JPH0229313B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0229313B2 JPH0229313B2 JP59122740A JP12274084A JPH0229313B2 JP H0229313 B2 JPH0229313 B2 JP H0229313B2 JP 59122740 A JP59122740 A JP 59122740A JP 12274084 A JP12274084 A JP 12274084A JP H0229313 B2 JPH0229313 B2 JP H0229313B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seaweed
- protoplasts
- hydrolase
- fusion
- transformation method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は海苔の細胞融合による形質転換方法、
更に詳しくは、アマノリ属に属する２種の海苔の
プロトプラストを細胞融合して、いわゆるハイブ
リド細胞を形成することにより、優れた所望の形
質を保有する海苔を得るための形質転換方法に関
する。 従来の技術 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細
胞間の融合、いわゆる細胞融合についての研究が
非常に盛んとなり、陸上植物においては既に実用
化の段階にまで成功したものもみられるに至つて
いる。 しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関し
ての細胞融合の研究報告は少なく、その成功例に
ついても未だみられていない。 因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物
では市販の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチ
ーム等）を用いて容易にそれらのプロトプラスト
を調製し得るけれども、アマノリ類をプロトプラ
スト化できる酵素が現在のところ入手し得ないた
め、アマノリ類の細胞融合の技術が陸上植物に比
べて遅れている一因と考えられる。 而して、アマノリ類をプロトプラスト化するた
めの試みとしては今までのところ、藤田等による
「酵素処理によるノリ、アオノリ類のプロトプラ
ストの分離とその発生」についての報告（日本水
産学会、昭和57年秋季講演要旨集、第32頁、211）
がみられるのみである。この藤田等による方法
は、海苔葉体を物理的手段で細断して得られる葉
片にシユードモナス属（Pseudomonas）SPの菌
株（Ｐ−１株）の培養液から得た粗酵素液を約４
時間程度作用させてプロトプラストを調製するも
のであるが、この方法ではプロトプラストを得る
ための酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を物
理的に切断したものに酵素を作用させるので得ら
れるプロトプラストが不健全になる可能性が高
く、したがつてこのプロトプラストを用いての細
胞融合に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞
融合の手法においてはそれに用いるプロトプラス
トの健全度が非常に主要な要因であつて、プロト
プラストが不健全であると細胞融合に当つての融
合率が低くなつて以後の培養による成育も劣るよ
うになると考えられるからである。 また、上記方法で海苔葉体を切断するには、シ
ユードモナスSP菌株が生産する酵素が海苔の表
層部分には作用せずに切断部分から作用して海苔
の細胞壁を崩壊してプロトプラストとなるとの認
識に基づいているものと考えられる。 Preston等の報告によると、海苔は表層にマン
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミ
クロフイブリル形態のキシランから構成されてお
り、細胞充間物質としてポルフイランが存在して
いるとされる。また、L.A.Hanic等によると、海
苔の表層には蛋白質から成る薄い被覆が存在して
いるとされる。すなわち、このような海苔の組織
上の観点から、海苔は切断しなければプロトプラ
スト化できないと考えられていたものと思われ
る。 本発明者は、細胞融合に適した海苔の健全なプ
ロトプラストを得るには、海苔を物理的に切断す
ることなくその表層から崩壊させることが必要で
あるとの見地から海苔のプロトプラスト化につい
て検討した結果、海苔を少なくともマンナン加水
分解酵素およびキシラン加水分解酵素を含有する
酵素液で処理するか、更にはポルフイラン加水分
解酵素も含有する酵素液で処理することにより、
海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得る
ことの知見を得て、海苔のプロトプラスト化の技
術を開発した。［特開昭60−41485号（特願昭58−
149378号）］ 発明が解決しようとする問題点 本発明者は、上述した海苔のプロトプラスト化
の成功に伴なつて、アマノリ属に属する２種の海
苔のプロトプラストを調製し、細胞融合の手法を
適用して細胞質融合体を作成することにより、上
記２種の海苔がそれぞれ保有する優良な形質を兼
ね具えた海苔が得られることの知見を得て、本発
明をなすに至つた。 すなわち、本発明の目的は、アマノリ属に属す
る２種の海苔のプロトプラストを細胞融合させて
細胞質融合体を作成することにより、優良な所望
の形質を保有する海苔を得るための形質転換方法
を提供することにある。 以下本発明を詳しく説明する。 発明の構成 本発明は、アマノリ属に属する２種の海苔のプ
ロトプラストを調製し、それらのプロトプラスト
を細胞融合して細胞質融合体を作成し、得られた
細胞質融合体を育成する海苔の細胞融合による形
質転換方法において、該海苔のプロトプラストの
調製を、海苔葉体をマンナン加水分解酵素、キシ
ラン加水分解酵素及びプロテアーゼで処理するこ
とにより行うことを特徴とする形質転換方法に関
するものである。 現在、養殖に用いられている海苔の品種は多種
類であるが、それらの中で主に用いられているの
はスサビノリとアサクサノリである。就中、スサ
ビノリは我国で最も広く養殖されていて、繁殖力
が強く、色彩および光沢などの外観も優れている
が、その反面食味上の香気が乏しく、かつ海水中
の栄養分濃度の減少に伴ない組織が粗剛になる欠
点がある。一方アサクサノリは富栄養漁場では葉
体が柔かく香気も豊かで美味であるけれども、貧
栄養の漁場では、いわゆる色落ちが激しく品質が
低下する欠点を有する。 また、野性株であるマルバアマノリはその形態
が小型でマル葉型であり、かつ生長率が悪いため
養殖には適さないが、貧栄養漁場でも比較的色落
ちが少ないという耐性を有する。 したがつて、本発明では主として上記スサビノ
リ、アサクサノリ、マルバアマノリの３種のうち
の２種の海苔のプロトプラストをそれぞれ組合わ
せて細胞融合させることにより、それらの各海苔
が本来保有する優れた形質を兼ね具えた新しい品
種の海苔を育成するものである。 本発明では、まず、上記各海苔のプロトプラス
トを調製するが、その調製は、海苔葉体をマンナ
ン加水分解酵素、キシラン加水分解酵素及びプロ
テアーゼで処理することにより行う。マンナン加
水分解酵素及びキシラン加水分解酵素としては、
例えば、シユードモナス属（Pseudomonas）に
属する難消化性多糖類（マンナン、キシランおよ
びポルフイラン）の加水分解能を有する微生物
（シユードモナス（Pseudomonas）sp.PT―５、
微工研条寄第330号）を、海苔もしくは海苔由来
の多糖類（海苔を熱水抽出して可溶性成分を除去
して得られる、主としてマンナンもしくはキシラ
ンのような多糖類から成る残渣又は該残渣を更に
精製処理して多糖類含量を高めたもの）を誘導物
質として含む培地中で培養して得られる培養液を
遠心分離し、その上澄液を酵素液を用いてもよ
い。上記酵素液にはマンナン加水分解酵素とキシ
ラン加水分解酵素が含まれているので該酵素液を
海苔葉体に作用させるとマンナン加水分解酵素が
海苔の表面に存在する顆粒状のマンナンに作用し
て葉体に大きく切断部を形成し、それにより、キ
シラン加水分解酵素により細胞壁を形成している
ミクロフイブリル形態のキシランが作用され易く
なつて、葉体の細胞壁が分解除去されてプロトプ
ラスト化されるようになる。また、上記酵素液に
はポルフイラン分解酵素も含まれているので、海
苔葉体の細胞充間物質としてのポルフイランにも
作用して分解するのでプロトプラスト化が一層促
進される。 なお、上記プロトプラスト化に際して、海苔葉
体を予めパパインのようなプロテアーゼで処理す
るか、又は上記酵素液と並行的にプロテアーゼを
作用させることが必要である。 本発明においては、上述のようにしてスサビノ
リ、アサクサノリおよびマルバアマノリのプロト
プラスト化を行なつて得られる各プロトプラスト
の２種についてそれぞれ細胞融合を行なう。 細胞融合は公知の手法を適用して行なうとよ
く、上記２種のプロトプラストを混合して形成さ
せた沈澱にポリエチレングリコール溶液とHigh
−PH−Ca溶液を加えて放置した後、これに培養
液（人工海水Asp.12）を加えて培養を行なつて
細胞質融合体を作成する。なお、培養は15度の温
度で6000Luxの照度で明期９時間、暗期15時間の
条件下で行なうとよい。 上述のようにして得られた細胞質融合体の識別
は、スサビノリとアサクサノリとのプロトプラス
トの細胞融合、並びにスサビノリとマルバアマノ
リとのプロトプラストの細胞融合では各細胞の色
が下記のように異なるので識別可能であるが、ア
サクサノリとマルバアマノリとのプロトプラスト
の細胞融合では細胞の色が同色であるので次に述
べるように予めプロトプラストを染色することに
より識別を行なう。 各海苔の細胞の色： スサビノリ（スサビグリーン） 緑色 アサクサノリ 茶色 マルバアマノリ 茶色 染色による識別： アサクサノリとマルバアマノリの各プロトプラ
ストの一方を予め下記組成のニユートラルレツド
で染色したものを細胞融合に用いる。 ニユートラルレツド 10mg 人工海水（Asp12） 100ml 上記組成の溶液にマンニトールを0.75Mになる
ように添加し溶解して調製する。 上記細胞質融合体の識別は顕微鏡下で行ない、
パスツールピペツトのような毛細管を用いて融合
体を選択して吸い取り、前述した条件下で培養を
行ない、得られた成葉について形質の判定を行な
う。 核融合の確認は、上述のごとくして得られた成
葉の一部をDAPI染色し、螢光顕微鏡下で観察し
て行なう。 発明の効果 次に、本発明に従つて細胞融合して得られた細
胞質融合体を識別したものを培養して得られた成
葉についてそれぞれの形質を判定した結果を表１
乃至表３に示す。なお、細胞融合に用いた各品種
の海苔が本来保有する形質も併せて表１乃至表３
にそれぞれ示した。
更に詳しくは、アマノリ属に属する２種の海苔の
プロトプラストを細胞融合して、いわゆるハイブ
リド細胞を形成することにより、優れた所望の形
質を保有する海苔を得るための形質転換方法に関
する。 従来の技術 近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細
胞間の融合、いわゆる細胞融合についての研究が
非常に盛んとなり、陸上植物においては既に実用
化の段階にまで成功したものもみられるに至つて
いる。 しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関し
ての細胞融合の研究報告は少なく、その成功例に
ついても未だみられていない。 因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物
では市販の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチ
ーム等）を用いて容易にそれらのプロトプラスト
を調製し得るけれども、アマノリ類をプロトプラ
スト化できる酵素が現在のところ入手し得ないた
め、アマノリ類の細胞融合の技術が陸上植物に比
べて遅れている一因と考えられる。 而して、アマノリ類をプロトプラスト化するた
めの試みとしては今までのところ、藤田等による
「酵素処理によるノリ、アオノリ類のプロトプラ
ストの分離とその発生」についての報告（日本水
産学会、昭和57年秋季講演要旨集、第32頁、211）
がみられるのみである。この藤田等による方法
は、海苔葉体を物理的手段で細断して得られる葉
片にシユードモナス属（Pseudomonas）SPの菌
株（Ｐ−１株）の培養液から得た粗酵素液を約４
時間程度作用させてプロトプラストを調製するも
のであるが、この方法ではプロトプラストを得る
ための酵素処理に長時間を要し、しかも海苔を物
理的に切断したものに酵素を作用させるので得ら
れるプロトプラストが不健全になる可能性が高
く、したがつてこのプロトプラストを用いての細
胞融合に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞
融合の手法においてはそれに用いるプロトプラス
トの健全度が非常に主要な要因であつて、プロト
プラストが不健全であると細胞融合に当つての融
合率が低くなつて以後の培養による成育も劣るよ
うになると考えられるからである。 また、上記方法で海苔葉体を切断するには、シ
ユードモナスSP菌株が生産する酵素が海苔の表
層部分には作用せずに切断部分から作用して海苔
の細胞壁を崩壊してプロトプラストとなるとの認
識に基づいているものと考えられる。 Preston等の報告によると、海苔は表層にマン
ナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミ
クロフイブリル形態のキシランから構成されてお
り、細胞充間物質としてポルフイランが存在して
いるとされる。また、L.A.Hanic等によると、海
苔の表層には蛋白質から成る薄い被覆が存在して
いるとされる。すなわち、このような海苔の組織
上の観点から、海苔は切断しなければプロトプラ
スト化できないと考えられていたものと思われ
る。 本発明者は、細胞融合に適した海苔の健全なプ
ロトプラストを得るには、海苔を物理的に切断す
ることなくその表層から崩壊させることが必要で
あるとの見地から海苔のプロトプラスト化につい
て検討した結果、海苔を少なくともマンナン加水
分解酵素およびキシラン加水分解酵素を含有する
酵素液で処理するか、更にはポルフイラン加水分
解酵素も含有する酵素液で処理することにより、
海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得る
ことの知見を得て、海苔のプロトプラスト化の技
術を開発した。［特開昭60−41485号（特願昭58−
149378号）］ 発明が解決しようとする問題点 本発明者は、上述した海苔のプロトプラスト化
の成功に伴なつて、アマノリ属に属する２種の海
苔のプロトプラストを調製し、細胞融合の手法を
適用して細胞質融合体を作成することにより、上
記２種の海苔がそれぞれ保有する優良な形質を兼
ね具えた海苔が得られることの知見を得て、本発
明をなすに至つた。 すなわち、本発明の目的は、アマノリ属に属す
る２種の海苔のプロトプラストを細胞融合させて
細胞質融合体を作成することにより、優良な所望
の形質を保有する海苔を得るための形質転換方法
を提供することにある。 以下本発明を詳しく説明する。 発明の構成 本発明は、アマノリ属に属する２種の海苔のプ
ロトプラストを調製し、それらのプロトプラスト
を細胞融合して細胞質融合体を作成し、得られた
細胞質融合体を育成する海苔の細胞融合による形
質転換方法において、該海苔のプロトプラストの
調製を、海苔葉体をマンナン加水分解酵素、キシ
ラン加水分解酵素及びプロテアーゼで処理するこ
とにより行うことを特徴とする形質転換方法に関
するものである。 現在、養殖に用いられている海苔の品種は多種
類であるが、それらの中で主に用いられているの
はスサビノリとアサクサノリである。就中、スサ
ビノリは我国で最も広く養殖されていて、繁殖力
が強く、色彩および光沢などの外観も優れている
が、その反面食味上の香気が乏しく、かつ海水中
の栄養分濃度の減少に伴ない組織が粗剛になる欠
点がある。一方アサクサノリは富栄養漁場では葉
体が柔かく香気も豊かで美味であるけれども、貧
栄養の漁場では、いわゆる色落ちが激しく品質が
低下する欠点を有する。 また、野性株であるマルバアマノリはその形態
が小型でマル葉型であり、かつ生長率が悪いため
養殖には適さないが、貧栄養漁場でも比較的色落
ちが少ないという耐性を有する。 したがつて、本発明では主として上記スサビノ
リ、アサクサノリ、マルバアマノリの３種のうち
の２種の海苔のプロトプラストをそれぞれ組合わ
せて細胞融合させることにより、それらの各海苔
が本来保有する優れた形質を兼ね具えた新しい品
種の海苔を育成するものである。 本発明では、まず、上記各海苔のプロトプラス
トを調製するが、その調製は、海苔葉体をマンナ
ン加水分解酵素、キシラン加水分解酵素及びプロ
テアーゼで処理することにより行う。マンナン加
水分解酵素及びキシラン加水分解酵素としては、
例えば、シユードモナス属（Pseudomonas）に
属する難消化性多糖類（マンナン、キシランおよ
びポルフイラン）の加水分解能を有する微生物
（シユードモナス（Pseudomonas）sp.PT―５、
微工研条寄第330号）を、海苔もしくは海苔由来
の多糖類（海苔を熱水抽出して可溶性成分を除去
して得られる、主としてマンナンもしくはキシラ
ンのような多糖類から成る残渣又は該残渣を更に
精製処理して多糖類含量を高めたもの）を誘導物
質として含む培地中で培養して得られる培養液を
遠心分離し、その上澄液を酵素液を用いてもよ
い。上記酵素液にはマンナン加水分解酵素とキシ
ラン加水分解酵素が含まれているので該酵素液を
海苔葉体に作用させるとマンナン加水分解酵素が
海苔の表面に存在する顆粒状のマンナンに作用し
て葉体に大きく切断部を形成し、それにより、キ
シラン加水分解酵素により細胞壁を形成している
ミクロフイブリル形態のキシランが作用され易く
なつて、葉体の細胞壁が分解除去されてプロトプ
ラスト化されるようになる。また、上記酵素液に
はポルフイラン分解酵素も含まれているので、海
苔葉体の細胞充間物質としてのポルフイランにも
作用して分解するのでプロトプラスト化が一層促
進される。 なお、上記プロトプラスト化に際して、海苔葉
体を予めパパインのようなプロテアーゼで処理す
るか、又は上記酵素液と並行的にプロテアーゼを
作用させることが必要である。 本発明においては、上述のようにしてスサビノ
リ、アサクサノリおよびマルバアマノリのプロト
プラスト化を行なつて得られる各プロトプラスト
の２種についてそれぞれ細胞融合を行なう。 細胞融合は公知の手法を適用して行なうとよ
く、上記２種のプロトプラストを混合して形成さ
せた沈澱にポリエチレングリコール溶液とHigh
−PH−Ca溶液を加えて放置した後、これに培養
液（人工海水Asp.12）を加えて培養を行なつて
細胞質融合体を作成する。なお、培養は15度の温
度で6000Luxの照度で明期９時間、暗期15時間の
条件下で行なうとよい。 上述のようにして得られた細胞質融合体の識別
は、スサビノリとアサクサノリとのプロトプラス
トの細胞融合、並びにスサビノリとマルバアマノ
リとのプロトプラストの細胞融合では各細胞の色
が下記のように異なるので識別可能であるが、ア
サクサノリとマルバアマノリとのプロトプラスト
の細胞融合では細胞の色が同色であるので次に述
べるように予めプロトプラストを染色することに
より識別を行なう。 各海苔の細胞の色： スサビノリ（スサビグリーン） 緑色 アサクサノリ 茶色 マルバアマノリ 茶色 染色による識別： アサクサノリとマルバアマノリの各プロトプラ
ストの一方を予め下記組成のニユートラルレツド
で染色したものを細胞融合に用いる。 ニユートラルレツド 10mg 人工海水（Asp12） 100ml 上記組成の溶液にマンニトールを0.75Mになる
ように添加し溶解して調製する。 上記細胞質融合体の識別は顕微鏡下で行ない、
パスツールピペツトのような毛細管を用いて融合
体を選択して吸い取り、前述した条件下で培養を
行ない、得られた成葉について形質の判定を行な
う。 核融合の確認は、上述のごとくして得られた成
葉の一部をDAPI染色し、螢光顕微鏡下で観察し
て行なう。 発明の効果 次に、本発明に従つて細胞融合して得られた細
胞質融合体を識別したものを培養して得られた成
葉についてそれぞれの形質を判定した結果を表１
乃至表３に示す。なお、細胞融合に用いた各品種
の海苔が本来保有する形質も併せて表１乃至表３
にそれぞれ示した。
【表】
【表】
【表】
上記表１にみられるように、アサクサノリ×マ
ルバアマノリの組合わせによる細胞質融合体では
アサクサノリ本来の良好な呈味を保有すると共に
アサクサノリに欠如している貧栄養耐性を兼ね具
えた形質が発現している。 すなわち、従来、アサクサノリは、呈味の点で
特に優れた品種とされていたものの、その養殖上
貧栄養の漁場ではいわゆる“色落ち”をするとい
う欠点があつたが、野生種の故に養殖に適さない
マルバアマノリと細胞融合することにより、貧栄
養耐性を有する養殖に適した品種が得られるよう
になる。 また、アサクサノリの養殖中には屡々あかぐさ
れ病の発生がみられ、その防止のための対策は現
在のところないが、表２にみられるように、アサ
クサノリをスサビノリの突然変異株であるスサビ
グリーンと細胞融合させて得られる融合体ではア
サクサノリが本来保有する葉の色調を呈し、かつ
あかぐされ病に対する耐性を有する形質が発現す
る。 更に、表３にみられるように、スサビノリの突
然変異株であるスサビグリーンと野生種であるマ
ルバアマノリの組合わせによる細胞質融合体で
は、葉の色として好ましい茶色を呈すると共に好
ましい葉の形状である広線形を有する形質のもの
が得られる。因に、マルバアマノリはその葉の形
状が円形であつて、生長率も悪いため養殖には適
しない。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 海苔のプロトプラストの調製： 約１cm程度の大きさのアサクサノリの葉体５枚
を0.2％パパイン液（PH7.4のトリス塩酸バツフア
ー10mlにパパイン20mgを溶解した溶液）に浸漬
し、20℃の温度で５分間振とう（70ストローク／
分）させた。ついで、上記によりパパインで処理
した葉体を、予めシユードモナス
（Pseudomonas）sp.PT―５（微工研条寄第330
号）をスサビノリ粉末を基質とする培地中で培養
して得られた酵素液（0.75Mマニトール添加）に
浸漬し、20℃で60分間振とう（70ストローク／
分）させてプロトプラスト化を行なつた。得られ
た酵素処理混合物を40μメツシユのナイロン製網
で濾過し、濾液を遠心分離（1500rpm、５分間）
して残渣にプロトプラストを得た。 プロトプラストの作出個数を第４表に示す。 なお、作出個数は、約１cmの大きさの葉体５枚
から得られたプロトプラストを、Thomaの血球
計算盤を用いて求めた。 また、このようにして得られたプロトプラスト
の再生率を求めることにより、プロトプラストの
健全性を評価した。 なお、再生率は、プロトプラストを後述する人
工海水ASP12に懸濁させ、温度15℃のもとに、
照度6000Luxの明期９時間、暗期15時間の条件で
７日間静置培養して求めた。 結果を第４表に示す。 上記と同様の手順によりスサビグリーン並びに
マルバアマノリの各プロトプラストを調製した。 細胞融合： 上述のようにして調製したマルバアマノリとス
サビグリーンの２種のプロトプラストを混合した
プロトプラスト混合液の0.1ml（106個）をパスツ
ールピペツトでペトリ皿内に滴下し、５〜10分間
放置してプロトプラストをガラス表面に沈澱させ
た。この沈澱に下記組成のポリエチレングリコー
ル溶液の0.2mlを加えて10分間放置した後、さら
に下記組成のHigh PH−Ca溶液の0.5mlを加えて
５分間放置した。 ポリエチレングリコール溶液の組成 ポリエチレングリコール（MW6000）の54％水
溶液にCaCl2・2H2O10.5mM、K2PO4・
H2O0.7mMおよびグルコース0.1Mを添加する。 High PH−Ca溶液の組成 CaCl2・2H2Oを100mMおよびグルコースを
0.4Mの各濃度に蒸留水に溶解する。 100mM NaOH―グリシンバツフアー（PH
10.5）にグルコースを0.4Mの濃度に溶解する。 上記との溶液を使用前に１：１の割合に混
合する。 次に、上述のように放置したものに、下記に示
す人工海水Asp.12からなる培養液0.3mlを加え、
５分後その0.3mlをペトリ皿から吸い上げ、さら
にそれに上記培養液を、５分後その0.3mlを吸い
上げる操作を５回繰返して行なつた後、新たに上
記培養液を加えて培養を行なつた。培養は15℃の
温度で6000Lux照度下で明期９時間（暗期15時
間）で行なつた。 人工海水（ASP12）の組成： NaCl 28ｇ MgSO4・7H2O ７ｇ MgCl2・6H2O ４ｇ KCl 400mg CaCl2・2H2O 1.46ｇ NaNO3 100mg K2HPO4 10mg グリセロ燐酸ナトリウム 10mg ビタミンB12 0.02μｇ ビオチン 0.1μｇ チアミン 10μｇ ＰMetal 10ml ＳMetal 10ml トリスアミノメタン １ｇ 蒸留水 1000ml PH 8.0〜8.1
ルバアマノリの組合わせによる細胞質融合体では
アサクサノリ本来の良好な呈味を保有すると共に
アサクサノリに欠如している貧栄養耐性を兼ね具
えた形質が発現している。 すなわち、従来、アサクサノリは、呈味の点で
特に優れた品種とされていたものの、その養殖上
貧栄養の漁場ではいわゆる“色落ち”をするとい
う欠点があつたが、野生種の故に養殖に適さない
マルバアマノリと細胞融合することにより、貧栄
養耐性を有する養殖に適した品種が得られるよう
になる。 また、アサクサノリの養殖中には屡々あかぐさ
れ病の発生がみられ、その防止のための対策は現
在のところないが、表２にみられるように、アサ
クサノリをスサビノリの突然変異株であるスサビ
グリーンと細胞融合させて得られる融合体ではア
サクサノリが本来保有する葉の色調を呈し、かつ
あかぐされ病に対する耐性を有する形質が発現す
る。 更に、表３にみられるように、スサビノリの突
然変異株であるスサビグリーンと野生種であるマ
ルバアマノリの組合わせによる細胞質融合体で
は、葉の色として好ましい茶色を呈すると共に好
ましい葉の形状である広線形を有する形質のもの
が得られる。因に、マルバアマノリはその葉の形
状が円形であつて、生長率も悪いため養殖には適
しない。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 海苔のプロトプラストの調製： 約１cm程度の大きさのアサクサノリの葉体５枚
を0.2％パパイン液（PH7.4のトリス塩酸バツフア
ー10mlにパパイン20mgを溶解した溶液）に浸漬
し、20℃の温度で５分間振とう（70ストローク／
分）させた。ついで、上記によりパパインで処理
した葉体を、予めシユードモナス
（Pseudomonas）sp.PT―５（微工研条寄第330
号）をスサビノリ粉末を基質とする培地中で培養
して得られた酵素液（0.75Mマニトール添加）に
浸漬し、20℃で60分間振とう（70ストローク／
分）させてプロトプラスト化を行なつた。得られ
た酵素処理混合物を40μメツシユのナイロン製網
で濾過し、濾液を遠心分離（1500rpm、５分間）
して残渣にプロトプラストを得た。 プロトプラストの作出個数を第４表に示す。 なお、作出個数は、約１cmの大きさの葉体５枚
から得られたプロトプラストを、Thomaの血球
計算盤を用いて求めた。 また、このようにして得られたプロトプラスト
の再生率を求めることにより、プロトプラストの
健全性を評価した。 なお、再生率は、プロトプラストを後述する人
工海水ASP12に懸濁させ、温度15℃のもとに、
照度6000Luxの明期９時間、暗期15時間の条件で
７日間静置培養して求めた。 結果を第４表に示す。 上記と同様の手順によりスサビグリーン並びに
マルバアマノリの各プロトプラストを調製した。 細胞融合： 上述のようにして調製したマルバアマノリとス
サビグリーンの２種のプロトプラストを混合した
プロトプラスト混合液の0.1ml（106個）をパスツ
ールピペツトでペトリ皿内に滴下し、５〜10分間
放置してプロトプラストをガラス表面に沈澱させ
た。この沈澱に下記組成のポリエチレングリコー
ル溶液の0.2mlを加えて10分間放置した後、さら
に下記組成のHigh PH−Ca溶液の0.5mlを加えて
５分間放置した。 ポリエチレングリコール溶液の組成 ポリエチレングリコール（MW6000）の54％水
溶液にCaCl2・2H2O10.5mM、K2PO4・
H2O0.7mMおよびグルコース0.1Mを添加する。 High PH−Ca溶液の組成 CaCl2・2H2Oを100mMおよびグルコースを
0.4Mの各濃度に蒸留水に溶解する。 100mM NaOH―グリシンバツフアー（PH
10.5）にグルコースを0.4Mの濃度に溶解する。 上記との溶液を使用前に１：１の割合に混
合する。 次に、上述のように放置したものに、下記に示
す人工海水Asp.12からなる培養液0.3mlを加え、
５分後その0.3mlをペトリ皿から吸い上げ、さら
にそれに上記培養液を、５分後その0.3mlを吸い
上げる操作を５回繰返して行なつた後、新たに上
記培養液を加えて培養を行なつた。培養は15℃の
温度で6000Lux照度下で明期９時間（暗期15時
間）で行なつた。 人工海水（ASP12）の組成： NaCl 28ｇ MgSO4・7H2O ７ｇ MgCl2・6H2O ４ｇ KCl 400mg CaCl2・2H2O 1.46ｇ NaNO3 100mg K2HPO4 10mg グリセロ燐酸ナトリウム 10mg ビタミンB12 0.02μｇ ビオチン 0.1μｇ チアミン 10μｇ ＰMetal 10ml ＳMetal 10ml トリスアミノメタン １ｇ 蒸留水 1000ml PH 8.0〜8.1
【表】
細胞質融合体の選抜：
マルバアマノリとスサビグリーンのプロトプラ
ストの色は前者が茶色で後者が緑色であることか
ら、融合体の識別は可能であるので、顕微鏡下で
融合体を識別し、パスツールピペツトで吸い取り
選抜した。 このようにして選抜した細胞質融合体を上記人
工海水Asp12中で15℃の温度で6000Lux照度下に
明期９時間（暗期15時間）で培養して育成して成
葉を得た。 この成葉について形質を調べたところ、さきに
示した表３におけるマルバアマノリ×スサビグリ
ーンの諸形質を保有していた。 実施例 ２ 実施例１に記載したと同様の手順で調製したマ
ルバアマノリとアサクサノリのプロトプラストは
同じ茶色を呈するのでアサクサノリのプロトプラ
ストを前記組成のニユートラルレツドで予め染色
した後、両者のプロトプラストを、実施例１に記
載と同様の手順で細胞融合し、得られた細胞質融
合体の選抜を行ない、ついで培養、育成して成葉
を得た。 この成葉について形質を調べたところ、表１に
おけるマルバアマノリ×アサクサノリの諸形質を
保有していた。 比較例 １ 0.2％パパイン液に代えて以下に示す培養液を
用いたほかは、実施例１と同様にして、アサクサ
ノリのプロトプラストを調製した。 得られたプロトプラストについて、実施例１と
同様に作出個数および再生率を求めた。 結果を第４表に示す。 培養液の組成 濾過滅菌海水 1000ml NaNO3 169.98mg Na2HPO4・12H2O 35.80mg NaEDTA 11.16mg FeCl3 0.54mg PImetal液 ２ml PH 8.0 PImetal液の組成 蒸留水 1000ml H3BO3 6.1840ｇ MnCl2・4H2O 0.6925ｇ ZnCl2 0.0545ｇ CoCl2・6H2O 2.3795mg CuCl2・2H2O 0.0170mg
ストの色は前者が茶色で後者が緑色であることか
ら、融合体の識別は可能であるので、顕微鏡下で
融合体を識別し、パスツールピペツトで吸い取り
選抜した。 このようにして選抜した細胞質融合体を上記人
工海水Asp12中で15℃の温度で6000Lux照度下に
明期９時間（暗期15時間）で培養して育成して成
葉を得た。 この成葉について形質を調べたところ、さきに
示した表３におけるマルバアマノリ×スサビグリ
ーンの諸形質を保有していた。 実施例 ２ 実施例１に記載したと同様の手順で調製したマ
ルバアマノリとアサクサノリのプロトプラストは
同じ茶色を呈するのでアサクサノリのプロトプラ
ストを前記組成のニユートラルレツドで予め染色
した後、両者のプロトプラストを、実施例１に記
載と同様の手順で細胞融合し、得られた細胞質融
合体の選抜を行ない、ついで培養、育成して成葉
を得た。 この成葉について形質を調べたところ、表１に
おけるマルバアマノリ×アサクサノリの諸形質を
保有していた。 比較例 １ 0.2％パパイン液に代えて以下に示す培養液を
用いたほかは、実施例１と同様にして、アサクサ
ノリのプロトプラストを調製した。 得られたプロトプラストについて、実施例１と
同様に作出個数および再生率を求めた。 結果を第４表に示す。 培養液の組成 濾過滅菌海水 1000ml NaNO3 169.98mg Na2HPO4・12H2O 35.80mg NaEDTA 11.16mg FeCl3 0.54mg PImetal液 ２ml PH 8.0 PImetal液の組成 蒸留水 1000ml H3BO3 6.1840ｇ MnCl2・4H2O 0.6925ｇ ZnCl2 0.0545ｇ CoCl2・6H2O 2.3795mg CuCl2・2H2O 0.0170mg
【表】
評 価
第４表に示す結果からも明らかなように、プロ
テアーゼ処理を行うと、未処理の場合と比較し、
プロトプラストの作出個数がはるかに多く、また
得られたプロトプラストは、その再生率が示すよ
うに、極めて健全性に優れている。
テアーゼ処理を行うと、未処理の場合と比較し、
プロトプラストの作出個数がはるかに多く、また
得られたプロトプラストは、その再生率が示すよ
うに、極めて健全性に優れている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アマノリ属に属する２種の海苔のプロトプラ
ストを調製し、それらのプロトプラストを細胞融
合して細胞質融合体を作成し、得られた細胞質融
合体を育成する海苔の細胞融合による形質転換方
法において、該海苔のプロトプラストの調製を、
海苔葉体をマンナン加水分解酵素、キシラン加水
分解酵素及びプロテアーゼで処理することにより
行うことを特徴とする形質転換方法。 ２ マンナン加水分解酵素及びキシラン加水分解
酵素による処理に先立ち、海苔葉体をプロテアー
ゼで処理する特許請求の範囲第１項記載の形質転
換方法。 ３ マンナン加水分解酵素及びキシラン加水分解
酵素による処理と平行して、海苔葉体をプロテア
ーゼで処理する特許請求の範囲第１項記載の形質
転換方法。 ４ ２種の海苔がスサビノリとアサクサノリであ
る特許請求の範囲第１項記載の形質転換方法。 ５ ２種の海苔がスサビノリとマルバアマノリで
ある特許請求の範囲第１項記載の形質転換方法。 ６ ２種の海苔がアサクサノリとマルバアマノリ
である特許請求の範囲第１項記載の形質転換方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122740A JPS611386A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 海苔の細胞融合による形質転換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122740A JPS611386A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 海苔の細胞融合による形質転換方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611386A JPS611386A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH0229313B2 true JPH0229313B2 (ja) | 1990-06-28 |
Family
ID=14843415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59122740A Granted JPS611386A (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | 海苔の細胞融合による形質転換方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611386A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61212281A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 温度耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212280A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 貧栄養耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212279A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | あかぐされ病耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| AU2027595A (en) * | 1994-05-27 | 1995-12-07 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition for treating inflammatory bowel diseases |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5639790A (en) * | 1979-09-11 | 1981-04-15 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Preparation of yeast fungus body by protoplast fusion |
| JPS5729229A (en) * | 1980-07-29 | 1982-02-17 | Topy Ind | Growing of "matsutake" strain |
-
1984
- 1984-06-14 JP JP59122740A patent/JPS611386A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS611386A (ja) | 1986-01-07 |
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