローチは、還元、酸化および加水分解などの化学反応により分解され得る化学構造を通して免疫複合体が固体支持体に結合されるようにケミストリーを工夫することである。例えば、１９８０年１１月４日にＣａｒｌｓｓｏｎらに交付された米国特許４．２３１．９９９はチオール− ジスルフィド交換に基づく改良された接合方法を伴う免疫化学的アッセイに用いるための試薬を開示している。その試薬は、１分子以上の免疫グロブリンと１ユニット以上の分析的に検出できる基との可溶性接合体より成り、分子およびユニットが分解可能な−５−Ｓ−基を含む架橋を介して相互に結合されているという特徴を有する。

免疫複合体などを固体支持体に結合させるのに化学的に分解可能な架橋を用いることは、考えとしてはりっばであるが特別な場合にしか価値がないことがわかっている。何故ならば、架橋の切断に用いられる酷しい条件が他所の破壊をひきおこすこともあり、そのために遊離された複合体に要求される生物活性が減じたり破壊されたりすることがあるためである。こうしたことから、リガンドとその結合パートナ−が関与する非共有結合系を、アッセイ系の成分を合体させるための架橋として、そしてリガンドをその結合パートナ−から速やかにしかも穏やかに移した後アッセイ系の成分を分離するための手段として用いることの方がより広（適用可能な方法であろう。

前述のビオチン−アビジン系の大部分の応用は、強固で効率的な結合にのみ関するものである。しかしながら、Ｆｌｏｆｍａｎｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１：　９７８〜９８４　（１９８２））は、ビオチニル−インスリンおよびその類縁体の一部が、＾■５ｅｐｈａｒｏｓｅに固定されたスクシノイルアビジンに非共有結合的に結合でき、またその負荷された樹脂を過剰ビオチンを含有する緩衝液にさらすことにより生物特異的に遊離され得ることを開示している。ここで、スクシノイルアビジンがアビジンそれ自体よりも低い等電点を有する化学修飾されたアビジンである点に注目したかもしれない。したがってそれが非特異的結合に関する問題を生じることはさほどない。

Ｌｉｃｈｓｔｅｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２０　（１）：　４１〜４５　（１９６５））　は、ビオチンの類縁体の評価にアビジンおよびストレプトアビジンを用いることを開示している。アビジンとは異なり、ストレプトアビジンはビオチン類縁体であるブチすビオチンを結合し得ないと測定された。

Ｆｉｎｎら　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：　２５５４〜２５５８．　（１９８４））　は、スクシニル化ビジン類と複合体を形成できる一連のビオチン化およびデチオビオチン化インスリンを開示しており、その場合ビオチンのカルボキシル基とインスリンの間隔は７〜２０原子の幅で変動する。これに対し、Ｆｉｎｎらはさらに、デチオビオチンおよびそのアミドがストレプトアビジンを結合できないことを開示していてＬｉｃｈｓｔｅｉｎらの知見を確認している。

Ｉｋａｒｉｙａｍａら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｗ、Ｓｙｗｐ　５ｅｒｉｅｓ、１７（Ｃｈｅｗ、５ｅｎｓｏｒｓ）　：　６９３〜６９８　（１９８３））は、膜結合したアゾ色素−酵素標識アビジン複合体を用いたビオチンに対するバイオアフィニティー・センサーを開示している。

ビオチン含有溶液にさらすと、酵素標識アビジンは膜から遊離され、溶液中に安定なアビジン−ビオチン複合体が形成される。

遊離自在リガンドが速やかにディスプレーサ−・リガンドにより置換されることによって、レポーターまたは分析的に検出可能な基を含む固定化複合体の一部、または少なくともレポーターまたは分析的に検出可能な基それ自体を自由液体媒質に遊離させ、次いで定量測定できるようにした可逆性結合置換系に遊離自在リガンドを用いる特異的結合アッセイが必要とされている。さらに、レポーター成分の不溶性相への非特異的結合に起因して生じる可能性のある妨害を減じたりあるいは除去する特異的結合アッセイが必要とされている。

本発明の概要本発明の第１アツセイは、＾、１．　リンカ−を通して第１結合パートナーを結合した固体支持体（該第１結合パートナ−はストレプトアビジン、アビジン、スクシニル化アビジン、核酸および抗体より成る群より選択される）：２、被検体または第２結合パードナー：被検体複合体：および３、ａ、一時的結合を通して第１結合パートナーに、そして共有結合を通して第２結合パードナー：被検体複合体の第２結合パートナーに結合された（この場合第２結合パードナー：被検体複合体の被検体はその上に検出可能なレポーターを有する第３結合パートナーに結合される）、またはす、　一時的結合を通してその上に検出可能なレポーターを有する第３結合パートナーに、そして共有結合を通して第２結合パードナー：被検体複合体の第２結合パートナーに結合された、またはＣ０一時的結合を介してその上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナーに、そして共有結合を通して被検体に結合された遊離自在リガンドより本質的に成る固定化サンドイッチ構造を、第１結合パートナーを結合した前記固体支持体を１、　被検体を含有すると思われる液体検体；２．　単独の、または共有結合を通して第２結合パートナーに結合された遊離自在リガンド；および３、　その上に検出可能なレポーターを有する第２または第３結合パートナーと接触させることにより調製する段階；Ｂ、　その固定化サンドイッチ構造を可溶性成分から分離する段階：Ｃ０前記一時的結合を、１、　遊離自在リガンドに対し過剰量のディスプレーサ−・リガンドを添加するか、または２、　第１、第２または第３結合パートナーに対するディスプレーサ−・リガンドの親和性が第１、第２または第３結合パートナーに対する遊離自在リガンドの親和性より高くなるようなディスプレーサ−・リガンドを添加することにより切る段階：およびり、　溶液中の検出可能なレポーターを測定する段階より成る被検体の非競合特異的結合アッセイである。

本発明の第２アツセイは＾、　一時的結合を通して遊離自在リガンドを結合させることができる第１結合パートナーまたは被検体を固体支持体に固定化する段階；Ｂ、　段階Ａの生成物を、１、　被検体を含有する液体検体；２、　既知量の、共有結合を通して遊離自在リガンドに結合され、そして被検体に結合できる第１結合パートナー１または既知量の遊離自在リガンド：被検体複合体（この場合その遊離自在リガンドは一時的結合を通して固体支持体上の第１結合パートナーに結合され得る）；および３、　その上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナー（この場合その第２結合パートナーは一時的結合を通して遊離自在リガンドに結合され得る）、または既知量の、その上に検出可能なレポーターを有する被検体と結合できる第２結合パートナを組み合わせることにより調製されたレポーター標識複合体を含有する混合物と接触させることにより固定化レポーター標識複合体を形成する段階；Ｃ０その固定化レポーター標識複合体を可溶性成分から分離する段階：Ｄ、　前記一時的結合を、１、　遊離自在リガンドに対し過剰量のディスプレーサ−・リガンドを添加するか、または２、　第１または第２結合パートナーに対するディスプレーサ−・リガンドの親和性が第１または第２結合パートナーに対する遊離自在リガンドの親和性より高くなるようなディスプレーサ−・リガンドを添加することにより切る段階；およびＥ、　溶液中のレポーターを測定する段階より成る被検体の競合型特異的結合アッセイである。

本発明の説明本発明は、非免疫・可逆的結合置換系を用いた特異的結合アッセイに関する。この系においては、遊離自在リガンド、該遊離自在リガンドに対する結合パートナ −１関心のある被検体、レポーター基および該被検体に対する少なくとも一つの結合パートナ−を不溶性相に結合させることにより、不溶性相に結合されたレポーター標識複合体を形成する。その結合複合体の調製の後、遊離自在リガンドをレポーター標識複合体の一部と共に置換するディスプレーサ−・リガンドを添加することにより、レポーターを自由液体媒質中で分析的に検出できそして検体中の被検体濃度に関連付けることができるようになっている。

遊離自在リガンドは、遊離自在リガンドを結合させた不溶性相に過剰のディスプレーサ−・リガンドを添加することによって、結合パートナ−に対する遊離自在リガンドのそれよりも高い結合パートナ−に対する親和性を有するディスプレーサ−・リガンドを用いることによって、あるいは両者の組み合わせによってディスプレーサ−・リガンドにより置換され得るあらゆる物質である。

遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドと構造的に同一であることができ（それによって過剰のディスプレーサ−・リガンドを用いるだけで遊離自在リガンドを置換するのに十分となる）、あるいは遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドの構造類似体であることができ、あるいは遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドとは構造的に非類似であることができる。

自由液体媒質中で関心のある被検体を測定するために遊離自在リガンドと、レポーター標識複合体の少なくとも一部を遊離させるためのディスプレーサ−・リガンドとを用いる本発明の非免疫可逆系は、競合および非競合イムノアッセイおよびＤＮＡプローブアッセイを含む任意の特異的結合アッセイに適用することができる。

本発明の好ましい態様は、固相に固定化された、関心のある被検体に結合できる第１結合パートナー、デチオビオチン（ＤＴＢ）に共有結合的に結合された第２結合パートナー（ここでＤＴＢは遊離自在リガンドとして働り）、レポーター標識ストレプトアビジン（ここでストレプトアビジンは第３結合パートナーとして働き、また一時的結合を通して遊離自在リガンドに結合することができる）を用いる非競合サンドイッチイムノアッセイである。ビオチンがディスプレーサ−・リガンドとして用いられる。

あるいはまたストレプトアビジンを第２結合パートナーに共有結合的に結合でき、また一時的結合を通してレポーター標識ＤＴＨに結合させることができる。図１のサンドイッチ構造はこの好ましい態様を示している。

不溶性相への結合パートナ−の結合は例えば１９８７年４月２８日にＬａｕらに交付された米国特許Ｎｏ、　４．６６１，４０８に開示されているような既知の方法を用いて作ることができる。遊離自在リガンドに対する結合パートナ−または被検体に対する結合パートナ−は、架橋により、非共有結合による結合により、あるいは好ましくは共有結合による結合により固体担体に結合させることができる。特異的結合パートナ−を上に結合できる任意の固体担体を用いることができる。例えば、それらに限定されるものではないが固体担体は、二酸化クロム粒子、シリカ、鉄酸化物、セファロース系樹脂カラム、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース紙の架橋デキストラン、ガラスピーズ、蛍りん光体（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）粒子、ガラス繊維、プラスチックチューブ、またはミクロタイタープレートを包含し得る。二酸化クロム粒子が好ましい。

被検体に対する結合パートナ−は、関心のある被検体または遊離自在リガンドを特異的に結合する能力を維持しつつ、固体支持体に共有結合的に結合され得る、または遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンドまたは他の結合パートナ −に共有結合的に結合され得る任意の物質であってよい。被検体に対する結合パートナ−の例には抗体、抗原、レセプター、および核酸が包含される。

遊離自在リガンドに対する結合パートナ−は、一時的結合が形成されるように、遊離自在リガンドにおよびディスプレーサ−・リガンドに可逆的に結合できる任意の物質であってよい。一時的結合は、遊離自在リガンドを置換するディスプレーサ−・リガンドの添加で切ることのできる、遊離自在リガンドと結合パートナ −の間の結合である。遊離自在リガンドに対する適切な結合パートナ−の例にはアビジン、ストレプトアビジン、スクシニル化アビジン、ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチン、および官能化アゾ色素が包含される。ストレプトアビジンが好ましい。

ディスプレーサ−・リガンドは、一時的結合を通して遊離自在リガンドに対する結合パートナ−に可逆的に結合した遊離自在リガンドを置換できる任意の物質であってよい。適切なディスプレーサ−・リガンドの例にはビオチン、デチオビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジンが包含される。ビオチンが好ましいディスプレーサ−・リガンドである。

遊離自在リガンドは、ディスプレーサ−・リガンドにより置換され得る任意の物質である。置換とはディスプレーサ−・リガンドの添加で遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する結合パートナ−の間の一時的結合を切ることを意味する。遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドと構造的に同一であってよ（、あるいは遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドの構造類似体であってよ（、あるいは遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドとは構造的に非類似であってよい。適切な遊離自在リガンドの例にはデチオビオチン、イミノビオチン、２−（４（ヒドロキシ−１−ナフタレニル）アゾ〕安息香酸（ＮＡＢ＾）、２−［（８−ヒドロキシ−５−キノリニル）アゾ〕安息香酸（ＱＡＢ＾）、２−（（２，６−シメチルー４−ヒドロキシフェニル）アゾ〕安息香酸（ジメチルＩＩＡＢ＾）、ストレプトアビジン、スクシニル化アビジン、およびアビジンが包含される。デチオビオチンが好ましい。結合パートナ−に対する遊離自在リガンドの親和性はｌＱ？ｌ−１以上であるのが好ましい。

ディスプレーサ−・リガンドによる遊離自在リガンドの置換はいくつかの手段により達成することができる。

遊離自在リガンドとディスプレーサ−・リガンドが構造的に同一である場合、遊離自在リガンドとその結合パートナ−の間の一時的結合を切るには、遊離自在リガンドに対して過剰のディスプレーサ−・リガンドを添加することができる。例えば、遊離自在リガンドが一時的結合を通してタンパク質などの結合パートナ− に結合されたビオチンである場合には、タンパク質に結合されたビオチンに対して過剰の遊離ビオチンをディスプレーサ−・リガンドとして添加して一時的結合を切ることができる。

遊離自在リガンドの置換はまた、遊離自在リガンドに対する結合パートナ−に対する親和性定数が遊離自在リガンドよりも高いディスプレーサ−・リガンドを添加することにより達成することもできる。例えば、遊離自在リガンドがデチオビオチンで結合パートナ−がストレプトアビジンであるときは、デチオビオチンよりも、ストレプトアビジンに対する親和性定数が高いビオチンをディスプレーサ −・リガンドとして用いることができる。遊離自在リガンドを置換するための前述の二つの方法の組み合わせを用いることができる。

前記において特定された条件を満たせばその他の遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンド、および遊離自在リガンドに対する結合パートナ−も本発明に用いるのに適している可能性があると考えられる。

本発明の方法は、様々な競合および非競合型特異的結合アッセイを用いて実施することができる。次の例は本発明の方法を用いて実施できる非競合型特異的結合アッセイのいくつかのバリエーションを例示したものである。

第１の例は、（ａ）被検体に結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相を用意し；（ｂ）その不溶性相を次の成分：１、　被検体を含有すると思われる液体媒質；２、　遊離自在リガンドに共有結合的に結合された、被検体に結合できる第２結合パートナー；３、　遊離自在リガンドに結合できそしてその上に検出可能なレポーターを有する第３結合パートナーと接触させて固定化サンドイッチ構造を形成し、それによって遊離自在リガンドを一時的結合を通して第３結合パートナ−に結合させ；（ｃ）未反応成分を固定化サンドイッチ構造から分離し；（ｄ）その固定化サンドイッチ構造をディスプレーサ−・リガンドと接触させることにより遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する第３結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有サンドイッチ構造の一部を固定化サンドイッチ構造から遊離させ；そして（ｅ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る液体中の被検体を測定するための特異的結合アッセイである。

図１のサンドイッチ構造１は、本発明の方法を用いた特異的結合アッセイの第１の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンドおよび遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のいくつかの組み合わせを示している。好ましい一態様においては、被検体を含有すると思われる液体媒質と、遊離自在リガンドに共有結合的結合された被検体に結合できる第２結合パートナーとより成る最初の２成分をまず、被検体に結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相と接触させる。この段階の後に洗浄を行って未反応成分を除去し、またその洗浄段階の後で、遊離自在リガンドに結合できかつ検出可能なレポーターを結合させた第３結合パートナーより成る第３成分と接触させる。

遊離自在リガンドに対する第１結合パートナーは、既知の連結用化合物を用いて不溶性相に直接共有結合的に結合でき、あるいは後で不溶性相に共有結合的に結合できる結合パートナ−例えばビオチンを用いて結合することができる。

第２の例は、（ａ）遊離自在リガンドに結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相を用意し；（ｂ）その不溶性相を次の成分：１、　被検体を含有すると思われる液体媒質：２、　遊離自在リガンドに共有結合的に結合され、そして被検体に結合できる第２結合パードナー：および３、　被検体に結合できそしてその上に検出可能なレポーターを有する第３結合パートナーと接触させることにより、遊離自在リガンドが一時的結合を通して第１結合パートナーに結合されている固定化レポーター標識サンドイッチ構造を形成し；（ｃ）未反応成分を固定化レポーター標識サンドイッチ構造から分離し：（ｄ）その固定化レポーター標識サンドイッチ構造をディスプレーサ−・リガンドと接触させることにより、遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する第１結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有サンドイッチ構造の一部を遊離させ；そして（ｅ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る液体媒質中の被検体を測定するための特異的結合アッセイである。

図１のサンドイッチ構造２は、本発明の方法を用いた特異的結合アッセイの第２の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンドおよび遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のいくつかの組み合わせを示している。

第３の例は、（ａ）被検体に結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相を用意し：（ｂ）被検体に結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相を（１）被検体を含有すると思われる液体媒質；（２）被検体に共有結合的に結合できるように活性化された遊離自在リガンドと接触させることにより、遊離自在リガンドが被検体に共有結合的に結合された固定化サンドイッチ構造を形成し、（ｃ）未反応成分を固定化サンドイッチ構造から分離し；（ｄ）その固定化サンドイッチ構造を、遊離自在リガンドに結合できそしてその上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナーと接触させることにより、固定化レポーター標識サンドイッチ構造を形成し；（ｅ）その固定化レポーター標識サンドイッチ構造をディスプレーサ−・リガンドと接触させることにより、遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する第２結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有サンドイッチ構造の一部を遊離させ；そして（ｆ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る液体媒質中の被検体を測定するための特異的結合アッセイである。

不溶性相との接触に先立ち、あるいはそれと同時に遊離自在リガンドを被検体に共有結合的に結合させるべく遊離自在リガンドを被検体を含有すると思われる液体媒質と反応させることができる。不溶性相との接触に先立って被検体を遊離自在リガンドと反応させるのが好ましい。遊離自在リガンドを活性化させることにより、遊離自在リガンドと被検体との間に共有結合を形成できるようにすることができる。遊離自在リガンドの活性化は、ビオチン化被検体の既知の調製方法（例えばｌ５ｈｉｋａｖａｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎｉｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２３：　４４５〜４５３　（１９９０））を用いて行うことができる。

図１のサンドイッチ構造３は、本発明の方法を用いた特異的結合アッセイの第３の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンドおよび遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のいくつかの組み合わせを示している。

第４の例は、（ａ）被検体に結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相を用意し：（ｂ）次の成分：１　被検体を含有すると思われる液体媒質；２、　被検体に結合でき、そして第１遊離自在リガンドに共有結合的に結合された第２結合パートナー；３、　第１遊離自在リガンドに結合できる第３結合パードナー：および４、　第３結合パートナーに結合できそしてその上に検出可能なレポーターを有する第２遊離自在リガンドをインキュベートすることによりレポーター標識複合体含有混合物を形成し；（ｃ）前記不溶性相をレポーター標識複合体含有混合物と接触させて固定化レポーター標識サンドイッチ構造を形成し；（ｄ）その固定化レポーター標識サンドイッチ構造をディスプレーサ−・リガンドと接触させることにより、第１および第２遊離自在リガンドと第３結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有複合体の一部を遊離させ；そして（ｅ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る液体媒質中の被検体を測定するための特異的結合アッセイである。

図１のサンドイッチ構造４は本発明の方法を用いた特異的結合アッセイの第４の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンド、および遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のい（つかの組み合わせを示している。

前述の例については、不溶性相を特定された成分全部と同時的に接触させた後未反応成分を洗浄除去してもよく、あるいは不溶性相を示された順序で順次添加される成分と接触させ各成分との接触後に洗浄を行ってもよ（、あるいは不溶性相を他の任意の所望の順序で添加された成分と接触してもよい。好ましい態様（図１のサンドイッチ構造１）においては、成分を前述の如（順次添加していくのが好ましい。さらに、前述の例のすべてについて、遊離自在リガンドはディスプレーサ−・リガンドと構造的に同一であっても、ディスプレーサ−・リガンドの類縁体であっても、あるいはディスプレーサ−・リガンドとは構造的に非類似であってもよい。遊離自在リガンドがディスプレーサ−・リガンドと構造的に同一である場合には、そのディスプレーサ−・リガンドは遊離自在リガンドを首尾よく置換するには遊離自在リガンドより過剰に存在させなければならない。

図　１固定化サンドイッチ構造およびディスプレーサ−・リガンド（非競合型特異的結合アッセイ）サンドイッチ構造１：不溶性相−ＢＰｌ：被検体：　ＢＦ２−ＲＬ〜ＢＰ３一本第３結合パートナ−（ＢＦ２）　＝遊離自在リガンドがビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素である場合には、ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン；遊離自在リガンドがストレプトアビジン、スクシニル化アビジンまたはアビジンである場合には、ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素遊離自在リガンド（Ｒ１、）　＝ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチン、官能化アゾ色素、ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジンド（ＤＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することができる）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）図１（続き）第１結合パートナ−（ＢＰＩ）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合二　−被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−＝共有結合図１（続き）不溶性相−ＢＰＩ−ＲＬ−ＢＦ２　：被検体：　ＢＦ２一本第１結合パートナ−（ＢＰＩ）　＝ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン遊離自在リガンド（Ｒ＋、）　＝ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素ド（ＤＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することができる）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−第３結合パートナ−（ＢＦ２）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合：　＝被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−＝共有結合図１（続き）不溶性相−ＢＰＩ：被検体−ＲＬ−ＢＦ２−＊第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン遊離自在リガンド（ＲＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素ド（ＤＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することができる）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）第１結合パートナ−（ＢＰｌ）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合：　＝被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−二共有結合図１（続き）不溶性相−ＢＰＩ　：被検体：　ＢＦ２−ＲＬ−ＢＦ２−ＲＬ一本第３結合パートナ−（ＢＦ２）　＝　ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン遊離自在リガンド（ＲＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素ド（Ｄ＋、）　＝　ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することができる）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）第１結合パートナ−（ＢＰＩ）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合：　＝被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−一共有結合次の例は本発明の方法を用いて実施できる競合型特異的結合アッセイの例である。

液体媒質中の被検体を測定するための特異的結合アッセイの第５の例は、（８）関心のある被検体を結合した不溶性相を用意し：（ｂ）次の成分：（１）測定された量の、被検体を含有すると思われる液体媒質：（２）既知量の、被検体に結合できそして遊離自在リガンドに共有結合的に結合できる第１結合パートナー　；（３）遊離自在リガンドに結合できそしてその上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナーと組み合わせることによりレポーター標識複合体の混合物を形成し；（Ｃ）そのレポーター標識複合体含有混合物を前記不溶性相と接触させて固定化レポーター標識複合体を形成し：（ｄ）その固定化レポーター標識複合体を可溶性成分から分離し；（ｅ）その固定化レポーター標識複合体をディスプレーサ−・リガンドと接触させることにより、遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する第２結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有複合体の一部を遊離させ：そして（ｆ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る。

図２の構造１は、本発明の方法を用いた特異的結合アッセイの第５の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンドおよび遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のいくつかの組み合わせを示している。

液体媒質中の被検体を測定するための特異的結合アッセイの第６の例は（ａ）関心のある被検体を結合した不溶性相を用意し；（ｂ）次の成分：（１）測定された量の、被検体を含有すると思われる液体媒質；（２）既知量の、被検体に結合でき、そして遊離自在リガンドに結合できる第２結合パートナーに共有結合的に結合された第１結合パートナー；および（３）その上に検出可能なレポーターを有する遊離自在リガンドを組み合わせることによりレポーター標識複合体の混合物を形成し；（Ｃ）前記不溶性相をレポーター標識複合体の混合物と接触させて固定化レポーター標識複合体を形成し：（ｄ）その固定化レポーター標識複合体を可溶性成分から分離し；（ｅ）その固定化レポーター標識複合体をディスプレーサ−・リガンドと接触させることにより、遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する第２結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有複合体の一部を遊離させ；そして（ｆ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る。

図２の構造２は、本発明の方法を用いた特異的結合アッセイの第６の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンド、および遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のい（つかの組み合わせを示している。

液体媒質中の被検体を測定するための特異的結合アッセイの第７の例は、（ａ）遊離自在リガンドに結合できる第１結合パートナーを結合した不溶性相を用意し：（ｂ）次の成分：（１）測定された量の、被検体を含有すると思われる液体媒質：（２）既知量の、被検体に共有結合的に結合された遊離自在リガンド：および（３）既知量の、複合体に結合できそしてその上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナーを組み合わせることにより、レポーター標識複合体の混合物を形成し；（ｃ）そのレポーター標識複合体含有混合物を前記不溶性相と接触させて固定化レポーター標識複合体を形成し：（ｄ）その固定化レポーター標識複合体を可溶性成分から分離し：（ｅ）その固定化レポーター標識複合体をディスプレーサ−・リガンドと接触させることによって、遊離自在リガンドと遊離自在リガンドに対する第１結合パートナーとの間の一時的結合を切ると共にレポーター含有複合体の一部を遊離させ：そして（ｆ）自由溶液中の遊離レポーターを測定することより成る。

図２の構造３は、本発明方法を用いた特異的結合アッセイの第７の例に用いるのに適した遊離自在リガンド、ディスプレーサ−・リガンドおよび遊離自在リガンドに対する結合パートナ−のいくつかの組み合わせを示している。

図　２固定化構造およびディスプレーサ−・不溶性相−被検体：　ＢＰＩ−ＲＬ−ＢＦ２一本第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン遊離自在リガンド（ＲＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチンおよびイミノビオチン、官能化アゾ色素ド（ＯＬ）　＝ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することができる）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）第１結合パートナ−（ＢＰＩ）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合：　＝被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−＝共有結合図２（続き）不溶性相−被検体：　ＢＰＩ−ＢＰ２〜ＲＬ一本第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン遊離自在リガンド（ＲＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素ド（ＤＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することかで舎る）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）第１結合パートナ−（ＢＰＩ）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合：　＝被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−＝共有結合図２（続き）不溶性相−ＢＰＩ〜ＲＬ−被検体：ＢＦ２−＊第１結合パートナ−（ＢＰＩ）　＝ストレプトアビジン、スクシニル化アビジンおよびアビジン遊離自在リガンド（ＲＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン、イミノビオチンおよび官能化アゾ色素ド（ＤＬ）　＝　ビオチン、デチオビオチン（これは遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性が低い遊離自在リガンド、例えばイミノビオチンまたは官能化アゾ色素を置換するのに使用でき、あるいは過剰の遊離デチオビオチンを添加すれば、複合体中に含まれるデチオビオチンを置換することができる）、およびストレプトアビジン（これは過剰の遊離ストレプトアビジンを添加すれば複合体中のストレプトアビジンを置換できる）第２結合パートナ−（ＢＦ２）　＝抗体、抗原、核酸およびレセプターを含む、被検体に対する任意の特異的結合パートナ−＊＝検出可能なレポーター基〜＝一時的結合：　＝被検体に対する結合パートナ−と被検体の間の結合−一共有結合デイスプレーサ−・リガンドが遊離自在リガンドとは構造的に非類似である場合には常に、ディスプレーサ−・リガンドの結合パートナ−に対する親和性は遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性よりも高くなければならない。好ましくは、遊離自在リガンドの結合パートナ−に対する親和性に対するディスプレーサ−・リガンドの結合パートナ−に対する親和性の割合は１０２である。

ディスプレーサ−・リガンドによる遊離自在リガンドの置換の結果として複合体のレポーター標識部分が自由溶液中に遊離された後分析的に検出できる任意のレポーター基を用いることができる。かかるレポーター基の例には次のものが包含されるがそれらに限定されるものではない：酵素、蛍光色素、りん光色素、放射性同位元素、および高電子密度マーカー。酵素は好ましいレポーターである。レポーター基は、使用された特定のアッセイ・コンフィギユレーションに応じて最終的には自由溶液中に遊離される複合体の任意の部分に結合させることができる。例えば、レポーター基は、遊離自在リガンドに、あるいは遊離自在リガンドに対する結合パートナ−または被検体に対する結合パートナ−に結合させることができる。レポーター基は既知の方法［ｉｔａｇａｗａ、ＥｎｚｙｍｅＩｇ＋ｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、　ｐｐ、　８１〜８９．　Ｉｇａｋｕ−３ｈｏａｈ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８１）］を用いて結合させることができる。

不溶性相に結合パートナ−を結合させた特異的結合アッセイに特に言及している前述の本発明の例によれば好ましい遊離自在リガンドはデチオビオチンである。

デチオビオチンを親水性スペーサー分子を通して結合パートナ−に結合させるのが特に好ましい。遊離自在リガンドは、一端がアミン基でモして他端がカルボキシル基で官能化された、従ってα、ω−アミノ酸として適切に設計された極めて水溶性の化合物に由来する親水性スペーサーを介して担体に接合することができる。

本発明に有用な好ましいスペーサー分子は一般式（式中、Ｒ＝　ＨまたはＣ■。

ａ＝１または２で示される。

次式（＾＾−１６）（＾Ａ−１６）で示される親水性スペーサー分子が特に好ましい。

この化合物群は、１モルの適切なジアミン、例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールのビス（アミノアルキル）エーテルを１モルの環状ジカルボン酸無水物、例えば無水コハク酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸と反応させることにより合成することができる。そのジアミンと無水物の双方が可溶であるが目的反応生成物は不溶である有機溶媒系を用いるのが有利である。一般に、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルおよびそれらの混合物が適している。

一般式％式％）（式中ｎ＝２〜６）で示されるものを含む（それらに限定されるものではない）水溶性α、ω−アミノ酸に由来するその他の親水性スペーサーも本発明に有用であり得ると思われる。かかる化合物は商業的に入手可能である。

我々の評価では、遊離（未接合）デチオビオチンはストレプトアビジンに約１０口ｒ′の結合定数をもって結合する。これはかなり大きな結合定数であり、またデチオビオチンーストレブトアビジン複合体が解離する速度を高める、あるいは低めるいかなる現象も、遊離ビオチンの添加によりデチオビオチン接合体複合体が固相結合ストレプトアビジンから遊離され得る速度を低めることになろう。デチオビオチン接合体複合体の速やかな遊離は本発明の重要な一特徴である。

Ｇａｒｌｉｃｋら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６３：　２１０〜２１５　（１９８８））は、ビオチンおよびビオチン類縁体を疎水性部分に直接接合させるとその接合体のアビジンからの解離速度が低下することを示している。親水性リンカ−の使用は、この疎水性効果を回避しそしてデチオビオチン標識複合体のストレプトアビジンからの十分な遊離速度を確保する手段を提供する。

実施例　１デチオビオチンを遊離自在リガンドとして、またビオチンをディスプレーサ−・リガンドとして用いた非競合型イムノアッセイにおける、固体支持体から遊離した酵素標識複合体の測定によるＴＳＨの測定１、　デチオビオチンに共有結合的に結合した抗−ＴＳＨ抗体の合成（ＤＴＢ；抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１−　ＤＴＢ）この実施例は、遊離自在リガンドとして働くことができるＤＴＢと被検体に対する結合パートナ−として用いられた抗−ＴＳｌ’ｌ　ＩｇＧ１抗体との間に挿入された親水性スペーサーの、酵素標識ストレプトアビジンへのＤＴＢ−ＡＡ−１６−抗−ＴＳＨＩｇＧ１複合体の結合における使用および効果を例示するものである。

５１、００ｓ＋ｗのジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ；Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、）および総重量を３．４００　ｑとするのに十分な乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＩＳＯ；Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、）を入れたバイアルを撹拌してＤＳＣを溶解した。体積が分かっている試料の重量を測定することにより比重は１．１０４であると測定された。ＤＳＣ濃度は次のようにして計算した。

ＤＳＣ濃度＝　（５１，００１＋９　ｘ　１．１０４）／　（２５６，２Ｘ　３４００ｍｇ）＝　６．６９３Ｘ　１０−’（ミ’Ｊ　％　／ｌ／／　５ｌ）１２．５０１１９　（５，８３４Ｘ　１０−’モル）　（Ｄテｆオヒオチン（ＤＴＢ　；Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）および９９５＊／のＤＳＣ原液（５，６４７Ｘ　１０ −’モルのＤＳＣ）を入れたバイアルを撹拌してＤＴＢを溶解した。２０１のトリエチルアミン（ＴＥ＾；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、　）を添加しそしてその混合物を室温で１時間撹拌した。以下活性化ＤＴＢ溶液と呼ぶ生成溶液の濃度は次のようにして計算した。

活性化ＤＴＢ濃度＝　（１２，５０１＋９Ｘ　１．１０４）／　（２１４，３Ｘ　９９５＊ｌ）＝　６．４７２Ｘ　１０−’（ミリモル／　ｐｌ）抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１モノクローナル抗体はＥ、　１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、　より入手したハイブリドーマ細胞系統４／４６．２．２．１より既知の方法を用いて産生じた。ＩｇＧ１は前記細胞系統に由来する腹水液より、プロティンＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　４Ｂカラム（Ｐｈａｒｓａｃｉａ　Ｃｏ、）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。ＩｇＧはそのカラムより酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）を用いて溶出し、次いで４〜８℃の冷室で０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に対して一夜透析した。２．６４＠ｇ／寓ｌ抗−ＴＳＨＩｇＧ１抗体を含有するこの溶液の一部（２ｍ／）をジメチルスルホキシド中の２０倍モル過剰の活性化ＤＴＢと混合した。その反応混合物を室温で６０分分間中かに揺動し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，Ｑｘ　３０ｃ＋＋　；　Ｐｈａｒｖａｃｉａ　Ｃｏ、　）にかけ、そして抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１抗体−ＤＴＢを０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１抗体−０７８画分を集めプールした。

２、　抗−ＴＳＦＩ　１ｇＧ２−β−ガラクトシダーゼの合成杭−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ２モノクローナル抗体をＴｈｅ　Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｃｏ。

より入手した細胞系統９７２．３より産生じた。単離方法は、抗−ＴＳｌ’ｌ　ＩｇＧ１抗体の単離について前述したものと同様とした。１１，２り／諺！抗− ＴＳＨ１ｇＧ２を含有する溶液６禦ｌをホスフェート緩衝食塩水（ｐｉ　７．４）に対して４〜８℃で一夜透析した。その抗−ＴＳＨＩｇＧ２溶液の濃度をホスフェート食塩水溶液で５菖ｗ／ｍ／に調節し、そして６８．４８９の抗−ＴＳＨ１ｇＧ２を含有する溶液をジメチルスルホキシド（ＤＩＩＳＯ；　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）中の３０倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル− ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＩＣＣ；　ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）と混合し、そして室温で３０分分間中かに撹拌した。次にその溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，ＯＸ３０ｃｍ　；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏ、　）にかけ、そして抗−ＴＳＨ１ｇＧ２をホスフェート食塩水緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出した。得られるマレイミド活性化抗−ＴＳＦＩ　１ｇＧ２の画分を集めプールした。

全部で４０１Ｗ９のβ−ガラクトシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社；２２．４重量％のタンパク質）を８８ｗ／のホスフェート食塩水緩衝液（ｐＨ６，５）で再構成した。次に前記マレイミド−活性化抗−ＴＳＨ１ｇＧ２をチオール含有β−ガラクトシダーゼと３：１モル比（抗体３モルおよびβ−ガラクトシダーゼ１モル）で混合しそして室温で６０分間反応を進行させた。次いでその反応を！−１１のｐ４−エチルマレイミド（ＮＥＷ　；　Ｓｉｇｇｔａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）の添加によりクエンチし、そして室温で３０分間インキュベートした。得られた粗製抗−ＴＳＨＩｇＧ２−β−ガラクトシダーゼをＧＦ−４５０ＸＬサイズ排除カラム（２２，５ｍｍＸ２５ｃｍ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｃｏ、）を用いたｌ’１ＰＬｃにより単離し、次いで０．１％アジ化ナトリウム緩衝剤含有０．２Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐｉ　７．０）を用いて２　ｍｌ１分の流速で溶出した。免疫活性および酵素活性（ラジオイムノアッセイ、ＲＩ＾および酵素活性測定などの既知方法を用いて測定）の双方を示す抗−ＴＳＨＩｇＧ２−β−ガラクトシダーゼ画分を集めプールした。

３、　定量的甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＦＩ）イムノアッセイ６５０β９のストレプトアビジン−固定化二酸化クロム粒子および２０ｘｑの抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧＩ　ＤＴＢを含む試験管セットを３７℃で１５分間インキュベートした。そのストレプトアビジンは例えば米国特許Ｎｏ、４，６６１．４０８に開示されているような既知方法を用いて、予め二酸化クロム磁性粒子に固定化しておいた。インキュベーションの後、それら粒子を５００ｘｌの１ｌｅｐｅｓ緩衝液（ｐｌＴ７．５）を各試験管に添加することにより洗浄した。次に抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１−　ＤＴ８〜ストレブトアビジンー二酸化クロム粒子を含む試験管を２つの濃度系列に分けた；０βＩ　Ｏ／　ｍ　ｌ濃度の５００ｊｔ’のＴＳＨ被検体を一方のセットの容管に添加し、そして５５１１０／ｍ／濃度の５００＊／のＴＳＨ（Ｅ、Ｉ、　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、）を他方のセットの容管に添加した。両セットを３７℃で１０分間インキュベーションし、そして５００μｌの１ｌｅｐｅｓ緩衝液で３回洗浄した。この後で、全試験管に５０ｈｊの抗−ＴＳＨＩｇＧ２−β−ガラクトシダーゼを添加し、それら混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、そしてそれら粒子を５００ｊＺのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＦｌ　７．５）で４回洗浄した。

それら試験管を次いで２つのセットに分けた。各セットは、ＴＳｌ’ｌを０および５５βＩｌｌ／■ｌ濃度レベルで含む試験管を含む。第１セツトの試験管（以下＾ｌセットと呼ぶ）に２５０＊／のｔｌｅｐｅｓ緩衝液と２５０＊Ａ’のクロロフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＣＰＲＧ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−菖ａｎｎｈｅｔｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社）基質を添加した。反応を３７℃で３０分間進行させ、次いで５属９の０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−１１ａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅ■ｔｅａ１社）の添加によりクエンチした。

依然として固相に結合されたままでの酵素標識複合体測定に基づく着色生成物の吸光度をａｃａ■ディスクリート・クリニカル・アナライザー（ｄｉｓｃｒｅｔｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて５７７ｎｍで測定した。

第２セツトの試験管（以下Ｂ１−１セツトと呼ぶ）に３００ｐｌの０．６８ｍｇ／　ｍｌビオチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）をディスプレーサ −・リガンドとして添加してデチオビオチンを置換して酵素標識複合体を遊離させた。それら試験管を３７℃で１０分間インキュベートし、次いで各試験管の上清２５０βｌを取り出してクリーンな試験管に入れた。遊離した酵素標識複合体を含むこれらの試験管（以下Ｂ１−２セツトと呼ぶ）に２５０＊ｌのＣＰＲＧを添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、５βＩｇの０ＮＰＧを添加することにより反応をクエンチし、そして着色生成物の吸光度をａｃａ■ディスクリート・クリニカル・アナライザー（Ｅ、１．　ｄｕＰｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｇ＋ｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、）を用いて５７７ｎｓでモニターした。

酵素標識された遊離複合体の測定について前述した諸工程を繰り返した（以下Ｂ１−３セツトと呼ぶ）。ＣＰＲＧおよび抗−ＴＳＦＩ　ＩｇＧ１−　ＤＴＢの試料をネガティブコントロールとして、ａｃａ　＠ディスクリート・クリニカル・アナライザーを用いて５７７ｎ■で測定した。表１は、結合型および遊離型酵素標識複合体についての０ｘｌＵ／ｍｆおよび５５ｘＩＵ／■ｌ　ＴＳＨにおける吸光度測定値を示している。

基質ブランク　２０．５　− （＾１セット）４４．７１２９３遊離型複合体　３９．９　６６０．４（Ｂｌ−２セツト）実施例　２遊離自在リガンドに対するレポーター標識結合パートナ−への結合体の結合に対する、酵素標識複合体中の親水性スペーサーの存在の効果この実施例は、遊離自在リガンドとして働＜　ＤＴＢと被検体に対する結合パートナ−として用いられた抗−ＴＳＩＩＩｇＧ２抗体との間に挿入された親水性スペーサーの、酵素標識ストレプトアビジンへのＤＴＢ−＾＾−１６−抗−ＴＳＨＩｇＧ２複合体の結合における使用および効果を例示するものである。形成される固定化レポーター標識複合体は、二酸化クロム粒子−抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１　：　ＴＳＨ：抗−ＴＳＨＩｇＧ２−＾＾−１６−ＤＴＢ〜ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼである。

■、　抗−ＴＳＨＩｇＧ２−　ＤＴＢの合成杭−ＴＳＨＩｇＧ２モノクローナル抗体をＴｈｅ　Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｃｏ。

より入手したハイブリドーマ細胞系統９７２．３より既知の方法を用いて産生じた。抗−ＴＳＲＩｇＧ２−　ＤＴＢは実施例１に記載の手順を用いて調製した。

２、　抗−ＴＳＨＩｇＧ２−＾Ａ−１６−ＤＴＢの合成使用した親水性スペーサーは、式：％式％＾＾−１６は、１モルの無水コハク酸を１モルのエチレングリコールビス（３− アミノプロピル）エーテル（＾ｇ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｏｋｙｏ　Ｋａｓｅｌ、　Ｉｎｃ、）と反応させることにより製造した。両反応体ともアセトニトリルに極めて可溶性であるのに対し＾＾−１６はアセトニトリルに極めて不溶性であることから、反応はアセトニトリルを溶媒として用いて行った。

５０、０３９　（０，２８４モル）重量のエチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテルおよび２００＊Ｊのアセトニトリルを機械式撹拌機、滴下漏斗および窒素フラッシュを備えた１リツトル丸底フラスコに添加した。その溶液を激しく撹拌し、そして無水コハク酸（０，２８４モル）（＾１ｄｒｉｃｈ　Ｃｏ、）のア七ト二トリル２００＊／中の溶液を２時間にわたって滴加した。この間、＾＾−１６が反応溶液から、一部間化した粘稠“油”として析出した。全ての無水コハク酸溶液を添加後、アセトニトリルを傾瀉により除去し、そして残留物を新しいアセトニトリルを１００ｍ１ずつ用いて３回洗浄した。この洗浄の後、４００ｍ１の無水エーテルの溶液を反応フラスコに添加し、そしてその反応混合物を次いで数時間連続撹拌した。固化した＾Ａ−１６は粘稠度が徐々に微細粉末のそれに変化してい（のがみられた。反応混合物を乾燥窒素雰囲気下にひだ付きフィルターを通して重力濾過しそして大部分のエーテルを乾燥窒素でフラッシュすることにより除去した。得られた＾Ａ−１６反応生成物を次いで真空デシケータ−中に数時間放置することにより乾燥した。

酸・塩基分析滴定に基づき、生成物は９５％の純度を有するものと測定された。

＾Ａ−１６は極めて水溶性かつ極めて吸湿性であるが大抵の有機溶媒に不溶性であると測定された。＾Ａ−１６はトリエチルアミン（ＴＥＡ）含有温ＤＩＳＯ（１諺９の＾＾−１６あたり１６．５ｘｌのＤＩＳＯと０．８２５〆ｌのＴＥＡ）に溶解することがわかった。

５０、２９１１９のジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）および３．３５８ｇｇの乾燥ＤＭＳＯを入れたバイアルを撹拌してＤＳＣを溶解しＤＳＣの最終製置を６゜３５９Ｘ　１０−’ミリモル／βｌとした。

次に８９５＊１’のＤＳＣ溶液の溶液（５，６９Ｘ　１０−’モル）を１１．０８ｍｇ（５，１７０ｘ　１０−５モル）のＤＴＢと混合し、そしてその混合物を撹拌してＤＴＢを溶解した。その後、２０ｊ７のＴＥＡを添加しそしてその溶液を室温で６０分分間中かに撹拌した。

１６、５４■９の＾＾−１６（５，６８７Ｘ　１０−６モル、前記手順を用いて調製）、２７１＊Ｊの乾燥ＤＩＩＳＯおよび１３．５βｌのＴＥＡを含む５００＃７円錐形Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌ＠に円錐形磁気撹拌機を設け、きつく栓をし、４０〜５０℃に維持されたアルミニウム加熱ブロックに入れ、そして自由流動性溶液が得られるまで撹拌した。＾＾−１６のＤＩＩＳＯ中の溶液を活性化ＤＴＢの溶液に添加しそして前記Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌ＠を１００ｊｌＤＩＳＯで３回すすいだ。

得られた混合物を室温で一夜放置した。この後、８９４＊ＪのＤＳＣ溶液（５，６８７Ｘ　１０−’モルＤＳＣ）を室温で少なくとも６０分分間中かに混合した。次に生成溶液（以下活性化ＤＴＢ−＾＾−１６溶液と呼ぶ）の密度を、体積の分かった試料の重量を測定することにより測定した。

Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ細胞系統９７２．３に由来しそして実施例１に記載のものと同じ手順を用いて調製された５■ｇ　／　ｍ　ｌ抗−ＴＳＨＩｇＧ２抗体の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＦＩ　８．０）中の溶液の一部（２＠４）をＤＩＩＳＯ中の２０倍モル過剰の活性化ＤＴＢ−＾＾−１６溶液と混合した。その反応混合物を室温で約６０分間中やかに混合した。抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ２−Ａ＾−１６−ＤＴＢ複合体を含む生成溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，５Ｘ３０ｃｍ　；　Ｐｈａｒｖａｃｉａ　Ｃｏ、　）にかけ、次いで０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。得られた抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ２−＾＾−１６−ＤＴＢを含む両分を集めプールした。

ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（酵素標識ストレプトアビジン）はＴｈｅ　Ｃｈｅｓｉｃｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙより入手した。

ａ、　定量的ＴＳＩＩイムノアッセイ２系統の試験管を用意した。一方の系統には０　＊ＩＵ／繭！濃度のＴ　Ｓ　１１を５００βｌを入れ、他方の系統は５０ｊＩ［ｌ／ｍ／濃度のＴＳＨを５００ μｌを入れた。次にそれら試験管を各セットが０および５５〆ＩＩ／＋＋／双方の濃度レベルでＴＳＩ’ｌを含む管を包含する２セツトに分けた。１０＃９の抗 −ＴＳＩＩＩｇＧ２−ＤＴＢの溶液５００１１を一方のセットの試験管（以下Ａ２セットと呼ぶ）に添加し、モして１０ｎの抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ２−＾Ａ−１６−ＤＴＨの溶液５００＊／を他方のセット（以下８２セツトと呼ぶ）に添加した。次にそれら２セツトの試験管中の反応混合物を次のような同じ方法で処理した。反応混合物を３７℃でｌＯ分間インキュベートシ；その上に抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１抗体が予め固定化されている２５０＃ｙの二酸化クロム粒子を添加し；それら反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした後、２５〇−璽ｔｒｉｓ、　５０ｍＭホウ酸ナトリウムより成る緩衝液（ｐＨ７、８）５００ｘｌで洗浄した。この後、０．２１ｇのストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体を含む５００ｊＺを添加し、それら反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした後、５００βｌの２５０■Ｍ　ｔｒｉｓ、　５０閣厘ホウ酸ナトリウム（ｐＨ７，８）で洗浄した。

２５０＊Ｊの６．８ｍｇ７ｍ１ビオチン含有ビオチン溶液および３００〆ｌの、２．５ｍｌ　ＤＥＡ中の蛍光定量用基質４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＩＵＰ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−１ａｎｎｈｅｉ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）より成るアリコートをＡ２および８２セツトの各試験管に加え、それら反応混合物を３７℃で５分間インキュベートし、次いで３００ｘｌの０．５Ｍ　ＥＤＴ＾溶液の添加によりクエンチした。生成した二酸化クロム粒子−抗−ＴＳＩＩＩｇＧｌ　：　ＴＳＨ：抗−ＴＳＨＩｇＧ２−＾Ａ−１６−ＤＴＢ−ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体の結合画分により生じたメチルウンベリフェロン（１１１）の蛍光強度を５ＬＩＩ＾＊１ｎｃｏ蛍光計（ＳＬ）ｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｉｎｃ、）を用いて測定した。

表　２Ａ２（親水性スペーサーを有しない複合体）　０．６６　１．０３８２−２（親水性スペーサーを有する複合体）　０．５　７．１Ｆ、　１．　Ｕ、　＝蛍光強度単位Ｆ、　１．　Ｕ、は、５ＬＩＩ＾５ｉｎｃｏ　ＳＰＦ　５００Ｃ分光蛍光計（ＳＬＩＩ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ。

Ｉｎｃ、　）を用い、計器パラメータを次のとおり設定して測定：Ｅｘ／脂＝３７５／４７５　ｎｍ、分解能Ｅｘ／Ｅｓ＝４／１０　ｎｍ。

間隔時間（Ｉｎｔ、　ｔｉｍｅ）　０．１秒、利得＝ｌＯ１ＨＶ＝７１５Ｖ表２に示された結果は、Ａ２セットの親水性スペーサーを有しないロＴＢ−抗−ＴＳＨＩｇＧ２複合体が、ＤＴＢ−＾＾−１６−抗−ＴＳＲＩｇＧ複合体を含むＢ２ −２セツトよりも少量のアルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジンを結合できたことを示している。この結合能の相異は、立体障害効果で説明し得る。

実施例　３二酸化クロム粒子−抗−ＴＳＨｒｇＧｌ　：　ＴＳＩＩ　：抗−τＳＯＩｇＧ２ −＾＾−１６−ＤＴＢ−ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合体からのアルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジンの遊離および測定によるＴＳＨの測定２セツトの試験管を用意した。容管は２５０真ｖのその上に抗−ＴＳＩＩ　ＩｇＧ１を予め固定化しである二酸化クロム粒子、０、５１ｑ（Ｄ　抗−ＴＳＨ１ｇＧ２−　ＡＡ−１６−ＤＴＢを含ム５００＊／および５００ｍ１のＴＳＩＩ　（ここで各セットの試験管の含むＴＳＩＩ濃度は次のとおりとした：０．０．１．０．５．５．０１２５ｔｉ；　、ｋ　ヒ５０ｇＩＵ／　ｍｌ）を含んだ。３７℃ で３０分間インキュベーション後、二酸化クロム粒子を５００ｘＪの２５０ｍＭ　ｔｒｉｓ、５０５Ｍホウ酸ナトリウムｉｌｉ液（ｐＨ７，８）を用いて３回洗浄しり、　５００ｘ／ノｏ、　５ｓｙ／１１１ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼの溶液５００βｌを各試験管に添加し、それらの試験管を３７℃ で１５分間インキュベートし、そして粒子を５００＊／の２５０■麗ｔｒｆｓ、　５Ｑｍｌ１重亜硫酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で４回洗浄した。６．８冨ｇ／冒ｌビオチン溶液３００＊＃のアリコートを各試験管に添加しそしてそれらの管を３７℃で１０分間インキュベートした。粒子を磁気的に分離し、そして各試験管よりの上清２５０ｙｌをクリーンな試験管セット（以下Ａ３セットと呼ぶ）に移した。予熱しておいた２、２５璽腫ＭＵＰの２．５Ｍ　ＤＥ＾緩衝液中の溶液を各試験管に添加し、そしてＳＬＭ　Ａｉ＋１ｎｃｏ　Ｐｈｏｔｏｎカウンター８０００　Ｃ分光蛍光計（ＳＬＩＩ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、　Ｉｎｃ、）を用い、レートモード（ｒａｔｅｖ）ｄｅ）により蛍光強度を測定した。表３に示された結果は本発明の方法を同時アッセイ方式にうまく用いて被検体の定量測定手段を提供することができることを示して表　３＾３セット：同時ＴＳｎアッセイ方式ＴＳｆｌの濃度（ｊｌ［ｊ／肩ｌ）　シグナル（Ｆ、　１．　Ｕ、　／分）０　０、６５７０・Ｉ　Ｏ，７６ｇ０、５　３．２００５　２２．１１２５　１２２、２４５０　２１３、９７＾１１１ＮｃＯ８０００Ｃ計器パラメータ：Ｅｅｌ　：　４８４ｎｍ、Ｅｘ　：　３７５ｎｍ　；分解能Ｅｘ　：　１６ｎｍ、分解能Ｅｍ：１６ｎ■ 実施例　４二酸化クロム粒子−抗−ＴＳＨＩｇＧ１　：　ＴＳＩＩ　：抗−ＴＳｔｌＩｇＧ２−ストレプトアビジン〜ＤＴＢ−＾＾−１６−アルカリ性ホスファターゼ複合体からのアルカリ性ホスファターゼ標識ＤＴＢ−＾＾−１６の遊離および測定によるＴＳＨの測定１、ＤＴＢ−＾＾−１６−アルカリ性ホスファターゼおよびＤＴＢ−アルカリ性ホスファターゼの合成実施例２に記載したものと同様な手順を用いた。

２、　抗−ＴＳＨ１ｇＧ２−ストレプトアビジンの合成５ｍｇのストレプトアビジンの調製物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−１１ａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ）を０．６５ｍ１の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）で再構成した。その溶液を１０倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＩＣＣ；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ、）と混合し、そして反応混合物を室温で３０分分間中かに撹拌した。

その溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，ＯＸ　３０ｃ＋＋）にかけ、次に０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出した。得られたマレイミド−活性化ストレプトアビジンを含有する両分を集めプールした。

（実施例２−１に記載の如（調製された）抗−ＴＳＩＩ　１ｇＧ２の１０露ｇ／ｍｌ溶液の１ｍｌアリコートを１０００ｉ１の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）に対し透析し、そして常時撹拌しながら４〜８℃に一夜保った。

その溶液を暗色バイアルに移しそしてタンパク質濃度を５　ｍｇ／　ｍｌに調節した。次にその溶液をジメチルスルホキシド（ＤＩＩＳＯ）中の１５倍モル過剰のＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴ＾；　Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅ＋＋１ｃａｌ　Ｃｏ、　）と混合した。

その反応混合物を室温で３０分分間中かに撹拌した。その溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，Ｑｘ　３０ｃｓ＋）にかけ、次いで０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｔｌ　６．５）で溶出した。

得られたアセチルチオール化−抗−ＴＳＨ１ｇＧ２を含有する画分を集めプールした。

２、２ｍｌアリコートのアセチルチオール化抗−ＴＳＨＩｇＧ２抗体の１．０＋＋ｇ／ｍ／溶液、１．２ｙｓｌのマレイミド−活性化ストレプトアビジンの１．０ｍｇ／ｓ／溶液、および７５ｐｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７，０）を暗色バイアル中で同時に一緒に混合した。その反応混合物を室温で６０分分間中かに撹拌する一方、ＧＦ−２５０サイズ排除ＨＰＬＣカラム（９，４ｍｍｘ　２５ｃｍ　；　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｃｏ、　）を備えたＨＰＬＣを用いて反応を監視した。１０ｙｌの０．１ＭＮ−エチルマレイミド（ＮＥ菖：Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を添加することにより室温で反応をクエンチした。

そのクエンチさせた溶液を３０分間放Ｗ後、その溶液をＧＦ−４５０ＸＬサイズ排除カラム（２２，５■−×２５ｃｍ　；Ｅ、１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｗｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、）を用いた■ＰＬｃにより精製した。次に抗−ＴＳＨ１ｇＧ２−ストレプトアビジンを０．１％アジ化ナトリウム緩衝剤含有０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて２　ｍｌ／分の流速で溶出した。得られたビオチン結合および免疫反応性の双方を示す両分をプールした。

抗−Ｔｉ　１ｇＧ２−二酸化クロム粒子は実施例２に用いたものと同様とした。

３、　定量的ＴＳ）Ｉイムノアッセイ２セットの試験管を用意した。容管は２５０＊ｙのその上に抗−Ｔ！Ｊ　ＴｇＧｌが予め固定化されている二酸化クロム粒子；　５００ｇ１の２１＋す／■ｌ抗 −ＴＳＨ１ｇＧ２−ストレプトアビジン、および５００＊／のＴＳＩｔが入れである。各セットの試験管の含有するＴＳＦＩ濃度は次のとおりとした：０．２５および５０μＩＵ／ｍｉ’０３７℃で３０分間インキュベートした後、二酸化クロム粒子をＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗浄した。次に、５００＊ｌの２　ｐｇ／■ｌ　ＤＴＢ−＾＾−１６−アルカリ性ホスファターゼを一方のセットの試験管（以下＾４セットと呼ぶ）に添加し、そして５００＊／の２ｐ９／ｍｌ　ＤＴＢ−アルカリ性ホスファターゼを他方のセットの試験管（以下Ｂ４− １セットと呼ぶ）に添加した。両セットを３７℃で１５分間インキュベートした後５００＊Ｊの１ｌｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，５）で４回洗浄した。

＾４セットの試験管を２つの同じサブセットに分けた。

それらサブセットの一方の各試験管に、２５０１１の６．８ｍｇ／諺！ビオチンの溶液および２５０〆ｌの２．５Ｍ　ＤＥＡ中の蛍光測定用基質４−メチルウンベリフェリルホスフェート（墓ＵＰ。

Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−１ａｎｎｈｅｉｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加して総結合型ＴＳＨ複合体を測定した。その反応混合物を３７℃で５分間インキュベートした後、５００＊ｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡクエンチング溶液の添加により反応をクエンチした。次に粒子を磁気的に分離し、そして各試験管の上演１００ｇ７をクリーンなセットの試験管（以下＾４−１セットと呼ぶ）に移した。

次に各試験管に２．５ｍｌのクエンチング溶液を添加し、そしてレポーターにより生じたシグナルＡｗｉｎｃｏ蛍光計を用いて測定した。

遊離物、ＤＴＢ−ＡＡ−１６−アルカリ性ホスファターゼを測定するために、３００鼻ｌのビオチン（６，８ｍｇ７　ｍｌビオチン濃度）を＾４セットの他方のサブセットに添加しそして３７℃で１０分間インキュベートした。次に粒子を磁気的に分離し、そして各試験管の上演２５０４１をクリーンな試験管セット（以下＾４−２セットと呼ぶ）に移した。次に、２５０〆ｌのＭＵＰを各試験管に添加しそしてそれら試験管を３７℃で５分間インキュベートした。０．５Ｍ　ＥＤＴＡクエンチング溶液の添加により反応をクエンチした。１００ｊｊアリコートにさらに２１１／のクエンチング溶液を添加し、そしてレポーターにより生じたシグナルを＾■１ｎｃｏ蛍光計を用いて測定した。

親水性スペーサーを有しないＤＴＢ−アルカリ性ホスファターゼを含む８４セツトの試験管を、結合型ＴＳＨ複合体（Ｂ４−１セツト）および遊離レポーター（Ｂ４−２セツト）の双方を測定するため、＾４セットについて前述したものと同じ手順を用いて処理した。

＾４セットおよび＾４セットの結果を表４に示す。

表　４＾４セット（ＤＴＢ−＾＾−１６−アルカリ性ホスファターゼを含有）基質ブランク　８６一− 結合型複合体（＾４−１セット）　１１３　１５７　２１６遊離レポーター（＾４−２セット）　１０１　１３０　１７７Ｂ４セツト（ＤＴＢ−アルカリ性ホスファターゼを含有）基質ブランク　７６− 結合型複合体（Ｂ４−１セツト）　９９　８６遊離レポーター（Ｂ４−２セツト）　８６　８４Ｆ、　１．　Ｕ、　＝蛍光強度単位ＳＬＩ＾ｗｉｃｏｎ　Ｐｈｏｔｏｎカウンター８０００Ｃ（ＳＬＩＩ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、　Ｉｎｃ、）、計器パラメータは次のとおり設定：Ｅｘ／Ｅｍ＝３７５／４５０　ｍｌ、分解能Ｅｘ／Ｅｗ＝２／２　ｎｍ、ＨＶ＝８５０Ｖ。

利得＝１００、間隔時間＝１秒表４の結果は、ＤＴＢを親水性スペーサー＾＾−１６を用いることなく直接アルカリ性ホスファターゼにカップリングさせた場合には、得られる複合体が、ＤＴＢを親水性スペーサー＾＾−１６を介してアルカリ性ホスファターゼに連結した場合よりも少ないストレプトアビジン−抗体複合体を結合することを示している。

実施例　５親水性スペーサー（ＡＡ−１６）に結合された遊離自在リガンドとしてＤＴＢを、そしてディスプレーサ−・リガンドとしてストレプトアビジンを用いたイムノアッセイにおける固体支持体から遊離される酵素標識複合体の遊離および測定によるＴＳＩｔの測定２系統の試験管を用意した。一方のセットは０ｊＩＵ／■ｌ濃度のＴＳＨ被検体を５００ｇ１’含有し、また他方のセットは２５ｕＩＵ／■ｌ濃度のＴＳＩＩ被検体を５００＊／含有した。両系統の各試験管に１２５ｇｇの二酸化クロム粒子を含有する５０〆ｌの溶液を添加した後、実施例２に記述したように調製された抗−ＴＳＨ１ｇＧ２−＾＾−１６−ＤＴＢ　０．５＃ｙを含有する５００〆ｌの溶液を添加した。全ての試験管を定期的にかき混ぜながら３７℃で３０分間インキュベートした。

次に二酸化クロム粒子を分離し、そして５００＊ｌの２５０ｓｉｌｔｒｉｓ、　５（ｌｓ１重亜硫酸ナトリウム洗浄緩衝液で３回洗浄した。両系統の各試験管に５００＊／の０．００１ｍｇ／■ｌストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（Ｃｈｅ■１ｃｏｎ　Ｃｏ、　）含有溶液を添加した。次にそれらの試験管を３７℃で１５分間インキュベートし、粒子を磁気的に分離し、そして２５０■ 璽　ｔｒｔｓ、５０園厘ホウ酸ナトリウム洗浄緩衝液で４回洗浄した。一方の系統の試験管に３００ｊＪのビオチン（２５０ｍｌｔｒｘｓｘ　５０菖菖ホウ酸ナトリウム緩衝液中３．０ｕｙ／　ｍｌ）を添加し、そして他方の系統のものには３００ｐｌのストレプトアビジン（Ｖｉｓｔａ　Ｗａｓｈ緩衝液中１ａｗ／ｌ／）を添加した。次に試験管を３７℃で１０分間インキュベートした後、二酸化クロム粒子を分離した。

１１０Ｐ／ＤＥ＾混合物２．４ｍｌの溶液をキュベツト中で３７℃に予め加温した。次に反応試験管よりの上清１００ｊ／を添加することにより反応を開始させた。０秒および３０秒の時点で＾■１ｃｏｎ蛍光計を用いてＲＦＵを読みとった。それらの読みを引き算しそしてその差に２を乗じてＲＦＵ／分とした。結果を表５に示す。

０　０、２５　０．７２２５　４５、４６　３０．７９基質ブランクは０．０１　ＲＦＵ／分であった。

表５の結果は、ストレプトアビジンがレポーターを遊離させるためのディスプレーサ−・リガンドとして用いることができ、このアッセイ方式にビオチンを使用する必要がなくなることを示している。

実施例　６固相および遊離非特異的結合に対する表面積変数の効果非特異的結合に対する表面積変数の効果を測定するために０．０．０５．０．１および５０ｘＩυ／■ｌ濃度のＴＳＨ試料を５００βｌ含む２セツトの試験管を３組用意した。ＴＳ）Ｉ濃度を同じようにしたこれらの試験管に、その上に抗− ＴＳＨＩｇＧ１を固定化した１２５ｇｇ、２００鼻ｖおよび２５０ｇｇの二酸化クロム粒子の溶液５０μｌを添加した。各試験管に０．５ｊｗの抗−ＴＳＩＩＩｇＧ２−　Ａ＾−１６−ＤＴＢを含む５００〆ｌの溶液を添加した。全ての試料を定期的にかき混ぜながら３７℃で３０分間インキュベートした。次に二酸化クロム粒子を分離し、そして５００＊ｌの２５０ｍ１ｌ　ｔｒｉｓ、　５０ｍ１ｌホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗浄した。３回目の洗浄の後、５００ｇ１のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（Ｃｈｅ■ｉ　ｃｏｎＣｏ、　）の０．０旧、ｓ＋ｇ／■ｌ溶液を添加しそして反応混合物を３７℃ で１５分間インキュベートさせた。次に全ての試験管を５００１１１の２５０ｍ１ｌ　ｔｒｉｓ、　５Ｑｗｌｌホウ酸ナトリウム洗浄液で４回洗浄した。

一方のセットの試験管は遊離レポーターの測定に用いた。このセットに３００１のビオチンの１５０ｍ１１カーボネート緩衝液中の６．８ｕｙ／ｍｌ溶液を添加し、そして反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートさせた。次に二酸化クロム粒子を分離しそして各試験管の上清２５０ｕ／を取り出しそしてクリーンな試験管セット（以下＾５セットと呼ぶ）に移した。

固体結合型レポーターの測定に用いた他方のセット（以下８５セツトと呼ぶ）に対しては、２５０μｌのビオチン溶液を二酸化クロム粒子に添加し、そしてそれら試験管をインキュベージコンまたは上清分離を行うことなく用いた。（＾５セットおよび８５セツトの）試験管の各々に、２５０βｌのＩＩＵＰ／　ＤＥ＾溶液を添加し、そして反応混合物を３７℃で５分間インキュベートした。次に５Ｍ　ＥＤＴＡクエンチング溶液の添加により反応をクエンチした。二酸化クロム粒子を８５セツトから分離しそして全試験管からの１０（ｂｌをクリーンなキュベツトに入れた。次に２．５ｍｌのクエンチング溶液を全てのキュベツトに添加してそれらの溶液を八−１ｃｏｎ蛍光計により読み取れる範囲に調整し、３７５ｎｍの励起および４７５１■の発光における測定値を読んだ。結果を表６に示す。

２５０　１００　０．５１　０．１１２００　８００　０．４９　０．１２１２５　０．３０　０．３０　０．１１基質ブランクは０．０３である。

表６の結果は、固体結合型レポーター標識複合体（８５セント）における非特異的結合は表面積が小さくなるにつれて減少することを示している。このことは二酸化クロムについてこれまでも知られかつ実証されていることである。しかしながら、遊離レポーター標識複合体（＾５セット）に対する非特異的結合は表面積とは無関係である。この結果は、本発明の遊離自在リガンド法を用いることにより提供される重要な利点を実証している。

国際調査報告フロントページの続き（７２）発明者　ツエン、スーザン・イエンーティーアメリカ合衆国プラウエア州　１９７０７．ホッケシン、トーピンコート９

Claims

【特許請求の範囲】１．Ａ．１．リンカーを介して第１結合パートナーを結合した固体支持体（該第１結合パートナーはストレプトアビジン、アビジン、スクシニル化アビジン、核酸および抗体より成る群より選択される）；２．被検体または第２結合パートナー：被検体複合体；および３．ａ．一時的結合を介して第１結合パートナーに、そして共有結合を介して第２結合パートナー：被検体複合体の第２結合パートナーに結合された（この場合第２結合パートナー：被検体複合体の被検体は、その上に検出可能なレポーターを有する第３結合パートナーに結合される）、またはｂ．一時的結合を介してその上に検出可能なレポーターを有する第３結合パートナーにそして共有結合を介して第２結合パートナー：被検体複合体の第２結合パートナーに結合された、またはｃ．一時的結合を介してその上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナーに、そして共有結合を介して被検体に結合された遊離自在リガンドより本質的に成る固定化サンドイッチ構造を、第１結合パートナーを結合した前記固体支持体を１．被検体を含有すると思われる液体検体：２．単独の、または共有結合を介して第２結合パートナーに結合された遊離自在リガンド；および３．その上に検出可能なレポーターを有する第２または第３結合パートナーと接触させることにより調製し；Ｂ．その固定化サンドイッチ構造を可溶性成分から分離し；Ｃ．前記一時的結合を、１．遊離自在リガンドに対し過剰量のディスプレーサー・リガンドを添加するか、または２．第１、第２または第３結合パートナーに対するディスプレーサー・リガンドの親和性が第１、第２または第３結合パートナーに対する遊離自在リガンドの親和性より高くなるようなディスプレーサー・リガンドを添加することにより切断し；そしてＤ．溶液中の検出可能なレポーターを測定する工程より成る被検体の非競合型特異的結合アッセイ。２．Ａ．一時的結合を介して遊離自在リガンドを結合させることができる第１結合パートナーまたは被検体を固定支持体に固定化し；Ｂ．工程Ａの生成物を、１．被検体を含有する波液検体；２．既知量の、共有結合を介して遊離自在リガンドに結合され、そして被検体に結合できる第１結合パートナー、または既知量の遊離自在リガンド：被検体複合体（この場合遊離自在リガンドは一時的結合を介して固体支持体上の第１結合パートナーに結合され得る）；および３．その上に検出可能なレポーターを有する第２結合パートナー（この場合第２結合パートナーは一時的結合を介して遊離自在リガンドに結合され得る）、または既知量の、その上に検出可能なレポーターを有する被検体と結合できる第２結合パートナーを組み合わせることにより調製されたレポーター標識複合体を含有する混合物と接触させることにより固定化レポーター標識複合体を形成し；Ｃ．その固定化レポーター標識複合体を可溶性成分から分離し；Ｄ．前記一時的結合を、１．遊離自在リガンドに対し過剰量のディスプレーサー・リガンドを添加するか、または２．第１または第２結合パートナーに対するディスプレーサー・リガンドの親和性が第１または第２結合パートナーに対する遊離自在リガンドの親和性より高くなるようなディスプレーサー・リガンドを添加することにより切断し；そしてＥ．溶液中のレポーターを測定する工程より成る被検体の競合型特異的結合アッセイ。