JPS5935599B2 - コリンエステラ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血清中のコリンエステラーゼ（以下、Ｃｈ−Ｅ
と記す）活性測定のための方法に関する。

更に詳しくは、本発明は基質としてｐ−ヒドロキシベン
ゾイルコリンを用い、Ｃｈ＝Ｅの酵素作用によつて生成
するｐ−ヒドロキシ安息香酸を補酵素ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドフォスフェート還元型（以下、Ｎ
ＡＤＰＨと記す）の存在下でｐ−ヒドロキシ安息香酸水
酸化酵素の作用によりＮＡＤＰＨがＮＡＤＰ（酸化型）
に変化する際の吸光度の減少又は溶存酸素量の消費を測
定する方法である。血清中のＣｈ−Ｅ活性測定は臨床的
には肝疾患特に慢性の肝実質障害や肝硬変で高率にその
活、性が低下することから重要な意味をもつ。

従来、Ｃｈ−Ｅ活性測定のための方法はガス分析法、ｐ
Ｈメーター法、比色法、爪′法、螢光法、電極法など数
多くある。〔柴田久雄：ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）７（１）：３５（１９７９）〕セヶφで、ｐＨ
メーター法と比色法は日常の臨床検査として広く普及し
ている。前者はＣｈ−Ｅにより生成した酢酸をｐＨ指示
薬であるフェノールレッド、ブロムチモールブルーなど
を用いて測定する方法〔高橋・柴田、医学と生物学、２
０：９６（１９５１）〕であるが、検量線が極度に曲が
り操作が繁雑でそのうえ正確性にも問題がある。後者に
は、［ｙｒＮＢ法〔Ｇａｒｒｙ、Ｐ、Ｊ、、Ｃｌｉｎ。
Ｃｈｅｍ）１１（２）：９１（１９６５）〕と酵素法〔
五味邦英、臨床病理特集第２９号：１４５（１９７７）
及び特開昭５４−１３６８９５号〕とがある。ＤＴＮＢ
法はアセチルチオコリン、ブチリルチオコリン及びプロ
ピオニルチオコリンなどを基質として用い、生成したチ
オコリンに５・ ５’−ジチオビスー２−ニトロ安息香
酸（ＤＴＮＢ）を加え黄色に発色せしめ、標準物質とし
てＳＨ化合物である還元型グルタチオンを用いる方法で
あるが、この方法はビリルビンや還元物質の影響はまぬ
がれないし、試薬の安全性も問題になる。また、酵素法
はベンゾイルコリンやオルソトルオイルコリンなどを基
質として用い、生成したコリンをコリンオキシダーゼに
よりベタインに変化させ、その時生成する過酸化水素を
ベルオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリンと
フェノールなどとの酸化的縮合反応で発色する方法であ
る。この方法はコリンをオキシダーゼによつて過酸化水
素一発色系へ導びくため血清中に共存するリン脂質の分
解などで生じるコリンの干渉を受けたり、ビリルビンや
アスコルビン酸などの還元物質による影響が問題になる
と同時に自動分析装置に適した方法とは言い難い。本発
明の目的は、かかる欠点を有する従来のＣｈ−Ｅ活性測
定法の問題点を克服せんとするものである。

即ち、本発明は基質としてｐ−ヒドロキシベンゾイルコ
リンを用い、Ｃｈ−Ｅ゛・の酵素作用によつて生成する
ｐ−ヒドロキシ安息香酸を補酵素ＮＡＤＰＨの存在下で
ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の作用に、よりＮＡ
ＤＰＨがＮＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を測定す
る方法によつて上記問題点を解決することにより、迅速
でかつ操作が簡単で自動分析装置に適した反応速度測定
法を提供することにある。本発明による測定法の反応機
構を式で示せば次のとおりである。

上記、反応式（１）で生成したｐ−ヒドロキシ安息香酸
は、補酵素ＮＡＤＰＨの存在下でｐ−ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素の作用により反応式（２）の如く３・４−
ジヒドロキシ安息香酸に変化する。

この際のＮＡＤＰＨがＮＡＤＰに酸化される時の吸光度
の減少を波長３４０ｎｍで測定することでＣｈＥ活性値
が求められる。本発明は３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰＨ
の吸光度の減少の変化を反応のスタート時より連続的に
測定するか、又は一定時間後に測定するか、又は反応阻
害剤により一定時間後に人為的にストツプさせて測定す
ることによつて行うことができる。

反応をストツプさせる場合には、ネオスチグミン、工セ
リン及び有機リン系のＣｈ−Ｅ活性を阻害させる公知の
ものを使用する。更に、ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素の使用をうけて消費する際の溶存酸素量の消費速度
を酸素電極を用いて測定することでＣｈ−Ｅ活性測定が
できるし、可能ならば螢光光度討を用いてＮＡＤＰＨの
螢光の減少を測定することも期待できる。本発明は従来
法と比較すれば、呈色反応系を使用しないため過酸化水
素一発色系における欠点、即ちビリルピンやアスコルビ
ン酸などの還元物質による影響やリン脂質の分離で生じ
るコリンの干渉を除くことができると同時に多量検体処
理が可能な自動分析装置に適した簡単でかつ迅速なＣｈ
−Ｅ活性の測定ができる。

本発明で使用するｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は
、シユードモナス（ＰＳｅＵｄＯｍＯｌｌａＳ）属に属
する細菌、例えばシユードモナス・ダキユーネ（Ｐｓ．
ｄａｃｕｎｈａｅ）、シユードモナス・デスモリチカ（
Ｐｓ．ｄｅｓｍＯｌｙｔｉｃａ）、シユードモナス・フ
ルオレツセンス（Ｐｓ．ｆｌｕＯｒｅｃｅｎｓ）、シユ
ードモナス・プチダ（Ｐｓ．ｐｌｔｉｄａ）、などから
生産されるものである。

〔ＫｅｉｊｉＹａｎＯ，．ＫｅｉＡｒｉｍａ、Ａｇｒ．
ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．、３３（５）：６８９（１９６９
）〕ｐ＝ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素はフラビン（Ｆ
ＡＤ）関与の酵素であるので本発明の測定法においてフ
ラビンを適当量存在させた方がより有利な酵素活性を示
す。

また、本発明で使用する基質のｐ−ヒドロキシベンゾイ
ルコリンは冷暗所保存で２週間以上良好な安定性をもつ
ものである。

尚、この基質の製法については特願昭５５−９３８９６
号に詳１．く述べている。本発明における基質のＣｈ−
Ｅ反応の至適ＰＨは７．５〜 ９．５の間で可能である
が、特にＰＨ８．２が望しい。

ＰＨを保つための緩衝剤としてはハロゲンイオンを含ま
ない緩衝剤であれば良い。例えば、トリスヒドロキシメ
チルアミノメタン、グリシルグリシン、ホウ酸塩、ピロ
リン酸、バルビタール酸塩、Ｎ −Ｎ−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）グリシン、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメ
チル）メチルグリシンなどが用いられる。また、本発明
方法で用いられる試薬及び酵素については、Ｃｈ−Ｅ活
性測定の結果に影響を及ぼすことなく広範囲の濃度で使
用することができるので、ひとつの試薬の設定条件を厳
密に、かつ狭い範囲で行う必要はない。

以下に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれによつ
てなんら限定されるものでない。

実施例 １ （ハ 試薬 １ 組成（最終濃度）． ２ 調製法 トリスヒドロキシメチルアミノメタン ６．０６ｙを水約８００ゴに溶解しマレイン酸溶液でＰ
Ｈ８．２とする。

これにｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード３５１
７ｎｆ７、ＦＡＤ−２ナトリウム２．５〜、ＮＡＤＰＨ
− ４ナトリウム２７２ｍ９、ｐ−ヒドロキシ安息香酸
水酸化酵素２２０Ｕを溶解した後全量を１０００ｍ１と
する。（２）測定操作法 測定液３ｍ１を取り３７℃になるまで予備加温（３分間
位）し、これに血清５０μｌを加える。

直ちに３７℃で３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定
する。Ｃｈ−Ｅ活性値は下記の式により討算される。〔
式〕 実施例 ２ （１）試薬 １ 組成（最終濃度） ２ 調製法 トリスヒドロキシメチルアミノメタン ６．０６Ｖを水約８００ｍ１に溶解しマレイン酸溶液を
加えＰＨ８．２とする。

これにｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード３５１
〜、ＦＡＤ−２ナトリウム２．５〜、ＮＡＤＰＨ−４ナ
トリウム１．３５ｙ．ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵
素２２０Ｕを溶解した後全量を１０００ゴとする。

１０、 罰１１ピコセ弘，Ｖ台｝卜 測定液を３７℃になるまで加温し、これを酸素センサー
が接しているセル内に導入し血清を２０μｌ添加する。

この時の酸素濃度の消費を酸素センサー（スタツトグル
コースアナライザ一Ｓ−８０：ＡＩＣ社製）により測定
する。（３） Ｃｈ−Ｅ活性値単位換算１ 単位既知の
血清２０μｌを上記測定法と同様に操作し、その測定値
との比で表わす。

＜式＞ ２ 濃度既知のｐ−ヒドロキシ安息香酸２０μｌを反応
させ、反応前後の消費量より換算する。

＜式＞ 実施例 ３ （ｌ）試薬 １ 組成（最終濃度） ２ 調製 （イ） トリスヒドロキシメチルアミノメタン６．０６
Ｖを水約８００“に溶解し、マレイン酸溶液でＰＨ８．
２とする。

これにＦＡＤ−２ナトリウム２．５Ｔ！９、ＮＡＤＰＨ
−４ナトリウム２７２Ｗ９、ｐ−ヒドロキシ安息香酸水
酸化酵素３３０Ｕを溶解した後、全量を１０００ｍ１と
する。

（ロ） トリスヒドロキシメチルアミノメタン６．０６
ｙを水約８００ゴに溶解し、マレイン酸溶液でＰＨ８．
２とする。

これにｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード５２６
．５〜を溶解した後、全量を１０００ゴとする。

←Ｊ ネオスチグミン６ｙを水約１０００“に溶解する
。

（２）測定操作法 １ プランク 、ｚ：ｘ；：＝：：゜−＝：一蕾″ １０分間インキユベーシヨン後に試薬←→を０．１ｍｊ
加えて直ちに３４０ｎｍで吸光度を測定する。

この時の吸光度はＡＢとする。２ 試料 試料血清又は標準血清２０Ｉｔ１に試癩イ）を１．０“
混合し３７℃５分後に試薬仲）０．５“を添加し３７℃
で１０分間インキユベーシヨンした後に試薬を０．１“
添加し直ちに反応を停止させ３４０ｎｍで吸光度を測定
する。

この時の試料の吸光度はＡＩ．標準血清の吸光度はＡｓ
とする。（３） Ｃｈ−Ｅ活性値の求め方 標準血清の単位に相当する吸光度の減少 （ＡＢ−Ａｓ）をグラフにプロツトし検量線を作成する
。

試料血清の吸光度の減少（ＡＢ−ＡＩ）を討算し検量線
から試料血清のＣｈ−Ｅ活性値を求める。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明におけるｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素の必要量を示し、第２図は本発明において血清５０
ｕ１を用いてインキユベーシヨンした時の反応時間とＮ
ＡＤＰＨの関係を示し、第３図は本発明における血清の
希釈率と酵素活性の関係を示し、第４図は本発明とブチ
リルチオコリン法との相関図を示し、第５図は実施例２
において試料として希釈血清を用いた時の酸素濃度の減
少を示し、第６図は実施例２において各希釈血清での酸
素消費速度を１分間当りの電圧変化を記録で示し、第Ｔ
図は実施例３におけるＣｈ−Ｅ活性値と吸光度の減少量
の関係を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 基質と酵素反応により得られる反応生成物をｐ−ヒ
   ドロキシ安息香酸水酸化酵素の存在下で、ＮＡＤＰＨを
   酸化してＮＡＤＰとする際の吸光度の減少又は溶存酸素
   量の消費を測定することを特徴とするコリンエステラー
   ゼ活性の測定方法。