PT85699B

PT85699B - Celula epitelioide de roedor e processo de preparacao de eritropoietina humana

Info

Publication number: PT85699B
Application number: PT85699A
Authority: PT
Original assignee: Integrated Genetics Inc
Priority date: 1986-09-15
Filing date: 1987-09-14
Publication date: 1990-08-31
Also published as: US4954437A; AU7842987A; AU604051B2; DK478287D0; DK478287A; FI873897L; FI873897A7; EP0267678A1; FI873897A0; JPS63185396A; PT85699A

Description

Esta invenção refere-se à utilização de técnicas de DNA recombinante para produzir eritropoietina humana (EPO) .

A (EPO) é uma proteína, produzida normalmente no pulmão do feto e nos rins dos adultos que desempenha uma função na regulação do nível de oxigénio do sangue estimulando a proliferação e diferenciação das células precursoras da célula de sangue vermelho para amadurecer as células de sangue vermelho. A EPO purificada pode ser administrada a doentes humanos para o tratamento de problemas médicos associados com o suprimento da célula de sangue vermelho inadequada,por exemplo, anemia e deficiência renal crónica. A EPO tem sido produzida em células cultivadas transformadas por um vector que contém um cDNA codificando a EPO, por exemplo, como se descreveu em Kirin-Amgen PCT Application WO85/02610.

Descobriu-se que as células epitelioides dos roedores tais como, células C127 do rato, quando transformadas por um vector de DNA recombinante que contém uma sequência de DNA que codifica a EPO, são capazes de produzir EPO de elevada actividade biológica que, de modo semelhante à EPO que ocorre naturalmente, é modificada pós-translacionalmente por adi ção dos hidratos de carbono com ligações N- e 0- que possuem .592

Ref: IG —epo

uma quantidade substancial de ácido siálico o que é importante na vida média in vivo. Estas modificações pós-translacionais são permitidas, presumivelmente, pela presença nas células do mecanismo enzimático necessário.

Verificou-se que a EPO produzida pelas células recombinantes da invenção tem uma composição em hidratos de carbono diferente da EPO urinária, exibindo ainda a EPO recombinan te (rEPO) da invenção elevada actividade biológica.

No vector que transforma as células a sequência de DNA que codifica a EPO está de preferência sob controle trans cricional de um gene de metalotioneina eucariota e o vector inclui ainda, pelo menos, 69% da região de transformação do genoma de virus de papiloma bovino ( descrito em Hawley et al., Patente Americana N9. 4 419 446, aqui incorporada como referência).

A EPO da invenção exibe boa actividade biológica e é produzida com elevado rendimento. Em adição, as células recom binantes da invenção podem ser mantidas em produção num meio sem soro durante um grande período de tempo (pelo menos 32 dias). A utilização dos meios sem soro elimina a contaminação do produto de EPO final a partir de proteínas de sangue sem EPO, e facilita bastante a purificação.

Além disso, a invenção também descreve um método de produção de pelo menos 99% de EPO puro, envolvendo a) a cultura de células epitelioides de roedores contendo EPO recombinante num meio nutriente sem soro para produzir um méio con tendo EPO, b) a clarificação do meio de restos de células para produzir um meio contendo EPO clarificada, c) a sujeição do meio contendo EPO a uma cromatografia de permuta iónica para produzir EPO purificada parcialmente, d) sujeição da EPO purificada parcialmente a uma HPLC de fase inversa num solven te orgânico para produzir EPO pura no solvente orgânico, e e) remoção do solvente orgânico.

Em realizações preJà?idas do método, passo e) é levado a efeito por cromatografia de permuta iónica ou por evapora_ 9 _ .592

Ref: IG—EPO >

ção de solvente ou remoção de solvente por diâlise seguida de filtração de gel.

Noutras formas de realização a seguir ao passo b) o meio contendo EPO clarificada é tratado para inibir a degradação proteolitica da EPO durante o passo (c), por remoção de proteases no meio que contém EPO clarificada por fraccionamento numa coluna de tingimento ou por adição ao meio que contém EPO clarificada, de um inibidor de protease .

Outros aspectos e vantagens da invenção serão apresen tados na descrição seguinte da realização preferida e nas reivindicações.

Descrevem-se primeiro os desenhos.

A Fig. 1 é a sequência nucleótida da região de codificação da EPO humana (tirado de Nature (1985), Vol. 313, pâg. 806) indicando as posições de duas sondas descritas aqui (” EP01 e EPOZ) que foram utilizadas para isolar o gene; as ligações intra - exão no clone genômico são indicadas por se tas .

A Fig. 2 é uma representação em forma de diagrama do gene de EPO em banda EPO3, descrito aqui; a Fig, 2a dâ os locais de restrição confirmados em lamda EPO3; A Fig. 2b ilustra a estratégia sequêncial para as regiões de codificação estratégica sequencial para as regiões de codificação da EPO. Os espaços negros representam regiões de codificação da EPO; as setas a cheio representam regiões sequenciadas pelo método de Maxam-Gilbert e as linhas a tracejado regiões subclonadas em pUClB e sequenciadas pelo método de Sanger. Os locais de restrição são: A = Ava I, Bg = BgXlI; BS = BstE II; K= Kpnl; P=PstI; Pv = Pvu II; X=XbaI.

A Fig. 3 é um conjunto de ilustrações em forma de dia grama dos clones cDNA da EPO descritos aqui e a estratégia sequencial empregada. As setas a tracejado representam regiões sequenciadas pelo método de Sanger e as setas a cheio regiões sequenciadas pelo método de Maxam-Gilbert. Os locais de restrição são: A=AccI; Bg = BgLII ; H= Hinfl; K =KpnI;

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Ref: IG—EPO ¹ p=PstI; X=Xba I.

► )

A Fig. 4 é uma sequência de DNA parcial de clones de EPO 104B e 125, descritos aqui. As $tas representam ligações intrão-exão. Os locais Xbal e Kpnl utilizados na construção de cDNA de EPO de comprimento total estão também representados .

A Fig. 5 é uma representação na forma de diagrama da construção de um clone de cDNA de EPO de comprimento total e a sua inserção em vectores de expressão com base em BPV.

Os locais de restrição são B= BamHI ; BG=BGLII ; K=KPNI; S=SalI; X=XbaI. As setas representam o promotor MT; os espaços a cheio representam DNA sintético; os espaços a tracejado representam cDNA de EPO; os espaços com duplo tracejado representam sequências sem promotor de MT; espaços abertos representam sequências de BPV, as linhas indicam sequências de pBR322; e os espaços a ponteado representam sequências de SV40.

A Fig. 6 é uma representação na forma de diagrama da construção de EPO 782 B/Bgle EPO 1789 B. As regiões de codificação são representadas como espaços, as sequências de intrão como linhas a tracejado. Os locais de restrição são B= BamHI; Bg=Bgl II; K=KpnI.

A Fig. 7 é uma representação esquemática da construção de uma sequência de codificação genônica de EPO apropria da para inserção em vectores de expressão baseados em BPV. Os espaços e os locais de restrição são como na Fig . 5 e Pu = Pvu I.

A Fig 8 é um perfil de absorvância (280 mm) da elutriação de n-propanol a partir de uma coluna Οθ de fase inversa; o gradiente de elutriacção foi 0-40% de n-propanol em 10 Mm de fosfato, PH 6,0.

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Ref: IG--EPO

A Fig. 9 é uma ilustração gráfica da estabilização de EPO a um pH de 5,0 pela pepestatina inibidor de protease.

Isolamento do gene de EPO Humana

Protegeram-se 5X10 placas de uma cultura genómica humana (Lawn et al., 1978, Célula 15: 1157) por técnicas padrão com duas sondas de DNA sintéticas (EPO 1 e EP02, ver Fig. 1) que correspondem a porções da sequência de DNA de EPO publicada (jacobs et al., 1985, Nature, 313: 806). Analisou-se um clone que hibridizou para ambas as sondas (lombada EP03) por projecção de restrição e verificou-se que continha o gene de EPO total num fragmento de EcoRI 20Kb (ver Fig. 2) . Os exões do gene da EPO foram sequenciados e verificou-se serem idênticos à sequência de DNA publicada.

Isolamento de clones de CDNA de EPO Humana

A cultura de cDNA foi construída a partir de mRNA isolado a partir de um feto humano de cerca de 20 semanas de 2Q gestação por insersão de cDNA de extremidade de C no vector pkt 218 de plasmideo com extremidade de G por processos de clonagem padrão. A cultura que consiste em cerca de 140000 clones foi protegida com as sondas de DNA sintético EP01 e EP02. Encontraram-se quatro clones positivos.

₂₅ 0 clone 104B que hibridizou para as sondas EP01 e EP02 e o clone 125 que hibridizou para a sonda EP01 5' foram analisados. apenas, a seguir. Os clones 104B(de comprimento 1330bp) e 125 ( de comprimento 810bp) e a estratégia sequencial estão representadas na Fig. 3. As sequências de DNA par₃₀ ciais destes clones estão representadas na Fig. 4.

A sequência do clone 104B entre os nucleótidos 63 e

724 tem 100% de homologia com a sequência de DNA publicada do cDNA da EPO. Este clone contém assim a sequência de codificação total para os 166 aminoácidos da proteína EPO madura 35 e para 22 aminoácidos da sequência principal. Os primeiros .592

Ref: IG—EPO

nucleôtidos da região de codificação estão perdidos neste clone e são substituídos por 62 nucleôtidos que derivam do intrão entre os exões 1 è 2 do gene da EPO. 0 RNA a partir do qual derivou esta sequência resultou provavelmente de uma ocorrência de união anómala.

A comparação da sequência do clone 125 com a sequêncií. da EPO publicada mostrou que este clone codifica para aminoácidos -22 a +55 da proteína EPO. Na extremidade 5' deste clone estão 72 nucleôtidos do intrão entre os exões 1 e 2 ( apenas 27 nucleôtidos são representados na Fig. 4) e na extremidade 3' estão aproximadamente 460 nucleôtidos do intrão entre os exões 3 e 4 ( apenas se sequenciaram os primeiros 64 nucleôtidos deste intrão). 0 intrão entre os exões 2 e 3 derivou correctamente.

Construção de um clone de cDNA de EPO de comprimento total e a sua inserção em vectores de expressão de mamíferos

Visto que nenhum dos clones de cDNA contém a região de codificação de EPO completa, sintetizaram-se os 13 nucleó tidos do primeiro exão de EPO que codificam para as extremidades amino do peptídeo principal. Devido a esta união anomala no clone 104B, não houve nenhum local de restrição convenientemente apropriado neste clone que pudesse ser utilizado para ligar o DNA sintético que codifica para o primeiro exão. No clone 125, por outro lado, há um local Xbal 5' do segundo exão que podia ser utilizado para uma fusão do DNA sintético segundo exão. Um cDNA de comprimento total podia depois ser construído combinando esta fusão 1-2 do exão no clone 125 com o fragmento 3' do cDNA do clone 104B no local Kpnl comum. Faz-se uma descrição detalhada desta construção a seguir sendo ilustrado nas Figs . 5 e 6. A EPO125 foi digerida com Xbal, deixando uma parte saliente 4bp 5' na extremidade 5' do exão 2. Esta parte saliente de cordão único foi .592

Ref: IG—EPO ►

removida utilizando exonuclease SI para dar extremidades embotadas que partem exactamente no segundo exão de EPO. Para estas extremidades foram ligados os fragmentos de DNA sintéticos seguintes:

BamHI EcoRI -27_ -24

VV173: 5' GATCCGAAT TCATGGGGGTGCACG 3'

VV172: 3' GCTTAAGTACCCCCACGTGC 5'

Estes ligantes contem uma parte saliente BamHI na extremidade 5' para inserção nos vectores de expressão baseados em BPV (ver a seguir) seguida por um local de EcoRI para inserção em vectores SV40, bem como 13 regiões de codificação de nucleótidos do primeiro exão do gene EPO. Com vista a evitar a própria ligação destes ligantes nas partes salientes de BamHI, apenas VV172 foi ligada. Após a adição dos ligantes a EPO 125 foi digerida com Kpnl foi isolado e ligado a BamHI mais Kpnl pUClB cortado para produzir pUCEPO.

Quatro clones simples desta construção foram sequenciados e verificou-se terem a sequência esperada com a fusão correcta do DNA sintético e o segundo exão no local Xbal modificado. 0 fragmento 137bp BamHi-Kpnl de pUCEPO codificando para a porção 5’ de EPO e o fragmento 649bp Kpnl - BglII de EPO 104B codificado para a porção 3' de EPO foram isolados e ligados ao local BglII tratado com fosfatase alcalina de vectores CL28 Bam e CLH3a, respectivamente( ver a seguir). A orientação 5' para 3' da inserção cDNA da EPO entre os vectores foi conferida por topografia de restrição. Os plasmideos resultantes, EPO782 B/Bgl Mt e EPO782 B/Bgl SV foram digeridos com BamHI e Sall e o genoma BPV ( disponível publicamente; ver Howley et al., id) foi inserido como um fragment BamHI-SalI para produzir os plasmideos de expressão EPO782 Mt BPV e EPO782 SV BPV.

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Ref: IG—EPO

Construção de um gene de EPO modificado apropriado para inserção em vectores de expressão de mamíferos

Devido à elevada incidência dos clones cDNA isolados que removeram de forma incompleta o primeiro intrão do gene EPO (ver atrás e também Jacobs et al., id.), construiu-se um clone genómico de EPO modificado a partir do qual o primeiro intrão tinha sido removido por engenharia genética. Isto podia ser levado a efeito convenientemente por combinação da porção 5' do clone cDNA EPO782 B/Bgl com as sequências 3' da gene EPO no local único Kpnl que está localizado no segundo exão do gene . Esta construção está descrita em detalhe a seguir e está ilustrada nas Figuras 6 e 7 · fragmento Xbal-BglII comprido de 1763bp de lombada EPO3 (ver Fig. 2), que contém todos menos o primeiro exão de EPO, foi subclonado em T25B, um vector que contêm locais Xbal e BglII únicos para produzir plasmideos T25xba/Bgl (vêr Fig. 7) ·

T25Xba/Bgl foi digerido com BglII, as partes salientes foram preenchidas ao utilizar o fragmento Klenow de polimerase de DNA, adicionaram-se os liga tes BamHI e o vector foi tornado circular. 0 fragmento 2,3Tb Kpnl de T25Xba/Bque contém a porção 3’ do gene EPO e algumas sequências de metalotio neina foi depois ligado a Kpnl-pUC cortado EPO (ver Fig. 5) para dar EPO1789B . Este plasmídeo contém o gene de EPO desejado a partir do qual se removeu o primeiro intrão. 0 fragmen to de BamHI que contém EPO a partir de EPO1789B foi isolado e ligado ao local de BglII de CLH3 a para produzir o plasmídeo EPO1789BPV. A orientação 5' para 3' do clone de EPO entre o vector foi conferida pela análise de restrição . Neste plasmideo foi inserido o genoma BPV como um fragmento de BamHI-SalI para produzir plasmídeo de expressão EPO1789SVBPV.

Vectores de Expressão e transformação de células epitelioides de mamíferos .592

Ref: IG--EPO

O cDNA de EPO e o clone genómico modificado podem ser inseridos em qualquer vector de expressão de mamíferos apropriado, de preferência os que poâem ser utilizados para transformar as células epitelioides de roedores tais como células C127 de rato. Os vectores de expressão preferidos são os vectores BPV descritos em Wei et al., U.S.SN. 782.686, pedida em 1 de Outubro de 1985 assinada pelo mesmo requerente da pre sente invenção e aqui incorporada por referência, e Hsiung et al., 1984, J .Molec. e App. Ganet, 2:497· Os vectores (Figs.

e 7) incluem um promotor de metalotioneina (MT) a partir do qual os genes inseridos podem ser transcritos e o virus DNA de papilona bovino (BPV) efectuar a transfecção de células de mamíferos. 0 vector CLH3a também inclui sequências de poli adenilação de promotor recente derivados do virus SV40 que podem afectar a expressão a partir de um gene inserido no vec tor. Os plasmideos de expressão ilustrados também incluem uma porção do plasmídeo pML E.Coli, que permite o fechamento entre os sistemas procariotas e eucariotas. Não se necessita de nenhuma selecção para a conservação destes plasmideos em células hospedeiras e podem ser conservados em elevado número de reprodução (aproximadamente 50-100 células/reprodução). OcDNA de EPO e o clone genómico de EPO modificado foram inseridos nestes vectores BPV como se descreveu atrás. As construçães de vector de expressão finais são representadas nas Figs. 5 e 7 . Ê de conveniência que os nomes dos vectores de expressão sejam simplificados para CEM, CES E CEG em relacçãc a EPO782MtBPV, EPO782SVBPV e EPO17895VBPV respectivamente. Estes vectores foram transformados na estirpe MC1061 E.Coli utilizando métodos convencionais e desenvolveram-se em cultura em massa. Os DNAs foram purificados por associação com CsCl antes da transfecção nas células de mamíferos .

Levou-se a efeito em dias separados três a cinco conjuntos de transfecções com os diferentes vectores nas células C127 do rato ( comercialmente apropriada), como se segue:

As células C127 de rato foram conservadas em meio Eagle .592

Ref: IG—EPO

modificado de Dulbecco (DME) suplementadas com 10% de soro de vitela fetal e lOmM de glutamina como se descreveu em Hsiung et al., id. As transfecções de DNA foram levadas a efeito pelo método descrito em Wilger et al., 1977, Cell 11: 233, como modificando por Hsiung et al., id. Dez a vinte microgramas de DNA precipitado de fosfato de cálcio foram incubadas durante 6 a 8 horas a 37SC com 1 X 10 células em meio de cultura fresco. 0 meio foi removido e as células tratadas com 20% de glicerol em 10mM de solução salina tamponada - fos fato (PBS), pH7,O, durante um ou dois minutos à temperatura ambiente, foi lavado duas vezes com PBS e adicionou-se DME fresco. Es células foram depois incubadas a 379C e o meio substituido após 24 horas e de três a quatro em três a quatro dias, a seguir.

EXPRESSÃO DE EPO

Foci, representado BPV as células Cl27 transformadas, foram detectadas 10-14 dias após transfecção. Os sobrenadantes a partir dos pratos que contêm transformantes foram teste dos 17 dias após a transfecção por teste rápido 3H-Thy (Krystal 1983, Exp. Hematol., 11/7,649) e verificou-se que continham EPO. Duas e meia a três semanas após transfecção, foci foram isolados pelo método do anel de clonação e transferidos para frascos T-25. Após as células atingirem aproximadamente 20% de confluência, os sobrenadantes foram testados para produção de EPO por teste rápido 3H-Thy. Um total de 76 linhas de células transformantes de 15 CEM, 35 CES e 26 CEG) transferiram-se para frascos T-75·

Quando as células estiverem confluentes os sobrenadantes são testados para espressão de EPO e as células contadas e congeladas. Para testar a reprodutibilidade e a estabilidade destas linhas de células, 21 linhas de células da mais elevada produção foram descongeladas e novamente protegidas para níveis de expressão de 24 horas numa base de célula. Os cinco principais produtores (transformantes de 3CES e 2 CEG) foram escolhidos e expandidos em garrafas cilíndricas para

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Ref: IG—EPO

testar o crescimento e as propriedades de produção. Fluidos representativos de cultura de 24 horas a partir de linhas de células CES9dog e CEG4d em frascos T-75 contêm 600 μ/ml θ 800 μ/ml de eEPO medidos por teste rápido 3H-thy utilizando EPO urinária humana como um padrão e 490 e 540 μ/ml quando medidos por teste de incorporação de Fe em células de medu la óssea de ratasana, in vitro (Goldwasser et al., 1975, Endocrinology 97: 315) · Estas amostras foram também activas in vivo no teste do rato policitémico como descrito por Cotes et al., 1961 Nature 191:1065.

de EPO humana recombinante

A produção de EPO a partir de células C127 transformadas em meio sem soro foi atingida por expansão das células em soro contendo o meio em garrafas cilíndricas, transferindo as células para partículas de microveiculos em vasos de cultura ratativos e substituindo o meio de crescimento que contém soro por meio de produção sem soro uma vez que as células tenham atingido a densidade de saturação. 0 meio de cultura condicionado foi depois substituído regularmente por meio sem soro fresco e os vasos foram conservados numa produção contínua durante meses sem a adição de qualquer soro· Este método permite uma produção económica de quantidades grandes de meio condicionado sem soro a partir do qual a EPO humana recombinante pode ser prontamente purificada (ver a seguir) .

As células a partir de linhas de células CES9 dog cresceram em garrafas cilíndricas contendo DME + 10% FBS sob condições de cultura padrão. 0 processo para a preparação e ino culação de culturas rotativas de microveiculos é semelhante para todos os tamanhos de vasos variando entre lOOml e 15 litros. Todos os vasos de microveiculos são proporcionados por Bellco Glass Company. Antes de cada utilização os vasos rotativos individuais são lavados de fresco, secos ao ar e a

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₁ seguir possuem um revestimento fino de silicone (sigmacote, Sigma Chemical Co.) aplicado à superfície de vidro interior. Após secagem os vasos são extensamente lavados com água desti lada antes de serem utilizados.

As partículas de microveículos escolhidas para produção de EPO são Cytodex 3 (pharmacia) . A concentração de microveículo final em todos os vasos de suspensão é 5gm/litro de meio de cultura. 0 vaso é cheio com metade do seu volume final com

PBS e adiciona-se a quantidade apropriada de partículas de microveículo. Permite-se que as partículas aumentem de volume durante 3 horas à temperatura ambiente. São depois lavadas duas vezes com PBS por decantação e o volume do vaso reduzido normalmente a metade do seu volume . 0 vaso é tapado sem exactidão preparado para autoclave e depois esterilizado com vapor durante uma hora a 1212C ( duas horas para os vasos de 15 litros) . Após arrefecimento à temperatura ambiente o PBS é removido até 20% do volume final e adiciona-se DMEM ao volume final. A cultura é depois agitada durante 30 minutos a 3720. Após agitação, deixa-se depositar as partículas e 80% do sobrenadante é substituído por meio de crescimento fresco com 10% de FBS. Os vasos estão agora prontos para inoculação.

Como um exemplo, dois frascos rotativos de 15 litros foram semeados com células da linha CES9 dog . Cada vaso foi semeado com células de tripsina fresca a partir de 15 garrafas cilíndricas em 10 litros de meio de crescimento (DMEM + 10% FBS) e 5g/litro de 3 partículas de Cytodex. A concentração inicial das células nos vasos Jòi de 1X10^ células/ml. As culturas foram depois colocadas em agitadores magnéticos (Bellco) e desenvolvidas a 372C. Os vasos de 10 litros foram agitados a 20 rpm. As culturas foram experimentadas diariamente e ao segundo dia, 80% do meio de crescimento foi substituído por meio fresco. Neste momento iniciou-se o arejameno do revestimento por lavagem do espaço superior com uma mistura de 95% de ar/5% C0₂. No quarto dia o meio de crescimento foi novamente substituído. No sexto dia o número de células

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estava entre 1,75 a 2,5 X 10 células/ml. As células foram enumeradas por contagem nucleí (Levine et al., Somatic Call Ernetics (1977) 149).

Neste momento, as culturas rotativas foram transferidas para a fase de produção: 0 meio de crescimento foi mudado duas vezes (80% de troca de volume de cada vez) com DMEM sem soro e após a segunda lavagem, substituiu-se ó meio por CEM 2000 sem soro (Scott Labs). As culturas foram verificadas todos os dias para a produção de EPO. De 48 em 48 horas 80% do meio condicionado foi recolhidoe substituído por igual volume de CEM 2000 fresco ( oito litros por vaso). 0 meio a partir de ambos os vasos foi reunido em cada dia de colecção e submetido a purificação. 0 meio sem soro represen tativo, colhido a partir de culturas rotativas de 10 litros (descrito atrás) continha EPO humana para uma concentração de aproximadamente 600U/ml como se verificou pelo teste de . . · incorporação H-Thy e pelo radio-imuno-teste de EPO utilizan do EPO urinário humana como padrão.

Como um outro exemplo, seis frascos rotativos de um litro foram semeados com células CES9dog em DMEM + 10% FBS. Após as células terem atingido a densidade de saturação os vasos foram postos em produção por substituição de 80% do meio de crescimento com meio de produção sem soro como se descreveu atrás. Os meios a partir dos vasos em duplicado foram colhidos todas as 48, 72 ou 96 horas respectivamente. A produção de EPO média nestes vasos rotativos de 1 litro foi de 576, 698 e 842 unidades por 24 horas como se mediu por RIA para dados colhidos em 48, 72 e 96 horas, respectivamente . Ao fim de 32 dias as células estavam ainda a produzir EPO nos mesmos níveis .

Purificação de EPO recombinante

A EPO humana recombinante pede ser prontamente purificada a partir do meio sem soro condicionado por células de ma58 .592

Ref: IG—EPO

8Ϊ míferos que produzem rEPO. A purificação para a homogeneidade envolce geralmente os passos: (1) clarificação, concentração e diálise do meio de cultura; (2) cromotografia de permuta iónica; (3) cromotografia líquida de realização elevada de fase inversa (RP-HPLC); e (4) filtração de gel ou cromotografia de permuta iónica. Os passos 1 e 2 removerão do meio de cultura proteases e alguns componentes de soro permanecem no meio de produção ( especialmente em colheitas pequenas após agitação das culturas de soro que contêm desenvolvimento no meio de produção sem soro); os passos 2 e 3 produzem uma purificação maior e o passo 4 é designado para remover o solvente orgânico utilizado no passo 3 e para elutriar a EPO purificada no tampão de formulação final. Estes passos são descritos com mais detalhe a seguir. Todos os processos de purificação são levados a efeito a 42 c com a excepção do passo de RP-HPLC, que é levado a efeito à temperatura ambiente .

Como num exemplo, puro, rEPO foi preparada a partir de 11,75 litros de meio de produção sem soro colhido a partir de culturas rotativas de 10 litros descritos atrás. Os níveis de EPO foram medidos através de processo de purifica. . 3 ção utilizando o teste de incorporação H-thy e um RIA de EPO. Todas as curvas de resposta a doses para diferentes etapas de purificação foram paralelas umas em relação às outras e ao padrão urinário humano.

1) Clarificação, concentração e diálise do meio de cultura

11,75 litros dos meios sem soro condicionados de CES9dog, colhidos a partir de frascos rotativos de 10 litros e que contêm aproximadamente 700 unidades de EPO por ml foram preparados em Tween 80,0,01% e depois clarificados de restos de células e microveículos por passagem através de um cartuTM cho de filtro Pall Profile 0,5cm para uma velocidade de

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₁ fluxo de 2,5 litros/ minuto. A pressão do cartucho não excedeu 20psi. Os meios clarificados foram depois concentrados 10 vezes e o fluxo submetido a diâlise em 50 mM de acetato de sódio, pH 5,0 contendo 15mM de Nacl e 0,01% Tween 80 para ₅ uma condutividade final de 6,90 mS/cm . Isto foi acompanhado com um sistema de fluxo tangencial= foi utilizado um cartuchc S10Y10 de ultracentrifugação Especial Amicon possuindo uma membrana YM de grau de admissão 10000 MW para uma velocidade de fluxo de retenção de 1,5-2 litros/minuto, uma velocidade ₁₀ de fluxo de afloramento de 0,4-0,8 litros/ minuto e uma pressão de fundo mantida em 25-30 psi. 0 volume da concentração final foi 970 ml, o seu pH 5,0 e a sua condutividade 6,90 mS/ cm . A recuperação de EPO por intermédio destes passos é maior do que 90% 15

2) Cromotografia de permuta iónica

Uma protecção de resinas permutadoras de iões demonstrou que as resinas de força iónica elevada são as mais apro priadas para a purificação de EPO. Neste exemplo particular utilizou-se uma coluna de fluxo rápido S-Sepharose de Pharmacia. Equilibrou-se uma coluna de 2,5 cm x 12,5 cm (60 ml) a 42 C com 50 mM de acetato de sódio, pH 5,0, que contem 15 mM de Nacl e que possui uma condutividade de 6,90 ms/Cm . Orientou-se a absorvência do efluente da coluna para 280 mm com um detector in-line (LKB). A coluna foi carregada com 960 ml dos meios concentrados para uma velocidade de fluxo de 5ml/minuto (61,6 cm/hora) e foi lavada com um tampão de equilíbrio até que a absorvência regressasse à linha de base (aproximadamente 2 volumes de coluna) . Elutriou-se a coluna com 300 ml de um gradiente linear de sal de 0,015M a 0,4M Nacl em 50 mM Na acetato, pH 5,0. Recolheram-se fracções (6 ml) em tubos que contêm 0,15 ml de Tris-Hcl 2M, pH 8,8. Isto ajustou o pH do efluente para aproximadamente 8,0 e conduziu a uma concentração final TRIS de 0,05 M. Finalmente _ i ς 58 .592

Ref: IG—EPO

a coluna foi lavada com 0,05 M TRIS-HC1, pH 9,0, contendo Nacl 2M. Reuniram-se as fracções que contêm EPO.

A coluna de fluxo Rápido S-Sepharose conduziu a uma purificação 7 vezes maior e a uma recuperação de cerca de ₅ 60%. As perdas neste passo são devidas a proteases presentes no meio condicionado que são activas para pH 5,0 ( que é o pH óptimo para a purificação de EPO com esta resina). (Como se descreveu a seguir, as perdas neste passo podem ser minimizadas pela utilização de corantes imobilizados ou inibido10 res de protease).

3) Preparação de HPLC de Fase Inversa

HPLC foi levado a efeito com um sistema de cromotografia líquida de elevada pressão líquida de águas que consis te num sistema de libertação de solvente de modelo 6000A e num programador de solvente de modelo 660. Equilibrou-se à temperatura ambiente a coluna 0θ de 2,2 cm x 25 cm ( tamanho de partículas 10 um Amicon, tamanho de poros 100A) com lOmM de Nap04, tampão de pH 6,0. (Uma coluna de comprimento de átomos de carbono diferente, por exemplo, Cq.-C/gr pode tambén. ser utilizada, mas é menos preferida). A amostra reunida de S— Sepharose foi pré-filtrada através de um filtro AcrodisK Gelman de 0,45 um e carregada para uma coluna por injecções repetidas utilizando um circulo de amostra de 2ml. A coluna foi posta a funcionar para 6 ml/minuto (71,0 cm/¹¹) ® ^a absorvência do efluente foi orientada para 280 nm. Depois dc· carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 10 mM de NapO^, pH 6,0 até que a absorvência regresse à linha de base A coluna foi elutriada com um gradiente linear de n-propanol 0% a 40% de 2,5 horas ( em 10 mM NaPO^, pH6) . Recolheram-se fracções (6ml) de um minuto. Elutriaram-se vários picos pequenos absorvendo para 280 nm entre 60 mi iutos e 95 minutos do gradiente e um pico único acentuado entre 100 minutos e 110 miautos (Fig. 8) . Os picos de elutriação foram analisa_ 1A .592

Ref: IG—EPO

dos por SDS PAGB . As fracções que continham EPO coincidiram com o pico largo entre 100 minutos e 107 minutos ( aproximadamente 25% de propanol). A leitura do densitómetro laser do gel SDS manchado de Coomassie indicou que a EPO foi maior do que 99% pura, neste passo. Neste exemplo o passo Οθ conduziu a uma purificação duas vezes maior.

A recuperação da actividade imunológica e biológica in vitro neste passo, foi elevada (83%), indicando que o n-propanol não possuía nenhuns efeitos contrários na actividade bilógica in vitro.

4) Cromotografia por filtração com gel )

Para assegurar a completa remoção do solvente orgânico e para elutriar a EPO purificada num tampão compatível fisio logicamente, o material purificado 0θ pode ser ainda fraccio nado por cromatografia de filtracção de gel. Se a resina de filtração de gel não é compatível com concentrações elevadas de solventes orgânicos, o passo de diálise de fluxo pode ser utilizado antes da filtração de gel com vista a remover a maior parte do solvente orgânico. Se a matriz de resina da última coluna é resistente ao solvente orgânico utilizado, as fracções reunidas a partir do passo RP-HPLC podem ser passadas directamente sobre esta coluna sob condições onde a proteína se liga à resina e o solvente orgânico flui. 0 solvente orgânico pode depois ser lavado extensivamente com um tampão aquoso e a proteína pode ser finalmente elutriada a partir da coluna.

A fracção de elutriação a partir da coluna Cg foi preparada contendo 1% do manitol e Nacl 0,5M pela adição de material sólido e depois introduzida numa célula de agitação Amicon possuindo uma mambrana de ultracentrifugação YM 10 (grau de admissão de 10000 M.W ) . 0 volume foi reduzido apro ximadamente 10 vezes e depois reconstituído para o volume

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Ref: IG—EPO original com 15 mM de NaPO^, pH 7,2 contendo Nacl 0,5 M e 1% de material. 0 processo foi repetido duas vezes e a fracção submetida a diálise foi concentrada até um volume final de

17,5 ml. A análise deste processo para a proteína total utilizando o método de Lowry mostrou uma recuperação meior que

98%. Catorze ml do material submetido a diálise foram depois fraccionados por cromatografia de filtração de gel.

Uma coluna de 2,5 cm x 98 cm (481 ml) de resina de filtração Cellufine GC 200 (Amicon) foi equilibrada a 42C con 15mM de NaPO^, tampão de pH 7,2 contendo Nacl 0,5M e 1% de manitol para uma velocidade de fluxo de 0,8 ml/minuto (9,8 cn/hora) . A amostra de 14 ml foi carregada, o efluente da coluna foi orientado para 280 nm e recolheram-se fracções de 6 ml. Elutriou-se um pico simétrico único e SDS PAGE confirmou ser o pico referente à EPO. Não se conseguiu maior puri ficação para EPO neste passo e a recuperação foi 89%.

A EPO produzida pelo método de purificação anterior foi superior a 99% pura como se verificou por SDS-PAGE e possuía elevada potência nos testes biológicos in vitro e in vivo . 0 rendimento total de EPO neste exemplo foi de 41%.

A adição de uma coluna de corante ao passo 1 conduz a uma purificação adicional e, mais importante ainda, remove as proteases de contaminação a partir de EPO e consequentemente permite recuperações maiores de EPO no passo de Fluxo Rápido de S-Sephorose. Os meios clarificados foram carregados numa coluna de Tris-acril-M azul ( Pharmacia) equilibra30 dos com 10 mM de NaPO^ de pH 6,0, 150 mM de Nacl e elutriados com um gradiente linear de sal entre 0,15 a 2,5 M Nacl em 10 mM de NaP0₄ de pH 6,0 e depois submetidos a diálise em 50 mM de acetato de Na, pH 5,0 contendo 15 mM de Nacl. A recuperação de EPO a partir da coluna de TRIS-acril Azul foi quase completa e a recuperação na coluna de Fluxo Rápido de S-Sepharose foi de 86% comparada com 60% no exemplo 1. A EPO que contém um meio conce ítrado 10 vezes ou um material de passo 2 parcialmente purificado mostrou degradar-se rapida- 18 .592

Ref: IG—EPO

mente (t 1/2 aproximadamente 4 h) quando incubada a 3720 sob condições ácidas suaves a um pH de 5,0. Esta degradação parece ser provocada por proteases que são activas para pH 5,0. Os rendimentos melhorados no passo 2 como se ilustra neste exemplo podem ser atribuídos à separação de proteases a partir da proteína EPO pela coluna de TRlO-acril Azul. (Podem-se utilizar também outros corantes comercialmente válidos).

Os inibidores de protease podem também ser adicionados ao meio condicionado com vista a melhorar os rendimentos de EPO. Testaram-se vários inibidores de protease comercialmente válidos para se verificar se podiam evitar a degradação da EPO para pH 5,0. Diluiu-se o meio de EPO (passo 1) 10 vezes concentrado (passo 1) 1:10 em 50 mM de Acetato de sódio, pH 5,0 e depois incubou-se a 372C com ou sem inibidores de protease para uma concentração de 5 micro gr amas/ml. As fracções foram tomadas durante um periodo de 29 horas, e testadas por RIA. Esta experiência mostrou que a pepestatina (sigma) tinha um significado de efeito estabilizante na imunoactividade da EPO durante este período de tempo, para pH 5,0. A pepest ati na foi depois testada para determinar a concentração mínima à qual é eficaz. Sob as mesmas condições, como se descreveu atrás, incluiu-se a pepestatina num meio concentrado 10 χ para uma grama de 0,0005 a lpg/ml e foi incubada a 3720 durante 25 horas. A IC 50 ( a concentração à qual 50% das proteases são inibidas) de pepestatina é aproximadamente 0,02 pg/ml (Fig. 9) . Para testar o efeito da pepestatina no processo de purificação, adicionou-se 0,2 pg/ml de pepestatina ao meio concentrado 10 χ e aos tampões para a coluna de S-Sepharose· Sob estas condições recuperou-se 97% de EPO a partir da colu na de Fluxo Rápido de S-Sepharose comparando aproximadamente com 60% sem a utilização do inibidor de protease .

passo da cromatografia de filtração de gel (passo 4, anterior) pode ser substituído pelo passo de permuta iónica de Fluxo Rápido de S-Sepharose para remover solventes orgânicos . Reuniram-se as fracções que contem EPO elutriada a .592

Ref: IG—EPO

► partir da coluna Cg para aproximadamente 2T% de propanol, o pH baixou para 5,0 por diluição com nove volumes de tampão de Acetato de Na 0,05M, pH 5,0 e depois aplicou-se uma coluna de Fluxo Rápido de S-Sepharose equilibrada em 50 mM de Acetato de sódio de pH 5,0 contendo 15mM de Nacl. A coluna Foi lavada com vários volumes deste tampão e a EPO Foi depoi; elutriada com PBS de pH 8,0. A recuperação de EPO neste passo Foi quantitativa e veriFicou-se que o produto Final não possuía propanol Ksidual,

Caracterização da rEPO purificada

A rEPO purificada a partir do meio condicionado por células CES9dog como se descreveu atrás foi parcialmente caracterizada e comparada com a EPO urinária humana. A análise da rEPO por SDS-PAGE seguida por mancha de prata e coomassie azul mostrou que a rEPO purificada por este método foi maior do que 99% pura. Migra com um peso molecular aparente de aproximadamente 34K em SDS-PAGE como uma banda de proteína única.

A sequência de aminoácido da rEPO purificada foi determinada pela sequência N-terminal e digestão enzimática da rEPO, separação dos peptídeos criados por HPLC de fase inver sa e sequenciação destes peptídeos utilizados e sequenciados de fase gasosa. Mais do que 95% de molécula de EPO foi sequênciada.

Foram feitas as seguintes observações: a sequência de aminoácido de rEPO produzida por células C127 transformadas de BPV não se distingue da EPO urinária humana. Em particular, a análise da sequência amino-terminal indicou que o peptídeo hidrofóbico principal está clivado, na posição correc ta. Não se observou nenhum sinal para qualquer amino-ácido PTH ( Fenil-tio-hidantoinas) nas posições 24,38 e 83 do peptídeo EPO. Estas posições correspondem a Asn na sequência de EPO, representando os locais possíveis para a adição de hidratos de carbono ligados na posição N(Asn-X-Ser ou Thr,

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)

Neuberger et al., 1972: As Glicoproteinas: a sua composição, estrutura e função, p. 450). Estes dados e os resultados da análise de hidratos de carbono da EPO sugerem que na rEPO produzida em células C127 todos os três locais possíveis de N-glicosilação estão na verdade glicosilados. A posição 126 do aminoâcido corresponde a uma serina na sequência do ácido nucleico. Não se viu nenhum sinal para qualquer aminoâcido PTH, nesta posição. A análise de hidratos de carbono de um peptídeo que contém este resíduo indicou a presença de galar tose indicando que o Ser 126 é glicosilada na posição 0. A análise de hidratos de carbono de rEPO revelou a presença de açucares neutros e amino e de quantidades substanciais de ga loctose e ácido siálico. A composição de hidratos de carbono da EPO da invenção difere da composição de hidratos de carbo no publicada da EPO urinária humana, (não se analisou independentemente a EPO urinária e portanto não se pode ter a certeza da exactidão dos resultados publicados). Verificouse que a rEPO da invenção possuía elevada actividade biológica nos testes in vitro e in vivo.

Utilização terapêutica ►

A EPO humana pode ser liofilizada e reconstituída em água esterilizada antes da utilização. A EPO em solução salina pode ser administrada numa base regular ( por exemplo) semanalmente) para doentes humanos sofredores de anemia ou deficiência renal. A administração é feita pelos métodos de administração utilizados para outras proteínas que afectam o sangue, por exemplo, activador de plasminogéneo de tecido. A administração é de preferência por injecção de pílula ou por infusão intravenosa.

Para a subsistência durante muito tempo de um doente humano, por exemplo 10-100 pg de EPO liofilizada dissolve-se em água esterilizada e coloca-se num reservatório de seringa que é utilizado para injectar uma pílula de EPO num _ 9Ί _ .592

Ref: IG—EPO

doente, intravenenosamente ; o tratamento é levado a efeito três vezes por semana.

Utilização de diagnóstico

Os anticorpos, tanto policlonal como monoclonal podem ser criados para a EPO e utilizados em métodos de imuno-ensaios convencionais para quantificar a EPO em fluidos biológicos, por exemplo, soro ou urina, de doentes que se suspeita terem deficiência em EPO.

Depósitos >

As células de E . Coli que contêm o plasmídeo CES foram depositadas em 12 de Setembro de 1986 na Agricultural Research Culture Collection e tomaram o ns . de acesso NRRL de B-18113.

requerente, Integrated Genetics, Inc., concorda que a cultura designada possuindo o número de acesso ATCC B-18113 seja mantida através da vida efectiva de uma patente concedida, dura te 30 anos a partir da data de depósito ou durante 5 anos após o último pedido para o depósito após a publicaçãc da patente, qualquer que seja a duração e garante o reabastecimento da cultura que possui o número de Acesso ATCC B-18113 no depositário no caso de um depósito se tornar inviável durante a vida efectiva de uma patente concedida, durante 30 anos a partir da data do depósito ou durante 5 anos após o último pedido para o depósito após a publicação de uma patente qualquer que seja a duração.

Outras formas de realização estão entre as reivindicações a seguir. Por exemplo, embora se prefira a utilização de todo o genoma BPV, pode também utilizar-se 69% da região de transformação. Porém, quando apenas se utiliza 69% da região poderão ser indesejáveis as interacções entre o plasmídeo a o cromossoma da célula hospedeira, isto é, grande parte

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Ref: IG—EPO >

do plasmídeo DNA pode incorporar-se no cromossoma em vez de permanecer epissonal, de forma que o plasmídeo é mais difícil ser reconstituído a partir das células Além disso se se utilizar menos do que a quantidade total do genoma BPV, a região pBR que é frequentemente ligada ao BPV ( Visto que BPV é normalmente fornecido como parte de um plasmídeo derivado de pBR 322) pode ser removida antes da transfecção, porque a região pBR, num fragmento de BPV inferior ao total pode também possuir um efeito inibitório na transfecção. Isto não ocorre quando se utiliza o DNA de BPV de comprimento total.

Novos arranjos indesejáveis podem também ocorrer quando se utiliza apenas 69% da região.

Ê preferível que o promotor de metalotioneina eucariota seja de mamífero, de preferência ainda, de origem da murina, mas qualquer promotor de metalotioneina pode ser utilizado. (cada espécie de mamífero que produz uma metalotioneinc faz aparentemente isso utilizando um gene estruturalmente diferente) .

Para construir um vector dentro do âmbito da invenção excepto CES, o DNA de linha de célula pode ser utilizado comc a fonte do promotor MT e gene estrutural, do gene de EPO e dc genoma BPV, podendo esses elementos genéticos ser inseridos, utilizando técnicas de DNA recombinante convencionais, num vector desejado.

Pode-se utilizar quaisquer células apropriadas. Podem ser utilizadas, por exemplo, outras linhas de células de fibroblasto de roedores que podem ser infectadas por BPV; por exemplo, pode-se utilizar células NIH 3T3 (ATCC CCL92).

depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América em 15 de Setembro de 1986 sob o n2 . 907 .369

Claims

lê. - Célula epitelioide de roedor transformada por um vector de DNA recombinante caracterizada por compreender uma sequência de DNA codificando a eritropoietina humana, sendo a referida célula transformada capaz de produzir eritropoietina humana glicosilada com ligação-N ou-0.
2â . - célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência de DNA codificando a eritropoietina humana estar sob controle transcricional de um promotor para um gene de metalotioneina eucariótico.
3ê . - Célula de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o vector compreender ainda, pelo menos, 69% da região de transformação do genoma do virus de papiloma bovino .
4ê . - Célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser uma célula c 127 de rato.
5ê . - Processo para a preparação de eritropoietina humana caracterizada por se utilizar uma célula de acordo com as reivindicações 1 ou 3.
6ê . - Processo para a preparação de eritropoietina de acordo com a reivindicação 1 ou 5 caracterizado por se preparar uma eritropoietina com uma composição de hidrato de carbono diferente a partir de EPO urinária.
7a . - Processo para a preparação de pelo menos 99% de EPO pura caracterizado por:

a) se cultivar células epitelioides de roedores contendo EPO recombinante em meio nutriente livre de soro para produzir um meio contendo EPO.

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Ref: IG—EPO

b) clarificar o meio de restos de células para produzir um meio contendo EPO clarificado,

c) submeter o meio contendo EPO a uma cromatografia de permuta iônica para produzir EPO purificada parcialmente _r

d) submeter a EPO purificada parcialmente a uma HPLC de fase inversa num solvente orgânico para produzir EPO pura no solvente orgânico,

e) remover o solvente orgânico.
8a. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o passo (e) ser levado a efeito por cromatografia de permuta iônica.
9a. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o passo (e) ser levado a efeito por evaporação do solvente ou remoção por diálise, seguida de filtração de gel.
10a . - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a seguir ao passo (b) o meio que contém EPO clarificada ser tratado para inibir a degradação proteolítica da EPO durante o passo (c).

lia . - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o tratamento para inibir a clivagem proteolítica compreender a remoção de proteases no meio que contém EPO clarificado por fraccionamento numa coluna.
12a . - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o tratamento para inibir a clivagem proteolitica compreender a adição ao meio que contém EPO clarificada de um inibidor de protease .
13a. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a HPLC de fase inversa do passo (d) ser levado a efeito utilizando uma coluna C8.