JPS626676A - オウレン属植物の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はオウレン属植物を組織培養して健胃薬、染料な
どに利用されるベルベリンなどのイソキノリン系アルカ
ロイドを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

イソキノリン系アルカロイドを得る従来の方法としては
、天然で生育したオウレン属植物から抽出等によって該
アルカロイドを直接採取する方法があるが、該方法は植
物の生育等が自然環境や天候に左右されまた該植物の収
集にも時間と手間がかかるため有利な方法とは言えない
。

そこでこれに代わる方法として、例えばファイトケミス
トリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　２３＠　
２８１〜２８５頁（１９８４年）等に記載されているよ
うに、オウレン属植物の組織培養方法によってベルベリ
ン、パルマチン、コプテシン、ヤテオリジンなどのイソ
キノリン系アルカロイドを得る方法が提案されている。

しかし、これら従来公知の組織培養方法においては、培
養細胞から生産される目的物のイソキノリン系アルカロ
イドの収量が低いという問題がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

したがってこのような組織培養法によりイソキノリン系
アルカロイドの工業的な生産を目指す場合、さらに生産
性を高めることが重要な課題であった。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、オウレン属
植物の組織を効率よく培養してイソキノリン系アルカロ
イドを従来法に比べて多く得る方法について検討した。

〔問題点を解決するための手段〕

その結果、本発明者等はオウレン属植物の組織培養にお
いては、組織培養物によるイソキノリン系アルカロイド
の生産性は培地の溶存酸素濃度に大きく影響されること
を見出し、本発明を完成するに到った。すなわち本発明
の方法によれば、オウレン属植物を液体培地を用いて組
織培養するに当たり、該培地の溶存酸素濃度を１０ない
し２０ｐｐｍにしてイソキノリン系アルカロイドを生産
することを特徴とするオウレン属植物の組織培養方法、
が提供される。

本発明の方法において用いられるオウレン属植物として
は、例えばオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ
Ｍａｋｉｎｏ　）、セリバオウレン（Ｃ，ｊａｐｏｎｉ
ｋａ　Ｍａｋｉｎ。

ｖａｒ、ｄｕｓｓｅｃｔａ　Ｎａｋａｉ　）、キクバオ
ウレン（Ｃ。

ｊａｐｏｎｉｋａ　Ｍａｋｉｎｏ　ｖａｒ、ｊａｐｏｎ
ｉｃａ　）、コセリバオウレン（Ｃ，ｊａｐｏｎｉｋａ
　Ｍａｋｉｎｏ　ｖａｒ、ｍａｊｏｒ　５ａｔａｋｅ　
）、バイカオウレンＣＣ，ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉａ　
Ｍｉｑ、　）およびミツバオウレン（Ｃ，ｔｒｉｆｏｌ
ｉａ　５ａｌｉｓｂ、）等を挙げることができる。本発
明ではこれらの植物の中では特にセリバオウレンを用い
ることが好ましい。

本発明で使用される液体培地は、無機成分および炭素源
を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を
添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地で
ある。

該培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナ
、トリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、
マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、
コバルト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、具
体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、リン酸ｌ水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム
、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モ
リブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリ
ウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例
示できる。

該培地の炭素原としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ−ク
ロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）　、インドール酪Ｍ　（ＩＢＭ）および
このらの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデニ
ン（ＢＡ）　、カイネチン、ゼアチンのサイトカイニン
類を例示できる。本発明ではサイトカイニン類は通常は
培地に添加しないことが望ましいが、必要に応じて添加
する場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０　　Ｍ
　（０，０２■／ｌ）以下の低濃度で使用することが好
ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ、）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボブラビン（ビタミン
Ｂ２）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システィン、フェニルアラニンおよ
びリジンなどを例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μＭないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１　ｇ／ｚな
いし約１００　ｇ　／　ｌ、前記植物ホルモン類を約０
．１ｒｎｇ／　ｌないし約１００ｍｇ／　ｌ、前記ビタ
ミン類を約０．１ｍｇ／ｊ！ないし約１５０ｍｇ／　Ｉ
ｔおよび前記アミノ酸類を０ないし約１０００ｍｇ／　
１含ませて使用することが望ましい。

本発明のオウレン属植物の組織培養に用いられる前記培
地として具体的には、従来から知られている植物の組織
培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・スクー
グ（’６２　）　　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏｏ
ｇ　〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９
６５）　　（Ｌｉｎｓ＋＋＋ａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ
）の培地、ホワイト（”６３　）　　（Ｗｈｉｔｅ　）
の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ　）のＢ−５培地
、三井のＭ−９培地、エッチ・ニッチの培地ＣＮ１ｔｓ
ｃｈ　　＆Ｎ１ｔｓｃｈ）等に前記した炭素源および植
物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記したビタミ
ン類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示でき
るが、本発明ではこの中でも特にニッチ・ニッチ、リン
スマイヤー・スクーグ又はムラ゛シゲ・スクーグの培地
を用いて調製される培地が好ましい。なお、上記した従
来公知の培地の組成に関しては、例えば、行内、中高、
古谷著の「新植物組織培養Ｊ　Ｐ３８６〜Ｐ３９１、朝
食書店、１９７９年に記載されている。

本発明では前記した液体培地を用いてオウレン属植物の
組織培養を行い、イソキノリン系アルカロイドが生産さ
れるが、この場合、本発明では培地の溶存酸素濃度が通
常１０ないし２０ｐｐｍ　、好ましくは１０ないし１５
ｐｐｍとなるようにして組織培養が行われる。溶存酸素
濃度が通常１０ｐｐｍよりも低い場合および通常２０ｐ
ｐｍよりも高い場合にはオウレン属の培養細胞によるイ
ンキノリン系アルカロイドの生産量が低下するので好ま
しくない。培地の溶存酸素濃度を本発明で行われる前記
濃度範囲にする方法としては以下に示す方法を例示でき
る。

すなわち通常圓ないしＮ”Ｃで組織培養が行われる液体
培地において、該培地に接触する酸素含有ガと培地を適
宜の方法によって接触させることにより、培地の溶存酸
素濃度を前記範囲にすることができる。この場合の酸素
含有ガスとしては具体的にはチッ素等の不活性成分を含
んだ種々の酸素濃度を有するガスや純酸素ガスを例示で
きる。酸素含有ガスとして空気を大気圧以下で培地と接
触させる方法は従来のズボイシア属植物の組織培養にお
いて採用された方法であって、この方法では培地の溶存
酸素濃度は培養温度によっても多少異なるが通常８ｐｐ
ｍ程度と低いためイソキノリン系アルカロイドの生産量
は少ないので好ましくない。本発明では必要に応じて酸
素含有ガスとして空気を用いることも出来、この場合に
は該ガスを加圧することによって系内の全圧を高くして
ガス中の酸素分圧を前記範囲にすることによって、培地
の溶存酸素濃度を本発明の範囲にすることができる。

大気圧下で組織培養を行う場合には純酸素ガスを使用し
ても培地の溶存酸素濃度は通常４０ｐｐｍ程度しか高ま
らないため、更に酸素濃度を高めたい場合には通常知ら
れている適宜方法によって加圧した系で組織培養を行う
方法が採用される。要するに本発明では、状況に応じて
酸素含有ガス中の酸素分圧を適宜選ぶことによって培地
の溶存酸素濃度を前記範囲にして培養が行われる。

本発明では酸素含有ガスと培地を接触させる方法として
は特にどのような方法を用いなければならないというこ
とは無く、通常知られているどのような方法でも採用で
きる。そして該接触方法として具体的には、例えば液体
培地中に置かれた多数の孔を有するガス分散器を介して
培地中に酸素含有ガスを放出させる通気培養方法、ある
いはシリコン、テフロン等の特殊な材料から作られた酸
素透過性の膜からできた任意形状のガス送入部を培地と
接触させてこの膜を介して培地中に酸素を供給する方法
などを例示できる。酸素透過性の膜を用いる方法では、
通気培養のときのような激しい気泡の発生も無いので培
養物に好ましくない外力をかけないようにすることがで
きるので一層好ましい。

培地の溶存酸素濃度を測定する方法としては例えば以下
に示すような方法がある。−−■１−−−ガルパニック
セル型の酸素 電極を用いて溶存酸素濃度に比例して発生する電流を測
定し、所定の溶存酸素濃度に対応する電流以上になると
自動的に供給酸素量を減じ、かつ該電流値以下の場合、
自動的に供給量を増加せしめることによって境地の溶存
酸素濃度を所定の値に維持する方法である。

本発明で実施される組織培養においては、培養槽あるい
は培養装置については特にどのようなものを用いなけれ
ばならないということはな（、前記した本発明の要件を
満足できるものであればどのようなものでも使用出来る
。本発明では培地を、必要に応じて培養槽自体の振とう
、旋回あるいは攪拌羽根等の手段によって攪拌しても良
いし、又静置しても良い。あるいは又本出願人が特願昭
５９−２６２０９９号によって提案した液体散布の方法
、すなわち液体培地を培養物の上方からシャワー状に散
布するようにして培養する方法を採用することもできる
。この場合には液体培地を培養器とは別の所で酸素含有
ガスと接触させて培地の溶存酸素濃度を前記範囲に調整
してからこの液体培地を培養器に導入し、リサイクル使
用する方法を例示できる。

本発明では前記方法によってオウレン属植物が組織培養
されてイソキノリン系アルカロイドが生産される。この
場合のイソキノリン系アルカロイドとして具体的にはベ
ルベリン、パルマチン、コプテシン、ヤテオリジン等で
あってこの中ではベルベリンが好ましい。

以下、本発明の組織培養の具体的方法について示す。

先ず、オウレン属に属する植物の植物体、例えば、根、
生長点、葉、茎、果実、種子等から採取された組織片を
、例えば、新植物組織培養（朝食書店１９７９版）、２
１頁に記載されている寒天で固めた、リンスマイヤース
クーグの培地（ＲＭ−１９６５）上に置床して、１０〜
３５℃で７〜３０日間程度培養することによって該組織
片の一部をカルス化させる。

このようにして得られるオウレン属植物のカルスを、通
常知られている方法によって継代培養すると、カルスの
生育速度が漸次高まる。次にこのカルスを増殖に適した
液体培地、例えば、新植物組織培養（利金書店１９７９
年版）、２１頁に記載されているリンスマイヤースクー
グの液体培地に移して更に増殖させると培養細胞の生育
速度は更に高められ安定化した培養細胞が得られる。本
発明の方法では、このようにして得られる安定化した培
養細胞を本発明の前記液体培地に添加して更に培養が行
われる。

本発明の組織培養における培養温度としては、通常は、
約１０ないし約３５℃、この中でも特に約２３ないし約
２８℃が好適であり、該温度を約１０℃未満にすると培
養細胞の増殖速度は小さく、また該温度を３５℃以上に
したときも同様に培養細胞の増殖速度は小さくなる。本
発明の組織培養を行うに当たっでは、光は必ずしも必要
ではないが、光の照射はベルベリン等のイソキノリン系
アルカロイドの生成を妨げない。

本発明の方法においては、培養終了後に培養細胞をデカ
ンテーションあるいは濾過等の方法によって液体培地か
ら分離し、次に該培養細胞から目的とするベルベリン等
のイソキノリン系のアルカロイドを従来から知られてい
る天然品のオウレンオウバク等に通用されている抽出等
の方法によって分離することができる。このようにして
得られる該アルカロイドは必要に応じて再結晶等の方法
によって純度を高めることができる。

〔発明の効果〕

本発明のオウレン属植物の組織培養方法によれば従来法
に比べてベルベリン等のイソキノリン系アルカロイドを
多く生産することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ セリバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｍ
ａｋｉｎ。

Ｖａｒ、ｄｉｓｓｅｃｔａ　Ｎａｋａｔ　）の葉を７０
％エタノール溶液および次亜塩素酸ソーダ水溶？＆（有
効塩素量０．５％）で殺菌した後に、ショ糖３％、ナフ
タレン酢酸１０−’Ｍ、ベンジルアデニン１０　　Ｍを
含有する無菌のリンスマイヤー・スクーグの液体培地（
組成を第１表に示す）を寒天で固めた固体培地（寒天１
重量％）上に置床して２５°Ｃ暗所で培養してセリバオ
ウレンのカルスを得た。次に、このセリバオウレンのカ
ルスを上記と同様の条件でリンスマイヤー・スクーグの
液体培地で１４日毎に植えつぎ、ロータリーシェーカー
で旋回環＃（振幅２５＋ｕ、１１００ｒｐ　）　シてセ
リバオウレンの培養細胞の生育速度を速め、安定化した
セリバオウレン培養細胞を得た。

溶存酸素濃度計と酸素含有ガス通気管を備えた通気攪拌
培養槽（内容積２りにＣｕ２＋濃度を１μＭに変更した
無菌の上記液体培地１．５１および上記カルス１５ｇ新
鮮重量を入れ、溶存酸素濃度が１０ｐｐｍになるように
酸素含有ガスの通気量を調節しなから２５°Ｃ暗所で２
週間培養した。得られたカルスを乾燥した後の重量は１
７．９　ｇ　（１１，９ｇ　／β）であった。乳鉢を用
いて乾燥カルスを破砕した後に９０％メタノールでイソ
キノリン系アルカロイドを抽出した。品抽出液を高速液
体クロマトグラフィーを用いてベルベリン、パルマチン
、コプテシン、ヤテオリジン等のイソキノリン系アルカ
ロイドを分析したところ、乾燥カルス重量あたりの該イ
ソキノリン系アルカロイドの合計量は１２．７重量％で
あった。このうちベルベリンは８．１重量％第　　　１
　　　表 なお、アルカロイドの分析には山田らの方法（Ｐｈｙｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３２８１　（１９８４）　
）に従って以下の条件を用いた。

カラム　：μｍボンダパックＣＩＢ、３Ｑｃｍ　Ｘ３．
９ｍｍ熔　媒　：オクタンスルホン酸ナトリウム５ｍＭ
と酢酸１％を含む水−アセトニトリ ル（１３ニア） 測定波長：　２５４ｎｍ 実施例２〜５、比較例１〜２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）オウレン属植物を液体培地を用いて組織培養する
   に当たり、該培地の溶存酸素濃度を１０ないし２０ｐｐ
   ｍにしてイソキノリン系アルカロイドを生産することを
   特徴とするオウレン属植物の組織培養方法。