JPH0235364A - 特異結合性タンパク質の固定化されたポリマー粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は特異結合性タンパク質の固定化されたポリマー
粒子、詳しくは特異結合性タンパク質を粒子に固定化さ
せ、特異結合性タンパク質に特異的に結合する被測定対
象を検出するという、免疫学的粒子凝集反応に利用でき
る特異結合性タンパク質の固定化された親水性ポリマー
粒子に関するものである。

（従来の技術） 特異結合性タンパク質を固定化させた担体粒子は、特異
結合性クンバク質に特異的に結合する被測定対象を結合
させ、検出する方法、代表的には受身凝集反応、受身凝
集阻止反応および混合受身凝集反応に用いられている。

上記の受身凝集反応は、抗原を固定化させた担体粒子と
、測定する検体を■底あるいはＵ底のマイクロプレート
のウェルに添加し混合反応させる。

検体中に抗原と特異的に反応する抗体がある場合には、
担体表面の抗原と反応し、反応陽性の凝集像が認められ
る。この時、反応陽性の凝集像は一般にウェルの底面に
粒子が拡散した状態であり、一方反応陰性の像は、Ｕ底
又は■底のウェルの中心に落下し、ボタン状の状態を呈
する。

次に受身凝集阻止反応ばＵ底あるいはＶ底のマイクロプ
レートのウェル中に抗原と検体を加え、一定時間放置し
た後これに、抗体を固定化させた担体粒子を加え、混合
反応させる。検体中に抗原に特異的に反応する抗体があ
る場合には、抗原と検体中の抗体が反応し、中和するた
め、抗体を固定化させた担体粒子の凝集像が認められな
い。これを反応陽性とし、この時の像はＵ底又は■底の
ウェルの中心に落下し、ボタン状の状態であり、一方反
応陽性の像はウェルの底面に粒子が拡散した状態を呈す
る。

また混合受身凝集反応はマイクロプレートのＵ底又はＶ
底のウェルの底面に抗原を結合し、この抗原結合部分に
検体を反応させた後、洗浄し、抗体を結合した担体粒子
を反応させ、担体粒子がＵ底又は■底の底面−面に広が
る像を陽性、粒子が底面の中央部にボタン状に集合した
像を陰性と判定することにより抗体を検出する方法であ
る。

従来、−船釣に特異結合性タンパク質を結合させるのに
利用されている粒子担体には、ヒト及び動物赤血球、活
性炭の粉末、カオリン、ポリスチレンラテックス、アク
リルアミド粒子、ゼラチン粒子がある。この他にアガロ
ース、デキストラン、セルロースなどアフィニティーク
ロマトグラフィーで用いられる担体材料が利用可能であ
る。

（発明が解決しようとする課題） しかしながらかかる担体粒子としてヒト及び動物赤血球
を利用することはＳ、ν、Ｂｏｙｄｅｎ、　Ｊ、Ｅｘｐ
。

Ｍｅｄ、、　９３．１０７　（１９５１）にもあるよう
に容易に調整利用できるものの固体差、血球の新鮮さが
バラツキやすい。さらに固有の表面抗原が非特異反応を
増大させると言う欠点がある。

活性炭の粉末、カオリンは形状が不定形でかつ粒子径を
均一に調整しにくいと言う欠点がある。

ポリスチレンラテックスは均一なナイスが確保できるも
のの表面の疎水的性質に由来する非特異的な凝集が起き
やすかったり、凍結乾燥できない等の欠点をもっている
。

アガロース、デキストラン、セルロース等はアフィニテ
ィークロマトグラフィーで用いられる好ましい粒子担体
を提供しているが、免疫学的粒子凝集反応に必要な好ま
しくは粒径１μ〜１０μの均一なサイズの粒子を得るこ
とは困難で実用化されていない。

ゼラチンとアラビアガムもしくはカルボキシメチルセル
ロースナトリウムのような水溶性多糖との複合コアセル
ベ−１・から免疫学的粒子凝集反応に用いる粒子担体を
得る方法が特開昭５７−１５３６５８号公報に開示され
ているが、ゼラチン、アラビアガム等は天然の高分子成
分であり、均一な性質の材料を安定に得ることには限度
がある。自然の産物であるためにその性質を人為的にコ
ントロールできず、その影響が粒子担体に反映されると
言う欠点を持っている。

アクリルアミドからなる親水性ポリマー粒子はアフィニ
ティークロマトグラフィーの分野で利用されるだけでな
く、各種免疫学的な分析に利用されている。中でもバイ
オ・ランド社から発売されているアフィゲル ｌ−１ アフィゲル７０１はアミノ基、アフィゲル７０２はカル
ボキシル基を有し、必要に応じて好ましい架橋剤を用い
てタンパク質等の固定化が可能である。

−船釣に用いられる架橋法には架橋剤にカルボジイミド
を用いる方法、グルタルアルデヒド、グイマレイミド、
イソシアネート、等々を用いる方法があげられる。しか
しながら、架橋反応時の反応基の安定性、反応性をコン
トロールすることは容易ではない。特に粒子凝集反応に
用いる場合粒子表面の表面電位、解離基の状態、親水性
疎水性の程度が重要となり、実際に実用化されている例
は少ない。本来すぐれた素材であるにもがかわらず、そ
の長所が十分生かされていない。

（課題を解決するための手段） 本発明は、上記担体粒子の問題点を解決し、免疫学的粒
子凝集反応に利用し得る特異結合性クンバク質を固定化
した粒子を開発するべく鋭意研究した結果達成されたも
ので、色素が結合した非タンパク質性の親水性ポリマー
からなる担体粒子にタンニン酸あるいはタンニン酸を含
む化合物を介して特異結合性タンパク質が固定化されて
成ることを特徴とする特異結合性タンパク質の固定化さ
れたポリマー粒子に関するものである。

本発明で用いられる非タンパク質性の親水性ポリマーか
らなる担体粒子としては、化学的に安定で自然凝集がな
く、それ自身抗原活性を有しないものが良い。担体粒子
の粒径ば１μ〜１０μが好ましく、形状は球形が望まし
いが、凝集像が適切に形成できるものであれば良い。

このような担体粒子の材質としてはアクリルアミドから
合成されるものが好ましいが、セルロース、アガロース
、デキストラン等から形成される粒子、親水性モノマー
を含み合成された親水性ラテックス粒子、表面に親水基
を導入した親水性ラテックス粒子等も技術的には利用可
能である。担体粒子には、水溶液中での分散状態を保持
できるように、カルボキシル基、スルホン基、リン酸基
、ヒドロキシル基、エポキシ基等を導入するのが好まし
い。

上記担体粒子に結合されている色素は担体に良く染まり
、脱離しにくいものが良い。一般に色素と総称されるも
のの中に動物色素、植物色素などの天然色素、合成染料
、顔料、塗料、着色料などの合成色素がある。この中で
合成染料は工業的に多く使用され、粒子などを着色する
のに適当である。

合成染料の中で、カチオン性染料、直接染料などを用い
ることができるが、好ましくはカチオン性染料が適して
いる。

カチオン性染料としてはアイゼン　ビクトリアピュアー
　ブルー（Ａｉｚｅｎ　Ｖｉｃｔｏｒｉａ　Ｐｕｒｅ　
Ｂｌｕｅ）ＢＯＩＩ。

アイゼン　ビクトリア　フ゛ル−（八１ｚｅｎ　Ｖｉｃ
ｔｏｒｉａＢｌｕｅ）Ｂ１１．　　アイゼン　メチル　
バイオレット　ピュアー　スペシャル（Ａｉｚｅｎ　Ｍ
ｅｔｈｙｌ　Ｖｉｏｌｅｔ　ＰｕｒｅＳｐｅｃｉａｌ）
　（採土ケ谷化学工業■製）、ジアクリルブルー（Ｄｉ
ａｃｒｙｌ　Ｂｌｕｅ）ＧＲＬ−Ｎ　、ジアクリル　ブ
ルーＫＳＬ−Ｎ、　　ジアクリル　ブルーＡＶ−Ｎ（三
菱化成工業■製）、カイアクリル　ブルー（Ｋａｙａｃ
ｒｙｌ　Ｂｌｕｅ）ＢＭ−ＥＤＴＯ２０，カイアクリル
　ブルー２ＲＬ−ＥＤ　Ｒ−０１１゜カイアクリル　ロ
ーダミン（Ｋａｙａｃｒｙｌ　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）Ｂ
Ｌ−ＥＤ　ｌ’１ｏ０９．（日本化薬味類）を挙げるこ
とができる。

直接染料としては、リアクティブ　グリーン（Ｒｅａｃ
ｔｉｖｅ　Ｇｒｅｅｎ）、ダイレクト　コツパー　ブル
ー（Ｄｉｒｅｃｔ　ｃｏｐｐｅｒ　Ｂｌｕｅ）２Ｂ（三
井東圧化学■製）、アイゼン　プリムラ　ブルーＢＧＬ
１１、ダイレクトスカイ　ブルー（Ｄｉｒｅｃｔ　Ｓｋ
ｙ　Ｂｌｕｅ）５Ｂ　（採土ケ谷化学工業■製）、シア
ルミナス　ブルー（Ｄｉａｌｕｍｉｎｏｕｓ　Ｂｌｕｅ
）ＲＦ、シアルミナス　ブルーＧＦ（三菱化成工業■製
）を挙げることができる。

これらの中でアイゼン　ビクトリア　ピュアーブルーＢ
ＯＨ、アイゼン　ビクトリア　ブルー旧１が特に好まし
い。

特異結合性タンパク質は、抗原抗体反応のように、その
対応体が存在し、その対応体と反応し合うものである。

特異結合性タンパク質の例としては、血清中の免疫グロ
ブリン、アルブミン、フェリチン等のタンパク質、ＨＢ
抗原、ＩＩＴＶ等の病原体、各種内分泌線に由来するホ
ルモン、α−アミラーゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素、
生理活性のあるペプタイドを挙げることができる。

本発明の特異結合性タンパク質の固定化されたポリマー
粒子は前記担体粒子に色素を結合させ着色担体をつくり
、この担体の色素にタンニン酸あるいはタンニン酸を含
む化合物を結合させ、該タンニン酸またはタンニン酸を
含む化合物を介して特異結合性タンパク質を固定化する
ことにより得られる。使用されるタンニン酸を含む化合
物としては、タンニン、ガロタンニンが挙げられる。ま
た製造に際して使用する粒子懸濁液は色素、タンニン酸
あるいはタンニン酸を含む化合物、特異結合性タンパク
質が反応しやすい溶液がよい。例としてリン酸緩衝液、
グリシン−Ｎ　ａ　Ｏ１＋緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）
緩衝液などの緩衝液を挙げることができる。

粒子懸濁液は必要に応じてＮａＣｊ２等の塩や界面活性
剤を添加する。界面活性剤は、粒子の分散性を良くする
為に用いられるものである。例として、カチオン性、ア
ニオン性、非イオン性、両性の界面活性剤を挙げること
ができるが、特にＮ−アシルアミノ酸あるいはその塩類
（例えばＲ−Ｃｏ−Ｎ（Ｃｔｈ）ＣＨ２ＣＯＯ１ｌ、　
Ｒ−Ｃｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＩｌ□ＣＯＯＮａ　、　Ｒ
−Ｃｏ−Ｎ−（Ｃ１，＋）ＣＨ□ＣＨ□Ｃ００Ｎａ）の
アニオン性界面活性剤が好ましい。

粒子懸濁液のｐＨは色素、タンニン酸あるいはタンニン
酸を含む化合物、特異結合性タンパク質によって異なる
が、通常ｐＨ５〜ｐ１１９の範囲が良い。

また、反応温度も色素、タンニン酸あるいはタンニン酸
を含む化合物、特異結合性タンパク質によって異なるが
、通常４°Ｃ〜５０°Ｃの範囲が良い。

（実施例） 本発明を次の実施例により説明する。

災施桝上 く未着色粒子と着色粒子における抗ヒ）ＩｇＧの検出比
較〉 （１）未着色粒子と着色粒子へのヒトＩｇＧ感作方法１
、　ポリアクリルアミド粒子の未着色粒子ｖＣ０１０４
２（日本ゼオン■製）の１％懸濁液１２００μｉを取り
０．０１％アイゼン　ビクトリア　ピュアブルーＢｏｌ
＋（以下Ａ・Ｖ　−Ｐ　−Ｂ　−Ｂｏｌ＋）を含む０．
０１％ポリビニルアルコール（和光製）水溶液６００　
μ℃を添加し、混合した。

２、　未着色粒子ＶＣＯ１０４２と１で得られた着色粒
子を０．　］、５５ＭＮａＣＥと０．０１％ザルコシネ
ー１ｎ、Ｎ（日光ケミカル■製）を含む０．０１　Ｍ　
Ｔｒｉｓ−１１ｃｎｐＨ７，５（以下Ｔｒｉｓ−３−３
）　　１　ｍｌで２５００ｒｐｍ　Ｘ　３ｍ１ｎの遠心
を用いて３回洗浄し、Ｔｒｉｓ−３−３を１２００μ℃
を添加した。

３、　タンニン酸（半井化学■製）をＴｒｉｓ−３−３
で、０．５．１０μＢ／ｍｌの３種の濃度に調整し、そ
の４００ｕｌずつと２のＴｒｉｓ−３−３；容液４００
μｆｆずつを混合し、３７°Ｃで１時間インキュベーシ
ョンした。

４．３の生成物をＴｒｉｓ−３−３Ｌｍｌで２５００ｒ
ｐｍ　Ｘ　３ｍ１ｎの遠心を用いて３回洗浄し、Ｔｒｉ
ｓ−３−３各８００μｉずつ添加し、４００μρずつ２
木に分けた。

５、　ヒトＩｇＧ　　（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
ｓ　Ｉｎｃ、製）をＴｒｉｓ−３−５で０．５０ｕｇ　
／ｍｌ−の濃度に調整し、その４００μＰと４で得られ
た溶液４００μｉを」　２ 混合し、３７°Ｃで１時間インキュベーションした。

６．５の生成物を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）（ベーリンガーマンハイム社製）　ヲ含ムＴ　ｒ　ｉ
　ｓＳ５５−８ｌで２５００ｒｐｍ　Ｘ　３　ｍｉｎの
遠心を用いて、３回洗浄し０．１％ＢＳＡを含むＴｒｉ
ｓ−３−５１ｍｌを添加した。

（２）抗ヒ目ｇｃの検出 １、　ウサギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｃａｐｐｅ１社製）を０
．１％ＢＳ八を含むＴｒｉｓ−３−３で１／２００〜１
／６４００の希釈系列を作り、その２５μｌを■底マイ
クロプレートへ添加した。

２、　次に（１）−５で得られた溶液２５μ尼を添加し
反応させた。

３、下記に示す結果が得られた。

４、　上記の結果より未着色粒子は抗ヒトｒｇＧを検出
することができず、着色粒子は抗ヒト１ｇＧを検出する
ことができた。

実Ｊｌ引乙 〈抗ヒｌｉｇＧの検出〉 （１）ヒトＴｇＧの感作方法 １、　ポリアリルアミド粒子の未着色粒子ｖｃ。

１０４２　（日本ゼオン■製）の１％懸濁液４００μ１
を取す０．０１％アイゼン　ビクトリア　ピュアーブル
ーＢ０１１　　（以下Ａ・■・Ｐ　−Ｂ　−ＢＯＩ＋）
を含む。０．０１％ポリビニルアルコール水溶液２００
μｌを添加し、混合した。

２．１の生成物を０．１５Ｍ　ＮａＣｆｆと０．０１％
ザルコシネー）ＬＮ（日光ケミカル■製）を含む０．０
１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！、ｐＨ７，５（以下Ｔｒｉｓ
−５−Ｓ）　　ｌ　ｍｌで２５００ｒｐｍ　Ｘ　３　ｍ
ｉｎの遠心を用いて３回洗浄し、Ｔｒｉｓ−３−３を４
００ｕｎ添加した。

３、　タンニン酸（半井化学■製）をＴｒｉｓ−５−５
で５０Ｍｇ／ｍＨの濃度に調整し、その４００　μｌと
２のＴｒｉｓ−３−３ｉ液４００μｎを混合し、３７°
Ｃで１時間インキュベーションした。

４．３の生成物をＴｒｉｓ−３−Ｓ　１ｍｌで２５００
ｒｐｍ　Ｘ　３ｍ１ｎの遠心を用いて４回洗浄し、Ｔｒ
ｉｓ−３−５８００μｌを添加し４００　μρずつ２本
に分けた。

５、　ヒｌ１ｇＧ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｊｃａｌｓ　
Ｉｎｃ、）をＴｒｉｓ−３−Ｓで０．１μ／　ｍｌの濃
度に調整し、その４００　μｌと４の４００μ！を混合
し、３７°Ｃで１時間インキュベーションした。

６．５の生成物を０．１％ウシ血清アルブミン（ＵＳＡ
）　（ベーリンガーマンハイム）を含むＴｒｉｓＳ−３
１ｍＱで２５００ｒｐｍ　Ｘ　３　ｍｉｎの遠心を用い
て３回洗浄し、０．１％ＢＳ八を含むＴｒｉｓ−５−３
１ｍｌ。

を添加した。

（２）抗ヒ１〜ｒ、ｔ、ｃの検出 ゴ、　ウサギ抗ヒｌ□　ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅ１社製）を
０．１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−Ｓ−３で１／２００〜
１１５１２００の希釈系列を作り、その２５μｌを■底
マイクロプレートへ添加した。

２、　次に（＋）−６で得られた溶液２５μｌを添加し
反応させた。

３、　下記に示す結果が得られた。

」　６ ４、　上記の結果より、着色した粒子はタンニン酸５０
１１μｌｍｌ処理、ヒトＩｇＧ　１　ｐｇ　／ｍｌの感
作濃度で抗ヒトＩｇＧ　１／２５６００まで検出するこ
とができた。

実１貫ユ ＜ｌｌＢｓ抗体検出〉 （１）ｌｌＢｓ抗原の感作方法 １、　実施例１の（１）と同様の操作で１（Ｂｓ抗原（
Ｒ（ＩＣｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｙ）　（生化学工業）を
感作した。なおｌｌＢｓ抗原は、Ｔｒｉｓ−５−３で２
．５１１μｌｍｌの濃度に調整した。

（２）ＨＢ　ｓ抗体の検出 １、　実施例１の（２）と同様の操作でＨＢｓ抗体を検
出した。なお■Ｂｓモノクロナール抗体を使用し、０．
１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−３−３で１／１０００〜１
／２５６０００の希釈系列を作成した。

２、下記に示す結果が得られた。

３、上記の結果よりＨＢｓ抗体１／１２８０００希釈ま
で検出することができた。

失施炎土 〈抗ヒトＩｇＧの検出〉 （１）ヒトＩｇＧＯ感作方法 １、　ポリアクリルアミド粒子の未着色粒子ｖｃ０１０
３８（日本ゼオン■製）の１％懸濁液１００μｌを取り
エチレングリコール２００　μｌと下記の各種濃度のダ
イレクト　コツパー　ブルー２８（Ｄ　・Ｃ−Ｂ−２Ｂ
）（三井東圧化学■製）と０．ＩＮ　）ＩＣ／２５０μ
ｆｆｉを混合し、５０’Ｃテ３０分間インキユヘーショ
ンした。

２．１の生成物を０．０１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）
　２０を含む０．ＯＩＭ　ＩＪン酸緩衝生理食塩水ｐＨ
７，２（以下ＰＢＳ−Ｔ）で２０００ｒｐｍ　Ｘ　３　
ｍｉｎの遠心を用いて３回洗浄を行った。

３．２の生成物を精製水１　ｍｆｌで２０００ｒｐｍ　
Ｘ　３　ｍｉｎの遠心を用いて、３回洗浄し、０．０１
％トウイーン２０を含むＰＢＳｌｍｆｉを添加し室温に
１時間放置した。

４．３の生成物をＰＢＳｌｍｆｆｉで２０００ｒｐｍ　
Ｘ　３　ｍｉｎの遠心を用いて、３回洗浄し、ＰＢＳ　
５００μ！添加した。

５、　タンニン酸（半井化学■製）をＰＢＳで２μｇ／
　ｍｌの濃度に調整し、その２５０　μ！と、４の溶液
２５０　μ℃を混合し、３７°Ｃで３０分間インキユヘ
ーションした。

６．５の生成物をＰＢＳｌｍＲで２０００ｒｐｍ　Ｘ　
３ｍ１ｎの遠心を用いて３回洗浄し、ＰＢＳ　２５０μ
尼を添加した。

７、　ヒトｒｇＧ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ　
Ｉｎｃ、）をＰＢＳで２０μｇ、／ｍＱの濃度に調整し
、その２５０　μｉと６の２５０μｌを混合し、３７°
Ｃで１時間インキュベーションした。

８．７の生成物を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳｌｍＲで
２０００ｒｐｍ　Ｘ　３　ｍｉｎの遠心を用いて２回洗
浄し、０．１％ＢＡＳを含むＰＢＳ　２００　μ℃を添
加した。

（２）抗ヒトＩｇＧの検出 １、　ウザギ抗ヒｌ１ｇＧ　（Ｃａｐｐｅ１社製）を０
，１％ＢＳＡを含むＰＢＡで１／１００希釈したものと
、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳのそれぞれ２５μ！を、
■底マイクロプレートへ添加した。

２、　　（１）−８の溶液２５μ℃を添加し反応させた
。

３、　下記に示す結果が得られた。

４、　上記の結果よりダイレクト　コツパー　ブルー２
Ｂの濃度が変化しても抗ヒトＴｇＧを検出することがで
きた。

（発明の効果） 本発明においては、色素の結合した非タンパク質性の親
水性ポリマーにタンニン酸あるいはタンニン酸を含む化
合物を介して特異結合性タンパク質を固定させた構成と
したことにより、この特異結合性タンパク質の固定化さ
れた親水性粒子を免疫学的粒子凝集反応に用いた場合凝
集像が適切にでき、被測定対象を正確に検出することが
できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、色素が結合した非タンパク質性の親水性ポリマーか
   らなる担体粒子にタンニン酸あるいはタンニン酸を含む
   化合物を介して特異結合性タンパク質が固定化されて成
   ることを特徴とする特異結合性タンパク質の固定化され
   たポリマー粒子。