JPH02303430A - トロパン系アルカロイド産生植物の不定根の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野） 本発明はズボイシア、ダクラ、ハシリドコロ、ヒヨス等
のトロパン系アルカロイドを代謝産生する植物の組織を
特定の培地を用いて組織培養することによりスコポラミ
ンおよび／又はヒヨスチアミン等のトロパン系アルカロ
イドを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

スコポラミンはｙｔ痩剤、鎮痛剤および副交感神経しゃ
新薬として、またヒヨスチアミンは副交感神経しゃ新薬
としそ、それぞれ医薬として重用されている。これらの
化合物は、天然の植物体中から抽出して製造されている
が、天然物を原料としているため、その生産が天候に左
右されること、収穫時期が限定されていることなどが問
題となっている。そのためこれらの化合物を植物の組織
培養により生産する研究が内外で数多く行われた。

カルスによる生産では、山田らによるヒヨスのカルスに
よる生産例が知られている（　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）
ｉｅｐｏｒ　ｔｓ土、１０１．−１０３（１９８２）　
）が、スコボラミン含量は２０ｐｐｍと、天然の植物体
中の含量と比較して低いものであった。また山田らは、
ズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　Ｌｅｉｃｈｈａｒｄｔ
ｊｉ　Ｆ、Ｍｕｅｌｌ）の組織培養により得られる不定
根中に著量のスコポラミンおよびヒヨスチアミンが存在
することを見出している（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ
ｐｏｒｔｓ　３．１８６〜１８８（１９８４）　）が、
その量はまだ充分とは言えないものであった。そこで、
ズボイシア不定根の各種培養条件を検討し、培地のアン
モニウムイオンと硝酸イオンの比率を０．２以上にする
ことおよび培地の溶存酸素濃度を１０ないし６５ｐｐａ
＋とすることにより、トロパン系アルカロイドの生産性
を向上させることを見出し、本出願人はそれぞれ特願昭
６０−１４３８８２号および特願昭６０−１４３８８１
号として特許出願をしているが、工業的な見地からはそ
の生産性を更に高めることが望まれる。

（発明が解決しようとするｉ！１８） したがってこのような組織培養によりトロパン系アルカ
ロイドの工業的な生産を目指す場合、さらに生産性を高
めるため、培養槽の単位容積当りの組繊培養物の収量を
高くすることが重要な課題であった。

組織培養物（培養細胞など）の収量は培地の栄養基ｆ（
培地成分）濃度に依存しているので、従来の培養でよく
使用されるリンスマイヤーとスクーグの培地、ホワイト
の培地やエッチ＆ニッチの培地では培養中に栄養基質が
消費されてしまい、組織培養物濃度を高くして培養する
ことはできない。また、組織培養物濃度を高める方法と
して、培地の栄養基質濃度を従来よりも高めて培養する
方法も考えられるが、栄養基質濃度をあまり高（すると
、組織培養物の壊死などの栄養基′ａ濃度傷害が起きる
ため、栄養基質濃度を高めて組織培養物の生産体を高め
る方法には限界がある。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、ズボイシア
、ダツラ、ハシリドコロおよびヒヨス属等のトロパン系
アルカロイドを産生ずる植物の不定根を濃度を高めて効
率よく培養する方法を研究した結果、次のような事実を
見出した。

〔課題を解決するための手段〕

その結果、本発明者等は培養期間中、液体培地中ノ硝酸
イオン濃度ヲ１０〜３０ＩＩＭ、ｔＪ！１度を２〜１０
％に保つように培養槽中に液体培養又は培地成分の供給
を行うことにより、トロパン系アルカロイドを産生ずる
植物の不定根を高濃度で培養し、かつ培養によって得ら
れる不定根のトロパン系アルカロイド含量を低下させる
ことなく培養できることを見出し、本発明を完成するに
至った。

即ち、本発明によれば、トロパン系アルカロイドを産生
ずる植物の不定根を液体培養によ；て組織培養する方法
において、不定根を高濃度で培養し、培養期間を通じて
液体培地中の硝酸イオン濃度を１０〜ｂ 培養槽中に液体培地又は培地成分の供給を行うことを特
徴とするトロパン系アルカロイドを産生ずる植物の不定
根の組織培養方法が提供される。

上記において高濃度とは、従来の組織培養における培養
物濃度より高濃度であることを意味し、特に、本発明の
ｍｍ培養方法は、培養開始時の培養槽における組織培養
物の濃度が組織培養物の新鮮重量で表して２５ｇ／　１
より高濃度であるか、或いは培養終了時の培養槽におけ
る組織培養物の濃度が組織培養物の新鮮重量で表して２
００ｇ／　７！より高濃度であるような、高濃度で培養
を行う場合に特に有効である。

本発明では組織培養はトロパン系アルカロイドを産生ず
る植物を用いて行われるが、該当する植物として具体的
には、ズボイシア・ミオボロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ
　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）、　ズボイシア・ライヒハ
ルデイ（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　Ｉｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ
）等のズボイシア属植物、ダツラ・ダツラ（Ｄａｔｕｒ
ａ　ｔａｔｕｌａ）、ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒ
ａ　ａｒｂｏｒｅａ）、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａ
ｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、
スコボリア・ジャポニカ（Ｓｃｏｐｏｌｉａ　ｊａｐｏ
ｎｉｃａ）等のスコポリア属植物、ヒョシアマス・ニガ
ー（ｌｌｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス
属植吻およびアトローバ・ベラドンナ（八ｔｒｏｐａ　
ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）等のアトローバ属植物などのナ
ス科植物を例示することができる。

本発明では前記植物の不定根を培養してトロバン系アル
カロイドを生産するに当たって、培養期間中に液体培養
または培地成分の供給を行う。以下これについて詳述す
る。

本発明における培地成分の供給は、連続的であっても非
連続的であってもよく、これに伴い培養朋間中分連続又
は非連続的に培養槽中から培地の抜き出しを行ってもよ
い。

本発明においては、培養期間中、培養液中の硝酸イオン
濃度を１０〜３０ＩＩＩＭ、好ましくは２０ｍＭ〜１０
ｍＭに保ための硝酸量を含む液体培地又は培地成分を供
給する。また、培養期間中、培養液中の糖濃度を２〜１
０％、好ましくは２〜３％に保つための糖の量を含む液
体培地又は培地成分の供給を行う。

使用しうる糖源としては、シ＝Ｉ　＃Ｎ等の炭水化物と
その誘導体などが例示されるが、好ましくシｇ１３が用
いられる。供給する液体培地又は培地成分におけるその
他の成分としては、特に限定されず、培養開始時に使用
した培地成分を用いても良い。

本発明で使用される培養開始時の培地成分については、
無機成分として、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、
カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜
鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の
元素を含む無機塩を挙げることができ、具体的には硝酸
カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ｌ
水素カリウム、リン酸ｌ水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、
硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナト
リウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛
、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、シー！糖等の炭水化物とその
誘導体、脂肪酸等のを機酸などを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、ｐ−
クロロフェノキシ酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）　、インドール酪酸（ＩＢＭ）および
これらの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデニ
ン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン
類を例示できる０本発明ではサイトカイニン類は通常は
培地に添加しないことが望ましいが、必要に応じて添加
する場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０−’Ｍ
（０，０２１ｎｇ／　ｆ　）以下の低濃度で使用するこ
とが好ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミン８．）、ピリドキシン（ビタミンＢ＆）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
ａＸ）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、フェニルアラニンおよびリジンなど
を例示できる。

本発明の前記培地は、硝酸イオン濃度及び糖濃度を前記
特定の範囲とし、通常は、それ以外の前記無機成分を約
０．１μＨないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１ｇ／
ｌないし約１０ｈ／ｌ、前記植物ホルモン類を＃Ｏ，Ｏ
ＸμＨないし約１００μｉ、前記ビタミン類を約０．１
■／２ないし約１５０ｍｇ／ｌｆｉおよび前記アミノ酸
類を０ないし約１００ｍｇ／ｌｆｉ含ませて使用される
ことが望ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記培地として具体的に
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられて
いる培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（’６２）　（
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、リンス
マイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９６５）　　（Ｌｉｎｓ
ｍａｉｅｒ　＆Ｓｋｏｏｇ　）の培地、ホワイト（’　
６３）　　（Ｗｈ　ｉ　ｔｅ　］の培地、ガンボルグ（
Ｇａｍｂｏｒｇ）のＢ−５培地、三井のＭ９培地、ニッ
チ・ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ　Ｎ１ｔｓｃｔ＋）の培地等
に前記した炭素源および植物ホルモンを添加し、更に必
要に応じて前記したビタミン類、アミノ酸類を添加して
調製される培地を例示できるが、本発明ではこの中でも
特にエッチ・エッチ、リンスマイヤー・スクーグ又はム
ラシゲ・スクーグの培地を用いて調製される培地が好ま
しい。なお、上記した従来公知の培地の組成に関しては
、例えば、性向、中隔、古谷著の［新植物組織２培養Ｊ
Ｐ３８６〜Ｐ３９１、朝食書店、１９７９年に記載され
ている。

本発明のＭｉ礒培養では、トロパン系アルカロイドを代
謝産生ずる植物の不定根を、前記培地を用いて組織培養
しトロパン系アルカロイドを含有する不定根を得る。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の不定根として
具体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽などの組
織片又は細胞を、本発明に係わる組織培養あるいは他の
従来の組織培養方法によってｍ織培養して得られる不定
根が例示できる。

上記のような不定根を、本発明方法によって、組織培養
すれば、高濃度で培養することができ、従って、培養槽
の単位容積当りの培養物の収量を高くすることができ、
トロパン系アルカロイドの収量を同上させることができ
る。

本発明では不定根を用いる場合に、植物の組織片を例え
ば毛根病菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｒｕｍｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓ）で感染させ、これによって出現する毛
根を用いることもできる（例えば本出願人に係わる特願
昭６１−８９９７５号で提案した方法を用いることもで
きる。） 本発明の方法によって得られる１０パン系アルカロ・イ
ドとして具体的には、スコポラミン、ヒヨスチアミン及
びこれらの化合物のアセチル化合物を例示できるが、こ
の中ではスコポラミンとと三Ｊスチアミンが好ましい。

本発明ではトロパン系アルカロイドを含有する培養細胞
から該アルカロイ１を分１”モ１１する方法としては、
例えば薬局法等に記載されている、トロパン系アルカロ
イドを含有する植物からこれら化合物を単離精製する場
合に用いられてきた通常の方法を採用することができる
。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ 当社薬草面にて栽培したＤｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｐｏｒ
ｏｉｄｅｓＲ，Ｂｒの葉を洗浄し、１０％アンチホルミ
ン液に１０分間浸漬し、次いで滅菌水で３回洗浄した後
、約ＩＣｕｔに切断し、ナフタレン酢酸およびヘンシル
アデニンをそれぞれｌｆｌ’Ｍおよび１０−　’Ｍとな
るように添加したリンスマイヤー・スクーグの寒天培地
に置床し、２５゛Ｃで３０日間培養する。カルス形成と
同時に発生した不定根を切り出し、インドール酪酸を１
０−’Ｈになるように添加したエッチ・エッチの液体培
地に移植し、２年間継代培養した。このようにして得た
不定根１ｇ（新鮮重量）をインドール醋酸を１０−’Ｈ
になるように添加し、リン酸濃度を２．５ｍＦ　とした
エッチ・ニッチの液体培地（硝酸イオン）８ｍＭ、糖３
％）２０ｄを含む１００ゴ容の三角フラスコに移植して
振とう培養開始した（細胞の仕込量５０ｇ　（新鮮重量
）／り。培養開始後７日目に培養中の三角フラスコより
培地を１−ぬき取り、硝酸イオン濃度と糖濃度の測定を
行なった。この測定値をもとにして培養液中の硝酸イオ
ン濃度を１８ｍＭ、糖濃度を３％とするのに必要な硝酸
イオンと糖を含む液体培地１ｍｌを添加した。さらに同
様の操イ乍を１０．１２．１４．１７．１８８日目行な
い２１１日目で培養を行った。

得られた不定根を乾燥後、塩基性のクロロホルム−メタ
ノール液５０ｍｆで抽出した。これに４０ｍ／の１Ｎ硫
酸を加えてアルカロイド層を硫酸層に移した。さらに、
アンモニア水２Ｉ＋１／およびクロロホルム４０ｎｉ／
を加えてアルカロイＶをクロロホルム層に移し、これを
減圧濃縮し、ガスクロマトグラフでアルカロイド量を分
析した。この場合のアルカロイドの生産量を表１に示し
た。

なお、糖濃度の測定は糖度計、硝酸イオン濃度の測定は
ブルシン法ＣＪｌｓ、　Ｋ　０１０２　（１９８１））
で行った。ガスクロマトグラフの分析は以下の条件で行
った。

カラム：　Ｓｉ！１ｃｏｎｅ　Ｏシー１７（１％）　ｏ
ｎＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｗ　（Ｍｅｓｈ　８０〜１０
１００）３φＸ１ｍガラスカラム キャリヤガス：Ｎ２ カラム温度　：２００°Ｃ 比較例１ 実施例１において培養中の添加を行なわない以外は該実
施例と同様に行った結果を表１に示した。

実施例２ 実施例１において添加する液体培地１　ｍｌ中の成分と
してさらに硝酸イオンと糖以外に他の二・７チニソチ培
地成分を含むこと以外は該実施例と同様に行った結果を
表１に示した。

実施例３ 実施例２において培養開始時の糖濃度を５％とし、培養
中の添加時の糖の測定により、糖濃度が３％以下となっ
た時のみ糖濃度が３％に保たれるような糖の添加を行う
以外は硝酸イオンなどの添加を含め該実施例と同様に行
った結果を表１に示した。

比較例２ 比較例】において培養開始時の硝酸イオン濃度を５０ｍ
Ｍ、糖濃度１２％にした以外は該比較例と同様に行った
結果を表１に示した。

（本頁以下余白） 表　　１ 〔発明の効果〕 本発明の組織培養によるトロパン系アルカロイドの生産
方法を採用すれば、従来法に比べてトロパイ系アルカロ
イドを、中でも特にスコポラミンおよび／又はヒヨスチ
アミンを大量に効率よく生産することができる。

出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人、弁理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トロパン系アルカロイドを産生する植物の不定根を
   液体培養によって組織培養する方法において、不定根を
   高濃度で培養し、培養期間を通じて液体培地中の硝酸イ
   オン濃度を１０〜３０ｍＭに、かつ糖濃度を２〜１０％
   に保つように、培養槽中に液体培地又は培地成分の供給
   を行うことを特徴とするトロパン系アルカロイドを産生
   する植物の不定根の組織培養方法。 ２、培養開始時の培養槽における組織培養物の濃度が組
   織培養物の新鮮重量で表して２５ｇ／ｌより高濃度であ
   るか、或いは培養終了時の培養槽における組織培養物の
   濃度が組織培養物の新鮮重量で表して２００ｇ／ｌより
   高濃度であることを特徴とする請求項１記載の組織培養
   方法。