JPH0239894A - デオキシリボヌクレオシドの生産 - Google Patents
デオキシリボヌクレオシドの生産Info
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- JPH0239894A JPH0239894A JP1139002A JP13900289A JPH0239894A JP H0239894 A JPH0239894 A JP H0239894A JP 1139002 A JP1139002 A JP 1139002A JP 13900289 A JP13900289 A JP 13900289A JP H0239894 A JPH0239894 A JP H0239894A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野〕
本発明はデオキシリボヌクレオシドであるチミジンおよ
び／またはその関連塩基であるチミンの生産方法に関す
る。
び／またはその関連塩基であるチミンの生産方法に関す
る。
（従来技術〕
チミジン−リンｉ（ＴＭＰ）はすべての微生物でＤＮＡ
の生産中に形成されるヌクレオシドである。関連ヌクレ
オシドであるチミジンは自己免疫不全症候１［Ａｌｎ５
）の治療に用いる組成物中の活性成分であるアジドチミ
ジン生産の中間体である。チミジンはピリミジンヌクレ
オシドであり。
の生産中に形成されるヌクレオシドである。関連ヌクレ
オシドであるチミジンは自己免疫不全症候１［Ａｌｎ５
）の治療に用いる組成物中の活性成分であるアジドチミ
ジン生産の中間体である。チミジンはピリミジンヌクレ
オシドであり。
現在のところ化学的に展進されているが、バシル王 玉
エヱユ２バＢａｃｉｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）の突
然変異木床を用いてチミジンを含む多種を発酵生産する
ことも、日本国特許公報３９−１６３４５号、１９６４
年８月１１日公開、に示唆されている。
エヱユ２バＢａｃｉｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）の突
然変異木床を用いてチミジンを含む多種を発酵生産する
ことも、日本国特許公報３９−１６３４５号、１９６４
年８月１１日公開、に示唆されている。
使用した突然変異木床および誘導された株は両方共、公
認の寄託機関（ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌａｃｔｉｏｎ
）に寄託されていないらしく、突然変異木床は公報第
３９−１６３４５号に突然変異体２９０１株として同定
されているだけである。現在ではチミジンまたはチミン
の発酵生産法それ自体が無いと考えられる。ピリミジン
ヌクレオシドに加えてプリン類のヌクレオシドが存在す
る。ブレビバクテリウム へルボルム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｌｖｏｌｕｍ）株を用いｆｃ発酵
によるプリン類の関連ヌクレオシド、グアノシン−５′
−一リン酸の生産が米国特許第３２４９５１１号、１９
６６年５月６日公開。
認の寄託機関（ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌａｃｔｉｏｎ
）に寄託されていないらしく、突然変異木床は公報第
３９−１６３４５号に突然変異体２９０１株として同定
されているだけである。現在ではチミジンまたはチミン
の発酵生産法それ自体が無いと考えられる。ピリミジン
ヌクレオシドに加えてプリン類のヌクレオシドが存在す
る。ブレビバクテリウム へルボルム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｌｖｏｌｕｍ）株を用いｆｃ発酵
によるプリン類の関連ヌクレオシド、グアノシン−５′
−一リン酸の生産が米国特許第３２４９５１１号、１９
６６年５月６日公開。
に示唆されている。
（発明が解決しようとする課題〕
本発明に従って、我々はチミジンおよび／またはチミン
の生産方法であり、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｆｕｍ ）属の細菌株を同化可能な炭素源お
よびその他の栄養素含金む培養液中適切な培養条件下で
好気培養してチミジンおよび／またはデミン金生産する
こと、生産されたチミジンおよび／またはチミンを厘接
培地内に蓄積すること、ならびにそうした後に生産かつ
蓄積されたチミジンおよびまたはチミンを培地から分−
匪すること、からなる上記物質の生産方法を提供する。
の生産方法であり、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｆｕｍ ）属の細菌株を同化可能な炭素源お
よびその他の栄養素含金む培養液中適切な培養条件下で
好気培養してチミジンおよび／またはデミン金生産する
こと、生産されたチミジンおよび／またはチミンを厘接
培地内に蓄積すること、ならびにそうした後に生産かつ
蓄積されたチミジンおよびまたはチミンを培地から分−
匪すること、からなる上記物質の生産方法を提供する。
（課題を解決するための手段〕
ブレビバクテリウム（Ｂ１−ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
） 属の適切な株であればどのような株でも本発明の
方法に用いることができるが、チミジンおよび／またが
望ましい。
） 属の適切な株であればどのような株でも本発明の
方法に用いることができるが、チミジンおよび／またが
望ましい。
特に適切な株は本明細書の実施例１に詳細に記載した方
法に従ってブレビバクテリウム へルポ上土ＡＴＣＣ１
９３９０から誘導された４６１株である。ＡＴＣＣ１９
３９０は１発酵にょる２−置換−６−ヒドロキシプリン
のりボタイド生産法につＡて記述している米国特許第３
５８６６０６号に記載されている。４６１株はザ ナシ
ョナル コレクションズ オブ インダストリアル ア
ンド マリーンバクテリア リミティド（ｔｈｅ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ １ｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅ
ｒｉａ Ｌｔｄ ） （ＮＣＩ ＭＢ ）、〔私書箱３
１号、１６５ アベイロード（Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ
）、アバデイ−７（Ａｂｅｒｄｅｅｎ ）、ＡＢ９８Ｄ
Ｇ、スコツトランド、英国〕に１９８８年４月２８日に
寄託されており、その受入番号はＮＣＩＭＢ４００１４
である。
法に従ってブレビバクテリウム へルポ上土ＡＴＣＣ１
９３９０から誘導された４６１株である。ＡＴＣＣ１９
３９０は１発酵にょる２−置換−６−ヒドロキシプリン
のりボタイド生産法につＡて記述している米国特許第３
５８６６０６号に記載されている。４６１株はザ ナシ
ョナル コレクションズ オブ インダストリアル ア
ンド マリーンバクテリア リミティド（ｔｈｅ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ １ｎ
ｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅ
ｒｉａ Ｌｔｄ ） （ＮＣＩ ＭＢ ）、〔私書箱３
１号、１６５ アベイロード（Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ
）、アバデイ−７（Ａｂｅｒｄｅｅｎ ）、ＡＢ９８Ｄ
Ｇ、スコツトランド、英国〕に１９８８年４月２８日に
寄託されており、その受入番号はＮＣＩＭＢ４００１４
である。
これ以上に特に好適な株はブレビバクテリウムへルボル
ムＬ−１７株（ＮＣＩＭＢ４００１４株より誘導〕およ
び２．９７７（ＡＴＣＣ１９３９０株よシ誘導〕であり
、Ｌ−１７は本明細書の実施例６に記載された方法に従
って誘導され、また２、９７７はＬ−１７を誘導するた
めに使用した方法と本質的に同一の方法によって誘導さ
れた。Ｌ−１７お！び２．９７７床１９８９年２ 月２
１ 日−ＮＣＩＭＢｉＣ寄託されてお９、その受入番号
はそれぞれ４０１１７および４０１１６である。
ムＬ−１７株（ＮＣＩＭＢ４００１４株より誘導〕およ
び２．９７７（ＡＴＣＣ１９３９０株よシ誘導〕であり
、Ｌ−１７は本明細書の実施例６に記載された方法に従
って誘導され、また２、９７７はＬ−１７を誘導するた
めに使用した方法と本質的に同一の方法によって誘導さ
れた。Ｌ−１７お！び２．９７７床１９８９年２ 月２
１ 日−ＮＣＩＭＢｉＣ寄託されてお９、その受入番号
はそれぞれ４０１１７および４０１１６である。
また、本発明に従って、我々はブレビバクテリー２訟
ヘルポルムＮＣＩＭＢ４００１４株ならびにその床から
誘導した変異体（ｖａｒｉａｎｔ ）および突烈震異体
（ｍｕｔａｎｔ ） の生物学的純粋培養を提供する
。
ヘルポルムＮＣＩＭＢ４００１４株ならびにその床から
誘導した変異体（ｖａｒｉａｎｔ ）および突烈震異体
（ｍｕｔａｎｔ ） の生物学的純粋培養を提供する
。
プルヒハクテリウム へルボルムＮＣＩＭＢ４０１１７
および４０１１６株ならびにそれらより誘導した変異体
および突然変異体の生物学的純粋培養は、１９８９年６
月２２日出願の英国特許同時係属出願第８９０６６２４
．５号に明確に示した発明の本題である。
および４０１１６株ならびにそれらより誘導した変異体
および突然変異体の生物学的純粋培養は、１９８９年６
月２２日出願の英国特許同時係属出願第８９０６６２４
．５号に明確に示した発明の本題である。
本発明の方法は流加培養法またはバッチ法で行なうと最
も効果的であるが連続培養法も可能である。好適には、
炭素源はグルコースであるが、グルコース以外の糖およ
びアルコールのような別の炭素源を用いることもできる
。好適には、ｐＨは５〜９の範囲であり、時にｐＨ７ま
たはその付近の６〜８の範囲が特に適切である。水酸化
アンモニクムのような塩基全培養液に添加してｐＨ全要
求範囲内に維持する。適切には、温度は２０〜６５℃の
範囲であり、２５′″〜５０℃の温度範囲が望ましい。
も効果的であるが連続培養法も可能である。好適には、
炭素源はグルコースであるが、グルコース以外の糖およ
びアルコールのような別の炭素源を用いることもできる
。好適には、ｐＨは５〜９の範囲であり、時にｐＨ７ま
たはその付近の６〜８の範囲が特に適切である。水酸化
アンモニクムのような塩基全培養液に添加してｐＨ全要
求範囲内に維持する。適切には、温度は２０〜６５℃の
範囲であり、２５′″〜５０℃の温度範囲が望ましい。
本発明の方法にとって特に適切な生産用培地を第１表に
示す。
示す。
第１表
本発明の方法にとって適切なもう１つの生産用培地を第
２表に示す。
２表に示す。
第２表
チミジンおよび／またはチミン全生産かつ蓄積させた後
、それは、培養液の上澄液より任意の適切な手段：例え
ば、イオン交換、液体抽出および疎水クロマトグラフィ
ー；によって分離され、この中ではイオン交換が１まし
い、チミジンおよび／またはチミンにとって適切なイオ
ン交換による分離方法は、これらの溶質をイオン交換樹
脂上に吸潰させて、さらに水およびメタノール金柑いて
チミジ／および／またはチミンを特異的に溶出させる方
法である。
、それは、培養液の上澄液より任意の適切な手段：例え
ば、イオン交換、液体抽出および疎水クロマトグラフィ
ー；によって分離され、この中ではイオン交換が１まし
い、チミジンおよび／またはチミンにとって適切なイオ
ン交換による分離方法は、これらの溶質をイオン交換樹
脂上に吸潰させて、さらに水およびメタノール金柑いて
チミジ／および／またはチミンを特異的に溶出させる方
法である。
生産されたチミジンはアジドチミジンならびに他の医学
的および生化学的薬品の製造に使用されうるＯ 本発明は以下の実施例によって具体的に説明される。
的および生化学的薬品の製造に使用されうるＯ 本発明は以下の実施例によって具体的に説明される。
実施例１ ：４３１株（ＮｃＩＭＢ４００１４）の作製
４６１株はＡＴＣＣ１９３９０よシ三段階の方法を経て
作製した。第一段階ではＡＴＣＣ１９３９０をＵＶライ
トで処理し、さらにその結果得られた培養液にピリミジ
ン類似率の５−フルオロウラシルを加えた。そうした後
、５−フルオロウラシル耐性細胞を選択して１９０株を
作製した。その後。
４６１株はＡＴＣＣ１９３９０よシ三段階の方法を経て
作製した。第一段階ではＡＴＣＣ１９３９０をＵＶライ
トで処理し、さらにその結果得られた培養液にピリミジ
ン類似率の５−フルオロウラシルを加えた。そうした後
、５−フルオロウラシル耐性細胞を選択して１９０株を
作製した。その後。
１９０株を培養し、さらにＵＶライト、次に５−フルオ
ロウラシルで処理し、再び５−フルオロウラシル耐性細
胞を選択して２９５株金作製した。
ロウラシルで処理し、再び５−フルオロウラシル耐性細
胞を選択して２９５株金作製した。
２９５株’ｔＵＶライトで処理し、その後チミジン全単
一炭素源として培養し庚場合に増殖減少を示す細胞を選
択した。この選択により４６１株を作製した。４６１株
はチミジンおよび／またはチミンの著しい生産能力を示
し、この生産物は培養液中に蓄積された。
一炭素源として培養し庚場合に増殖減少を示す細胞を選
択した。この選択により４６１株を作製した。４６１株
はチミジンおよび／またはチミンの著しい生産能力を示
し、この生産物は培養液中に蓄積された。
実施１３’ｌＪ２：４３１株を用いたチミジンの生産第
３表に示す接種用培地を振とぅフラスコに調製し、実施
例１に記載した方法に従って作表した接種した培地はス
ターテを用い１回転速度１５Ｃ１ｒｐｍ−温度２８℃、
ｐＨ７で振とぅ培養し次。そうした後、２００プの培種
培地を４１の操作容量の発酵槽に移し、さらに第１表に
示した培地を加えた。次いで培養をｐＨ７（５０俤水酸
化アンモニウム溶液を加えることによって維持した）、
温度３０’Ｃ，および溶存酸素圧力（ＤＯＴ）Ｏ以下で
行なった。スターラーの回転速度は培養中ずっと５０
Ｏｒｐｍ に保った。培養中を通して培地のグルコー
ス濃度を検査し、その濃度が５ｆ／ｌ以下に減少した場
合にはさらなるグルコース全添加して濃度が最大で５０
ｔ／ｌｌになるようにした。０．２６ｆ／Ａのチミジ
ンおよび２．６ ？／１のチミジンが７日間の発酵の結
果生産された。これらの生産物は高性能液体クロマトグ
ラフィー（Ｈ−Ｐ、 Ｌ、 Ｃ，） によって同定さ
れた。
３表に示す接種用培地を振とぅフラスコに調製し、実施
例１に記載した方法に従って作表した接種した培地はス
ターテを用い１回転速度１５Ｃ１ｒｐｍ−温度２８℃、
ｐＨ７で振とぅ培養し次。そうした後、２００プの培種
培地を４１の操作容量の発酵槽に移し、さらに第１表に
示した培地を加えた。次いで培養をｐＨ７（５０俤水酸
化アンモニウム溶液を加えることによって維持した）、
温度３０’Ｃ，および溶存酸素圧力（ＤＯＴ）Ｏ以下で
行なった。スターラーの回転速度は培養中ずっと５０
Ｏｒｐｍ に保った。培養中を通して培地のグルコー
ス濃度を検査し、その濃度が５ｆ／ｌ以下に減少した場
合にはさらなるグルコース全添加して濃度が最大で５０
ｔ／ｌｌになるようにした。０．２６ｆ／Ａのチミジ
ンおよび２．６ ？／１のチミジンが７日間の発酵の結
果生産された。これらの生産物は高性能液体クロマトグ
ラフィー（Ｈ−Ｐ、 Ｌ、 Ｃ，） によって同定さ
れた。
実施例３：Ｌ−１７株の作製
Ｌ−１７株はＮＣＩＭＢ４０Ｇ１４株の培養液を５−フ
ルオｏ２−デオキシウリジンで処理すること、および高
濃度のこのようなピリミジン類似物に耐性である細胞を
選択してＬ−１７株を作製することによってＮＣＩＭＢ
４００１４株よシ作友した。
ルオｏ２−デオキシウリジンで処理すること、および高
濃度のこのようなピリミジン類似物に耐性である細胞を
選択してＬ−１７株を作製することによってＮＣＩＭＢ
４００１４株よシ作友した。
Ｌ−１７株はチミジンおよび／またはチミンの著しい生
産能力全示し、この生産物は培養液中に蓄積された。
産能力全示し、この生産物は培養液中に蓄積された。
３１旦ま：Ｌ−１７株を用いたチミジンの生産第４表に
示した接種用培地を振とうフラスコに調製し、実施例６
に記載した方法に従って作製した°レビバ −１ ムＬ
−１７味の培養液を接１した。
示した接種用培地を振とうフラスコに調製し、実施例６
に記載した方法に従って作製した°レビバ −１ ムＬ
−１７味の培養液を接１した。
接種した培地は、スターラーの回転速度１５０ｒｐｍ、
温度２８’Ｃ，ｐＨ７で振とう培養した。そうした後、
２００．ｄｃり接触培地を操作容量６１の発酵槽に移し
、さらに第１表に示した培地を加え喪。その後、培養’
（ｆ”１）Ｈ（５０％水酸化アンモニウム溶液を加える
ことによって維持した）、温度２５℃、溶存酸素圧力（
ＤＯＴ）０ 以下で行なった。スターラーの回転速度
は培養中を通じて５００ｒｐｍ に保った。培養中全
通して培地内グルコースａｉ’を検査し、さらに２ＣＪ
ＣＪ１／１３のグルコースを発酵槽内に供給した。
温度２８’Ｃ，ｐＨ７で振とう培養した。そうした後、
２００．ｄｃり接触培地を操作容量６１の発酵槽に移し
、さらに第１表に示した培地を加え喪。その後、培養’
（ｆ”１）Ｈ（５０％水酸化アンモニウム溶液を加える
ことによって維持した）、温度２５℃、溶存酸素圧力（
ＤＯＴ）０ 以下で行なった。スターラーの回転速度
は培養中を通じて５００ｒｐｍ に保った。培養中全
通して培地内グルコースａｉ’を検査し、さらに２ＣＪ
ＣＪ１／１３のグルコースを発酵槽内に供給した。
生産物は１゜９１７１のチミジンおよび２．Ｏｒ／Ｅの
チミンを含んでいることが認められた。
チミンを含んでいることが認められた。
生産されたチミジンおよびチミンは以下に示す方法のイ
オン交換分離によって培養液から分離し九二 細胞は遠心分離を用いて発酵生産物より除去した。チミ
ジンおよびチミン含有の溶液はＸＡ、Ｄ４樹脂〔ローム
アンド バーズ（Ｒｏｈｍ ａｎ、ｄＨａａｓ）、ク
ララレイ（Ｃｒａｗｌｅｙ ）、英国〕を充填した吸着
カラム（直径２．６ ｃｍ、長さ５０の）に負荷した。
オン交換分離によって培養液から分離し九二 細胞は遠心分離を用いて発酵生産物より除去した。チミ
ジンおよびチミン含有の溶液はＸＡ、Ｄ４樹脂〔ローム
アンド バーズ（Ｒｏｈｍ ａｎ、ｄＨａａｓ）、ク
ララレイ（Ｃｒａｗｌｅｙ ）、英国〕を充填した吸着
カラム（直径２．６ ｃｍ、長さ５０の）に負荷した。
カラムはｐＨ７の水を用いて、１時間あたシカラム容量
の４倍量の流速で浴出した。
の４倍量の流速で浴出した。
チミン全長く含む画分はカラム容量の５倍量の水金カラ
ムに通したところ水で溶出された。次いでカラム全メタ
ノールで溶出した。チミジン画分はカラム容量の１倍量
のメタノールを流したところで溶出された。
ムに通したところ水で溶出された。次いでカラム全メタ
ノールで溶出した。チミジン画分はカラム容量の１倍量
のメタノールを流したところで溶出された。
実施例５：２．９７７株の作製
２．９７７株はＡＴＣＣ１’７’３９０よシニ段階の方
法を経て作製された。
法を経て作製された。
第一段階では、ＡＴＣＣ１９３９０全ＵＶライトで処理
し、その結果得られたｊ＠養液に葉酸拮抗剤であるトリ
メトプリムを加えた。トリメトゲリムに耐性なａ胞を選
択して２．６０２株を作製した。
し、その結果得られたｊ＠養液に葉酸拮抗剤であるトリ
メトプリムを加えた。トリメトゲリムに耐性なａ胞を選
択して２．６０２株を作製した。
次に、２．６０２ 株を培養し、ＵＶライトで処理し、
その結果得られた培養液に５−フルオロ−２−デオキシ
ウリジン音節えた。高濃度の５−フルオロ−２−デオキ
シウリジンに耐性な細胞を選択し、２．９７７ 採音作
製した。
その結果得られた培養液に５−フルオロ−２−デオキシ
ウリジン音節えた。高濃度の５−フルオロ−２−デオキ
シウリジンに耐性な細胞を選択し、２．９７７ 採音作
製した。
生産物は前述のＬ−１７株（実施例６を参照されたい〕
と本質的に同一でおる。
と本質的に同一でおる。
（外４名〕
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、チミジンおよび／またはチミンを生産する方法であ
り、￥ブレビバクテリウム￥（￥Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ￥）属の細菌株を同化可能な炭素源およびその
他の栄養素を含む培養液中適切な培養条件下で好気培養
してチミジンおよび／またはチミンを生産すること、生
産されたチミジンおよび／またはチミンを直接培養液内
に蓄積すること、ならびにそうした後生産かつ蓄積され
たチミジンおよび／またはチミンを培養液から分離する
こと、からなる上記物質の生産方法。 ２、細菌株が￥ブレビバクテリウム￥￥ヘルボルム￥（
￥Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｈｅｌｖｏｌｕｍ
￥）種の株である、請求項１記載の方法。 ３、細菌株が￥ブレビバクテリウム￥￥ヘルボルム￥（
￥Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｈｅｌｖｏｌｕｍ
￥）ＮＣＩＭＢ４００１４、４０１１６あるいは４０１
１７株のうちの１株、またはこれらの株のうちの１株よ
り誘導した変異体（ｖａｒｉａｎｔ）あるいは突然変異
体（ｍｕｔａｎｔ）である、請求項２記載の方法。 ４、パッチ法または流加培養法で行なう、請求項１〜３
のいずれか１項に記載の方法。 ５、同化可能な炭素源がグルコースである、請求項１〜
４のいずれか１項に記載の方法。 ６、細菌株をｐＨ５〜９の範囲で培養する、請求項１〜
５のいずれか１項に記載の方法。 ７、細菌株を温度２０°〜３５℃の範囲で培養する、請
求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８、生産かつ蓄積されたチミジンおよび／またはチミン
を培養液からイオン交換によって分離する、請求項１〜
７のいずれか１項に記載の方法。 ９、生産および蓄積されたチミジンおよび／またはチミ
ンをイオン交換樹脂上に吸着させさらに水およびメタノ
ールを用いて特異的に溶出させる、請求項８記載の方法
。 １０、￥ブレビバクテリウム￥￥ヘルボルム￥（￥Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｈｅｌｖｏｌｕｍ￥）Ｎ
ＣＩＭＢ４００１４株ならびにこの株より誘導した変異
体（ｖａｒｉａｎｔ）および突然変異体（ｍｕｔａｎｔ
）の生物学的純粋培養。
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