JPH02295483A - Ｔｐａのプロテアーゼ領域中に位置する修飾残基をコードする新しい遺伝子配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はプラスミノーゲン活性化に関する非活性が同上
している治療用タンパク質を産生ずるための組み換えＤ
ＮＡ技術の使用に関するものであり、特に、新しいヒト
修飾組織プラスミノーゲン活性化因子（ｍｔＰＡ）遺伝
子およびそのような遺伝子を含むプラスミド、それによ
って形質転換あるいは形質導入された宿主細胞、および
それらから産土されたＩＩＩＬＰＡ分子の使用法に関す
るものである。

発明の背景 組織ブラスミノーゲン活性化因子（ＩＰＡ）はブラスミ
ノーゲンからプラスミンへの転換を触媒する多頭域セリ
ンプ口テアーゼである。したがって、ｆＰ＾は治療上の
価値がある。外から投与した場合、ＬＰＡは凝固した血
液の溶解（血栓溶解）に効果がある。ＩＰＡは、心筋梗
塞治療の臨床的試験で有効であることか示された。その
他に効果が示唆されたものとして、肺塞栓症、静脈血栓
症、および卒中がある。

ヒ１・黒色ＩＩ（メラノーマ）細胞から分泌されＩ；Ｉ
ＰＡかりジケン（ｌｊｉｊｋｅｎ）他によって精製され
、解析されたＵ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５６．７
０３５　（＋９８１））。外因性ｔＰＡの治療上の有用
性は、黒色腫由来物質を用いて示された（米国特許第１
、７５２、６０３号、コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）他、Ｊ．
　ＣＩｉｎ．　　ｌａｙ．　７１，　３６８　（１９８
３）；コーニンガー（ＫｏｒａｉＩＩｇｅｒ）他、Ｊ．
　ＣＩｉｎ．　ｌ＋ｖ．　６９，５７３　（＋９１１２
））。黒色腫由来ｔＰＡと正常子宮組織白米１Ｐ＾との
違いが報告された（ポール（Ｐｏｂ１）他、ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔ，世，　２９　（１９８４）。リジケン（ｉｉ
ｉｊｋｅｎ）他、Ｂｉｏｃｂｅ＋＊．　Ｂｉｏｐｈｙｓ
．　Ａｃｔ！５１０，目０　（＋９７９）は、ヒト子宮
組織からのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｕｔ
ＰＡ）の部分精製を報告している。

組み換えＤＮＡ技術は以前に癌細胞系（ポーズ（［ｌｏ
ｖｅｓ）黒色腫細胞）からｍＲＮＡを得るために用いら
れ、このｍＲＮＡかポーズＩＰＡをフードするｃＤＮＡ
の産土に使用された（ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅ１）他、
米国特許第４，７６６，（１７５号）。ウエイ（Ｗｅｉ
）他との共同出願である米国特許出願第７ｇ２，６８６
号は、ここに完全に参考文献として含まれるものである
が、子宮ｔＰＡをコーＦｔるＤＮＡ配列について述べて
いる。この参考文献はさらに、啼乳動物細胞では翻訳後
プロセシング過程で通常はグリコシル化されるアミノ酸
をコードする３つの場所のいずれか１カ所以上の１）Ｎ
Ａ配列の部位特異的ミュータジエネシスについて述べて
いる。得られた変化したアミノ酸配列を持つ修ｆｉｔＰ
Ａ分子は、変異を受けた部位でグリコンル化されなくな
る。この研究はウェイ（Ｗｅ　ｉ）他、ＤＮＡ　４、７
６　（１９８５）、ロー（Ｌａｕ）他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ５、９５３　（＋！Ｈ７）およびＥＰＡ
　１７８，１０５号でも報告された。本発明で、マウス
Ｃｌ２７細胞中で分泌される１［’Ａおよび＋＊ｔＰＡ
の発現のために使用される発現ベクターは、レデ４　−
（Ｒｅｄｄｙ）他、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　ＢｉｏｅｈｅＩ１
．１０Ｄ，　＋５４　（１９８６）に記述されている。

ＩＰＡ分子は５つの別個の構造的領域を含んでいる。ブ
ラスミンの存在下では、一本ｉ１１ＰＡすなわちチモー
ゲン酵素が切断されて活性化されｊ；二本鎖型となるこ
とができる。重鎮はこれらの領域のうち４つを含む＝７
イブ口ネクチンの一部と相同性を持つ゛フィンガー″領
域；上皮成長因子と相同性を持つ゛成長因子′゛領域；
および２つの同等でない“クリングル′″領域である。

二本鎖型ｔＰＡを形成するためのブラスミン切断は、ク
リングル２のＣ末端（Ａｒ（２７Ｂ）で起きる。軽鎖は
トリブシンおよびキモトリプシンに相同なセリンズロテ
アーゼ領域を含む。

ＩＰＡは、血栓マトリソクスを形成する７イブリンに対
する親和性により、比較的血゛栓に特異的なプラスミノ
ーゲン活性化因子である。このフィブリン親和性は、フ
ィンガー領域およびクリングル２領域と７ィブリンとの
相互作用のためだと考えられている。よく分からない理
由で、クリングル１領域はクリングル２領域よりも弱く
フィブリンと相互作用する（ファン・ゾネベルト（ｖｉ
ａ　２ｏ＋＋＋＋ｓｖｓｌｄ）他、Ｐｒｏｃ．　Ｎｌｌ
ｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　Ｉ３：　４６７
０（１９８６））。親和性の相違は、例えば、セリンプ
ロテアーゼ領域に対する相対的な向きが違うためかもし
れない。

多数のセリンブロテアーゼの塩基配列が決定され、多く
が結晶化された。結晶化された酵素のＸ線回折技術によ
る研究から、セリンブロテアーゼであるトリブシン、キ
モトリプシン、ズブチリシン、エラスターゼ、およびカ
リクレインの３次元構造が決定された。これらの構造の
考察および基質特異性に関する実験データから、酵素の
活性部位の構造および電荷がどのように特異性を決めて
いるかということにたいする洞察が与えられると考えら
れており、このようなデータを分子をデザインする新し
い方法を生み出すのに利用することが本発明の一つの局
面である。

ウロキナーゼ（ＵＫ）とｔＰＡはどちらも同じ反応一プ
ラスミノーゲンのＡｒＨ４ｓｌ結合の切断を触媒する。

これらの酵素はこの反応を非常に異なる触媒効率で行う
。ウロキナーゼ（■Ｋ）またはｔＰＡのプラスミノーゲ
ン活性化の第２次速度定数はそれぞれ３８８よび４．ｇ
ｉｌＭ−’　ｍｉａ−’であり、ＵＫの方が８倍効率が
よい（り−（Ｌｅｅ）他、ｌｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　２７，　７５０６（１９Ｂｇ）。しかし、ＯＫとは異
なり、ｔＰＡはその触媒活性がフィブリンによって増幅
される望ましい性質をもつものである。７イブリン刺激
程度の推測値は２０００＠を越えた（デ・ブリース（＋
ｌｅ　Ｔｒｉｅｓ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２
７、０６５　（１９Ｎ））。

ＵＫの高い触媒効率およびｔＰＡのフィブリン特異性を
持つ改善された溶血試薬を与えることが本発明の一つの
局面である。

このような改善された試薬を開発するためのこれまでの
試みとしては、部位特異的ミュータジエネシスによって
ｔ　ＰＡ−ＵＫハイブリッドを生成することが行われた
（デ・ブリース、上述）．これらの試みにおいては、ｔ
ＰＡの７ィブリン結合領域がＵＫのセリンブロテアーゼ
領域に融合された。このようなハイブリッドはフィブリ
ンの非存在下でｔＰＡよりも速い速度でブラスミノーゲ
ンを切断するが、元のＬＰＡが脊する望ましい程度の７
イブリン依存性は失われた。

望みの性質を持ち、従来のキメラ法の欠陥を克服するよ
うな新しい分子を与えることが本発明の別の局面である
。

本発明の更に別の局面は、望ましい修ｉｍｔＰＡ分子（
ｍｔＰＡ）を製造するために、ｊＰＡ　ｃＤＮＡを所望
の方法で予測可能に変化させることのできる新規方法を
提供することである。

発明の概要 本発明の多様な原理及び局面により、ＩＰＡセリンプロ
テアーゼ領域配列を他のセリンプロテアーゼ配列（最も
望ましくはｔｌＫ）と比較すること、ＬＰ人の予測され
た３次構造の分子モデリング、および分子の触媒効率が
向上しているＩＰＡ分子中の変位を同定することを含む
ｔＰＡの触媒効率の改善への新しいアプローチが与えら
れる。それにより、このアプローチによってもとの【Ｐ
八分子のプロテアーゼ領域中の選択されたアミノ酸の置
換によって生成されるｍＬＰＡも与えられる。驚くべき
ことに、ｔＰＡとＵＫとのプロテアーゼ領域の１次構造
の違いによりフィブリンの非存在下での触媒効率が異な
ることも見いだされた。理論に制限されることを望むも
のではないが、ｔｌ’Ａプロテアーゼ領域のプラスミノ
ーゲン結合領域中のあるアミノ酸残基がプラスミノーゲ
ン分子の一部に対する望ましい結合工不ルギーを与え、
これらの位置で別のアミノ酸に置換することによりこれ
らの相互作用が増大されるという仮説が立てられる。本
発明の方法及び分子は、これらの予想外の発見を考慮に
いれた、組織ブラスミノーゲン活性化因子と関連した生
物活性を有する新しい分子を生成するだめの新しいアプ
ローチを与えるものである。ｔＰＡのプロテアーゼ領域
の３次元構造を予測するために他のセリンプ．ロテアー
ゼの活性部位の構造を使用することが上記の観点からさ
らに有用なことが見いだされた。このような変異により
正しくない折りたたまれ方（ＩｏＬｄｉａＯ　、分泌の
欠陥、あるいは＋ｓｔＰＡの活性の低下が起こりそうな
のに、プロテアーゼ領域中のこのような変化によってさ
えも野生型あるいは修飾されていない【ＰＡよりも生物
活性が高い分子が得られることが発見されたのは驚くべ
きことであっｔ；。

目的とする修飾ＬＰＡ分子の産生のために推奨される本
発明の方法は、ｔｐＡ中のアミノ酸残基をＵＫ中の対応
する残基により近づくように変化させることを含む。プ
ロテアーゼ領域（下線で示す）中の最も推奨されるヌク
レオチド置換および得られるアミノ酸置換は、表４に列
記した配列を含む。

これらの配列のうち２つ以上を組み合わせたり、さらな
るアミノ酸置換あるいは挿入によって変化させられるこ
と、および、これら全ての修飾はそのタンパク質の触媒
活性がｔＰＡが持つものよりも実質的に低くない限りは
包含されることを、本分野の技術に熟達しｔ；ものは認
識するであろう。

本発明の別の推奨される方法は、ｔＰＡをコードするｃ
　ＤＮＡを変化させることにより、ｌ［’Ａタンパク質
配列中に少なくとも一つの変化したアミノ酸を導入する
ことからなる。（ｃＤＮＡにより本明細書全体を通して
特定し説明するが、これは議論と理解をただ容易にする
ためのものであり、制限するものではない：ここで述べ
た新しい発明を実施する際にｔＰＡをコードするゲノム
をｃ　ＤＮＡの代わりに使用可能なことは、技術に熟達
した者は認識するであろう。）一つの態様においては、
これらの変化は、変異の存在が′ｌ４＠酵素消化によっ
て確認できるように単独の制限酵素切断部位を導入ある
いは除去することによって作成される。最も推奨される
態様では、これらの修飾はｉｎ　ｖｉｖｏの半減期が長
くなった分子を得るために他の修飾、例えば残基１２０
または残基４５１のグルタミンをアスパラギンに変化さ
せることと組み合わせて行い、このような変化はここで
はそれぞれ旧２０ＱまたはＮ４５１Ｑと表記した（以下
に示す１文字アミノ酸変換表に従って、ここでＮはアス
パラギンを表し、Ｑはグルタミンを表す）。別の推奨さ
れる態様は、本発明の変異と、ＩＰＡのフィンガーまた
はＥＧＦ相同性領域のその他の欠失との組み合わせを含
む。このような他の欠失変異により半減期が長くなるこ
とが報告された（コレン（Ｃｏｌｌｅｏ）他、Ｂｌｏｏ
ｄ　７１，　２１６　（１９８ｇ））。

本発明により、配列の保持および複製のため、および望
ましい変異分子の産土のための形質転換された宿主生物
；変異体あるいは修飾ｔＰＡ（ｍｔＰＡ）分子をコード
する修飾配列のＣＯＳ，　ＣＩ２７、およびＣ［１０細
胞中での発現のための発現ベクター；およびこれらの発
現系に由来するｍｊＰＡタンパク質も与えられる。

詳細な説明と最適な態様 写ｊ１ ゛組織プラスミノーゲン活性化因子”、または゛ＩＰＡ
”という語は、天然の材料由来の、あるいは微生物細胞
または細胞培養液中で組み換えＤＮＡ技術によって産土
されたタンパク質に関するものである。これはフィプリ
ンに結合し、グラスミノーゲンからプラスミンへの変換
を触媒することができる。

゛゜修飾組織ブラスミノーゲン活性化因子′゜または゛
ｍｔＰＡ’という語は、アミノ酸の除去、挿入、重複、
あるいは置換によって変化させたＬＰＡの誘導体に関す
るものである。これらはアレル多様性によって自然に生
じた変化であるか、または該タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡまたは遺伝子の部位特異的ミュータジェネシスに
よって生じた人工的な変換の場合がある。

“細胞培養物″という語は、典型的には、元の植物また
は動物の外でも細胞が生育し続けることができるような
多細胞植物または動物由来の生育している細胞を含んだ
ものに関するものである。

“宿主細胞″という語は、細胞培養液中で増殖可能であ
って、ＬＰＡの生物学的特徴を有する分子を発現させる
ために、該分子をコードする遺伝子を含むプラスミドま
ｔ；はベクターで形質導入または形質転換可能な、酵母
、細菌を含む微生物、およびこれに限るものではないが
、曙乳動物細胞を含む真核生物細胞に関するものである
。

“領域″という語は、特定の機能を備える個々の連続的
なアミノ酸配列部分に関するものである。

ＬＰＡに関しては、この観点からの有用な参考文献とし
て領域範囲を定義した、Ｌ，バンヤイ（Ｂｓｌｙｘｉ）
他、「７イブ口ネクチンと組織型ブラスミノーゲン活性
化因子の７イグリン結合性構造の共通な進化的起源Ｊ　
、ＦＥＢＳ　Ｌｅｆｔ．　１６３（１）、３７−４１　
（１９８３）およびＴ．ナイ（Ｎｙ）他、「ヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子遺伝子の構造二機能領域と
構造領域に対するイントロンおよびエクソン構造の関連
」、Ｐｒｏｃ．　　Ｎｓｋｌ．　　Ａｃｘｄ．　　Ｓｃ
ｉ．　　ＵＳＡ　　Ｈ、　５３５５−Ｓゴ５９（１９Ｎ
）がある。以下に示す表２および表３は一般に受け入れ
られている領域範囲のおおよその位互を示している。

“下流″という語は、発現の向きにさらに進んだ配列を
示すものである：例えば、コード領域は開始コドンの下
流に位置する。

゛領域間′゜という語は、領域と領域の間にあるタンパ
ク質のアミノ酸配列の範囲に関するものである。

”維持される″という語は、自律増殖する物質としてブ
ラスミドが存在する場合、または宿主のゲノム中に内在
化した状態で存在する場合に、形質転換された宿主内に
ブラスミドが安定に存在することに関するものである。

゜゜微生物″′という語は、単細胞原核生物および単細
胞真核生物のどちらも含んでいる。

゛非天然エンドヌクレアーゼ制限部位″という句は、天
然のｃ　ＤＮＡには通常は存在しないが、ｃＤＮＡヌク
レオチド配列内の部位特異的ミュータジエネンスによっ
て操作を加えて作成したエンドヌクレアーゼ制限部位に
関するものである。

゜゛オペロン′゜という語は、構造遺伝子、レギュレー
ター遺伝子、およびレギュレーター遺伝子の産物によっ
て認識されるＤＮＡ中の調節要素を含む遺伝子発現およ
び制御の完全な単位である。

“プラスミド″という語は、自律増殖する染色体外環状
ＤＮＡであり、発現型と非発現型の双方が含まれる。こ
のような分子の発現を与える組み換え微生物または細胞
培養物が発現プラスミドを含んでいると記述される場合
、“発現ブラスミド”という語は、染色体外環状ＤＮＡ
と宿主染色体中に内在化したＤＮＡの双方を含む。

“プロモーター′″という語は、転写開始のためにＲＮ
＾ボリメラーゼが結合するのに関与するＤＮＡ領域であ
る。

“ＤＮＡ配列″という語は、アデノシン、チミジン、シ
トシン、およびグアノシンのヌクレオチド塩基からなる
一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり、さらにゲノムＩ
）ＮＡとコピーＩＶＡ（ｃＤＮＡ）を含む。

“適切な宿主′゛という語は、ゲノムに組み込まれるた
めまたは発現されるために、組み換えプラスミドと適合
性であってグラスミドの複製が可能である細胞培養物あ
るいは微生物に関するものである。

゛上流″という語は、発現の逆の向きに進んだ配列を指
す。“上流”はまた、別のヌクレオチドの５′側に先行
する配列も示す。例えば、細菌のプロモーターは転写ユ
ニットの上流であり、開始コドンは終始コドンの上流で
ある。

“制限エンドヌクレアーゼもしくは制限酵素ともいう語
は、それぞれの酵素に特徴的な場所あるいは部位で二本
鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を切断する酵素に関するもので
ある。例えば、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌは次
に示す位置のみでｄｓＤＮＡを切断する＝Ｓ’ＧＡＡＴ
ＴＣ３゜を５’Ｇ　　　と　ＡＡＴＴＣ３″　の断片に
する。

３’ＣＴＴＡＡＧ５’３’ＣＴＴＡＡ　　　　Ｇ５’こ
のような酵素は多数知られているが、本発明の最も推奨
される態様は、特定の性質をもつ選択された制限酵素の
みに主に関連する。

プラスミドおよび断片を表記するのに用いた慣習的表現
は、プラスミドとその断片の慣習的な表記と同義になる
ようにする。慣習的な環状の図ではなく、図表または表
中の一本の線状の図は、環状および線状二本鎖ＤＮＡの
両者を表し、翻訳開始または転写は左から右（Ｓ′から
３″）のむきに起きるように描かれている。異なるＮＨ
！末端型には明らかな番号付けの修飾が適用されること
は容易に理解されるであろうが、ヌクレオチドとアミノ
酸の番号は表２に示した特異的なアミン（Ｎｉｌ！）末
端型に対応する。以下の表は標準的なアミノ酸の略記法
を示している。

アラニン アルギニン アスパラギン アスパラギン酸 システイン グルタミン グルタミン酸 グリシン　　　　　Ｇｌｙ　　　　　　　　　Ｇヒスチ
ジン　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　　Ｈイソロイシン　
　　Ｉｔｓ　　　　　　　　　１ロインン　　　　　Ｌ
ｅα　　　　　　　　Ｌリジン　　　　　　Ｌｙｓ　　
　　　　　　　Ｋメチ才二ン　　　　Ｍｅｔ　　　　　
　　　　Ｍ７エニルアラニン　Ｐｈｅ　　　　　　　　
　Ｆプロリン　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　　　Ｐセ
リン　　　　　Ｓｅｒ　　　　　　　　Ｓトレオニン　
　　　Ｔｈｒ　　　　　　　　　Ｔトリグトファン　　
Ｔｒｐ　　　　　　　　　Ｗチロンン　　　　　Ｔｙｒ
　　　　　　　　’１バリン　　　　　Ｖａｌ　　　　
　　　　Ｖセリンプロテアーゼの一次配列間の相違が触
媒効率の相違の原因であるという上述の発見に関連して
、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリク
レイン、ＵＫ，およびｔＰＡ　（Ｊｔ後の二つは表１に
示されている）の一次配列間で比較を行った。ＬＰＡと
υＫのプロテアーゼ領域のコンピュータ一で作成した像
が、４つのセリンプロテアーゼの既に報告されているＸ
線座標を元にして作成された。ｔＰＡとＵＫの触媒３部
位と活性部位結合ポケットの比較から、プラスミノーゲ
ンの切断部位に見いだされた３ペプチドＰｒｏ−Ｇｌｙ
−Ａｒ（の配列に結合するためのＬＰＡ活性部位の親和
性が大きいことに関連すると思われる多数のアミノ酸の
相違が示されｔ；。本発明は、これらの新しく発見され
た相違箇所を有利に操作するための新しい方法を与える
。

一般的な方法 ＤＮＡ調製、制限酵素消化、制限酵素分析、ゲル電気泳
動、ＤＮＡ断片の単離、ＤＮＡ沈澱、ＤＮＡ断片連結、
細菌の形質転換、細菌のコロニー選択と増殖は本分野で
は慣用的な方法であり、マニアナイス（ｌｈ＋＋ｉｓｔ
ｉｓ）他、　Ｍｏｌｅｃｗｌｉｒ　　Ｃｌｏロｉｎ（：
Ａ　　ＬｓｂｏｒｓｔｏｒｙＭ！ＩＩＩ！ｌ、コールド
スプリングハーハー、ニューヨーク１９０　（以下では
、マニアティスとして参考にする）に詳述されている。

緩衝化した培地内でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＲＮＡ転写法
、およびウサギ網状赤血球溶解液中のｉｎ　ｖｉｔｒｏ
タンパク質翻訳は販売元の指示に示されている方法で行
う（プロメガ・バイオテク）。ＤＮＡ塩基配列決定は一
本鎖ＤＮＡまたは変性させＩ；二本鎖ＤＮＡのいずれか
を用いてサンガーのジデオキシ法で行った。

＋ＰＡ　ｃＤＮＡ源 ヒト子宮＋Ｐ＾の全長のｃＤＮＡのクローニングはレデ
ィー（Ｒｅｄｄｙ）らによって報告された（１９８７）
。実質的に、ｍＲＮＡはヒト子宮組織からグアニジンチ
オンア不−ト法およびそれに統＜　ＣｓＣｌ勾配精製と
オリゴｄＴア７イニティー精製によって調製した。逆転
写酵素とクレノーを用いてメッセンジャーＲＮＡを二本
鎖ｃＤＮ＾に変換し、それをｐＢｔ！３ＨのＰｓｔ１部
位にクローニングした。そのＬＰＡ　ｃＤＮＡをポーズ
黒色腫【Ｐ＾の配列から演鐸したオリゴヌクレオチドで
スクリーニングした。２４５５塩基対のｃ　ＤＮＡが単
離され、塩基配列が決定され、報告されている配列とよ
く一致することが示された（ぺ冫二カ（Ｐｅａｎｍｉｃ
＊）他、１９８３）。子宮ＩＰＡ　ｅＤＮＡは幾つかの
部位で（特にクローンの３′非翻訳領域中）黒色腫ｔＰ
Ａと異なっていｆ−Ｃレディー他、１９１７より）。

ＩＰＡの＾ＴＧ開始コドンの近くの、クローンの５′末
端のＳ［＊ａ１部位（スクレオチド１も）およびＢｇｌ
ｌ＋部位（２０９Ｇ）を切断し、ｄＮＴＰ’ｓの存在下
でクレノーでフィルインし，　Ｓ！ＩＩリンカーをプラ
ント末端に連結させた。ｃＤＮ＾をＳｉｌｌ断片として
ＰＢ２３２２に再クローン化し、続いてＳｉ１１部位を
用いて他のベクターに再クローン化した。

部位特異的ミュータジェネシスのためのプライマーの合
成 ヒト子宮ＬＰＡ　ｃＤＮＡを、固相ホスホトリエステル
法で調製しＩ；合成オリゴヌクレオチドを用いて部位特
異的ミュータジエネシスを行うことにより修飾した。

以下に示すプライマーを合成し、上記のようなミュータ
ジエネシスに使用しｔ；。これらはアンチセンス配列で
ある。

■．プライマ−ＰＰＩ　（！Ｉマー） ５’　ＧＣＣ．ＣＣＣ．ＧＣ▲．▲ＡＣ．ＧＡ▲．ＣＣ
Ｇ．ＣＴＣ　３’２．ブライ？−ＰＰ！　（Ｈ？−） ５’　ＣＧＧ．ＡＡＡ．ＣＣＧ．＾ＴＣ．ＣＴＧ．ＧＡ
Ａ．ＧＣＡ　３’３．プライマ−ＰＰ３　（２１マー） ５’　ＡＧＴ．ＧＴＣ．ＧＧＣ．ＡＴＣ．ＧＡＡ．ＣＴ
Ｃ．ＣＴＴ　３’４．グライマ−ＰＰ４　（２１７−） Ｓ’　　ＧＴＣ．ＡＴＴ．ＧＴＣ．ＧＡＧ．ＣＧＴ．Ｇ
ＴＣ．ＡＴＣ　　３’５．プライマ−ＰＰＳＥ　（２１
マー）５’　　ＧＴＡ．ＣＡＧ．ＴＣＴ．ＣＴＣ．ＡＴ
Ｇ．ＡＧＣ．ＣＴＣ　　３’６．プライマ−ＰＰ５Ｑ　
（２１マー）５’　　ＧＴＡ．ＣＡＧ．ＴＣＴ．ＣＴＧ
．ＡＴＧ．ＡＧＣ．ＣＴＣ　　３″７．ブライマ−ＰＰ
６Ｓ　（２１マー）５゜　ＣＣＧ．ＡＧＴ．ＧＴＣ．Ｇ
ＣＴ．ＡＧＣ．ＡＣＡ．ＣＡＧ　　３’８．ブライマ−
ＰＰ６Ｔ　（２１マー）Ｓ’　　ＣＣＧ．ＡＧＴ．ＧＴ
Ｃ．ＴＧＴ．ＡＧＣ．ＡＣＡ．ＣＡＧ　　３’９．プラ
イマ−ＰＰ６Ｄ　（Ｈマー） ５’　　ＣＣＧ．ＡＧＴ．ＧＴＣ．ＧＴＣ．ＡＧＣ．Ａ
ＣＡ．ＣＡＧ　　３’Ｏ．プライマ−ＰＰ７　（２７７
−） ５″ＣＴＧ．ＧＧＧ．ＧＣＣ．ＧＣＣ．ＧＧＧ．ＣＡＧ
．ＡＧＴ．ＧＴＣ．ＴＣＣ　３″Ｉ＋．ブライマーＰＰ
８　（２１７−）Ｓ’　　ＧＣＣ．ＣＴＧ．ＧＣＡ．Ｇ
ＣＴ．ＧＴＣ．ＧＴＧ．ＣＡＡ　　３’１２．ブライマ
ーＰＰ９　（２１マー）Ｓ’　ＧＣＣ．ＣＣＡ．ＧＣＴ
．ＣＡＣ．ＧＡＴ．ＧＣＣ．ＣＡＣ　３’目．プライマ
−ＰＰＩＯＡ　（２１マー）５′　＾ＴＣ．ＣＴＴ．Ｃ
ＴＧ．ＡＧＣ．ＡＣＡ．ＧＣＣ．ＣＡＧ　　３’＋４．
グライマ−ＰＰＩＯＳ　（Ｈマー）Ｓ’　　ＡＴＣ．Ｃ
ＴＴ．ＣＴＧ．ＡＣＴ．ＡＣＡ．ＧＣＣ．ＣＡＧ　　３
″１５．プライマ−ＰＰＩＩＤ　（２１７−）Ｓ’　　
ＧＴＡ．ＣＡＣ．ＡＣＣ．ＧＴＣ．ＧＡＣ．ＡＴＣ．Ｃ
ＴＴ　　３″１６．ブライマ−ＰＰ３　（Ｈマー） Ｓ’　ＧＴＡ．ＣＡＣ．ＡＣＣ．ＣＴＧ．ＣＡＣ．ＡＴ
Ｃ．ＣＴＴ　３″ここで用いたＭＵに基づくオリゴヌク
レオチドによるミュータジエネシス法は、実質的にクン
ケル（Ｋｕｉｋｅ１）他が報告したものである（Ｆｒｅ
ｅ．　Ｎ＊ｔｌ．Ａｃ！ｄ．　Ｓｃｉ．　［ＩＳＡ　８
！，　４８ｆｉ　（１９８５））。ＭＩ３ｔＰＡ．ＭＧ
Ｂベクター（上述の米国特許出願および・ウエイらの報
告に記述されている、Ａｓａ　１２０　Ｇｉｎ変異を持
つＩＰＡ　ＣＤＮＡ）を含む７アージを大腸菌ＣＨ３６
株（ａａｔ−ｕＢ−）中で、０．Ｓｊｌｇ／ｗｌウリジ
ンが存在する培地中で培養した。チミンの代わりに ウランル残基を含む一本鎖ＤＮＡが産土された。

木鎖ＭＩ３ｍｐｌ８．ｍｔＰＡは慣習的な方法で調製し
た。

リン酸化した変異用オリゴヌクレオチドｌｏｇを１５ｇ
の一本Ｍ　ＤＩ１１Ａと、ＩＸＳＳＣ（Ｌｌ５１ｉ１　
ＮａＣＩ，　１５ａ＋ＡＩクエン酸ナトリウム）を含む
総体積２０μ１中でアニーリングさせＩ；。アニーリン
グ混合液を７０゜Ｃに加熱し、ウォーターバス内で数時
間かけてゆっくりと温度を下げた。アニールさせた断片
を、ＤＮＡポリメラーゼと丁４リガーゼの働きで共有結
合で閉じた環状ＤＮＡに転換した。アニール用混合液は
、２０ｍＭＨｅＨ＋ｅｓ（ｐＨ７．８），　２ｍＭ　Ｄ
ＴＴ，　ｌｏｍＭ　ＭｇＣｌ２、５００ｐＭ各ｄＡＴＰ
．　ｄＴＴＰ，　ｄＣＴＰ，およびｄＧＴＰ，　ＩｍＭ
　ＡＴＰ，　２．５ユニノトのクレノーおよび２ユニッ
トのＴ４　ＤＮＡリガーゼを含むように１００μｌとな
るように調製しＩ；。

インキュベーンヨンはＧ°ＣでＳ分間行い、続いて室温
で５分、３７℃で２時間、およびその後に１６℃で一晩
行った。

上述の反応混合液１０Ｉｉ１を大腸菌Ｄ■５株（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
）のコンビテント細胞３０Ｇμ１に加え、氷上で１時間
静置した。３７°Ｃで５分間、細菌をヒートショックに
かけ、次に２００μ！の対数増殖中期にある大腸菌ＪＭ
ＩＧＩ株（ＡＴＣＣから入手可能）を含む３１の軟寒天
（０．６％）で連統的に希釈し、ＬＢ寒天プレート上に
注ぎ、固まらせた。プレートを３７℃で一晩インキユベ
ートしｔこ。

プレートからニトロセルロースで写しとり、真空下でＳ
Ｇ℃で２時間焼き付けて、上述のプライマー群から選択
した、３２ｐ標識した望みの変異体オリゴヌクレオチド
とハイブリダイズさせた。に変異体ポジティブとなって
いるものを、ＤＮＡ：オリゴの複合体を熱変性して、Ｒ
ｒ　ＤＮＡ大量調製のために大量にＪＭＩＯＩ内でさら
に増殖させた。Ａｓ＋＋　１２０からＧｌｕの変異およ
び新しい変異を含むＬＰＡ　ｃＤＮＡを含むＢｓｉ［１
１−■ｉｎｄｌｌ＋断片を、通常の制限酵素消化と連結
反応の方法を用いてＳＰ６５ベクターおよび／まＩ；は
啼乳動物細胞発現ベクターにさらに再クローニングした
。

この方法の一例は、変異体Ｖ４３６Ｅの作成であり、こ
こで最初の文字は元のアミノ酸、番号は配列部位の番号
、および第二の文字はその部位の新しいアミノ酸を表し
ている： Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｙ！ｌ　Ａｒ（　Ｌｅａ　Ｔ
ｙｔＧＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＧＴＣ　ＡＧＡ　ＣＴＧ
　ＴＡＣ１４ＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　＋４２５Ｐｌ’５Ｅフ゜ライマー（５’
　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＧＣＣ
ＴＣ　］’）を用いた部位特異的オリゴヌクレ才チド誘
導性ミュータジエ不シスにより以下のものが得られる Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｕ　　ｋｒｌ　　
Ｌｅｕ　　ＴｙｒＧＡＧ　　ＧＣＴ　　ＣＡＴ　　ＧＡ
Ｇ　　ＡＧＡ　　ＣＴＧ　　ＴＡＣ４０５　　　　　　
　　　　　　目２Ｓ上記の変異は、診断用の制限酵素部
位が導入されるように考案された。ＰＰＳＥの場合には
、変異体ｃＤＮＡ頭城中にＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡ
ＴＧ＾）が導入された。これにより、変異体のスクリー
ニングが便利になり、多様な変異作成を組み合わせる場
合に変異の存在を追跡するのがさらに便利となる。表４
に列挙されている変化したプロテアーゼ領域を持つその
他の組み換え修飾ｔＰＡ分子をコードするベクターも表
４に示されたプライマーを用いて同様に構築される。

ＩＩｔＰＡ　ｃＤＮＡ構造の証明 Ｌ３Ｄ９Ｖ．　Ｄ３６８Ａ．　ＲＳ４６５．　４６６Ｌ
Ｐ；およびＡ４７６Ｓ変異は慣習的な制限酵素解析、塩
基配列決定、および／またはｉｎ　ｖｉＬｒｏ転写／翻
訳解析によって証明された。本発明の方法の応用で同定
された他の分子も現在検討中である。変異体をコードす
るタンパク質は理想的にはザイモグラ７イーで解析され
、正しい分子量を持つ分子によって望みの繊維素溶解活
性が生じているかを確認するために、野生型ＩＰＡのザ
イモグラフィーと比較する。

ベクターと形質転換 Ｓｐ６５−ｎ＋Ｉｆ’Ａ 次に、ＩＰＡ　ｃＤＮＡ配列を含むＢａ＋ｍ■Ｉ−Ｈｉ
ａｄｌｌｌ断片を、制限酵素切断とゲル電気泳動によっ
て上述のＭ１３＋ａｐ１８．ｍｌＰＡから理想的に単離
し、Ｂａｍｌｌｌ−Ｈｉｎｄｌ１１で消化し／：．ＳＰ
６５ベクター（プロメガ・バイオテク社から商業的に入
手可能）に連結する。この向き（ＣＤＮＡの５′末端は
ＳＰ６プロモーターに隣接している）によりｉｎ　ｖｌ
ｔｒｏ　ＲＮＡ合成およびｉｎ　ｖｉｔｒｏタンパク質
合成による変異体タンパク質産物の解析が可能となる。

ＳＰ６５．ｍＬＰＡベクターも挿入されたｃＤＮＡの操
作の間使用するには便利なベクターである。

ＬＫ４４１Ｂ［ＩＳ．ｍｔｌ’＾ 第１図に示されているこのベクターは以下のように構築
された。アンピシリン耐性遺伝子、復製開始点、および
ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列を含む細菌ベ
クター領域は、プラスミドＰＣＤ▼ｌ（岡山とバーグ（
Ｂｅｒｇ）．　（１９ｇ３）　Ｍａｔ．　Ｃｅｌｌ．　
Ｂｉｏｌ．３：　２８０）由来のものである。　これら
の配列は第１図のヌクレオチド４３２Ｇから６６００ま
でを含む。クローニング領域ポリリンカー（ヌクレオチ
ド４３００から４３２０）はＳＰ６４ポリリンカー（メ
ルトン（ＭｅｌｌｏＩ１）他、（１９ｇ４）　Ｈａｃｌ
．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　Ｉ２：　７０３５）由来のも
のである。プロモーター、キャップ部位、Ｓ′非翻訳領
域および最初のイントロンは、ヒトベータアクチンをコ
ードする遺伝子由来のものである（第１図のヌクレオチ
ドＩから４３Ｎ）。この遺伝子はヌグ（Ｎ！）他、Ｍｏ
ｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　５：　０２０　（１９
８５）に記述されている。不才マイシン転写ユニット（
ヌクレ才チド６　６　０　０　カら１０，０００）ハＳ
Ｖ４０複製開始点と前期プロモーターに連結している細
菌性ネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる（サザン（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ）とバーグ（Ｂｅｒｇ）、Ｊ．　Ｍｏｌ
．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　ｌ：　３２７（＋９１
１２））。

第１図に関して、変異を導入したｃ　ＤＮＡ分子は以下
のようにＬＫ４４４８ＨＳベクターに便利に再クローニ
ングされる。新しいｍｔＰＡをコードするｃＤＮＡを含
むＢａ＋＊ＨＩ一旧ｎｄｌｌｌ断片を制限酵素切断とゲ
ル濾過によってＳＰ６５．＋ｓＬｆ’Ａから単離する。

この断片をＢｉｍＢｌ旧ｎｄｌ！！で消化したベクター
ＬＫ４４４Ｂ［ＩＳに連結する。

これにより、ヒトＩ−アクチンプロモーターによって制
御されて、ｃｏｓｙ細胞系中でｌ　ＰＡＷ似体の一時的
な発現が可能となる。

ｃｏｓｔａｌ胞のトランスフェクション有利に使用され
る一過性発現系では、発現ベクター（ＬＫ４４４ＢＨＳ
．ａｌＰ▲）が＾ＴＣＣに＃ＣＲＬＩ６Ｓｌとして寄託
されているＣＯＳ７細胞のトランスフエクションに用い
られる。外来ＤＮＡを導入して２、３日後、培養物中の
培地を分析して分泌されｔ；修飾ＬＰＡタンパク質の活
性を解析する。この過程は以下のように行う。

トランス７エクションに先立ち、ＤＭＥＭ＋ＩＯ％グル
タミン中、１００ｍｍプレート中で１日、３ＸｌＧ’細
胞を培養する。ＩＯから２０ＢのＤＮＡを２．０１のト
リス緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）に加え、この溶液
にｌＩｌｌの２腸ｇ／ｍｌ　ＤＥＡＥ−デキストラン（
５Ｇ＋ｕのＤＥＡＥ−デキストランヲ２５＋ａｌのＴＢ
Ｓに加えて、トランスフェクションの直簡に調製する）
を添加する。細胞を２回、リン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で洗浄し、トランスフエクション溶液を加える。

細胞を３７℃で１５〜３０分間インキユベートし、デキ
ストラン溶液を除き、細胞を再度ＰＢＳで２回洗浄する
。この溶液を次に１０１のＤＭＥＭ培地（無血清）と１
００１のクロロキン（１ＧＩＩＩＭ）を合わせたもので
置き換える。細胞を３７℃で４時間インキュベートＩ，
、ＰＢＳによって２回洗浄し、ＧＩＴ無血清培地（１０
＋ｓ１）で培養する。

ＣＬｌｌ３ＡＸＳＶ２ＤＩＩＦＲ 第２図に示されているこのベクターは、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ転写ユニットから構築されており、ＳＶ４　
０前期領域グロモーター、マウスＤ［ＩＦＲ遺伝子、お
よびＳＶ４ｆｌスモールＴイントロンおよび前期領域ポ
リアデニル化シグナル配列からなる（レディ−（Ｒｅｄ
ｄｙ）他、ＤＮＡ　６：４６１　（ｎｏ））。コレラノ
配列は第２図のヌクレオチド！から１９２５を含んでい
る。ｐＭＬベクターの細菌性ブラスミド配列（ラスキー
（Ｌｕｓｋｙ）とポッチャム（Ｂｌｅｈｘｍ）、ＮｓＬ
ｕｒｅ　０３：　７９　（１９８２））はヌクレオチド
２２０１から４５４２を与える。この配列はアンビシリ
ン耐性遺伝子と細菌の複製開始点をコードしている。メ
タロチオ不インプロモーター（ベクターのヌクレオチド
４５４２から７５１０は、マウスのメタロチオネイン−
１遺伝子からイントロンとポリＡ配列を除いたものに由
来している（グランビレ（Ｇｌａｎｖｌｌｌｃ）他、Ｎ
ｉｔｕｒｅ　２９２：　２６７　（１９Ｎ）；　ハマー
（ａ＊ｍｅｒ）とワリング（Ｌｌｌｉｎｇ）、Ｊ．　Ｍ
ｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｉ：　２７３　（
１９Ｂ２））。Ｓ１４０前期領域ポリアデニル化シグナ
ル配列は、レディー他、１９７８に記述されているベク
ターに由来している。これらの配列は第２図のヌクレオ
チド７５ｌ４から７７５１である。

Ｍｌ３ｉ＋ｐ１ｇ．ｍｔＰＡ　ｔＰＡ　ｃＤＮＡはＳａ
ｌｔで制限酵素消化して、Ｘｈｏｌで切断したベクター
に再クローニングすることが出来る。ｔＰＡ　ｃＤＮＡ
あるいはその変異体の向きはメタロチオネインプロモー
ターにより発現が行われるようにする。ＣＬ［Ｉ３ＡＸ
ＳＶＩＤＨＦＲ．ＩＩＬＰＡベクターは、メトトレキセ
ート増幅の能力を持ったＣＩＩＯ細胞中でｌｌＩｔ！’
Ａの安定な発現のために使用される。ＤＨＦＲ−ｃＨＯ
Ｊａｌのトランス７エクションＤＩＩＫＸ　Ｃ■０細胞
はコロンビア大学（ニューヨーク）のローレンス・チェ
イシン（Ｌｉｖｒｅａｅｅ　Ｃｈｓｓｉａ）から入手し
た。この細胞はジヒドロ葉酸レダクターゼが欠損してい
る。この遺伝子はベクターＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤｌｌＦ
Ｒには存在する。細胞をトランスフエクシッンの２４時
間前に、ｌ００ｌＩｍシャーレあｌこり７ＸＩＧ’細胞
の密度で、アルファプラス培地１０％　ＦＢＳ．　１％
グルタミン培地中にまく。０．５ｉ＋１　　トランス７
エクシコン緩衝液（組成は総体積ＳＯＯｍ１当たり、４
１　ＮｓＣｌ，　Ｑ．Ｉｇ５ｇ　ＫＣＩ，　０．０５ｇ
　ＮｓｚＨＰＯ，，　０．５ｇデキストロース、２．５
ｇ　［ｌＥＰＥＳ，　９■７．５）中、ブラスミドは１
００−ＳＯｍｇとする。上記の溶液に３０ｍｌの２Ｍ　
ＣａＣｌ２を加え、その混合液を室温で４５分間平衡化
させる。培地をディソシュから除き、細胞をＰＢＳで２
回洗浄し、ＤＮＡ溶液を細胞に加える。細胞を室温で２
０分間インキユベートする．５ｍｌの培地を加え、細胞
を４時間３７℃でインキユベートする。培地を除去し、
トランス７エクション緩衝液中の１５％グリセロールで
、３７℃で３。５分間処理して細胞にショックを与える
。４８時間後、細胞を理想的には１：３に分け，０．０
２ｏ＋Ｍメトトレキセートを含む選択培地を与える。旭
理に対して生き残る細胞のコロニーはトランス７エクシ
ョン後１Ｇから１４日後に現れる。その後に、報告され
ている方法にしたがってメトトレキセート濃度を上げて
選択されたコロニーを増幅させることができる（例えば
、マイケル（Ｍｉｃｈｅ１）他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｂ＋＋
ｏｌｏｔｙ　３．　５６１　（ＤＨ）；　り冫ゴールド
（Ｒｉａｇｏｌｄ）の米国特許第４，６５６，Ｈ４号）
。これらの細胞に産生されＩ；修＠　ＩＰＡタンパク質
は既知の方法で精製することができる（ラ才（Ｌ！Ｉ１
）他、Ｂｉｏ／Ｔｅｅｈａｏｌｏｇｙ　Ｓ，　９５３　
　（１９８７））。

ＣＬ［！３ＡＸＢＰｖ．ｍｊＰＡ 第３図に示されているベクターは、Ｂｓｄｌ断片として
直鎖状にされ、且つ一方の粘着末端がＳａｉ１部位に変
換された全長のウシバビロマウイルス（ＢＰＶ）ゲノム
かも構築された（レディー他、１９８７）。

これらの配列は図示されたベクターのヌクレオチドＩか
ら７９４５を含む。アンビシリン耐性遺伝子および細菌
の復製開始点をコードするｐＭＬ由来の細菌プラスミド
配列（ラスキーとポッチャム、ｌ９８１）はヌクレオチ
ド７９４５からＩ　Ｏ　２　Ｒ　６である。メタロチオ
不インプロモーターはグランビル他（１９ｇ＋）ｊ−；
よびハマーとウ才り冫グ（ＮＵ）に示されｔこベクター
由来のものである。この配列は、ＣＬＩｌ３ＡＸＢＰＹ
のヌクレオチド１０２０から１３２０に見いだされる。

Ｓｖ４０前期ポリ人配列（レディー他、１９０）はヌク
レ才チドＩＨ８６から１３５２９に見られる。

ＳＰ６５．ｍＬＰＡ　ｃＤＮＡｌ！　Ｓａｌｉで制限酵
素消化し、断片をゲルからの精製で単鵡することができ
る。Ｓ！ＩＩ断片はＸｈｏｌで切断したベクターＣＬＨ
３ＡＸＢＩ’Ｖに連結スルコトカテキ、ＣＬｔｌ３ＡＸ
ＢＰＶ．＋＊ｔ　ＰＡを形成する。挿入されｔ；配列が
ＣＩ２７細胞中のメタロチオネインプロモーターの影響
下に置かれるように向きを有利に決定し、選択する。

Ｃ１２７細胞のトランス７エクション 次に、既に報告されているジン（Ｈｓｉｕｓ１）他、Ｊ
．Ｍｏｌ．＾ｐｐｌ．　Ｇｅｎ１ｔｉｃｓ　２、４９７
　（＋９８４）の方法に従って、調製しｆ：　ＣＬＨ３
ＡＸＢＰＹ．ｍＬＰＡ　ＤＮＡテ？　ウ７．　ＣＩ２７
細胞をトランスフエクトする。

修飾ＩＰＡタンパク質は既に報告されている方法（ラオ
他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ＠ｏｌｏ（ｙ　５、９５３　（＋
９８７））によって培養後の培地から精製することがで
きる。

修飾ｔＰ＾のア／セイ 培養後の培地中のｍｔＰＡタンパク質の定量は、アメリ
カン・ダイアグノスティカ社（米国コネチカット州グリ
ニッチ）から販売されているＥＬＩＳＡキットで行った
。抗体のコーティングおよび検出はヤギ抗ヒトＩＰＡ　
ＩｇＧでを用いＩ；。

活性は、ブラスミノーゲン活性化速度に関する既知の分
光学的アッセイによって理想的に決定された（７エルハ
イジェン（Ｖｅｒｂｅｉｊｅ＋＋）他、Ｔｂｒｏｏ＋ｂ
．｝１ａｅｍｏｓｔａｓ．　４８，　２６６　（１９Ｎ
））。アッセイで測定された吸光度変化はＷ■０黒色腫
ＩＰＡ［準品を参考にしてユニットに変換する。ｍｔＰ
Ａタンパク質の非活性はユニット数をＥＬＩＳＡアッセ
イで決定した夕冫パク質のｍｇ数で割って算出すること
ができる。

フィブリン親和性アツセイ あるいは、　不ルス（ＮＣｌｌｅｓ）他、（１９８７）
　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｗ．　２６２、１０ｇ５５
に述べられている方法を、新しいｍ［　ＰＡ分子のフィ
ブリンにたいする親和性の決定に用いることができる。

薬学的応用 本発明のｍｊ　ＰＡは、例えば生理食塩水などの薬学的
に受け入れられる基剤物質と混合して、経口的、静脈注
射で、あるいは心臓患部の動脈への注射などで投与する
ことが可能である。一般的に、投与は現在用いられてい
る血栓溶解酵素、認可されているｌ　ＰＡ，ストレプト
キナーゼ、およびウロキナーゼと同様に行われる。

本発明のｎｆＰＡは、例えは手術後の患者、血栓に起因
する心筋梗塞を最近起こした患者、静脈血栓症患者など
の塞栓症の処置が必要なヒト患者の血栓を溶解させるた
めに治療的に使用することできる。以下に例を挙げる。

実施例ｌ 丸薬注射による塞栓症の緊急治療のｊこめに、５ｌＱｍ
ｇ程度の治療的に有効量の凍結乾燥ＩｍｔＰＡを生理食
塩水と混合し、シリンジ中に入れ、患者にｍｊＰＡ丸薬
を静脈注射するのに使用する。

実施例２ 血栓症の迅速な溶解のための注射治療のためには、約ｌ
ｏｎｇ／ｈｒの凍結乾燥したｍＬＰＡを約１時間以上静
脈内に注入し、その後に約３時間以上の期間約ＳＯｍｇ
／ｈｒを静脈内注入する。

実施例３ 血栓症の迅速な注入治療のために、生理食塩水内約１０
Ｂの＋ｓｊＰＡ丸薬の静脈内注射を注入の前に行う以外
は実施例の方法で行う。

実施例４ 静脈血栓症の緩やかな溶解のための注入治療には、生理
食塩水に溶解した凍結乾燥ｍＬＰＡを約１５ｍｇ／ｂｒ
の濃度で約１２−２４時間、静脈中に注入する。

上述の例は、単なる代表的な例であって、選択したそれ
ぞれのｍｔＰＡの個々の繊維素溶解特性により多様性が
生じることは、本分野の技術に熟達したものは、容易に
理解するであろう。本発明の本質または範囲から外れる
ことなくここで述べたことを基礎として多数の修飾がな
されることも明らかであり、特別にではあるが制限する
ものではなく、本発明のｍｔＰＡはｉｎ　ｖ目『０アッ
セイやおそらくｉｎ　ｖｉｖｏ画像化応用などを含む診
療目的にも使用されるであろうし、さらに、適用の本質
または範囲から外れることなくさらなる修飾もなされる
であろう。

組織ブラスミノーゲン活性化因子（ｔＰ＾》とウロキナ
ーゼ（ＵＫ）プロテアーゼ領域のアミノ酸配列比較 ＴＰ＾　　： υＫ： ＩＫＧＧＬＦＡＤ［＾Ｓ　ＩＩ　Ｐ阿Ｑ＾ΔＩ　Ｆ　Ａ
　Ｋ　ＩＩ　Ｒ　Ｒ　Ｓ　Ｐ１−ＧＧＥＦＴＴＩＥＮＱ
Ｐｉ八＾Ｉ　Ｙ　Ｒ　Ｒ　ＩＩ　Ｒ　Ｃ（：　Ｅ　Ｒ　
Ｆ　Ｌ　Ｃ　（：　Ｇ　ｒ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ｓ　Ｃ　Ｗ　
Ｉ　Ｌ　Ｓ　Ａ　Ａ　ＩＩ　Ｃ　Ｆ　Ｑ　Ｅ　Ｒ　Ｆ　
Ｐ　Ｐ　ＩＩ　Ｉ＋ＳＶＴＹＶＣＧＧＳＬＩＳＰＣ４Ｖ
ＩＳＡＴＩＩＣＦＩＤＹＰＫＫＥＤＬＴＶ　ＩＬＧＲＴ
ＹＩＩＶＰＧＥＥＥＱＫＦＥＶＥＫＹ　ＩＶＩＩＫＥＦ
ＹＩＶＹＬＧＲＳＲＬＮＳＮＴＱ（：ＥＭＫＦＥＶＥＮ
ＬＩＬＩＩＫＤＹＤＤＤＴＹＤ ＳＡＤＴＬ＾１１１１ ＮＤＩ＾ＬＬＱＬＫＳＤＳＳＲＣＡＱＥＳＳＶＮＤ　［
ＡＬＬＫ　ＩＲＳＫＥＧＲＣＡＱＰＳＩＩＴＶ　Ｉｔ　
Ｔ　Ｖ　Ｃ　Ｌ　Ｐ　Ｐ　Ａ　Ｄ　Ｌ　Ｑ　Ｌ　Ｐ　Ｄ
　Ｗ　Ｔ　Ｅ　Ｃ　Ｅ　Ｌ　Ｓ　Ｇ　Ｙ　Ｇ　Ｋ　Ｉｔ
　Ｅ　Ａ　Ｌ　ＳＩＱＴ　ＩＣＬＰＳＭＹＮＤＰＱＦＣ
ＴＳＣＥＴＴＧＦＧＫＥＮＳＴＤＰ　Ｆ　Ｙ　Ｓ　Ｅ　
Ｒ　Ｌ　Ｋ　Ｅ　Ａ　１１　Ｖ　Ｒ　Ｌ　Ｙ　Ｉ’　Ｓ
　Ｓ　Ｒ　Ｃ　Ｔ　Ｓ　Ｑ　ＩＩ　Ｌ　Ｌ　Ｎ　ＲＹ　
Ｌ　Ｙ　Ｐ　Ｅ　Ｑ　Ｌ　Ｋ　Ｈ　Ｔ　Ｖ　Ｖ　Ｋ　Ｌ
　Ｉ　Ｓ　Ｉｔ　Ｒ　Ｅ　Ｃ　Ｑ　Ｑ　Ｐ　Ｉｔ　Ｙ　
Ｙ　Ｇ　ＳＴ　Ｖ　Ｔ　Ｄ　Ｎ　Ｍ　Ｌ　Ｃ　Ａ　Ｇ　
Ｄ　Ｔ　Ｒ　Ｓ　（；　Ｇ　Ｐ　Ｑ　Ａ　Ｎ　Ｌ　ＩＩ
　Ｄ　Ａ　Ｃ　Ｑ　Ｇ　Ｄ　Ｓ　Ｇ　（；ＥＶＴＴＫＭ
ＬＣＡＡＤＰＱＷＫＴ−−−−−−ＤＳＣＱＧＤＳＧＧ
八一旦 子宮ブレブロｔｐ＾の核酸およびアミノ酸配列＝１９０
　　　　　　　　　　　５００　　　　　　　　　　　
５１０ｒ’ＬＶｃＬＮＤＧＩＩＭＴＬｌ：　ｒ　ＩＳＷ
ＧＬＧＣＩ；ＱＫＤＶＰＧＰＬＶＣＳＬＱＧＲＭＴＬＴ
Ｇ　ＩＶＳ［ＲＧＣＡＬＫＤＫＰＣ八ＣＡＣＴＴＣ（；
ＴＴＡＧＴＡＣＣＴＡＣ（；ＴＴＣ Ｅ ＾ ■ Ｈ Ｄ ＾ Ｈ Ｋ Ｒ Ｇ Ｌ Ｃ Ｃ ■ Ｌ Ｌ し Ｃ Ｇ ＶＹＴＫＶＴＮＹＬＤＷＩＲＤＮＭＲＰＶ　Ｙ　Ｔ　Ｒ
　Ｖ　Ｓ　ＩＩ　Ｆ　Ｌ　Ｐ　Ｗ　Ｔ　Ｒ　Ｓ　ＩＩ　
Ｔ　Ｋ　ＥＴＣＣＡＴＧＣＣＣ（：ＡＴＴＣＡＧ＾＾（
；ＡＧＧＡ（；ＣＣＡ［；八ＴＣＴ−−Ｌ−−−−−−
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ＴＧＴＡＧＴＣＡＧＴＡＣＣＹ ｑ ■ ！ Ｃ Ｒ Ｄ Ｅ Ｋ Ｔ Ｑ Ｈ ■ Ｙ ｑ ｑ Ｈ Ｑ Ｓ Ｔ＾ ＋２４０ 八Ｔ Ｌ Ｒ Ｐ ■ Ｌ Ｒ Ｓ Ｎ Ｒ ■ Ｅ Ｙ Ｃ 縛 Ｃ Ｎ Ｓ Ｃ Ｒ ＾ Ｎ Ｙ Ｃ Ｒ Ｎ Ｐ Ｄ Ｒ ロ Ｓ κ Ｐ Ｃ Ｙ ■ Ｆ Ｋ ＾ Ｇ 八Ｃ（：ＧＴＣＣ：ＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴ（：八＾Ｉｌ
：ＡＧＴＣＴ品八Ｃｌｌ：ＡＣＣＣ κ Ｙ Ｓ Ｓ Ｅ Ｆ Ｃ Ｓ Ｔ Ｐ ＾ Ｃ Ｓ Ｅ Ｃ Ｎ Ｓ Ｄ Ｃ Ｙ ＾＾＾ＣＣＣｎＡＣＣＣＡＣＴＣＧＧ＾Ｆ Ｇ Ｎ Ｇ Ｓ ＾ Ｙ Ｒ Ｃ Ｔ Ｓ Ｌ Ｔ Ｅ Ｓ Ｃ ＾ Ｓ Ｃ ＧＡＧＧＩ；ＣＡＣＣＴＴＡＡ（：ＧＴＡＣＴＡＣＣΔ
ＣＴＡＴＣＣ（；ＴＴＣＣ＾＾＾ＴＧＴＣＴＣＧＴ（：
ＴＣＴＴ（：（：ＧＧＴＣＡＣＩ，ＣＬ Ｐ 縛 Ｎ Ｓ ■ Ｌ ■ Ｇ Ｋ ■ Ｙ Ｔ ＾ Ｑ Ｎ Ｐ Ｓ ＾ Ｑ ＾ Ｌ Ｃ Ｌ Ｃ Ｋ Ｎ Ｙ Ｃ Ｒ Ｎ Ｐ ロ Ｇ Ｄ ＾ Ｋ Ｐ 阿 Ｃ ■ Ｌ Ｋ Ｎ Ｒ Ｒ Ｌ ■ Ｅ Ｙ Ｃ Ｄ ■ Ｐ Ｓ Ｃ Ｒ ■ ■ Ｐ Ｇ Ｅ Ｅ Ｅ ｑ Ｋ Ｆ ［ ■ Ｅ Ｋ Ｙ ■ ■ Ｋ Ｓ Ｔ Ｃ Ｇ Ｌ Ｒ ｑ Ｙ Ｓ Ｑ Ｐ Ｑ Ｆ Ｒ ■ Ｋ Ｇ Ｇ Ｌ Ｆ ［ Ｆ Ｄ Ｄ Ｄ Ｔ Ｙ Ｄ Ｎ Ｄ ■ ＾ Ｌ Ｌ Ｑ し Ｋ Ｓ Ｄ Ｓ ＾ Ｄ ■ ＾ Ｓ ■ Ｐ 阿 ｑ ＾ ＾ ■ Ｆ ＾ Ｋ Ｒ Ｒ Ｓ Ｐ Ｓ Ｒ Ｃ ＾ Ｑ Ｅ Ｓ Ｓ ■ ■ Ｒ Ｔ ■ Ｃ し Ｐ Ｐ ＾ Ｄ し Ｇ Ｅ 代 Ｆ し Ｃ Ｇ Ｃ ｌ し Ｓ Ｓ Ｃ 一 Ｉ し Ｓ 八 ＾ Ｑ し Ｐ Ｄ ■ ■ Ｅ Ｃ Ｅ Ｌ Ｓ Ｇ Ｙ Ｃ Ｋ Ｅ 八 Ｌ Ｓ Ｃ Ｆ Ｑ Ｅ Ｒ Ｆ Ｐ Ｐ Ｈ し Ｔ ■ ■ Ｌ Ｇ Ｒ ■ Ｙ Ｐ Ｆ Ｙ Ｓ Ｅ Ｒ Ｌ Ｋ Ｅ ＾ Ｈ Ｖ Ｒ Ｌ Ｙ Ｐ Ｓ Ｓ Ｒ Ｃ 去一二と Ｔ Ｓ Ｑ Ｌ Ｌ Ｎ Ｒ Ｔ ■ Ｔ Ｄ Ｎ Ｈ Ｌ Ｃ ＾ Ｇ Ｄ Ｔ （デーガン（Ｄｅｇａｎ）他による１９８６）ヌクレオ
チド γ』一乙煎＝一 プロペアチド ２２から１０８ ２９から Ｒ Ｓ Ｃ Ｃ Ｐ Ｑ 八 ■ し Ｄ 八 Ｃ Ｑ Ｃ Ｄ Ｓ Ｇ Ｃ Ｐ ／シグナル フィンガー領域 １３３から２４６ ９から４６ 成長因子領域 ２６８から３６７ ５４から８７ Ｌ ■ Ｃ Ｉ， Ｎ Ｄ Ｃ Ｒ Ｈ Ｔ Ｌ ■ Ｇ ■ ■ Ｓ Ｇ Ｌ Ｇ クリングル１領域 ３９１から６３４ ９５から１７６ クリングル２領域 ６５５から９００ １８３から２６４ プロテアーゼ領域 ９４３から１６９８ ２７９から５３０ Ｃ Ｇ Ｑ Ｋ Ｄ ■ Ｐ Ｇ ■ Ｙ Ｔ Ｋ ■ Ｔ Ｎ Ｙ Ｌ Ｄ ■ ［；ＣＡＣＴＧＴ丁ＧＴＡＣＩＩ：ＣＴＲ Ｄ Ｎ Ｈ Ｒ Ｐ傘 去−二［ Ｙ３７１Ｌ（ブライマ−１’Ｐ４と） ＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｂｒ　Ｌｅｕ＾ｓｐ＾３１１＾３１
）Ｌ３０９Ｖ （プライマーＰＰＩと） （：ｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｌ＋ｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
　（：ｌｙＧＡＴ　ＧＡＣ　ＡＣ灸旺ＣＣ＾Ｃ＾＾ＴＧ
＾Ｃ（：Ａ（：　　ＣＧ（：　　ＴＴＣ　　ＧＴＴ　　
Ｔ（：Ｃ　　［；ｆ；Ｇ　　ＧＧｅＵ里■（プライマー
ＰＰＳＥと） Ｇｌｕ＾Ｉａ　ｔｌｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｙｒ邸μ川（ブライマーｒ’Ｐ２と） Ｃｙｓ　Ｉ”ｈｅ　Ｇｌｎ　ｂ且＾ｒｇ　Ｐｈｅ　Ｉ’
ｒｏ（：ＡＧ　　ＧＣＴ　　ＣＡＴ　　ＧＡＧ　　八Ｇ
Ａ　　ＣＴ（１；　　ＴＡＣＴ（：Ｃ　　ＴＴＣ　　Ｃ
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（ブライマーＰＰ５Ｑと》 Ｇｌｕ＾Ｉａ　Ｉｒｉｓ　（；Ｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　
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ＧＡＴ四月１（ブライマーＰＩ’ｌｌＤと） Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　知且Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
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【図面の簡単な説明】

第１図は、新しいｍｔＰ＾をＣＯＳ細砲中で発現させる
ための発現ベクターＬＫ４４４ＢＨＳを示している。 第２図は、新しいｓｔＰ＾をＣＩＩＯ細胞中で発現させ
るための発現ベクターＣ　Ｌ　１＋３＾ＸＳＶ２ＤＩＩ
ＦＲを示している。 第３図は、新しいＩＰ八をＣ１２７細胞で発現させるた
めの発現ベクターＣＬＩ１３八Ｘ［ｉＰＶを示している
。 （外４名） １．工−Ｌ５ 第 ロ ２２００　　５？ＩＬ１ ＢａｍＨＩ　Ｈ２５ ＥｃｏＲＩ 手 続 袖 正 書（方式） 平成 ２年 ５月ユダ日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然組織プラスミノーゲン活性化因子の繊維素溶
   解様（ｆｉｂｒｉａｅｌｙｔｉｃ−ｌｉｋｅ）活性を有
   する組み換えポリペプチドであって、該組み換えポリペ
   プチドをコードする核酸配列が天然に存在するｔＰＡ配
   列のプロテアーゼ領域を変化させた核酸配列を含んでい
   るもの。
2. （２）プロテアーゼ領域中の該変化により、天然に存在
   するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子のプロテ
   アーゼ領域をコードする核酸配列に対して一層相同性の
   ある配列が得られるものである請求項１記載のポリペプ
   チド。
3. （３）組み換えポリペプチドが、Ｌ３０９Ｖ、Ｅ３２９
   Ｄ、Ｄ３６８Ａ、Ｙ３７１Ｌ、Ｖ４３６Ｅ、Ｖ４３６Ｑ
   、Ｇ４６２Ｓ、Ｇ４６２Ｔ、Ｇ４６２Ｄ、Ａ４７６Ｓ、
   １４９９Ｖ、Ｇ５０６Ａ、Ｇ５０６Ｓ、Ｐ５１１Ｄ、Ｐ
   ５１１Ｎ、およびＲＳ４６５、４６６ＬＰからなる群か
   ら選択された配列によってコードされるポリペプチドか
   らなるものである請求項２記載のポリペプチド。
4. （４）修飾プロテアーゼ領域を含むｔＰＡ繊維素溶解様
   活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列であっ
   て、該核酸配列が以下の配列からなる群から選択された
   配列を含んでいるもの：【遺伝子配列があります】
5. （５）Ｎ−グリコシル化のシグナルであるＡｓａ−Ｘ−
   （ＳｅｒまたはＴｈｒ）をコードするＤＮＡ配列中のコ
   ドンの少なくとも一つと置換したコドンがさらに含まれ
   ていて、該置換したコドンがコードするアミノ酸により
   該シグナル部位でのグリコシル化が阻害される請求項４
   記載の配列。
6. （６）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
7. （７）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
8. （８）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
9. （９）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
10. （１０）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
11. （１１）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
12. （１２）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
13. （１３）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
14. （１４）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
15. （１５）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
16. （１６）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
17. （１７）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
18. （１８）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
19. （１９）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
20. （２０）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。
21. （２１）【遺伝子配列があります】 を含む請求項４記載の配列。