JPH01127958A - カルバモイルオニウム化合物を用いてポリマー粒子に化合物を結合させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリマー粒子に結合している化合物を有する
ポリマー粒子の製造方法に関する。具体的には、カルバ
モイルオニウム化合物を用いてポリマー粒子に反応性ア
ミン含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物
を結合させることによるかかる物質の製造に関する。こ
の得られる物質は、診断過程で使用することができる。

〔従来の技術〕

ポリマー粒子のような不溶性担体物質に結合されている
生理活性ポリペプチドまたはタンパクは、多様な方面で
使用されてきている。例えば、人間および動物における
病理学上のまたは他の状態の診断は、人間または動物の
体液中の免疫反応性種、例えば抗体または抗原の検出の
ために免疫学上の原理を用いてしばしば実施されている
。一般に外果物質として知られている抗原、例えば医薬
、ハプテン、毒素、レクチン、ポリペプチドまたはタン
パクは、それらを体内に導入した場合、抗体として知ら
れている一定の可溶性タンパクの産生を惹起する。

他のタンパクおよびアミン含有化合物、例えば酵素、ビ
オチンまたは多＃Ｎ類が、アフィニティー・クロマトグ
ラフィー、酵素反応、特異的パインディング反応および
イムノアッセイにおける使用のために種々の担体物質に
共有結合されている。有用な担体物質の中には、ヒツジ
およびヒトの赤面法、細菌の細胞、ラテンクス粒子、樹
脂の粒子ならびに微細なジアゾ化アミノセルロースがあ
る。

例えば、乳化剤の不存在下でわずかに水溶性の七ツマ−
（例えば、エポキシ基含有モノマー）から製造される担
体粒子は、当該技術分野で既知である。他の化合物、例
えばジアミン、ジヒドラジン、メルカプトアルキルアミ
ンおよびジメルカプタンは、医薬、酵素または他の反応
性種をその後に結合するための結合部分として担体物質
に結合されている。

また、カルボキシル化ラテックス粒子が、例えば米国特
許第４，１８１，６３６号明細書に記載されるように、
診断試薬を調製するために使用されている。

そこに記載されているところでは、表面カルボキシル基
を有する粒子に免疫反応性種を共有結合させるための手
段として、水溶性カルボジイミドの使用を含む。

〔発明が解決しようとする課題〕

有用な試薬が提供されているとはいえ、前述の既知の手
段は、免疫反応性種の露出した反応性基ならびに担体表
面のカルボキシル基を活性化することに向けられている
。その結果、免疫反応性種の分子内および分子間の架橋
または重合が生じ、従って、前記種の主要部分は受容体
分子との複合体化を害される。反応性種、例えば抗体は
一般に非常に高価であるので、この問題は重大な経済的
損失を意味する。また、担体粒子にタンパクを結合する
ためのカルボジイミドの使用は、一定のタンパクレベル
では記載されるほど効率的でないことが明らかにされた
。

そこで、カルボキシル化したポリマー粒子に反応性アミ
ン含有化合物を効率よく、そして結合する化合物に悪影
響を及ぼすことなく結合するための迅速な方法を手にす
ることが望まれるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、 Ａ、　　（１）ポリマー粒子表面にカルボキシル基を有
しており、かつ少なくとも１つはペンダントカルボキシ
ル基を含む１以上のエチレン系不飽和重合性子ツマ−か
ら調製されるポリマー粒子の水性懸濁液と、（２）カル
バモイルオニウム化合物を接触させて、ペンダント中間
体反応性基を有する反応性中間体ポリマー粒子を製造す
る工程、ならびに Ｂ、工程Ａで製造される反応性中間体ポリマー粒子と、
この粒子の中間体反応性基と反応する反応性アミン基ま
たはスルフヒドリル基をそれぞれ有する反応性アミン含
有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を接触
させて、前記粒子と前記反応性化合物との共有結合を形
成する工程を、含んでなるポリマー粒子に反応性アミン
含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を結
合させる方法により解決される。

〔実施態様〕

本発明の方法に従って製造される物質は、多様な化学的
および生物学的過程で使用することができる。例えば、
アフィニティー・クロマトグラフィー、酵素により促進
される反応、水の精製、被分析物が結合したポリペプチ
ドまたはタンパクに対して特異的なパインディング親和
性を有する免疫反応性種である場合のイムノアッセイ、
および当業者に既知の他の方法に使用することができる
。

ある場合には、本発明を、使用してさらに生物学上興味
深い化合物、例えば医薬、ホルモン、酵素、抗体もしく
は他のタンパクまたは多糖類と反応し得る中間体的な結
合性部分を結合することができる。

本発明により製造される物質の用途の１つは、被分析物
または検出される物質が、免疫学上の相対物（またはレ
セプター）として入手できるか、または提供され得る生
理学上の流体、ヒトまたは動物の細胞または組織抽出物
中に見い出される免疫反応・性種である場合のＨＡ集ア
ッセイにおける凝集性免疫化学試薬にある。該試薬を使
用して検出することができる代表的な免疫反応性種は、
限定されるものでないが、微生物（バクテリア、プロト
シア、カビ、ウィルスおよびリケッチア）、臓器特異性
抗原を含む組織抗原、ホルモン、酵素、血液細胞抗原も
しくは血液中に見い出される他の物質、血漿タンパク、
乳タンパク、唾液タンパク、尿タンパク、病理学上のタ
ンパク、自己抗体を含む抗体および医薬を包含する。か
かる態様では、本発明の方法において使用される反応性
アミン含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合
物は、興味の対象である被分析物のレセプター、例えば
抗原または抗体であるような免疫学上の化合物である。

他の態様では、本明細書に記載される物質は、前記粒子
に結合されている酵素を有することができる。この態様
で結合され得る酵素は、酵素活性を損なうことなく粒子
上の活性ペンダント基と本発明に従って反応し得る反応
性アミン基または反応性スルフヒドリル基を有するもの
を包含する。

さらに他の態様では、本発明により製造される物質は、
溶液形式かまたは乾燥形式（すなわち、乾式分析要素）
のいずれかの競合的パインディングアッセイにおいて、
あるいはイムノメトリックアッセイ、例えば「サンドイ
ンチ」アッセイとして当業者に知られている方法に使用
することができる。

本発明の方法は、カルバモイルオニウム化合物を用いて
、反応性カルボキシル基を有するポリマー粒子に、反応
性アミン基または反応性スルフヒドリル基をそれぞれ有
する反応性アミン含有化合物または反応性スルフヒドリ
ル含有化合物を結合させることを含む２段階工程である
。

一般に、本発明の方法に有用なポリマー粒子は、粒子サ
イズが０．０１〜５１Ｍ５好ましくは０．１〜３１Ｍの
水不溶性ラテックス粒子である。それらは、全体が同一
のポリマーから構成されることを意味する均一ポリマー
粒子であるか、またはｌ以ｔのポリマーから構成される
、例えば米国特許第３，７００，６０９号明細書に記載
されるようなグラフト・コポリマーおよび例えば米国特
許第４，４０１，７６５号明！ｌＩ書に記載されるよう
なコアー・シェル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ）ポリマーで
あることができる。なお、ポリマー粒子は、反応性アミ
ン含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物の
結合に利用し得る表面カルボキシル基を有することが必
須である。このような基は、ポリマー中にかかる基を含
むモノマー（例えば、アクリル酸、メタクリル酸および
イタコン酸等）を取り込ませるか、またはカルボキシル
基に転化し得る他の反応性基を有するポリマーのさらな
る化学反応（例えば、マレイン酸無水物のような無水物
の加水分解もしくは表面メチロールもしくは末端アルデ
ヒド基の酸化）により該粒子に付加することができる。

ポリマー粒子は、乳化重合法（回分式、半連続式および
連続式を含む）、懸濁重合法、グラフト共重合法、なら
びに高分子化学の技術分野における当業者に既知の他の
方法を含む、いずれかの適当な重合法を用いて製造する
ことができる。乳化重合を使用すれば、例えば米国特許
第４．４１５，７００号明細書（前記）およびＲｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎ　１５９６３（１９７７年７月）に記載されているよ
うに界面活性剤または乳化剤の使用をすることなく、一
般に小さな粒子を提供することができるのでそれが好ま
しい。前記のＲｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｐ
ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに記載されているような連続乳化
重合が最も好ましい方法である。

有用なカルボキシル化粒子は、カルボキシル化スチレン
およびその誘導体（カルボキシル化スチレン−ブタジェ
ンのコポリマー）、アクリル酸ポリマーおよびメタクリ
ル酸ポリマーならびに他の物質から製造され、その多く
は商業的に入手可能である。

好ましくは、ポリマー粒子は、次の構造式−＋−Ａ−ｈ
「−−Ｈ−Ｂ→ゴ「８ （上式中、Ａは、カルボン酸基またはその基の塩もしく
は前駆体を含有する１以上のエチレン系不飽和重合性モ
ノマーに由来する反復単位を表し、そしてＢは、１以上
のエチレン系不飽和重合性モノマーに由来する反復単位
を表す）で示されるポリマーから成る。

Ａを誘導することができるモノマーは、限定されるもの
でないが、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、ア
コニット酸、フマル酸、マレイン酸、アクリル酸β−カ
ルボキシエチル、メタクリル酸β−カルボキシエチル、
ニーおよび■−カルボキシメチルスチレン、メタクリル
アミドヘキサン酸ならびにＮ−（２−カルボキシ−１，
１−ジメチルエチル）アクリルアミドあるいはそれらの
塩または無水前駆体を包含する。本発明の実施において
は、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アコニッ
ト酸、フマル酸、マレイン酸、アクリル酸β−カルボキ
シエチル、メタクリル酸β−カルボキシエチルあるいは
それらの塩または無水前駆体が好ましい。Ｂを誘導する
ことができるモノマーは、限定されるものでないが、ス
チレンおよびスチレン誘導体（例えば、ビニルトルエン
、４−ｔ−７”チルスチレン、ジビニルベンゼンおよび
２−クロロメチルスチレン）、アクリル酸およびメタク
リル酸エステル（例えば、アクリル酸メチル、メタクリ
ル酸エチル、アクリル酸酸寒−ブチル、メタクリル酸２
−エチルヘキシル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸
２−ヒドロキシエチル、メタクリルアミド、ジメタクリ
ル酸エチレンおよびアクリル酸２−ヒドロキシエチル）
、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸
ナトリウム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン
酸ナトリウム、■＝スチレンスルホン酸塩、またはアク
リロニトリルを包含する。好ましくは、Ｂは、スチレン
またはスチレンＨＡ　’に体あるいはアクリル酸または
メタクリル酸エステルに由来するものである。

ＡおよびＢモノマーとも、使用される特定のモノマーお
よびそれらの割合は、粒子に水不溶性を゛　付与するよ
うに選ぶことが重要である。前記に示した構造において
、Ｘは０．１〜７０、そして好ましくは１〜２０のモル
パーセントである。

ポリマー粒子を構成する代表的なポリマーは、コポリ（
スチレン−塩化ビニルベンジル−アクリル酸）（モル比
、８５：１０：５）、コポリ　（スチレン−アクリル酸
）（モル比、９９：ｌ）、コポリ　（スチレン−メタク
リル酸）（モル比、９０：１０）、コホＩＪ（スチレン
−アクリル酸−ニーおよびｌ−ジビニルベンゼン）（モ
ル比、８９：１０：１）、コポリ　（スチレン−アクリ
ル酸２−カルボキシエチル）（モル比、９０　：　１０
）およびコポリ　（メタクリル酸メチル−アクリル酸）
（モル比、７０　：　３０）を包含する。

ある態様では、前記粒子は、コアー（ｃｏｒｅ）が第１
のポリマーから成り、シェル（ｓｈｅｌｌ）が第２のポ
リマーから成るコアー・シェル粒子である。

第２のポリマーは、反応性カルボキシル基か、またはポ
リペプチドもしくはタンパクの結合に先立ってカルボキ
シル基に転化することができる基を有していなければな
らない。コアー・シェルポリマー粒子の代表例は、以下
の例２に示される。

本発明の実施においては、ポリマー粒子に反応性アミン
含有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を共
有結合するためにカルバモイルオニウム塩が使用される
。これらの塩は、米国特許第４．４２１．８４７号明細
書にいくつか記載されており、一般には、次式（１） の構造で示される。

なお、式（１）において、Ｚは、融合炭素環式環を有す
る複素環を含む置換されているかもしくは置換されてい
ない５−もしくは６−員の複素環式芳香族環（例えば、
ピリジニウム、イミダゾリウム、チアゾリウム、イソキ
サゾリウムまたはキノリニウム環）を完成するために必
要な原子を表す。好ましくは、Ｚは、置換されている６
員の複素環式芳香環を完成するのに必要な原子を表す。

さらに、ｍおよびｎは、独立してＯまたはｌであり、 Ｒ１およびＲ２は、相互に独立して、置換されているか
または置換されていないアルキル（一般に、１〜６の炭
素原子、例えばメチル、エチル、イソプロピルまたはク
ロロメチル）あるいは置換されているかまたは置換され
ていないアリール（一般に、６〜１０の炭素原子、例え
ばフェニル、■−メチルフヱニル、ニークロロフェニル
またはナフチル）、あるいは置換されているかまたは置
換されていないアラルキル（一般に、７〜１２の炭素原
子、例えば了り−ル基において同様に置換されていても
よいベンジルまたはフェネチル）である。

他方、Ｒ’およびＲ２は一諸になって、ピペリジン環、
ピペラジンまたはモルホリン環を完成するのに必要な原
子を表し、そしてこれらの環は、それぞれ１以上の炭素
原子を有する１以上のアルキル基またはハロゲン原子に
より置換されていてもよい。

Ｒ３は、水素原子、前記Ｒ１について定義したような置
換されているかまたは置換されていないアルキルである
か、あるいは式 （式中、Ａは、ホモポリマーまたはコポリマーの分子量
が１０００以上であるような１以上のエチレン系不飽和
重合性化合物から形成されるホモポリマーまたはコポリ
マーの重合ビニル主鎖を表す）で示される基である。有
用なエチレン系不飽和重合性化合物は、高分子化学の技
術分野の当業者に既知である。ポリマー（Ａ）は、式（
１）により示される化合物に由来する追加の部分を含ん
でいてもよい。

Ｒ４は、水素原子、置換されているがまたは置換されて
いないアルキル（Ｒ’について前記に定義されるような
）であるか、あるいはＺがピリジニウム環を完成するの
に必要な原子を表し、がっｎがＯである場合には、Ｒ４
は、次の（ａ）〜（ｅ）の基から選ばれる。

（ａ　）　−ＮＩ？”−ＣＯ−Ｒ’　（基中、Ｒ６は、
水素または置換されているかもしくは置換されていない
アルキル（一般に、１〜４の炭素原子、例えばメチル、
エチル、ｎ−ブチル、クロロメチル）であり、Ｒ７は、
水素、置換されているかもしくは置換されていないアル
キル（Ｒｈについて前記に定義されるような）であるか
、あるいは＝ＮＲ１１Ｒ９（基中、Ｒ８およびＲ９は、
相互に独立して水素または置換されているかもしくは置
換されていない、Ｒ６について前記に定義されるような
アルキル基である〕、（ｂ）−（Ｃ１ｌ□）ｑ−ＮＲ”
Ｒ”　Ｃ基中、ＲＩＯは、−Ｃｏ−Ｒ１２であり、Ｒ目
は、水素または置換されているかもしくは置換されてい
ないアルキル（Ｒ６について前記に定義されるような）
であり、Ｒ＋ｚは水素、置換されているかもしくは置換
されていないアルキル（Ｒ”について前記に定義される
ような）または−ＮＲＩＩＲＩ４（基中、Ｒ１３は、Ｒ
ｈについて前記に定義されるような置換されているかも
しくは置換されていないアルキルまたはＲ１についてｉ
ｉｉ記に定義されるような置換されているかもしくは置
換されていないアリールであり、ＲＩ４は水素、Ｒ６に
ついて前記に定義されるような置換されているか置換さ
れていないアルキルまたはＲ１について定義されるよう
な置換されているがもしくは置換されていないアリール
であり、そしてｑは１〜３である〕、 （ｃ　）−（ＣＨｚ）ｒ−ＣＯＮＲ”Ｒｌｂ（基中、Ｒ
ＩＳは、水素、置換されているかもしくは置換されてい
ないアルキル（Ｒ’について前記に定義されるような）
または置換されているかもしくは置換されていないアリ
ール（Ｒ’について前記に定義されるような）であり、
Ｒ１１ｋは、水素または置換されているかもしくは置換
されていないアルキル（Ｒ６について前記に定義される
ような）であり、あるいはＲＩＳとＲ１６は一緒になっ
て、５−または６員の脂肪族環を完成するのに必要な原
子を表し、そしてｒはθ〜３である〕、 （ｄ）　　→ＣＨｆｈ−ＣＨ−Ｒ” 〔基中、Ｒ１７は、水素、置換されているかもしくは置
換されていないアルキル（Ｒ６について前記に定義され
るような）であり、Ｙは、オキシまたは−ＮＲＩ９−で
あり、ＲＩＩ＋は水素、置換されているかもしくは置換
されていないアルキル（Ｒ６について前記に定義される
ような）　、−ＣＯ−Ｒ”または−Ｃｏ−ＮＨＲ”　（
基中、Ｒ１９、Ｒ２（１およびＲ”は、相互に独立して
水素またはＲ６について前記に定義されるような置換さ
れているかもしくは置換されていないアルキルである）
であり、そしてｔは２または３である〕、ならびに （ｅ）−Ｒ”ＸＩｅ　（基中、ＲＺＩは、１〜６の炭素
原子の置換されているかもしくは置換されていないアル
キレン（例えば、メチレン、トリエチレンまたはイソプ
ロピレン）であり、そしてｘｌθは、共有結合性の陰イ
オン性の基、例えばピリジニウム核と分子内塩を形成す
るようなスルホネートまたはカルボキシレートである〕
。

Ｒ５は、置換されているかもしくは置換されていないア
ルキル（Ｒ６について前記に定義されるような）、置換
されているかもしくは置換されていないアラルキル（Ｒ
’について前記に定義されるような）であり、Ｒ５が結
合している窒素原子が二重結合を介して環の残りの部分
と結合している場合には、ｍはＯであることを示す。

Ｘは、陰イオン、例えばハライド、テトラフルオロボー
レート、ニトレート、スルフェート、且−トルエンスル
フェート、ベルクロレート、メトスルフェートまたはヒ
ドロキシトイオンであり、そして■は、０または１であ
り、Ｒａ　カーＲ２１ＸＩｅである場合にはＶは０だけ
を示す。

本発明の実施に際して使用されるカルバモイルオニウム
化合物は、好ましくは、前記式（１）のＲ１およびＲ２
が一緒になってモルホリン環を完成するのに必要な原子
を表し、Ｚがピリジニウム環を完成するのに必要な原子
を表し、Ｒ４が−Ｒ”　’　Ｘ　’　ｅ　　（例エバ、
−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）　テアリ、ソシてｍ、ｎおよ
びＶがそれぞれＯを表すものである。

代表的なカルバモイルオニウム化合物は、１−（４−モ
ルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチル）−ピ
リジニウムヒドロキシド、分子内塩、および１−（４−
モルホリノカルボニル）ピリジニウムクロリドを包含す
る。

最も好ましくは、■−（４−モルホリノカルボニル）−
４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロキシド、
分子内塩である。

すべての反応性アミン含有化合物または反応性スルフヒ
ドリル含有化合物は、ポリマー粒子上のカルボキシル基
とカルバモイルオニウム化合物の反応によって形成され
る中間体と反応し得る、反応性アミン基または反応性ス
ルフヒドリル基をそれぞれ含む化合物である限り、本発
明に従うポリマー粒子に結合することができる。かかる
化合物は、限定されるものでないが、モノアミン、モノ
ヒドラジド、ジアミン、ジヒドラジド、酵素、ビオチン
もしくはそれらの誘導体、アビジンもしくはそれらの誘
導体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク、
多糖類、および当業者に明白であるはずの他の化合物を
包含する。特定の態様によれば、反応性アミン含有化合
物または反応性スルフヒドリル含有化合物は、生理活性
を有するポリペプチドまたはタンパクである。「生理活
性」とは、生理学上の流体中に見い出される可能性があ
る他の成分との相互作用に対するその能力をいう。かか
る相互作用は、物質が酵素である場合には、触媒活性で
あることができる。さらに、相互作用は、相互に親和性
を有する物質、例えばビオチンとアビジンまたは抗原と
抗体等との間で生じる複合体形成性であることができる
。他の！環様では、反応性アミン含有化合物または反応
性スルフヒドリル含有化合物は、ポリマー粒子に第２の
化合物を結合するための結合性部分であり得る、ジアミ
ン、多糖類、アミノ酸、ペプチドまたはタンパクである
。第２の化合物は、限定されるものでないが、酵素、抗
体、抗原、医薬、ビオチンまたはそれらの誘導体および
当業者に極めて明白な他のものを包含する。

好ましくは、免疫反応性種である反応性アミン含有化合
物または反応性スルフヒドリル化合物は、限定されるも
のでないが、前記に列挙した生物学上の化合物および化
学化合物を包含する。より好ましくは、それは、抗体、
例えば医薬、ホルモン、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　Ａ抗原、クラミジア（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｉａ）抗原、ゴノコッカ（Ｇｏｎｏｃｏｃｃａ）
抗原、ヒトの繊毛性性腺刺激ホルモン、ヒトの黄体形成
ホルモンまたはヘルペスウィルスに対して向けられる抗
体である。他方、免疫反応性種は、＋１ＴＬＶ−Ｉまた
はＩＩＩｖ−■の抗原のような抗原であることができる
。

一定の態様では、本発明の方法により製造される物質は
、それらに取り込まれているトレーサーを有することが
できる。トレーサーは、試薬の検出を可能にする検出可
能な種である。有用なトレーサーとしては、放射性同位
体、発色化合物、蛍光化合物、酵素、化学発光化合物、
燐光化合物および当業者に既知の他の物質が挙げられる
。トレーサーは、いずれかの適当な方法で試薬に取り込
ませることができる。例えば、トレーサーは、生理活性
ポリペプチドまたはタンパクに、例えば共有結合的にか
、またはイオン結合的に取り込ませることができる。他
方、好ましくは、トレーサーはポリマー粒子に、例えば
外面かまたはその容積の一部分かもしくは全体に分布す
る内部か、あるいは両方に結合（共有結合的にかまたは
吸収的に）されて、ポリマー粒子に取り込まれる。

ある態様では、トレーサーは、ポリマー粒子の全体かま
たはその表面のいずれかに、発色成分としてかまたはカ
ラーカプラー成分としてポリマー粒子中に分布される。

発色成分は、ポリマー粒子が構成されるポリマーの主鎖
に結合される。カラーカプラー成分は、発色現像化合物
（ｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ
）と酸化的にカップリングして、染料を提供することが
できる。これらの成分もまた、ポリマー主鎖に結合され
、そしてモノマーに結合されている該成分を有するエチ
レン系不飽和重合性モノマーの反応により付与される。

かかる七ツマ−の例は、ヨーロッパ特許出願公開第２２
７．１７３号公報に記載されている。特に有用なモノマ
ーは、次式 ％式％ （上式中、Ｒは水素、ハロゲンまたは低級アルキルであ
り、そしてＣＯ口Ｐは、カラーカプラー成分であり、そ
の多くは当該技術分野で既知である）で示される。２つ
の代表的モノマーとしては、Ｈ ■ が挙げられる。

かかるモノマーから製造されるポリマーは、コポリ　〔
スチレン−アクリル酸ブチル−Ｎ−（３。

５−ジクロロ−４−エチル−２−ヒドロキシフェニル）
アクリルアミド−メタクリル酸〕（重に比、５０　：　
２０　：　２０　：　１０）　、コポリ　〔アクリル酸
ブチル−Ｎ−（３，５−ジクロロ−４−エチル−２−ヒ
ドロキシフェニル）アクリルアミド−クロロメチルスチ
レン−メタクリル酸〕　（重量比、２０　：　２０　：
　４０：２０）およびコポリ　（アクリル酸ブチル−Ｎ
−〔１−（２，４，６−ドリクロロフヱニル）−１，２
゜４−トリアゾリン−５−オン−２−イルコアクリルア
ミド−クロロメチルスチレン−メタクリル酸）（重量比
、２０　：　２０　：　４０　：　２０）を包含する。

本発明の方法は、２工程で実施され、その第１工程は、
前記のカルバモイルオニウム化合物と前記のポリマー粒
子の水性懸濁液を接触させてカルボキシル基の代わりに
中間体反応性基を有する反応性中間体ポリマー粒子を製
造することを包含する。この工程は、所望のｐＨを与え
るために適当な酸または緩衝剤を用いて適当なｐＨで実
施される。

一般に、ｐＨは６未満であるが、反応が進行する限り臨
界的でない。より好ましくは、ｐＨは３．５と６の間で
ある。ポリマー粒子表面のカルボキシル基に対するカル
バモイルオニウム化合物のモル比は、１：１００〜１０
：１であり、好ましくは１：ＬＯ：２：１である。

本発明の方法の第２工程では、第１工程で形成された反
応性中間体が、該反応性中間体の中間体反応性基と反応
し得る、それぞれ反応性アミン基または反応性スルフヒ
ドリル基を有する反応性アミン含有化合物または反応性
スルフヒドリル含有化合物と接触される。これにより、
・ポリマー粒子と反応性化合物とが共有結合を形成する
。ポリマー粒子に対する反応性化合物の重量比は、一般
に１　：　１０００〜１：ｌであり、好ましくは１：１
００〜１：１０である。この第２工程は、早期の凝集を
伴うことなく所期の反応が生じるように、適当なｐＨに
て実施することができる。ｐＨ値は、含まれる反応体お
よび反応媒体中のそれらの濃度に応じて多様であること
ができる。殆どのタンパクおよびポリペプチドに対して
は、このｐＨは６より大きいであろう。

本発明の方法は、一般に１０〜６０℃、好ましくは１５
〜３０℃の温度で実施される。２つの工程の方法のため
の温度は同一であるか、または相違するものであっても
よい。

本発明の方法に関するさらに詳細な事項は、次の代表例
から当業者にとって容易に明瞭となるであろう。

蒸留水４５．７１　ｇ中、カルバモイルオニウム化合物
１−（４−モルホリノカルボニル”）　−４−（２−ス
ルホエチル）ピリジニウムヒドロキシド（分子内塩）　
５．２９　ｇ　（０，００９３２モル）の溶液を、５０
ｍ１のコポリ　（スチレン−塩化ビニルベンジル−アク
リル酸）（モル比、８５：１０：５）粒子（平均サイズ
、約０．６６ρ）の４％懸濁液（ｐＨ３，６）に添加し
た。

得られた混合物は、約ｐｔ＋ｓ、ｏであった。

ポリマー１００■（乾燥重量）を含有する前記活性化ラ
テックスの一部を、室温（約２２℃）下で１時間インキ
ュベーションし、そして同量の第２試料を３時間インキ
ュベーションした。それぞれを、標識化（トリチウム化
）ウシγ−グロブリン（’ＩＩ　ＢＧＧ）　　５■で処
理し、次いで５０ｍ／の遠心管中で０．１モルのリン酸
カリウム（ｐＨ７，０＞を用いて、最終容量を３０ｍ１
にした。反応物を、４５“の角度に固定されている回転
盤に設置すると同時に、３０〜３５ｒｐｍの回転数で回
転させながら室温下に５時間維持した。

対照混合物（対照１）は、カルバモイルオニウム化合物
による活性化を行わなかったことを除き、コポリ（スチ
レン−塩化ビニルベンジル−アクリル酸）（モル比、８
５：１０：５）粒子の同量のバッチを前記と全く同様に
インキュベージシンすることにより調製し、非特異的パ
インディング（吸着）について試験した。該ポリマーの
活性クロロメチル基とタンパクにおけるアミン基の選択
的な反応を介するポリマー粒子へのウシＴ−グロブリン
タンパクの共有結合は、低温ではたとえあるとしても少
ないことが事前の実験かられかっていた。この後者の反
応は、効率を高めるためには加熱および反応時間を延ば
すことが必要である。

第２の対照混合物（対照２）は、カルバモイルオキソニ
ウム化合物で活性化していないラテックス１００■（乾
燥型Ｎ）を３７℃で２４時間前記のような回転数で回転
しなから０１１モルのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８
，５）　　３０ｒｄ中でトリチウム化したウシγ−グロ
ブリン５ｍｇと一緒に処理することにより調製した。

前述したインキュベーション時間の終わりに、過剰のウ
シ血清アルブミン（１００■、２０■／ｍｌ適当な緩衝
液中）を添加して反応を停止した。該アルブミンを添加
した後さらに試料を４〜１８時間インキュベーションし
た。

ポリマー粒子へ結合したタンパクの総量は、（ａ）反応
混合物の既知小量１−中の総ｃｐｍ（１分当たりのカウ
ント）を測定し、（ｂ）反応混合物の試料１ｍｌを遠心
した後の上澄に残存するｃｐｍを測定し、次いで（Ｃ）
（ｂ）で得られたベレットの繰り返し洗浄後のラテック
ス試薬のｃｐｍを測定することにより定量した。ポリマ
ー粒子に共有結合したタンパク画分は、界面活性剤１％
のドデシル硫酸ナトリウムの存在下、３７℃で２４時間
回転させながらインキュベーションした後に測定した。

結合タンパクのｔ＝ｉの測定に対する前記と同じ方法を
用いて共有結合したタンパク量を定量した。結果を次の
第１表および第■表に示す。

第１表 第■表 この試験は、周囲反応条件下で、対照１および２の他の
反応様式に比し、短い反応時間で、かつより優れたパイ
ンディング効率でカルボキシル化粒子にウシγ−グロブ
リンを共有結合することができることを示す。

例２：ｊｌの３．′Ｔおよび ２種のモノクローナル抗テオフィリン抗体を、例１で使
用したカルバモイルオニウム化合物で活性化したカルボ
キシル化ポリマー粒子および官ｔａ基クロロメチルスチ
レンを含有する粒子の双方と反応させた。使用した抗体
は、（１）　ＫａｌｌｅｓｔｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ、（Ｃａｔａｌｏｇ　Ｉｌ＆Ｌ０４６．Ｌ
ｏｔ　ｋＷＯ７２９＋Ｆｉ１１１１＆１ＷＯ８５４，ｃ
ｌｏｎｅ　ｎｕｍｂｅｒ　９−４９−７Ａ＋４８）によ
り販売されているテオフィリンに対するモノクローナル
抗体、および（２）テオフィリン−ウシ血清アルブミン
で免疫した雌のＢａ１ｂ／Ｃマウスに由来する牌リンパ
球と骨髄腫細胞５Ｐ２１０−Ａｇ１４の融合により調製
されるテオフィリンに対して特異的なモノクローナル抗
体であり、そしてこのものは、室温におけるリン酸緩衝
溶液中で約５　Ｘ１０７Ｍ−’のＫａを有するカッパイ
ソタイプ、γ２ｂである。ポリマー粒子に結合する抗体
の量は、３Ｈウシγ−グロプリンを抗テオフィリン抗体
で置換するパラレルな試験により測定した。粒子に結合
した活性な抗体の量は、次に記載する酵素標識パインデ
ィング試験において比較した。

ポリマー５００■（乾燥重量）および脱イオン水１０ｍ
Ｚに溶解したカルバモイルオニウム化合物２５０■を含
有するラテックスを５０−の蒸留水にｐＨ５で懸濁させ
ることにより、カルボキシル化ラテックス・コポリ　（
スチレン−アクリル酸）（モル比、９９：１）粒子を、
カルバモイルオニウム化合物で活性化した。ラテックス
を室温で３０分間攪拌し、次いで遠心した。上澄を廃棄
し、そしてラテックスを約１０ｍ１の蒸留水に再懸濁し
た。・得られた試薬の分別した試料（乾燥重量で１００
■のポリマー）を、緩衝液（０，０５モル濃度のリン酸
カリ、ｐＨ７，０）　　３０−中の前記２つのタイプの
抗体の１の試料３．１６ｍｇとそれぞれ混合した。反応
物を、約２４時間室温下で回転させながらインキュベー
ションした。反応を、ウシ血清アルブミン（１００ｍｇ
、２０ｎｗ／ｍ／）の添加により停止し、次いで約４時
間インキュベーションを続けた。反応物を遠心し、上澄
を廃棄し、そして非イオン界面活性剤ＴＲＩＴＯＮＸ−
１００（ローム・アンド−ハース社（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ
　ｌ１ａａｓ。

Ｃｏ）により販売されているオクチルフェノキシ・ポリ
エトキシ・エタノール〕の１％を含有するリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７，４）　　３０ｍｌにラテックスを再懸濁し
た。インキュベーションを３７℃で約１８時間継続した
。その後、ラテックスを遠心し、上澄を廃棄し、そして
得られたベレットをリン酸緩衝溶液で２度洗浄した後、
その溶液で再懸濁した。

クロロメチルスチレン誘導ラテックス〔コポリ（スチレ
ン−ジビニルベンゼン）（モル比、９９．２　：０．８
）のコアーおよびコポリ　（塩化ビニルベンジル−ジビ
ニルベンゼン）（モル比、９Ｂ、８　：　１．２　）を
有するコアー・シェル・コポリマー］の２つの試料を、
ｐｌ＋８．５における０、１モル濃度のホウ酸ナトリウ
ム緩衝液３０−中の前記抗体の１方の試料３．１６■と
インキュベーションした。始めのインキュベーションを
室温よりむしろ３７℃で実施する以外は、カルボキシル
化ラテックスに対する前記したものと同様に反応物を処
理した。

各ラテックス調製物に結合した抗体の看は、平行して実
施した試料が有するコポリ　（スチレンージビニルベン
ゼン）のコアーおよびコポリ　（塩化ビニルベンジル−
ジビニルベンゼン）のシェルを有するコアー・シェル粒
子、ならびに前記に示したのとまったく同様に処理し、
そして同じ量のコポリ　（スチレン−アクリル酸）の粒
子に結合した：ＩＨウシγ−グロブリンについてのカウ
ント数をアッセイすることにより定量した。各調製物に
おける活性な抗体の相対量は、ラテックスの連続的な希
釈物（結合した抗体の質量に基づく理論的なテオフィリ
ンのパインディング部位の３．１６　Ｘ　１０−　”モ
ル濃度〜ｌＸｌ０−”モル濃度）を、固定した濃度のテ
オフィリン−グルコースオキシダーゼ標識（５ｘｌ□−
＋ｏモル濃度）と混合するアッセイにより定量した。遠
心後溶液に残存するテオフィリン−グルコースオキシダ
ーゼ標識の量を測定し、そして該酵素標識の５０％を結
合するのに要求されるテオフィリンパインディング部位
の濃度を決定した。結果を以下にまとめた。

−のパインディング１ ゴ７−・シェル・コボリマーラテフクス　　５８．３％
　　　　　　　　１８．４この試験は、本発明による周
囲反応条件を用いるカルボキシル化粒子に、高い温度で
活性ハロゲン基を介して粒子に結合することができるも
のとほぼ同等に抗体が結合し得ることを示す。さらに活
性ハロゲン基を介してポリマー粒子に抗体が直接結合す
る他のプロトコールにより示されるものと同様な抗体活
性の保存度を有しており、活性化カルボキシル化粒子に
抗体が結合し得ることを示す。いくつかの事前の試験で
は、本明細書に記載した方法により活性ハロゲン粒子に
結合される抗体の質量の５０％以上が滴定したテオフィ
リンに対して残存することを示した。従って、同じこと
が活性化カルボキシル粒子に結合する抗体について観察
されるであろうと予測される。

例３：カルボジイミド吐人との　六 この例は、既知のカルボジイミドの化学的性質を用いて
粒子にタンパクを結合させる方法と本発明の方法を比較
し、そしてまたフエノバルビタールのアッセイにおいて
得られる試薬の使用を比較する。

フエノハルビタールに対するモノクロ−プル抗体は、フ
ェノパルビタールーヒト血清アルブミンの抱合体を用い
るＢａ１ｂ／Ｃマウスの免疫によりイーストマン・コダ
ソク社（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｃｋ　Ｃｏ）で調製
された。免疫マウスの牌を骨髄腫（ＳＰ２／　Ｏ−Ａｇ
１４）細胞と融合させてハイブリドーマを生成した。こ
の調製方法は、既知の方法を用いた。

かくして調製した抗体を、外表面上のペンダントカルボ
キシル基を有するポリマー粒子に共有結合させた。この
粒子は、コポリ　（スチレン−メタクリル酸）（モル比
、９０　：　１０）から成っている。粒子へ結合した抗
体の質量は、抗フエノパルビタール抗体に代えトリチウ
ム化したウシＴ−グロブリンを用いるパラレルな試験で
定量した。粒子に結合した活性タンパク量を、前記例２
に記載したような酵素標識パインディング試験で比較し
た。

前記のポリマー粒子のＩの試料（乾燥重量３０■）は、
０．１モル濃度の２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホ
ン酸緩衝液（ｐＨ６）　　１０ｍＺ中の１−（４−モル
ホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチル）ピリジ
ニウムヒドロキシド（分子内塩）（１６喀、１．５　ｍ
ｍｏｌｅ　／　ｇ粒子）と１０分間混合し、次いで抗フ
ェノバルビクール抗体（０，３ｍｇ）を添加した。該ポ
リマーラテックスの第２の試料は、同じ分子内塩と混合
し、次いで抗フェノハルビタール抗体１．５曙を添加し
た。

同一のラテックスの第３の試料は、１−シクロへキシル
−３−（２−モルホリノエチル）カルホジイミド−メト
ー且−トルエンスルホネート（１９，１ｍ１ｒ、ｌ、　
５　ｍｍｏｊ２　ｅ　／　ｇ粒子）と１０分間混合し、
次いで抗フェノバルビタール抗体０．３■を添加した。

該ラテンクス粒子の第４の試料は、前記カルボジイミド
と混合し、次いで抗体１．５■を添加した。

これらの試料を、第■表および第■表において対照１お
よび対照２と称した。

結合反応は、室温下で回転させながら２４時間それらの
混合物をインキュベーションすることにより実施した。

反応は、ウシ血清アルブミン（３０ｎｗ、３０■／−）
を添加することにより停止し、その後４時間さらにイン
キュベーションを続けた。反応混合物を遠心し、上澄を
廃棄し、そしてベレットをリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４
）で１度洗浄し、次いでその溶液で再懸濁した。

各ラテンクス調製物に結合した抗体の質量は、例１に記
載したように、パラレルに実施した試料が有している粒
子に結合したトリチウム化つシγ−グロブリンについて
の放射性のカウント数をアッセイすることにより定量し
た。共有結合量／総量の割合は、例１に記載したように
界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウムでインキュベーショ
ンした後に計算した。質量パインディング試験の結果を
、以下の第ｍ表および第■表にまとめた。

各調製物における活性抗体の相対量は、例２に記載した
ものと同様な酵素標識パインディング試験で定量した。

この例は、抗フェノバルビタール抗体が非常に高い効率
でカルバモイルオニウム化合物を使用しているポリマー
粒子に共有結合し得ることを示している。またさらに、
その抗体は、有用な免疫学上の試薬の成形品に結合でき
ることを示す。抗体／ポリマー粒子の比率が低いところ
では、標識化抗原の５０％を結合するために、対照の試
薬に対するよりも４部低い濃度の本発明の固定化抗体試
薬が必要であった（０．３■のタンパクが添加された場
合、対照の８６　ｎｍｏＡの理論的なフエノバルビクー
ルパインディング部位が、本発明の１９　ｎｍｏｌに対
応する）。このことは、先行技術のカルボジイミドの化
学的作用よりも本発明の方法についての抗体活性の残率
が４倍以上であることを示唆する。

第■表 （質量パインディング試験） 第■表 （ラテンクスー酵素標識滴定） この例は、カルバモイルオニウム化合物を用いるカルボ
キシル化ポリマー粒子へのジアミンの結合により本発明
の実施について説明するものである。本発明のこの特徴
の重要性は、アミン含有モノマーの既知の重合方法を用
いて外表面に反応性アミン成分を有する粒子を製造する
ことが困難であるとの事実にある。

脱イオン化蒸留水（１００ｍｆ）に懸濁したコポリ（ス
チレン−アクリル酸）（モル比、９０：１０）（７）１
部（乾燥重量３ｇ）を、脱イオン化蒸留水に溶解した１
−（４−モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエ
チル）ピリジニウムヒドロキシド（分子内塩）を合わせ
、脱イオン化蒸留水で容量を３００−にした。反応混合
物を室温で３０分間攪拌し、その後１０℃、６０００ｒ
ｐｍにて３０分間遠心した。上澄を廃棄し、粒子を脱イ
オン化蒸留水９０ｒｎｌに再懸濁した。このようにして
活性化したポリマー粒子を含有するラテックスを３つの
部分に分け、そして各部を以下に記載する３種のジアミ
ンの１の過剰と反応させた。

反応人工　　ジアミンＡ１ヘキサンジアミン（５６７■
）を０．１モルのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）３
０ｍｌに溶解し、ｐＨ８に調節した。この溶液を活性化
ラテックス３０ｍ／に添加し、ホウ酸塩緩衝液で容量を
１００ｍ１にした。

Ｕ立上　ジアミンＢ、Ｌ−リジン・ｌ　ＨＣＺ（５４８
■）を、反応Ａに記載したように溶解しそして反応させ
た。

反応Ｃ：　ジアミンＣ，Ｌ−リシル−し一リジン・２Ｈ
Ｃ１（２６０■）を、また、反応Ａに記載したように溶
解しそして反応させた。

前記の３種の反応を、室温および回転させながら４時間
続けた。各反応混合物を透析袋に入れ、そして脱イオン
化蒸留水に対して約２４時間透析した。次に、これらを
６０００ｒｐｍで３０分間遠心し、そして上澄を廃棄し
た。その後、各反応生成物を脱イオン化蒸留水１００ｍ
１に再懸濁し、次いで遠心および再懸濁工程を２度以上
繰り返した。得られた反応生成物は、それぞれラテック
ス粒子に共有結合したジアミンを含んでいた。

前記で製造した各反応生成物を、次の方法で酸化したア
ルデヒド基を有するＩｇＧタンパクと反応させた。

まず最初に、ＩｇＧを塩化ナトリウム（０，１５モル濃
度）を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（０，０１モル
濃度、ｐＨ６）中に透析した。用いたＩｇＧは、トリチ
ウム化つシγ−グロブリン（３１ＢＧＧ）であった。そ
のタンパクの炭水化物を、室温にて１時間、最終濃度と
して３０ＩＩＩｍｏｌのＮａ１０４を用いて酸化した。

最終濃度として１００　ｍｍｏβのグリセロールを添加
して反応を停止し、次いでその反応物を商業的に入手し
得るファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＰＤ−１０脱
塩カラムを介して製造者の使用説明書に従って通過させ
ることにより過剰の試薬を除去した。

前記した３種の反応生成物のそれぞれの１部すウム緩衝
液（ρ）１６）を用いて９ｍＺの最終容Ｖにした。得ら
れた反応物を、回転させながら室温下に５時間維持した
。各反応物にＮａＢＨ３ＣＮ　（１００ｍｍｏ６　）溶
液１ｍＺを添加し、さらに室温下で１６時間回転を続け
た。

対照物質（対照１）は、ジアミン成分を含有するラテッ
クを原料のカルボキシル化ラテックスの１部で置換する
ことにより同様に製造した。追加の対照（２〜４）は、
それぞれのジアミンラテックスとの反応における酸化し
たタンパクを酸化していないトリチウム化つシγ−グロ
ブリンで置換することにより同様に製造した。また、対
照５では、原料カルボキシル化ラテックスに酸化してい
ないトリチウム化つシγ−グロブリンを付加した。

記載した反応の終了時に、過剰のウシ血清アルブミン（
３０■、３０ｒｒｇ／ｍｌ、緩衝液中）を添加してそれ
ぞれの反応を停止した。これらの試料は、タンパク停止
剤を添加した後、さらに４時間インキュベーションした
。

ラーテソクスに結合した抗体のＩ＋＝　ｎは、前記例２
に記載した方法により定量した。粒子に共有結合してい
る３ＩＩ　ＢＧＧの両分は、前記例２に記載したように
１％のドデシル硫酸ナトリウムの存在下でインキュベー
ションした後測定した。結果を次の第Ｖ表に示す。

第Ｖ表 ジアミンＡ−Ｃに関するこれらの結果は、本発明に従う
カルバモイルオニウム化合物による活性化後、ポリマー
粒子のカルボキシル基とジアミンが反応することを示す
。その後、粒子上の得られたアミン成分は、トリチル化
したＴｇＧの酸化したアルデヒド基と反応した。データ
により示されるように、粒子上のアミン成分に十分パイ
ンディングするためには、タンパク上にアルデヒド基が
存在していなければならない。それらの基が酸化されて
いない場合（対照２〜５）には、粒子にほんの少画分の
タンパクが共有結合しただけである。

さらに、有意な共有結合のためには粒子上に十分なアミ
ン成分が存在していなければならない。小さな共有結合
がカルボキシル化粒子単独についても見られる（対照１
）。

コポリ　〔スチレン−アクリル酸）゛チルシーＮ−（３
，５−ジクロロ−４−エチル−２−ヒドロキシフェニル
）アクリルアミド−メタクリル酸〕（重量比、５０　：
　２０　：　２０　：　１０）のポリマー粒子は、次の
方法で製造された。

攪拌器、冷却器および窒素供給口を装備したフラスコに
、窒素でパージした薄留水を添加し、そのフラスコを６
０℃に加熱した湯浴中に設置した。

スチレン（５０ｇ）、アクリルＭ　ｎ−ブチル（２０ｇ
）およびＮ−（３，５−ジクロロ−４−エチル−２−ヒ
ドロキシフェニル）アクリルアミド（２０ｇ）ならびに
アセトン（２００ｍＺ）を混合し、フラスコに添加した
。ＫｚＳｚＯｅ　（２ｇ　）およびに、Ｓ、Ｏ５（１ｇ
）の組み合わせ開始剤を、フラスコに添加し、１５分間
反応を続けた。次に、メタクリル酸（２０ｇ）を添加し
、１８時間反応を続けてポリマー粒子のラテックスを得
た。゛ ポリマー粒子のカラーカプラー成分を発色させるために
、１０％のｇｚｓｚｏｅ溶液２００　ｆｆ１７と共に次
の組成〔トリエタノールアミン（ｌｌｍｆ）、ベンジル
アルコール（１４，２ｍＮ）　、塩化リチウム（２，１
ｇ）、臭化カリウム（０，６ｇ）、硫酸ヒドロキシア起
ン（３，２ｇ＞、亜硫酸カリウム−（４５％の溶液、２
．８ｎｔ／）、１−ヒドロキシエチレン−１，１−ジ−
リン酸（６０％、０．８ｍ７）、４−アミノ−３−メチ
ル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチ
ル）アニリン硫酸ヒトレート　（４，３５ｇ　）、炭酸
カリウム（無水物、２８ｇ）、スチルベン蛍光増白剤（
０，６ｇ）、界面活性剤（１ｍＺ）および水で１１にし
た（ｐＨ１０，８）　）の発色現像剤を添加した。得ら
れた着色粒子を連続透析浴中で蒸留水に対して２４時間
透析し、次いで８０℃にてロータリー・エバポレーター
を用い残存モノマーを除去した。

５０ｍ１のポリエチレン製遠心管における０、　１モル
の２−（４−モルホリン）エタンスルホン酸（ｐＨ６）
　３０　ｍ／中の前記着色粒子１００ｍｇに、カルバモ
イルオニウム化合物１−（４−モルホリノカルボニル）
−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロキシド
（分子内塩）（０，１５ｍｍｏＥ　）を添加した。この
懸濁液を、４５°の角度で回転盤に固定しながら３０〜
３５ｒｐｍにて１０分間回転させた。

反応混合物にトリチウム化つシＴ−グロブリン（Ｉｍｇ
）を添加し、さらに２４時間回転を続けた。

反応を、過剰のウシ血清アルブミン（１００■、５０ｍ
ｇ／　ｍｌ緩衝液中）の添加により停止し、そして試料
をさらに２４時間インキュベーションした。

粒子に結合した抗体の総量は、反応物の試料ｌｌｌ１１
の遠心後の上澄に残存する放射性同位体に由来する１分
当たりのカウントを測定することにより定ｖし、そして
１分当たりの総理論カウントからこの量を差し引いて各
反応物にインプットした。

粒子に９３％のタンパクが結合したことが測定された（
ポリマーの１ｇ当たり９．３　ｍｇのタンパクが結合し
た）。

〔発明の効果〕

本発明は、反応性アミン含有化合物または反応性スルフ
ヒドリル化合物、例えば生理活性ポリペプチドまたはタ
ンパクを迅速に結合するための方法を提供し、それによ
って、イムノアッセイ、診断試験、アフィニティー・ク
ロマトクラフィー、酵素反応および他の生物学的または
化学的過程のために有用な物質を形成する。結合は、結
合される反応性化合物に悪影響を及ぼすことなく達成さ
れる。すなわち、該粒子のペンダントカルボキシル基と
の共存結合の形成に関係する反応性アミノ基または反応
性スルフヒドリル基の架橋または失活は極微である。

これらの利点は、特殊な結合剤の使用によって達成され
る。これらの薬剤は、かつて当該目的に使用されたこと
のないカルバモイルオニウム化合物である。初めのうち
は、かかる化合物も従来使用されているカルボジイミド
のように、反応性化合物の反応性アミン基または反応性
スルフヒドリル基を無差別に失活するであろうと予測さ
れた。

意外にも、本発明者等は事実はそうでないことを見い出
し、このことによって本明細書に開示される非常に有用
でかつ非常に効率的な結合方法を発明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、（１）ポリマー粒子表面にカルボキシル基を有
   しており、かつ少なくとも１つはペンダントカルボキシ
   ル基を含む１以上のエチレン系不飽和重合性モノマーか
   ら調製されるポリマー粒子の水性懸濁液と、 （２）カルバモイルオニウム化合物を接触させてペンダ
   ント中間体反応性基を有する反応性中間体ポリマー粒子
   を製造する工程、ならびに Ｂ、工程Ａで製造される反応性中間体ポリマー粒子と、
   この粒子の中間体反応性基と反応する反応性アミン基ま
   たはスルフヒドリル基をそれぞれ有する反応性アミン含
   有化合物または反応性スルフヒドリル含有化合物を接触
   させて、前記粒子と前記反応性化合物との共有結合を形
   成する工程、を含んでなるペンダントカルボキシル基を
   介してポリマー粒子に反応性アミン含有化合物または反
   応性スルフヒドリル含有化合物を結合させる方法。