DK174236B1

DK174236B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et protein som har human vævsplasminogenaktivatorfunktion, fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat indeholdende proteinet, DNA-isolat, som koder for proteinet, rekombinante klonings- og ......

Info

Publication number: DK174236B1
Application number: DK198301988A
Authority: DK
Inventors: Gordon Allen Vehar; David Vannorman Goeddel; William Jack Kohr; Diane Pennica
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1982-05-05
Filing date: 1983-05-04
Publication date: 2002-10-07
Also published as: GB2119804B; IE831024L; AU563031B2; JP2564444B2; CA1293211C; EP0093619B1; DE3380567D1; EP0093619B2; BG60253B2; AU1414283A; IE54975B1; ZW10483A1; RO90639A; NO852065L; PT76636B; MY8700119A; PT76636A; DE3316297A1; DD210303A5; DE93619T1

Description

1 DK 174236 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har human plasminogenaktivator-funktion, fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat indeholdende proteinet, DNA-isolat, som koder for proteinet, rekombinante klonings- og ekspressionssvektorer indeholdende dette DNA, samt mikroorganisme eller cellekultur 5 transficeret dermed.

Opfindelsen bygger på erkendelsen af DNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens for human plasminogenaktivator. Denne erkendelse muliggjorde produktionen af human plasminogenaktivator ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi, hvilket igen 10 muliggjorde fremstillingen af materiale i tilstrækkelig kvalitet og mængde til at starte og gennemføre dyreforsøg og klinisk prøvning som forudsætninger for markedsgodkendelse, uhindret af de restriktioner, som nødvendigvis ligger i de hidtil anvendte isoleringsmetoder med produktion og ekstraktion for eksisterende cellekultur.

15 De publikationer og andre materialer, som anvendes til at belyse opfindelsens baggrund og i særlige tilfælde til at give yderligere detaljer vedrørende dens udøvelse, er af nemhedsgrunde sammenfattet i den vedføjede referenceliste, til hvis numre der henvises i den følgende tekst.

20 Opfindelsens baggrund A. Human vævsplasminogenaktivator

Det fibrinolytiske system er i en dynamisk ligevægt med koagulationssystemet og 25 opretholder et intakt, åbent vasculært leje. Koagulationssystemet aflejrer fibrin som en matrix, der tjener til at genoprette en hæmostatisk tilstand. Det fibrinolytiske system fjerner fibrinnetværket, efter at den hæmostatiske tilstand er opnået. Den fibrinolytiske proces frembringes af det proteolytiske enzym plasmin, som dannes ud fra et plasmaprotein-forstadium, plasminogen. Plasminogen omdannes til plasmin via aktivering 30 ved hjælp af en aktivator.

For tiden er to aktivatorer kommercielt tilgængelige, streptokinase og urokinase. Begge er indiceret til behandling af akutte vasculære sygdomme, såsom hjerteinfarkt, apoplexi, lungeemboli, dyb venethrombosfs, perifer arteriel occlusion og andre venøse thromboser.

35 Tilsammen udgør disse sygdomme en overvejende sundhedsrisiko.

Den etiologiske basis for disse sygdomme peger på enten en delvis eller i alvorlige tilfælde en total occlusion af en blodkar med en blodprop - thrombus eller thromboembolus.

Traditionel antikoagulantterapi, som f.eks. med heparin og coumarin, gør intet for direkte 40 at forhøje opløsningen af thrombi eller thromboemboli. De tidligere omtalte thrombolytiske midler, streptokinase og urokinase, har nydt praktisk og effektiv anvendelse. Imidlertid har hver af dem alvorlige begrænsninger. Ingen af dem har en høj affinitet for fibrin; og som følge deraf aktiverer de begge cirkulerende og flbrinbundet plasminogen uden større skelen. Det plasmin, som dannes i cirkulerende blod, neutraliseres temmelig hurtigt og går f 2 DK 174236 B1 tabt for nyttig thrombolyse. Resterende plasmin vil nedbryde flere koaguleringsfaktorproteiner, f.eks. fibrinogen, faktor V og faktor VIII, hvorved de frembringer et hæmorrhagisk potentiale. Desuden er streptokinase stærkt antigent, og patienter med høje antistoftitere reagerer utilstrækkeligt på behandling og kan ikke 5 forblive under kontinuerlig behandling. Urokinaseterapi er dyr, da den involverer isolering af urokinase fra human urin eller vævskultur, og den er derfor ikke alment accepteret inden for klinisk praksis. Urokinase har været genstand for talrige undersøgelser; se f.eks. referencerne 1-6.

10 Såkaldte plasminogenaktivatorer er blevet isoleret fra forskelligt humant væv, f.eks. uterusvæv, blod, serum (se alment referencerne 7-11) og fra cellekultur (reference 94). Sammensætninger deraf er også blevet beskrevet (referencerne 12, 13). Se også referencerne 14-18. Plasminogenaktivatorerne afledt fra disse kilder er blevet klassificeret i to hovedgrupper: plasminogenaktivatorer af urokinase-type (u-PA) og 15 plasminogenaktivatorer af vævstype (t-PA) baseret på forskelle i deres immunologiske egenskaber. (Forkortelserne t-PA og u-PA er dem, som er foreslået ved det XXVIII møde i den internationale komité vedrørende thrombosis og hæmostatisk, Bergamo, Italien, 27. juli 1982).

20 For nylig er der blevet identificeret en human melanomalinje, som secernerer t-PA.

Karakterisering af denne melanomaplasminogenaktivator har vist, at den hverken kan skelnes immunologisk eller med hensyn til aminosyresammensætning fra den plasminogenaktivator, som isoleres fra normalt humant væv (19, 88).

25 Produktet blev isoleret i relativt ren form, karakteriseret og fundet at være et højaktivt fibrinolytisk middel (20).

Flere undersøgelser (f.eks. referencerne 95-98), som anvendte t-PA renset fra melanoma-cellelinjen, har vist dens højere affinitet for fibrin sammenlignet med plasminogenaktiva-30 torer af urokinase-type. Mere intensive undersøgelser af human t-PA som potentielt thrombolytisk middel er imidlertid blevet forhindret af dens yderst lave koncentration i blod, vævsekstrakter, blodkarperfusater og cellekulturer.

Det er blevet forudset, at anvendelsen af rekombinant-DNA- og dermed forbundne 35 teknologier ville være en højst effektiv måde til fremstilling af de nødvendige store mængder human vævstypeplasminogenaktivator af høj kvalitet (tidligere betegnet som human plasminogenaktivator), som er i hovedsagen fri for andet humant protein. Sådanne materialer ville sandsynligvis udøve bioaktivitet, som ville tillade deres anvendelse klinisk til behandling af forskellige cardiovasculære tilstande eller sygdomme.

40 B. Rekombinant-DNA-teknologi

Rekombinant-DNA-teknologien er nu så gammel, at den har nået en vis forfinelse.

Molekylærbiologer er i stand til at rekombinere forskellige DNA-sekvenser med nogen f 3 DK 174236 B1 lethed og skabe nye DNA-enheder, som er i stand til at producere rigelige mængder exogent proteinprodukt i transformerede mikroorganismer eller cellekulturer. De almene midler og fremgangsmåder er for hånden til in vitro ligeringen af forskellige stumpendede eller kohæsivt endede fragmenter af DNA, hvorved der produceres kraftige 5 ekspressionsmedier, som er nyttige til transformation af bestemte organismer, således at de dirigeres til effektiv syntese af et ønsket exogent produkt. Hvad angår det individuelle produkt, forbliver vejen imidlertid noget omstændelig, og videnskaben er endnu ikke nået frem til et stadium, hvor der kan foretages regulære forudsigelser af held. Faktisk løber de, der påberåber sig heldige resultater uden den underliggende forsøgsbasis, en betydelig 10 risiko for manglende gennemførlighed.

DNA-rekomblnation af de nødvendige elementer, dvs. et repliceringsorlgin, en eller flere fænotypiske selektionsegenskaber, en ekspressionspromotor, en heterolog genindsætning og resterende vektor, gennemføres almindeligvis uden for værtscellen. Det resulterende 15 rekombinante replicerbare ekspressionsmedium, eller plasmidet, indføres i celler ved transformation, og store mængder af det rekombinante medium opnås ved dyrkning af transformanten. Hvor genet er rigtigt indsat med hensyn til dele, som styrer transkriptionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, er det resulterende ekspressionsmedium nyttigt til faktisk at producere den polypeptidsekvens, for hvilken det 20 indsatte gen koder, en proces, der betegnes som ekspression. Det resulterende produkt kan opnås ved lysering, om nødvendigt, at værtscellen i mikrobielle systemer og udvinding af produktet ved passende rensning fra andre proteiner.

I praksis kan man ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi udtrykke helt heterologe 25 polypeptider, såkaldt direkte ekspression, eller den kan alternativt udtrykke et heterologt polypeptid sammensmeltet med en del af aminosyresekvensen af et homologt polypeptid.

I de sidstnævnte tilfælde gøres det ønskede bioaktive produkt sommetider bioinaktivt i det sammensmeltede, homologt/heterologe polypeptid, indtil det spaltet i et ekstracellulært miljø (21, 22). 3T

30 ·· På lignende måde er teknikken for celle- eller vævskulturer til undersøgelse af genetik og cellefysiologi veletableret. Der rådes over midler og fremgangsmåder til opretholdelse af permanente cellelinjer, fremstillet ved successive rækkeoverførsler fra isolerede normalceiler. Til brug i forskningen holdes sådanne cellelinjer på en fast bærer i et 35 væskemedium eller dyrkes i suspensionen indeholdende understøttende næringsstoffer. Opskalering til fremstillinger i stor målestok synes kun at frembyde mekaniske problemer. Yderligere baggrundsviden kan f.eks. fås fra referencerne (23) og (24).

Ligeledes er proteinbiokemi et nyttigt og i virkeligheden nødvendigt tilbehør til 40 bioteknologien. Celler, der producerer det ønskede protein, producerer også hundreder af andre proteiner, endogene produkter af cellernes metabolisme. Disse forurenede proteiner såvel som andre forbindelser kunne, hvis de ikke fjernes fra det ønskede protein, vise sig toxiske, hvis de indgives et menneske eller dyr under forløbet af en terapeutisk behandling med det ønskede protein. Derfor kommer teknikkerne inden for proteinbiokemien til deres 4 DK 174236 B1 ret, idet de muliggør udformningen af separationsprocedurer, som er egnet for det bestemte omhandlede system og giver et homogent produkt, som er sikkert for den påtænkte anvendelse. Proteinbiokemien giver også veje til at bevise identiteten af det ønskede produkt, idet de karakteriserer det og sikrer, at cellerne har produceret det 5 pålideligt uden nogen ændringer eller mutationer. Denne gren af videnskaben er også involveret i udformningen af bioprøvninger, stabilitetsundersøgelser og andre procedurer, som er nødvendige, før heldige kliniske undersøgelser og markedsføring kan finde sted.

Sammenfatning af opfindelsen 10

Opfindelsen bygger på den erkendelse, at rekombinant-DNA-teknologi kan anvendes med held til at producere human vævsplasminogenaktivator (t-PA), fortrinsvis i direkte form og i tilstrækkelige mængder til at starte og gennemføre dyreforsøg og klinisk prøvning som forudsætninger for markedsgodkendelse. Produktet, human t-PA, er i alle dets former 15 egnet til brug ved profylaktisk eller terapeutisk behandling af mennesker for forskellige cardiovasculære tilstande eller sygdomme.

Opfindelsen angår i et første aspekt en fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har human vævsplasminogenaktivator-funktion, og som især er i stand til at katalysere 20 omdannelsen af plasminogen til plasmin, det binder til fibrin og er klassificeret som en t-PA baseret på immunologiske egenskaber, kendetegnet ved ekspression i en rekombinant værtsorganisme af transformerende DNA, som koder for proteinet; hvor proteinet omfatter en sekvens på 527 aminosyrer fra N-terminal serin til C-terminal prolin i fig. 5, som kan kodes af cDNA, der er afledt af mRNA, som er ekstraheret fra Bowes-25 melanomcellelinjen, og som (a) har det i fig. 4 viste restriktionsmønster for den formodede modne vævsplasminogenaktivator-sekvens, og 30 (b) hybridiserer kraftigt med sekvenserne: (i) 5'-TCACAGTACTCCCA-3' (ii) 5'-TTCTGAGCACAGGGCG-3‘ (iii) et 4,2 kb langt PvuII-fragment fra humant genomisk DNA, som hybridiserer kraftigt med sekvensen 35 30 40 CGG GTG GAA TAT TGC TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CAC TCA 50 60 GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACC 40 66 TGC CAG CAG GCC CTG T.

I et andet aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har human vævsplasminogenaktivator-funktion, og som Især er i stand til at katalysere 45 omdannelsen af plasminogen til plasmin, det binder til fibrin og er klassificeret som en t-PA baseret på immunologiske egenskaber, kendetegnet ved ekspression i en 5 DK 174236 B1 rekombinant værtsorganisme af transformerende DNA, som koder for proteinet, hvor proteinet omfatter en allel eller et derivat som følge af aminosyredeletion, -substitution, -insertion, -addition eller -udskiftning af den i krav 1 definerede 527 aminosyrer lange sekvens.

5

Ved fremgangsmåden ifølge dette andet aspekt af opfindelsen kan værtsorganismen med fordel være mammal, f.eks. en kinesisk-hamster-ovarie-cellelinje, og fremgangsmåden kan inkludere isolering og oprensning af proteinet og eventuelt anvendelse af dette til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

10 I et yderligere aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat, som er kendetegnet ved at der anvendes et protein med vævsplasminogenaktivator-funktion fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

15 Ved at t-PA-produktet produceres af genetisk manipulerede mikroorganismer eller cellekultursystemer, åbnes der mulighed for at producere human vævsplasminogenaktivator på en meget mere effektiv måde end det tidligere har været muligt, hvilket åbner for en hidtil uigennemførlig kommerciel udnyttelse. Desuden kan den omhandlede humane vævsplasminogenaktivator, afhængigt af værtscellen, indeholde" 20 tilknyttet glycosylering I større eller mindre grad sammenlignet med nativt materiale. I hvert fald vil t-PA'en være fri for de forureninger, som normalt er forbundet med den i dens ikke-rekombinante cellulære miljø.

I yderligere aspekter angår opfindelsen et DNA-isolat, som koder for et protein som 25 fremstillet ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen; en rekombinant kloningsvektor indeholdende sådant DNA; en rekombinant ekspressionsvektor, som indeholder sådant DNA, og som er i stand til i en transformerende mikroorganisme eller cellekultur at udtrykke den kodende sekvens og producere det tilsvarende polypeptid; og en mikroorganisme eller cellekultur, som er transficeret med DNA, der koder for et protein, 30 der er fremstillet ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen, og er i stand til at udtrykke DNA 'et med henblik på at fremstille proteinet. Den transficerede mikroorganisme, f.eks. til kloningsformål, vil ofte være en E. coli stamme; mens den transficerede cellelinje med fordel kan være en pattedyrcellelinje, f.eks. en kinesisk-hamster-ovarie-cellelinje.

35 Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 1 viser en 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) af 35S-methionin-mærkede proteiner, som kan fældes med anti-t-PA-IgG secerneret fra melanoma-celler med og uden proteaseinhibitor.

40

Fig. 2 viser elektroforese af de immunofældede translationsprodukter af mRNA-fraktioner afledt fra melanomaceller.

6 DK 174236 B1

Fig. 3 viser hybridiseringsmønstret af 96 bakteriekolonier transformeret med cDNA under anvendelse af sammenhældningen af 32P-mærket 14-mer som sonde fremstillet på basis af en sekvens på 5 aminosyrer af human t-PA.

5 Fig. 4 er et restriktionsendonucleasekort af den fulde længde af humant t-PA-cDNA.

Fig. 5A, 5B og 5C viser nucleotidsekvensen og den afledte aminosyresekvens af den fulde længde af human t-PA-cDNA.

10 Fig. 6 er en skematisk afbildning åf konstruktionen af ekspressionsplasmidet pARIPA0.

Fig. 7 viser resultaterne af en fibrinpladeprøvning for fibrinolytisk aktivitet af E. coli celler transformeret med pARlPA0.

15 Fig. 8 er et HPLC-spor af peptider fra trypsinnedbrydning af human t-PA.

Fig. 9 viser konstruktionen af et plasmid, som koder for den direkte ekspression af moden humant t-PA i E. coli.

20 Fig. 10 viser resultaterne af en fibrinpladeprøvning for fibrinolytisk aktivitet af den humane t-PA produceret af E. coli transformeret med pt-PAtrpl2.

Fig. 11 viser konstruktionen af DHFR (mutant- eller vildtype)/t-PA, som koder for plasmider, der er egnet til at transformeres ind i pattedyrvævskulturceller.

25

Fig. 12 er et skematisk diagram af human vævsplasminogenaktivator fremstillet ved den metode, som er eksemplificeret i afsnit E. 1 i den følgende beskrivelse.

Detailbeskrivelse 30 A. Definitioner I denne beskrivelse skal "human vævsplasminogenaktivator" eller "human t-PA" eller "t-PA" betegne human plasminogenaktivator af vævstype produceret af mikrobielle eller 35 cellekultur-systemer i bioaktive former omfattende en proteasedel og svarende til de vævsplasminogenaktivatorer, som ellers er native for humant væv. Den her omhandlede humane vævsplasminogenaktivator er blevet defineret ved hjælp af det bestemte DNA-gen og deduktiv aminosyresekvensbestemmelse. Det vil forstås, at naturlige allele variationer eksisterer og forekommer fra individ til individ. Disse variationer kan påvises ved en eller 40 flere aminosyreforskelle i den samlede sekvens eller ved udeladelser, udskiftninger, indsætninger, ombytninger eller tilføjelser af en eller flere aminosyrer i sekvensen.

Desuden vil stedet for og graden af glycosylering afhænge af arten af værtscellemiljøet.

J* 7 DK 174236 B1

Der findes potentiel mulighed for ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi at fremstille forskellige humane vævsplasminogenaktivatorderivater, modificeret på forskellig måde ved resulterende udskiftning af en eller flere aminosyrer, udeladelser, tilføjelser eller udskiftninger, f.eks. ved hjælp af stedsdirigeret mutagenese af den grundliggende DNA.

5 Heri vil være inkluderet fremstillingen af derivater, som har bevaret det nødvendige "kringle"-område og serinprotease-område, der er alment karakteristisk for den her beskrevne humane vævsplasminogenaktivator, men i øvrigt er modificeret som beskrevet ovenfor. Alle sådanne allele variationer og modifikationer, som resulterer i derivater af human vævsplasminogenaktivator, er inkluderet i opfindelsens omfang, såvel som andre 10 beslægtede humane plasminogenaktivatorer af vævstypen, som ligner den fysisk og biologisk, så længe den nødvendige karakteristiske humane vævsplasminogenaktivator-aktivitet forbliver upåvirket i sin art.

Human vævsplasminogenaktivator fremstilles 1) med methionin som dens første 15 aminosyre (på grund af indsætningen af ATG-startsignal-codonen foran strukturgenet) eller 2) hvor methioninet er fraspaltet intra- eller ekstracellulært, med dens normale første aminosyre eller 3) sammen med enten dens signalpolypeptid eller et andet konjugeret protein end det konventionelle signalpolypeptid, hvor signalpolypeptidet eller konjugatet er specifikt fraspalteligt i et intra- eller ekstracellulært miljø (se reference 21), eller 4) ved 20 direkte ekspression i moden form uden nødvendigheden af at fraspalte noget fremmed, overflødigt polypeptid. Det sidste er særlig vigtigt, hvor en given vært eventuelt ikke eller ikke effektivt fjerner et signalpeptid, hvis ekspressionsmediet er udformet til at udtrykke vævspfasminogenaktivatoren sammen med dens signalpeptid. Den således producerede humane t-PA i dens forskellige former udvindes og renses i hvert tilfælde til et niveau, som 25 passer til dens anvendelse ved behandling af forskellige vasculære tilstande eller sygdomme.

Endvidere har t-PA former, som inkluderer både enkeltkæde (l-kæde)-proteinet og 2-kæde-proteinet. Det sidstnævnte afledes proteolytisk fra 1-kæde-forbindelsen. Teorien er, 30 at 2-kæde-proteinet er forbundet med produceret fibrin, og at den proteolytiske omdannelse fra 1- til 2-kæde-materiale sker ved locus for omdannelsen af plasminogen til plasmin. Opfindelsen tilvejebringer midler til indgivning af 1-kædeproteinet med henblik på in vivo omdannelse som netop beskrevet eller til Indgivning af 2-kæde-protein, som også er blevet påvist at være aktivt. 2-kæde-proteinet kan fremstilles ved in vitro proteolytisk 35 omdannelse, efter at l-kæde-materialet er produceret. Et såkaldt "kringle"-område er anbragt ovenfor serinproteasedelen og antages at have en vigtig funktion ved binding af den omhandlede vævsplasminogenaktivator til en fibrinmatrix; heraf den iagttagne specifikke aktivitet af vævsplasminogenaktlvatoren over for håndgribelige eksisterende thrombi. Den omhandlede vævsplasminogenaktivator produceres indeholdende den 40 enzymatisk aktive del svarende til natlvt materiale, og betegnelsen "human vævsplasminogenaktivator" definerer produkter omfattende en sidan portion alene eller sammen med yderligere aminosyresekvenser op til fuld-længde-molekylet.

8 DK 174236 B1

Sammenfattende har human t-PA siledes en funktionel definition; den er i stand til at katalysere omdannelsen af plasminogen til plasmin, bindes til fibrin og er klassificeret som en t-PA baseret pi immunologiske egenskaber som anført ovenfor.

5 Nar betegnelsen "hovedsageligt ren form" anvendes til at beskrive tilstanden af human t-PA produceret ifølge opfindelsen, betyder den fri for protein eller andre materialer, som normalt er forbundet med human t*PA, men den produceres af ikke-rekombinante celler, dvs. i dens "native" miljø.

10 "DHFR-protein" henfører til et protein, som er i stand til at udøve den aktivitet, som er forbundet med dihydrofolatreduktase (DHFR), og som derfor skal produceres af celler, der er i stand til at overleve på et medium, som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin (-HGT-medium). I almindelighed er celler, som mangler DHFR-protein, ude af stand til at vokse pi dette medium, men celler, som indeholder DHFR-protein, kan gøre det med held.

15 "Celler, som er følsomme for MTX" henfører til celler, som er ude af stand til at vokse på medier, der indeholder DHFR-inhibitoren methotrexat (MTX). "Celler, som er følsomme for MTX“ er således celler, der, med mindre de ændres genetisk eller suppleres på anden måde, ikke vil vokse under omgivelses- og mediumbetingelser, der er egnede for 20 celletypen, når MTX-koncentrationen er 0,2 pg/ml eller mere. Nogle celler, såsom bakterier, udviser ikke MTX-følsomhed, fordi de ikke tillader MTX inden for deres celleafgrænsninger, selv hvis de indeholder DHFR, som ellers ville være følsomme for dette middel. Ϊ almindelighed vil celler, der som deres DHFR-protein indeholder vild-type-DHFR, være følsomme for methotrexat, hvis de er permeable for eller i stand til at optage MTX.

25 "Vild-type-DHFR” henfører til dihydrofolatreduktase som almindeligvis findes i den pågældende organisme. Vildtype-DHFR er almindeligvis følsomt in vitro for lave koncentrationer af methotrexat.

30 "DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX" har en funktionel definition. Dette er et DHFR-protein, som, når det dannes inden i cellerne, vil tillade væksten af MTX-følsomme celler i et medium indeholdende 0,2 pg /ml MTX eller mere. Det erkendes, at en sådan funktionel definition afhænger af den lethed, hvormed organismen producerer "DHFR-proteinet med lav bindingsaffinitet for MTX" såvel som af proteinet selv. Anvendt i denne 35 opfindelses sammenhæng skulle en sådan balance mellem disse to mekanismer imidlertid ikke være besværlig. Opfindelsen opererer med hensyn til at tilføre evnen til at overleve disse niveauer af MTX, og det er ikke afgørende, om evnen til at gøre dette påvirkes af forøget ekspression foruden den iboende natur af den producerede DHFR.

40 Betegnelsen "ekspressionsvektor" inkluderer vektorer, som er i stand til at udtrykke DNA-sekvensen indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er operabelt forbundet med andre sekvenser, som er i stand til at frembringe deres ekspression. Det er underforstået, selv om det ikke altid udtrykkeligt anføres, at disse ekspressionsvektorer må være replicerbare i værtsorganismerne enten som episomer eller som en integral del af den chromosomale 9 DK 174236 B1 DNA. Det er klart, at mangel på replicerbarhed ville gøre dem effektivt inoperable. Alt i alt er "ekspressionsvektor" givet en funktionel definition, og enhver DNA’Sekvens, som er i stand til at frembringe ekspression af en specificeret DNA-kode anbragt deri, er inkluderet i denne betegnelse, som den anvendes på den specificerede sekvens. I almindelighed er 5 ekspressionsvektorer, som er nyttige inden for rekombinant-DNA-teknik, ofte i form af "plasmider", som henfører til cirkulære dobbeltstrengede DNA-løkker, som i deres vektorform ikke er bundet til chromosomet. I denne beskrivelse anvendes "plasmid" og "vektor" i samme betydning, da plasmidet er den mest almindeligt anvendte form for vektor. Imidlertid skal opfindelsen inkludere sådanne andre former for 10 ekspressionsvektorer, som tjener ækvivalente funktioner, og som herefter måtte blive kendt inden for teknikken.

"Rekombinante værtsceller" henfører til celler, som er blevet transformeret med vektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik. Som defineret her, produceres 15 t-PA i de mængder, som opnås ved denne transformation frem for i sådanne mindre mængder, eller mere almindeligt i sådanne mindre end sporbare mængder, som måtte produceres af den utransformerede vært. t-PA produceret af sådanne celler kan betegnes som "rekombinant tPA".

20 B. Værtscellekulturer og vektorer

De vektorer og fremgangsmåder, som er angivet i denne beskrivelse, er egnet til anvendelse i værtsceller over et bredt område af prokaryotiske og eukaryotiske organismer.

25 I almindelighed foretrækkes selvfølgelig prokaryoter til kloning af DNA-sekvenser ved konstruktion af de vektorer, som er nyttige for opfindelsen. F.eks. er E. coli K12 stamme 294 (ATCC No. 31446) særlig nyttig. Andre mikroorganismestammer, som kan anvendes, inkluderer E. colistammer, såsom E. coli B og E. coli X1776 (ATCC No. 315). Disse 30 eksempler skal selvfølgelig anses for at være belysende.

Prokaryoter kan også anvendes til ekspression. De førnævnte stammer såvel som E. coli W3110 (F ', λ", prototroph, ATCC No. 27325), bacilli, såsom Bacillus subtilus, og andre enterobacteriaceae, såsom Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og 35 forskellige pseudomonas-arter kan anvendes.

I almindelighed anvendes plasmidvektorer indeholdende replicon og kontrolsekvenser, som er afledt fra arter, der er forenelige med værtscellen i forbindelse med disse værter.

Vektoren bærer almindeligvis et repliceringssted såvel som markeringssekvenser, som er i 40 stand til at give fænotypisk selektion i de transformerede celler. F.eks. transformeres E. coli typisk under anvendelse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coli-art (Bolivar et al.,

Gene 2: 95 (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracydinresistens, og tilvejebringer således lette midler til identifikation af transformerede celler. pBR322-plasmidet eller et andet mikrobielt plasmid må også Indeholde eller modificeres til at 10 DK 174236 B1 indeholde promotorer, som kan anvedes af mikroorganismen til ekspression af dens egne proteiner. De promotorer, som anvendes mest almindeligt ved rekombinant-DNA-konstruktion, inkluderer D-lactamase-(penicillmase) og lactose-promotorsystemerne (Chang et al., Nature, 275: 617 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977); 5 (Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979)) og et tryptophan-(trp)-promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Adds Res., 8:4057 (1980); EP offentliggørelsesskrift nr. 0036776). Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, er der blevet opdaget og udnyttet andre mikrobielle promotorer, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser er blevet publiceret, hvilket sætter en fagmand i stand til at ligere dem funktionel med plasmidvektorer (Siebenlist et 10 al., Celle 20: 269 (1980)).

Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryotiske mikroorganismer, såsom gærkulturer. Saccharomyces cerevisiae eller almindelig bagegær er den mest almindeligt anvendte blandt eukaroytiske mikroorganismer, selv om et antal andre stammer er 15 almindeligt tilgængelige. Til ekspression i Saccharomyces er f.eks. plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979);

Tschemper et al-. Gene, 10: 157 (1980» almindeligt anvendt. Dette plasmid indeholder allerede trpl-genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, der mangler evnen til at vokse i tryptophan, f.eks. ATCC No. 44076 eller PEP4-1 (Jones, 20 Genetics, 85: 12 (1977)). Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som en karakteristisk egenskab ved gærværtscelle-genomet giver så et effektivt miljø til sporing af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.

Egnede promoteringssekvenser i gærvektorer inkluderer promotorerne for 3-phospho-25 glyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073 (1980)) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 (1978), såsom enolase, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphat-isomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatklnase, triosephosphat-isomerase, phosphoglucose-30 Isomerase og glucokinase. Ved konstruktion af egnede ekspressionsplasmider ligeres de med disse gener forbundne afslutningssekvenser også ind i ekspressionsvektoren på 3'-siden af den sekvens, som man ønsker at udtrykke, for at give polyadenylering af mRNA'en og afslutning. Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at transkrip-tionen er styret af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkoholdehydrogenase 2, 35 isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydningsenzymer forbundet med nitrogenmetabolismen og den førnævnte glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase samt enzymer, som er ansvarlige for maltose- og galactoseudnyttelse (Holland, ibid.). Enhver plasmidvektor indeholdende gærkompatible promotor-, repliceringsorigin- og afslutnings-sekvenser er egnet.

40

Foruden mikroorganismer kan også kulturer af celler afledt fra flercellede organismer anvendes som værter. I princippet er enhver sådan cellekultur anvendelig, hvad enten den er fra hvirveldyr eller hvirvelløse dyr. Imidlertid har interessen været størst for hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en 11 DK 174236 B1 rutineprocedure i de seneste år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. Eksempler på sådanne nyttige værtscellelinjer er VERO- og HeLa-celler, kinesisk-hamster-ovarie (CHO)-cellelinjer og W138, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinjer. Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et 5 repliceringsorigtn, en promotor anbragt foran genet, som skal udtrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindingssteder, RNA-splejsningssteder, et polyadenyleringssted og transkriptionsafslutningssekvenser.

Til brug i pattedyrceller tilvejebringes styringsfunktionerne på ekspressionsvektorerne ofte 10 ved hjælp af viralt materiale. F.eks. afledes almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2 og hyppigst abevirus 40 (SV40). Den tidlige og den sene promotor fra SV40 virus er særlig nyttige, fordi begge let opnås fra viruset som et fragment, der også indeholder det SV40-virale repliceringsorigin (Fiers et al., Nature 273; 113 (1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forudsat at der er inkluderet den sekvens 15 på omkring 250 bp, der strækker sig fra Hindlll-stedet hen imod Bgil-stedet lokaliseret i det virale repliceringsorigin. Endvidere er det også muligt, og ofte ønskeligt, at udnytte promotor- eller styringssekvenser, der normalt er forbundet med den ønskede gensekvens, forudsat at sådanne styringssekvenser er kompatible med værtscellesystemerne.

20 Et repliceringsorigin kan tilvejebringes enten ved konstruktion af vektoren, så den inkluderer et exogent origin, som f.eks. kan være afledt fra SV40 eller anden viral (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV osv.) kilde eller kan være tilvejebragt af den chromosomale værtscelle-repliceringsmekanisme. Hvis vektoren er integreret i værtscellechromosomet, er den sidstnævnte ofte tilstrækkelig.

25

Ved udvælgelse af en foretrukken værtscelle til transfektion med vektorerne ifølge opfindelsen, som omfatter DNAsekvenser, der koder for både t-PA og DHFR-protein, er det passende at udvælge værten i overensstemmelse med den anvendte type DHFR-protein.

Hvis der anvendes vild-typeDHFR-protein, foretrækkes det at vælge en værtscelle, som ér 30 deficient med hensyn til DHFR, hvilket tillader anvendelsen af DHFR-kodesekvensen som markør for heldig transfektion i et selektivt medium, der mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En passende værtscelle i dette tilfælde er kinesisk-hamster-ovarie (CHO)-cellelinjen, der er deficient mht. DHFR-aktivitet, og som fremstilles og formeres som beskrevet af Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sd. (USA) 77: 4216 (1980).

35

Hvis der på den anden side anvendes DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX som den styrende sekvens, er det ikke nødvendigt at anvende DHFR-deficiente celler. Da mutant-DHFR’en er resistent over for methotrexat, kan MTX-holdige medier anvendes som selektionsmidler, forudsat at værtscellerne i sig selv er methotrexat-føisomme. De fleste 40 eukaryote celler, som er i stand til at absorbere MTX, viser sig at være methotrexat-føisomme. En sidan nyttig cellelinje er CHO-linjen, CHO-KIATCC No. CCL 61.

Eksempler, som er anført nedenfor, beskriver anvendelse af E. coli under anvendelse af lac- og trp-promotorsystemet og anvendelse af CHO-celler som værtsceller, og 12 DK 174236 B1 ekspressionsvektorer, som inkluderer SV40-repliceringsoriginet som promotor. Imidlertid vil det ligge inden for faglig viden at anvende analog teknik til at konstruere ekspressionsvektorer til ekspression af de ønskede proteinsekvenser i alternative prokaryote eller eukaryote værtscellekulturer.

5

Tilfredsstillende mængder human t-PA produceret af cellekulturer, og senere raffinementer med anvendelse af en sekundær kodesekvens tjener til at forhøje produktionsniveauerne endnu mere. Den sekundære kodesekvens koder for dihydrofolatreductase (DHFR), som påvirkes af en externt kontrolleret parameter, såsom methotrexat, hvilket tillader styring 10 af ekspressionen ved styring af methotrexat (MTX)-koncentrationen.

C. Anvendte metoder

Hvis der anvendes celler uden formidable cellemembranbarrierer som værtsceller, udføres 15 transfektion ved calciumphosphat-fældningsmetoden som beskrevet af Graham and Van der Eb, Virology, 52: 456 (1973). Imidlertid kan der også anvendes andre metoder til indførelse af DNA i celler, som f.eks. kerneinjektion eller protoplastfusion.

Hvis der anvendes prokaryote celler eller celler, som indeholder væsentlige 20 cellevægkonstruktioner, er den foretrukne transfektionsmetode calciumbehandling under anvendelse af calciumchlorid som beskrevet af Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sd.

(USA), 69:2110 (1972).

Til konstruktion af egnede vektorer indeholdende de ønskede kode- og styringssekvenser, 25 anvendes standardligeringsteknik. Isolerede plasmlder eller DNA-fragmenter spaltes, skræddersys og genligeres I den ønskede form til dannelse af de nødvendige plasmider.

Spaltning gennemføres ved behandling med restriktionsenzym (eller -enzymer) i en egnet puffer. I almindelighed anvendes omkring Ιμς plasmid eller DNA-fragmenter med omkring 30 1 enhed enzym i omkring 20 μΙ pufferopløsning. (Passende puffere og substratmængder for bestemte re-striktionsenzymer er specificeret af producenten). Inkubationstider på omkring 1 time ved 37°C er anvendelige. Efter inkubationen fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og nucleinsyren udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol.

35

Hvis der kræves stumpe ender, behandles præparatet i 15 minutter ved 15°C med 10 enheder polymerase I (Klenow), phenol-chloroform-ekstraheres og ethanol-fældes.

Størrelsesseparationen af de spaltede fragmenter gennemføres under anvendelse af 6% 40 polyacrylamidgel som beskrevet af Goeddel, D., et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

Til ligering behandles tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af de ønskede komponenter, passende endetilpasset til at give korrekt pasning, med omkring 10 enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 Mg DNA. (Når spaltede vektorer anvendes som komponenter, kan det være nyttigt 13 DK 174236 B1 at forhindre genligering af den spaltede vektor ved forbehanding med bakteriel alkalisk phosphatase).

Med henblik på analyse for at bekræfte korrekte sekvenser i de konstruerede plasmider 5 anvendes ligeringsblandingerne til at transformere E. coli K12 stamme 294 (ATCC 31446), og heldige transformanter selekteres efter ampicillin- eller tetracyclin-resistens, hvor det er passende. Fra transformanterne præpareres plasmider, som analyseres ved restriktion og/eller sekvensbestemmes ved den metode, som er beskrevet af Messing et, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) eller den metode, som er beskrevet af Maxam et al., Methods in 10 Enzymology, 65:499 (1980).

Amplifikation af DHFR-proteinkodesekvenser frembringes ved dyrkning af værtscellekulturer i nærvær af koncentrationer pi fra omkring 20 000 til omkring 500 000 nM methotrexat, en kompetitiv Inhibitor af DHFR-aktivitet. Det effektive 15 koncentrationsområde er selvfølgelig stærkt afhængigt af arten af DHFR-genet og proteinet og af værtens egenskaber. Det er klart, at alment definerede øvre og nedre grænser ikke kan fastslås. Egnede koncentrationer af andre folsyreanaloge eller andre forbindelser, som inhiberer DHFR, vil også kunne anvendes. MTX selv er imidlertid hensigtsmæssigt, let tilgængeligt og effektivt.

20 D. Almen beskrivelse af foretrukne udførelsesformer

Human vævsplasminogenaktivator blev opnået ifølge den følgende protokol: 25 1. Humane melanomaceller, som aktivt producerede vævsplaminogenaktivator, blev dyrket til konfluens.

2. Cellepiller fra sådanne cellekulturer blev ekstraheret I nærvær af ribonudease-inhibitorer for at isolere al cytoplasmisk RNA.

30 3. En oligo-dT-søjte isolerede den totale mRNA i polyadenyleret form. Denne mRNA blev størrelsesfraktioneret under anvendelse af syre-urlnstof-agarose-gel-elektroforese.

4. Gelfraktionen indeholdende vævsplasminogenaktivatorspecifik RNA blev identificeret på 35 følgende måde: RNA'en fra hver af gelfraktionerne blev translateret i et in vitro system af kaninreticulocytlysat suppleret med hundepancreasmicrosomer. De resulterende translationsprodukter blev derpå immunofældet med human vævsplasminogen-aktivator-specifikt IgG-antistof.

40 5 . Den passende RNA (21 til 24S) blev omdannet til tilsvarende enkelstrenget komplementær DNA (cDNA), udfra hvilken der blev produceret dobbeltstrenget cDNA.

Efter påsætning af en poly-dC-hale blev den indsat i en vektor, såsom et plasmid, bærende en eller flere fænotypiske markører.

»·' ·' 14 DK 174236 B1 6. De således fremstillede vektorer blev anvendt til at transformere bakterieceller til opnåelse af etklonet cDNA-bibliotek. En sammenhældning af radiomærkede syntetiske deoxy-oligonucleotider, som var komplementære til codoner for kendte aminosyresekvenser i t-PA, som f.eks. sammenhældningen af 8 14-mere, 5’- 5 dTC(A/G)CA(A/G)TA(C/T)TCCCA-3' (komplementære til sekvenser, der koder for den kendte - se nedenfor - amlnosyresekvens: tryptophan - glutaminsyre - tyrosin - cystein -asparaginsyre (W-E-Y-C-D)), blev fremstillet og anvendt til at sondere kolonibiblioteket.

7. Fra de positive cDNA-kloner blev plasmid-DNA isoleret og sekvensbestemt.

10 8. Den sekvensbestemte DNA, som kodede for t-PA, blev derpå skræddersyet in vitro til indsætning i et passende ekspressionsmedium, som blev anvendt til at transformere en passende værtscelle, som igen fik lov til at vokse i en kultur og producere den ønskede humane vævsplasminogenaktivator.

15 9. Den således producerede humane vævsplasminogenaktivator har ca. 251 aminosyrer i dens enzymatiske serin-protease-del og en "kringle,,-indeholdende sekvens ovenfor denne, som for nærværende antages at være ansvarlig for fibrinbinding. Det modne protein plus dets signalpræsekvens indeholder ialt 562 aminosyrer.

20

Den ovenstående procedure kan i sig selv anvendes med held til at producere ren t-PA. Fremgangsmåder med anvendelse af en yderligere kode-sekvens, som er følsom for methotrexat, tillader produktion i værtscellekulturer af antigenaktivt t-PA-protein i mængder på over 0,1 pg pr. celle pr. dag. Med passende anvendelse af forstærkende betingelser 25 kan der opnås mængder på over 20 pg pr. celle pr. dag. Sagt på en anden måde opnås gen-ekspressionsniveauer, der resulterer i produktion af mere end 9 x 10'6 Plough-enheder pr. celle pr. dag eller, med egnet amplifikation, mere end 18 x 10"1 Plough-enheder pr. celle pr. dag af t-PA-aktivitet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 I dette aspekt drages fordel af methotrexat som et middel, der, selv om det normalt er 2 fatalt for celler, som er i stand til at optage det, tillader celler at vokse i nærvær af kon 3 trollerede niveauer af MTX ved amplifikation af genet, der koder for DHFR-kodesekvensen 4 (Schimke, Robert T. et al., Science. 202: 1051 (1978); Biedler, J.L. et al., Cancer Res. 32: 5 153 (1972); Chang, S.E. et al., £§11, 7: 391 (1976)).

6 7

Af betydning for dette aspekt er påvisningen af, at amplifikation af genet for DHFR kan 8 forårsage amplifikation af dermed forbundne sekvenser, der koder for andre proteiner.

9

Dette viser sig at være tilfældet, når det forbundne protein er hepatitis B overflade-antigen 10 (HBsAg) (Christman, 3. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79: 1815 (1982)); E. coli proteinet 11 XGPRT (Ringold, Gordon, et al., 3. Molec. and Appl. Gen., 1:165 (1981)); og en endogen sekvens fra en DHFR/SV40-plasmid-kombination (Kaufman, R.F. et al., 3. Molec. Biol., 159: 601 (1982).

15 DK 174236 B1

Andre mekanismer til tilføring af methotrexatresistens inkluderer formindskelse af bindingsaffiniteten af DHFRproteinet, således at det er mindre modtageligt for methotrexat (Flintoff, W.F. et al., Somat. Cell. Cenet., 2: 245 (1976)), men i dette tilfælde viser der sig også at ske amplifikation.

5

Det synes som om generne både for vild-type-DHFR og for DHFR, som er resistent for MTX som følge af dets egen formindskede bindingskapacitet, forstærkes ved tilstedeværelse af MTX. Derfor angår dette aspekt i princippet anvendelse af virkningen af DHFR-sekvensamplifikation på dermed forbundne proteinkodesekvenser for at give en 10 styringsmekanisme, som tillader forhøjede ekspressionsniveauer af t-PA-sekvenser i nærvær af MTX eller som forudgående behandling af transformerede celler med MTX.

E. Eksempler 15 De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen. I disse eksempler anvendtes en E. coli værtskuitur og en CHO-cellelinje, der er egnet for den type DHFR-protein-kodesekvens, som skal indføres, som værtscellekulturer. Imidlertid er andre eukaryote og prokaryote celler ligesåvel egnede til brug i ovennævnte fremgangsmåde.

20 E.l Ekspression af det humane t-PA-gen i E. coli E.l.A Figurforklaringer

Fig. 1 er et autoradiogram af en 10% SDS-PAGE, som viser immunofældet [35S]-25 methionin-mærket-protein secerneret fra humane melanomaceller under en 3-timers puls in vivo i nærvær (bane b) eller fravær (bane a) af proteaseinhibitoren aprotinin. Efter immunofældning med vævsplasminogenaktivator-specifik IgG blev der iagttaget tre bånd (bane a) med molekylvægte på omkring 65000, 63000 og 35000. Når proteaseinhibitoren er til stede, iagttages imidlertid intet bånd med molekylvægt 35 000. Der immunofældes 30 ingen produkter, når der anvendes præimmunserum (bane c). Vandringerne og molekylvægtene af 14C-mærkede proteinstandarder er vist til venstre for bane a.

Fig. 2 viser gelelektroforese af de immunofældede translationsprodukter af RNA-fraktioner isoleret fra en syreurinstof-saccharosegel. Et overvejende bånd blev iagttaget i 35 fraktionsnumrene 7 og 8 efter translation i nærvær af hundepancreasmikrosomer efterfulgt af immunfældning med vævsplasminogenaktivator-specifik IgG. Dette bånd har en molekylvægt på omkring 63000 dalton. Størrelsen af den mRNA, der vandrer i fraktionerne 7 og 8, er omkring 21 til 24S. Positionerne af ribosomale RNA-markører, som blev bestemt efter elektroforese på RNA-urinstofgelen og gjort synlige ved ethidiumbromidfarvning, er 40 afmærket oven over de passende gelbaner.

Fig. 3 viser hybridiseringsmønstret af 96 kolonier med 1P-dTC(A/G)CA(A/G)TA(C/T)TCCCA (W-E-Y-C-D)-sonde. 96 individuelle transformanter blev dyrket i en mikrotiterplade, re-plica-udsået og dyrket på en nitrocellulosemembran. Kolonierne blev derpå lyseret, 16 DK 174236 B1 bakteriel DNA fikseret, og filtrene hybridiseret med 32P-14-mer (W-E-Y-C-D)-sonderne.

Filtrene blev vasket for at fjerne ikke-hybridiseret sonde og eksponderet pi røntgenfilm.

Dette autoradiogram er repræsentativt for de mønstre, der blev opnået med 48 individuelle Filtre (4600 uafhængige kolonier). Et eksempel på en positiv 5 vævsplasminogenaktivator-cDNA-klon på filter nummer 25 er mærket som E10 (pil).

Fig. 4 er et restriktionsendonudeasekort over den fulde længde af den humane vævsplasminogenaktivator-cDNA. Antallet og størrelsen af fragmenter produceret ved restriktionsendonuclease-spaltning blev bedømt ved elektroforene igennem 6% 10 acrylamidgeler. Positioner af steder blev bekræftet ved nudeinsyresekvens (vist i fig. 5). Kodeområdet af den største åbne aflæsningsramme er indrammet i en kasse, og det skraverede område repræsenterer den formodede signalpeptidsekvens, medens det prikkede område repræsenterer den formodede moden vævspiasminogenaktivator-sekvens (527 aminosyrer). 5'-enden af mRNA'en er til venstre, medens 3’-enden er til højre.

15

Fig. 5A, 5B og 5C belyser nudeotidsekvensen og den afledte aminosyresekvens af den fulde længde af den humane vævsplasminogenaktivator-cDNA. De 35 aminosyrer (-35 til -l), som går forud for den modne sekvens, er afbildet som en uafbrudt sekvens. Det antages, at denne sekvens på 35 aminosyrer består af en hydrofil "pro’'-sekvens, forud for 20 serin (+1) i det modne protein, på omkring 12-15 aminosyrer, og foran hvilken der kommer et "konventionelt'' hydrofobt signal (som strækker sig i 5’-retningen til -35).

Denne type af præ-prostruktur på secernerede proteiner er blevet beskrevet tidligere, f.eks. med præ-proalbumin. Hvis man antager denne teori, vil alle de secernerede vævsplaminogen-aktivator-molekyler starte med serinet (+1) som den aminoterminale 25 ende. En anden teori er, at den hydrofile sekvens kunne være involveret i funktionen af vævsplasminogenaktivator på en måde, som er analog med den, der iagttages med plasminogen, hvor et peptid på 10000 dalton kan fraspaltes den aminoterminale del af na-tivt plaminogen (Glu-plasminogen, navngivet efter den aminoterminale rest), hvilket resulterer i et mindre molekyle med en ny aminoterminal ende, betegnet Lys-plasminogen.

30 Lys-plasminogen aktiveres lettere til plasmin og har også en større affinitet for fibrin end Glu-plasminogen. Plasmin er blevet påvist at katalysere omdannelsen af Glu- til Lys-plasminogen. Denne type styringsmekanisme resulterer i en "positiv tilbagekoblings" -mekanisme. De første mængder dannet plasmin har foruden nedbrydning af fibrin også den virkning at frembringe plasminogenmolekyler, som aktiveres lettere og også bindes 35 tættere til deres substrat end nativt plasminogen. Resultatet er en hurtigere nedbrydning af fibrin. Det hydrofile peptid i vævsplasminogenaktivator kunne være involveret i en lignende mekanisme, hvor spaltning resulterer i modificeret binding af enzymet til fibrin. I hvert fald betragtes sekvensen på 35 aminosyrer som en præsekvens til det modne protein.

40

Fig. 6 er et skematisk diagram af konstruktionen af et vævsplasminogen-aktivator-ekspressionsplasmid pARIPA0. Udgangsplasmidet pPA25E10 blev først nedbrudt med PstI for at isolere et 376 bp-fragment, som derpå blev nedbrudt som vist i figuren.

17 DK 174236 B1

Fig. 7 viser resultatet af en fibrinpladeprøvning for fibrinolytisk aktivitet af ekspressionsproduktet opnået via pARIPA° i transformerede celler.

Fig. 8 er et HPLC-spor af peptider fra trypsinnedbrydning af den omhandlede 5 vævsplasminogenaktivator (absorbans ved 210 nm). Pilen identificerer maksimet svarende til det peptid, som blev anvendt til at udforme nudeotidsonden, som blev anvendt med kolonibiblioteket. Det ved dette maksimum repræsenterede peptid fandtes at have den fulde sekvens: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. De andre overvejende maksima blev ligeledes sekvensbestemt og fundet at bekræfte den korrekte aminosyresekvens af human 10 vævsplasminogenaktivator. Peptid-l-bogstavs-koden henfører til følgende aminosyrebetegnelser:

Asp D asparaginsyre Ile I isoleucin 15 Thr T threonin Leu L leucin

Ser S serin Tyr y tyrosin

Glu E glutaminsyre Phe F phenylalanin

Pro P prolin His H histidin

Gly G glycin Lys K lysin 20 Ala A alanin Arg R arginin

Cys C Cystein Trp W tryptophan

Val V valin Gin Q glutamin

Met M methionin Asn N asparagin 25 Fig. 9 afbilder konstruktionen af et plasmid, der koder for den direkte ekspression af moden human vævsplasminogenaktivator i E. coli. 50 pg af plasmid pPA17 bliver nedbrudt med Sau3AI, Hindi og Hhal og underkastet elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Der blev udvundet ca. 0,5 pg af 55 bp Sau3AI-HhaI fragmentet. På lignende måde blev ca. 3 ug af 263 bp Hhal-Narl-fragmentet oprenset fra 80 pg af klon pPa25E10, ved at man først' 30 isolerede et 300 bp Pstl-Narl-fragment og derpå nedbrød dette fragment med Hhal. Allé ' nedbrydninger blev gennemført ved 37°C f en time, og reaktionsprodukteme blev opløst og elektroelueret fra 6% polyacrylamidgeler. De to angivne deoxyoligonucleotider 5’ dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) og 5’ GATCACTTGATAAGACATG (II) blev syntetiseret ved fastfasephosphotriester-metoden (51). 100 pmol af oligonucleotid II blev phosphoryleret i 35 en 30 μΙ reaktionsblanding indeholdende 60 mM "Tris" (pH 8), 10 mM MgC12, 15 mM 6-mercaptoethanol og 50 pCi (r-32P]ATP (Amersham 5000 Ci mmol'1), der tilsattes 12 enheder T4-polynudeotidkinase, og reaktionen fik lov at foregå ved 37°C i 15 minutter.

Derpå tilsattes 1 μΙ 10 mM ATP og 12 enheder T4-kinase, og reaktionen fik lov at foregå i yderligere 30 minutter. Efter phenol/CHC13-ekstraktion blev den phosphorylerede oligo-40 mer II og 5'-hydroxy-oligomeren I kombineret med 0,5 pg af det eluerede 55 bp

Sau3AI-HhaI fragment og 2 pg af 263 bp Hhal-Narl fragmentet og ethanolfældet. Disse fragmenter blev ligeret ved stuetemperatur i 4 timer I 60 pi 20 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC12, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 1000 enheder T4-DNA-ligase. Blandingen blev nedbrudt i 1 time med 48 enheder Narl, 20 enheder EcoRI og 40 enheder Bglll (for 18 DK 174236 B1 at eliminere polymerisering under legering af kohæsive Sau3AI-termini) og underkastet elektroforese på en 6% gel. Produktet på 338 bp (omkring 0,1 μg) blev udvundet ved elektroeluering. Resten af t-PA-kodesekvenserne (aminosyreme 111-528) blev isoleret på et 1645 bp fragment ved nedbrydning af plasmid pPA25E10 med Narl og Bglll. Plasmidet 5 pLeIFAtrpl03 er et derivat af plasmidet pLeIFA25 (52), hvori EcoRI-stedet fjernest fra LeIF A-genet er blevet fjernet (53). 3 Mg pLeIFAtrpl03 blev nedbrudt med 20 enheder EcoRI og 20 enheder Bglll i 90 minutter ved 37°C, underkastet elektroforese på en 6% polyacrylamidgel, og det store (ca. 4200 bp) vektorfragment blev udvundet ved elektroeluering. Til den endelige konstruktion blev 80 ng EcoRI-Bglli pLeIFAtrpl03 ligeret 10 med 100 ng af 1645 bp Narl-Bglil-fragmentet og 20 ng af 338 bp EcoRI-Narl-fragmentet i 10 timer ved stuetemperatur. Denne ligeringsblanding blev anvendt til at transformere E. coli K-12 stamme 294. Plasmid-DNA blev præpareret ud fra 38 af disse transformanter og nedbrudt med EcoRI. 71 af disse plasmider indeholdt de ønskede 600 bp og 472 bp EcoRI-fragmenter. DNA-sekvensanalyse bekræftede, at et af disse plasmider (pt-PAtrpl2) havde 15 den ønskede nudeotidsekvens ved forbindelserne mellem trp-promotoren, den syntetiske DNA og cDNA'en.

Flg. 10 viser resultatet af en fibrin-plade-prøvning for fibrinolytisk aktivitet af et her omhandlet vævsplasminogenaktivator-ekspressionsprodukt. En kultur af E. coli W3110/pt-20 PAtrp 12 dyrket natten over i Luria-væske indeholdende 5 pg /ml tetracyclin blev fortyndet 1:100 i M9medium indeholdende 0,2% glucose, 0,5% casaminosyrer og 5 ph/ml tetracyclin. Cellerne blev dyrket ved 37eC til en A550 på 0,02, og der tilsattes indolacrylsyre til en slutkoncentration på 20 pg /ml. Prøver blev opsamlet ved centrifugering til A550 = 0,5-0,6 (ca. 2 x 108 celler/ml) og øjeblikkeligt frosset.

25 Cellepillerne blev suspenderet i 6M guanidin-hydrochlorid ved 5 x 108 celler/ml, ultralydbehandlet i 10 sekunder, inkuberet ved 24 °C i 30 minutter og derpå dialyseret i 4 timer over for 25 nM "Tris"-HCl pH 8,0, 250 mM NaCI, 0,25 mM EDTA og 0,01% ’Tween 80".

Efter dialyse blev prøverne centrifugeret ved 13000 g i 2 minutter, og 10 μΙ af supernatanterne blev analyseret for vævsplasminogenaktivator-aktivitet. Ifølge den 30 procedure, som er beskrevet af Granelli-Piperno og Reich (87), blev pladen inkuberet i 3,5 timer ved 37°C, og lysezonerne målt. Kvantificering blev opnået ved sammenligning med fortyndinger af en renset melanoma-vævsplasminogenaktivator-opløsning.

E.l.B Kilde til vævsplasminogenaktivator-mRNA 35

Der anvendtes humane melanomaceller (Bowes). Melanomacellerne blev dyrket til sammenflydende monolag i 100 ml "Earles Minimal Essential Medium" suppleret med mættet hydrogencarbonat (0,12 * slutkoncentration), 2 mM glutamin og 10% varmeinaktiveret fetalt kalveserum. For at bekræfte, at melanomacellerne aktivt 40 producerede human vævsplasm i nogenaktivator, blev humane melanomaceller dyrket til sammenflydning i en 24 hullers mikrotiterskive. Enten i nærvær eller i fravær af 0,33 μΜ af proteaseinhibitoren aprotinin blev cellerne vasket en gang med phosphatpufret saltopløsning, og der tilsattes 0,3 ml serumfrit methioninfrit medium. Der tilsattes 75 μΟ [35S)methIonin, og cellerne blev mærket ved 37°C i 3 timer. Ved enden af 3 timers 19 DK 174236 B1 mærkningsperioden blev mediet fjernet fra cellerne og behandlet med enten vævsplasminogenaktivator-specifikt IgG eller præimmimserum til immunfældning (54). De immunfældede produkter blev udspredt ved elektroforese pi en 10% SDS-acrylamid-gel. Gelpladen blev fikseret, tørret og underkastet fluorografi.

5

E.l.C. Isolering og størrelsesfraktionering af mRNA

Total RNA fra melanomacellekulturer blev ekstraheret i hovedsagen som rapporteret af Ward et al. (55). Celler blev pelleteret ved centrifugering og derpå gensuspenderet i 10 10 mM NaCI, 10 mM "Tris"-HCl pH 7,5, 1,5 mM MgCl2. Cellerne blev lyseret ved tilsætning af NP-40 (1% slutkoncentration), og kerner blev pelleteret ved centrifugering. Supernatanten indeholdt den totale RNA, som blev yderligere renset ved flere ganges phenol- og chloroformekstraktioner. Den vandige fase blev gjort 0,2 M mht. NaCI, og derpå blev total RNA udfældet ved tilsætning af to volumener ethanol. Oligo-dT-cellulose-kromatografi blev 15 anvendt til at rense mRNA fra de totale RNA-præparater (54). Typiske udbytter fra 10 g dyrkede melanomaceller var 5-10 mg total RNA og 50-200 pg poly(A) + mRNA.

Fraktionering af polyA+ mRNA (200 pg) (56) blev gennemført ved elektroforese gennem urinstof-agarose-geler. Agarose-gel-pladen (57, 58) var sammensat af 1,75% agarose, 20 0,025 M natriumcitrat, pH 3,8, og 6 M urinstof. Elektroforesen blev gennemført i 7 timer ved 25 mA og 4 °C. Gelen blev derpå fraktioneret med et barberblad. De indiviuelle skiver blev smeltet ved 70 °C og ekstraheret to gange med phenol og en gang med chloroform. Fraktionerne blev derpå ethanolfældet og derefter prøvet ved in vitro translation i et kaninreticulocytlysat-system, Bethesda Research Lab. (59, 60), suppleret med hundepan-25 creasmicrosomer som følger:

Translationer blev udført under anvendelse af 25 pCt [35S]-methionin og 500 mg af hver gelskive-RNA i et slutvolumen på 30 Al indeholdende 24 mM "HEPES", 48,3 mM ka-liumchlorid, 10 mM creatinphosphat, 19 aminosyrer i en koncentration på 50 mM hver, 1,1 30 mM magnesiumchlorid,l6,6 mM EDTA, 0,16 mM dithiothreitol, 9,3 mM hæmin, 16,6 pg /ml creatinkinase, 0,33 mM calciumchlorid, 0,66 mM EGTA, 23,3 mM natriumchlorid.

Inkubationer blev udført ved 30 °C i 90 minutter. Hundepancreasmicrosomale membraner fremstillet ud fra rå microsomer under anvendelse af EDTA til fjernelse af ribosomeme (61) 35 blev behandlet med nuclease som beskrevet (62) og var til stede i translationsblandingen i en slutkoncentration på 7 A260 enheder/ml. Translationsprodukter eller immunfældede translatlonsprodukter blev analyseret ved elektroforese på 10% polyacrylamidgeler i natriumdodecylsulfat som tidligere beskrevet (63). De ufarvede gelplader blev fikseret, tørret og underkastet fluorografi (64).

40

De resulterende translationsprodukter fra hver gelfraktion blev immunfældet med anti-(human vævsplasminogenaktivator)-specifikt kanin-IgG. Et fremtrædende immunfældet polypeptidbånd blev iagttaget ved translationen af RNA-fraktionsnumrene 7 og 8 (vandring på 21 til 24S) med en molekylvægt på omkring 63000 dalton. Dette bånd blev ikke 20 DK 174236 B1 iagttaget, når præimmun-lgG blev anvendt til immunfældning, hvilket antydede, at disse polypeptider var vævsplasminogenaktivator-specifikke.

E.I.D Fremstilling af et kolonibibliotek indeholdende vævsplasminogenaktivator-5 sekvenser 5 μς gelfraktioneret mRNA (gelskive 7-mRNA) blev anvendt til fremstilling af dobbeltstrenget cDNA ved standardprocedurer (52, 65, 66). cDNA’en blev størrelsesfraktioneret på en 6% polyacrylamidgel. cDNA'en på over 350 bp i længde (125 10 mg) blev elektroelueret. 30 mg cDNA blev udvidet med deoxy(C)-rester under anvendelse af terminaldeoxynucleotidyl-transferase (67) og anneleret med 300 ng af plasmidet pBR322 (68), som på lignende mide var blevet påsat en hale af deoxy(G)-rester ved Pstl-stedet (67). Den annelerede blanding blev derpå transformeret ind i E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446). Der blev opnået omkring 4600 transformanter.

15 E.l.E. Fremstilling af DNA-sonde

Renset human vævsplasminogenaktivator blev opnået ifølge proceduren i angivne referencer (19, 20).

20

Molekylet blev scannet for at lokalisere områder, som var bedst egnet til fremstilling af syntetiske sonder, som følger:

For at gøre proteinet modtageligt for nedbrydning med trypsin blev det reduceret og 25 carboxymethyleret. En prøve på 2 mg vævsplasminogenaktivator blev først dialyseret over for 0,01% "Tween 80" natten over ved stuetemperatur. Det lyophiliserede protein blev derpå opløst i 12 ml af en 0,56 M 'Tris"-HCl-puffer (pH 8,6), som var 8 M mht. urinstof og 5 mM mht. EDTA. Disulfidbindingerne blev reduceret ved tilsætning af 0,1 ml B-mercaptoethanol. Denne reaktion blev udført under nitrogen i 2 timer ved 45 °C. De 30 reducerede disulfider blev alkyleret til carboxymethylderivatet ved tilsætning af 1,0 ml 1,4 M iodeddikesyre i IN NaOH. Efter 20 minutter ved stuetemperatur blev reaktionen standset ved dialyse over for 0,01% "Tween 80” i 18 timer ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen blev lyophiliseret.

35 Det resulterende lyophiliserede carboxymethylerede protein blev opløst igen i 3 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,5). Der tilsattes trypsin (TP CK) (forhold 1:50) og proteinet blev nedbrudt ved 36 °C. Aliquoter (0,1 ml) blev udtaget efter 3 timer, 6 timer og 12 timer. Endnu en tilsætning af trypsin foretoges efter 12 timer. Reaktionen blev standset efter 24 timer ved frysning af prøven, indtil den kunne injiceres på HPLC. Nedbrydningens 40 fremadskriden blev bestemt ved SDS-geler på aliquoteme. Alle geler var tomme, undtagen et svagt bånd på 3 timers aliquoten. Dette viste, at nedbrydningen efter 24 timer var fuldstændig, og at der ikke var nogen store peptider tilbage.

_ 21 DK 174236 B1

En prøve (ca. 0,5 ml) blev injiceret i en højopløsnings-"Altex C-8 ultrasphere" 5 μ kolonne med to forløb. En gradient af acetonitril blev indstillet gradvis (1-5% på 5 minutter, 5-35 % på 100 minutter, 35-50 % på 30 minutter). I et af de to præparative forløb blev elueringsmidiet kontrolleret ved to bølgelængder (210 nm og 280 nm). Forholdet mellem 5 absorptionerne ved de to bølgelængder blev anvendt til at indicere de tryptophanholdige peptider.

De peptidmaxima, som mest sandsynligt indeholdt tryptophan, eller som antoges at være nyttige af andre grunde, blev sekvensbestemt først. Dette muliggjorde bestemmelsen af 10 sekvensen omkring de fleste af tryptophanresteme. Efter sekvensbestemmelse af omkring 25 af de bedst mulige peptidmaksima blev alle de sekvensdata, som kunne bringes overens, sat sammen til opnåelse af en foreløbig model af den primære struktur af vævsplasminogenaktivator. Fra disse data og denne model blev der lokaliseret flere mulige sonder.

15 E.l.F. Identifikation af bakterielle kloner indeholdende vævsplasminogenaktivator-cDNA-sekvenser

Kolonierne blev individuel indpodet i huller på mikrotiterplader indeholdende LB (93) + 20 5 μθ/ητιΙ tetracyclin og opbevaret ved -20 °C efter tilsætning af dimethylsulfoxid til 7 %. To kopier af kolonibiblioteket blev opdyrket på nitrocellulosefiltre, og DNA'en fra hver koloni blev fikseret til filteret ved Grunstein-Hogness-proceduren (69).

Den 32P-mærkede TC(A/G)CA(A/G)TA(C/T)TCCCA sonde blev fremstillet ud fra syntetisk-25 oligomer (W-E-Y-C-D) 14-mersamlingen som beskrevet ovenfor. Filtre indeholdende 4600 transformanter blev præhybridiseret i to timer ved stuetemperatur i 50 mM natriumphosphat pH 6,8, 5X SSC (80), 150 μ9 /ml ultralydbehandlet laksesperm-DNA, 5X Denhardt's opløsning (85), 10% formamid og derpå hybridiseret med 50 x 106 tællinger/minut af den mærkede sonde i den samme opløsning. Efter inkubation natten ‘ 30 over ved stuetemperatur blev filtrene vasket tre gange ved stuetemperatur i 6X SSC, ;-0,1% SDS i 30 minutter, en gang i 2X SSC og derpå eksponeret på Kodak XR-5 røntgenfilm med Dupont Lightning Plus intensiveringsskærme i 16 timer.

Plasmid-DNA blev isoleret ved en hurtig metode (71) fra alle kolonier, som viste positiv 35 hybridiseringsreaktion. cDNA-indsætningerne af disse kloner blev derpå sekvensbestemt efter subkloning fra fragmenter Ind i M13 vektoren mp 7 (73) og ved Maxam Gilbert's kemiske procedurer (74). Fig. 3 viser filter nr. 25, der udviser hybridiseringsmønstret af en positiv vævsplasminogenaktivator-klon. cDNA-indsætningen i klon 2510 blev påvist at være den DNA, der koder for vævsplasminogenaktivator, ved sammenligning af dens 40 aminosyresekvens med peptidsekvensen (se ovenfor) opnået ud fra renset vævsplasminogenaktivator og ved dens ekspressionsprodukt produceret I E. coli som beskrevet nærmere nedenfor. cDNA-indsætningen i klon 25E10 (plasmid pPA25ElO) havde en længde på 2304 basepar, hvor den længste åbne aflæsningsramme kodede for et pro- 22 DK 174236 B1 tein på 508 aminosyrer (molekylvægt 56 756) og indeholdt et 3'-utranslateret område på 772 bp. Denne cDNA-klon manglede de N-terminale kodesekvenser.

E.l.G. Direkte ekspression af en human vævsplasminogenaktivator-klon i E. coli 5

Med henvisning tit fig. 6 blev 50 pg pPA25E10 (ovenfor) nedbrudt med Pst I, og 376 bp fragmentet blev isoleret ved elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Omkring 3 pg af dette fragment blev isoleret fra gelen ved elektroeluering, nedbrudt med 30 enheder Dde I i 1 time ved 37°C, phenol- og chloroformekstraheret og ethanolfældet. De resulterende 10 Dde I-kohæsive ender blev udvidet til stumpe ender ved tilsætning af 5 enheder DNA-polymerase I (Klenow fragment) og 0,1 mM hver af dATP, dCTP, dGTP, dTTP til reaktionsblandingen og inkubation ved 4 °C i 8 timer. Efter ekstraktion med phenol og chloroform blev DNA'en nedbrudt med 15 enheder Narl i 2 timer, og reaktionsbtandingen blev underkastet elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Der blev udvundet 0,5 pg af 15 det ønskede stumpendede Narl-fragment på 125 bp. Dette fragment koder for aminosyrerne nr. 69-110 af det modne fuldlængde vævsplasminogenaktivator-protein.

Til isolering af Narl-Bglll-fragmentet på 1645 bp blev 30 pg pPA25E10 nedbrudt med 30 enheder Narl og 35 enheder Bglll i 2 timer ved 37°C, og reaktionsblandingen blev 20 underkastet elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Der blev udvundet ca. 6 pg af det ønskede Narl-BgIII-fragment på 1645 bp.

Ptasmidet OR1SRC er et derivat af plasmidet pSRCexl6 (79), hvori EcoRI-stederne proximalt til trp-promotoren og distalt for SRC-genet er blevet fjernet ved reparation med 25 DNA-polymerase I (28), og det selvkomplementerende oligodeoxynucleotid AATTATGAATTCAT (syntetiseret ved phosphotriestermetoden (75)) blev indsat i det resterende EcoRI-sted umiddelbart op til Xba-stedet. 20 pg pnRlSRC blev nedbrudt fuldstændigt med EcoRI, phenol- og chloroformekstraheret og ethanolfældet. Plasmidet blev derpå nedbrudt med 100 enheder nuclease SI ved 16°C i 30 minutter i 25 mM 30 natriumacetat (pH 4,6), 1 mM ZnC12 og 0,3 M NaCI for at skabe en stump ende med sekvensen ATG. Efter phenol- og chloroformekstraktion og ethanolfaeldning blev DNA’en nedbrudt med BamHI, underkastet elektroforese på en 6% polyacrylamidgel, og det store (4300 bp) vektorfragment udvundet ved elektroeluering.

35 Ekspressionsplasmidet blev samlet ved ligering af 0,2 pg af vektoren, 0,06 pg af det stumpendede Narl-fragment på 125 bp og 0,6 pg af Narl-Bglll-fragmentet på 1645 bp med 10 enheder T4-DNA-ligase i 7 timer ved stuetemperatur og anvendt til at transformere E. coli stamme 294 (ATCC nr. 31446) til ampicillin-resistens. Plasmid-DNA blev præpareret fra 26 af kolonierne og nedbrudt med Xbal og EcoRI. Tolv af disse 40 plasmider indeholdt de ønskede 415 bp Xbal-EcoRI- og 472 bp EcoRI-fragmenter. DNA-sekvensanalyse bekræftede, at flere af disse plasmider havde en ATG-startcodon korrekt placeret ved starten af aminosyre nr. 69 (serin). Et af disse plasmider, pARIPA0, blev prøvet og producerede den ønskede vævsplasminogenaktivator (fig. 7).

E.l.H. Fuld-løengde vævsplasmlnogenaktivator-cDNA

23 DK 174236 B1 a) Fremstilling af et kolonibibliotek indeholdende N-terminale vævsplasminogen-aktivator-sekvenser 5 0,4 pg af det syntetiske oligonucleotid 5' 11 GI GAGCACAGGGCG 3’ blev anvendt til priming af 7,5 pg af gelfraktion-8-mRNA (ovenfor) for at fremstille dobbeltstrenget cDNA ved standardprocedurer (65, 66). cDNA'en blev størrelsesfraktioneret på en 6% polyacryl-amidgel. En størrelsesfraktion på over 300 bp (36 μς) blev elektroelueret. 5 μg cDNA blev 10 udvidet med deoxy(C)rester under anvendelse af terminal deoxycytldyltransferase (67) og anneieret med 50 ng af plasmidet bPR322 (68), som på lignende måde var blevet påsat en hale af deoxy(G)-rester ved Pstl-stedet (67). Den annelerede blanding blev derpå transformeret ind i E. coli K12 stamme 294. Der blev opnået ca. 1500 transformanter.

15 b) Southern-hybridisering af human genomisk DNA

Da cDNA-primingsreaktionen er blevet udført under anvendelse af et syntetisk fragment, der hybridiserede 16 basepar fra den N-terminale ende af klon pPA25E10, var der intet ' hensigtsmæssigt restriktionsfragment til rådighed i dette 29 bp område (som inkluderer v 20 den 16-mere sekvens) til screening af cDNA-klonerne. Derfor var det nødvendigt at isolere en human-vævsplasminogenaktivator-genomisk klon for at identificere eventuelle primerudvidede cDNA-kloner indeholdende N-terminale vævsplasminogenaktivatorkode-sekvenser.

24 DK 174236 B1 rekombinante λ-fager blev udslet på DP 50 Sup F i en tæthed pi 10000 pfu/15 cm plade, og nitrocellulosefilteraftryk blev fremstillet for hver plade ved den metode, som er angivet af Benton og Davis (78). En 32P-mærket DNA-sonde blev fremstillet ved standardprocedurer (83) ud fra et 110 bp Hpall-Rsal-fragment lokaliseret 34 bp fra S'-enden af 5 plasmidet pPA25E10. Hvert nitrocellulosefilter blev forhybridiseret ved 40 °C i to timer i 50 mM natriumphosphat (pH 6,5), 5X SSC (77), 0,05 mg/ml ultralydbehandlet laksesperm-DNA, 5X Denhardt's opløsning (84), 50 % formamid og derpå hybridiseret med 50 x 106 teellinger/minut af den mærkede sonde i denne samme opløsning indeholdende 10 % natriumdextransulfat (85). Efter inkubation natten over ved 40 °C blev 10 filtrene vasket fire gange ved 50 °C i 0,2X SSC, 0,1 % SDS i 30 minutter, en gang I 2X SSC ved stuetemperatur og derpå eksponeret pi Kodak XR-5 røntgenfilm med Dupont Cronex intensiveringsskærme natten over. Der blev opnået ialt 19 kloner, som hybridiserede med sonden. Fag-DNA blev fremstillet som tidligere beskrevet (86) ud fra 6 rekombinanter. λ klon C blev udvalgt til fremstilling af et PvuIIfragment til koloniscreening.

15 30 Mg DNA blev nedbrudt med Pvu II i 1 time ved 37°C og underkastet elektroforese på 1,0% agarosegeler. Et 4,2 kbp fragment, som tidligere var pivist at indeholde vaevsplasminogenaktivator-sekvenser, blev elektroelueret og renset. En 32P-mærket sonde blev fremstillet ved standardprocedurer (83) for kolonihybridiseringer som beskrevet nedenfor.

20 d) Sortering af kolonibibliotek for S’-vævsplasminogenaktivator-sekvenser

Kolonierne blev overført fra plader og dyrket på nitrocellulosefiltre, og DNA'en fra hver koloni blev Okseret til filtret ved Grunstein-Hogness-proceduren (69). En 32P-mærket sonde 25 blev fremstillet ved kalvethymus-priming (83) af et PvuII-fragment på 4,2 kbp fra en isoleret vævsplasminogenaktivator-X-genomisk klon. Filtre indeholdende de 1500 transformanter blev hybridiseret med 112 x 106 tællinger/minut af 32P-mærket λ-genomisk PvuIIfragment. Hybridisering blev gennemført i 16 timer under anvendelse af betingelser som beskrevet af Fritsch et al. (82). Filtrene blev grundigt vasket og derpå eksponeret på 30 Kodak XR-5 røntgenfilm med Dupont Lightning-Plus intensiveringsskærme i 16-48 timer.

18 kolonier hybridiserede klart med den genomiske sonde. Plasmid-DNA blev isoleret fra hver af disse kolonier og blev bundet til nitrocellulosefiltre og hybridiseret med det 32P-mærkede syntetiske oligonudeotid (16-mer), som blev anvendt til den oprindelige primningsreaktion. Af de 18 kloner hybridiserede 7 med den kinasebehandlede 16-mer.

35 Ved sekvensanalyse efter subkloning af fragmenter ind i M13 vektoren mp7 (73), blev en klon (pPA17) vist at indeholde det korrekte S'-N-terminale område af vævsplasminogenaktivator, en signal-ledersekvens og et 5‘-utranslateret område på 84 bp. Fra de to kloner pPA25ElO og pPA17 blev den fuldstændige nucleotidsekvens (fig. 5) og restriktionsmønstret (fig. 4) af en fuldlængde vævsplasminogenaktivator-klon bestemt.

40

Det native vævsplasminogenaktivator-molekyle har evnen til at stabiliseres af 17 disulfidbroer baseret på homologi med andre serinproteaser. Der er fire potentielle N-glycosyleringssteder, tre lokaliseret i "kringle"-områderne ved Asnll7, Asnl84, Asn218 og et potentielt sted i let-kæde-området ved Asn448' Variationer i strukturen af _ « v.\ 25 DK 174236 B1 oligosaccharid-liganderne kan være ansvarlige for de forskellige molekylære former (enheder med molekylvægt 65000 og 63000).

E.l.l. Direkte ekspression af fuld-længde-vævsplasminogenaktivator-cDNA-klon I E. coli 5

En rekonstruktion af hele kodesekvensen var mulig ved anvendelse af det fælles Hhal-restriktionsendonucleasested, som deles af begge partielle kloner pPA17 og pPA25E10. Et 55 bp Sau3AI-HhaI-restriktionsfragment svarende til aminosyrerne 5-23 blev isoleret fra plasmidet pPA17. Sau3AI-restriktionsstedet var lokaliseret ved codon fire af den antagne 10 modne kodesekvens og blev anvendt til at fjerne signalpeptid-kodeområdet. Et 263 bp Hhal Narl-fragment (som koder for aminosyrerne 24-110) blev også isoleret fra plasmid pPA25E10. Der blev udformet to syntetiske dexoyoligonudeotider, som genopretter codo-nerne for aminosyrerne 1-4, inkorporerer en ATG-translationsstartcodon og skaber en EcoRI-kohæsiv ende. Disse tre fragmenter blev derpå ligeret sammen til dannelse af et 15 338 bp fragment, som koder for aminosyrerne 1-110. Dette fragment og et 1645 bp Narl-Bglll-fragment fra pPA25E10 blev derpå ligeret mellem EcoRI- og BglU-stederne af plasmidet pLEIFAtrpl03 (53) til dannelse af ekspressionsplasmidet pt-PAtrpl2. Det klonede t-PA-gen transkriberes under styring af et 300 bp fragment af E. coli trp-operonet, som indeholder trp-promotoren, operatoren, og Shine-Dalgarno-sekvensen af trp-20 lederpeptldet, men mangler lederpeptid-ATG-startcodonen (52).

E. coli K12 stamme W3110 (ATCC nr. 27325) indeholdende plasmidet pt-PAtrpl2 blev dyrket, og ekstrakter præpareret til prøvning for flbrinolytisk aktivitet. En metode, som blev anvendt til måling af vævsplasminogenaktivatoraktlvitet, er fibrinpladeprøvningen 25 (87). Denne måler mængden af plasmindannelse ved måling af graden af plas- minnedbrydning af fibrin i en agaroseplade indeholdende plasminogen og fibrin. Plasmin producerer en klar lysezone i fibrinpladen, og arealet af denne zone kan korreleres til mængden af vævsplasminogenaktivator i prøven. Når ekstrakter fra pt-PAtrpl2-kloner prøves for vævsplasminogenaktivator-aktivitet under anvendelse af fibrinpladeprøvningen 30 er en klar lysezone tydelig. Denne fibrinolytiske aktivitet inhiberes af anti-t-PA-IgG, men7 ikke af præimmun-IgG eller anti-urokinese-IgG, og der ses ingen aktivitet fra en ekstrakt fremstillet ud fra celler indeholdende leukocyt-interferon-plasmidet pLEIFAtrpl3 som kontrol. Under anvendelse af en standardkurve af renset t-PA kan det anslås, at der opnås omkring 20 enheder ekstraheret aktivitet pr. 109 celler (for renset t-PA er 90 000 Plough-35 enheder = 1 mg) (fig. 10).

E.l J. Sekvensanalyse

Sekvensanalysen var baseret på Edman-nedbrydningen (83b). Prøven blev indført i koppen 40 på Beckman 890B eller 890C "spinning cup"-sekvensbestemmelsesapparatet.

"Polybrene"® (poly=N,N,NlNi-tetramethyl-N-trimethylenhexamethylen'diammoniumdiacetat) blev anvendt som bærer i koppen (63C). Sekvensbestemmelsesapparatet var modificeret med en kold fælde og nogle programændringer for at reducere baggrundsmaksima.

*; μ 26 DK 174236 B1

Reagenserne var Beckman's "sequence grade 0,1 molar Quadrol buffer", phenylisothiocyanat og heptafluorsmørsyre.

De opsamlede Edman-cykluser blev manuelt omdannet til 2-anilino-5-thiazolinon-5 derivater. 1-chlorbutanet blev tørret under nitrogen. Derpå blev 1,0 N vandig saltsyre sat til 2-anilino-5-thiazolinonet, og blandingen blev opvarmet til 70 °C i 10 minutter for at omdanne det til 3-phenyl-2-thiohydantoinet (PTH-derivat). ΡΤΉ-aminosyreresten blev derpå opløst I 50% acetonitril og injiceret i en revers-fase højtryksvæskechromatograf.

Hver PTH-aminosyre blev derpå identificeret ved sammenligning med tilbage-10 holdelsestiderne af en standardblanding af PTH-aminosyrer, som blev indført i omdannelsesampullen og behandlet på samme mide som en cyklus fra sekvensbestemmelsesapparatet.

E.l.K. Prøvninger til sporing af ekspression af vævsplasminogenaktivator 15 1. Direkte prøvning af plasmindannelse a. Teori 20 En følsom prøvning for vævsplasminogenaktivator kan opnås ved at kontrollere den af vævsplasminogenaktivator katalyserede omdannelse af plasminogen til plasmin. Plasmin er et enzym, for hvilket der er chromogene substratprøvninger. Prøvningerne er baseret på den proteolytiske spaltning af et tripeptid fra en chromofor gruppe. Spaltningshastigheden står i direkte forhold til både specificiteten og koncentrationen af proteasen, som prøves.

25 Basis for prøvningen er bestemmelsen af den mængde plasmin, der dannes efter inkubation af den vævsplasminogenaktivator-holdlge opløsning med en opløsning af plasminogen. Jo større mængde aktivator, jo større mængde plasmin dannes. Plasmin måles ved kontrollering af dens spaltning af det chromogene substrat S2251 (forhandlet af Kabi Group, Inc., Greenwich, CT, USA).

30 b. Procedure

En aliquot af prøven blandes med 0,10 ml 0,7 mg/ml plasminogen (i 0,06 M "Tris" HC1, pH

7,4, indeholdende 0,012 M NaCI), og volumenet indstilles til 0,15 ml. Blandingen inkuberes 35 ved 37°C i 10 minutter, der tilsættes 0,35 ml S2251 (1,0 mM opløsning i den ovennævnte puffer), og reaktionen fortsættes i 30 minutter ved 37°C. Der tilsættes iseddike (25 pi) for at afslutte reaktionen. Prøverne centrifugeres, og absorbansen ved 405 nm måles.

Kvantisering af aktivitetsmængden opnås ved sammenligning med en standard-urokinaseopløsning. Prøvningsbetingelserne til sporing af fuld-længde 40 vævsplasminogenaktivatoren blev modificeret ved tilsætningen af fibrinogen (0,2 mg) til opløsningen. Fibrinogen resulterer i en stimulering af den iagttagne vævsplasminogenaktivator-aktivitet, hvilket resulterer I et noget forhøjet aktivitetsniveau. Aktiviteten blev optegnet i Plough-enheder, hvor 90 000 Plough-enheder er lig med den aktivitet, der udvises af 1 mg renset vævsplasminogenaktivator.

27 DK 174236 B1 2. Indirekte prøvning af plasmindannelse a. Teori 5

En følsom prøvning for vævsplasminogenaktivator-aktivitet er blevet udviklet (87).

Prøvningen er baseret på bestemmelse af plasmindannelse ved måling af graden af plasminnedbrydning af fibrin i en agarplade indeholdende fibrin og plasminogen. Plasmin producerer en klar lysezone i fibrinpladen. Arealet af denne lysezone kan korreleres til 10 mængden af vævsplasminogenaktivator i prøven.

b. Procedure

Ifølge den procedure, som er angivet af Granelli-Piperno and Reich (87) blev pladerne 15 inkuberet i 3,5 timer ved 37°C, og lysezonerne målt. Kvantiserlng blev opnået ved sammenligning med en standard-urokinaseopløsning.

E.l.L. Sporing af vævsplasminogenaktivator-aktivitet 20 1. Bakterievækst og prøvefremstilling

En koloni af E. coli indeholdende plasmidet pARIPA* blev indpodet i et reagensglas indeholdende 5 ml LB-vækstmedium indeholdende 20 μς /ml ampidllin. Cellerne blev dyrket natten over ved 37°C. En aliquot af denne kultur blev fortyndet 1:100 i 300 ml M9-25 medium indeholdende 20 pg /ml ampidllin. Cellerne blev dyrket i en rystekolbe ved 37°C i 4 timer med en resulterende absorbans ved 550 nm på 0,419. Den tryptophananaloge indolacrylsyre tilsattes i en koncentration på 30 pg /ml. Cellerne blev inkuberet i 90 minutter med en resulterende absorbans ved 500 nm på 0,628. Cellerne blev høstet ved centrifugering og gensuspenderet i 0,8 ml 0,01 M "Tris", pH 8,0, indeholdende 0,01 M 30 EDTA. Den resulterende suspension blev omrørt hurtigt ved stuetemperatur i 18 timer.

Prøven blev centrifugeret, og supernatanten prøvet for vævsplasmino-genaktivatoraktivitet.

Mht. ekspression af pt-PAtrpl2, se den detaljerede beskrivelse under forklaringen til fig.

35 10.

2. Aktivitetssporing

Tabellerne 1 og 2 viser resultaterne af aktiveringen af plasminogen med respektive E. coli 40 ekstrakter, når de blev prøvet. Der skabes en aktivitet, som er afhængig af tilstedeværelsen af plasminogen (tabel l). Denne aktivitet påvirkes ikke af præimmunserum fra en kanin, men inhiberes i betydelig grad af antiserum, som blev frembragt over for renset vævsplasminogenaktivator fra melanomaceller (88) (tabel 1 og 28 DK 174236 B1 2). Dette viser, at E. coli ekstrakterne producerer en plasminogenaktiverende aktivitet, som inhiberes af antistoffer over for vævsplasminogenaktivatoren.

Fig. 7 viser resultatet af en fibrinpladeprøvning for fibrinoiytisk aktivitet. En 5 standardmængde af urokinase sattes til midterrækken i koncentrationer på fra venstre til højre 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 og 0,02 Plough-enheder. Den nederste række er prøver af naturlig vævsplasmino-genaktivator med den samme mængde enzym i hvert hul. Hullerne indeholder fra venstre til højre vævsplasminogenaktivator, anti-plasminogenaktivator plus præimmunserum og vævsplasminogenaktivator plus vævsplasminogenaktivator-10 antistoffer. Hullerne i den øverste række indeholder hver 8 μΙ af vævsplasminogen-aktivator-ekstrakterne fra rekombinant E. coli. Det første hul er ekstrakten alene, det andet hul har tilsat præimmunserum, og det tredie hul har tilsat vævsplasminogenaktivator-antistoffer. Det er tydeligt, at præimmunserummet ikke påvirker naturlig eller rekombinant vævsplasminogenaktivator, og at vævs-15 plasminogenaktivator-antistoffeme inhiberer aktiviteten af naturlig vævsplasminogenaktivator såvel som af E. coli ekstrakterne. Baseret på urokinasestandardeme indeholder ekstrakterne lidt mindre end 2,5 Plough-enheder pr. ml.

Dette er favorabelt i sammenligning med den i tabel 1 opnåede værdi på 1,3 Plough-enheder pr. ml.

20

Tabellerne 1 og 2 angiver resultaterne af prøvninger gennemført som beskrevet enfor i afsnit E.l.K,l.b.:ovenfor i afsnit E.l.K.l.b.:

Tabel 1 25

Plasminogenaktivering med E. coli ekstrakter af kulturer indeholdende ρΔΜΡΑ°

Prøve__aktivitet1 %_Beregnede Plouah-enheder/ml 30 Ekstrakt (uden 0,043 (0) plasminogen)

Ekstrakt 0,451 (100) 1,3 35 Ekstrakt plus præimmunserum 0,477 106 ---

Ekstrakt plus anti-PA-antistoffer 0,079 9 40 ’Procent aktivitet beregnes ved at trække blindværdien (0,043) fra de opnåede værdier og dividere med den fra ekstrakten opnåede værdi.

29 DK 174236 B1

Tabel 2

Plasminogenaktivering med E. coli ekstrakter af kulturerne af pt-PAtrpl2 5 Prgy.e__aktivitet1 %

Ekstrakt 0,657 (100)

Ekstrakt plus 10 præimmunserum 0,665 » 101

Ekstrakt plus anti-PA-antistoffer 0,059 9 15

Fig. 10 repræsenterer resultaterne af en fibrinpladeprøvning gennemført med ekstrakter fra 10 liter gæringskultur af E. coli Indeholdende et vævsplasminogenaktivator-ud-trykkende plasmid. Den fibrinolytiske aktivitet af den vævsplasminogenaktivator-holdige ekstrakt repræsenteres i fig. 10 ved hullet A. Denne fibrinolytiske aktivitet inhiberes af 20 anti-tPA-IgG (hul C), men ikke af præimmunlgG (hul B) eller anti-urokinese-IgG (hul D), og der ses ingen aktivitet fra en ekstrakt fremstillet ud fra celler indeholdende leukocyt-Interferon-plasmidet pLEIFAtrpl03 (hul H) som kontrol.

E.2 Fremstilling af t-PA under anvendelse af DHFR-protein med en lav bindingsaffinitet 25 for MTX

E.2.A. Vektorkonstruktion

Sekvensen, der koder for human vævsplasmlnogenaktivator (t-PA) indsættes i et 30 ekspressionsplasmid indeholdende en mutant-DHFR med lav bindingsaffinitet for MTX, beskrevet i US patentansøgning nr. 459 151, indleveret den 19. januar 1983, svarende til EP patentansøgning publikationsnr. 117 060. Indsætningen sker ved følgende procedure (se fig. 11): 35 Tre fragmenter fra overlappende t-PA-plasmider, pPA25E10, pPA17 og pt-PAtrpl2 (ovenfor), blev fremstillet som følger: Plasmid pPA17 blev nedbrudt med Dde I, fyldt ud under anvendelse af Klenow DNA-polymerase I og klippet med Pst I; det således dannede fragment på ca. 200 bp indeholdende S’-terminal t-PA-sekvens blev Isoleret. Det andet t-PA-fragment blev opnået ved nedbrydning af ptPAtrpl2 med PstI og Narl og isolering af 40 fragmentet på 310 bp. Det tredie t-PA-fragment blev opnået ved nedbrydning af pPA25E10 med Narl og Bglll og isolering af fragmentet på omkring 1645 bp, som foruden meget af t-PA-kodeområdet indeholder nogle ikke-translaterede 3'-sekvenser.

30 DK 174236 B1

Plasmid pE342, som udtrykker HBV-overfladeantigen (også betegnet som pHBs348-E) er blevet beskrevet af Levinson et al., US patentansøgning nr. 326 980, indleveret den 3. december 1981, svarende til EP patentansøgning publikationsnr. 73 656. Kort fortalt blev originet for abevirus SV40 isoleret ved nedbrydning af SV40DNA med Hindlll og 5 omdannelse af HindlH-enderne til EcoRI-ender ved tilsætning af en omdanner (AGCTGAATTC). Denne DNA blev klippet med PvuII, og der blev tilføjet RI-linkere. Efter nedbrydning med EcoRI, blev 348 bp fragmentet, som spænder over originet, isoleret ved polyacrylamidgelelektroforese og elektroeluering og klonet ind i pBR322.

Ekspressionsplasmidet pHBs348-E blev konstrueret ved kloning af 1986 bp fragmentet fra 10 EcoRI- og Bglll-nedbrydning af HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) Acad. Press, N.Y.

(1980)) (som spænder over genet, der koder for HBsAG) ind i plasmidet pML (Lusky et al., Nature, 293: 79 (1981)) ved EcoRI- og BamHI-stederne. (pML er et derivat af pBR322, som har en deletion, der eliminerer sekvenser, som er inhiberende for plasmidreplicering i abeceller). Det resulterende plasmid (pRIBgl) blev derpå lineariseret med EcoRI, og 348 bp 15 fragmentet repræsenterende SV40-originområdet blev indført i EcoRI-stedet af pRI-Bgl. Originfragmentet kan indsættes i såvel den ene som den anden orientering. Da dette fragment koder for både den tidlige og den sene SV40-promotor foruden repliceringsoriginet, vil HBV-gener kunne udtrykkes under styring den ene eller den anden promotor afhængigt af denne orientering (pHBS348-E repræsenterer HB’er udtrykt under styring af den tidlige 20 promotor). pE342 modificeres ved delvis nedbrydning med EcoRI, udfyldning af det spaltede sted under anvendelse af Klenow DNA-polymerase I og sammenligering af plasmidet igen, således at EcoRI-stedet forud for SV40-originet i pE342 er fjernet. Det resulterende plasmid, betegnet pE342 RI, nedbrydes med EcoRI, udfyldes under anvendelse af Klenow DNA-polymerase I og klippes med BamHl. Efter elektroforese på 25 acrylamidgel elektroelueres, phenol-chloroform-ekstraheres og ethanol-fældes fragmentet på omkring 3500 bp som ovenfor.

Den således fremstillede pE342 3500 bp vektor og de ovenfor beskrevne t-PA-f rag menter på omkring 2160 bp blev sammenligeret under anvendelse af standardteknik. Et plasmid 30 indeholdende de tre t-PA-kodende fragmenter i den rigtige orientering blev isoleret, karakteriseret og betegnet pF342-t-PA. Dette plasmid blev nedbrudt med Sac II og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. For at tilvejebringe DHFR-sekvensen (sammen med styringssekvenser for dens ekspression) blev der frembragt et fragment på omkring 1700 bp ved SacII-nedbrydning af pEHER. (pEHER er et plasmid, som udtrykker 35 mutant-DHFR, og som er beskrevet i US patentansøgning nr. 459 151 (ovenfor)). Dette fragment blev ligeret ind i pE342-t-PA-plasmidet til dannelse af pETPAER400, et plasmid, som er analogt med pEHER, undtagen at HBsAg-kodningsområdet er blevet erstattet med cDNA-sekvenserne fra t-PA.

40 E.2.B Ekspression og amplifikation af t-PA-sekvensen pETPAER400 (pETPER) blev transficeret ind i både dhfr CHO-DUX Bil celler og DHFR+ CHO-Kl (ATCC CCL61) celler ved den metode, som er angivet af Graham og Van der Eb (ovenfor). Transformerede dhfr celler blev selekteret ved vækst i glycin-, hypoxanthin- og 31 DK 174236 B1 thymidin-deficient medium. Transformerede DHFR+ celler blev selekteret ved vækst i 2100 nM MTX. Kolonier, som opstod på det passende selektionsmedium, blev isoleret under anvendelse af kloningsringe og formeret i det samme medium til flere generationer.

5 Til amplifikation udspredes celler fra kolonierne i medier indeholdende 5 x 104, 105, 2, 5 x 10s, 5 x 105 og 106 nM MTX og passeres igennem flere gange. Celler udsås i meget lave (102-103 celler/plade) celletætheder i 10 cm skåle, og de resulterende kolonier isoleres.

E.2.C Prøvningsmetoder 10

Ekspression af t-PA i de transficerede forstærkede kolonier kan hensigtsmæssigt bedømmes ved fremgangsmåder, som ligner dem, der er anført i afsnit E.l.K.l.b (ovenfor).

Samtidig amplifikation af DHFR- og t-PA-sekvenser bedømmes ved isolering af DNA fra 15 sammenflydende monolag af forstærkede kolonier som følger: Sammenflydende monolag i 150 mm plader vaskes med 50 ml steril PB5 og lyseres ved tilsætning af 5 ml 0,1% SDS, 0,4 M CaC12, 0,1 M EDTA, pH 8. Efter 5-10 minutter fjernes blandingen, phenolekstra-heres, chloroformekstraheres og ethanolfældes. DNA'en gensuspenderes i 1 ml (pr. 150 mm plade) 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA (TE), der tilsættes RNase til 0,1 mg/ml, og 20 opløsningen inkuberes i 30 minutter ved 37°C . Derpå tilsættes SDS til 0,1% og pronase (Sigma) til 0,5 mg/ml. Efter 3-16 timers inkubation ved 37°C ekstraheres opløsningen igen med phenol, med chloroform og fældes med ethanol. DNA-pillen gensuspenderes i 0,5 ml vand og nedbrydes med restriktionsenzymer. Omkring 5-10 pg nedbrudt DNA underkastes elektroforese i en agarosegel [1% agarose i "Tris"-acetatpuffer (40 mM "Tris", 1 mM EDTA, 25 indstillet til pH 8,2 med eddikesyre)]; Crouse et al., J. Biol. Chem., 257: 7887 (1982)).

Efter at blåt bromphenolfarvestof var vandret 2/3 af vejen ned gennem gelen, blev gelen fjernet og farvet med ethidiumbromid. Efter synliggørelse af DNA’en med ultraviolet lys overføres DNA'en fra gelen til nitrocellulosefiltre ifølge Southerns procedure (J. Mol. Biol.

98: 503. (1975)). Filtrene hybridiseres derpå med en nick-translateret sonde fremstillet ud 30 fra 1700 bp SacII-fragmentet af pEHER (fremstillet og hybridiseret som beskrevet ovenfor) eller ud fra Bglllfragmentet af pETPER på omkring 1970 bp.

E.3 Produktion af t-PA i sammenhæng med vild-type-DHFRprotein 35 E.3.A. Vektorkonstruktion På en måde, som er analog med den, der anvendtes ved konstruktionen af pETPER, konstrueredes plasmid pETPRF indeholdende DNA-sekvensen, der koder for vild-type-DHFR. Konstruktionen foregik som beskrevet I eksempel E.2.A, undtagen at 40 plasmidet pEHER som kilde for DHFR-proteingensekvensen blev erstattet med plasmidet pE342.HBV.E400.D22, som er beskrevet i US patentansøgning nr. 459 152, indleveret d.

19. januar 1983, svarende til EP patentansøgningspublikations nr. 117 058. Plasmidet pE342.HBV.E400.D22 er det samme som pEHER, undtagen hvad angår en forskel på et enkelt basepar mellem vild-type- og mutant-DHFR. Således er det resulterende plasmid 32 DK 174236 B1 pETPFR, analogt i enhver henseende med pETPER, undtagen at DNA-sekvensen, der koder for vild-type-DHFR er anvendt i stedet for sekvensen af mutanten.

E.3.B. Ekspression af t-PA-sekvens 5 pETPFR blev anvendt til at transficere DHFR-deficiente CHO-celler (Urlaub og Chasin (ovenfor)) under anvendelse af calciumphosphat-fældningsmetoden angivet af Graham og Van der Eb. 21 kolonier, som opstod pi det selektive medium (-HGT) blev prøvet ved sporing af plasmindannelse som bedømt ved nedbrydningen af fibrin i en agarplade in-10 deholdende fibrin og plasminogen, beskrevet af GranelliPipemo et al., J. Exp. Med., 148: 223 (1978).

Fire af de stærkest positive kloner blev derpå prøvet kvantitativt for plasmindannelse på en pr. -celle-basis ifølge den metode, som er anført i afsnit E.l.K.l.b.

15

Ved en sådan kvantitativ bestemmelse fandtes det, at de fire prøvede kloner udviste den samme eller sammenlignelige t-PA-sekretion til mediet, bestemt som enheder/celle/dag.

Subkloner blev fremstillet ved overføring af podemateriale fra to af klonerne til separate plader indeholdende -HGT-medium. To af de resulterende subkloner, 18B og 1, blev 20 anvendt til yderligere analyse.

E.3.C. Amplifikation og t-PA-produktionsniveauer

De ovennævnte subkloner blev udslet i en koncentration på 2 x 10s celler pr. 100 mm 25 plader i 50 nM MTX for at promotere amplifikation. De celler, som overlevede, gav, når de blev prøvet som beskrevet ovenfor, i alle tilfælde omkring ti gange den uforstærkede mængde af vævsplasminogenaktivator-aktivitet. To af disse kloner blev udvalgt til yderligere undersøgelse og blev navngivet 1-15 og 18B-9.

30 Subklon 1-15 blev yderligere forstærket ved podning af 2 x 105 celler i 100 mm plader indeholdende 500 nM MTX. Prøvning af de således forstærkede celler gav en yderligere forøgelse (på omkring tre gange) i t-PA produktion; når de blev prøvet kvantitativt ved fremgangsmåden fra afsnit C.I.C., var niveauerne i området 7 x 104 enheder/celle/dag. En portion af disse forstærkede celler blev derpå overført og holdt i nærvær af 10 000 nM 35 MTX. Subkloner af 1-15 og 18B-9 blev yderligere prøvet efter at være holdt i omkring 1-2 måneder ved de i tabel 3 specificerede betingelser.

33 DK 174236 B1

Tabel 3

Cellelinje Vækstbetingelser ng t-PA/celle/dag* 5 l-15soo 500 μΜ MTX 28,5 x 10 3 l-15soo 500 μΜ MTX 26,0 X 10 3 l-15soo (-HGT medium, intet MTX) 8,3 x 10'3 10 l-lSsoo (-HGT medium, intet MTX) 18,0 x 10'3 l-15toooo 10 μΜ MTX 29,3 x 10 3 15 1-15,0000 10 μΜ MTX 49,0 X 103 18B-9 50 μΜ MTX 14,3 x 10‘3 18B-9 50 μΜ MTX 14,4 x 10 3 20 18B-9 (-HGT medium, intet MTX) 14,3 x 10'3 18B-9 (-HGT medium, intet MTX) 14,4 x 103 25 1 (-HGT medium, intet MTX) 1,0 x 103 1 (-HGT medium, intet MTX) 0,7 x 10-3 30 *t-PA i kulturmediet blev prøvet kvantitativt ved en radioimmunprøvning som følger: renset t-PA og renset ioderet sporings-t-PA afledt fra melanomaceller blev fortyndet i serie til at inkludere koncentrationer på 12,5-400 ng/ml i en puffer indeholdende phosphatpufret saltopløsning, pH 7,3, 0,5 % okseserumalbumin, 0,01 % "Tween 80" og 0,02 % NaN3. Passende fortyndinger af mediumprøver sattes til 35 de radioaktivt mærkede sporingsproteiner. Antigenerne fik lov at inkubere natten over ved stuetemperatur i nærvær af en 1:10000 fortynding af IgG-fraktionen af et kanin-anti-t-PA-antiserum. Antistof-antigen-komplekset blev fældet ved absorption til gede-anti-kaninlgG-immunperler (BioRad) i to timer ved stuetemperatur.

Perlerne blev klaret ved tilsætning af saltopløsning som fortyndingsmiddel 40 efterfulgt af centrifugering i 10 minutter ved 2000 G ved 4 °C. Supernatanterne blev smidt væk, og radioaktiviteten i bundfaldene blev kontrolleret.

Koncentrationer blev tilskrevet ved sammenligning med referencestandard.

34 DK 174236 B1

Cellelinjerne er som følger: cellelinje "1" er en uforstærket klon fra det oprindelige sæt på fire. "1-15500" er en forstærket subklon af cellelinje "1", som først blev forstærket i 50 nM MTX til opnåelse af 1-15 og derpå overført til yderligere amplifikation i 500 nM MTX. 1-1510000 er en subklon af 1-15500, som er blevet yderligere forstærket i nærvær af 10000 5 nM MTX. Cellelinje 18B-9 er en subklon af en af de oprindelige fire sporede, som er blevet forstærket på 50 nM MTX.

Alle de forstærkede celler viser forøgede niveauer af tPA-produktion i forhold til det, der udvises af den uforstærkede cellekultur. Selv den uforstærkede kultur producerer 10 mængder aft-PA på over 0,5 pg/celle/dag; amplifikation resulterer i niveauer, der nærmer sig 50 pg/celle/dag.

F. Farmaceutiske præparater 15

Forbindelserne kan sammensættes ifølge kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved det omhandlede humane vævsplasminogenaktivator-produkt kombineres i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bærermedium. Egnede bærere og deres sammensætning, inklusive andre humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin, er 20 beskrevet f.eks. i Remington’s Pharmaceutical Sciences af E.W. Martin. Sådanne præparater vil indeholde en effektiv mængde af det omhandlede protein sammen med en egnet mængde medium til fremstilling af farmaceutisk acceptable præparater, der er egnede til effektiv indgivning hos værten.

25 F.eks. kan den omhandlede humane vævsplasminogenaktivator indgives parenteralt til individer, der lider af cardiovasculære sygdomme eller tilstande. Dosering og dosishyppighed kan svare til det, som for tiden anvendes ved kliniske undersøgelser af andre cardiovasculære thrombolytiske midler, f.eks. omkring 440 int.enh./kg legemsvægt som en intravenøs grunddosering efterfulgt af en kontinuert intravenøs infusion med omkring 30 440 int.enh./kg/h i 12 timer hos patienter, der lider af lungeemboli.

Som et eksempel på en passende doseringsform af i hovedsagen homogen vævsplasminogenaktivator i parenteral form kan en ampul indeholdende 25000 int.enh. vævsplasminogenaktivator-aktivitet, 25 mg mannitol og 45 mg NaCI rekonstitueres med 5 35 mi sterilt vand til injektion og blandes med et egnet volumen 0,9% natriumchloridinjektionsvæske eller 5 % dextrose-injektionsvæske til intravenøs indgivning.

G. Detaljeret beskrivelse af rekombinant human t-PA 40

Strukturen af den bestemte udførelsesform af human t-PA fremstillet i de foranstående eksempler er blevet undersøgt ret detaljeret både ved opklaring af genkodesekvensen og ved proteinbiokemi-teknik. Den nuværende forståelse af proteinstrukturen er vist i fig. 12.

35 DK 174236 B1

Det er tidligere blevet påvist af Collen og medarbejdere (88), at to-kæde human t-PA dannes ved proteolytisk spaltning af enkelt-kæde-molekylet til to polypeptider forbundet af disulfidbinding. Det foreliggende arbejde tillader den konklusion, at den tunge kæde (molekylvægt 30882) er afledt fra den NH2-terminale del, og den lette kæde (molekylvægt 5 28126) omfatter det COOH-terminale område. N-terminal sekvensbestemmelse af to-kæde-molekylet tyder på, at to-kæde-formen dannes ved spaltning af en enkelt arginyl-isoleucin-binding (fig. 12; vist ved pil).

Den primære struktur af en portion af tung-kæde-området af human t-PA (fig. 12) afslører 10 en høj grad af sekvenshomologi med "kringle"-områderne af plasminogen (89) og prothrombin (40, 41). "Kringle'-området henfører til en karakteristisk tredobbelt disulfidstruktur, som oprindeligt blev opdaget i ”proM-fragmentet af prothrombin og først beskrevet i detaljer af Magnusson et al. (91, 92). Fra den primære sekvens af t-PA fremgår to såkaldte "kringle"-områder på hver 82 aminosyrer, der deler en høj grad af 15 homolog! med de fem "kringieH-områder i plasminogen. De resterende 91 N-terminale aminosyrer har kun lidt homologi med det konventionelle "kringle"-område. Man kan imidlertid forestille sig, at dette område også kan antage en struktur indeholdende flere disulfldbindinger, da der her findes 11 yderligere cysteinrester.

20 Det katalytiske sted i den lette kæde af human t-PA, det såkaldte serinprotease-område, dannes som i andre serinenzymer mest sandsynligt ved histidin322 , asparaginsyre371 og serin478-resterne. Endvidere er aminosyresekvenserne, som omgiver disse rester, meget homologe med de tilsvarende dele af andre serinproteaser, såsom trypsin, prothrombin og lasminogen.

25 36 DK 174236 B1

Bibliografi I. US patentskrift nr. 3355361.

5 2. US patentskrift nr. 3926727.

3. US patentskrift nr. 4029767.

4. US patentskrift nr. 4258030.

10 5. US patentskrift nr. 4271150.

6. EP offentliggørelsesskrift nr. 0037687.

15 7. Rijken, D.C., "Plasminogen Activator from Human Tissue", Krips Repro Meppe, 1980.

8. US patentskrift nr. 3555000.

20 9. US patentskrift nr. 3998947.

10. US patentskrift nr. 4245051.

II. EP offentiiggørelsesskrift nr. 0023860.

25 12. US patentskrift nr. 4083961.

13. US patentskrift nr. 4177262.

30 14. US patentskrift nr. 4082612.

15. Wallen, P., Proc. Serono Symp., 9, 91 (1977).

16. Thorsen, S., et al., Thrombos, Diathes. haemorrh., 28, 65 (1972).

35 17. Collen, Thrombos. Haemostas. 43, 77 (1980).

18. Wiman et al., Nature 272, 549 (1978).

40 19. EP offentliggørelsesskrift nr. 0041766.

20. Weimar, W. et al., The Lancet Vol. II, No. 8254, p. 1018 (1981).

21. GB offentliggørelsesskrift nr. 2007676A.

37 DK 174236 B1 22. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

23. Microbiology, 2d Ed., Harper and Row Publications, Inc., Hagerstown, Maryland 5 (1973), isærside 1122 ff.

24. Scientific American 245. 106 (1981).

25. GB offentliggørelsesskrift nr. 2055382A.

10 26. DE offentliggørelsesskrift nr. 2644432.

27. Chang et al.. Nature 2Z5, 617 (1978).

15 28. Itakura et al., Science, 198.1056 (1977).

29. Goeddel et al., Nucleic Acids research 8, 4057 (1980).

30. EP offentliggørelsesskrift nr. 0036776.

20 31. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980).

32. Stinchcomb et al., Nature 282. 39 (1979).

25 33. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).

34. Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980).

35. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (1980).

30 36. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134. 48 (1978).

37. Jones, Genetics 85, 23 (1977).

35 38. Hitzeman et al„ J. Biol. Chem. 25.5, 12073 (1980).

39. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968).

40. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978).

40 41. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

42. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, New York.

38 DK 174236 B1 43. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975).

44. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds. (1973).

5 45. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).

46. Bolivar et al.. Gene 2, 95 (1977).

10 47. Lusky et al., Nature 293. 79 (1981).

48. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).

49. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978).

15 50. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).

51. Crea et al., Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980).

20 52. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980).

53. Gray et al., Nature 225, 503 (1982).

54. Oppermann et al., Virology 108. 47 (1981).

25 55. Ward et al., J. Virol. 9, 61 (1972).

56. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 1408 (1972).

30 57. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).

58. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979).

59. Lodish, Ann. Rev. of Biochem. 45, 40 (1976).

35 60. Pelham et al., Eur. J. Biochem. 43, 247 (1974).

61. Biobel, et al., 1. Cell Biology 67, 852 (1975).

40 62. Shields et al., 3. Biol. Chemistry 253, 3753 (1978).

63. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).

64. Bonner et al., Eur. J. Biochem. 46, 83 (1974).

39 DK 174236 B1 65. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).

66. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

5 67. Chang et al., Nature 225, 617 (1978).

68. Bolivar et al., Gene 2, (1977).

10 69. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A. 72, 3961 (1975).

70. Hanahan et al., Gene 10, 63 (1980).

71. Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

15 72. Smith, Methods Enzymol. 65, 499 (1980).

73. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

20 74. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 499 (1980).

75. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 5765 (1978).

76. Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978).

25 77. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).

78. Benton et al., Science 196. 180 (1977).

30 79. McGrath and Levinson, Nature 295, 423 (1982).

80. Blin et al., Nucleic Acid Res. 3, 2303 (1976).

81. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).

35 82. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980).

83. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442. 324 (1976).

40 83b. Edman et al., European J, Biochem. 1, 80 (1967).

84. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641 (1966).

85. Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3683 (1979).

40 DK 174236 B1 86. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980).

5 87. Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med. 148, 223 (1978).

88. Rijken et al., J. Biol. Chem. 25£, 7035 (1981).

89. Sottrup-Jensen et al., Progress in Chemical 10 Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Raven Press, N.Y. p. 191 (1978).

90. Sothrup-Jensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72, 2577 (1975).

91. Magnussen et al., Proteolysis and Physiological Regulation, Ribbons et al., Eds., 15 Academic Press, New York, p. 203 (1976).

92. Magnussen et al., Proteases and Biological Control, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., p. 123 (1975).

20 93. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).

94. Reich, E., Proteases and Biological Control, (Ibid) p. 333-341.

25 95. Matsuo, 0., et al., Throm. Haemostasis 45 225 (1981).

96. Koringer, C., et al., Throm. Haemostasis 46 561, 662 (1981).

97. Hoylaerts, M., et al., J. Biol. Chem. 257 2912 (1982).

30 98. Koringer, C., et al., Thromb. Haemostasis 46 685 (1981)

Claims

41 DK 174236 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har human vævsplasminogen-aktivator-funktion, og som især er i stand til at katalysere omdannelsen af plasminogen til 5 plasmin, det binder til fibrin og er klassificeret som en t-PA baseret på immunologiske egenskaber, kendetegnet ved ekspression i en rekombinant værtsorganisme af transformerende DNA, som koder for proteinet; hvor proteinet omfatter en sekvens på 527 aminosyrer fra N-terminal serin til C-terminal prolin i fig. 5, som kan kodes af cDNA, der er afledt af mRNA, som er ekstraheret fra Bowes-melanomcel lelinjen, og som 10 (a) har det i fig. 4 viste restriktionsmønster for den formodede modne vævsplasmi nogenaktivator-sekvens, og (b) hybridiserer kraftigt med sekvenserne: 15 (i) 5'-TCACAGTACrCCCA-3' (ii) 5’-TTCTGAGCACAGGGCG-3’ <iii) et 4,2 kb langt PvuII-fragment fra humant genomisk DNA, som hybridiserer kraftigt med sekvensen 20 30 40 CGG GTG GAA TAT TGC TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CAC TCA 50 60 GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACC 66

25 TGC CAG CAG GCC CTG T.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som har human vævsplasminogen-aktivator-funktion, og som især er i stand til at katalysere omdannelsen af plasminogen til 30 plasmin, det binder til fibrin og er klassificeret som en t-PA baseret på immunologiske egenskaber, kendetegnet ved ekspression i en rekombinant værtsorganisme af transformerende DNA, som koder for proteinet, hvor proteinet omfatter en allel eller et derivat som følge af aminosyredeletion, -substitution, -insertion, -addition eller -udskiftning af den i krav 1 definerede 527 aminosyrer lange sekvens. 35

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der fremstilles et protein, som ikke er ledsaget af giycosylering, der er nativ for human vævsplasminogenaktivator.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at værtsorganismen er en E. coli-stamme.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at værtsorganismen er et ikke-humant pattedyr. 45

42 DK 174236 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at værtsorganismen er en kinesisk hamsterovarie-cellelinje.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, 5 at den omfatter isolering og oprensning af proteinet.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat kendetegnet ved, at der anvendes et protein med vævsptasminogenaktivator-funktion fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7. 10

9. DNA-isolat, kendetegnet ved, at det koder for et protein, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller 2.

10. Rekombinant kloningsvektor, kendetegnet ved, at den indeholder DNA, som 15 koder for et protein, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller 2.

11. Rekombinant ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den indeholder DNA, som koder for et protein, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller 2, og at den i en transformerende mikroorganisme eller cellekultur er i stand til at udtrykke den 20 kodende sekvens og producere det tilsvarende protein.

12. Mikroorganisme eller cellekultur, kendetegnet ved, at den er transficeret med DNA, der koder for et protein, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller 2, og at den er i stand til at udtrykke DNA'et med henblik på at fremstille proteinet. 25

13. Mikroorganisme ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den er en E. coli-stamme.

14. Cellekultur ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den er en pattedyrcellelinje.

15. Cellekultur ifølge krav 14, kendetegnet ved, at cellelinjen er en kinesisk hamsterovarie-cellelinje.