JPH02296150A - 血液試験法 - Google Patents

血液試験法

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JPH02296150A
JPH02296150A JP2054789A JP5478990A JPH02296150A JP H02296150 A JPH02296150 A JP H02296150A JP 2054789 A JP2054789 A JP 2054789A JP 5478990 A JP5478990 A JP 5478990A JP H02296150 A JPH02296150 A JP H02296150A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、患者が以前に、ある種の抗原、さらに詳しく
は疾患、感染、アレルギーまたは類似の疾病を指示する
抗原にｋｌｉ露されたことがあるか否かを決定するため
の操作に関する。
疾患等のり陰性について患者を診断する場合、医師は通
常、各種疾患または他の疾病に対する以前のｉｈを指示
する血液中の因子の存否を決定するため血液検査を行う
ことになる。抗原、一般的には感染性物質への患者の以
前の暴露を決定するための旧来の検査は通常、提起され
る抗原に対Ｊ−る循環体液性抗体の存否に関づる試験に
よっていた。このような試験の例には、風疹や多数の他
のウィルスおよび細菌抗原に対する免疫性を検出する血
液検査が包含される。抗体の検出手段は多数あって、抗
原Ｍ覆うデックス粒子の凝集もしくｔよ凝集欠如を観察
するうｊツクス凝集反応；発色を肉眼的にもしくは分光
測光法で観察する固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：
放射能の値を測定Ｊる放射免疫測定法；リポソーム中に
含まれる色素もしくは蛍光の存在および強電（もしくは
不存在）を検出するリボンーム法：固体基質に付着した
放射能の値を測定する放射免疫測定法Ｍ（ＲＡＳＴ’）
、検出すべき抗体に対する固定化抗原を試験リンプルと
反応させ、抗原を洗浄してＪ１特異的に付着した抗体を
除去し、試験すべきクラスの抗体に向けられた蛍光標識
抗体を適用し、蛍光の存否を測定する間接免疫蛍光法；
ならびにその他の方法を挙げることが−Ｃきる。抗体が
存在する場合はその力価を測定し、その免疫グ臼ブリン
クラスを決定しくとくに興味があるのｔよ、ＩｑＭ：急
性の′！Ｊ露を意味する、ＩｇＧ：過去の′ＪＡ露を意
味する、ＩＱＥ：７レルギー状態を意味づる）、与えら
れた抗原への以前の思召の暴露を決定することができる
。上述の試験はすべてＢ−リンパ球と呼ばれる一部のリ
ンパ球の機能を測定するものである。
症例によっては、また疾患の過程によっては、抗体応答
が全くまたはほとんど起こらない場合があって、上述の
試験では患者の以前の暴露を決定できないことがある。
しかしながら、多くの疾患および臨床状態は、検知可能
な体液性抗体すなわら１３−リンパ球応答を生じないこ
とはあっても、細胞性免疫すなわち］−リンパ球応答は
必ず産生υる。［−リンパ球応答が優占する疾患および
臨床状態の例には、多くの゛符生体疾患、結核、サル七
ネラ症、淋病、かび感染症、リケッチア感染症およびＬ
ｙ＋＋ｅ病がある。
Ｄａｔｔｗｙｌｅｒらの最近の報告（Ｎｅｗ　ＥｎｌＪ
ｌ、　Ｊ、　Ｈｅｄ、３１９：１４４１．１９８８＞に
よれば、疾患の初期の過程である種の抗生物１１療法を
受１〕た患者を含めてかなりの割合の患者は、Ｌｙｍｅ
病スピロヘータに対して検出可能な抗体を産生しないが
、測定可能なＴ−リンパ球応答は示すという。
疾患、感染性物質等への以前の暴露により［−リンパ球
応答が血中に起こるかどうかを決定するには２種の一般
的な方法がある。第一の操作は、以前の暴露から生じた
形態学的な細胞の変化によるものである。以前に暴露さ
れた１−リンパ球は、その特定の抗原に再捕露された場
合、芽１１Ｉ胞様の特性を示すのであろう。たとえば、
Ｔ−リンパ球は１［常より大きい核とａｎな好塩基性細
胞買をしつようになる。活性化を示づ生化学的変化、た
とえば膜リン脂質の体謝回転の増加、ＲＮへおよびタン
パク賀合成の増大、細胞内Ｃａ　　’ＩＡ度の変化、丁
−細胞成長因子インターロイキン−２に対する表面受容
体の発現、３日−チミジンの取り込みの増大、ならびに
最近のＣｈａｔｉｌａ　、　ｒ、らの報告（Ｎｅｗ　Ｆ
ｎｇｌ、　Ｈｅｄ、Ｊ、、　３２０　：　６９６．１９
８９　）にまとめられ−Ｃいる他の現家ら起こる。
］−リンパ芽球の検定のため過去に最も使用され、また
与えられた抗原に対する特異的な［−リンパ球応答の存
否を検出するためｏａｔｔｗｙ＋ｅｒらによりｔ、ｙｎ
＋ｅ病の研究に用いられた方法は、トリチウム化チミジ
ン取り込みの検定（３Ｈ−チミジン取り込み検定）であ
る。この検定は、煩雑であり、敢（ト）性同位元素を必
要とし、また比較的純粋なリンパ球集団の単頗を要求し
、また完了までに数日かかる。
本発明は、患者血液中の以前に暴露されたＴリンパ芽の
存否を検出Ｊるメζめの簡単な技術に関する。疑われる
疾病を診断するための抗原をたとえば緩！！ｉ良塩溶液
のような適当なｐ１１調節メジウム中に分散させて、患
者の全血とともにインキュベー１−する。このインキュ
ベーションにより、以前に暴露されたリンパ球は活性化
され、最終的には芽１１１胞の形態を示すように、すな
わちリンパ芽球になる。適当な時間インキュベートした
のちに、蛍光染料、たとえばカルシウム感受性染料ｆｕ
ｒａ−２の７レトメチルエステルまたは活性化リンパ球
もしくはリンパ芽球に対して親和性を有する伯の？？色
剤を血液サンプルに加える。染料は、化学的手段すなわ
ち、過剰のカルシウムイオンと結合することにより、ま
たは他の手段たとえばトランスノェリン、Ｌｃｕ　−２
３、■−細胞成長因子インターロイキン−２等に特異的
な蛍光標識抗体を付加することにより、活性化リンパ球
または生成したリンパ芽球に吸引されるようになる。染
色、着色剤：または蛍光標識抗体が、血液サンプル中の
応答リンパ球またはリンパ芽球を特異的に識別可能にづ
る。識別性を付与する添加剤は、応答リンパ球に、リン
パ球が真のリンパ芽球になる前またはなった後のいずれ
に結合してもよいことに注目すべきである。すなわち、
以前に感作されたリンパ球は、完全に形態学的変化が起
こる前に、添加物を引きつける特性を表す。処理した血
液を次に、フ【］−トを内部に含む透明なチューブ中で
遠心分離して、リンパ芽球を含むすべてのリンパ球をチ
ューブ中の小面積内にＩｌ縮する。リンパ芽球の濃縮技
術は１９７７年６月７日、５ｔｅｐｈｅｎ　Ｃ１ａｒｋ
ＷａｒｄｌａＷらに付与された米国特許用４．０２７゜
６６０号に開示されている。チューブは毛細管で５、ま
た予め真空にしたもっと大きなチューブでもよい。ｍ胞
濃縮が終わったのら、リンパ球層を調べて、リンパ球層
内のリンパ芽球の存在を指示する打色または蛍光のレベ
ルを検出覆る。このような着色または蛍光特性の検出は
たとえば１９７８年５月おＪ、び１９８５年１２月にそ
れぞれいずれら５ｔｃｐｈｅｎ　Ｃ，Ｗａｒｄｌａｗに
付与された米国特許用ｉ　１５６，５７０号および第４
．５５８．９４７号に開示された′Ｓ！置を用いて実施
づることができる。
したがって、本発明の目的は、患者血液中のリンパ球を
感作する抗原への以前の患茜の届露を診断するための改
良された操作および装置を提供することにある。
さらに本発明の１°１的は、上述の操作において、血液
サンプルに光学的に検出ｒＴＩ　１１！なインジケータ
ーを添加して血液リンプル中の応答リンパ球を光学的に
識別性にする操作を提供することにある。
さらに本発明の目的は、上述の操作において、感作リン
パ球はＴ−リンパ球である操作を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、上述の操作においで、血液
サンプルを透明なチューブ中で遠心分離してリンパ球を
バンドに濃縮し、ついで識別性の指示を光学的に分析す
る操作を提供することにある。
これらのまた他の目的および利点は、本発明の好ましい
８様に関する以Ｆの詳細の説明ならびに添付の図面から
より明白になるものと考える。
第１図は、本発明の操作を実施するためのキットに使用
される３個のサンプルチューブの透視図である。
第２図は、光学的識別性の検査のための血球の層化を行
った遠心分離チューブの透視図である。
本発明には陰性および陽性対照を包含させることができ
る。陰性対照はＴ−リンパ球が非特異的刺激に対して応
答しないことを確定するために用いられる。陽性対照は
、患者のリンパ球が、患者の過去に１ａ露されたことの
知られている単一のししくは混合した抗１Ｊｉｊたとえ
ば破傷風トキソイド、シフテリアト１−ソイド、モンス
リア、またはリンパ球を活性化Ｊることが知られている
化学物質たとえばフィトヘアグルチニン、フッ化アルミ
ニウム等に応答できるかどうかを確定するために用いら
れる。
患者の血液は３個の別個の試薬つ１ルまたは容器、陰性
試験対照容器２、サンプリング容器４、および陽性試験
対照ｆＶ３６中に入れられる。これらはそれぞれス１〜
ツバー付の盈８が施され、この蓋を通して血液が移され
る。染料は別個に加えてもよく、また３個の容器の内部
に予め′＃Ｉｌ覆しておくこともできる。
陰性試験容器２はその中に抗原メジウムを含ｌυでいる
が、抗原【よ含まない。血液を抗原メジウムに加え、そ
の中で試験サンプルと同様、着色剤または蛍光物質を加
える。次に血液サンプルを、リンパ球／単球バンド１４
が占める空間を制限するプラスヂックフ［１−ト１２を
含む遠心分１１１１チューブ１０中゛Ｃ遠心分離する。
このバンドについ−Ｃ次に識別化の形跡を調べる。それ
が認められる場合に１１、血液サンプル中でリンパ球の
活性化が自然に起こりつるということであって、試験サ
ンプルにおける類似の結果の真実性には問題が残る。着
色変化が認められない場合はナンブルの結果の真実性が
６［される。すなわら、血液サンプル中には自然のリン
パ芽球は存在しないことが確認される。　陽性試験容器
６は、血液サンプルを、上述のように、正常な患者の大
部分でリンパ球の活性化が知られている感染性抗原中の
いずれかの抗原と混合づるために使用する。陽性のイン
キュベージコン混合物を、インキュベートされた血液＋
Ｊシンブル中形成されるＭ　Ｉ’ｄ誘発リンパ芽球に親
和性を右Ｊ−る着色剤または蛍光物質とともに、第２図
に示すように遠心分離する。血球バンド１４中の識別化
されたリンパ芽球の存否を調べる。それが存在づる場合
は、この試験に対する患者血液の感受性が確認される。
存在がみられない場合に番よ、医師はその試験に患者が
感受性を示さないことを確認でき、試験される疾患抗原
に対する陽性反応の欠如の理由を決定するための１０ト
」−ルを用い、試験抗原に対ηる陰性反応がその抗原に
対する以前の鷺露および感作の欠如を示すとは考えられ
４１いことが確認される。
すなわら、患者に対する試験の有用性は、陽性対照に対
ザる患者の陽性反応および陰性対照に対する陰性反応に
よってｖｌ認することができる。
本発明は以下の点で従来の操作とは異なる。
１）本発明は、個々の各細胞からの蛍光シグナルを測定
する個々の細胞の計数とは異なり、集合させたリンパ球
の全集団の集積された蛍光を利用される（血液１１０μ
ｌを含む遠心分離された毛細管のリンパ球／甲球バンド
には数十５個の細胞が含まれている）。
２）本発明は予めリンパ球を精製、単ｍする必要がなく
、したかつ−（仝血（凝固阻止）について実施できる。
３）本発明は放射性同位元素の使用を必要とし１．５い
。
４）−・緒に包装した試験バック中に構成要素として陰
性対照および陽性対照、ならびに既定ｒｒ）の抗原が用
いられ、しかも結果の解釈にはラフ１〜ウエアを使用で
きるので、研究の訓練を受けていない者にも容易に使用
できる。
抗原に対するＴ−リンパ球応答の容易に実Ｍｊ　ｉ’ｉ
Ｊ能な試験法の応用の可能性はいくら強調してし強調し
すぎということはない。上に掲げた疾患の診断の補助の
可能性のほかに、本発明の試験方法は次のような場合、
すなわら湿疹またｔよ接触性皮膚炎のような遅延循１過
敏竹及応の原因の診断、測定ｉ＋］能な抗体応答を生じ
る前の窓用におけるある種のウィルス感染症の診断、自
己免役疾患の経過の追跡、および腫瘍抗原の存在または
抗腫瘍免疫の尺磨として診断に有用である。
試験はまた一部の抗原、たとえば数種のマラリアからの
抗原について実施することもできる。陽性反応がみられ
たならば、個々の種について試験を行い、関係するマラ
リアの秒を同定する。アレルゲンについてもパネル試験
ついで特異的試験を実施することかできる。
本発明は以上、ヒトの患者に関連して説明したが、本発
明は動物についても使用できるものであり、患者の詔に
は動物も包含される。
本発明の、以上開示された態様には、本発明の概念から
逸脱することなく多くの変更および改変が可能であって
、本発明は特許請求の範囲による以外のたとえば上述の
特定の態様によって制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明を実施するためのキットに用いられる３
個のチューブの透視図であり、第２図は光学的識別性の
＠査のために血球の層化を打つＩご遠心分離チコーブの
透視図゛Ｃある。

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）血中のリンパ球を感作する抗原への患者の以前の
    暴露の有無を決定する血液試験法において、ａ）患者の
    血液サンプルとその暴露が疑われる抗原との混合物を形
    成し、ｂ）この混合物に、その疑われる抗原に応答する
    血中のリンパ球と親和性を有する光学的に検出可能なイ
    ンジケーターを添加して上述の応答するリンパ球を光学
    的に識別可能にし、ｃ）その混合物の一部を透明なチュ
    ーブ中で遠心分離してチューブ内にリンパ球／単球をバ
    ンドとして濃縮し、ついでｄ）遠心分離されたリンパ球
    ／単球バンド中における光学的に識別可能なリンパ球お
    よび／またはリンパ芽球の存否を決定して患者のリンパ
    球の一部が疑われる抗原に感作されているかどうかによ
    って、患者が以前にその抗原への暴露を経験したか否か
    を決定する各工程からなる方法。
  2. （２）リンパ球はＴ−リンパ球である請求項（１）記載
    の方法。
  3. （３）インジケーターは活性化リンパ球またはＴ−リン
    パ芽球と化学的反応性を示す請求項（２）記載の方法。
  4. （４）インジケーターは活性化リンパ球またはＴ−リン
    パ芽球上の表面受容体に特異的な抗体が付加されている
    請求項（２）記載の方法。
  5. （５）インジケーターは着色剤である請求項（３）また
    は（４）に記載の方法。
  6. （６）インジケーターは蛍光物質である請求項（３）ま
    たは（４）に記載の方法。
  7. （７）疑われる抗原はｐＨの制御されたメジウム中に含
    有される請求項（２）記載の方法。
  8. （８）さらに透明なチューブ内に円筒状のフロートを配
    置してチューブ内のリンパ球／単球バンド中の細胞群の
    密度を上昇をさせる工程からなる請求項（１）記載の方
    法。
  9. （９）決定工程は識別可能なリンパ球の光学的識別性の
    強度を測定する操作による定量的測定である請求項（８
    ）記載の方法。
  10. （１０）血中のリンパ球を感作する抗原への暴露を包含
    する患者の以前の身体的疾病への暴露の有無を決定する
    血液試験法において、ａ）患者の血液サンプルとその暴
    露が疑われる抗原を含めたメジウムとの第一の混合物を
    形成し、ｂ）この混合物に、リンパ球のその疑われる抗
    原への以前の暴露の結果として形成される活性化リンパ
    球またはリンパ芽球に対して親和性を有する第一の光学
    的に検出可能なインジケーターを添加して混合物中の活
    性化リンパ球またはリンパ芽球を光学的に識別可能にし
    、ｃ）その混合物の一部を円筒状のフロートを含む透明
    なチューブ中で遠心分離してチューブ内にリンパ球／リ
    ンパ芽球／単球をバンドとして濃縮し、ついでｄ）遠心
    分離されに血球バンド中における光学的に識別可能な血
    球の存否を光学的識別性の強度の測定によって定量して
    患者が以前にその身体的疾病への暴露を経験したかどう
    かを決定する方法。
  11. （１１）リンパ球はＴ−リンパ球である請求項（１０）
    記載の方法。
  12. （１２）インジケーターは混合物中のＴ−リンパ芽球と
    化学的反応性を示す請求項（１０）記載の方法。
  13. （１３）インジケーターはＴ−リンパ芽球上の表面受容
    体に特異的な抗体が付加されている請求項（１０）記載
    の方法。
  14. （１４）さらに疑われる抗原およそ他の抗原性またはリ
    ンパ球のアクチベーターであることが知られている物質
    を欠く抗原メジウムのサンプルを準備し、抗原を欠くメ
    ジウムと患者の血液サンプルの混合物を形成させ、メジ
    ウム−血液混合物に第一のインジケーターを加え、メジ
    ウム−血液混合物の部分を円筒状のフロートを含む透明
    なチューブ中で遠心分離してリンパ球／単球をチューブ
    内にバンドとして濃縮し、リンパ球／単球バンド中に光
    学的識別性が存在するか否かを測定して、疑われる抗原
    について実施した試験結果の真実性を確認する各工程か
    らなる陰性対照試験を行う操作を包含する請求項（１０
    ）記載の方法。
  15. （１５）さらに患者の血液を準備し、この血液と実質的
    普遍的に以前に暴露されていることが明らかにされてい
    る抗原の混合物を形成させ、この混合物に上記の普遍的
    抗原に応答するリンパ球に対して親和性を有する第二の
    光学的に検出可能なインジケーターを加えて上記の応答
    するリンパ球を光学的に識別可能にし、血液−抗原混合
    物の一部を円筒状のフロートを含む透明なチューブ中で
    遠心分離してチューブ内にリンパ球／単球をバンドとし
    て濃縮し、ついでリンパ球／単球バンド中に光学的識別
    性が存在するか否かを測定して、疑われた抗原について
    実施した試験に対する患者の血液の順応性を確認する各
    工程からなる陽性対照試験を行う操作を包含する請求項
    （１０）記載の方法。
  16. （１６）血中のリンパ球を感作する抗原への患者の以前
    の暴露の有無を決定するためのキットにおいて、ａ）メ
    ジウム中その暴露が疑われる抗原を含有し、患者の血液
    サンプルを添加できるようにした第一の容器、ｂ）暴露
    が疑われる抗原を欠く上記メジウムのみを含有し、患者
    の血液サンプルを添加できるようにした第二の容器、お
    よびｃ）実質的普遍的に以前に暴露されていることが明
    らかにされている抗原を含有し、患者の血液サンプルを
    添加できるようにした第三の容器からなるキット。
  17. （１７）メジウムはｐＨが制御された液体である請求項
    （１６）記載のキット。
  18. （１８）血中のリンパ球を感作する抗原への患者の以前
    の暴露の有無を決定するためのキットにおける、その疑
    われる抗原を含有させるために調製されたがその抗原を
    含んでいない液体メジウムを含有し患者の血液サンプル
    が添加できるようにした陰性対照容器の使用。
  19. （１９）血中のリンパ球を感作する抗原への患者の以前
    の暴露の有無を決定するためのキットにおける、普遍的
    にヒトは以前に暴露されていることが明らかにされてい
    る抗原を含有し患者の血液サンプルが添加できるように
    した容器の使用。
  20. （２０）血中のリンパ球を感作する抗原への患者の以前
    の暴露の有無を決定する血液試験法において、ａ）患者
    の血液サンプルと一群の抗原の混合物を形成させ、ｂ）
    この混合物に、その抗原に応答する血中のリンパ球と親
    和性を有する光学的に検出可能なインジケーターを添加
    して応答するリンパ球を光学的に識別可能とし、ｃ）そ
    の混合物の一部を透明なチューブ中で遠心分離してチュ
    ーブ内にリンパ球／単球をバンドとして濃縮し、ついで
    ｄ）遠心分離されたリンパ球／単球バンド中における光
    学的に識別可能なリンパ球および／またはリンパ芽球の
    存否を決定し、一群の抗原中患者のリンパ球の一部が感
    作されている抗原を調べて患者が以前にその抗原への暴
    露を経験したかどうかを決定する各工程からなる方法。
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