JPH0332741B2 - - Google Patents
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- JPH0332741B2 JPH0332741B2 JP57044297A JP4429782A JPH0332741B2 JP H0332741 B2 JPH0332741 B2 JP H0332741B2 JP 57044297 A JP57044297 A JP 57044297A JP 4429782 A JP4429782 A JP 4429782A JP H0332741 B2 JPH0332741 B2 JP H0332741B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- amylase
- glucose
- immobilized
- god
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アミラーゼ活性測定電極に関するも
のである。
のである。
現在用いられている膵疾患診断法の中に、膵酵
素逸脱現象を検査する方法があり、血清や尿中の
膵酵素の測定が行われている。特に、アミラーゼ
は他の酵素に比べ、活性が安定なこと、生体内に
活性阻害物質や類似酵素がなく測定が簡単なこと
等の利点により、膵疾患の診断や経過観察に非常
に重要である。
素逸脱現象を検査する方法があり、血清や尿中の
膵酵素の測定が行われている。特に、アミラーゼ
は他の酵素に比べ、活性が安定なこと、生体内に
活性阻害物質や類似酵素がなく測定が簡単なこと
等の利点により、膵疾患の診断や経過観察に非常
に重要である。
従来のアミラーゼ活性測定法には、比濁法、ヨ
ウ素滴定法、酵素法などがあげられる。比濁法と
は、アミロースの加水分解後におけるでんぷん水
溶液の濁り度と生じたα−アミラーゼの濃度を関
連づけるものである。ヨウ素滴定法は、青色にな
つたでんぷん−ヨウ素溶液がα−アミラーゼによ
つて加水分解され青色が薄くなることを利用して
いる。しかし、この方法は色の変化とα−アミラ
ーゼとの間に直接関係がないので信頼度が低い。
ウ素滴定法、酵素法などがあげられる。比濁法と
は、アミロースの加水分解後におけるでんぷん水
溶液の濁り度と生じたα−アミラーゼの濃度を関
連づけるものである。ヨウ素滴定法は、青色にな
つたでんぷん−ヨウ素溶液がα−アミラーゼによ
つて加水分解され青色が薄くなることを利用して
いる。しかし、この方法は色の変化とα−アミラ
ーゼとの間に直接関係がないので信頼度が低い。
酵素法は、でんぷんをα−アミラーゼにより加
水分解し、その生成物をグルコースに分解する酵
素と共存させ生成したグルコースを測定すること
により、α−アミラーゼ活性を測定しようという
試みがあり、酵素の基質特異性をうまく利用して
いる。しかし、このアプローチは、最終的にα−
アミラーゼが関与し生成したグルコースを測定す
るため、あらかじめ試料中に存在するグルコース
（内因性グルコース）の影響が問題となる。又、
酵素が高価なため、測定コストが高くつく。
水分解し、その生成物をグルコースに分解する酵
素と共存させ生成したグルコースを測定すること
により、α−アミラーゼ活性を測定しようという
試みがあり、酵素の基質特異性をうまく利用して
いる。しかし、このアプローチは、最終的にα−
アミラーゼが関与し生成したグルコースを測定す
るため、あらかじめ試料中に存在するグルコース
（内因性グルコース）の影響が問題となる。又、
酵素が高価なため、測定コストが高くつく。
従つて、本発明の目的は、簡単に内因性グルコ
ースを除去し、迅速かつくり返しα−アミラーゼ
活性を測定できる電極を提供することである。
ースを除去し、迅速かつくり返しα−アミラーゼ
活性を測定できる電極を提供することである。
本発明の特徴は、アミラーゼとその基質により
生成した反応物をグルコースに分解する酵素と、
グルコースオキシダーゼ（以下GODで表す）と
を固定化してなるH2O2検出用の第１の電極と、
第１の電極によるH2O2の検出を妨害する物質を
電解除去するための第２の電極からなることであ
る。第２の電極が、GODを固定化し白金層を有
する多孔質膜のため、内因性グルコースがGOD
によりグルコン酸となり発生したH2O2も白金層
で酸化され除去できる。又GODも、アミラーゼ
とその基質により生成した反応物をグルコースに
分解する酵素（グルコアミラーゼ、あるいはα−
グルコシダーゼ等）も固定化されているため、く
り返し迅速にα−アミラーゼ活性を測定できる。
生成した反応物をグルコースに分解する酵素と、
グルコースオキシダーゼ（以下GODで表す）と
を固定化してなるH2O2検出用の第１の電極と、
第１の電極によるH2O2の検出を妨害する物質を
電解除去するための第２の電極からなることであ
る。第２の電極が、GODを固定化し白金層を有
する多孔質膜のため、内因性グルコースがGOD
によりグルコン酸となり発生したH2O2も白金層
で酸化され除去できる。又GODも、アミラーゼ
とその基質により生成した反応物をグルコースに
分解する酵素（グルコアミラーゼ、あるいはα−
グルコシダーゼ等）も固定化されているため、く
り返し迅速にα−アミラーゼ活性を測定できる。
本発明によるアミラーゼ活性測定電極におい
て、血清を添加した際の反応例を次に示す。α−
アミラーゼの基質としてソジウムスターチグリコ
レートを用い、アミラーゼとその基質により生成
した反応物をグルコースに分解する酵素として、
グルコアミラーゼを用いた。
て、血清を添加した際の反応例を次に示す。α−
アミラーゼの基質としてソジウムスターチグリコ
レートを用い、アミラーゼとその基質により生成
した反応物をグルコースに分解する酵素として、
グルコアミラーゼを用いた。
（内因性）
グルコース＋O2グルコース ―――――――→ オキシダーゼ グルコノラクトン＋H2O2 (1) H2O2→2H+＋2e＋O2 (2) ソジウムスターチグリコレート α−アミラーゼ ――――――――――→ グルコアミラーゼグルコース (3) グルコース＋O2グルコース ―――――――→ オキシダーゼ グルコノラクトン＋H2O2 (4) H2O2→2H+＋2e＋O2 (5) まず、血清中の内因性グルコースが上記(1)式に
示した様に第２の電極の固定化GODによりグル
コノラクトンに変換され、発生したH2O2は(2)式
のごとく第２の電極の白金層で電解除去される。
同様に、測定の妨害物質となるアスコルビン酸や
尿酸も第２の電極の白金層で電解除去される。ソ
ジウムスターチグリコレートは(3)式に示す様に血
清中のα−アミラーゼにより分解され、さらに第
１の電極に固定化されたグルコアミラーゼにより
グルコースにまで分解される。生成したグルコー
スは(4)式のごとく第１の電極の固定化GODによ
り酸化されH2O2が生成し、次にこのH2O2は(5)式
の様に第１の電極の白金層で酸化され、得られた
酸化電流値によりグルコースの濃度を検知し、こ
れによりα−アミラーゼ活性を測定することがで
きる。
グルコース＋O2グルコース ―――――――→ オキシダーゼ グルコノラクトン＋H2O2 (1) H2O2→2H+＋2e＋O2 (2) ソジウムスターチグリコレート α−アミラーゼ ――――――――――→ グルコアミラーゼグルコース (3) グルコース＋O2グルコース ―――――――→ オキシダーゼ グルコノラクトン＋H2O2 (4) H2O2→2H+＋2e＋O2 (5) まず、血清中の内因性グルコースが上記(1)式に
示した様に第２の電極の固定化GODによりグル
コノラクトンに変換され、発生したH2O2は(2)式
のごとく第２の電極の白金層で電解除去される。
同様に、測定の妨害物質となるアスコルビン酸や
尿酸も第２の電極の白金層で電解除去される。ソ
ジウムスターチグリコレートは(3)式に示す様に血
清中のα−アミラーゼにより分解され、さらに第
１の電極に固定化されたグルコアミラーゼにより
グルコースにまで分解される。生成したグルコー
スは(4)式のごとく第１の電極の固定化GODによ
り酸化されH2O2が生成し、次にこのH2O2は(5)式
の様に第１の電極の白金層で酸化され、得られた
酸化電流値によりグルコースの濃度を検知し、こ
れによりα−アミラーゼ活性を測定することがで
きる。
以下に本発明によるアミラーゼ測定電極を実施
例を用いて説明する。
例を用いて説明する。
実施例 １
α−アミラーゼとその基質により生成した反応
物をグルコースに分解する酵素としてグルコアミ
ラーゼを使用した場合の電極の構成を第１図に示
した。電極の担体として、ポリカーボネート多孔
質膜（直径10mm、孔径2000Å、膜厚10μｍ、孔密
度３×108個／cm2）１，２を用い、これらの膜の
片面にスパツタリング法により白金層３，４（厚
さ数百〜数千オングストローム）を形成した。膜
２にはGOD、膜１にはGODとグルコアミラーゼ
を展開し、電極ホルダーに設置した後、グルタル
アルデヒド蒸気中で固定化した。被検液側である
第２の電極９の表面および孔にはGOD７が、第
１の電極８の表面および孔にはGOD５とグルコ
アミラーゼ６が固定化されている。
物をグルコースに分解する酵素としてグルコアミ
ラーゼを使用した場合の電極の構成を第１図に示
した。電極の担体として、ポリカーボネート多孔
質膜（直径10mm、孔径2000Å、膜厚10μｍ、孔密
度３×108個／cm2）１，２を用い、これらの膜の
片面にスパツタリング法により白金層３，４（厚
さ数百〜数千オングストローム）を形成した。膜
２にはGOD、膜１にはGODとグルコアミラーゼ
を展開し、電極ホルダーに設置した後、グルタル
アルデヒド蒸気中で固定化した。被検液側である
第２の電極９の表面および孔にはGOD７が、第
１の電極８の表面および孔にはGOD５とグルコ
アミラーゼ６が固定化されている。
上記の薄膜状の電極を装着した円筒形の電極ホ
ルダーの断面と電極系について第２図に模式図で
示した。図中１０は上記の酵素を固定化した酵素
電極であり、膜１がホルダーの内側になる様に外
とう管１１で本体１２に装着されている。白金層
４は内側の白金リード１３に、白金層３は外側の
白金リード１４にそれぞれ接している。第１の電
極８に対するAg／AgCl参照極１５と対極１６を
電極ホルダー内部に、第２の電極９に対する
Ag／AgCl参照極１７と対極１８は電極ホルダー
の外側に配して電極系を構成している。又、電極
ホルダー内は電解液１９で満たされている。第１
の電極は、参照極１５に対して＋0.6Vに設定し、
以下の測定を行つた。第２の電極においても同様
に電圧を設定し測定した。
ルダーの断面と電極系について第２図に模式図で
示した。図中１０は上記の酵素を固定化した酵素
電極であり、膜１がホルダーの内側になる様に外
とう管１１で本体１２に装着されている。白金層
４は内側の白金リード１３に、白金層３は外側の
白金リード１４にそれぞれ接している。第１の電
極８に対するAg／AgCl参照極１５と対極１６を
電極ホルダー内部に、第２の電極９に対する
Ag／AgCl参照極１７と対極１８は電極ホルダー
の外側に配して電極系を構成している。又、電極
ホルダー内は電解液１９で満たされている。第１
の電極は、参照極１５に対して＋0.6Vに設定し、
以下の測定を行つた。第２の電極においても同様
に電圧を設定し測定した。
上記の電極を、α−アミラーゼの基質としてソ
ジウムスターチグリコレートを充分含んだ緩衝液
中に浸漬し、α−アミラーゼを添加した。第３図
は、横軸にα−アミラーゼの添加量（unit／100
ml）、縦軸に第１の電極の電流増加速度（μA／
分）、を表している。２つの値にはよい相関がみ
られ、アミラーゼ活性測定が充分可能なことが確
かめられた。又、内因性グルコースの影響を調べ
るためにグルコースを添加したところ、酸化電流
値の増加はほとんどみられなかつた。これは第２
の電極によりグルコースが除去されたためと考え
られる。さらに、アスコルビン酸や尿酸を添加し
た場合も、酸化電流値の増加はみられなかつた。
これは第２の電極の電解酸化によつてその影響が
除去されたことによるものと考えられる。
ジウムスターチグリコレートを充分含んだ緩衝液
中に浸漬し、α−アミラーゼを添加した。第３図
は、横軸にα−アミラーゼの添加量（unit／100
ml）、縦軸に第１の電極の電流増加速度（μA／
分）、を表している。２つの値にはよい相関がみ
られ、アミラーゼ活性測定が充分可能なことが確
かめられた。又、内因性グルコースの影響を調べ
るためにグルコースを添加したところ、酸化電流
値の増加はほとんどみられなかつた。これは第２
の電極によりグルコースが除去されたためと考え
られる。さらに、アスコルビン酸や尿酸を添加し
た場合も、酸化電流値の増加はみられなかつた。
これは第２の電極の電解酸化によつてその影響が
除去されたことによるものと考えられる。
次に、上記の本発明によるアミラーゼ測定電極
をＡとし、これと比較するため、以下のＢ、Ｃの
電極を作製した。Ｂは、第２の電極にGODを固
定化せず、その他はＡと同じもの、Ｃは第２の電
極にGODに固定化せず、かつ第１の電極にルコ
アミラーゼを固定化していないもの、いいかえれ
ば、Ａの電極において第１の電極にのみGODが
固定化されているものである。
をＡとし、これと比較するため、以下のＢ、Ｃの
電極を作製した。Ｂは、第２の電極にGODを固
定化せず、その他はＡと同じもの、Ｃは第２の電
極にGODに固定化せず、かつ第１の電極にルコ
アミラーゼを固定化していないもの、いいかえれ
ば、Ａの電極において第１の電極にのみGODが
固定化されているものである。
Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれに血清を添加し、それに対
する酸化電流値（応答電流μA）を測定した。第
４図に、横軸は血清を添加後の時間（sec）、縦軸
は応答電流（μA）を示す。Ａが血清添加後すば
やく直線的に電流が増加しているのに比べ、Ｂと
Ｃは30秒ぐらいまで曲線状に増加後、ＢはＡと平
行に電流が増加し、Ｃは増加がストツプした。Ｃ
はGOD固定化電極のみなので、血清中のグルコ
ース量を測定している。Ｂは第２の電極にGOD
が固定化されていないため、内因性のグルコース
が除去できない。そのため、Ｂでα−アミラーゼ
活性を測定するためには、α−アミラーゼを添加
して30秒ぐらい後電流が直線的に増加し始めてか
ら測定しなくてはならないという不便さがある。
又、内因性グルコースのため誤差も大きくなる。
従つて、本発明の電極Ａの様に、GODを固定化
してなる第２の電極を設置すれば、α−アミラー
ゼの活性をより正確に迅速に測定することができ
る。
する酸化電流値（応答電流μA）を測定した。第
４図に、横軸は血清を添加後の時間（sec）、縦軸
は応答電流（μA）を示す。Ａが血清添加後すば
やく直線的に電流が増加しているのに比べ、Ｂと
Ｃは30秒ぐらいまで曲線状に増加後、ＢはＡと平
行に電流が増加し、Ｃは増加がストツプした。Ｃ
はGOD固定化電極のみなので、血清中のグルコ
ース量を測定している。Ｂは第２の電極にGOD
が固定化されていないため、内因性のグルコース
が除去できない。そのため、Ｂでα−アミラーゼ
活性を測定するためには、α−アミラーゼを添加
して30秒ぐらい後電流が直線的に増加し始めてか
ら測定しなくてはならないという不便さがある。
又、内因性グルコースのため誤差も大きくなる。
従つて、本発明の電極Ａの様に、GODを固定化
してなる第２の電極を設置すれば、α−アミラー
ゼの活性をより正確に迅速に測定することができ
る。
実施例 ２
α−アミラーゼの基質としてマルトペントース
を使用し、α−アミラーゼとマルトペントースに
より生成した反応物をグルコースに分解する酵素
としてα−グルコシダーゼを用い、実施例１と同
様の電極を作製し、α−アミラーゼ添加実験と血
清添加実験を行つた。実施例１と同じくα−アミ
ラーゼの活性を正確かつ迅速に測定できた。
を使用し、α−アミラーゼとマルトペントースに
より生成した反応物をグルコースに分解する酵素
としてα−グルコシダーゼを用い、実施例１と同
様の電極を作製し、α−アミラーゼ添加実験と血
清添加実験を行つた。実施例１と同じくα−アミ
ラーゼの活性を正確かつ迅速に測定できた。
以上２つの実施例をあげたが、その他のアミラ
ーゼ活性測定法（酵素法）においても、基質と固
定化酵素の組み合わせを変えるだけで応用でき
る。
ーゼ活性測定法（酵素法）においても、基質と固
定化酵素の組み合わせを変えるだけで応用でき
る。
アミラーゼ活性測定に関する酵素がすべて固定
化されているため、くり返し測定が可能であり、
電極に多孔質薄膜を使用しているため、応答も迅
速であつた。
化されているため、くり返し測定が可能であり、
電極に多孔質薄膜を使用しているため、応答も迅
速であつた。
以上の様に、本発明のアミラーゼ活性測定電極
は、内因性のグルコースを簡単に除去することが
でき、しかも、アミラーゼ活性を迅速にくり返し
測定することができる。
は、内因性のグルコースを簡単に除去することが
でき、しかも、アミラーゼ活性を迅速にくり返し
測定することができる。
第１図は本発明の一実施例であるアミラーゼ活
性測定電極の拡大断面模式図、第２図はアミラー
ゼ活性測定電極の断面および電極系を示す模式
図、第３図はアミラーゼの添加量と電流増加速度
の関係を示す図、第４図は血清添加後の時間と電
流値の関係を示す図である。 １，２……多孔質膜、３，４……白金層、５，
７……固定化グルコースオキシダーゼ、６……固
定化グルコアミラーゼ、８……第１の電極、９…
…第２の電極、１０……酵素電極、１１……外と
う管、１２……本体、１３，１４……白金リー
ド、１５，１７……Ag／AgCl参照極、１６，１
８……対極、１９……緩衝液。
性測定電極の拡大断面模式図、第２図はアミラー
ゼ活性測定電極の断面および電極系を示す模式
図、第３図はアミラーゼの添加量と電流増加速度
の関係を示す図、第４図は血清添加後の時間と電
流値の関係を示す図である。 １，２……多孔質膜、３，４……白金層、５，
７……固定化グルコースオキシダーゼ、６……固
定化グルコアミラーゼ、８……第１の電極、９…
…第２の電極、１０……酵素電極、１１……外と
う管、１２……本体、１３，１４……白金リー
ド、１５，１７……Ag／AgCl参照極、１６，１
８……対極、１９……緩衝液。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 導電性の層を形成した多孔質膜上に酵素およ
びグルコースオキシダーゼを固定化した第１の電
極と、前記第１の電極に隣接し、導電性の層を形
成した多孔質膜上にグルコースオキシダーゼを固
定化した第２の電極とからなり、前記第１の電極
は、前記酵素がアミラーゼとその基質により生成
した反応物をグルコースに分解することにより、
過酸化水素検出をおこない、前記第２の電極は前
記第１の電極による過酸化水素の検出を妨害する
物質を電解除去することを特徴とするアミラーゼ
活性測定電極。 ２ 導電性の層が白金層である特許請求の範囲第
１項記載のアミラーゼ活性測定電極。 ３ 前記酵素が、グルコアミラーゼ又はａ−グル
コシダーゼである特許請求の範囲第１項または第
２項記載のアミラーゼ活性測定電極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57044297A JPS58160861A (ja) | 1982-03-18 | 1982-03-18 | アミラ−ゼ活性測定電極 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57044297A JPS58160861A (ja) | 1982-03-18 | 1982-03-18 | アミラ−ゼ活性測定電極 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58160861A JPS58160861A (ja) | 1983-09-24 |
| JPH0332741B2 true JPH0332741B2 (ja) | 1991-05-14 |
Family
ID=12687567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57044297A Granted JPS58160861A (ja) | 1982-03-18 | 1982-03-18 | アミラ−ゼ活性測定電極 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58160861A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60114760A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-21 | Hitachi Ltd | マルト−スセンサ |
| CN108548858B (zh) * | 2018-06-22 | 2024-11-15 | 桂林中辉科技发展有限公司 | 一种快速测量淀粉酶的电化学试纸及其制备与检测方法 |
-
1982
- 1982-03-18 JP JP57044297A patent/JPS58160861A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58160861A (ja) | 1983-09-24 |
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