JPH04233459A - 可溶化試薬 - Google Patents
可溶化試薬Info
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- JPH04233459A JPH04233459A JP3205210A JP20521091A JPH04233459A JP H04233459 A JPH04233459 A JP H04233459A JP 3205210 A JP3205210 A JP 3205210A JP 20521091 A JP20521091 A JP 20521091A JP H04233459 A JPH04233459 A JP H04233459A
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- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、液体試料から分析対象
物を抽出するのに有用な試薬に関する。さらに詳しくは
、生物学的試料の成分からの分析対象物、特に疎水性分
析対象物の解離を容易にすることにより該試料中に存在
する該分析対象物の測定を可能にする試薬に関する。
物を抽出するのに有用な試薬に関する。さらに詳しくは
、生物学的試料の成分からの分析対象物、特に疎水性分
析対象物の解離を容易にすることにより該試料中に存在
する該分析対象物の測定を可能にする試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生物
学的流体（たとえば、血清、血漿、全血、尿など）中の
治療薬レベルや他の分析対象物をモニターすることは、
適当な患者管理を助けるための情報を医師に提供する上
で非常に有用になってきている。たとえば、患者投与量
を調節し、最適治療効果を達成し、無用な治療効果以下
の投与レベルまたは有害な毒性投与レベルを回避するこ
とができる。薬物レベルのモニターまたは他の分析対象
物の検出に使用する従来法が知られている。そのような
従来法には、ラジオイムノアッセイおよび蛍光偏光イム
ノアッセイなどの非放射性同位元素アッセイが含まれる
。 しかしながら、そのような方法では、疎水性分析対象物
の量または存在を決定する場合に、生物学的試料の種々
の細胞成分との該対象物の細胞内関係のために一致した
結果が得られない。それゆえ、そのような分析対象物が
該細胞成分と結合したままである場合には、分析系中の
該分析対象物の検出は困難であり、とりわけ該分析対象
物が特に低レベルで存在する場合にはある種の場合に検
出が不可能である。
学的流体（たとえば、血清、血漿、全血、尿など）中の
治療薬レベルや他の分析対象物をモニターすることは、
適当な患者管理を助けるための情報を医師に提供する上
で非常に有用になってきている。たとえば、患者投与量
を調節し、最適治療効果を達成し、無用な治療効果以下
の投与レベルまたは有害な毒性投与レベルを回避するこ
とができる。薬物レベルのモニターまたは他の分析対象
物の検出に使用する従来法が知られている。そのような
従来法には、ラジオイムノアッセイおよび蛍光偏光イム
ノアッセイなどの非放射性同位元素アッセイが含まれる
。 しかしながら、そのような方法では、疎水性分析対象物
の量または存在を決定する場合に、生物学的試料の種々
の細胞成分との該対象物の細胞内関係のために一致した
結果が得られない。それゆえ、そのような分析対象物が
該細胞成分と結合したままである場合には、分析系中の
該分析対象物の検出は困難であり、とりわけ該分析対象
物が特に低レベルで存在する場合にはある種の場合に検
出が不可能である。
【０００３】たとえば、トリトンＸ−１００Ｒ、ツイー
ンＲ、ドデシル硫酸ナトリウムおよびサポニンなどの、
種々の分析対象物を分析用に抽出するための種々の試薬
が記載されているが、そのような試薬の使用は、特に特
異的結合タンパク質や抗体などの試薬を分析に使用する
場合には多くの欠点を有する。たとえば、そのような試
薬は多くの場合、完全な細胞溶解を達成することができ
ず、疎水性分析対象物の場合には相当量が細胞成分に結
合したままであるため分析に利用することができない。 同様に、そのような試薬がたとえばイムノアッセイシス
テム中に存在すると該イムノアッセイに使用した特異的
結合タンパク質や抗体が有意に変性され、そのため該タ
ンパク質や抗体の結合活性が減少する。さらに、液体試
料中に存在する種々の細胞成分や他の物質から分析対象
物を解離させるために上記試薬を使用することは、特に
該解離を達成するために該試薬を高濃度で使用する場合
に、種々の分析系で使用した試薬の完全性（ｉｎｔｅｇ
ｒｉｔｙ）に重大な影響を与える。
ンＲ、ドデシル硫酸ナトリウムおよびサポニンなどの、
種々の分析対象物を分析用に抽出するための種々の試薬
が記載されているが、そのような試薬の使用は、特に特
異的結合タンパク質や抗体などの試薬を分析に使用する
場合には多くの欠点を有する。たとえば、そのような試
薬は多くの場合、完全な細胞溶解を達成することができ
ず、疎水性分析対象物の場合には相当量が細胞成分に結
合したままであるため分析に利用することができない。 同様に、そのような試薬がたとえばイムノアッセイシス
テム中に存在すると該イムノアッセイに使用した特異的
結合タンパク質や抗体が有意に変性され、そのため該タ
ンパク質や抗体の結合活性が減少する。さらに、液体試
料中に存在する種々の細胞成分や他の物質から分析対象
物を解離させるために上記試薬を使用することは、特に
該解離を達成するために該試薬を高濃度で使用する場合
に、種々の分析系で使用した試薬の完全性（ｉｎｔｅｇ
ｒｉｔｙ）に重大な影響を与える。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物学的試料
中の疎水性分析対象物の決定のための分析系、とりわけ
該分析対象物に特異的に結合するタンパク質を用いた分
析系において本発明の可溶化試薬を用いた際に、本発明
の可溶化試薬が生物学的試料中の種々の成分（細胞物質
、リン脂質、タンパク質など）から該分析対象物を解離
させることにより該分析系が実質的に改良されるという
発見に基づいている。特に、本発明の可溶化試薬は、予
期せずまた驚くべきことに、実質的に低濃度にて、上記
成分、とりわけ細胞成分から疎水性分析対象物を解離さ
せ、一方それと同時に、分析系中に存在する特異的結合
タンパク質（たとえば、抗体など）の変性を最小限に抑
える。本発明の可溶化試薬は、シクロスポリンなどの疎
水性分析対象物の決定のための蛍光偏光イムノアッセイ
において特に有用である。
中の疎水性分析対象物の決定のための分析系、とりわけ
該分析対象物に特異的に結合するタンパク質を用いた分
析系において本発明の可溶化試薬を用いた際に、本発明
の可溶化試薬が生物学的試料中の種々の成分（細胞物質
、リン脂質、タンパク質など）から該分析対象物を解離
させることにより該分析系が実質的に改良されるという
発見に基づいている。特に、本発明の可溶化試薬は、予
期せずまた驚くべきことに、実質的に低濃度にて、上記
成分、とりわけ細胞成分から疎水性分析対象物を解離さ
せ、一方それと同時に、分析系中に存在する特異的結合
タンパク質（たとえば、抗体など）の変性を最小限に抑
える。本発明の可溶化試薬は、シクロスポリンなどの疎
水性分析対象物の決定のための蛍光偏光イムノアッセイ
において特に有用である。
【０００５】本発明の可溶化試薬は、非イオン性かまた
は両イオン性のいずれかの特性を有する界面活性剤を約
１．５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは
約２％（ｗ／ｖ）含有し、該界面活性剤は生物学的試料
の成分から実質的にすべての疎水性分析対象物を解離さ
せることができる。好ましくは、上記界面活性剤は、ア
ルキル−オキシ（ポリエチレン−オキシ−プロピレン−
オキシ−イソプロパノール）などの非イオン性ポリグリ
コール界面活性剤かＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートなどの
両イオン性界面活性剤のいずれかである。本発明の可溶
化試薬にはまた、約０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ
）のサポニンも含有されていてよい。
は両イオン性のいずれかの特性を有する界面活性剤を約
１．５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは
約２％（ｗ／ｖ）含有し、該界面活性剤は生物学的試料
の成分から実質的にすべての疎水性分析対象物を解離さ
せることができる。好ましくは、上記界面活性剤は、ア
ルキル−オキシ（ポリエチレン−オキシ−プロピレン−
オキシ−イソプロパノール）などの非イオン性ポリグリ
コール界面活性剤かＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートなどの
両イオン性界面活性剤のいずれかである。本発明の可溶
化試薬にはまた、約０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ
）のサポニンも含有されていてよい。
【０００６】本発明の可溶化試薬は、全血、血清、血漿
、尿、脊髄液などの生物学的試料から分析対象物、とり
わけ疎水性分析対象物を解離させる。本発明から考えら
れるように、疎水性分析対象物としてはステロイド類、
シクロスポリンなどの薬物などが挙げられるが、これら
に限られるものではない。
、尿、脊髄液などの生物学的試料から分析対象物、とり
わけ疎水性分析対象物を解離させる。本発明から考えら
れるように、疎水性分析対象物としてはステロイド類、
シクロスポリンなどの薬物などが挙げられるが、これら
に限られるものではない。
【０００７】とりわけ本発明の可溶化試薬は、生物学的
試料中に存在する赤血球、一群の白血球（リンパ球など
）、リン脂質、タンパク質などの細胞物質から上記分析
対象物を解離させ、そのことによって該分析対象物が所
望の分析系で容易に測定が可能なようにする。本発明の
可溶化試薬は、特異的結合タンパク質を用いた疎水性分
析対象物の決定のための分析系、特にイムノアッセイ系
において有用であるが、放射活性アッセイなどの他のア
ッセイ系にも用いることができる。
試料中に存在する赤血球、一群の白血球（リンパ球など
）、リン脂質、タンパク質などの細胞物質から上記分析
対象物を解離させ、そのことによって該分析対象物が所
望の分析系で容易に測定が可能なようにする。本発明の
可溶化試薬は、特異的結合タンパク質を用いた疎水性分
析対象物の決定のための分析系、特にイムノアッセイ系
において有用であるが、放射活性アッセイなどの他のア
ッセイ系にも用いることができる。
【０００８】本発明の可溶化試薬に非イオン性界面活性
剤を使用するのが望ましい場合は、そのような非イオン
性界面活性剤は、アルキルオキシ（ポリエチレンオキシ
プロピレンオキシ）イソプロパノール（一般にタージト
ールＲとしても知られている）などの非イオン性ポリグ
リコール界面活性剤であるのが好ましい。本発明の可溶
化試薬に両イオン性界面活性剤を使用するのが望ましい
場合は、そのような両イオン性界面活性剤は、Ｎ−テト
ラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プ
ロパンスルホネート、Ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−デ
シル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ヘキサ
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロ
パンスルホネートなどから選ばれる。
剤を使用するのが望ましい場合は、そのような非イオン
性界面活性剤は、アルキルオキシ（ポリエチレンオキシ
プロピレンオキシ）イソプロパノール（一般にタージト
ールＲとしても知られている）などの非イオン性ポリグ
リコール界面活性剤であるのが好ましい。本発明の可溶
化試薬に両イオン性界面活性剤を使用するのが望ましい
場合は、そのような両イオン性界面活性剤は、Ｎ−テト
ラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プ
ロパンスルホネート、Ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−デ
シル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ヘキサ
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロ
パンスルホネートなどから選ばれる。
【０００９】上記非イオン性界面活性剤または両イオン
性界面活性剤のいずれかに加えて、本発明の可溶化試薬
はまたサポニンなどの配糖体をさらに含有していてもよ
い。
性界面活性剤のいずれかに加えて、本発明の可溶化試薬
はまたサポニンなどの配糖体をさらに含有していてもよ
い。
【００１０】本発明による可溶化試薬は、生物学的試料
中に存在する種々の細胞成分の実質的にすべてを溶解す
ることができ、所望の分析対象物の実質的にすべてを他
の生物学的試料成分から解離させることにより該分析対
象物を分析に供することができるようにする。とりわけ
、本発明の可溶化試薬は、たとえば赤血球、白血球など
の細胞集団を実質的に完全に細胞溶解することができ、
その中に含まれる所望の分析対象物の実質的にすべてを
回収することができる。加えて、本発明の可溶化試薬は
また、生物学的試料中に存在する他の成分、たとえば細
胞物質、リン脂質、タンパク質など（所望の分析対象物
が結合したままになっていて分析に利用できなくなって
いる）から該分析対象物を解離させることができる。
中に存在する種々の細胞成分の実質的にすべてを溶解す
ることができ、所望の分析対象物の実質的にすべてを他
の生物学的試料成分から解離させることにより該分析対
象物を分析に供することができるようにする。とりわけ
、本発明の可溶化試薬は、たとえば赤血球、白血球など
の細胞集団を実質的に完全に細胞溶解することができ、
その中に含まれる所望の分析対象物の実質的にすべてを
回収することができる。加えて、本発明の可溶化試薬は
また、生物学的試料中に存在する他の成分、たとえば細
胞物質、リン脂質、タンパク質など（所望の分析対象物
が結合したままになっていて分析に利用できなくなって
いる）から該分析対象物を解離させることができる。
【００１１】本発明の可溶化試薬は、予期せずまた驚く
べきことに、実質的に低濃度にて上記細胞溶解および分
析対象物の解離を達成することができることがわかった
。特に、わずか１．５％（ｗ／ｖ）の低濃度の非イオン
性または両イオン性界面活性剤をサポニンとともに用い
た可溶化試薬の使用が上記細胞溶解および分析対象物の
解離に有効であることがわかった。界面活性剤の濃度は
好ましくは約１．５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）
、さらに好ましくは約２％（ｗ／ｖ）であり、さらに約
０％〜約２５％、好ましくは２％のサポニンが可溶化試
薬に含まれていてもよい。
べきことに、実質的に低濃度にて上記細胞溶解および分
析対象物の解離を達成することができることがわかった
。特に、わずか１．５％（ｗ／ｖ）の低濃度の非イオン
性または両イオン性界面活性剤をサポニンとともに用い
た可溶化試薬の使用が上記細胞溶解および分析対象物の
解離に有効であることがわかった。界面活性剤の濃度は
好ましくは約１．５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）
、さらに好ましくは約２％（ｗ／ｖ）であり、さらに約
０％〜約２５％、好ましくは２％のサポニンが可溶化試
薬に含まれていてもよい。
【００１２】生物学的試料を本明細書に記載するような
分析系で使用する前に該生物学的試料の処理試薬が使用
され、そのような試薬がその後の分析の間にも該試料中
に存在することが考えられる。それゆえ、本発明の可溶
化試薬は、たとえば、界面活性剤や一般に同様の目的で
使用される他の前処理試薬の存在に感受性の特異的結合
タンパク質や抗体を使用する分析系に生物学的試料を使
用する場合に特に有用である。たとえば、本発明の可溶
化試薬をイムノアッセイ系で分析前に使用することによ
り、該アッセイ系で使用する抗体試薬の変性を最小限に
抑えることができ、その結果、該抗体試薬の結合活性が
実質的になんらの影響も受けることがなくなる。
分析系で使用する前に該生物学的試料の処理試薬が使用
され、そのような試薬がその後の分析の間にも該試料中
に存在することが考えられる。それゆえ、本発明の可溶
化試薬は、たとえば、界面活性剤や一般に同様の目的で
使用される他の前処理試薬の存在に感受性の特異的結合
タンパク質や抗体を使用する分析系に生物学的試料を使
用する場合に特に有用である。たとえば、本発明の可溶
化試薬をイムノアッセイ系で分析前に使用することによ
り、該アッセイ系で使用する抗体試薬の変性を最小限に
抑えることができ、その結果、該抗体試薬の結合活性が
実質的になんらの影響も受けることがなくなる。
【００１３】本発明の可溶化試薬をイムノアッセイを行
うために使用する場合は、試料をまず可溶化試薬で処理
し、試料中に存在する細胞集団を溶解し、上記他の成分
から疎水性分析対象物を解離させる。ついで、得られた
溶液を、米国特許出願第５６７，８５３号（発明の名称
：「タンパク質沈澱試薬」、１９９０年８月１５日出願
）に記載されているような沈澱試薬で処理する。そのよ
うな沈澱試薬は、本発明の可溶化試薬で試料を処理した
結果生じる細胞物質を含むあらゆる妨害タンパク質を沈
澱させる。また、そのような沈澱試薬を用いた前処理の
結果生じる沈澱物質は重力で沈降するが、試料を遠心分
離にかけることにより解離分析対象物を抽出するのが好
ましく、その際、得られる上澄み液が、実質的に細胞物
質および成分を含まない形で所望の分析対象物を含有し
ている。ついで、この上澄み液を、当業者に知られた検
出可能なトレーサー化合物、および当該技術分野で知ら
れた方法により調製した分析対象物に対する適当な抗体
または結合試薬と混合する。そのような一般的なイムノ
アッセイ法によれば、試料中に存在する分析対象物とト
レーサー化合物とは限られた数の結合部位に対して競合
し、その結果、分析対象物複合体およびトレーサー化合
物複合体が生成する。トレーサー化合物と抗体の濃度を
一定に保持することにより、トレーサー複合体に対する
分析対象物複合体の生成の比は試料中に存在する分析対
象物の量に正比例する。
うために使用する場合は、試料をまず可溶化試薬で処理
し、試料中に存在する細胞集団を溶解し、上記他の成分
から疎水性分析対象物を解離させる。ついで、得られた
溶液を、米国特許出願第５６７，８５３号（発明の名称
：「タンパク質沈澱試薬」、１９９０年８月１５日出願
）に記載されているような沈澱試薬で処理する。そのよ
うな沈澱試薬は、本発明の可溶化試薬で試料を処理した
結果生じる細胞物質を含むあらゆる妨害タンパク質を沈
澱させる。また、そのような沈澱試薬を用いた前処理の
結果生じる沈澱物質は重力で沈降するが、試料を遠心分
離にかけることにより解離分析対象物を抽出するのが好
ましく、その際、得られる上澄み液が、実質的に細胞物
質および成分を含まない形で所望の分析対象物を含有し
ている。ついで、この上澄み液を、当業者に知られた検
出可能なトレーサー化合物、および当該技術分野で知ら
れた方法により調製した分析対象物に対する適当な抗体
または結合試薬と混合する。そのような一般的なイムノ
アッセイ法によれば、試料中に存在する分析対象物とト
レーサー化合物とは限られた数の結合部位に対して競合
し、その結果、分析対象物複合体およびトレーサー化合
物複合体が生成する。トレーサー化合物と抗体の濃度を
一定に保持することにより、トレーサー複合体に対する
分析対象物複合体の生成の比は試料中に存在する分析対
象物の量に正比例する。
【００１４】本発明の可溶化試薬は蛍光偏光イムノアッ
セイ系において特に有用であり、該系において試料中の
分析対象物の量は、アッセイ混合物を偏光で励起させ、
ついで遊離の未結合トレーサー化合物およびトレーサー
抗体複合体のいずれかから放射される蛍光の偏光を測定
することにより決定される。抗体と複合体を形成してい
ないトレーサー化合物は、蛍光の吸収および再放射に要
する時間よりも短い時間で自由に回転することができる
。その結果、再放射される光は比較的ランダムな方向を
向いており、そのため抗体と複合体を形成していないト
レーサー化合物の蛍光偏光は低く、０に近付く。特異的
抗体と複合体を形成すると、かくして形成したトレーサ
ー−抗体複合体は抗体分子の回転を担うが、これは相対
的に小さなトレーサー化合物分子の回転よりも遅いため
観察される偏光は増大する。
セイ系において特に有用であり、該系において試料中の
分析対象物の量は、アッセイ混合物を偏光で励起させ、
ついで遊離の未結合トレーサー化合物およびトレーサー
抗体複合体のいずれかから放射される蛍光の偏光を測定
することにより決定される。抗体と複合体を形成してい
ないトレーサー化合物は、蛍光の吸収および再放射に要
する時間よりも短い時間で自由に回転することができる
。その結果、再放射される光は比較的ランダムな方向を
向いており、そのため抗体と複合体を形成していないト
レーサー化合物の蛍光偏光は低く、０に近付く。特異的
抗体と複合体を形成すると、かくして形成したトレーサ
ー−抗体複合体は抗体分子の回転を担うが、これは相対
的に小さなトレーサー化合物分子の回転よりも遅いため
観察される偏光は増大する。
【００１５】上記のような決定を行う場合、分析対象物
は抗体部位に対してトレーサー化合物と競合し、観察さ
れるトレーサー−抗体複合体の蛍光偏光は、遊離のトレ
ーサー化合物の値とトレーサー−抗体複合体の値との間
のものとなる。従って、試料中に高濃度の分析対象物が
含まれていると、観察される蛍光偏光値は遊離のトレー
サー化合物の値に近くなる、すなわち低くなる。逆に試
料中に含まれる分析対象物の濃度が低い場合は、偏光値
はトレーサー−抗体複合体の値に近くなる、すなわち高
くなる。イムノアッセイの反応混合物を垂直偏光ついで
水平偏光で順番に励起させ、放出される光の垂直成分の
みを分析することにより、反応混合物中の蛍光の偏光を
正確に決定することができる。偏光と分析対象物濃度と
の正確な関係は濃度が既知のカリブレーターの偏光値を
測定することによって確立することができ、それから作
成した標準曲線より分析対象物の濃度を内挿することが
できる。
は抗体部位に対してトレーサー化合物と競合し、観察さ
れるトレーサー−抗体複合体の蛍光偏光は、遊離のトレ
ーサー化合物の値とトレーサー−抗体複合体の値との間
のものとなる。従って、試料中に高濃度の分析対象物が
含まれていると、観察される蛍光偏光値は遊離のトレー
サー化合物の値に近くなる、すなわち低くなる。逆に試
料中に含まれる分析対象物の濃度が低い場合は、偏光値
はトレーサー−抗体複合体の値に近くなる、すなわち高
くなる。イムノアッセイの反応混合物を垂直偏光ついで
水平偏光で順番に励起させ、放出される光の垂直成分の
みを分析することにより、反応混合物中の蛍光の偏光を
正確に決定することができる。偏光と分析対象物濃度と
の正確な関係は濃度が既知のカリブレーターの偏光値を
測定することによって確立することができ、それから作
成した標準曲線より分析対象物の濃度を内挿することが
できる。
【００１６】蛍光偏光法を用いる場合は、「ミリ偏光単
位」、「スパン」（ミリ偏光単位にて）および「相対強
度」により結果を定量することができる。ミリ偏光単位
の測定は、試料中にフェニルクロロベンゼン（ＰＣＢ）
が不在のときに最大量のトレーサー化合物が抗体に結合
した場合の最大偏光を示す。正味のミリ偏光単位が高く
なればなるほど、抗体に対するトレーサー化合物の結合
は良好となる。本発明の目的のためには、正味のミリ偏
光値が少なくとも約１３０であるのが好ましい。
位」、「スパン」（ミリ偏光単位にて）および「相対強
度」により結果を定量することができる。ミリ偏光単位
の測定は、試料中にフェニルクロロベンゼン（ＰＣＢ）
が不在のときに最大量のトレーサー化合物が抗体に結合
した場合の最大偏光を示す。正味のミリ偏光単位が高く
なればなるほど、抗体に対するトレーサー化合物の結合
は良好となる。本発明の目的のためには、正味のミリ偏
光値が少なくとも約１３０であるのが好ましい。
【００１７】「スパン」とは、正味のミリ偏光値と抗体
に最小量のトレーサー化合物が結合した場合の偏光値と
の差異を示す。スパンが大きいほどデータの数値分析は
良くなる。本発明の目的のためには、少なくとも約１５
ミリ偏光単位のスパンが好ましい。
に最小量のトレーサー化合物が結合した場合の偏光値と
の差異を示す。スパンが大きいほどデータの数値分析は
良くなる。本発明の目的のためには、少なくとも約１５
ミリ偏光単位のスパンが好ましい。
【００１８】「相対強度」は、バックグラウンド蛍光を
越える蛍光シグナルの強度の測定手段である。それゆえ
、強度が高いほど一層正確な測定が得られる。強度は、
垂直偏光の強度に水平偏光強度を２倍したものを加えた
合計として決定される。強度は、トレーサー化合物の濃
度や他のアッセイ変数に依存して、バックグラウンドノ
イズの約３倍から約３０倍の範囲である。本発明の目的
のためには、バックグラウンドノイズの約３倍から約２
０倍の強度が好ましい。
越える蛍光シグナルの強度の測定手段である。それゆえ
、強度が高いほど一層正確な測定が得られる。強度は、
垂直偏光の強度に水平偏光強度を２倍したものを加えた
合計として決定される。強度は、トレーサー化合物の濃
度や他のアッセイ変数に依存して、バックグラウンドノ
イズの約３倍から約３０倍の範囲である。本発明の目的
のためには、バックグラウンドノイズの約３倍から約２
０倍の強度が好ましい。
【００１９】本発明の可溶化試薬は、米国特許出願第５
６７，８４２号（発明の名称：「シクロスポリンの定量
のためのイムノアッセイ試薬および方法」、１９９０年
８月１５日出願）に記載されているようなシクロスポリ
ンの第一位にあるＭｅＢｍｔ（Ｎ−メチル−（４Ｒ）−
４−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−４−メチル−（Ｌ）
−トレオニン）の水酸基に４−アミノメチルフルオレセ
インがカップリングした蛍光トレーサー化合物、および
国際特許出願公開ＷＯ ８６／０２０８０に記載されて
いるようなシクロスポリンに対するモノクローナル抗体
を使用した、シクロスポリンおよびその代謝産物の蛍光
偏光イムノアッセイを行うのに特に有用である。そのよ
うな方法では、米国特許出願第５６７，８５３号（発明
の名称：「タンパク質沈澱試薬」、１９９０年８月１５
日出願）に記載されているような硫酸亜鉛、エチレング
リコールおよびメタノールからなる沈澱試薬、希釈緩衝
液、およびカリブレーターおよびコントロールもまた用
いられる。そのような沈澱試薬は、妨害タンパク質、ヘ
モグロビンおよび他の妨害物質を沈澱させながら同時に
疎水性分析対象物を溶液中に維持することにより、該分
析対象物がたとえば特異的結合タンパク質（たとえば、
抗体など）に結合することができるようにするために用
いられる。
６７，８４２号（発明の名称：「シクロスポリンの定量
のためのイムノアッセイ試薬および方法」、１９９０年
８月１５日出願）に記載されているようなシクロスポリ
ンの第一位にあるＭｅＢｍｔ（Ｎ−メチル−（４Ｒ）−
４−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−４−メチル−（Ｌ）
−トレオニン）の水酸基に４−アミノメチルフルオレセ
インがカップリングした蛍光トレーサー化合物、および
国際特許出願公開ＷＯ ８６／０２０８０に記載されて
いるようなシクロスポリンに対するモノクローナル抗体
を使用した、シクロスポリンおよびその代謝産物の蛍光
偏光イムノアッセイを行うのに特に有用である。そのよ
うな方法では、米国特許出願第５６７，８５３号（発明
の名称：「タンパク質沈澱試薬」、１９９０年８月１５
日出願）に記載されているような硫酸亜鉛、エチレング
リコールおよびメタノールからなる沈澱試薬、希釈緩衝
液、およびカリブレーターおよびコントロールもまた用
いられる。そのような沈澱試薬は、妨害タンパク質、ヘ
モグロビンおよび他の妨害物質を沈澱させながら同時に
疎水性分析対象物を溶液中に維持することにより、該分
析対象物がたとえば特異的結合タンパク質（たとえば、
抗体など）に結合することができるようにするために用
いられる。
【００２０】試料を本発明の可溶化試薬および上記沈澱
試薬で処理したら、ついで、シクロスポリンまたはシク
ロスポリンとその代謝産物を含有する上澄み液を抗体と
混合する。トレーサー化合物および希釈緩衝液を加える
前に、バックグラウンド蛍光の読み取りを行い、約１０
分から約３０分のインキュベーション期間の後、蛍光偏
光の読み取りを上記のようにして行う。
試薬で処理したら、ついで、シクロスポリンまたはシク
ロスポリンとその代謝産物を含有する上澄み液を抗体と
混合する。トレーサー化合物および希釈緩衝液を加える
前に、バックグラウンド蛍光の読み取りを行い、約１０
分から約３０分のインキュベーション期間の後、蛍光偏
光の読み取りを上記のようにして行う。
【００２１】
【実施例】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 シクロスポリンの蛍光偏光イムノアッセイ試薬 本発明の可溶化試薬を用いた蛍光偏光イムノアッセ
イを行うための試薬を下記のようにして調製した。 （ａ）シクロスポリントレーサー試薬：（ｉ）［Ｏ−（
クロロホルミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン（シク
ロスポリンクロロホルメート）の調製：
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 シクロスポリンの蛍光偏光イムノアッセイ試薬 本発明の可溶化試薬を用いた蛍光偏光イムノアッセ
イを行うための試薬を下記のようにして調製した。 （ａ）シクロスポリントレーサー試薬：（ｉ）［Ｏ−（
クロロホルミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポリン（シク
ロスポリンクロロホルメート）の調製：
【００２２】栓
および撹拌棒を備えた１０ｍｌ容丸底フラスコ中でシク
ロスポリン（２４．２ｍｇ、０．０２０ミリモル）をベ
ンゼン（２．０ｍｌ）中のホスゲンの２５％ｗ／ｗ溶液
中に溶解した。この反応液を５分間撹拌してシクロスポ
リンを溶解し、ついで室温で２４時間静置した。この反
応液を真空濃縮した。この生成物は固体として０°Ｃで
６カ月まで貯蔵することができた。その後の反応には、
ＤＭＦ中の０．０２Ｍ溶液を用いた。
および撹拌棒を備えた１０ｍｌ容丸底フラスコ中でシク
ロスポリン（２４．２ｍｇ、０．０２０ミリモル）をベ
ンゼン（２．０ｍｌ）中のホスゲンの２５％ｗ／ｗ溶液
中に溶解した。この反応液を５分間撹拌してシクロスポ
リンを溶解し、ついで室温で２４時間静置した。この反
応液を真空濃縮した。この生成物は固体として０°Ｃで
６カ月まで貯蔵することができた。その後の反応には、
ＤＭＦ中の０．０２Ｍ溶液を用いた。
【００２３】（ｉｉ）［Ｏ−（フルオレセイン−４’−
イルメチルアミノホルミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポ
リンの調製： 上記工程（ｉ）に記載したＤＭＦ中の０．０２Ｍ溶液と
してのシクロスポリンクロロホルメート（０．２ｍｌ、
４ミリモル）を、撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で塩
酸４’−アミノメチルフルオレセイン（２．０ｍｇ、５
ミリモル）と混合した。みかけのｐＨが（湿ったｐＨ紙
により）約７になるまでピリジンを加えた。この反応液
を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣を
メタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレート上に負
荷した。このプレートを１５％メタノール／メチレンク
ロライドで展開した。生成物のバンド（Ｒｆ＝０．５５
）をシリカゲルからメタノールで溶出した。
イルメチルアミノホルミル）ＭｅＢｍｔ］１シクロスポ
リンの調製： 上記工程（ｉ）に記載したＤＭＦ中の０．０２Ｍ溶液と
してのシクロスポリンクロロホルメート（０．２ｍｌ、
４ミリモル）を、撹拌棒を備えた栓付きバイアル中で塩
酸４’−アミノメチルフルオレセイン（２．０ｍｇ、５
ミリモル）と混合した。みかけのｐＨが（湿ったｐＨ紙
により）約７になるまでピリジンを加えた。この反応液
を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣を
メタノール中に取り、１ｍｍシリカゲルプレート上に負
荷した。このプレートを１５％メタノール／メチレンク
ロライドで展開した。生成物のバンド（Ｒｆ＝０．５５
）をシリカゲルからメタノールで溶出した。
【００２４】（ｉｉｉ）トレーサー試薬の調製：０．０
１％（ｗ／ｖ）ウシガンマグロブリン、０．１％（ｗ／
ｖ）アジ化ナトリウム、５．０％（ｗ／ｖ）エチレング
リコールおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ツイーンＴＭ２０
を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）中の上記（ｉｉ）で調製したシクロスポリントレー
サー化合物からなる６０ナノモルシクロスポリントレー
サー試薬を調製した。 （ｂ）モノクローナル抗体調合物： シクロスポリンに対するマウス（腹水）モノクローナル
抗体（サンドス・アクチエン・ゲゼルシャフト、バーゼ
ル、スイス）を、アジ化ナトリウムを含有するクエン酸
緩衝液中に希釈してモノクローナル抗体試薬を調製した
。
１％（ｗ／ｖ）ウシガンマグロブリン、０．１％（ｗ／
ｖ）アジ化ナトリウム、５．０％（ｗ／ｖ）エチレング
リコールおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ツイーンＴＭ２０
を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）中の上記（ｉｉ）で調製したシクロスポリントレー
サー化合物からなる６０ナノモルシクロスポリントレー
サー試薬を調製した。 （ｂ）モノクローナル抗体調合物： シクロスポリンに対するマウス（腹水）モノクローナル
抗体（サンドス・アクチエン・ゲゼルシャフト、バーゼ
ル、スイス）を、アジ化ナトリウムを含有するクエン酸
緩衝液中に希釈してモノクローナル抗体試薬を調製した
。
【００２５】（ｃ）前処理試薬：
０．１ＭトリスＴＭ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％ア
ジ化ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）硫酸銅および１０
．０％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸からなる前処理
試薬を調製した。 （ｄ）希釈緩衝液： ０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）および０．１
％（ｗ／ｖ）ウシガンマグロブリンからなる希釈緩衝液
を調製した。 （ｅ）全血沈澱試薬： ６０ｍＭ硫酸亜鉛、５０％（ｗ／ｖ）メタノールおよび
３３％（ｗ／ｖ）エチレングリコールからなる全血沈澱
試薬を調製した。
ジ化ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）硫酸銅および１０
．０％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸からなる前処理
試薬を調製した。 （ｄ）希釈緩衝液： ０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）および０．１
％（ｗ／ｖ）ウシガンマグロブリンからなる希釈緩衝液
を調製した。 （ｅ）全血沈澱試薬： ６０ｍＭ硫酸亜鉛、５０％（ｗ／ｖ）メタノールおよび
３３％（ｗ／ｖ）エチレングリコールからなる全血沈澱
試薬を調製した。
【００２６】（ｆ）可溶化試薬：
２．０％（ｗ／ｖ）タージトールミンフォーム（ｍｉｎ
ｆｏａｍ）１ＸＴＭ、２．０％（ｗ／ｖ）サポニンお
よび０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムからなる可溶
化試薬を調製した。 （ｇ）カリブレーター： シクロスポリンおよび人工のヒト全血マトリックスから
なるシクロスポリンモノクローナル全血カリブレーター
を調製した。カリブレーターは、保存剤としてアジ化ナ
トリウムを用い、０．０、１００、２５０、５００、１
０００および１５００ｎｇ／ｍｌの濃度にて調製した。 （ｈ）コントロール： シクロスポリンおよび人工全血マトリックスからなるシ
クロスポリンモノクローナル全血コントロールを調製し
た。コントロールは、保存剤としてアジ化ナトリウムを
用い、１５０、４００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度に
て調製した。
ｆｏａｍ）１ＸＴＭ、２．０％（ｗ／ｖ）サポニンお
よび０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムからなる可溶
化試薬を調製した。 （ｇ）カリブレーター： シクロスポリンおよび人工のヒト全血マトリックスから
なるシクロスポリンモノクローナル全血カリブレーター
を調製した。カリブレーターは、保存剤としてアジ化ナ
トリウムを用い、０．０、１００、２５０、５００、１
０００および１５００ｎｇ／ｍｌの濃度にて調製した。 （ｈ）コントロール： シクロスポリンおよび人工全血マトリックスからなるシ
クロスポリンモノクローナル全血コントロールを調製し
た。コントロールは、保存剤としてアジ化ナトリウムを
用い、１５０、４００および５００ｎｇ／ｍｌの濃度に
て調製した。
【００２７】シクロスポリン全血ＦＰＩＡアッセイプロ
トコール アボットＴＤｘＲセラピューティックドラッグアナ
ライザーを用い、全血試料中のシクロスポリンを決定す
るための蛍光偏光イムノアッセイを以下のようにして行
った。各１５０μｌのシクロスポリン含有患者全血試料
、コントロールおよびカリブレーターを、ラベルを付し
た遠心管にピペットで入れ、各管に可溶化試薬（５０μ
ｌ）を加えた。ピペットに空気泡を除いた全血沈澱試薬
を満たし、各遠心管の管壁にピペットの先端を接触させ
て各遠心管中に３００μｌを分配した。ついで、遠心管
に蓋をし、回転ミキサーで１０秒間混合し、遠心管が均
等に分布し遠心管のヘッドが平衡を保つように遠心管を
遠心管ヘッド中に置いた。透明な上澄み液および変性タ
ンパク質の固くて密なペレットが得られるまで９，５０
０×ｇで約５分間遠心分離にかけた。遠心分離の完了後
、各管の蓋を取り、ＴＤｘサンプルカートリッジの対応
試料ウエル中に上澄み液をデカントした。
トコール アボットＴＤｘＲセラピューティックドラッグアナ
ライザーを用い、全血試料中のシクロスポリンを決定す
るための蛍光偏光イムノアッセイを以下のようにして行
った。各１５０μｌのシクロスポリン含有患者全血試料
、コントロールおよびカリブレーターを、ラベルを付し
た遠心管にピペットで入れ、各管に可溶化試薬（５０μ
ｌ）を加えた。ピペットに空気泡を除いた全血沈澱試薬
を満たし、各遠心管の管壁にピペットの先端を接触させ
て各遠心管中に３００μｌを分配した。ついで、遠心管
に蓋をし、回転ミキサーで１０秒間混合し、遠心管が均
等に分布し遠心管のヘッドが平衡を保つように遠心管を
遠心管ヘッド中に置いた。透明な上澄み液および変性タ
ンパク質の固くて密なペレットが得られるまで９，５０
０×ｇで約５分間遠心分離にかけた。遠心分離の完了後
、各管の蓋を取り、ＴＤｘサンプルカートリッジの対応
試料ウエル中に上澄み液をデカントした。
【００２８】各カリブレーター、コントロールおよび試
料の蛍光偏光値を決定し、アボットＴＤｘアナライザー
の出力テープにプリントした。非線形回帰分析を用いて
各カリブレーターの偏光（Ｐ）と各カリブレーターの濃
度をプロットすることにより標準曲線を装置中で作成し
た。その際、各コントロールおよび試料の濃度は用意し
てある検量曲線（図１）から読み取り、出力テープにプ
リントした。
料の蛍光偏光値を決定し、アボットＴＤｘアナライザー
の出力テープにプリントした。非線形回帰分析を用いて
各カリブレーターの偏光（Ｐ）と各カリブレーターの濃
度をプロットすることにより標準曲線を装置中で作成し
た。その際、各コントロールおよび試料の濃度は用意し
てある検量曲線（図１）から読み取り、出力テープにプ
リントした。
【００２９】本発明の好ましい蛍光偏光アッセイの感度
は、１５．０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリンである。６０
の臨床試料を用いた現在利用できるラジオイムノアッセ
イと比較したとき、線形最小二乗回帰分析から０．９４
７の傾き、７．１５の切片および０．９６９の相関係数
が得られた。
は、１５．０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリンである。６０
の臨床試料を用いた現在利用できるラジオイムノアッセ
イと比較したとき、線形最小二乗回帰分析から０．９４
７の傾き、７．１５の切片および０．９６９の相関係数
が得られた。
【００３０】本発明による試験キットをＴＤｘアナライ
ザーと組み合わせて用いる場合は、本発明による蛍光偏
光イムノアッセイを行うための試薬はＴＤｘ試薬パック
の別のバイアル中に入れてよく、その際、試薬パック中
の各バイアルの蓋は除き試薬パック内部の所定の壁に置
く。従って、いったん試薬パックをＴＤｘアナライザー
の内部に入れたら、あとのアッセイ手順は完全に自動化
される。
ザーと組み合わせて用いる場合は、本発明による蛍光偏
光イムノアッセイを行うための試薬はＴＤｘ試薬パック
の別のバイアル中に入れてよく、その際、試薬パック中
の各バイアルの蓋は除き試薬パック内部の所定の壁に置
く。従って、いったん試薬パックをＴＤｘアナライザー
の内部に入れたら、あとのアッセイ手順は完全に自動化
される。
【００３１】手動アッセイを行う場合は、試料をまず上
記沈澱試薬で処理し、ついで希釈緩衝液と混合する。つ
いで、試料を入れた試験管に抗体試薬および前処理溶液
を入れ、バックグラウンド蛍光を読み取る。ついで、ト
レーサー化合物および希釈緩衝液を試料に加え、インキ
ュベート後、蛍光偏光を読み取る。
記沈澱試薬で処理し、ついで希釈緩衝液と混合する。つ
いで、試料を入れた試験管に抗体試薬および前処理溶液
を入れ、バックグラウンド蛍光を読み取る。ついで、ト
レーサー化合物および希釈緩衝液を試料に加え、インキ
ュベート後、蛍光偏光を読み取る。
【図１】 本発明の可溶化試薬を用いた蛍光偏光イム
ノアッセイにおいて、全血試料中のシクロスポリンの量
を決定する際に用いる検量曲線である。
ノアッセイにおいて、全血試料中のシクロスポリンの量
を決定する際に用いる検量曲線である。
Claims (10)
- 【請求項１】 非イオン性界面活性剤または両イオン
性界面活性剤を含有することを特徴とする、生物学的試
料の成分から疎水性分析対象物を解離させるための可溶
化試薬。 - 【請求項２】 該非イオン性界面活性剤が非イオン性
ポリグリコール界面活性剤である、請求項１に記載の試
薬。 - 【請求項３】 該両イオン性界面活性剤が、Ｎ−テト
ラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プ
ロパンスルホネート、Ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−デ
シル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
−アンモニオ−１−プロパンスルホネートおよびＮ−ヘ
キサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−
プロパンスルホネートよりなる群から選ばれたものであ
る、請求項１に記載の試薬。 - 【請求項４】 配糖体をさらに含有する請求項１、２
または３に記載の試薬。 - 【請求項５】 水溶液中の界面活性剤を約１．５％（
ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）含有する、請求項１、２
、３または４に記載の試薬。 - 【請求項６】 約２５％（ｗ／ｖ）未満の配糖体を含
有する請求項４に記載の試薬。 - 【請求項７】 請求項１、２または３に記載の可溶化
試薬を使用することを特徴とする、生物学的試料中の疎
水性分析対象物を決定するためのイムノアッセイ法。 - 【請求項８】 該可溶化試薬がさらに配糖体を含有す
るものである、請求項７に記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項９】 該可溶化試薬が、水溶液中の界面活性
剤を約１．５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）含有す
る、請求項７に記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１０】 該可溶化試薬が約２５％（ｗ／ｖ）
未満の配糖体を含有する請求項７、８または９に記載の
イムノアッセイ法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US567840 | 1984-01-03 | ||
| US56784090A | 1990-08-15 | 1990-08-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04233459A true JPH04233459A (ja) | 1992-08-21 |
Family
ID=24268855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3205210A Pending JPH04233459A (ja) | 1990-08-15 | 1991-08-15 | 可溶化試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0471293A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04233459A (ja) |
| AU (1) | AU8246891A (ja) |
| CA (1) | CA2048302A1 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002514308A (ja) * | 1997-06-11 | 2002-05-14 | ネルコ ケミカル カンパニー | 半導体蛍光光度計およびその使用方法 |
| JP2008538001A (ja) * | 2005-03-24 | 2008-10-02 | シーメンス メディカル ソリューションズ ダイアグノスティクス | 全血中の疎水性検体のための抽出剤 |
| JP2009511919A (ja) * | 2005-10-13 | 2009-03-19 | アボット・ラボラトリーズ | 水系界面活性剤を用いるタクロリムスの抽出および定量方法 |
| JP2011512318A (ja) * | 2007-08-06 | 2011-04-21 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | 免疫抑制剤の検出方法 |
| WO2022211084A1 (ja) * | 2021-04-01 | 2022-10-06 | 富士レビオ株式会社 | 生物学的サンプルの処理方法 |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4212555A1 (de) * | 1992-04-15 | 1993-10-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| JP3301646B2 (ja) * | 1993-03-19 | 2002-07-15 | シスメックス株式会社 | 幼若細胞測定用試薬 |
| FR2714906B1 (fr) * | 1994-01-12 | 1996-02-02 | Commissariat Energie Atomique | Agents de solubilisation de biomolécules constitués par des zwitterions non détergents et leurs utilisations. |
| US5888752A (en) * | 1995-05-16 | 1999-03-30 | Bayer Corporation | Universal rinse reagent and method for use in hematological analyses of whole blood samples |
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| US20050059583A1 (en) | 2003-09-15 | 2005-03-17 | Allergan, Inc. | Methods of providing therapeutic effects using cyclosporin components |
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