JPH02308793A - ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原 - Google Patents
ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原Info
- Publication number
- JPH02308793A JPH02308793A JP12809189A JP12809189A JPH02308793A JP H02308793 A JPH02308793 A JP H02308793A JP 12809189 A JP12809189 A JP 12809189A JP 12809189 A JP12809189 A JP 12809189A JP H02308793 A JPH02308793 A JP H02308793A
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- alpha
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- dna
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ミコバクテリウム、・カンサシ（Ｍｙｃ−ｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｏ＋ Ｋａｎｓａｓｉｉ）由来のツベ
ルクリン活性蛋白α抗原（以下α抗原と称する。）該α
抗原をコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んだ月１換
えＤＮＡにより形質転換された形質転換体を培養して、
目的とするミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原を
生産する製造法、該α抗原のシグナルペプチド、該シグ
ナルペプチドをコードする遺伝子および該α抗原のプロ
モーターに関する。
ｂａｃｔｅｒｉｕｏ＋ Ｋａｎｓａｓｉｉ）由来のツベ
ルクリン活性蛋白α抗原（以下α抗原と称する。）該α
抗原をコードする遺伝子、該遺伝子を組み込んだ月１換
えＤＮＡにより形質転換された形質転換体を培養して、
目的とするミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原を
生産する製造法、該α抗原のシグナルペプチド、該シグ
ナルペプチドをコードする遺伝子および該α抗原のプロ
モーターに関する。
ミコバクテリウム・カンサシは、結核菌やＢＣＧ菌と同
じ、遅育抗酸菌のうち、非定型抗酸菌に属し、結核とよ
（似た呼吸器系の疾患を引き起こす、最近、この非定型
抗酸菌による感染症（以下ＡＭ症とする）の患者が増加
してきているが、結核と異なって薬剤に対する抵抗性が
強いことから抗結核薬が効かず、難治感染症の一つとな
ってきている。また、結核と同様に肺ガンとの鑑別診断
もレントゲン写真のみでは難しい面があり、混合される
危険性がある。
じ、遅育抗酸菌のうち、非定型抗酸菌に属し、結核とよ
（似た呼吸器系の疾患を引き起こす、最近、この非定型
抗酸菌による感染症（以下ＡＭ症とする）の患者が増加
してきているが、結核と異なって薬剤に対する抵抗性が
強いことから抗結核薬が効かず、難治感染症の一つとな
ってきている。また、結核と同様に肺ガンとの鑑別診断
もレントゲン写真のみでは難しい面があり、混合される
危険性がある。
ところで、α抗原は、米国ら（Ａｍ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐ
ｉｒ。
ｉｒ。
Ｄｉｓ、、 ９２．９ （１９６５））によって初めて
、結核菌の培養上清より分離・精製されたツベルクリン
反応性タンパク賞で、他の非定型抗酸菌にも広く分布す
る交差反応物質（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａ＋
ａｔｅｒｉａｌ）であり、それぞれの菌種に特異的な抗
原決定基が存在することが判明している（Ａｍ、Ｒｅｖ
、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｔｓ、＋１３０、６４７（１９８４
）、 １ｂｉｄ、、 １３２．１７３（１９８５））。
、結核菌の培養上清より分離・精製されたツベルクリン
反応性タンパク賞で、他の非定型抗酸菌にも広く分布す
る交差反応物質（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ ａ＋
ａｔｅｒｉａｌ）であり、それぞれの菌種に特異的な抗
原決定基が存在することが判明している（Ａｍ、Ｒｅｖ
、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｔｓ、＋１３０、６４７（１９８４
）、 １ｂｉｄ、、 １３２．１７３（１９８５））。
従って、各種非定型抗酸菌からそれぞれの種由来のα抗
原を純粋な形で得ることができれば、各非定型抗酸菌症
を鑑別診断するための、抗原−抗体反応を利用したＥＬ
ＩＳＡ法による診断薬の開発が可能と考えられる。しか
し、現実的には、抗酸菌が分泌する蛋白は約３００種に
のぼりこの中からα抗原を精製して大量に得ることは極
めて難しく、遺伝子工学的手法により、α抗原を生産す
ることが望まれている。
原を純粋な形で得ることができれば、各非定型抗酸菌症
を鑑別診断するための、抗原−抗体反応を利用したＥＬ
ＩＳＡ法による診断薬の開発が可能と考えられる。しか
し、現実的には、抗酸菌が分泌する蛋白は約３００種に
のぼりこの中からα抗原を精製して大量に得ることは極
めて難しく、遺伝子工学的手法により、α抗原を生産す
ることが望まれている。
我々は、既に結核の診断薬開発を目指して、ＢＣＧ菌由
来のα抗原をコードする遺伝子をクローン化し、該遺伝
子を用いた組換えＤＮＡにより形質転換された大腸菌に
より、ＢＣＧ菌由来のα抗原を生産することに成功して
いる（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 。
来のα抗原をコードする遺伝子をクローン化し、該遺伝
子を用いた組換えＤＮＡにより形質転換された大腸菌に
より、ＢＣＧ菌由来のα抗原を生産することに成功して
いる（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 。
１７０、３８４７（１９８８））。
さらに、各菌種に特異的な抗原決定基を有するα抗原を
コードする遺伝子は、将来ＢＣＧ菌の分泌発現系を利用
した組換え生ワクチンのマーカー付きキャリアータンパ
ク賞の遺伝子として極めて有用になると考えられる。
コードする遺伝子は、将来ＢＣＧ菌の分泌発現系を利用
した組換え生ワクチンのマーカー付きキャリアータンパ
ク賞の遺伝子として極めて有用になると考えられる。
本発明の目的は、ミコバクテリウム・カンサシ由来のα
抗原をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えＤ
ＮＡにより形質転換体を用いるミコバクテリウム・カン
サシ由来のα抗原の製造法及び目的とするミコバクテリ
ウム・カンサシ由来のα抗原ポリペプチドの提供に有る
。
抗原をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えＤ
ＮＡにより形質転換体を用いるミコバクテリウム・カン
サシ由来のα抗原の製造法及び目的とするミコバクテリ
ウム・カンサシ由来のα抗原ポリペプチドの提供に有る
。
本発明者らは、上記課題を解決するべく研究を重ねた結
果、既にクローン化されているＢＣＧ菌由来のα抗原遺
伝子をプローブとして用いて、ミコバクテリウム・カン
サシ街来のα抗原遺伝子を単離し、その塩基配列を決定
し、次に該遺伝子を適当な発現ベクターに組み込むこと
により、大腸菌で抗α抗体と反応するα抗原タンパク質
を大量に製造することができた。
果、既にクローン化されているＢＣＧ菌由来のα抗原遺
伝子をプローブとして用いて、ミコバクテリウム・カン
サシ街来のα抗原遺伝子を単離し、その塩基配列を決定
し、次に該遺伝子を適当な発現ベクターに組み込むこと
により、大腸菌で抗α抗体と反応するα抗原タンパク質
を大量に製造することができた。
本発明は、下記のアミノ酸配列を有するツベルクリン活
性蛋白のα抗原に関する。
性蛋白のα抗原に関する。
また、本発明は上記タンパク質α抗原をコードする遺伝
子、該ｉｆｆ伝子を組み込んだＡｌｌ １０えプラスミ
ドベクターで形質転換した形質転換体を培養して目的の
ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原を生産せしめ
ることを特徴とするミコバクテリウム・カンサシ由来の
α抗原の！！！！逍法に関する。
子、該ｉｆｆ伝子を組み込んだＡｌｌ １０えプラスミ
ドベクターで形質転換した形質転換体を培養して目的の
ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原を生産せしめ
ることを特徴とするミコバクテリウム・カンサシ由来の
α抗原の！！！！逍法に関する。
さらに本発明は上記タンパク質α抗原のシグナルペプチ
ド、下記のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド これらシグナルペプチドをコードする遺伝子及びミコバ
クテリウム・カンサシα抗原のプロモーターに関する。
ド、下記のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド これらシグナルペプチドをコードする遺伝子及びミコバ
クテリウム・カンサシα抗原のプロモーターに関する。
以下に本発明について詳しく説明する。
ミコバクテリウム・カンサシ染色体ＤＮＡの調製は常法
によって行えばよく、例えば染色体ＤＮＡは鉛末らの方
法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １６９．８３９（１
９８７）〕に準じて塩化セシウム・臭化エチジウム密度
勾配遠心分離法により調製することができる。
によって行えばよく、例えば染色体ＤＮＡは鉛末らの方
法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １６９．８３９（１
９８７）〕に準じて塩化セシウム・臭化エチジウム密度
勾配遠心分離法により調製することができる。
α抗原遺伝子のクローン化は上記方法により得た染色体
ＤＮＡの種々の制限酵素による消化物を、アガロースゲ
ル電気泳動と歩ザンの方法（Ｊ、Ｍｏｌ。
ＤＮＡの種々の制限酵素による消化物を、アガロースゲ
ル電気泳動と歩ザンの方法（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｏｌ、 、 ９８．５０３ （１９７５） ）により
ＤＮＡ断片を結合したフィルターを調製することができ
る。このフィルターに対して、二ックトランスレーシゴ
ン法［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｏｌ、、 １１３．２３７（１９
７７））によりアイソトープ等で標識したＢＣＧ菌由来
、のα抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法通り、ハイブ
リダイゼーシッンさせることにより、ミコバクテリウム
・カンサシ由来のα抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出
することができる。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動による分画、Ｄ Ｅ −８１ペーパー法（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、 １７１．３８４７（１９８８）
）による分画、エタノール沈澱法等を適宜組合わせるこ
とにより、分離、濃縮することができる。
ＤＮＡ断片を結合したフィルターを調製することができ
る。このフィルターに対して、二ックトランスレーシゴ
ン法［Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｏｌ、、 １１３．２３７（１９
７７））によりアイソトープ等で標識したＢＣＧ菌由来
、のα抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法通り、ハイブ
リダイゼーシッンさせることにより、ミコバクテリウム
・カンサシ由来のα抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出
することができる。このＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動による分画、Ｄ Ｅ −８１ペーパー法（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、 １７１．３８４７（１９８８）
）による分画、エタノール沈澱法等を適宜組合わせるこ
とにより、分離、濃縮することができる。
このＤＮＡ断片をｐＵｃ１８プラスミドに導入し、ハナ
ハンの方法（Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．、１６６、５５７
（１９８３））に準じて例えば大腸菌５１０９株等の宿
主細胞に導入して形質転換させ、選択（大腸菌ＪＭ１０
９株の場合はアンピシリン耐性、β−ガラクトシダーゼ
活性陰性株）することによりＤＮＡライブラリーを作製
できる。
ハンの方法（Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．、１６６、５５７
（１９８３））に準じて例えば大腸菌５１０９株等の宿
主細胞に導入して形質転換させ、選択（大腸菌ＪＭ１０
９株の場合はアンピシリン耐性、β−ガラクトシダーゼ
活性陰性株）することによりＤＮＡライブラリーを作製
できる。
このＤＮＡライブラリーについて３２Ｐｇ識プロープヲ
用いたコロニーハイプリダイゼーシヲン（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６８．３７９（１
９７９））を行い、目的とするクローンをスクリーニン
グする。
用いたコロニーハイプリダイゼーシヲン（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６８．３７９（１
９７９））を行い、目的とするクローンをスクリーニン
グする。
α抗原遺伝子の塩基配列決定は上記クローンよりクロー
ン化ＤＮＡ断片を調製し、メッシングらの方法（Ｎ、Ａ
、Ｒ，、９，３０９（１９８１））によって塩基配列を
決定し、α抗原遺伝子の全塩基配列を決定することがで
きる。
ン化ＤＮＡ断片を調製し、メッシングらの方法（Ｎ、Ａ
、Ｒ，、９，３０９（１９８１））によって塩基配列を
決定し、α抗原遺伝子の全塩基配列を決定することがで
きる。
α抗原遺伝子の形質発現は上記で得たミコバクテリウム
・カンサシのα抗原遺伝子を用いてミコバクテリウム′
・カンサシ由来α抗原を生産するには、まず、クローン
化ＤＮＡの実質的な配列を適当な形質発現ベクターに組
み込み、α抗原生産用の組換えＤＮＡ分子を作製する。
・カンサシのα抗原遺伝子を用いてミコバクテリウム′
・カンサシ由来α抗原を生産するには、まず、クローン
化ＤＮＡの実質的な配列を適当な形質発現ベクターに組
み込み、α抗原生産用の組換えＤＮＡ分子を作製する。
ついで、この組換えＤＮＡ分子を適当な宿主細胞に導入
して形質転換し、形質転換株を得る。この形質転換株を
培地中で培養することにより、α抗原を含有する培養組
成物を得ることができる。
して形質転換し、形質転換株を得る。この形質転換株を
培地中で培養することにより、α抗原を含有する培養組
成物を得ることができる。
本発明において、クローン−化したα抗原遺伝子の実質
的な塩基配列を形質発現させるについては広範囲の原核
生物、もしくは真核生物の宿主細胞と形質発現ベクター
の組み合わせを採用することができるが通常は原核生物
を宿主細胞とする方法により実施するのが好ましい。ま
た形質発現ベクターとしては、上記宿主細胞に適合し得
るレプリコンと調節機能を含むベクター及び該宿主細胞
がそれ自身の蛋白質を発現するのに必要なプロモ−ター
を含有するか、もしくは含有するように改良されたもの
が好ましい。
的な塩基配列を形質発現させるについては広範囲の原核
生物、もしくは真核生物の宿主細胞と形質発現ベクター
の組み合わせを採用することができるが通常は原核生物
を宿主細胞とする方法により実施するのが好ましい。ま
た形質発現ベクターとしては、上記宿主細胞に適合し得
るレプリコンと調節機能を含むベクター及び該宿主細胞
がそれ自身の蛋白質を発現するのに必要なプロモ−ター
を含有するか、もしくは含有するように改良されたもの
が好ましい。
かくして得られるミコバクテリウム・カンサシ由来α抗
原生産用の組換えＤＮＡ分子を含有する宿主細胞（以下
形質転換体と言う）の培養は液体培地中、好気的に行う
ことができる。培地としては、例えばポリペプトン、酵
母抽出物、食塩、グルコースなどを含有する通常の栄養
培地の他、Ｍ９最少培地などを用いることができる。培
養は３０〜４０°Ｃで行うのが好ましい、また、培養に
際し、用いたプロモーターに応じて適当な誘導剤、例え
ばｆａｃプロモーターの場合であればイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシドを培地中に添加することにより
、形質転換体における発現の効率を高めることができる
。
原生産用の組換えＤＮＡ分子を含有する宿主細胞（以下
形質転換体と言う）の培養は液体培地中、好気的に行う
ことができる。培地としては、例えばポリペプトン、酵
母抽出物、食塩、グルコースなどを含有する通常の栄養
培地の他、Ｍ９最少培地などを用いることができる。培
養は３０〜４０°Ｃで行うのが好ましい、また、培養に
際し、用いたプロモーターに応じて適当な誘導剤、例え
ばｆａｃプロモーターの場合であればイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシドを培地中に添加することにより
、形質転換体における発現の効率を高めることができる
。
なお、本発明においては以下の略号を使用する。
Ａ：アデニン、Ｃ：チトシン、Ｇニゲアニン、Ｔ：チミ
ン、ｋｂ：キロ塩基、ｂｐ：塩基対、ＤＮＡ：デオキシ
リボ核酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、ｄＣＴＰ：デ
オキシシチジン三リン酸、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン
四酢酸、ＤＥＡＥ ニジエチルアミノエチル、ＳＤＳ
ニドデシル硫酸ナトリウム、Ｓ Ｓ Ｃ： ０．１５Ｍ
塩化ナトリウム、０．０１５ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）、Ａｌａ：アラニン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ａ
ｒｇ：アルギニン、Ｌｙｓ：リジン、Ａｓｎ：アスパラ
ギン、Ｍｅｔ ：メチオニン、Ａｓｐ：アスパラギン酸
、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｃｙｓニジスティン、Ｐ
ｒｏニブロリン、Ｇｉｎ：グルタミン、Ｓｅｒ：セリン
、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｇｌｙ
ニゲリシン、Ｔｒｐ： トリプトファン、Ｈｉｓ：ヒス
チジン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｖ
ａｌ：バリン、Ｉ−ＰＴＧ：イソブロビルーβ−Ｄ−チ
オガラクトシド、Ｘ−ｇａｌ ： ５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド 〔実施例〕 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
ン、ｋｂ：キロ塩基、ｂｐ：塩基対、ＤＮＡ：デオキシ
リボ核酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、ｄＣＴＰ：デ
オキシシチジン三リン酸、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン
四酢酸、ＤＥＡＥ ニジエチルアミノエチル、ＳＤＳ
ニドデシル硫酸ナトリウム、Ｓ Ｓ Ｃ： ０．１５Ｍ
塩化ナトリウム、０．０１５ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）、Ａｌａ：アラニン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ａ
ｒｇ：アルギニン、Ｌｙｓ：リジン、Ａｓｎ：アスパラ
ギン、Ｍｅｔ ：メチオニン、Ａｓｐ：アスパラギン酸
、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｃｙｓニジスティン、Ｐ
ｒｏニブロリン、Ｇｉｎ：グルタミン、Ｓｅｒ：セリン
、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｇｌｙ
ニゲリシン、Ｔｒｐ： トリプトファン、Ｈｉｓ：ヒス
チジン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｖ
ａｌ：バリン、Ｉ−ＰＴＧ：イソブロビルーβ−Ｄ−チ
オガラクトシド、Ｘ−ｇａｌ ： ５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド 〔実施例〕 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
実施例１
（１）ミコバクテリウム・カンサシ染色体ＤＮＡの調製
ミコバクテリウム・カンサシＡＴＣＣ１２４７８株をツ
ートン培地（組成：アスパラギン０，４％、クエン酸０
．２％、クエン酸ナトリウム０．２％、リン酸カリウム
０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、クエン酸第
１鉄アンモニウムｏ、ｏｏｓ％、グリセリン６％）１Ｎ
中にて３７℃で培養し、対数増殖期の菌体を遠心分離に
より集菌した。
ートン培地（組成：アスパラギン０，４％、クエン酸０
．２％、クエン酸ナトリウム０．２％、リン酸カリウム
０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、クエン酸第
１鉄アンモニウムｏ、ｏｏｓ％、グリセリン６％）１Ｎ
中にて３７℃で培養し、対数増殖期の菌体を遠心分離に
より集菌した。
得られた菌体を１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８，０）
、１ｍＭＥＤＴＡバッファー（以下、ＴＥと略記する。
、１ｍＭＥＤＴＡバッファー（以下、ＴＥと略記する。
）５−に懸濁し、リゾチーム５■を加えて３７゛Ｃで１
５分間インキエベートした０次いで、これに１０％ＳＤ
Ｓ水溶液０．５ｍを加えたのちフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（混合比２５ ： ２４：１
）の混合液６ｍで３回抽出し、得られた水層にエタノー
ル１０ｍを加え、沈澱するＤＮＡをガラス棒に巻き取っ
た。このＤＮＡをＴ Ｅ ６．６１１に溶解し、塩化セ
シウム７ｇ、エチジウムプロミド（５■／ｄ）水溶液０
．７ｍを加えて溶解させた。
５分間インキエベートした０次いで、これに１０％ＳＤ
Ｓ水溶液０．５ｍを加えたのちフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（混合比２５ ： ２４：１
）の混合液６ｍで３回抽出し、得られた水層にエタノー
ル１０ｍを加え、沈澱するＤＮＡをガラス棒に巻き取っ
た。このＤＮＡをＴ Ｅ ６．６１１に溶解し、塩化セ
シウム７ｇ、エチジウムプロミド（５■／ｄ）水溶液０
．７ｍを加えて溶解させた。
該溶液を遠心チューブ（米国ベックマン社製、クイック
シールチューブ）中に入れ、６０．００Ｏｒｐｍにて６
時間遠心して染色体ＤＮＡのバンドを遠心チューブの上
方より採取した。このＤＮＡ溶液をＴＥに対して透析、
脱塩して精製ミコバクテリウム・カンサシ染色体ＤＮＡ
を得た。
シールチューブ）中に入れ、６０．００Ｏｒｐｍにて６
時間遠心して染色体ＤＮＡのバンドを遠心チューブの上
方より採取した。このＤＮＡ溶液をＴＥに対して透析、
脱塩して精製ミコバクテリウム・カンサシ染色体ＤＮＡ
を得た。
（２）プローブの調製
ＢＣＧ菌のα抗原遺伝子のＬｅｕ”＝Ｇｌｎ”９に対応
する０ 、８ｋｂ Ｐ ｓｔ Ｉ断片をサブクローニン
グしたプラスミドｐＰ −１（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、 １７０．３８４７（１９８Ｂ） ） ２０ｇを制
限酵素ＰｓｔｌとＸｈｏＩで完全消化した。これを１％
アガロースゲル電気泳動にて分画した後ＤＥ−８１ペー
パー法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 。
する０ 、８ｋｂ Ｐ ｓｔ Ｉ断片をサブクローニン
グしたプラスミドｐＰ −１（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、 １７０．３８４７（１９８Ｂ） ） ２０ｇを制
限酵素ＰｓｔｌとＸｈｏＩで完全消化した。これを１％
アガロースゲル電気泳動にて分画した後ＤＥ−８１ペー
パー法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 。
１７０、３８４７ （１９８８））にて、４９０ｂｐと
３１０ｂｐのＰｓＬＩ−Ｘｈｏｌ断片を回収し、フェノ
ール及びクロロホルムで２回ずつ抽出してから２．５倍
容量のエタノールを加えて沈澱させた。この沈澱を減圧
乾燥後ＴＥ２ＯＪｌｌずつにｔ８解し、その１２ｍに［
ニックトランスレーシランキット」（宝酒造製）の１０
倍濃度バッファー４Ｉｌｌ、酵素溶液ＩＪｌｌ及び〔α
−３２ｐ）ｄＣＴＰ （アマジャム製、３，０００Ｃｉ
１０＋！ｎｏｌ） １０．ｍと蒸留水１３１１１を加え
た反応混合物を１５°Ｃで２時間反応させた。
３１０ｂｐのＰｓＬＩ−Ｘｈｏｌ断片を回収し、フェノ
ール及びクロロホルムで２回ずつ抽出してから２．５倍
容量のエタノールを加えて沈澱させた。この沈澱を減圧
乾燥後ＴＥ２ＯＪｌｌずつにｔ８解し、その１２ｍに［
ニックトランスレーシランキット」（宝酒造製）の１０
倍濃度バッファー４Ｉｌｌ、酵素溶液ＩＪｌｌ及び〔α
−３２ｐ）ｄＣＴＰ （アマジャム製、３，０００Ｃｉ
１０＋！ｎｏｌ） １０．ｍと蒸留水１３１１１を加え
た反応混合物を１５°Ｃで２時間反応させた。
反応終了後、フェノールで１回抽出したのち、水層を集
めた。これに、子牛胸腺ＤＮＡ溶液（１■／ｍＮ） ３
０１１！、３Ｍ酢酸ナトリウム１０Ｉ１１を加え、さら
にエタノールを加えて生じた沈澱を集め、ＴＥ Ｌｏｏ
Ｊ１！に溶かし、３ｇｐ標識プローブ（プローブＡ ：
４９０ｂｐ断片、プローブＢ ： ３１０ｂｐ断片）
として用いる。
めた。これに、子牛胸腺ＤＮＡ溶液（１■／ｍＮ） ３
０１１！、３Ｍ酢酸ナトリウム１０Ｉ１１を加え、さら
にエタノールを加えて生じた沈澱を集め、ＴＥ Ｌｏｏ
Ｊ１！に溶かし、３ｇｐ標識プローブ（プローブＡ ：
４９０ｂｐ断片、プローブＢ ： ３１０ｂｐ断片）
として用いる。
（３）サザンハイプリダイゼーシッンテスト前記（１）
で得た染色体ＤＮＡ３ｇを制限酵素ＫｐｎＩで完全消化
して０．８％アガロースゲル電気泳動にて分画した。こ
のゲルを１．５Ｍ塩化ナトリウム−０，５Ｍ水酸化ナト
リウム液中で４０分間振盪し、さらに３Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．５Ｍｌ−リスー塩酸バッファー（ｐＨ７，
０）中で１時間振盪した。
で得た染色体ＤＮＡ３ｇを制限酵素ＫｐｎＩで完全消化
して０．８％アガロースゲル電気泳動にて分画した。こ
のゲルを１．５Ｍ塩化ナトリウム−０，５Ｍ水酸化ナト
リウム液中で４０分間振盪し、さらに３Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．５Ｍｌ−リスー塩酸バッファー（ｐＨ７，
０）中で１時間振盪した。
最後に、２００倍濃のＳＳＣ中で３０分間振盪した。
このゲルに２００倍濃のＳＳＣに浸したナイロンメンブ
ランフィルタ−（米国ＮＥＮ社製、Ｇｅｎｅ ５ｃ−ｒ
ｅｅｎ Ｐｌｕｓ）をのせ、ＤＮＡを吸着させた。この
フィルターを２倍濃度のＳＳＣで洗浄してから室温で１
時間自然乾燥し、３７℃で１６時間さらに乾燥させた。
ランフィルタ−（米国ＮＥＮ社製、Ｇｅｎｅ ５ｃ−ｒ
ｅｅｎ Ｐｌｕｓ）をのせ、ＤＮＡを吸着させた。この
フィルターを２倍濃度のＳＳＣで洗浄してから室温で１
時間自然乾燥し、３７℃で１６時間さらに乾燥させた。
このフィルターをハイブリダイゼーシ町ン溶液として、
５倍濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ （０，５％フィコール４
００．０．５％ポリビニルピロリドン、０．５％ウシ血
清アルブミン）、５倍濃度のＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶
液及び仔牛胸腺ＤＮＡ１０ｘ／ａｄ）中に６５℃で６時
間静置した９次に、上記ハイブリダイゼーシッン溶液１
０ｄに（２）で得られた３ ｔ ｐ ８ｉＪプローブ２
０ｄを加え、５８°Ｃで１６時間静置した。このフィル
ターを２倍濃度５ｓｃｏ、ｔ％ＳＤＳ溶液中、室温で１
０分間の振盪洗浄を行った後、０．１倍濃度ＳＳＣ溶液
中、６０℃で２０分間の洗浄を４回繰り返し行った。洗
浄後フィルターを室温で乾燥させ、オートラジオグラフ
ィーを行づたところ第１図のレーン２及びレーン５に示
すような結果が得られた。レーン２はプローブＡをそし
てレーン５はプローブＢを用いて得られたものである。
５倍濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ （０，５％フィコール４
００．０．５％ポリビニルピロリドン、０．５％ウシ血
清アルブミン）、５倍濃度のＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶
液及び仔牛胸腺ＤＮＡ１０ｘ／ａｄ）中に６５℃で６時
間静置した９次に、上記ハイブリダイゼーシッン溶液１
０ｄに（２）で得られた３ ｔ ｐ ８ｉＪプローブ２
０ｄを加え、５８°Ｃで１６時間静置した。このフィル
ターを２倍濃度５ｓｃｏ、ｔ％ＳＤＳ溶液中、室温で１
０分間の振盪洗浄を行った後、０．１倍濃度ＳＳＣ溶液
中、６０℃で２０分間の洗浄を４回繰り返し行った。洗
浄後フィルターを室温で乾燥させ、オートラジオグラフ
ィーを行づたところ第１図のレーン２及びレーン５に示
すような結果が得られた。レーン２はプローブＡをそし
てレーン５はプローブＢを用いて得られたものである。
一方、ＫｐｎＩＯ代わりにＢａｍＨＩ及びＰｓｔｌを用
いて染色体ＤＮＡを消化した゛ものをレーン１．３．４
．６に示す、レーン１とレーン３ではプローブＡを使用
しており、レーン１はＢａｓ＋ＨＩでそしてレーン３は
Ｐｓｔｌで消化して得られたものである。また、レーン
４とレーン６ではプローブＢを使用しておりレーン４は
ＢａｍＨＩでそしてレーン６はＰｓｔｌで消化して得ら
れたものである。
いて染色体ＤＮＡを消化した゛ものをレーン１．３．４
．６に示す、レーン１とレーン３ではプローブＡを使用
しており、レーン１はＢａｓ＋ＨＩでそしてレーン３は
Ｐｓｔｌで消化して得られたものである。また、レーン
４とレーン６ではプローブＢを使用しておりレーン４は
ＢａｍＨＩでそしてレーン６はＰｓｔｌで消化して得ら
れたものである。
（４）ＤＮＡライブラリーの作成
■ＫｐｎｒＤＮＡ断片の調製
前項によって検出した５ 、５ｋｂｐ Ｋｐｎ Ｉ断片
をクローン化するため、ミコバクテリウム・カンサシ、
染色体Ｄ Ｎ Ａ２０ｘをＫｐｎＩで完全に消化した後
、０．８％アガロースゲル電気泳動により分画した。
をクローン化するため、ミコバクテリウム・カンサシ、
染色体Ｄ Ｎ Ａ２０ｘをＫｐｎＩで完全に消化した後
、０．８％アガロースゲル電気泳動により分画した。
約５．０〜６．３ｋｂｐの範囲のＤＮＡ断片を実施例１
−（２）と同様にＤＥ−８１ペーパー法により回収し、
フェノール、クロロホルムでそれぞれ２回ずつ処理後、
エタノール沈澱を行った。沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ２０
１１１に溶解してＫｐｎｌＤＮＡ断片溶液とした。
−（２）と同様にＤＥ−８１ペーパー法により回収し、
フェノール、クロロホルムでそれぞれ２回ずつ処理後、
エタノール沈澱を行った。沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ２０
１１１に溶解してＫｐｎｌＤＮＡ断片溶液とした。
■クローニングベクターｐＵｃ１８の処理プラスミドｐ
Ｕｃ１８（宝酒造製）４■を２ｃ単位のＫｐｎｌを用い
て完全に消化したのち、フェノール、クロロホルムでそ
れぞれ１回づつ抽出し、エタノール沈澱させた゛、この
沈澱を減圧乾燥した後、５０ｍＭトリス−塩酸バッフｙ
−（ｐＨ８，４） １９４Ｊｌ！ニ溶解し、１．５単位
のアルカリホスファターゼ（Ｅ、Ｃｏ１１Ｃ７５）を加
えて、６５℃で１時間反応させた。さらに、１．５単位
のアルカリホスファターゼを加えて、６５°Ｃで１時間
反応させた後、フェノール、クロロホルムでそれぞれ２
回ずつ抽出し、水層にエタノールを加えてＤＮＡを沈澱
させた。この沈澱をＴＥ ４０１１１に溶解し、０．１
眉／Ｉｌ！のベクターＤＮＡ溶液を調製した。
Ｕｃ１８（宝酒造製）４■を２ｃ単位のＫｐｎｌを用い
て完全に消化したのち、フェノール、クロロホルムでそ
れぞれ１回づつ抽出し、エタノール沈澱させた゛、この
沈澱を減圧乾燥した後、５０ｍＭトリス−塩酸バッフｙ
−（ｐＨ８，４） １９４Ｊｌ！ニ溶解し、１．５単位
のアルカリホスファターゼ（Ｅ、Ｃｏ１１Ｃ７５）を加
えて、６５℃で１時間反応させた。さらに、１．５単位
のアルカリホスファターゼを加えて、６５°Ｃで１時間
反応させた後、フェノール、クロロホルムでそれぞれ２
回ずつ抽出し、水層にエタノールを加えてＤＮＡを沈澱
させた。この沈澱をＴＥ ４０１１１に溶解し、０．１
眉／Ｉｌ！のベクターＤＮＡ溶液を調製した。
■組み換えＤＮＡ及びＤＮＡライブラリーの作成
（４）−■で１！翠したＫｐｎｌ断片溶液４Ｊ！！、（
４）−〇で調製したベクターＤＮＡ溶液２Ｉ１１とＤＮ
Ａライゲーションキット（宝酒造製）のＡ溶液３８ｊ１
！、Ｂ溶液６ｐ１の混合物を１６℃で３０分間反応させ
た後、反応混合物２０Ｉ１１をｆＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９株コンピテントセル（宝酒造製） １００ｔ１！に
加え、０°Ｃで４０分間静置し、４２℃で９０秒間、次
いで０℃で５分間静置した。この混合物に、バタトトリ
プトン１％、酵母抽出物０．５％、塩化ナトリウム０．
５％、グルコース０．１％からなるＬ−ブロス培地５０
０Ａｌを加えて３７℃で１時間静置した。この培養液の
一部を採り、アンピシリン５０ｔｒｇ／Ｉ、０．１ｍＭ
Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ、 ０．００４％Ｘ−ｇａｌを含む、
Ｌ−寒天平板培地（Ｌ−ブロス培地に１．５％寒天を加
える）に塗布し、３７°Ｃで約１６時間培養して、アン
ピシリン耐性でかつβ−ガラクトシダーゼ活性非保持の
白色コロニーを得て、ＤＮＡライブラリー作成に用いた
。
４）−〇で調製したベクターＤＮＡ溶液２Ｉ１１とＤＮ
Ａライゲーションキット（宝酒造製）のＡ溶液３８ｊ１
！、Ｂ溶液６ｐ１の混合物を１６℃で３０分間反応させ
た後、反応混合物２０Ｉ１１をｆＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９株コンピテントセル（宝酒造製） １００ｔ１！に
加え、０°Ｃで４０分間静置し、４２℃で９０秒間、次
いで０℃で５分間静置した。この混合物に、バタトトリ
プトン１％、酵母抽出物０．５％、塩化ナトリウム０．
５％、グルコース０．１％からなるＬ−ブロス培地５０
０Ａｌを加えて３７℃で１時間静置した。この培養液の
一部を採り、アンピシリン５０ｔｒｇ／Ｉ、０．１ｍＭ
Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ、 ０．００４％Ｘ−ｇａｌを含む、
Ｌ−寒天平板培地（Ｌ−ブロス培地に１．５％寒天を加
える）に塗布し、３７°Ｃで約１６時間培養して、アン
ピシリン耐性でかつβ−ガラクトシダーゼ活性非保持の
白色コロニーを得て、ＤＮＡライブラリー作成に用いた
。
（５）ミコバクテリウム・カンサシ由来α抗原遺伝子を
有するクローンの選択 上記（４）−■のＤＮＡライブラリーについて、α抗原
遺伝子を含む形質転換株を選択するため、上記（２）で
調製した３２Ｐ標識プローブを用いるコロニーハイブリ
ダイゼーションテストを行った。即ち、ナイロンメンブ
ランフィルタ−（米国ＮＥＮ社製、Ｃ１ｏｌｎｙ／Ｐｌ
ａｑｕｅ ５ｃｒｅｅｎ）上で上記（４）−■で調製し
たＤＮＡライブラリーの形質転換菌を培養し、常法に従
ってフィルターをアルカリ処理、ＬＭ）リスー塩酸バッ
ファー（ｐＨ７，５）による中和、そして１Ｍトリス−
塩酸バッファー（ｐＨ７，５）、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ムで処理した。次に、２倍濃度のＳＳＣにひたしたのち
、室温で３０分間、３７°Ｃで１８時間乾燥することに
より、ＤＮＡ結合フィルターを調製した。
有するクローンの選択 上記（４）−■のＤＮＡライブラリーについて、α抗原
遺伝子を含む形質転換株を選択するため、上記（２）で
調製した３２Ｐ標識プローブを用いるコロニーハイブリ
ダイゼーションテストを行った。即ち、ナイロンメンブ
ランフィルタ−（米国ＮＥＮ社製、Ｃ１ｏｌｎｙ／Ｐｌ
ａｑｕｅ ５ｃｒｅｅｎ）上で上記（４）−■で調製し
たＤＮＡライブラリーの形質転換菌を培養し、常法に従
ってフィルターをアルカリ処理、ＬＭ）リスー塩酸バッ
ファー（ｐＨ７，５）による中和、そして１Ｍトリス−
塩酸バッファー（ｐＨ７，５）、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ムで処理した。次に、２倍濃度のＳＳＣにひたしたのち
、室温で３０分間、３７°Ｃで１８時間乾燥することに
より、ＤＮＡ結合フィルターを調製した。
このフィルターを上記（３）のサザンハイブリダイゼー
ションと同様の操作を行い、プローブに強く結合する塩
基配列を含む組換えＤＮＡ分子を有する形質転換株を選
別することにより、２００個のコロニーから１個のコロ
ニーを〜得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを
抽出、精製し、ｐＫＡ−５２とした。
ションと同様の操作を行い、プローブに強く結合する塩
基配列を含む組換えＤＮＡ分子を有する形質転換株を選
別することにより、２００個のコロニーから１個のコロ
ニーを〜得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを
抽出、精製し、ｐＫＡ−５２とした。
（６）クローン化ＤＮＡの塩基配列決定ｐＫＡ−５２を
種々の制限酵素で切断して、前述（３）と同様にサザン
ハイプリダイゼーションで解析した所、α抗原遺伝子は
２．０ｋｂｐ ＨＬｎｃ ＩＩ断片上に存在するものと
推測されたので、（２）のプローブＤＮＡ断片の調製と
同様にして２．０ｋｂｐ Ｈｉｎｃ Ｕ断片を単離・精
製し、ベクターｐＵｃ１ＢのＨｉｎｃ ＩＩ部位にサブ
クローニングしくｐＫＡＨ２０）ジデオキシ法による塩
基配列決定法（Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ、 ７４．
５４６３ （１９７７））により、その塩基配列を決定
した。この結果を第２図に示した。
種々の制限酵素で切断して、前述（３）と同様にサザン
ハイプリダイゼーションで解析した所、α抗原遺伝子は
２．０ｋｂｐ ＨＬｎｃ ＩＩ断片上に存在するものと
推測されたので、（２）のプローブＤＮＡ断片の調製と
同様にして２．０ｋｂｐ Ｈｉｎｃ Ｕ断片を単離・精
製し、ベクターｐＵｃ１ＢのＨｉｎｃ ＩＩ部位にサブ
クローニングしくｐＫＡＨ２０）ジデオキシ法による塩
基配列決定法（Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ、 ７４．
５４６３ （１９７７））により、その塩基配列を決定
した。この結果を第２図に示した。
実施例２
ミコバクテリウム・カンサシを培地中で培養し、培地中
に分泌されたα抗原を各種カラム操作及び電気泳動を行
うことにより精製した。この精製α抗原のＮ末端付近の
アミノ酸配列をエドマン分解により決定したところ、第
２図に示した塩基配列のうち３９０〜４１０番から推定
されるアミノ酸配列に全く一致した。この結果から実施
例１でクローン化したＤＮＡ断片は、α抗原遺伝子を含
むものであり、３９０〜３９２番目のＴＴＣがＮ末端ア
ミノ酸のＩ Ｐｈ・に対応し１２４５〜１
２４７のＴＧＡが終止コドンにあたることが明らかとな
った。
に分泌されたα抗原を各種カラム操作及び電気泳動を行
うことにより精製した。この精製α抗原のＮ末端付近の
アミノ酸配列をエドマン分解により決定したところ、第
２図に示した塩基配列のうち３９０〜４１０番から推定
されるアミノ酸配列に全く一致した。この結果から実施
例１でクローン化したＤＮＡ断片は、α抗原遺伝子を含
むものであり、３９０〜３９２番目のＴＴＣがＮ末端ア
ミノ酸のＩ Ｐｈ・に対応し１２４５〜１
２４７のＴＧＡが終止コドンにあたることが明らかとな
った。
即ち、α抗原成熟ポリペプチドをコードする遺伝子、つ
まりα抗原の構造遺伝子は３９０〜１２４４番に該当す
る（図中の下線部分）゛、また２７０〜３８９番目の塩
基配列はα抗原の分泌に必要なシグナルペプチドをコー
ドする。
まりα抗原の構造遺伝子は３９０〜１２４４番に該当す
る（図中の下線部分）゛、また２７０〜３８９番目の塩
基配列はα抗原の分泌に必要なシグナルペプチドをコー
ドする。
α抗原のポリペプチドをコードする塩基配列から翻訳さ
れるアミノ酸残基数は２８５個であり、その計算分子量
は３０．６４４で、そのアミノ酸配列を第３図に示した
。
れるアミノ酸残基数は２８５個であり、その計算分子量
は３０．６４４で、そのアミノ酸配列を第３図に示した
。
また１９９〜２０４番のＴＣＧＡＣＡと２２３〜２２８
番のＴＡＡＧＴＴという配列は、ミコバクテリウム・カ
ンサシ由来α抗原のプロモーターであり、シグナルペプ
チドと共に分泌発現のために重要な領域と考えられる。
番のＴＡＡＧＴＴという配列は、ミコバクテリウム・カ
ンサシ由来α抗原のプロモーターであり、シグナルペプ
チドと共に分泌発現のために重要な領域と考えられる。
実施例３
（１）細菌内でのミコバクテリウム・カンサシ由来α抗
原の発現 形質発現ベクタ−ｐＫＫ２３３−２ （スウェーデン、
ファルマシア社製）、ｐｔｌｃ１８ （宝酒造製）と化
学合成オリゴヌクレオチドを用いてα抗原を生産した。
原の発現 形質発現ベクタ−ｐＫＫ２３３−２ （スウェーデン、
ファルマシア社製）、ｐｔｌｃ１８ （宝酒造製）と化
学合成オリゴヌクレオチドを用いてα抗原を生産した。
α抗原発現ベクターの構築のストラテジーを第４図に示
した。詳細を以下に説明する。
した。詳細を以下に説明する。
■化学合成オリゴヌクレオチドの調製
第２図に示した塩基配列を参考にして下記のような化学
合成オリゴヌクレオチドを合成した。
合成オリゴヌクレオチドを合成した。
化学合成オリゴヌクレオチドｌ：
５ ’ ＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＣＴ
ＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧ３ ’化学合
成オリゴヌクレオチド２： ５’ ＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧ
ＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡ３’からなる
オリゴヌクレオチド２種をそれぞれ、自動ＤＮＡ合成装
置（米国、アプライドバイオシステムズ社３７０Ａ型）
で合成したのち、ジメトキシトリチル基以外の保護基を
除去し、逆相中圧カラムクロマトグラフィー（条件：０
１８−シリカゲル。
ＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧ３ ’化学合
成オリゴヌクレオチド２： ５’ ＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＣＣＧＧ
ＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡ３’からなる
オリゴヌクレオチド２種をそれぞれ、自動ＤＮＡ合成装
置（米国、アプライドバイオシステムズ社３７０Ａ型）
で合成したのち、ジメトキシトリチル基以外の保護基を
除去し、逆相中圧カラムクロマトグラフィー（条件：０
１８−シリカゲル。
カラムを用い、移動相として１００ｍＭ トリエチルア
ミンアセテートバッファー（ｐＨ７，０）中、アセトニ
トリルからなる濃度勾配液を用いる）で精製した。
ミンアセテートバッファー（ｐＨ７，０）中、アセトニ
トリルからなる濃度勾配液を用いる）で精製した。
次いで、８０％酢酸を用いてジメトキシトリチル基を除
去した後、逆相ＨＰＬＣ（条件： ＹＭＣＰＡＣＫＡＭ
−３１４０Ｄ Ｓカラムを用い、移動相として１００ｍ
Ｍ）リエチルアミンアセテートバッフｙ−（ｐＨ７，０
）中、アセトニトリルからなる濃度勾配液を用いる）で
精製し、凍結乾燥した。
去した後、逆相ＨＰＬＣ（条件： ＹＭＣＰＡＣＫＡＭ
−３１４０Ｄ Ｓカラムを用い、移動相として１００ｍ
Ｍ）リエチルアミンアセテートバッフｙ−（ｐＨ７，０
）中、アセトニトリルからなる濃度勾配液を用いる）で
精製し、凍結乾燥した。
か（して得られた合成オリゴヌクレオチド１と２それぞ
れ２５Ｏｐｍｏｌずつキナーゼ反応バッファー（５０ｍ
Ｍ ）リスー塩酸バッファー（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
ＭＡＴＰ）中、１５単位のポリヌクレオチドキナーゼで
３７°Ｃで１時間反応させた。合成オリゴヌクレオチド
１と２それぞれの反応混合物から５０ｐｍｏ ｌずつを
混合し、７０°Ｃで５分間加熱した後、除冷するごとに
よりアニーリングさせて塩基配列 ５’ −ＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＣＴ
ＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’３’
−ＡＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣΔ八
ＣＴＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧ−５”で示へれるオ
リゴヌクレオチドアダプターを得た。
れ２５Ｏｐｍｏｌずつキナーゼ反応バッファー（５０ｍ
Ｍ ）リスー塩酸バッファー（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
ＭＡＴＰ）中、１５単位のポリヌクレオチドキナーゼで
３７°Ｃで１時間反応させた。合成オリゴヌクレオチド
１と２それぞれの反応混合物から５０ｐｍｏ ｌずつを
混合し、７０°Ｃで５分間加熱した後、除冷するごとに
よりアニーリングさせて塩基配列 ５’ −ＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＣＴ
ＧＣＣＧＧＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧ−３’３’
−ＡＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣΔ八
ＣＴＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧ−５”で示へれるオ
リゴヌクレオチドアダプターを得た。
このアダプターは、ミコバクテリウム・カンサシ由来α
抗原のＮ末端Ｐｈｅ’〜Ｇｌｎ”に対応する遺伝子を補
い、ρＫＫ２３３−２のｔｒｃプロモーターの下流に存
在するＮｃｏｌサイトに、α抗原遺伝子の一部を含むＢ
ａｎ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ断片を挿入するための粘着末端
を有する。
抗原のＮ末端Ｐｈｅ’〜Ｇｌｎ”に対応する遺伝子を補
い、ρＫＫ２３３−２のｔｒｃプロモーターの下流に存
在するＮｃｏｌサイトに、α抗原遺伝子の一部を含むＢ
ａｎ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ断片を挿入するための粘着末端
を有する。
■形質発現ベクターｐＫＫ２３３−２及びｐＵｃ１８の
処理ｐＫに２３３−２．１０河を制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ■で完全消化し、実施例１−（２）と同様に
して約３００ｂｐのＥｃｏＲＩ −Ｈｉｎｄｌｌ断片を
単離し、ＴＥＩＯμｌに溶解する。このＤＮＡ断片はｔ
ｒｃプロモーター、Ｉａｃオペレーター、ＳＤ配列、Ａ
ＴＧ開始コドン及びＮｃｏｌ、Ｐｓｔｒ、 Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ、クローニングサイトを含んでいる。
処理ｐＫに２３３−２．１０河を制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ■で完全消化し、実施例１−（２）と同様に
して約３００ｂｐのＥｃｏＲＩ −Ｈｉｎｄｌｌ断片を
単離し、ＴＥＩＯμｌに溶解する。このＤＮＡ断片はｔ
ｒｃプロモーター、Ｉａｃオペレーター、ＳＤ配列、Ａ
ＴＧ開始コドン及びＮｃｏｌ、Ｐｓｔｒ、 Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ、クローニングサイトを含んでいる。
次に、ｐＵｃ１８．５ｔ１ｇを同様にＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄ■で消化して生成する。２．６ｋｂｐのＥｃｏＲ
ｒ ｌ−１ｉｎｄｌｌｌ断片を単離し、ＴＥ２０ＩＪ
１に溶解する。それぞれＩＩずつ実施例１（４）−〇と
同様にＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、プ
ラスミドｐＵｃＫ１０を得た。このプラスミドはｐＫＫ
２３３−２よりもコピー数が多いｐＵｃ１８の複製開始
領域を存している。
ｉｎｄ■で消化して生成する。２．６ｋｂｐのＥｃｏＲ
ｒ ｌ−１ｉｎｄｌｌｌ断片を単離し、ＴＥ２０ＩＪ
１に溶解する。それぞれＩＩずつ実施例１（４）−〇と
同様にＤＮＡライゲーションキットを用いて連結し、プ
ラスミドｐＵｃＫ１０を得た。このプラスミドはｐＫＫ
２３３−２よりもコピー数が多いｐＵｃ１８の複製開始
領域を存している。
ρυＣＫＩＯ１５１ＩｇをＰｓｔＩで消化し、６５°Ｃ
，５分間熱処理して酵素を失活させた後、エタノール沈
澱を行う。沈澱を蒸留水９ｔｌｌと、１０倍濃度のプラ
ンティングバッファー（ＤＮＡプランティングキット、
宝酒造製）ｌＩｌ！を加えて溶解し、７０℃で５分間加
熱後、３７℃で３分間静置した。この溶液にＴ４ＤＮＡ
ボリメ′ラーゼＩＪ１！を加え、３７°Ｃで５分間反応
した後、ＤＮＡ希釈バッファー３９Ｉｉ１を加え激しく
撹拌する。フェノール、クロロホルムで１回ずつ処理し
た後、エタノール沈澱する。沈澱をＤＮＡ希釈バッファ
ー２０μ！に溶解し、その１４とＸｈｏＩリンカ−（２
，５ｐｍｏｌ／１１１） ２ Ｊｌｌを実施例１（４）
−■と同様にＤＮＡライゲーションキットを用いて連結
し、ｐＵＣＫｌｏのＰｓｔＩサイトをＸｈｏｌサイトに
変換したプラスミドｐＵＣＫ２０を得た。
，５分間熱処理して酵素を失活させた後、エタノール沈
澱を行う。沈澱を蒸留水９ｔｌｌと、１０倍濃度のプラ
ンティングバッファー（ＤＮＡプランティングキット、
宝酒造製）ｌＩｌ！を加えて溶解し、７０℃で５分間加
熱後、３７℃で３分間静置した。この溶液にＴ４ＤＮＡ
ボリメ′ラーゼＩＪ１！を加え、３７°Ｃで５分間反応
した後、ＤＮＡ希釈バッファー３９Ｉｉ１を加え激しく
撹拌する。フェノール、クロロホルムで１回ずつ処理し
た後、エタノール沈澱する。沈澱をＤＮＡ希釈バッファ
ー２０μ！に溶解し、その１４とＸｈｏＩリンカ−（２
，５ｐｍｏｌ／１１１） ２ Ｊｌｌを実施例１（４）
−■と同様にＤＮＡライゲーションキットを用いて連結
し、ｐＵＣＫｌｏのＰｓｔＩサイトをＸｈｏｌサイトに
変換したプラスミドｐＵＣＫ２０を得た。
■組み換えＤＮＡ及び形質転換体の調製実施例１−（６
）で得られたプラスミドｐＫＡ１１２０ （２，０ｋｂ
ｐ Ｈｉｎｃ ｍ断片を含有する＞１０■ずつをそれぞ
れＸｈｏＩ、 ＨｉｎｄＩ［［とＢａｎｌ５Ｘｈｏｌで
切断し、実施例１−（２）と同様にして１．１ｋｂｐ
Ｘｈｏｌ Ｈｉｎｄｌｌ！断片と０．５ｋｂｐ Ｂａ
ｎ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ断片単離し、Ｔ Ｅ２０ｍずつに
溶解する。
）で得られたプラスミドｐＫＡ１１２０ （２，０ｋｂ
ｐ Ｈｉｎｃ ｍ断片を含有する＞１０■ずつをそれぞ
れＸｈｏＩ、 ＨｉｎｄＩ［［とＢａｎｌ５Ｘｈｏｌで
切断し、実施例１−（２）と同様にして１．１ｋｂｐ
Ｘｈｏｌ Ｈｉｎｄｌｌ！断片と０．５ｋｂｐ Ｂａ
ｎ Ｉ −Ｘｈｏ Ｉ断片単離し、Ｔ Ｅ２０ｍずつに
溶解する。
次に、■で調製したｐＵｃＫ２０５ｉをＸｈｏｌ、Ｈｉ
ｎｄＩ［［で切断し、２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を同様
に単離し、ＴＥｌｏｊｌｌに溶解する。その１ｉｌｌと
前記１，１ｋｂｐＸｈｏＩ Ｈｉｎｄｎ［断片溶液２
Ｉ！！を実施例１（４）−■と同様にＤＮＡう゛イゲー
ションキットにて連結し、α抗原遺伝子のＣ末端側を含
むプラスミドｐＵｃに１００を得た。このｐｔｌｃに１
００２０ＩＩｇをＮｃｏｌ及びＸｈ。
ｎｄＩ［［で切断し、２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を同様
に単離し、ＴＥｌｏｊｌｌに溶解する。その１ｉｌｌと
前記１，１ｋｂｐＸｈｏＩ Ｈｉｎｄｎ［断片溶液２
Ｉ！！を実施例１（４）−■と同様にＤＮＡう゛イゲー
ションキットにて連結し、α抗原遺伝子のＣ末端側を含
むプラスミドｐＵｃに１００を得た。このｐｔｌｃに１
００２０ＩＩｇをＮｃｏｌ及びＸｈ。
Ｉで消化し、４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を同様に単離し
、ＴＥ１５ｐＺに溶解する。その１μｌと前記０．５ｋ
ｂｐ Ｂａｌｌｌ１−Ｘｈｏｌ断片溶液２ｄと、■で調
製した合成アダプターのアニーリング混合物約４０ｐｍ
ｏｌを同様にＤＮＡライゲーシッンキットにて連結し、
直接発現ベクターｐＵｃＫ２０１を得た。
、ＴＥ１５ｐＺに溶解する。その１μｌと前記０．５ｋ
ｂｐ Ｂａｌｌｌ１−Ｘｈｏｌ断片溶液２ｄと、■で調
製した合成アダプターのアニーリング混合物約４０ｐｍ
ｏｌを同様にＤＮＡライゲーシッンキットにて連結し、
直接発現ベクターｐＵｃＫ２０１を得た。
この組み換えＤＮＡを常法に従ってＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ
Ｉ０９株に形質転換した。このようにして、＆ＩＩ換え
ＤＮＡ ｐｔｌｃＫ２０１を含有する形質転換体＾ＪＫ
２０１ （微工研菌寄第１０６８３号）を得た。
Ｉ０９株に形質転換した。このようにして、＆ＩＩ換え
ＤＮＡ ｐｔｌｃＫ２０１を含有する形質転換体＾ＪＫ
２０１ （微工研菌寄第１０６８３号）を得た。
さて、このρｕＣに２０１は成熟型α抗原をコードする
遺伝子を含み形質転換体＾ＪＫ２０１は下記第１表で示
される塩基配列でコードされるミコバクテリウム・カン
サシ由来α抗原を生産する。
遺伝子を含み形質転換体＾ＪＫ２０１は下記第１表で示
される塩基配列でコードされるミコバクテリウム・カン
サシ由来α抗原を生産する。
第１表
■形質軸ＩＡ体＾Ｊに２０１によるα抗原の生産ＡＪＫ
２０１及び、ｕｃＫｉｏを含むｌＥ、ｃｏｌｉ ＪＨ１
０９株（ＪＭＩＯ９（ｐＵｃＫｌＯ）と略称〕をそれぞ
れＬ−フ゛ロス１自１１ｉ！５Ｉ１１（５０Ｉ！ｇ／ｌ
ｌ１１アンピシリン含有）中３７°Ｃで一晩振盪培養し
た。この培養液０．５ｄを新しいし一ブロス培地５０ｄ
（５０ｘ／ｄアンピシリン含有）に加え、３７°Ｃで
４．５時間振盪培養したのち、ＩＰＴＯを最終濃度１ｍ
Ｍになるように加え、３０’Ｃでさらに５時間振盪を続
けた。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、
該菌体を１０ｍＭ トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７，
０） ３ ｒｄに懸濁し、超音波処理（１００ＷＩＯ
分間）した後、遠心分離し上滑を採取した。
２０１及び、ｕｃＫｉｏを含むｌＥ、ｃｏｌｉ ＪＨ１
０９株（ＪＭＩＯ９（ｐＵｃＫｌＯ）と略称〕をそれぞ
れＬ−フ゛ロス１自１１ｉ！５Ｉ１１（５０Ｉ！ｇ／ｌ
ｌ１１アンピシリン含有）中３７°Ｃで一晩振盪培養し
た。この培養液０．５ｄを新しいし一ブロス培地５０ｄ
（５０ｘ／ｄアンピシリン含有）に加え、３７°Ｃで
４．５時間振盪培養したのち、ＩＰＴＯを最終濃度１ｍ
Ｍになるように加え、３０’Ｃでさらに５時間振盪を続
けた。得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、
該菌体を１０ｍＭ トリス−塩酸バッファー（ｐＨ７，
０） ３ ｒｄに懸濁し、超音波処理（１００ＷＩＯ
分間）した後、遠心分離し上滑を採取した。
この菌体抽出液の少量をレムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ２
２７、６８０（１９７０） ）に従って５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法とウェスタンプロット法に
より分析した結果を第５図に示す、同図に示すように、
抗α−Ｋ（ミコバクテリウム・カンサシ由来の精製α抗
原）抗体を用いたウェスタンプロット法において、ＪＭ
１０９ （ｐＵｃＫｌｏ） （レーン３）ではバンドが
見られないのに対し、ＡＪＫ２０１ （レーン２）では
α−Ｋ（レーン１）とほぼ同じ分子量約３０，０００の
位置にポジティブなバンドが見られ、成熟型α抗原が発
現していることがわかった。
２７、６８０（１９７０） ）に従って５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法とウェスタンプロット法に
より分析した結果を第５図に示す、同図に示すように、
抗α−Ｋ（ミコバクテリウム・カンサシ由来の精製α抗
原）抗体を用いたウェスタンプロット法において、ＪＭ
１０９ （ｐＵｃＫｌｏ） （レーン３）ではバンドが
見られないのに対し、ＡＪＫ２０１ （レーン２）では
α−Ｋ（レーン１）とほぼ同じ分子量約３０，０００の
位置にポジティブなバンドが見られ、成熟型α抗原が発
現していることがわかった。
本発明により提供されるミコバクテリウム・カンサシ由
来の抗原蛋白は抗原抗体反応（ＥＬＩＳＡ法）によるミ
コバクテリウム・カンサシ症の診断薬として使用できる
。
来の抗原蛋白は抗原抗体反応（ＥＬＩＳＡ法）によるミ
コバクテリウム・カンサシ症の診断薬として使用できる
。
また、本発明により提供されたミコバクテリウム・カン
サシのα抗原をコードする遺伝子及びそれを用いた遺伝
子工学的手法によるミコバクテリウム・カンサシのα抗
原製造法はミコバクテリウム・カンサシ症と結核あるい
は肺ガンを識別するのに有用なα抗原蛋白を大量に提供
するために重要である。
サシのα抗原をコードする遺伝子及びそれを用いた遺伝
子工学的手法によるミコバクテリウム・カンサシのα抗
原製造法はミコバクテリウム・カンサシ症と結核あるい
は肺ガンを識別するのに有用なα抗原蛋白を大量に提供
するために重要である。
さらに、本発明により提供されたミコバクテリウム・カ
ンサシのα抗原をコードする遺伝子、シグナルペプチド
７及びそれをコードする遺伝子及びプロモーターは、Ｂ
ＣＧ菌の分泌発現系による遺伝子組換えＢＣＧ生ワクチ
ンを開発するためのマーカー（特異抗原決定基）付きの
キャリアー蛋白遺伝子として利用できる。
ンサシのα抗原をコードする遺伝子、シグナルペプチド
７及びそれをコードする遺伝子及びプロモーターは、Ｂ
ＣＧ菌の分泌発現系による遺伝子組換えＢＣＧ生ワクチ
ンを開発するためのマーカー（特異抗原決定基）付きの
キャリアー蛋白遺伝子として利用できる。
４、面の簡単な説明
第１図は、ミコバクテリウム・カンサシ染色体ＤＮＡの
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩによる消化
物に対するプローブＡＳＢのサザンハイプリダイゼーシ
ョンを示す図である。第２図は決定した１３９６ｂｐの
ＤＮＡの塩基配列を示す。第３図はα抗原のアミノ酸配
列を示す、第４図は成熟型α抗原発現ベクターｐＵｃＫ
２０１の構築を示す図である。第５図はＪＭ１０９ （
ｐＵｃＫｌｏ）とＡＪＫ２０１の菌体抽出液をウェスタ
ンプロット法で分析した図である。
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩによる消化
物に対するプローブＡＳＢのサザンハイプリダイゼーシ
ョンを示す図である。第２図は決定した１３９６ｂｐの
ＤＮＡの塩基配列を示す。第３図はα抗原のアミノ酸配
列を示す、第４図は成熟型α抗原発現ベクターｐＵｃＫ
２０１の構築を示す図である。第５図はＪＭ１０９ （
ｐＵｃＫｌｏ）とＡＪＫ２０１の菌体抽出液をウェスタ
ンプロット法で分析した図である。
Claims (6)
- （１）下記のアミノ酸配列を有するツベルクリン活性蛋
白α抗原 アミノ酸配列（ I ）； 【遺伝子配列があります】 - （２）下記の塩基配列で示される請求項（１）に記載の
遺伝子 【遺伝子配列があります】 - （３）請求項（１）に記載のアミノ酸配列を有するミコ
バクテリウム・カンサシ由来のα抗原をコードする遺伝
子を含有する組換えＤＮＡにより形質転換された形質転
換体を培地中で培養し、生産されたα抗原を採取するこ
とを特徴とするミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗
原の製造法 - （４）形質転換体がエシェルヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈ−ｉａ ｃｏｌｉ）である請求項（３）に記載のα
抗原の製造法 - （５）下記のアミノ酸配列を有する請求項（１）に記載
のα抗原のシグナルペプチド 【遺伝子配列があります】 - （６）請求項（５）に記載のシグナルペプチドをコード
する遺伝子
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12809189A JPH02308793A (ja) | 1989-05-22 | 1989-05-22 | ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12809189A JPH02308793A (ja) | 1989-05-22 | 1989-05-22 | ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02308793A true JPH02308793A (ja) | 1990-12-21 |
Family
ID=14976180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12809189A Pending JPH02308793A (ja) | 1989-05-22 | 1989-05-22 | ミコバクテリウム・カンサシ由来のα抗原 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02308793A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002066055A1 (fr) * | 2001-02-20 | 2002-08-29 | Maruho Co., Ltd. | Nouvelle utilisation en medecine d'un antigene alpha ou d'un gene d'antigene alpha |
-
1989
- 1989-05-22 JP JP12809189A patent/JPH02308793A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002066055A1 (fr) * | 2001-02-20 | 2002-08-29 | Maruho Co., Ltd. | Nouvelle utilisation en medecine d'un antigene alpha ou d'un gene d'antigene alpha |
| US7524675B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-04-28 | Maruho Co., Ltd. | Pharmaceutical use of alpha antigen or alpha antigen gene |
| US7622297B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-11-24 | Maruho Co., Ltd. | Pharmaceutical use of α antigen or α antigen gene |
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