JPH0242023A - ヘモグロビンの高分子共役体、その調製方法及び用途 - Google Patents
ヘモグロビンの高分子共役体、その調製方法及び用途Info
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- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
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-
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、新しい高分子共役体、その調製方法及び、特
に輸血の枠内における酸素輸送因子としてその使用に関
する。
に輸血の枠内における酸素輸送因子としてその使用に関
する。
［従来の技術］
ストロマが無く血液と等張にされたヘモグロビンの水溶
液を静脈内注射によって注入することができるというこ
とは周知の事実である。
液を静脈内注射によって注入することができるというこ
とは周知の事実である。
ところが、ヘモグロビンが提起する欠点の一つとして、
それが特に小さいことを原因として血液循環路内にとど
まらずに血管系の外に拡散してしまうということがある
。
それが特に小さいことを原因として血液循環路内にとど
まらずに血管系の外に拡散してしまうということがある
。
この欠点を補正するためすなわち血液の「代用品」又は
酸素輸送因子である充てん用溶質としてのその使用の範
囲内で遊離ヘモグロビンの血管内持続性を増大させるた
め、いくつかの方法が用いられてきた。
酸素輸送因子である充てん用溶質としてのその使用の範
囲内で遊離ヘモグロビンの血管内持続性を増大させるた
め、いくつかの方法が用いられてきた。
例えば、非抗原性で血球適合性のある、しかも無毒の水
溶性高分子にヘモグロビンを固定させた。
溶性高分子にヘモグロビンを固定させた。
こうして水溶性重合体の化学的固定により改質されたヘ
モグロビンの数多くの例は、ヘモグロビンの生体内滞留
時間を大幅に増大できることを示している。
モグロビンの数多くの例は、ヘモグロビンの生体内滞留
時間を大幅に増大できることを示している。
使用されるさまざまな重合体のうち最も一般的なものは
、多糖特にデキストラン（フランス特許第２．３２８．
４７８号）、ヒドロキシエチルでんぷん（フランス特許
第２．３２８．４７８号）、イヌリン（欧州特許出願明
細書筒４３．６７５号）そしてポリアルキレングリコー
ル、特にポリエチレングリコールである。
、多糖特にデキストラン（フランス特許第２．３２８．
４７８号）、ヒドロキシエチルでんぷん（フランス特許
第２．３２８．４７８号）、イヌリン（欧州特許出願明
細書筒４３．６７５号）そしてポリアルキレングリコー
ル、特にポリエチレングリコールである。
しかしながらいずれの場合においても、こうしてこれら
の重合体の直接的な固定により改質されたヘモグロビン
は、輸血での使用には適さない酸素運搬特性しか有して
いない。
の重合体の直接的な固定により改質されたヘモグロビン
は、輸血での使用には適さない酸素運搬特性しか有して
いない。
実際、代用血液は、それが酸素と共に形成する組合せが
可逆的である、すなわち、それが酸素を固定できる（ヘ
モグロビンはこのとき酸素を添加された形となる）ばか
りでなく容易に酸素を解放することができる（このとき
ヘモグロビンは脱酸された形となる）場合にのみ、天然
の赤血球内ヘモグロビンが果たすものと同等の役割を果
たすことができる。
可逆的である、すなわち、それが酸素を固定できる（ヘ
モグロビンはこのとき酸素を添加された形となる）ばか
りでなく容易に酸素を解放することができる（このとき
ヘモグロビンは脱酸された形となる）場合にのみ、天然
の赤血球内ヘモグロビンが果たすものと同等の役割を果
たすことができる。
酸素に対するこの特性は、ヘモグロビンが露出される大
気内に含まれている酸素の部分圧に応じての輸送因子質
量１単位により保持される酸素量の変化に相応する曲線
（パークロフトの曲線と呼ばれる）によって特徴づけら
れる。
気内に含まれている酸素の部分圧に応じての輸送因子質
量１単位により保持される酸素量の変化に相応する曲線
（パークロフトの曲線と呼ばれる）によって特徴づけら
れる。
天然ヘモグロビンの水溶液（濃度１５μモル／リットル
）の場合、この変化は、２５℃、ｐＨ７，２で表わされ
た第１図の基準線によって示される。
）の場合、この変化は、２５℃、ｐＨ７，２で表わされ
た第１図の基準線によって示される。
この曲線に結びつけられるパラメータの１つとして、ヘ
モグロビン溶液が自ら組合さることのできる最大量の５
０％に等しい酸素質量を吸収するために受けなくてはな
らない酸素の部分圧である半飽和圧力（ｐｓ。）がある
、ところが、上述のような改質ヘモグロビン（重合体に
カップリングされたヘモグロビン）の場合、一定の酸素
の部分圧の下でヘモグロビンに組合わされた酸素の割合
を表わす第１図の曲線は、天然ヘモグロビンに相応する
曲線に比べ左への並進を受ける。
モグロビン溶液が自ら組合さることのできる最大量の５
０％に等しい酸素質量を吸収するために受けなくてはな
らない酸素の部分圧である半飽和圧力（ｐｓ。）がある
、ところが、上述のような改質ヘモグロビン（重合体に
カップリングされたヘモグロビン）の場合、一定の酸素
の部分圧の下でヘモグロビンに組合わされた酸素の割合
を表わす第１図の曲線は、天然ヘモグロビンに相応する
曲線に比べ左への並進を受ける。
このことはすなわち、改質ヘモグロビンの圧力Ｐ、ｏが
天然ヘモグロビンのものよりも低いことを意味している
。換言すると、改質ヘモグロビンは、酸素に対してあま
りにも強すぎる親和力を呈し、そのため酸素は供給を受
けた組織で急速に修復することができないという欠点が
でて（る。
天然ヘモグロビンのものよりも低いことを意味している
。換言すると、改質ヘモグロビンは、酸素に対してあま
りにも強すぎる親和力を呈し、そのため酸素は供給を受
けた組織で急速に修復することができないという欠点が
でて（る。
改質ヘモグロビンの酸素運搬特性のこの変化は、特に次
のような理由によって説明かつ（：すなわち 天然ヘモグロビンは赤血球内部において、デオキシヘモ
グロビンのアロステリック部位のアミンと結びつく赤血
球内の天然エフェクタであるシフオスフォー２．３−グ
リセリン酸塩（２，３ＤＰＧ）の影響を受け、これが酸
素に対するヘモグロビンの親和力を低下させているので
ある。
のような理由によって説明かつ（：すなわち 天然ヘモグロビンは赤血球内部において、デオキシヘモ
グロビンのアロステリック部位のアミンと結びつく赤血
球内の天然エフェクタであるシフオスフォー２．３−グ
リセリン酸塩（２，３ＤＰＧ）の影響を受け、これが酸
素に対するヘモグロビンの親和力を低下させているので
ある。
この欠点を補正するための改良は、シフオスフォ２．３
−グリセリン酸塩又は６リン酸イノシトールといった一
時的エフエクタ（又はリガンド）が存在し酸素が全（無
い状態で重合体とヘモグロビンの間のカップリングを行
なうことによって提案されている（フランス特許第８３
．１４５．４５号）。
−グリセリン酸塩又は６リン酸イノシトールといった一
時的エフエクタ（又はリガンド）が存在し酸素が全（無
い状態で重合体とヘモグロビンの間のカップリングを行
なうことによって提案されている（フランス特許第８３
．１４５．４５号）。
これらのポリリン酸化された物質はデオキシヘモグロビ
ンのアロステリック部位を強（錯化し、このデオキシヘ
モグロビンを安定化させ、こうして酸素の運搬にとって
重要であるアミノ化された部位を保護する。
ンのアロステリック部位を強（錯化し、このデオキシヘ
モグロビンを安定化させ、こうして酸素の運搬にとって
重要であるアミノ化された部位を保護する。
しかしながら、これらのエフェクタはヘモグロビンの重
合体共役体の浄化段階中又は、血漿の解離条件のために
浄化がエフェクタの除去を導かなかった場合には血漿の
中で、除去される。
合体共役体の浄化段階中又は、血漿の解離条件のために
浄化がエフェクタの除去を導かなかった場合には血漿の
中で、除去される。
この欠点を補正するため、例えばピリドキサルー５′−
リン酸塩を固定することによる、永久エフェクタの利用
を提案した（日本公開特許Ｊｐ第５９．１０４，３２３
号）。
リン酸塩を固定することによる、永久エフェクタの利用
を提案した（日本公開特許Ｊｐ第５９．１０４，３２３
号）。
又、ヘモグロビン上への固定の後酸素に対するその親和
力を著しく低下させるような複数のリン酸塩基と共にリ
ガンドを用いることも提案された。
力を著しく低下させるような複数のリン酸塩基と共にリ
ガンドを用いることも提案された。
しかしながら、これらの化合物が示す欠点の１つとして
、それらを得るためにはヘモグロビンに対する複数の作
業を行なわなくてはならず（いずれにせよ２つ以上の作
業）このことは減成物質、特にメトヘモグロビンの形成
を誘発するということがある。
、それらを得るためにはヘモグロビンに対する複数の作
業を行なわなくてはならず（いずれにせよ２つ以上の作
業）このことは減成物質、特にメトヘモグロビンの形成
を誘発するということがある。
同様に、フランス特許出願明細書第
８６．０９６２５号において、その血管外拡散率が制限
されるひいては取消されるようなサイズをもち、血漿の
解離条件に対し保護されており、遊離ヘモグロビンのも
のと比べて変化したのではな（改良された酸素運搬特性
を有し、その調製はヘモグロビンに対する反応段階の数
を制限するものであるような、ヘモグロビンの高分子共
役体が提案された。
されるひいては取消されるようなサイズをもち、血漿の
解離条件に対し保護されており、遊離ヘモグロビンのも
のと比べて変化したのではな（改良された酸素運搬特性
を有し、その調製はヘモグロビンに対する反応段階の数
を制限するものであるような、ヘモグロビンの高分子共
役体が提案された。
ところがこれらの化合物は、２段階にわたる方法すなわ
ち、重合体Ｐ上への陰イオン電荷をもつＺ部位の固定段
階及びそれに続く、酸素の無い状態での脱酸された形の
ヘモグロビンとＺ部位が固定された重合体Ｐの間の反応
の段階を含む方法によって得られるものとして提示され
た。
ち、重合体Ｐ上への陰イオン電荷をもつＺ部位の固定段
階及びそれに続く、酸素の無い状態での脱酸された形の
ヘモグロビンとＺ部位が固定された重合体Ｐの間の反応
の段階を含む方法によって得られるものとして提示され
た。
この方法は、既存の方法に比べて単純化されてはいるも
のの、特にデオキシヘモグロビン溶液を大嵐に用いる場
合において工業規模での利用がむずかしいものである可
能性があり、無酸素状態の下で作業しなければならない
という点でさらにむずかしいものである。
のの、特にデオキシヘモグロビン溶液を大嵐に用いる場
合において工業規模での利用がむずかしいものである可
能性があり、無酸素状態の下で作業しなければならない
という点でさらにむずかしいものである。
ところが出願人である当該会社は、全く予期せぬ形で、
フランス特許出願明細書第８６．０９６２５号の対象と
なっている共役体のいくつかを調製できるようにし又、
代用血液として生体内で使用できるようにするすぐれた
酸素運搬特性を呈する新しい共役体にまで当業者の入手
範囲を広めることを可能にするような、新しい方法を発
見した。
フランス特許出願明細書第８６．０９６２５号の対象と
なっている共役体のいくつかを調製できるようにし又、
代用血液として生体内で使用できるようにするすぐれた
酸素運搬特性を呈する新しい共役体にまで当業者の入手
範囲を広めることを可能にするような、新しい方法を発
見した。
実際、ヘモグロビンのカップリングのいくつかの共役体
は、酸素添加された形のヘモグロビンを使用し、酸素の
欠如が関与しない条件の下で作業することによって得る
ことができるということがわかった。
は、酸素添加された形のヘモグロビンを使用し、酸素の
欠如が関与しない条件の下で作業することによって得る
ことができるということがわかった。
ところが、酸素添加された形でのヘモグロビンを用いて
ヘモグロビンの高分子共役体を調製するという可能性は
、きわめて驚くべきものであり、ヘモグロビンの立体配
座に関する既知のデータに対しても又これまでに得られ
た結果に対しても矛盾することである。
ヘモグロビンの高分子共役体を調製するという可能性は
、きわめて驚くべきものであり、ヘモグロビンの立体配
座に関する既知のデータに対しても又これまでに得られ
た結果に対しても矛盾することである。
実際、ヘモグロビンの立体配座についての既知のデータ
特に、デオキシの形でヘモグロビンのアミンのうちのい
（つかは以下に定義づける塩橋を打ち立ててヘモグロビ
ンの鎖錠に参加するという事実を考慮に入れると、塩橋
に関与するヘモグロビンのこれらのアミンは、重合体と
容易に反応できない。デオキシヘモグロビンと重合体が
得られたヘモグロビンの高分子共役体にカップリングさ
れるとき、これらのアミンはヘモグロビンのオキシニブ
オキシ立体配座のトランジションをひきつづき行なう。
特に、デオキシの形でヘモグロビンのアミンのうちのい
（つかは以下に定義づける塩橋を打ち立ててヘモグロビ
ンの鎖錠に参加するという事実を考慮に入れると、塩橋
に関与するヘモグロビンのこれらのアミンは、重合体と
容易に反応できない。デオキシヘモグロビンと重合体が
得られたヘモグロビンの高分子共役体にカップリングさ
れるとき、これらのアミンはヘモグロビンのオキシニブ
オキシ立体配座のトランジションをひきつづき行なう。
さらに、デオキシヘモグロビンは、陰イオン基を内含す
る構造と精力的に結びつ（ことのできるアミン官能基で
覆われた１つの部位（βアロステリック部位）を有する
、従って、陰イオン電荷を持つ重合体はこのレベルで優
先的に反応し、それがカルボキシル、アルデヒド又はＯ
Ｈといった反応性の官能基を有する場合にはこの部位の
内部で反応し、デオキシ・ヘモグロビンが安定化されて
いる共役体を与え、ヘモグロビンが酸素添加された形に
あるとき塩橋はもはや存在せず、従って相応するアミン
はいかなるものであれ重合体と反応できる。このカップ
リングの結果、重合体により改質されたアミンがもはや
ヘモグロビンのデオキシ（脱酸）形態を安定化させる塩
橋を打ち立てることができないためヘモグロビンが脱酸
しにく（なった兵役体が得られる。なお、部位βはひじ
ように混乱しており、重合体の陰イオン基による配向効
果はもはや役目を果たせない。こうしてきわめて低いＰ
、。を有する共役体が得られる。
る構造と精力的に結びつ（ことのできるアミン官能基で
覆われた１つの部位（βアロステリック部位）を有する
、従って、陰イオン電荷を持つ重合体はこのレベルで優
先的に反応し、それがカルボキシル、アルデヒド又はＯ
Ｈといった反応性の官能基を有する場合にはこの部位の
内部で反応し、デオキシ・ヘモグロビンが安定化されて
いる共役体を与え、ヘモグロビンが酸素添加された形に
あるとき塩橋はもはや存在せず、従って相応するアミン
はいかなるものであれ重合体と反応できる。このカップ
リングの結果、重合体により改質されたアミンがもはや
ヘモグロビンのデオキシ（脱酸）形態を安定化させる塩
橋を打ち立てることができないためヘモグロビンが脱酸
しにく（なった兵役体が得られる。なお、部位βはひじ
ように混乱しており、重合体の陰イオン基による配向効
果はもはや役目を果たせない。こうしてきわめて低いＰ
、。を有する共役体が得られる。
これらの仮定は、
リン酸塩及び／又は硫酸塩及び／又はカルボキシル酸塩
から成る陰イオン電荷を有するＺ部位及び これらのＺ部位上にないカルボキシル基、アルデヒド基
又はＯＨ基 を含み、しかもイオン結合が重合体のＺ部位のリン酸塩
及び／又は硫酸塩及び／又はカルボキシル酸塩とヘモグ
ロビンの間で打ち立てられ、共有結合が重合体上にある
カルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基とヘモグロビ
ンの間で打ち立てられるような重合体を用いた結果によ
って確認された。
から成る陰イオン電荷を有するＺ部位及び これらのＺ部位上にないカルボキシル基、アルデヒド基
又はＯＨ基 を含み、しかもイオン結合が重合体のＺ部位のリン酸塩
及び／又は硫酸塩及び／又はカルボキシル酸塩とヘモグ
ロビンの間で打ち立てられ、共有結合が重合体上にある
カルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基とヘモグロビ
ンの間で打ち立てられるような重合体を用いた結果によ
って確認された。
実際、かかる重合体が酸素添加された形のヘモグロビン
との反応に付された場合、ヘモグロビンの高分子共役体
のＰ、。は天然ヘモグロビンのものよりも低くなる。
との反応に付された場合、ヘモグロビンの高分子共役体
のＰ、。は天然ヘモグロビンのものよりも低くなる。
一方ではカルボキシル酸塩の形で重合体とヘモグロビン
の間のイオン結合を打ち立てる陰イオン電荷として役立
ち他方ではヘモグロビンと重合体の間の共有結合の樹立
に参加するが、その中で共有結合に関与するカルボキシ
ル基はイオン結合を打ち立てるカルボキシル酸塩を有す
る２部位上にないようなカルボキシル基を含む重合体を
用いて得られた結果は、酸素添加された形のヘモグロビ
ンから調製されたヘモグロビン共役体が遊離ヘモグロビ
ンのものよりも低いＰ＠。を呈すること、換言するとか
かるヘモグロビン共役体は興味深い酸素運搬特性をもっ
ていないことを立証した［Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｆ調製的生化学）１４（４１，
３１３−３２９（１９８４年）参照のこと１゜ところが
、興味深い酸素運搬特性を呈するヘモグロビン共役体を
酸素添加されたヘモグロビンから調製する可能性が、本
発明に基づく方法のおかけで得られたのである。
の間のイオン結合を打ち立てる陰イオン電荷として役立
ち他方ではヘモグロビンと重合体の間の共有結合の樹立
に参加するが、その中で共有結合に関与するカルボキシ
ル基はイオン結合を打ち立てるカルボキシル酸塩を有す
る２部位上にないようなカルボキシル基を含む重合体を
用いて得られた結果は、酸素添加された形のヘモグロビ
ンから調製されたヘモグロビン共役体が遊離ヘモグロビ
ンのものよりも低いＰ＠。を呈すること、換言するとか
かるヘモグロビン共役体は興味深い酸素運搬特性をもっ
ていないことを立証した［Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｆ調製的生化学）１４（４１，
３１３−３２９（１９８４年）参照のこと１゜ところが
、興味深い酸素運搬特性を呈するヘモグロビン共役体を
酸素添加されたヘモグロビンから調製する可能性が、本
発明に基づく方法のおかけで得られたのである。
なおすでに、
重合体とヘモグロビンの間のイオン結合が陰イオン電荷
を有する重合体のＺ部位とヘモグロビンの間で打ち立て
られており、 共有結合は ・重合体の２部位とヘモグロビンの間又は・陰イオン電
荷の性質、陰イオン電荷の数そして単量体の数の間の関
係を条件として、ヘモグロビンと重合体の間で 打ち立てられているようなヘモグロビンの高分子共役体
が提案されている。
を有する重合体のＺ部位とヘモグロビンの間で打ち立て
られており、 共有結合は ・重合体の２部位とヘモグロビンの間又は・陰イオン電
荷の性質、陰イオン電荷の数そして単量体の数の間の関
係を条件として、ヘモグロビンと重合体の間で 打ち立てられているようなヘモグロビンの高分子共役体
が提案されている。
ところが、予期せぬ形で、負イオン電荷及びヘモグロビ
ンと重合体の間で共有結合を形成することのできる官能
基が同じＺ部位上にあることを条件として、１つの重合
体につき少なくとも１つの負イオン電荷で充分であると
いうことがわかった。
ンと重合体の間で共有結合を形成することのできる官能
基が同じＺ部位上にあることを条件として、１つの重合
体につき少なくとも１つの負イオン電荷で充分であると
いうことがわかった。
［課題を解決するための手段］
本発明の目的の１つは、生理的に適合性があり酸素を可
逆的に固定することのできる高分子共役体を容易に得る
ことを可能にする新しい方法を提供することにある。
逆的に固定することのできる高分子共役体を容易に得る
ことを可能にする新しい方法を提供することにある。
本発明の目的の１つは、遊離ヘモグロビンよりも容易に
酸素を放出できる高分子共役体を容易に得ることを可能
にする新しい方法を提供することにある。
酸素を放出できる高分子共役体を容易に得ることを可能
にする新しい方法を提供することにある。
本発明の目的の１つは、工業規模で容易に合成できる共
役体を得ることを可能にする新しい方法を提案すること
にある。
役体を得ることを可能にする新しい方法を提案すること
にある。
本発明のその他の目的の１つは、ヘモグロビンを最高で
も２つの段階、一般には、唯一の段階に付すことによっ
て、ヘモグロビン高分子共役体を得ることを可能にする
新しい方法を提供することにある。
も２つの段階、一般には、唯一の段階に付すことによっ
て、ヘモグロビン高分子共役体を得ることを可能にする
新しい方法を提供することにある。
本発明のその他の目的の１つは、代用血液として、特に
、輸血又は器官の潅流を必要とする手術において用いる
ことのできるヘモグロビン高分子共役体を含む水溶液を
大量に得ることを容易に可能にする新しい方法にある。
、輸血又は器官の潅流を必要とする手術において用いる
ことのできるヘモグロビン高分子共役体を含む水溶液を
大量に得ることを容易に可能にする新しい方法にある。
本発明のもう１つの目的は、遊離ヘモグロビンとの関係
において試験管内でＰ、。の増加により明らかになるそ
の酸素運搬特性が生体内でも安定した状態にとどまって
いるようなヘモグロビン溶；夜を容易に得ることができ
るようにする新しい方法を提供することにある。
において試験管内でＰ、。の増加により明らかになるそ
の酸素運搬特性が生体内でも安定した状態にとどまって
いるようなヘモグロビン溶；夜を容易に得ることができ
るようにする新しい方法を提供することにある。
本発明のもう１つの目的は、酸素に対する適度の親和力
ならびに、輸血実験の間に血色素尿症の抑制によりヘモ
グロビンの血管内持続を増大させるような高い流体力学
的容積を呈するヘモグロビン高分子化合物を容易に得る
ことができるようにする新しい方法を提供することにあ
る。
ならびに、輸血実験の間に血色素尿症の抑制によりヘモ
グロビンの血管内持続を増大させるような高い流体力学
的容積を呈するヘモグロビン高分子化合物を容易に得る
ことができるようにする新しい方法を提供することにあ
る。
本発明のもう１つの目的は、ヘモグロビンが存在する中
で但しヘモグロビンとカップリングしない条件の下で用
いられる重合体が遊離ヘモグロビンと比べて必ずしもＰ
、。の増大をひき起こさないことを特徴とする、遊離ヘ
モグロビンとの関係における試験管内でのＰ ｓｏの増
加により明らかになるすぐれた酸素運搬特性を呈するヘ
モグロビン高分子共役体を容易に得ることができるよう
にする新しい方法を提案することにある。
で但しヘモグロビンとカップリングしない条件の下で用
いられる重合体が遊離ヘモグロビンと比べて必ずしもＰ
、。の増大をひき起こさないことを特徴とする、遊離ヘ
モグロビンとの関係における試験管内でのＰ ｓｏの増
加により明らかになるすぐれた酸素運搬特性を呈するヘ
モグロビン高分子共役体を容易に得ることができるよう
にする新しい方法を提案することにある。
本発明の目的の１つは、試験管内でのＰ ｇｏの増大に
より明らかにされたすぐれた酸素運搬特性を呈し、しか
もそのＰ、。はヘモグロビンと重合体の間に打ち立てら
れたイオン結合の数と相関関係をもたせて調製されつる
ような新しい高分子共役体を提案することにある。
より明らかにされたすぐれた酸素運搬特性を呈し、しか
もそのＰ、。はヘモグロビンと重合体の間に打ち立てら
れたイオン結合の数と相関関係をもたせて調製されつる
ような新しい高分子共役体を提案することにある。
酸素に対して遊離ヘモグロビンのものよりも低い親和力
を示し、血漿の中でその高分子共役体が酸素運搬機能を
果たさなくてはならない時間中生物分解性が全く又はほ
とんど無いヘモグロビンの水溶性高分子共役体の調製方
法は、以下のことを特徴とする： 第１段階においては、重合体１鎖あたり少なくとも１つ
のＺ部位の割合で重合体Ｐ上にＺ部位を固定させること
；なお、重合体Ｐは水溶性をもち、無毒で好ましくは非
抗原性を有し血球適合型であり、しかもその分子量は約
１．０００〜５０万好ましくは約１．０００〜１０万で
あり、単数又は複数の極性基好ましくはヒドロキシル基
、カルボキシル基又はアミン基を含んでいる。又Ｚ部位
は、一方では複数の基、硫酸塩及び／又はリン酸塩及び
／又はカルボキシル酸塩により支持されヘモグロビンと
のイオン結合を生成することを目的とする少なくとも１
つの負の電荷を含み、他方ではヘモグロビンと共有結合
を生成することを目的とする少なくとも１つのカルボキ
シル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含んでいる。又かか
る固定は以下の方法のいずれかを用いて行なわれる：・
Ｙをアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル
又はハロゲンといった活性剤を用いて活性化可能な又は
活性の官能基として、化合物Ｚ−Ｙを用いることにより
、或いは ・重合体Ｐ上でＺ部位をラジカルグラフトすることによ
り。
を示し、血漿の中でその高分子共役体が酸素運搬機能を
果たさなくてはならない時間中生物分解性が全く又はほ
とんど無いヘモグロビンの水溶性高分子共役体の調製方
法は、以下のことを特徴とする： 第１段階においては、重合体１鎖あたり少なくとも１つ
のＺ部位の割合で重合体Ｐ上にＺ部位を固定させること
；なお、重合体Ｐは水溶性をもち、無毒で好ましくは非
抗原性を有し血球適合型であり、しかもその分子量は約
１．０００〜５０万好ましくは約１．０００〜１０万で
あり、単数又は複数の極性基好ましくはヒドロキシル基
、カルボキシル基又はアミン基を含んでいる。又Ｚ部位
は、一方では複数の基、硫酸塩及び／又はリン酸塩及び
／又はカルボキシル酸塩により支持されヘモグロビンと
のイオン結合を生成することを目的とする少なくとも１
つの負の電荷を含み、他方ではヘモグロビンと共有結合
を生成することを目的とする少なくとも１つのカルボキ
シル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含んでいる。又かか
る固定は以下の方法のいずれかを用いて行なわれる：・
Ｙをアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル
又はハロゲンといった活性剤を用いて活性化可能な又は
活性の官能基として、化合物Ｚ−Ｙを用いることにより
、或いは ・重合体Ｐ上でＺ部位をラジカルグラフトすることによ
り。
次に、第２段階において、約５〜約９のｐ＋（の水性媒
質内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップ
リングの後酸素添加された形から脱酸された形へ可逆的
に移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質
内で酸素を含んだ形のヘモグロビンと単数又は複数の部
位Ｚを有する重合体Ｐを反応させ、重合体が有している
Ｚ部位のうちの少なくとも１つとヘモグロビンの間の少
なくとも１つのイオン結合及び重合体が有する前記同一
２部位とヘモグロビンの間の少なくとも１つの共有結合
を形成させること； 上述の反応により場合によってイミン官能基が導き出さ
れた場合、この官能基は、例えばＮ ａ Ｂ Ｈ４，Ｎ
ａ ＣＮ Ｂ Ｈ、、ジメチルアミノボラン又はＨＣ
ＯＯＨを用いての還元などによってアミン官能基に安定
化されうること。
質内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップ
リングの後酸素添加された形から脱酸された形へ可逆的
に移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質
内で酸素を含んだ形のヘモグロビンと単数又は複数の部
位Ｚを有する重合体Ｐを反応させ、重合体が有している
Ｚ部位のうちの少なくとも１つとヘモグロビンの間の少
なくとも１つのイオン結合及び重合体が有する前記同一
２部位とヘモグロビンの間の少なくとも１つの共有結合
を形成させること； 上述の反応により場合によってイミン官能基が導き出さ
れた場合、この官能基は、例えばＮ ａ Ｂ Ｈ４，Ｎ
ａ ＣＮ Ｂ Ｈ、、ジメチルアミノボラン又はＨＣ
ＯＯＨを用いての還元などによってアミン官能基に安定
化されうること。
言語的便宜上、以下の記述においては、相反する指示の
無いかぎり「Ｚ部位」という表現は、重合体上への固定
後の２部位に相当するものとする。
無いかぎり「Ｚ部位」という表現は、重合体上への固定
後の２部位に相当するものとする。
上述の説明及び以下の説明において、ヘモグロビンと重
合体の間のイオン結合に介入する（カルボキシル基から
生じる）陰イオン電荷を指して「カルボキシル酸塩の（
ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ） Ｊという形容詞を、そして
ヘモグロビンと重合体の間の共有結合を打ち立てる（同
様にカルボキシル基から生じているが前記のものとは異
なる）官能基を指して「カルボキシルの（ｃａｒｂｏｘ
ｙｌｉｑｕｅ） Ｊという形容詞を用いている。
合体の間のイオン結合に介入する（カルボキシル基から
生じる）陰イオン電荷を指して「カルボキシル酸塩の（
ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ） Ｊという形容詞を、そして
ヘモグロビンと重合体の間の共有結合を打ち立てる（同
様にカルボキシル基から生じているが前記のものとは異
なる）官能基を指して「カルボキシルの（ｃａｒｂｏｘ
ｙｌｉｑｕｅ） Ｊという形容詞を用いている。
ｒカルボキシルの（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｑｕｅ） Ｊと
いう形容詞は、２つのカルボキシル基から形成された無
水物をも同様に包括する。
いう形容詞は、２つのカルボキシル基から形成された無
水物をも同様に包括する。
さらにカルボキシル酸塩から生じる陰イオン電荷は同様
に無水物官能基からも生じつる。
に無水物官能基からも生じつる。
酸素の欠如が関与しない条件の下で、酸素添加された形
のヘモグロビンを使用することができるということがわ
かった。より厳密に言うと、次のことがわかった： 例えば、Ｚ部位の固定を受けた後、重合体が凍結乾燥さ
れた場合、重合体を溶解させるのに用いた溶液をグロー
ブボックス内で脱酸させ真空下に置くことは不用である
こと 同様に上記溶液の脱酸の後、窒素スカベンジング（掃気
）を行なう必要はないこと：又聞様に、上述の段階すな
わちグローブボックスでのヘモグロビンの脱酸、真空下
放置及び窒素スカベンジングによりヘモグロビンを処理
することそして重合体とヘモグロビンの間のカップリン
グを行なうため後で無酸素状態の下で作業する必要性が
無用であること。
のヘモグロビンを使用することができるということがわ
かった。より厳密に言うと、次のことがわかった： 例えば、Ｚ部位の固定を受けた後、重合体が凍結乾燥さ
れた場合、重合体を溶解させるのに用いた溶液をグロー
ブボックス内で脱酸させ真空下に置くことは不用である
こと 同様に上記溶液の脱酸の後、窒素スカベンジング（掃気
）を行なう必要はないこと：又聞様に、上述の段階すな
わちグローブボックスでのヘモグロビンの脱酸、真空下
放置及び窒素スカベンジングによりヘモグロビンを処理
することそして重合体とヘモグロビンの間のカップリン
グを行なうため後で無酸素状態の下で作業する必要性が
無用であること。
同様に、この方法が、Ｚ部位が同時に以下のものを有し
ている場合にのみ適用可能であることもわかった： 硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸塩の中から選ばれた
負イオン基。
ている場合にのみ適用可能であることもわかった： 硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸塩の中から選ばれた
負イオン基。
カルボキシル基、アルデヒド基またはＯＨ基。
換言すると、この方法はイオン結合及び共有結合が、適
切な基をもつ少なくとも１つの同一のＺ部位を介して重
合体とへそグロビンの間に打ち立てられた場合にのみ適
用可能である。
切な基をもつ少なくとも１つの同一のＺ部位を介して重
合体とへそグロビンの間に打ち立てられた場合にのみ適
用可能である。
本発明に基づ（方法は、従って以下のような条件の下で
のみ適用できる： 重合体が有するＺ部位上にあるリン酸塩基、硫酸塩基又
はカルボキシル酸塩基とヘモグロビンの間にイオン結合
が樹立されていること； そして前記Ｚ部位が同様に、重合体とヘモグロビンの間
の共有結合を形成するアルデヒド基、カルボキシル基又
はＯＨ基をも含んでいること。
のみ適用できる： 重合体が有するＺ部位上にあるリン酸塩基、硫酸塩基又
はカルボキシル酸塩基とヘモグロビンの間にイオン結合
が樹立されていること； そして前記Ｚ部位が同様に、重合体とヘモグロビンの間
の共有結合を形成するアルデヒド基、カルボキシル基又
はＯＨ基をも含んでいること。
換言すると、本発明に基づく方法は、次のものを含む重
合体には適用されない； 一方では、硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸塩の中か
ら選ばれた陰イオン基を有するＺ部位の一部、 他方では、前記Ｚ部位上にあるカルボキシル基、アルデ
ヒド基又はＯＨ基。
合体には適用されない； 一方では、硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸塩の中か
ら選ばれた陰イオン基を有するＺ部位の一部、 他方では、前記Ｚ部位上にあるカルボキシル基、アルデ
ヒド基又はＯＨ基。
換言すると、重合体上への固定の前のＺ部位は、次の条
件を満たす少なくとも３つの官能基を含んでいる： 官能基の１つは重合体上に２基を付着させることのでき
る官能基である。
件を満たす少なくとも３つの官能基を含んでいる： 官能基の１つは重合体上に２基を付着させることのでき
る官能基である。
官能基の１つは、ヘモグロビンのアロステリック部位の
アミンとのイオン結合を打ち立てることのできる硫酸塩
、リン酸塩又はカルボキシル酸塩の官能基である。
アミンとのイオン結合を打ち立てることのできる硫酸塩
、リン酸塩又はカルボキシル酸塩の官能基である。
官能基の１つは、ヘモグロビンのＮＨ，基と共有結合を
形成することのできるアルデヒド、カルボキシル又はＯ
Ｈの官能基である。
形成することのできるアルデヒド、カルボキシル又はＯ
Ｈの官能基である。
これまで問題にされてきたＺ−Ｙ化合物の官能基Ｙを活
性化するために用いられる活性剤としては、例えば、カ
ルボジイミド又はカルボニルジイミダゾールから成るグ
ループの中から選ばれたものを挙げることができる。
性化するために用いられる活性剤としては、例えば、カ
ルボジイミド又はカルボニルジイミダゾールから成るグ
ループの中から選ばれたものを挙げることができる。
２部位が重合体上にラジカルグラフトによって固定され
る場合、例えば硝酸又は硫酸第２セリウム・アンモニウ
ム又はその他の、重合体鎖上に遊離基を生成できる物質
（アゾビス・イゾブチロニトリル、過酸化物など）のよ
うなラジカルイニシェークが用いられる。
る場合、例えば硝酸又は硫酸第２セリウム・アンモニウ
ム又はその他の、重合体鎖上に遊離基を生成できる物質
（アゾビス・イゾブチロニトリル、過酸化物など）のよ
うなラジカルイニシェークが用いられる。
本発明に基づく方法の有利な実施態様によると、ヘモグ
ロビンと重合体の間の共有結合に介入する全てのＺ部位
は、ヘモグロビンと重合体の間のイオン結合内に介入す
るＺ部位と同じである。
ロビンと重合体の間の共有結合に介入する全てのＺ部位
は、ヘモグロビンと重合体の間のイオン結合内に介入す
るＺ部位と同じである。
本発明に基づ（方法において、重合体の極性基がイオン
化可能でありその全てが２部位との結合に関与していな
い場合、これらの極性基は好ましくは、生体内で血漿た
んぽ（質と後で相互作用するのを防ぐため、ブロック（
遮断）される。
化可能でありその全てが２部位との結合に関与していな
い場合、これらの極性基は好ましくは、生体内で血漿た
んぽ（質と後で相互作用するのを防ぐため、ブロック（
遮断）される。
こうして、極性基がアミンである場合、Ｚ部位との結合
に関与していないアミンは、例えば無水酢酸などを用い
てブロックされつる。
に関与していないアミンは、例えば無水酢酸などを用い
てブロックされつる。
極性基がカルボキシル基である場合、これはエタノール
アミンなどでブロックされつる。
アミンなどでブロックされつる。
本発明に基づ（方法は、重合体の極性基が全てＺ部位と
の結合に関与しており、従って極性基に対して行なうべ
きブロッキングがもはや無いような条件の下で行なわれ
ると有利である。
の結合に関与しており、従って極性基に対して行なうべ
きブロッキングがもはや無いような条件の下で行なわれ
ると有利である。
これらの条件は特に、重合体の極性基に応じて重合体上
に固定されたＺ部位の量を調整することから成る。
に固定されたＺ部位の量を調整することから成る。
極性基が、使用されている重合体上に予め存在せず、重
合体上に固定しなければならない場合、２部位の固定の
後ブロックすべき（残留）極性基が無い状態で重合体」
二に固定されたＺ部位の数が望ましいものであるような
形で固定する極性基の贋を制御することも可能である。
合体上に固定しなければならない場合、２部位の固定の
後ブロックすべき（残留）極性基が無い状態で重合体」
二に固定されたＺ部位の数が望ましいものであるような
形で固定する極性基の贋を制御することも可能である。
Ｚ部位の数の制御は、それがＺ部位からくる負の電荷の
密度を介してＰｓｏの変動に介入して（るかぎりにおい
て、きわめて興味深いことでありうる。
密度を介してＰｓｏの変動に介入して（るかぎりにおい
て、きわめて興味深いことでありうる。
重合体上の極性基の固定の制御は、以下のような形で行
なうことができるニ アミノ化されたデキストランの例では、アミン基の数は
、触媒が存在する中でデキストランに対しエピクロルヒ
ドリンを反応させることから成る先行する反応を制御す
ることにより調整できる、 この制御は、反応時間を変化させるか又は触媒の量を変
化させることによって行なうことができる。
なうことができるニ アミノ化されたデキストランの例では、アミン基の数は
、触媒が存在する中でデキストランに対しエピクロルヒ
ドリンを反応させることから成る先行する反応を制御す
ることにより調整できる、 この制御は、反応時間を変化させるか又は触媒の量を変
化させることによって行なうことができる。
極性基が予め存在しているか又は重合体上にすでに固定
されている場合、重合体の極性基上の２部位の固定の制
御は、以下のように行なうことができる： 上の定義づけされているＺ−Ｙ化合物と重合体の極性基
の間のモル比を変化させることにより、又は 上記活性剤と重合体の極性基の間のモル比を変化させる
ことにより。
されている場合、重合体の極性基上の２部位の固定の制
御は、以下のように行なうことができる： 上の定義づけされているＺ−Ｙ化合物と重合体の極性基
の間のモル比を変化させることにより、又は 上記活性剤と重合体の極性基の間のモル比を変化させる
ことにより。
Ｚ基がラジカルグラフトされる場合、その固定の制御は
、グラフト反応の間に用いられるラジカルイニシェーク
の債を加減することにより、極性基とは無関係に行なわ
れる。
、グラフト反応の間に用いられるラジカルイニシェーク
の債を加減することにより、極性基とは無関係に行なわ
れる。
陰イオン電荷に関しては、１つの２部位につき少なくと
も１つの陰イオン電荷（それが硫酸塩、リン酸塩又はカ
ルボキシル酸塩のいずれであれ）で充分であること、そ
して重合体１つにつぎこのよりなＺ部位が少なくとも１
つで充分であることがわかった。
も１つの陰イオン電荷（それが硫酸塩、リン酸塩又はカ
ルボキシル酸塩のいずれであれ）で充分であること、そ
して重合体１つにつぎこのよりなＺ部位が少なくとも１
つで充分であることがわかった。
換言すると、本発明に基づく方法は、重合体とヘモグロ
ビンの間でイオン結合を形成するため少なくとも唯一つ
の陰イオン基特に重合体１つにつき唯一つの陰イオン（
かかる負イオン基は重合体とヘモグロビンの間の共有結
合には介入しない）を含む共役体の調製に適用可能であ
ることがわかった。
ビンの間でイオン結合を形成するため少なくとも唯一つ
の陰イオン基特に重合体１つにつき唯一つの陰イオン（
かかる負イオン基は重合体とヘモグロビンの間の共有結
合には介入しない）を含む共役体の調製に適用可能であ
ることがわかった。
又、本発明に基づ（方法により得られた高分子共役体が
水溶性で、無毒で好ましくは抗原性無くしかも血球適合
型であるために必要な１つの条件は、前記高分子共役体
の構成に入りつる重合体Ｐが水溶性で、無毒で好ましく
は抗原性無くしかも血球適合型ものであることであると
いうことがわかった。
水溶性で、無毒で好ましくは抗原性無くしかも血球適合
型であるために必要な１つの条件は、前記高分子共役体
の構成に入りつる重合体Ｐが水溶性で、無毒で好ましく
は抗原性無くしかも血球適合型ものであることであると
いうことがわかった。
さらに、重合体の鎖上に、永久エフェクタのｆ２割を果
たす陰イオン基を有するＺ部位が存在するために、溶液
状態のヘモグロビンの５０％が酸素添加される部分圧が
増大し、しかもこれを遊離リガンドが場合によって存在
するせいであるとすることはできないということがわか
った。
たす陰イオン基を有するＺ部位が存在するために、溶液
状態のヘモグロビンの５０％が酸素添加される部分圧が
増大し、しかもこれを遊離リガンドが場合によって存在
するせいであるとすることはできないということがわか
った。
これらの永久エフェクタは、脱酸された形のヘモグロビ
ン分子の立体配座なさらに強く安定化させながらヘモグ
ロビンが脱酸された形から酸素添加された形に可逆的に
移行できるようにするものでもあり、こうして酸素に対
するヘモグロビンの親和力は減少することになる。
ン分子の立体配座なさらに強く安定化させながらヘモグ
ロビンが脱酸された形から酸素添加された形に可逆的に
移行できるようにするものでもあり、こうして酸素に対
するヘモグロビンの親和力は減少することになる。
換言すると、これらのエフェクタにより、ヘモグロビン
は酸素を可逆的に輸送し、特に、供給を受けている組織
内で容易に酸素を再度解放することができる。
は酸素を可逆的に輸送し、特に、供給を受けている組織
内で容易に酸素を再度解放することができる。
共有結合は、それが本発明に基づ（方法により得られた
高分子共役体に対して、その共役体が酸素運搬機能を果
たさな（ではならない時間中（つまり２〜３日）血漿媒
質内でそれを生物分解性が全く又はほとんど無いものに
する安定性を与え、こうしてヘモグロビンの腎臓外及び
血管外の拡散を排除させるようなものである。
高分子共役体に対して、その共役体が酸素運搬機能を果
たさな（ではならない時間中（つまり２〜３日）血漿媒
質内でそれを生物分解性が全く又はほとんど無いものに
する安定性を与え、こうしてヘモグロビンの腎臓外及び
血管外の拡散を排除させるようなものである。
本発明に基づく方法によって得られた高分子共役体にお
いて、ヘモグロビンは少なくとも１つの共有結合により
重合体に結びつけられるが、ヘモグロビンと重合体の間
の共有結合の数が限界値を超える場合特に分子間に網状
化現象が存在する場合、これはヘモグロビンの特性を害
することになる。
いて、ヘモグロビンは少なくとも１つの共有結合により
重合体に結びつけられるが、ヘモグロビンと重合体の間
の共有結合の数が限界値を超える場合特に分子間に網状
化現象が存在する場合、これはヘモグロビンの特性を害
することになる。
この共有結合の限界数は、本発明に基づく高分子共役体
の平均分子量が約１００万を超えてはならないという事
実に相応する。
の平均分子量が約１００万を超えてはならないという事
実に相応する。
血漿媒質内で減成されている本発明に基づく方法により
得られる高分子共役体の構成に入る重合体は、約１，０
００〜５０万の平均分子量を有する。
得られる高分子共役体の構成に入る重合体は、約１，０
００〜５０万の平均分子量を有する。
本発明に基づく方法により得られる高分子共役体の構成
には入るものの生体内で減成されない重合体は、約１０
，０００以下の平均分子量をもっていなくてはならない
。これは、この値を超えると、重合体は腎臓の関門を通
過しにくくなり、従って生体内に蓄積することになるか
らである。
には入るものの生体内で減成されない重合体は、約１０
，０００以下の平均分子量をもっていなくてはならない
。これは、この値を超えると、重合体は腎臓の関門を通
過しにくくなり、従って生体内に蓄積することになるか
らである。
これは特に、生物分解性をもたないため約１０．０００
以下の平均分子量をもっていなければならないポリアル
キレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリ
ル酸メチル、又は成る種の多糖について言えることであ
る。
以下の平均分子量をもっていなければならないポリアル
キレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリ
ル酸メチル、又は成る種の多糖について言えることであ
る。
本発明の方法によって得られた高分子共役体の構成に入
る重合体は、その中でそれが好ましくは抗原性をもたな
いような分子量の範囲内で用いられなくてはならない。
る重合体は、その中でそれが好ましくは抗原性をもたな
いような分子量の範囲内で用いられなくてはならない。
従って、デキストランの場合、その分子量は約７０．０
００未満でなくてはならない。
００未満でなくてはならない。
本発明に基づく高分子共役体の調製の第１段階であり重
合体に対し２部位を固定する作業から成る段階は、既知
の方法を用いて行なうことができる。
合体に対し２部位を固定する作業から成る段階は、既知
の方法を用いて行なうことができる。
本発明に基づ（高分子共役体の調製の第１段階は又、Ｙ
をアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル又
はハロゲンの官能基としてＺ−Ｙタイプの化合物を用い
ることによっても行なうことができる。これらのＺ−Ｙ
化合物は従来の化学的技法を利用して用いることができ
る。例えば、予めポリアミノ化された重合体上に、ベン
ゼンペンタ又はヘキサカルボキシル酸、シフオスフォロ
ー２，３グリセリン酸、ピリドキサルー５′−リン酸を
固定させることができる。
をアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル又
はハロゲンの官能基としてＺ−Ｙタイプの化合物を用い
ることによっても行なうことができる。これらのＺ−Ｙ
化合物は従来の化学的技法を利用して用いることができ
る。例えば、予めポリアミノ化された重合体上に、ベン
ゼンペンタ又はヘキサカルボキシル酸、シフオスフォロ
ー２，３グリセリン酸、ピリドキサルー５′−リン酸を
固定させることができる。
この場合、例えばゲルろ適用カラムでの脱塩などによっ
てＺ−Ｙ化合物の痕跡を全て除去することが絶対不可欠
である。実際、反応しなかった、そして本発明に基づ（
高分子共役体についてたとえ低い濃度であれ、その特性
に関する結論を誤ったものにしてしまう可能性のあるＺ
−Ｙ化合物の存在は、避けなくてはならない。
てＺ−Ｙ化合物の痕跡を全て除去することが絶対不可欠
である。実際、反応しなかった、そして本発明に基づ（
高分子共役体についてたとえ低い濃度であれ、その特性
に関する結論を誤ったものにしてしまう可能性のあるＺ
−Ｙ化合物の存在は、避けなくてはならない。
同様に、ラジカルグラフト法のような、重合体上にポリ
アニオン鎖を固定させることのできる他のあらゆる方法
を用いることができる。
アニオン鎖を固定させることのできる他のあらゆる方法
を用いることができる。
上述の第２の段階は、重合体とヘモグロビンの間の反応
段階であり、必要とあらば場合によって重合体がヘモグ
ロビンとの反応に付される前に重合体の活性化段階が先
に行なわれてもよい。しかしこの活性化は、重合体とヘ
モグロビンの間の反応とほぼ同時であってもよい。
段階であり、必要とあらば場合によって重合体がヘモグ
ロビンとの反応に付される前に重合体の活性化段階が先
に行なわれてもよい。しかしこの活性化は、重合体とヘ
モグロビンの間の反応とほぼ同時であってもよい。
第２段階の間に、重合体はヘモグロビンと反応し、一方
では重合体のＺ部位とヘモグロビンの間のイオン結合そ
して他方では重合体とヘモグロビンの間の共有結合が形
成される。
では重合体のＺ部位とヘモグロビンの間のイオン結合そ
して他方では重合体とヘモグロビンの間の共有結合が形
成される。
ヘモグロビンのＮ Ｈｚ基との共有結合に介入して（る
のがＺ部位のカルボキシル基である場合、カルボキシル
基を活性化するために、水溶性カルポジイミド特にＮ′
−エチル−Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）カル
ボジイミドの塩酸塩（ＥＤＣＩ）、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド又はエトキシ−２−キノリン−■−カルボキ
シル酸エチル（ＥＥＤＱ）といった、ペプチド合成に従
来用いられている試薬を用いることができる。
のがＺ部位のカルボキシル基である場合、カルボキシル
基を活性化するために、水溶性カルポジイミド特にＮ′
−エチル−Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）カル
ボジイミドの塩酸塩（ＥＤＣＩ）、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド又はエトキシ−２−キノリン−■−カルボキ
シル酸エチル（ＥＥＤＱ）といった、ペプチド合成に従
来用いられている試薬を用いることができる。
このとき得られる結合はアミド結合である。
ヘモグロビンのＮ ８２基との共有結合に介入するのが
２部位のアルデヒド基である場合、例えば還元性アミノ
化を利用することができる。
２部位のアルデヒド基である場合、例えば還元性アミノ
化を利用することができる。
アルデヒドの還元性アミノ化は、アミンの作用によりイ
ミンを形成し同時にＮ ａ Ｂ Ｈ４、ＮａＣＮＢＨ３
，ジメチルアミノボラン又はＨＣ００８などの還元剤を
用いてイミンをアミンに還元することから成る。
ミンを形成し同時にＮ ａ Ｂ Ｈ４、ＮａＣＮＢＨ３
，ジメチルアミノボラン又はＨＣ００８などの還元剤を
用いてイミンをアミンに還元することから成る。
このとき得られる結合はアミン結合である。
ヘモグロビンのＮＨ２基との共有結合に介入するのがＺ
部位のアルデヒド基である場合、同様に、得られる結合
がイミン結合であるような条件の下で作業することがで
き、このイミン結合は次に上述のもののうちの１つのよ
うな穏やかな還元剤での還元によりアミンに安定化させ
ることができる。
部位のアルデヒド基である場合、同様に、得られる結合
がイミン結合であるような条件の下で作業することがで
き、このイミン結合は次に上述のもののうちの１つのよ
うな穏やかな還元剤での還元によりアミンに安定化させ
ることができる。
２基がアルデヒド基もカルボキシル基も含まないものの
、隣接する炭素上にあるものを含めたヒドロキシル基を
包含している場合、例えば過ヨウ素酸酸化、特に、Ｎ
ａ Ｉ Ｏ４を用いる酸化により、アルデヒド基を形成
することができる。
、隣接する炭素上にあるものを含めたヒドロキシル基を
包含している場合、例えば過ヨウ素酸酸化、特に、Ｎ
ａ Ｉ Ｏ４を用いる酸化により、アルデヒド基を形成
することができる。
これらのアルデヒド基とヘモグロビンのアミンの間で得
られる結合は、このときイミン結合であり、これは例え
ばＮ ａ Ｂ Ｈ４による還元によりアミンに安定化さ
せることができる。
られる結合は、このときイミン結合であり、これは例え
ばＮ ａ Ｂ Ｈ４による還元によりアミンに安定化さ
せることができる。
２部位がアルデヒド基もカルボキシル基も含んでいない
ものの単数又は複数のＯＨを含んでいる場合、これらの
Ｚ部位は、カルボニルジイミダゾールのような適当な試
薬を用いてヘモグロビンのＧＨ，基に対して投入されつ
る。この場合得られる結合は、カーバメイト結合−〇−
Ｃ−ＮＨ−である。
ものの単数又は複数のＯＨを含んでいる場合、これらの
Ｚ部位は、カルボニルジイミダゾールのような適当な試
薬を用いてヘモグロビンのＧＨ，基に対して投入されつ
る。この場合得られる結合は、カーバメイト結合−〇−
Ｃ−ＮＨ−である。
重合体との共有結合がイミン結合であるようなヘモグロ
ビン高分子共役体は、生体内で安定状態にない可能性が
ある。こういう理由から、ＮａＢＨ４，ＮａＣＮＢＨ，
又はジメチルアミノボランによる還元によりイミン官能
基をアミンにて安定化させるのが良いのである。
ビン高分子共役体は、生体内で安定状態にない可能性が
ある。こういう理由から、ＮａＢＨ４，ＮａＣＮＢＨ，
又はジメチルアミノボランによる還元によりイミン官能
基をアミンにて安定化させるのが良いのである。
共有結合を安定化させる必要がある場合、ヘモグロビン
はいずれにせよ２つ以上の反応段階には付されず、又そ
の他の場合においては重合体Ｐの活性化の有無に関わら
ずヘモグロビンは唯一の反応段階に付される。反応の効
率に加えてヘモグロビンが変性されないようにするには
、ヘモグロビンに対する反応段階の数を制限すること（
最高２段階）が基本的な条件の１つであるため、このこ
とは特に有利な点である。
はいずれにせよ２つ以上の反応段階には付されず、又そ
の他の場合においては重合体Ｐの活性化の有無に関わら
ずヘモグロビンは唯一の反応段階に付される。反応の効
率に加えてヘモグロビンが変性されないようにするには
、ヘモグロビンに対する反応段階の数を制限すること（
最高２段階）が基本的な条件の１つであるため、このこ
とは特に有利な点である。
第２段階の間、本発明に基づ（高分子共役体の形成中に
ヘモグロビンが、その酸素運搬特性を少なくとも一部分
でも保持できるようこれを構成するさまざまな単位に対
する可動性の著しい減少も重大な変性も受けないことが
実際重要である。
ヘモグロビンが、その酸素運搬特性を少なくとも一部分
でも保持できるようこれを構成するさまざまな単位に対
する可動性の著しい減少も重大な変性も受けないことが
実際重要である。
第２の反応段階は、ヘモグロビンの適正な保存を確保す
る温度で、それ以上になるとメトヘモグロビンが著しく
形成される（約５％以上）ような期間より短いことが好
ましい充分な期間中、場合によっては上述のような活性
体が存在する中で、約５〜約９のｐＨの緩衝された又は
緩衝されていない水性媒質の中で行なわれる。
る温度で、それ以上になるとメトヘモグロビンが著しく
形成される（約５％以上）ような期間より短いことが好
ましい充分な期間中、場合によっては上述のような活性
体が存在する中で、約５〜約９のｐＨの緩衝された又は
緩衝されていない水性媒質の中で行なわれる。
水性媒質は、ｐＨを望ましい値で安定させるため、従来
使用されている緩衝液により緩衝される。
使用されている緩衝液により緩衝される。
反応時間は、約３℃から約３０℃の温度で約３０分から
約２０時間好ましくは約１時間から約８時間である。
約２０時間好ましくは約１時間から約８時間である。
反応時間は特に作業温度により左右される。
使用されるヘモグロビンは、酸素添加された形をしてお
り、１０％のヘモグロビン溶液を用いるのが有利である
。
り、１０％のヘモグロビン溶液を用いるのが有利である
。
重合体とヘモグロビンの間のモル濃度の比は、さらに、
ヘモグロビン分子の大部分がボリアニオン重合体と共有
結合されるようなものでな（ではならない。
ヘモグロビン分子の大部分がボリアニオン重合体と共有
結合されるようなものでな（ではならない。
例として、６．５前後のｐＨの水性媒質内で溶液状態で
約３〜３０℃の温度にて、約１０．０００〜約４０．０
００の平均分子量のデキストラン重合体混合物とヘモグ
ロビンを反応させることにより（ここでデキストランと
ヘモグロビンの間のモル濃度比は約０．５〜５である）
、本発明に基づ（高分子共役体が得られ、それについて
の例えばゲル透過によるクロマトグラフィ検査は、もは
や遊離ヘモグロビンが無くなっていることを示している
、ということを記すことができる。
約３〜３０℃の温度にて、約１０．０００〜約４０．０
００の平均分子量のデキストラン重合体混合物とヘモグ
ロビンを反応させることにより（ここでデキストランと
ヘモグロビンの間のモル濃度比は約０．５〜５である）
、本発明に基づ（高分子共役体が得られ、それについて
の例えばゲル透過によるクロマトグラフィ検査は、もは
や遊離ヘモグロビンが無くなっていることを示している
、ということを記すことができる。
有利な実施態様に従うと、本発明の方法は、重合体のＺ
部位のそれぞれ適切な基とヘモグロビンの間取外ではい
かなるイオン結合もその他の共有結合も打ち立てられる
ことがないようなものである。
部位のそれぞれ適切な基とヘモグロビンの間取外ではい
かなるイオン結合もその他の共有結合も打ち立てられる
ことがないようなものである。
本発明に基づく有利な高分子共役体の調製方法は、ヘモ
グロビンと部位の間のイオン結合を作り出すことを目的
とする負の電荷（重合体と部位の間の結合にもヘモグロ
ビンと部位の間の共有結合にも関与していないもの）の
数と性質の関係が以下のとおりであるようＩ乙Ｚ部位を
重合体Ｐ上に固定するということをその特徴とする：各
Ｚ部位に硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基
が含まれている場合、重合体の単量体１０個毎に少なく
とも１つのこのような２部位がある； Ｚ部位に硫酸塩及び／又はリン酸塩で構成されている少
なくとも２つの陰イオン基が含まれている場合、重合体
ｌ鎖につき少なくとも１つのこのようなＺ部位がある； 各Ｚ部位がカルボキシル酸塩からの陰イオン電荷を含ん
でいる場合、（ヘモグロビンと重合体の間の共有結合に
関与していない）少なくとも２つのカルボキシル酸塩基
が同−Ｚ部位上に、そして単量体５つ毎に少なくとも１
つのこのような２部位がなくてはならない。
グロビンと部位の間のイオン結合を作り出すことを目的
とする負の電荷（重合体と部位の間の結合にもヘモグロ
ビンと部位の間の共有結合にも関与していないもの）の
数と性質の関係が以下のとおりであるようＩ乙Ｚ部位を
重合体Ｐ上に固定するということをその特徴とする：各
Ｚ部位に硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基
が含まれている場合、重合体の単量体１０個毎に少なく
とも１つのこのような２部位がある； Ｚ部位に硫酸塩及び／又はリン酸塩で構成されている少
なくとも２つの陰イオン基が含まれている場合、重合体
ｌ鎖につき少なくとも１つのこのようなＺ部位がある； 各Ｚ部位がカルボキシル酸塩からの陰イオン電荷を含ん
でいる場合、（ヘモグロビンと重合体の間の共有結合に
関与していない）少なくとも２つのカルボキシル酸塩基
が同−Ｚ部位上に、そして単量体５つ毎に少なくとも１
つのこのような２部位がなくてはならない。
Ｚ部位がカルボキシル酸塩からの少なくとも３つの負の
電荷を含んでいる場合（ヘモグロビンと重合体の間の共
有結合には関与していないもの）、重合体１鎖につき少
なくとも１つのこのようなＺ部位がある。
電荷を含んでいる場合（ヘモグロビンと重合体の間の共
有結合には関与していないもの）、重合体１鎖につき少
なくとも１つのこのようなＺ部位がある。
Ｚ部位と単量体の数の関係は、重合体ｌ鎖あたり少なく
とも１つのＺ部位があると記されている場合これは重合
体のいくつかの鎖はＺ部位を全く含まずその他の鎖は２
つの部位を含んでいる可能性があることを意味している
という点で、統計的なものであるが、ヘモグロビンに対
し活性であるためには１つの重合体鎖が少なくとも１つ
のＺ部位を含んでいな（ではならないということはきわ
めて明白である。
とも１つのＺ部位があると記されている場合これは重合
体のいくつかの鎖はＺ部位を全く含まずその他の鎖は２
つの部位を含んでいる可能性があることを意味している
という点で、統計的なものであるが、ヘモグロビンに対
し活性であるためには１つの重合体鎖が少なくとも１つ
のＺ部位を含んでいな（ではならないということはきわ
めて明白である。
もう一つの有利な実施態様によると、本発明に基づ（高
分子共役体の調製方法は、ヘモグロビンと部位の間にイ
オン結合を生成することを目的とする負の電荷（重合体
と部位の間の結合にも重合体と部位の間の共有結合にも
関与していないもの）の数と性質の関係が以下のとおり
であるように重合体Ｐ上に２部位を固定することをその
特徴とする： ２部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基
を含んでいる場合、重合体の鎖１つにつき少なくとも１
つのかかるＺ部位が、そして単量体１１個毎に最高１つ
のＺ部位がある； Ｚ部位がカルボキシル酸塩から成る唯一の陰イオン基（
重合体と部位間の結合にもヘモグロビンと重合体間の共
有結合にも関与していないもの）を含んでいる場合、重
合体ｌ鎖あたり少なくとも１つのかかるＺ部位がある。
分子共役体の調製方法は、ヘモグロビンと部位の間にイ
オン結合を生成することを目的とする負の電荷（重合体
と部位の間の結合にも重合体と部位の間の共有結合にも
関与していないもの）の数と性質の関係が以下のとおり
であるように重合体Ｐ上に２部位を固定することをその
特徴とする： ２部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基
を含んでいる場合、重合体の鎖１つにつき少なくとも１
つのかかるＺ部位が、そして単量体１１個毎に最高１つ
のＺ部位がある； Ｚ部位がカルボキシル酸塩から成る唯一の陰イオン基（
重合体と部位間の結合にもヘモグロビンと重合体間の共
有結合にも関与していないもの）を含んでいる場合、重
合体ｌ鎖あたり少なくとも１つのかかるＺ部位がある。
Ｚ部位が２つのカルボキシル酸塩からの２つの陰イオン
電荷（重合体と部位の間の結合にもヘモグロビンと重合
体の間の共有結合にも関与していないもの）を含む場合
、重合体ｌ鎖につき少なくとも１つのこのようなＺ部位
、そして単量体６つ毎に１つのこのようなＺ部位がある
。
電荷（重合体と部位の間の結合にもヘモグロビンと重合
体の間の共有結合にも関与していないもの）を含む場合
、重合体ｌ鎖につき少なくとも１つのこのようなＺ部位
、そして単量体６つ毎に１つのこのようなＺ部位がある
。
本発明に基づ（方法をこの変形実施態様に従って使用す
ることによって得られたヘモグロビン共検体は、新規な
ものである。
ることによって得られたヘモグロビン共検体は、新規な
ものである。
１つの有利な実施態様に従うと、本発明に基づく方法は
、重合体Ｐとヘモグロビンの間の共有結合が、Ｚ部位に
より支持されている少なくとも１つのカルボキシル基又
はアルデヒド基又はＯＨ基と、ヘモグロビンのアロステ
リック部位内にあるヘモグロビンの少なくとも１つのア
ミン特にヘモグロビンの２つのβ末端バリンのうちの少
なくとも１つのアミンの間で打ち立てられることをその
特徴としている。
、重合体Ｐとヘモグロビンの間の共有結合が、Ｚ部位に
より支持されている少なくとも１つのカルボキシル基又
はアルデヒド基又はＯＨ基と、ヘモグロビンのアロステ
リック部位内にあるヘモグロビンの少なくとも１つのア
ミン特にヘモグロビンの２つのβ末端バリンのうちの少
なくとも１つのアミンの間で打ち立てられることをその
特徴としている。
本発明の方法の有利な一実施態様に従うと、ヘモグロビ
ンの内部ＣＯ〇−基とＮＨ，’″基の間の塩橋は、ヘモ
グロビンが脱酸された形であるとき無傷である。
ンの内部ＣＯ〇−基とＮＨ，’″基の間の塩橋は、ヘモ
グロビンが脱酸された形であるとき無傷である。
塩橋というのは、ヘモグロビンが脱酸された状態にある
時ＮＨ″″３イオンとＣＯＯ−陰イオンの間に形成され
る成る種の分子間結合のことである。
時ＮＨ″″３イオンとＣＯＯ−陰イオンの間に形成され
る成る種の分子間結合のことである。
本発明の方法によって得られた高分子共役体中の塩橋は
好ましくは無傷でなくてはならない。これは、これらの
塩橋の形成に参加するイオンが他の結合に関与している
場合、酸素添加された形から脱酸された形へのヘモグロ
ビンの移行はきわめて困難かつ不完全な形でしか行なわ
れないからである。
好ましくは無傷でなくてはならない。これは、これらの
塩橋の形成に参加するイオンが他の結合に関与している
場合、酸素添加された形から脱酸された形へのヘモグロ
ビンの移行はきわめて困難かつ不完全な形でしか行なわ
れないからである。
「無傷の塩橋」という表現は、塩橋のうち少なくとも５
０％、望ましくはその８０〜９０％ひいては１００％が
変化していないということを意味している。
０％、望ましくはその８０〜９０％ひいては１００％が
変化していないということを意味している。
塩橋が無傷であるか否かの確認を可能にする基準は特に
以下のようなものである： ａ）酸素に対する親和力曲線：酸素に対する親和力曲線
（パークロフト曲線）が遊離ヘモグロビンのものに比べ
て右方へ移動した場合、これは、塩橋が変性されなかっ
たことを意味する。
以下のようなものである： ａ）酸素に対する親和力曲線：酸素に対する親和力曲線
（パークロフト曲線）が遊離ヘモグロビンのものに比べ
て右方へ移動した場合、これは、塩橋が変性されなかっ
たことを意味する。
ｂ）ヒルの係数（ｎ）：このパラメータは、パークロフ
ト曲線のシグマ形態を表わし、酸素の固定に多少の差こ
そあれ協調的な性質を反映する。ｎの値によりヘモグロ
ビンのアロステリック挙動の永続性を評価することがで
きる。天然ヘモグロビンの場合、この係数は２７と３０
の間にある。
ト曲線のシグマ形態を表わし、酸素の固定に多少の差こ
そあれ協調的な性質を反映する。ｎの値によりヘモグロ
ビンのアロステリック挙動の永続性を評価することがで
きる。天然ヘモグロビンの場合、この係数は２７と３０
の間にある。
Ｃ）ボーア効果：これは、さまざまなｐＨにおけるヘモ
グロビンの酸素運搬挙動を決定することから成り、これ
によりさまざまな操作に続く混乱を評価することができ
る。
グロビンの酸素運搬挙動を決定することから成り、これ
によりさまざまな操作に続く混乱を評価することができ
る。
もう１つの有利な実施態様に従うと１本発明に基づく高
分子共役体は、重合体が多糖、特にそのアルキル基が２
〜４個の炭素原子を含んでいるヒドロキシアルキルでん
ぷん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体、特にア
ミノ化されたデキストラン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ポリメタクリレート及びその誘導
体、ポリペプチド、そのアルキレン基が２〜５個の炭素
原子を含んでいるポリアルキレングリコール特にポリエ
チレングリコール及びボリブロビレングノコールの中か
ら選ばれているようなものである。
分子共役体は、重合体が多糖、特にそのアルキル基が２
〜４個の炭素原子を含んでいるヒドロキシアルキルでん
ぷん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体、特にア
ミノ化されたデキストラン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ポリメタクリレート及びその誘導
体、ポリペプチド、そのアルキレン基が２〜５個の炭素
原子を含んでいるポリアルキレングリコール特にポリエ
チレングリコール及びボリブロビレングノコールの中か
ら選ばれているようなものである。
本発明に基づく方法に従って得られたヘモグロビン共役
体は、重合体とヘモグロビンの間のイオン結合が、重合
体のＺ部位のリン酸塩、硫酸塩又はカルボキシル酸塩基
とヘモグロビンのアミン基の間で打ち立てられるような
ものである。
体は、重合体とヘモグロビンの間のイオン結合が、重合
体のＺ部位のリン酸塩、硫酸塩又はカルボキシル酸塩基
とヘモグロビンのアミン基の間で打ち立てられるような
ものである。
本発明の有利な実施態様に従うと、高分子共役体は、イ
オン結合が重合体の２部位のカルボキシル酸塩基とヘモ
グロビンのＮＨ２基の間で打ち立てられるようなもので
ある。
オン結合が重合体の２部位のカルボキシル酸塩基とヘモ
グロビンのＮＨ２基の間で打ち立てられるようなもので
ある。
本発明のもう１つの有利な実施態様によると、２部位は
Ｏ２０，Ｈ又ｉ：ｔＯＰＯ３Ｈ２を有する。
Ｏ２０，Ｈ又ｉ：ｔＯＰＯ３Ｈ２を有する。
本発明のもう１つの有利な実施態様に従うと、２部位は
、ビリドキサル硫酸、二硫酸エピネフリン、三硫酸エピ
ネフリン、二硫酸ノルエピネフリン、三硫酸ノルエピネ
フリン、二硫酸フェノールフタレインから成る。
、ビリドキサル硫酸、二硫酸エピネフリン、三硫酸エピ
ネフリン、二硫酸ノルエピネフリン、三硫酸ノルエピネ
フリン、二硫酸フェノールフタレインから成る。
本発明のもう１つの有利な実施態様によると、Ｚ部位は
、ビリドキサルリン酸、アデノシン三リン酸、ホスホチ
ロシン、ホスホセリン、六リン酸イノシトール及びその
誘導体、三、四、五すン酸イノシト−ル及びその誘導体
から成る。
、ビリドキサルリン酸、アデノシン三リン酸、ホスホチ
ロシン、ホスホセリン、六リン酸イノシトール及びその
誘導体、三、四、五すン酸イノシト−ル及びその誘導体
から成る。
本発明のもう１つの有利な実施態様によると、Ｚ部位は
以下の基を有している ｃｏｏ■ ０−ＣＨ なおここでｎは１から４まで変化する。
以下の基を有している ｃｏｏ■ ０−ＣＨ なおここでｎは１から４まで変化する。
本発明のもう１つの有利な実施態様に従うと、２部位は
、以下のものから成る： 重合体とＺ部位の間の結合にもヘモグロビンと２部位の
間の共有結合にも関与しない少なくとも１つのカルボキ
シル酸塩を主鎖上に含むカルボキシル酸 重合体とＺ部位の間の結合にもヘモグロビンと２部位の
間の共有結合にも関与しない少なくとも１つのカルボキ
シル官能基を含むベンゼンカルボキシル酸、 ジホスホ２，３−グリセリン酸塩基 クエン酸 １．２．３トリカルボキシル酸プロパン（プロパン−１
，２，３−トリカルボン酸）又はテトラカルボキシル酸
ブタン（ブタンテトラカルボン酸） 本発明のもう１つの有利な実施態様によると２は、以下
のものから成る： 次の化学式のヒドロキシ−２−ホルミル−５−ホスホセ
リンベンズアミド： 又は次の化学式のホルミル−４−ホスホセリンベンズア
ミド： ＣＨａＯＰＯｉＨｔ ２を重合体に結びつけている結合の性質は、存在する反
応要素及び反応条件によって異なる。
、以下のものから成る： 重合体とＺ部位の間の結合にもヘモグロビンと２部位の
間の共有結合にも関与しない少なくとも１つのカルボキ
シル酸塩を主鎖上に含むカルボキシル酸 重合体とＺ部位の間の結合にもヘモグロビンと２部位の
間の共有結合にも関与しない少なくとも１つのカルボキ
シル官能基を含むベンゼンカルボキシル酸、 ジホスホ２，３−グリセリン酸塩基 クエン酸 １．２．３トリカルボキシル酸プロパン（プロパン−１
，２，３−トリカルボン酸）又はテトラカルボキシル酸
ブタン（ブタンテトラカルボン酸） 本発明のもう１つの有利な実施態様によると２は、以下
のものから成る： 次の化学式のヒドロキシ−２−ホルミル−５−ホスホセ
リンベンズアミド： 又は次の化学式のホルミル−４−ホスホセリンベンズア
ミド： ＣＨａＯＰＯｉＨｔ ２を重合体に結びつけている結合の性質は、存在する反
応要素及び反応条件によって異なる。
Ｚを重合体に統合する結合は、エーテル、エステル、ア
ミド又はアミン結合である。
ミド又はアミン結合である。
エーテル結合は、重合体のＯＨ基に対するクロロこはく
酸の作用又はアクリル酸のラジカルグラフトによって得
られる；アミド結合は、Ｚ基のカルボキシル酸塩基と重
合体のＮＨ，基の間の反応とそれに続く還元により得ら
れる。この最後の反応は又最初の反応と同時にでも行な
える。すなわち還元性アミノ化である。
酸の作用又はアクリル酸のラジカルグラフトによって得
られる；アミド結合は、Ｚ基のカルボキシル酸塩基と重
合体のＮＨ，基の間の反応とそれに続く還元により得ら
れる。この最後の反応は又最初の反応と同時にでも行な
える。すなわち還元性アミノ化である。
一例として挙げると、エステル結合は、以下の作用によ
って得られる： 重合体のＯＨ基に対する、無水物の形での２部位のカル
ボキシル基の作用により、 又はカルボジイミドといった凝縮剤が存在する中で重合
体のＯＨ官能基に対しＺ部位のカルボキシル基を作用さ
せることにより、 調製方法の有利な一実施態様によると、２部位がエステ
ル結合を介して重合体に結びつけられている本発明に基
づ（共役体は、以下のようにして得られる： 第１段階においては、重合体上に２部位を固定させるた
め、重合体が中で可溶性である媒質の中で、ＯＨ官能基
を含む重合体に対し、カルボキシル基が無水物の形をし
ているＺ部位を反応させる； 第２段階においては、ｐｏが約５〜約９である水性媒質
内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップリ
ングの後酸素添加された形から脱酸された形へと可逆的
に移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質
内で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複数の
Ｚ部位を含む重合体Ｐを反応させ、こうして一方では、
ヘモグロビンと重合体が有するＺ部位のうちの少なくと
も１つの間の少なくとも１つのイオン結合そして他方で
は、ヘモグロビンと重合体が有する前記同−Ｚ部位の間
の共役結合を形成させる。
って得られる： 重合体のＯＨ基に対する、無水物の形での２部位のカル
ボキシル基の作用により、 又はカルボジイミドといった凝縮剤が存在する中で重合
体のＯＨ官能基に対しＺ部位のカルボキシル基を作用さ
せることにより、 調製方法の有利な一実施態様によると、２部位がエステ
ル結合を介して重合体に結びつけられている本発明に基
づ（共役体は、以下のようにして得られる： 第１段階においては、重合体上に２部位を固定させるた
め、重合体が中で可溶性である媒質の中で、ＯＨ官能基
を含む重合体に対し、カルボキシル基が無水物の形をし
ているＺ部位を反応させる； 第２段階においては、ｐｏが約５〜約９である水性媒質
内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップリ
ングの後酸素添加された形から脱酸された形へと可逆的
に移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質
内で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複数の
Ｚ部位を含む重合体Ｐを反応させ、こうして一方では、
ヘモグロビンと重合体が有するＺ部位のうちの少なくと
も１つの間の少なくとも１つのイオン結合そして他方で
は、ヘモグロビンと重合体が有する前記同−Ｚ部位の間
の共役結合を形成させる。
調製方法のもう１つの有利な実施態様によると、Ｚ部位
がエステル結合を介して重合体に結びつけられている本
発明に基づく共役体は、以下のようにして得られる： 第１段階においては、重合体に対しＺ部位を固定させる
ためカルボイミドといった凝縮剤が存在する中で、ＯＨ
官能基を含む重合体に対しカルボキシル基を含むＺ部位
を反応させる； 第２段階においては、ｐＨが約５から約９の水性媒質内
で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップリン
グの後酸素添加された形から脱酸された形へと可逆的に
移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質内
で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複数のＺ
部位を含む重合体Ｐを反応させ、こうして一方では、ヘ
モグロビンと重合体が有するＺ部位のうちの少なくとも
１つの間の少なくとも１つのイオン結合そして他方では
ヘモグロビンと重合体が有する前記同−Ｚ部位の間の共
有結合を形成させる。
がエステル結合を介して重合体に結びつけられている本
発明に基づく共役体は、以下のようにして得られる： 第１段階においては、重合体に対しＺ部位を固定させる
ためカルボイミドといった凝縮剤が存在する中で、ＯＨ
官能基を含む重合体に対しカルボキシル基を含むＺ部位
を反応させる； 第２段階においては、ｐＨが約５から約９の水性媒質内
で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップリン
グの後酸素添加された形から脱酸された形へと可逆的に
移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質内
で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複数のＺ
部位を含む重合体Ｐを反応させ、こうして一方では、ヘ
モグロビンと重合体が有するＺ部位のうちの少なくとも
１つの間の少なくとも１つのイオン結合そして他方では
ヘモグロビンと重合体が有する前記同−Ｚ部位の間の共
有結合を形成させる。
使用されるカルボイミドは、重合体が可溶性をもつ媒質
によって異なる。重合体がポリエチレングリコールであ
る場合、水又は有機媒質の中で可溶性をもつカルボジイ
ミドを用いることができる。重合体がデキストランであ
る場合、重合体は水の中にのみ溶けつるため、使用され
るカルボジイミドはＮ′−エチル−Ｎ（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドの塩酸塩（ＥＤＣＩ）で
あると有利である。
によって異なる。重合体がポリエチレングリコールであ
る場合、水又は有機媒質の中で可溶性をもつカルボジイ
ミドを用いることができる。重合体がデキストランであ
る場合、重合体は水の中にのみ溶けつるため、使用され
るカルボジイミドはＮ′−エチル−Ｎ（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミドの塩酸塩（ＥＤＣＩ）で
あると有利である。
ＯＨ基を含む重合体の例としては、デキストラン、ポリ
エチレングリコールを挙げることができる。
エチレングリコールを挙げることができる。
「カルボキシル基が無水物の形をしているＺ部位」とい
うのは、無水物の形（−無水物）をした２つのカルボキ
シル基を含むＺ部位だけでなく、各カルボキシル基対が
無水物の形（ポリ無水物：例えば２無水物又は３無水物
）をしているような偶数のカルボキシル基対を含む２部
位のことである。
うのは、無水物の形（−無水物）をした２つのカルボキ
シル基を含むＺ部位だけでなく、各カルボキシル基対が
無水物の形（ポリ無水物：例えば２無水物又は３無水物
）をしているような偶数のカルボキシル基対を含む２部
位のことである。
カルボキシル基が無水物の形をしているＺ部位の例とし
ては、ｌ、２，４．５テトラカルボキシルベンゼン２無
水物、ｌ、２．４トリカルボキシルベンゼン無水物とい
ったポリカルボン酸の無水物の他に、１．２．３．４テ
トラカルボキシルシクロブタン２無水物、テトラカルボ
キシルベンゾフェノン２無水物、テトラカルボキシルベ
ンゾフェノン２無水物、アコニット酸無水物を挙げるこ
とができる。
ては、ｌ、２，４．５テトラカルボキシルベンゼン２無
水物、ｌ、２．４トリカルボキシルベンゼン無水物とい
ったポリカルボン酸の無水物の他に、１．２．３．４テ
トラカルボキシルシクロブタン２無水物、テトラカルボ
キシルベンゾフェノン２無水物、テトラカルボキシルベ
ンゾフェノン２無水物、アコニット酸無水物を挙げるこ
とができる。
本発明に基づく方法は、有利なことにＺ部位として、無
水物官能基の１つのカルボキシル基の１つがヘモグロビ
ンと重合体の間の共有結合に関与し、その他のカルボキ
シル基（無水物官能基から成るものも含む）はＺ部位と
ヘモグロビンの間の共有結合及びイオン結合に用いられ
るような、ポリカルボキシル酸の２無水物を利用してい
る。
水物官能基の１つのカルボキシル基の１つがヘモグロビ
ンと重合体の間の共有結合に関与し、その他のカルボキ
シル基（無水物官能基から成るものも含む）はＺ部位と
ヘモグロビンの間の共有結合及びイオン結合に用いられ
るような、ポリカルボキシル酸の２無水物を利用してい
る。
又有利なことに本発明に基づく方法は、以下の式の化合
物を使用する 又は 重合体がデキストランである場合、上で問題にされてい
た第１段階に行なう媒質は、水である。
物を使用する 又は 重合体がデキストランである場合、上で問題にされてい
た第１段階に行なう媒質は、水である。
重合体がポリエチレングリコールである場合、媒質は水
であってもよいし、又ジメチルホルムアミドのような有
機媒質であってもよい。
であってもよいし、又ジメチルホルムアミドのような有
機媒質であってもよい。
重合体とヘモグロビンの間の共有結合は、ヘモグロビン
のＮ ＨＫ基と、Ｚ部位上にあるカルボキシル、アルデ
ヒド又はＯＨ基の間で打ち立てられる。
のＮ ＨＫ基と、Ｚ部位上にあるカルボキシル、アルデ
ヒド又はＯＨ基の間で打ち立てられる。
重合体とヘモグロビンの間の共有結合は、アミド、イミ
ン、アミン又はカーバメート結合である。
ン、アミン又はカーバメート結合である。
本発明の特に有利な一実施態様によると、共有結合は、
重合体のＺ部位のカルボキシル基とベモグロビンのＮ
８２基の間で打ち立てられる。
重合体のＺ部位のカルボキシル基とベモグロビンのＮ
８２基の間で打ち立てられる。
有利な一実施態様によると、本発明に基づ（方法は、約
４０，０００の分子量のアミノ化されたデキストランと
デキストラン１ｇあたり約２・１０−４モルのベンゼン
ヘキサカルボキシル酸を用いたヘモグロビン共役体の調
製に関するものである。なおここで イオン結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸
の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたベンゼ
ンペンタカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩基を介し
て打ち立てられる； 又、共有結合は、重合体とベンゼンへフサカルボキシル
酸の間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベン
ゼンペンタカルボキシル酸のその他のカルボキシル基と
ヘモグロビンのＮ Ｈｚ基の間で打ち立てられる。
４０，０００の分子量のアミノ化されたデキストランと
デキストラン１ｇあたり約２・１０−４モルのベンゼン
ヘキサカルボキシル酸を用いたヘモグロビン共役体の調
製に関するものである。なおここで イオン結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸
の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたベンゼ
ンペンタカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩基を介し
て打ち立てられる； 又、共有結合は、重合体とベンゼンへフサカルボキシル
酸の間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベン
ゼンペンタカルボキシル酸のその他のカルボキシル基と
ヘモグロビンのＮ Ｈｚ基の間で打ち立てられる。
有利な一実施態様に従うと、本発明に基づく方法は、約
１０．０００の分子量のアミノ化されたデキストランと
デキストラン１ｇあたり約３．５Ｘ１０−’モルのベン
ゼンヘキサカルボキシル酸を用いたヘモグロビン共役体
の調製方法に関するものである。なおここで イオン結合は、ベンゼンヘキサカルボキシル酸と重合体
の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたベンゼ
ンカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩基を介して打ち
立てられる。
１０．０００の分子量のアミノ化されたデキストランと
デキストラン１ｇあたり約３．５Ｘ１０−’モルのベン
ゼンヘキサカルボキシル酸を用いたヘモグロビン共役体
の調製方法に関するものである。なおここで イオン結合は、ベンゼンヘキサカルボキシル酸と重合体
の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたベンゼ
ンカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩基を介して打ち
立てられる。
又共有結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸
の間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベンゼ
ンペンタカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘ
モグロビンのＮＨ，基の間で打ち立てられる。
の間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベンゼ
ンペンタカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘ
モグロビンのＮＨ，基の間で打ち立てられる。
有利な一実施態様に従うと、本発明に基づく方法は、約
１０．０００の分子量のアミノ化されたデキストランと
デキストラン１ｇあたり約３．２ｘｌＯ−’モルのベン
ゼンテトラカルボキシル（酸？）を用いたヘモグロビン
共役体の調製に関するものである。なおここで、 イオン結合は、ベンゼンテトラカルボキシル酸と重合体
の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたベンゼ
ントリカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩基を介して
打ち立てられる： 又共有結合は、重合体とベンゼンテトラカルボキシル酸
の間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベンゼ
ントリカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘモ
グロビンのＮＨ。
１０．０００の分子量のアミノ化されたデキストランと
デキストラン１ｇあたり約３．２ｘｌＯ−’モルのベン
ゼンテトラカルボキシル（酸？）を用いたヘモグロビン
共役体の調製に関するものである。なおここで、 イオン結合は、ベンゼンテトラカルボキシル酸と重合体
の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたベンゼ
ントリカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩基を介して
打ち立てられる： 又共有結合は、重合体とベンゼンテトラカルボキシル酸
の間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベンゼ
ントリカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘモ
グロビンのＮＨ。
基の間で打ち立てられる。
有利な一実施態様に従うと、本発明に基づく方法は、約
１０．０００の分子量のアミン化されたデキストランと
重合体１ｇあたり約４・ｉｏ−’モルのブタントリカル
ボン酸を用いたヘモグロビン共役体の調製に関するもの
である。なおここで イオン結合は、重合体とブタンテトラカルボキシル酸の
間の結合に関与しない重合体上に固定されたブタントリ
カルボキシル酸塩のカルボキシル基を介して打ち立てら
れる： 又、共有結合は、重合体とブタンテトラカルボキシル酸
の間の結合にも上記イオン結合にも関与しないブタント
リカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘモグロ
ビンのＮ Ｈａ基の間で打ち立てられる。
１０．０００の分子量のアミン化されたデキストランと
重合体１ｇあたり約４・ｉｏ−’モルのブタントリカル
ボン酸を用いたヘモグロビン共役体の調製に関するもの
である。なおここで イオン結合は、重合体とブタンテトラカルボキシル酸の
間の結合に関与しない重合体上に固定されたブタントリ
カルボキシル酸塩のカルボキシル基を介して打ち立てら
れる： 又、共有結合は、重合体とブタンテトラカルボキシル酸
の間の結合にも上記イオン結合にも関与しないブタント
リカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘモグロ
ビンのＮ Ｈａ基の間で打ち立てられる。
有利な一実施態様に従うと、本発明の方法は、約５，０
００の分子量の一アミノ化されたモノメトオキシポリオ
キシエチレン及び重合体１ｇあたり約１．５Ｘ１０−’
モルのベンゼンヘキサカルボキシル（酸？）を用いたヘ
モグロビン共役体の調製に関するものである。なおここ
で、 イオン結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸
と重合体の間の結合に関与しない、重合体上に固定され
たベンゼンペンタカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩
基を介して打ち立てられ、 共有結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸の
間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベンゼン
ペンタカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘモ
グロビンのＮＨ童基の間で打ち立てられる。
００の分子量の一アミノ化されたモノメトオキシポリオ
キシエチレン及び重合体１ｇあたり約１．５Ｘ１０−’
モルのベンゼンヘキサカルボキシル（酸？）を用いたヘ
モグロビン共役体の調製に関するものである。なおここ
で、 イオン結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸
と重合体の間の結合に関与しない、重合体上に固定され
たベンゼンペンタカルボキシル酸塩のカルボキシル酸塩
基を介して打ち立てられ、 共有結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボキシル酸の
間の結合にも上述のイオン結合にも関与しないベンゼン
ペンタカルボキシル酸のその他のカルボキシル基とヘモ
グロビンのＮＨ童基の間で打ち立てられる。
有利な一実施態様に従うと、本発明に基づく方法は、約
１０．０００の分子量のデキストランと重合体１ｇにつ
き約６．３Ｘ１０−’モルのベンゼン−１，２，４１−
リカルボン酸を用いたヘモグロビン共役体の調製に関す
るものである。なおここで、 イオン結合は、重合体とベンゼン−１，２゜４トリカル
ボキシル酸（カルボン酸）の間の結合には関与しない、
重合体上に固定されたベンゼンジカルボキシル酸塩のカ
ルボキシル酸塩基を介して打ち立てられ、 共有結合は、重合体とベンゼン−１，２，４トリカルボ
キシル酸と重合体の間の結合にも上記イオン結合にも関
与しないベンゼンジカルボキシル酸のその他のカルボキ
シル基とヘモグロビンのＮ８２基の間で打ち立てられる
。
１０．０００の分子量のデキストランと重合体１ｇにつ
き約６．３Ｘ１０−’モルのベンゼン−１，２，４１−
リカルボン酸を用いたヘモグロビン共役体の調製に関す
るものである。なおここで、 イオン結合は、重合体とベンゼン−１，２゜４トリカル
ボキシル酸（カルボン酸）の間の結合には関与しない、
重合体上に固定されたベンゼンジカルボキシル酸塩のカ
ルボキシル酸塩基を介して打ち立てられ、 共有結合は、重合体とベンゼン−１，２，４トリカルボ
キシル酸と重合体の間の結合にも上記イオン結合にも関
与しないベンゼンジカルボキシル酸のその他のカルボキ
シル基とヘモグロビンのＮ８２基の間で打ち立てられる
。
有利な一実施態様に従うと、本発明に基づく方法は、約
１０．０００の分子量のデキストランと重合体１ｇあた
り約１．１５Ｘｌｏ−”モルのベンゼン−１，２，４，
５テトラカルボン酸を用いたヘモグロビン共役体の調製
に関するものである。なおここで、 イオン結合は、重合体とベンゼン−１，２゜４．５テト
ラカルボキシル酸と重合体の間の結合に関与しない、重
合体上に固定されたベンゼントリカルボキシル酸塩のカ
ルボキシル酸塩基を介して打ち立てられ、 共有結合は、重合体とベンゼン−１，２４，５テトラカ
ルボキシル酸の間の結合にも上述のイオン結合にも関与
しないベンゼントノカルボキシル酸のその他のカルボキ
シル基とヘモグロビンのＮ８２基の間で打ち立てられる
。
１０．０００の分子量のデキストランと重合体１ｇあた
り約１．１５Ｘｌｏ−”モルのベンゼン−１，２，４，
５テトラカルボン酸を用いたヘモグロビン共役体の調製
に関するものである。なおここで、 イオン結合は、重合体とベンゼン−１，２゜４．５テト
ラカルボキシル酸と重合体の間の結合に関与しない、重
合体上に固定されたベンゼントリカルボキシル酸塩のカ
ルボキシル酸塩基を介して打ち立てられ、 共有結合は、重合体とベンゼン−１，２４，５テトラカ
ルボキシル酸の間の結合にも上述のイオン結合にも関与
しないベンゼントノカルボキシル酸のその他のカルボキ
シル基とヘモグロビンのＮ８２基の間で打ち立てられる
。
本発明の方法により得られた高分子共役体は、メトヘモ
グロビンを全く又はほとんど（約５％未満）形成するこ
となく容易に合成することができ、ヘモグロビンに対す
る限られた数の反応しか関与しないためその変性が避け
られるという利点を呈している。
グロビンを全く又はほとんど（約５％未満）形成するこ
となく容易に合成することができ、ヘモグロビンに対す
る限られた数の反応しか関与しないためその変性が避け
られるという利点を呈している。
一方、本発明の方法により得られた高分子共役体は、試
験管内実験においてはＰ ｓｏの増大をひき起こすが生
体内での試験中腎臓外又は血管外の拡散により容易に除
去することができその効果が急速に消滅するような結合
していない低分子量のエフェクタを包含していない。
験管内実験においてはＰ ｓｏの増大をひき起こすが生
体内での試験中腎臓外又は血管外の拡散により容易に除
去することができその効果が急速に消滅するような結合
していない低分子量のエフェクタを包含していない。
本発明の方法により得られた高分子共役体は、酸素に対
し適度な親和力しかもたず、高い流体力学的容積をもつ
ため輸血作業中面色素尿症の抑制によりヘモグロビンの
血管内持続性を増大する、という利点をもつ。
し適度な親和力しかもたず、高い流体力学的容積をもつ
ため輸血作業中面色素尿症の抑制によりヘモグロビンの
血管内持続性を増大する、という利点をもつ。
本発明に従って調製されたポリアニオン重合体に不可逆
的に結びついたヘモグロビン共役体は、適当な組成の水
溶液中に溶解した場合、特に輸血又は器官の潅流を必要
とする手術において、代用血液としての役割を果たすこ
とができる。
的に結びついたヘモグロビン共役体は、適当な組成の水
溶液中に溶解した場合、特に輸血又は器官の潅流を必要
とする手術において、代用血液としての役割を果たすこ
とができる。
従って本発明は、上述の方法に従って得られた共役体を
内含する水溶液特に例えばタイロード圧液（その組成は
ＮａＣｌ２ ８ｇ／ｆｆ＋ＫＣ（２０，２ｇ／Ｑ ：
ＣａＣｆｆ２０．２ｇ／（２； ＭｇＣｆｆｚ ｏ、
１．ｇ／ Ｉ２： ＮａＨａ ＰＯ−０，０５／４２
： ＮａＨＣＯｓ １ｇ／ｊ２ ； Ｄ−グルコース
’＝ ｇ／Ｉ２）に対する長時間にわたる透析そしてヘ
モグロビンに関し約７％の濃度が得られるまでの限外ろ
過による濃縮によって血液と等張にさせられた溶液をも
その目的としている。
内含する水溶液特に例えばタイロード圧液（その組成は
ＮａＣｌ２ ８ｇ／ｆｆ＋ＫＣ（２０，２ｇ／Ｑ ：
ＣａＣｆｆ２０．２ｇ／（２； ＭｇＣｆｆｚ ｏ、
１．ｇ／ Ｉ２： ＮａＨａ ＰＯ−０，０５／４２
： ＮａＨＣＯｓ １ｇ／ｊ２ ； Ｄ−グルコース
’＝ ｇ／Ｉ２）に対する長時間にわたる透析そしてヘ
モグロビンに関し約７％の濃度が得られるまでの限外ろ
過による濃縮によって血液と等張にさせられた溶液をも
その目的としている。
本発明に基づく方法によって得られたヘモグロビンの高
分子共役体調製物は、潜在的な酸素輸送因子として検査
された。そしてこれらの調製物が実際可逆的に酸素を固
定することができ特に遊離ヘモグロビンよりもさらに容
易に酸素を放出できるものであることを示すことができ
た。このことは、以下の例１．３及び５内に記され以下
にコメントを付している第５図に表わされたこれらの物
質の酸素に対する親和力の曲線をみればわかる。実際、
これらの調製物は、きわめて高いものでありうる（９０
０〜５，０００Ｐａ）半飽和圧力（Ｐｌｌｏ）により特
徴づけられる。ちなみに、同じ条件（ＮａＣｆｆ ０
．０５Ｍ、ｐＨ７，２５℃）での天然ヘモグロビンのＰ
５゜は約４８０ Ｐａに等しい。
分子共役体調製物は、潜在的な酸素輸送因子として検査
された。そしてこれらの調製物が実際可逆的に酸素を固
定することができ特に遊離ヘモグロビンよりもさらに容
易に酸素を放出できるものであることを示すことができ
た。このことは、以下の例１．３及び５内に記され以下
にコメントを付している第５図に表わされたこれらの物
質の酸素に対する親和力の曲線をみればわかる。実際、
これらの調製物は、きわめて高いものでありうる（９０
０〜５，０００Ｐａ）半飽和圧力（Ｐｌｌｏ）により特
徴づけられる。ちなみに、同じ条件（ＮａＣｆｆ ０
．０５Ｍ、ｐＨ７，２５℃）での天然ヘモグロビンのＰ
５゜は約４８０ Ｐａに等しい。
従ってこれらの化合物は、大量の酸素を乏血した組織に
供給するために用いることができる。これらは又、輸血
においても用いることができ、賦形剤が存在する状態又
はしない状態で、血液と等張化された水溶液の形で患者
に投与することができる。これらの化合物は又低温保護
剤が存在する又はしない状態で凍結乾燥又は微粒化させ
、使用前に水中に再度溶解させることもできる。
供給するために用いることができる。これらは又、輸血
においても用いることができ、賦形剤が存在する状態又
はしない状態で、血液と等張化された水溶液の形で患者
に投与することができる。これらの化合物は又低温保護
剤が存在する又はしない状態で凍結乾燥又は微粒化させ
、使用前に水中に再度溶解させることもできる。
本発明の方法により得られた高分子共役体は、以下に示
されているようにマウスを用いて急性毒性に対し相対的
にテストされた。
されているようにマウスを用いて急性毒性に対し相対的
にテストされた。
例中に記されているさまざまなポリアニオン重合体は、
以下の条件の下で５ＷＩＳＳ系のマウスに対し注射した
：重合体は、２．５ｇ／βから５ｇ／βの濃度で精製水
中に溶解させ、ｐＨを７．４に調製した。
以下の条件の下で５ＷＩＳＳ系のマウスに対し注射した
：重合体は、２．５ｇ／βから５ｇ／βの濃度で精製水
中に溶解させ、ｐＨを７．４に調製した。
次に各溶液を０．５ｍ／、５匹のマウスに対し腹腔内注
射し、その後これらのマウスの挙動を７日間にわたり観
察した。これらの試験によってもいがなる急性毒性の徴
候も見られなかった。
射し、その後これらのマウスの挙動を７日間にわたり観
察した。これらの試験によってもいがなる急性毒性の徴
候も見られなかった。
本発明はさらに、遊離ヘモグロビンのものよりも低い酸
素親和力を呈し、それが血漿内で酸素運搬機能を果たさ
な（ではならない時間中全く又はほとんど生物分解性を
もたない、以下のことを特徴とする新しいヘモグロビン
共役体をもその目的としている： それが一方では、脱酸された形から酸素添加された形へ
と可逆的に移行することのできるヘモグロビン、そして
他方では、単数又は複数の極性基好ましくはヒドロキシ
ル基、カルボキシル基又はアミン基を含む分子量約１，
０００〜５０万好ましくは約１，０００〜１０万の、非
抗原性で血球適合型のものであることが望ましい水溶性
、無毒の重合体によって構成されている； かかる重合体には、硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸
塩の基から選ばれた少なくとも１つの基により支持され
重合体とのイオン結合を作り上げることを目的とする負
の電荷を少なくとも１つ含み、又ヘモグロビンとの共有
結合を作り上げることを目的とする少なくとも１つのカ
ルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含んでいる単
数又は複数のＺ部位がついている；重合体Ｐは、 ・一方では重合体が有するＺ部位の少なくとも１つの負
の電荷とヘモグロビンの間に打ち立てられる少なくとも
１つのイオン結合を介して、 ・他方では、重合体Ｐが有する前記２部位のカルボキシ
ル基、アルデヒド基又はＯＨ基のうちの少なくとも１つ
とヘモグロビンの間に打ち立てられる少なくとも１つの
共有結合を介して、 ヘモグロビンに結びつけられている： 重合体とヘモグロビンの間の共有結合 の数は、高分子共役体の平均分子量が約７０．０００か
ら約１００万好ましくは約７０．０００から約５０万と
なるようなものであり、負の電荷の性質及び数、部位の
数及び単量体の数の関係は以下のとおりである：・Ｚ部
位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基を含
む場合には、重合体一鎖あたり少なくとも１つのかかる
Ｚ部位、そして単量体１１個毎に最高１つのかかるＺ部
位がある。
素親和力を呈し、それが血漿内で酸素運搬機能を果たさ
な（ではならない時間中全く又はほとんど生物分解性を
もたない、以下のことを特徴とする新しいヘモグロビン
共役体をもその目的としている： それが一方では、脱酸された形から酸素添加された形へ
と可逆的に移行することのできるヘモグロビン、そして
他方では、単数又は複数の極性基好ましくはヒドロキシ
ル基、カルボキシル基又はアミン基を含む分子量約１，
０００〜５０万好ましくは約１，０００〜１０万の、非
抗原性で血球適合型のものであることが望ましい水溶性
、無毒の重合体によって構成されている； かかる重合体には、硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸
塩の基から選ばれた少なくとも１つの基により支持され
重合体とのイオン結合を作り上げることを目的とする負
の電荷を少なくとも１つ含み、又ヘモグロビンとの共有
結合を作り上げることを目的とする少なくとも１つのカ
ルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含んでいる単
数又は複数のＺ部位がついている；重合体Ｐは、 ・一方では重合体が有するＺ部位の少なくとも１つの負
の電荷とヘモグロビンの間に打ち立てられる少なくとも
１つのイオン結合を介して、 ・他方では、重合体Ｐが有する前記２部位のカルボキシ
ル基、アルデヒド基又はＯＨ基のうちの少なくとも１つ
とヘモグロビンの間に打ち立てられる少なくとも１つの
共有結合を介して、 ヘモグロビンに結びつけられている： 重合体とヘモグロビンの間の共有結合 の数は、高分子共役体の平均分子量が約７０．０００か
ら約１００万好ましくは約７０．０００から約５０万と
なるようなものであり、負の電荷の性質及び数、部位の
数及び単量体の数の関係は以下のとおりである：・Ｚ部
位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基を含
む場合には、重合体一鎖あたり少なくとも１つのかかる
Ｚ部位、そして単量体１１個毎に最高１つのかかるＺ部
位がある。
・Ｚ部位が、部位と重合体の間の結合にもヘモグロビン
と重合体の間の共有結合にも関与しないカルボキシル酸
塩１つから成る唯一の陰イオン基を含む場合、重合体一
鎖につき少なくとも１つのかかるＺ部位がある； Ｚ部位が、２つのカルボキシル酸塩から（る２つの陰イ
オン電荷を含む場合、重合体一鎖につき少なくとも１つ
のかかるＺ部位及び６つの単量体毎に最高１つの２部位
がある。
と重合体の間の共有結合にも関与しないカルボキシル酸
塩１つから成る唯一の陰イオン基を含む場合、重合体一
鎖につき少なくとも１つのかかるＺ部位がある； Ｚ部位が、２つのカルボキシル酸塩から（る２つの陰イ
オン電荷を含む場合、重合体一鎖につき少なくとも１つ
のかかるＺ部位及び６つの単量体毎に最高１つの２部位
がある。
このクラスの本発明に基づ（新しい高分子共役体は、特
に以下のことをその特徴とする：イオン結合のうちの少
なくとも１つ及び供給結合のうちの少なくとも１つが同
一のＺ部位の上にある適当なそれぞれの基を用いて打ち
立てられていること。
に以下のことをその特徴とする：イオン結合のうちの少
なくとも１つ及び供給結合のうちの少なくとも１つが同
一のＺ部位の上にある適当なそれぞれの基を用いて打ち
立てられていること。
そして、重合体一鎖につき上述の２部位が少なくとも唯
１つあること：換言すると、重合体一鎖につき上述のＺ
部位が唯１つで充分であること。
１つあること：換言すると、重合体一鎖につき上述のＺ
部位が唯１つで充分であること。
このクラスの新しい高分子共役体が、興味深い酸素運搬
特性を呈するのに対して、２部位上の陰イオン電荷の数
、性質及び重合体１鎖あたりのＺ部位の数の間の条件は
同じであるものの共有結合が（陰イオン基をもつ）Ｚ部
位上にないカルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基と
の間で打ち立てられるという点で上述の共役体とは異な
っているヘモグロビン高分子共役体は、はとんど又は全
く関心に値しない酸素運搬特性を呈する。
特性を呈するのに対して、２部位上の陰イオン電荷の数
、性質及び重合体１鎖あたりのＺ部位の数の間の条件は
同じであるものの共有結合が（陰イオン基をもつ）Ｚ部
位上にないカルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基と
の間で打ち立てられるという点で上述の共役体とは異な
っているヘモグロビン高分子共役体は、はとんど又は全
く関心に値しない酸素運搬特性を呈する。
本発明の有利な一実施態様によると、ヘモグロビンと重
合体の間の共有結合に介入する全てのＺ部位は、ヘモグ
ロビンと重合体の間のイオン結合に介入するＺ部位と同
じである。
合体の間の共有結合に介入する全てのＺ部位は、ヘモグ
ロビンと重合体の間のイオン結合に介入するＺ部位と同
じである。
本発明に基づくヘモグロビン高分子共役体の有利な１ク
ラスは、ヘモグロビンと重合体Ｐの開の共役結合がＺ部
位により支持されている少なくとも１つのカルボキシル
基又はアルデヒド基又はＯＨ基と、ヘモグロビンのアロ
ステリック部位内にあるヘモグロビンの少なくとも１つ
のアミン特にヘモグロビンの２つのβ末端バリンのうち
の少なくとも１つのアミンの間で打ち立てられているよ
うな高分子共役体で構成されている。
ラスは、ヘモグロビンと重合体Ｐの開の共役結合がＺ部
位により支持されている少なくとも１つのカルボキシル
基又はアルデヒド基又はＯＨ基と、ヘモグロビンのアロ
ステリック部位内にあるヘモグロビンの少なくとも１つ
のアミン特にヘモグロビンの２つのβ末端バリンのうち
の少なくとも１つのアミンの間で打ち立てられているよ
うな高分子共役体で構成されている。
本発明に基づくヘモグロビンの高分子共役体のもう１つ
の有利なりラスは、ヘモグロビンの内部のＣＯＯ−基と
ＮＨ，”基の間の塩橋が、そのヘモグロビンが脱酸され
た形にあるとき無傷であるような高分子共役体で構成さ
れている。
の有利なりラスは、ヘモグロビンの内部のＣＯＯ−基と
ＮＨ，”基の間の塩橋が、そのヘモグロビンが脱酸され
た形にあるとき無傷であるような高分子共役体で構成さ
れている。
本発明に基づくヘモグロビンの高分子共役体のもう１つ
の有利なりラスは、重合体Ｐが多糖、特にそのアルキル
基が２〜４個の炭素原子を含んでいるヒドロキシアルキ
ルでんぷん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体、
特にアミノ化されたデキストラン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリメタクリル酸塩及びそ
の誘導体、ポリペプチド、そのアルキレン基が２〜５個
の炭素原子を含んでいるポリアルキレングリコール、特
にポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコー
ルの中から選ばれているような高分子共役体で構成され
ている。
の有利なりラスは、重合体Ｐが多糖、特にそのアルキル
基が２〜４個の炭素原子を含んでいるヒドロキシアルキ
ルでんぷん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体、
特にアミノ化されたデキストラン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリメタクリル酸塩及びそ
の誘導体、ポリペプチド、そのアルキレン基が２〜５個
の炭素原子を含んでいるポリアルキレングリコール、特
にポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコー
ルの中から選ばれているような高分子共役体で構成され
ている。
本発明に基づく高分子共役体のもう１つの有利なりラス
は、重合体Ｐの平均分子量が、それがデキストラン及び
その誘導体から成る場合には７０．０００以下であり、
それがポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリド
ン又はポリアクリル酸メヂルの中から選ばれている場合
には１０．０００以下であるような高分子共役体で構成
されている。
は、重合体Ｐの平均分子量が、それがデキストラン及び
その誘導体から成る場合には７０．０００以下であり、
それがポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリド
ン又はポリアクリル酸メヂルの中から選ばれている場合
には１０．０００以下であるような高分子共役体で構成
されている。
本発明に基づく高分子共役体のもう１つの有利なりラス
は、Ｚ部位がエステル、エーテル、アミド又はアミン官
能基を介して重合体に結びつけられているような高分子
共役体で構成されている。
は、Ｚ部位がエステル、エーテル、アミド又はアミン官
能基を介して重合体に結びつけられているような高分子
共役体で構成されている。
本発明に基づく高分子共役体のもう１つの有＋１１なり
う又は、Ｚ部位がＯ２０，Ｈ，０ＰＯ３Ｈ，、０−ＧＨ
ｆＣＯＯｌ（＋２基（なおｎは１から約４まで変化する
）を含むか又は、ビリドキサル硫酸、ビリドキサルリン
酸、アデノシン三リン酸、ホスホチロシン、ホスホセノ
ン、六リン酸イノシトール及びその誘導体、主鎖上に２
〜１０個の炭素原子を含むポリカルボキシル酸、少なく
とも３つのカルボキシル官能基を含むベンゼンカルボキ
シル酸、２．３−ジホスホグリセリン酸塩からきている
ような高分子共役体で構成されている。
う又は、Ｚ部位がＯ２０，Ｈ，０ＰＯ３Ｈ，、０−ＧＨ
ｆＣＯＯｌ（＋２基（なおｎは１から約４まで変化する
）を含むか又は、ビリドキサル硫酸、ビリドキサルリン
酸、アデノシン三リン酸、ホスホチロシン、ホスホセノ
ン、六リン酸イノシトール及びその誘導体、主鎖上に２
〜１０個の炭素原子を含むポリカルボキシル酸、少なく
とも３つのカルボキシル官能基を含むベンゼンカルボキ
シル酸、２．３−ジホスホグリセリン酸塩からきている
ような高分子共役体で構成されている。
本発明に基づく化合物のもう１つの有利なりラスは、重
合体のＺ部位のそれぞれ適当な基とヘモグロビンの間取
外いかなるイオン結合も共有結合も打ち立てられ得ない
ような化合物で構成されている。
合体のＺ部位のそれぞれ適当な基とヘモグロビンの間取
外いかなるイオン結合も共有結合も打ち立てられ得ない
ような化合物で構成されている。
本発明に基づく高分子共役体のもう１つの有利なりラス
は、ヘモグロビンと重合体の間の共有結合が重合体上に
固定されたＺ部位からくるカルボキシル基とヘモグロビ
ンのＮ Ｈ２基を用いて打ち立てられているような高分
子共役体で構成されている。
は、ヘモグロビンと重合体の間の共有結合が重合体上に
固定されたＺ部位からくるカルボキシル基とヘモグロビ
ンのＮ Ｈ２基を用いて打ち立てられているような高分
子共役体で構成されている。
本発明に基づ（高分子共役体のもう１つの有利なりラス
は、重合体Ｐとヘモグロビンの間のイオン結合がＺ部位
のカルボキシル酸塩基とヘモグロビンの間で打ち立てら
れているような高分子共役体で構成されている。
は、重合体Ｐとヘモグロビンの間のイオン結合がＺ部位
のカルボキシル酸塩基とヘモグロビンの間で打ち立てら
れているような高分子共役体で構成されている。
上述の新しい方法から得られた高分子共役体に関してこ
れまで言われてきたことは全て、本発明に基づく高分子
共役体に特にあてはまることである。
れまで言われてきたことは全て、本発明に基づく高分子
共役体に特にあてはまることである。
本発明に基づく新しい高分子共役体は、オキシヘモグロ
ビンを使用する方法又はデオキシヘモグロビンを使用す
る方法を用いて得ることができる。
ビンを使用する方法又はデオキシヘモグロビンを使用す
る方法を用いて得ることができる。
本発明に基づ（ヘモグロビン共役体は、以下のようにし
て得ることができる： 第１段階において、以下のような比率で重合体Ｐの上に
、ヘモグロビンとイオン結合を生成することを目的とす
るイオン基を含むＺ部位を固定する： Ｚ部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基
を含む場合、重合体１鎖につき少なくとも１つのかかる
Ｚ部位、そして単量体１１個毎に最高１つのかかるＺ部
位がある。
て得ることができる： 第１段階において、以下のような比率で重合体Ｐの上に
、ヘモグロビンとイオン結合を生成することを目的とす
るイオン基を含むＺ部位を固定する： Ｚ部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基
を含む場合、重合体１鎖につき少なくとも１つのかかる
Ｚ部位、そして単量体１１個毎に最高１つのかかるＺ部
位がある。
Ｚ部位が、重合体と部位の間の結合にもヘモグロビンと
重合体の間の結合にも関与しない１つのカルボキシル酸
塩基から成る唯一の陰イオン基を含む場合、重合体一鎖
あたり少なくとも１つのかかるＺ部位がある。
重合体の間の結合にも関与しない１つのカルボキシル酸
塩基から成る唯一の陰イオン基を含む場合、重合体一鎖
あたり少なくとも１つのかかるＺ部位がある。
２部位が、重合体と部位の間の結合にも重合体とヘモグ
ロビンの間の共有結合にも関与しない２つのカルボキシ
ル酸塩基からくる２つの陰イオン電荷を含む場合、重合
体ｌ鎖あたり少なくとも１つのかかる２部位がそして６
つの単量体毎に最高１つのかかるＺ部位がある。
ロビンの間の共有結合にも関与しない２つのカルボキシ
ル酸塩基からくる２つの陰イオン電荷を含む場合、重合
体ｌ鎖あたり少なくとも１つのかかる２部位がそして６
つの単量体毎に最高１つのかかるＺ部位がある。
なおここで、重合体Ｐは、複数の極性基好ましくはヒド
ロキシル基、カルボキシル基又はアミン基を含み分子量
が約１，０００〜５０万好ましくは約１，０００から約
１０万の水溶性、無毒好ましくは非抗原性で血球適合性
のあるものであり、Ｚ部位は、一方では硫酸塩及び／又
はリン酸塩及び／又はカルボキシル酸塩基がもっている
少なくとも１つの電荷を含み、他方では少なくとも１つ
のカルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含む。
ロキシル基、カルボキシル基又はアミン基を含み分子量
が約１，０００〜５０万好ましくは約１，０００から約
１０万の水溶性、無毒好ましくは非抗原性で血球適合性
のあるものであり、Ｚ部位は、一方では硫酸塩及び／又
はリン酸塩及び／又はカルボキシル酸塩基がもっている
少なくとも１つの電荷を含み、他方では少なくとも１つ
のカルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含む。
なおかかる固定は以下の方法のいずれかで行なわれる：
Ｙをアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル
又はハロゲンといった活性の又は活性化可能な１つの官
能基として、Ｚ−Ｙ化合物を用いることにより、 又は、重合体Ｐに対しＺ部位のラジカルグラフトを行な
うことにより。
又はハロゲンといった活性の又は活性化可能な１つの官
能基として、Ｚ−Ｙ化合物を用いることにより、 又は、重合体Ｐに対しＺ部位のラジカルグラフトを行な
うことにより。
次に第２段階において、約５から約９の間のｐＨの水性
媒質内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカッ
プリングの後可逆的に酸素添加された形から脱酸された
形へと移行できるような条件の下で、脱酸されていない
媒質内で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複
数のＺ部位を含む重合体Ｐを反応させ、一方では重合体
が支持する少なくとも１つのＺ部位とヘモグロビンの間
の少なくとも１つのイオン結合そして重合体がもつ前記
同一の２部位とヘモグロビンの間の少なくとも１つの共
有結合を形成する 上述の反応がイミン官能基を導き出した場合、これらの
官能基は、例えばＮ ａ Ｂ Ｈ４、ＮａＣＮＢＨ３，
ジメチルアミノボラン又はＨＣＯＯＨを用いた還元によ
りアミン官能基に安定化させることができる。
媒質内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカッ
プリングの後可逆的に酸素添加された形から脱酸された
形へと移行できるような条件の下で、脱酸されていない
媒質内で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複
数のＺ部位を含む重合体Ｐを反応させ、一方では重合体
が支持する少なくとも１つのＺ部位とヘモグロビンの間
の少なくとも１つのイオン結合そして重合体がもつ前記
同一の２部位とヘモグロビンの間の少なくとも１つの共
有結合を形成する 上述の反応がイミン官能基を導き出した場合、これらの
官能基は、例えばＮ ａ Ｂ Ｈ４、ＮａＣＮＢＨ３，
ジメチルアミノボラン又はＨＣＯＯＨを用いた還元によ
りアミン官能基に安定化させることができる。
本発明に基づ（共役体は、フランス特許筒８６．０９６
２５に記されている方法に従って得ることもできる。
２５に記されている方法に従って得ることもできる。
本発明に従って調製されたポリアニオン重合体に不可逆
的に結合されたヘモグロビン共役体は、それが適当な組
成の水溶液内に溶解された場合、特に輸血又は器官潅流
を必要とする手術において、血液の代用品としての役割
を果たすことができる。
的に結合されたヘモグロビン共役体は、それが適当な組
成の水溶液内に溶解された場合、特に輸血又は器官潅流
を必要とする手術において、血液の代用品としての役割
を果たすことができる。
従って、本発明の目的は、上に記されている兵役体を含
む水溶液、特に例えばタイロード圧液（組成はＮａＣｌ
２ Ｂｇ／Ｑ：ＫＣＱ ０． ２ｇ／ｆ２；ＣａＣ
ｆｆ２０．２ｇ／Ｉ２；ＭｇＣｆ２．□０．１ｇ／ｆｆ
：ＮａＨｚＰＯ４０，０５ｇ／Ｑ ： Ｎ ａ ＨＣ
０３１ｇ ／ ｆ２ ： Ｄ 、グルコース１ ｇ／ｆ
ｆ）に対する長時間にわたる透析及びヘモグロビンにつ
いて約７％の濃度を得るまでの限外ろ過による濃縮によ
って血液と等歪化された溶液にもある。
む水溶液、特に例えばタイロード圧液（組成はＮａＣｌ
２ Ｂｇ／Ｑ：ＫＣＱ ０． ２ｇ／ｆ２；ＣａＣ
ｆｆ２０．２ｇ／Ｉ２；ＭｇＣｆ２．□０．１ｇ／ｆｆ
：ＮａＨｚＰＯ４０，０５ｇ／Ｑ ： Ｎ ａ ＨＣ
０３１ｇ ／ ｆ２ ： Ｄ 、グルコース１ ｇ／ｆ
ｆ）に対する長時間にわたる透析及びヘモグロビンにつ
いて約７％の濃度を得るまでの限外ろ過による濃縮によ
って血液と等歪化された溶液にもある。
本発明に基づき得られたヘモグロビンの高分子共役体の
調製物は、潜在的な酸素輸送因子として検査された。そ
して、それが実際遊離ヘモグロビンＪ：りも容易に可逆
的に酸素を固定し特にそれを放出できるものであること
を示すことができた。実際、これらの調製物は、同じ条
件下（Ｎａ、Ｃｌ２Ｏ，０５Ｍ、ｐＨ７，２５℃）での
天然ヘモグロビンの約４３０Ｐａに対してきわめて高い
（９０（’）−５，０００Ｐａ）ものでありうる半飽和
圧（ｐ 、。）により特徴づけられる。
調製物は、潜在的な酸素輸送因子として検査された。そ
して、それが実際遊離ヘモグロビンＪ：りも容易に可逆
的に酸素を固定し特にそれを放出できるものであること
を示すことができた。実際、これらの調製物は、同じ条
件下（Ｎａ、Ｃｌ２Ｏ，０５Ｍ、ｐＨ７，２５℃）での
天然ヘモグロビンの約４３０Ｐａに対してきわめて高い
（９０（’）−５，０００Ｐａ）ものでありうる半飽和
圧（ｐ 、。）により特徴づけられる。
従って、これらの共役体は、乏血した組織に対し大量の
酸素を供給するために用いることができる。同様にこれ
らは輸血にも用いられ、賦形剤が存在する又は存在しな
い状態で血液と等張にされた水溶液の形で患者に対し投
与できる。又この化合物は低温保護剤が存在する又はし
ない状態で凍結乾燥又は微粒化させて、使用前に水中に
？８解させることができる。
酸素を供給するために用いることができる。同様にこれ
らは輸血にも用いられ、賦形剤が存在する又は存在しな
い状態で血液と等張にされた水溶液の形で患者に対し投
与できる。又この化合物は低温保護剤が存在する又はし
ない状態で凍結乾燥又は微粒化させて、使用前に水中に
？８解させることができる。
本発明に基づく高分子共役体は、急性毒性に対して相対
的にテストした。
的にテストした。
本発明は、以下に限定的な意味をもたずに示された例を
用いてより良く理解することができよう。
用いてより良く理解することができよう。
〈実施例〉
凱工、ベンゼンペンタカルボキシル酸デキストラン（デ
キストランの分子量は４００００）とへモグロビの共有
結合共役体の合成。
キストランの分子量は４００００）とへモグロビの共有
結合共役体の合成。
オキシヘモグロビンとのカップリング。
乾燥物質１ｇあたり５・１０−’モルのＮＨ２を含むア
ミノ化されたデキストラン（つまり１００モルのグルコ
ビラノースに対し８モルのＮＨ２を含むもの）を、 Ｐ
、１ＩＵＢＥＲＴ他（米国国立科学アガデミー会報 １
９７８年、 ７５．３］４３）に従って、エピクロルヒ
ドリンによって活性化されたデキストランにアンモニア
水を作用させることにより調製する。
ミノ化されたデキストラン（つまり１００モルのグルコ
ビラノースに対し８モルのＮＨ２を含むもの）を、 Ｐ
、１ＩＵＢＥＲＴ他（米国国立科学アガデミー会報 １
９７８年、 ７５．３］４３）に従って、エピクロルヒ
ドリンによって活性化されたデキストランにアンモニア
水を作用させることにより調製する。
このアミノ化されたデキストランを２０−の水に箔かし
、ｐＨを０．１．ＮのＨ（Ｊ！で６５に調整する。その
後、１７ｇの塩酸Ｎ′−エチル−Ｎ−（３−ジメチル−
アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＴ）を加える
。ｐＨを６．５に戻し、反応を３日間２０℃で続行する
。０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液に対する透析の後、混
合物を無水酢酸で処理してデキストランで置換されてい
ないアミン官能基をブロックする。次に、リン酸塩緩衝
液０．２Ｍ、ｐＨ７，２を用いてＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ
ｃＡ ２０２（■旺・ＦＲＡＮＣＥ）のカラム上で脱塩
して小さな分子量の汚染物質を／８液からとり除き浄化
する、水に対する長時間に渡る透析の後、ポリアニオン
重合体を含む溶液を凍結乾燥させる。この化合物は真空
下で低温保存する。
、ｐＨを０．１．ＮのＨ（Ｊ！で６５に調整する。その
後、１７ｇの塩酸Ｎ′−エチル−Ｎ−（３−ジメチル−
アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＴ）を加える
。ｐＨを６．５に戻し、反応を３日間２０℃で続行する
。０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液に対する透析の後、混
合物を無水酢酸で処理してデキストランで置換されてい
ないアミン官能基をブロックする。次に、リン酸塩緩衝
液０．２Ｍ、ｐＨ７，２を用いてＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａ
ｃＡ ２０２（■旺・ＦＲＡＮＣＥ）のカラム上で脱塩
して小さな分子量の汚染物質を／８液からとり除き浄化
する、水に対する長時間に渡る透析の後、ポリアニオン
重合体を含む溶液を凍結乾燥させる。この化合物は真空
下で低温保存する。
得られたデキストランのポリカルボキシル塩は重合体１
ｇにつき２Ｘ１０−’モルのベンゼンベンタカルボギシ
ル塩（Ｂ、Ｐ、Ｃ，）を含んでいる。
ｇにつき２Ｘ１０−’モルのベンゼンベンタカルボギシ
ル塩（Ｂ、Ｐ、Ｃ，）を含んでいる。
５ｇのポリカルボキシル酸デキストランをＮａＣ１０，
０５Ｍ ２５０−の中に溶解させる。０．１Ｍのナト
リウムでｐＨを７に調整し、１０％のヘモグロビン）８
液１５０−を加える。その後、６００ｍｇの塩酸Ｎ′−
エチル−Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボ
ジイミド（ＥＤＣＩ）を加え反応を２０℃で２時間続行
する。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ３４（Ｉ［ｌＦ Ｆｒ
ａｎｃｅｌのカラム上で得られたクロマトグラムに遊離
ヘモグロビンがもう無くなっていることを確認する。共
役体のＰ、。は２６６０Ｐａである。１２５℃、Ｔｒｉ
ｓ ０． ０５Ｍ、 ｐＨ＝７． ２同じ条件下での
遊離ヘモグロビン：Ｐ、、、＝４３０Ｐａ）。
０５Ｍ ２５０−の中に溶解させる。０．１Ｍのナト
リウムでｐＨを７に調整し、１０％のヘモグロビン）８
液１５０−を加える。その後、６００ｍｇの塩酸Ｎ′−
エチル−Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボ
ジイミド（ＥＤＣＩ）を加え反応を２０℃で２時間続行
する。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ３４（Ｉ［ｌＦ Ｆｒ
ａｎｃｅｌのカラム上で得られたクロマトグラムに遊離
ヘモグロビンがもう無くなっていることを確認する。共
役体のＰ、。は２６６０Ｐａである。１２５℃、Ｔｒｉ
ｓ ０． ０５Ｍ、 ｐＨ＝７． ２同じ条件下での
遊離ヘモグロビン：Ｐ、、、＝４３０Ｐａ）。
例２：ベンゼンペンタカルポキシル酸デキストラン（デ
キストランの分子量は１００００）とヘモグロビンの共
有結合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリ
ング。
キストランの分子量は１００００）とヘモグロビンの共
有結合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリ
ング。
重合体は、例１のものと同じ方法で調製された乾燥物質
１ｇあたり４・１０−４モルのＮＨ，を含むアミノ化さ
れたデキストランを用いて調製される。
１ｇあたり４・１０−４モルのＮＨ，を含むアミノ化さ
れたデキストランを用いて調製される。
このアミノ化されたデキストラン１ｇを水２〇−の中に
溶解させ、ＮａＯＨＯ，ＩＭでｐＨを７，５に調整する
。
溶解させ、ＮａＯＨＯ，ＩＭでｐＨを７，５に調整する
。
その後、０．７ｇのベンゼンヘキサカルボキシル酸（Ｂ
、Ｈ，Ｃ，）、次に１ｇの塩酸Ｎ゛−エチルＮ−（３−
ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ
）を加える。２０℃で１日反応を続行させる。酢酸ナト
リウム溶液０５Ｍに対する透析の後混合物を無水酢酸で
処理し、デキストランで置換されていないアミン基をブ
ロックする。その後、リン酸塩緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ
＝７．２）と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ２０２（
ＩＢＦＦｒａｎｃｅｌ のカラム上での脱塩により低分
子量の汚染物質を除去して溶液を浄化する。ＴＳＧ
Ｇ３０００ＳＷカラム（ＬＫＢ、 Ｆｒａｎｃｅｌを用
いて高性能液体クロマトグラフィにより、ポリカルボキ
シル酸デキストランが余剰のベンゼンヘキサカルボキシ
ル酸塩について完全に浄化されていることを確認する。
、Ｈ，Ｃ，）、次に１ｇの塩酸Ｎ゛−エチルＮ−（３−
ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ
）を加える。２０℃で１日反応を続行させる。酢酸ナト
リウム溶液０５Ｍに対する透析の後混合物を無水酢酸で
処理し、デキストランで置換されていないアミン基をブ
ロックする。その後、リン酸塩緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ
＝７．２）と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ２０２（
ＩＢＦＦｒａｎｃｅｌ のカラム上での脱塩により低分
子量の汚染物質を除去して溶液を浄化する。ＴＳＧ
Ｇ３０００ＳＷカラム（ＬＫＢ、 Ｆｒａｎｃｅｌを用
いて高性能液体クロマトグラフィにより、ポリカルボキ
シル酸デキストランが余剰のベンゼンヘキサカルボキシ
ル酸塩について完全に浄化されていることを確認する。
水に対する長時間にわたる透析の後、ポリアニオン重合
体を含む溶液を凍結乾燥させる。化合物は真空下で低温
保存される。得られたポリカルボキシル酸デキストラン
には、重合体１ｇあたり３．５ＸＩＯ−’モルのＢ、Ｐ
、Ｃが含まれている。
体を含む溶液を凍結乾燥させる。化合物は真空下で低温
保存される。得られたポリカルボキシル酸デキストラン
には、重合体１ｇあたり３．５ＸＩＯ−’モルのＢ、Ｐ
、Ｃが含まれている。
２．５ｇのポリカルボキシル酸デキストランを００５Ｍ
のＮａＣ１水１５０ｉ中に溶かす。１０％のヘモグロビ
ン溶液１００−をカロえる。０．１Ｍのナトリウムでｐ
ｉ＋を７．５に調整し、０．０５ＭのＮａＣｌ水ン容液
で３００−にする。
のＮａＣ１水１５０ｉ中に溶かす。１０％のヘモグロビ
ン溶液１００−をカロえる。０．１Ｍのナトリウムでｐ
ｉ＋を７．５に調整し、０．０５ＭのＮａＣｌ水ン容液
で３００−にする。
次にＥＤＣＩを３５０ｍｇ加え、反応を２０℃で２時間
続行させる。ＴＳＧ Ｇ３０００ＳＷカラム（ＬＫＢ
、 Ｆｒａｎｃｅｌで得られたクロマトグラム上には遊
離ヘモグロビンがもう無いことを確認する。
続行させる。ＴＳＧ Ｇ３０００ＳＷカラム（ＬＫＢ
、 Ｆｒａｎｃｅｌで得られたクロマトグラム上には遊
離ヘモグロビンがもう無いことを確認する。
第２図は、溶離体積に応じての光学濃度を表わしており
、もはや遊離ヘモグロビンが全（無いことを確認させて
くれる。この図において、ｖＯは、カラムから排除され
た体積を表わし、Ｈｂの下の矢印は、遊離ヘモグロビン
すなわち重合体にカップリングされていないヘモグロビ
ンの溶離体積に相当する。
、もはや遊離ヘモグロビンが全（無いことを確認させて
くれる。この図において、ｖＯは、カラムから排除され
た体積を表わし、Ｈｂの下の矢印は、遊離ヘモグロビン
すなわち重合体にカップリングされていないヘモグロビ
ンの溶離体積に相当する。
共役体のＰｓｏは２７２０Ｐａである（２５℃１Ｔｒｉ
ｓ ０．０５Ｍ、 ｐＨ＝７．２ ：同じ条件下での
遊離ヘモグロビンのＰ、。＝４３０Ｐａ）。
ｓ ０．０５Ｍ、 ｐＨ＝７．２ ：同じ条件下での
遊離ヘモグロビンのＰ、。＝４３０Ｐａ）。
鼠ユニベンゼントリカルボキシル酸デキストラン（デキ
ストランの分子量１００００）とヘモグロビンの共有結
合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリング
。
ストランの分子量１００００）とヘモグロビンの共有結
合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリング
。
重合体は、乾燥重合体１ｇあたり４・１０−４モルのＮ
Ｈ，を含むアミノ化されたデキストランを用いて調製さ
れる。
Ｈ，を含むアミノ化されたデキストランを用いて調製さ
れる。
このアミン化された重合体１ｇを２０４の水の中に溶解
させ、０．１ＭのＮａ０ｔ（でｐＨを７５に調整する。
させ、０．１ＭのＮａ０ｔ（でｐＨを７５に調整する。
その後、０，５ｇのベンゼン１．２．４５−テトラカル
ボキシル酸（Ｂ、Ｔ、Ｃ）次に０．６ｇのＥＤＣＩを添
加する。２０℃で１時間反応を続行させる。次に溶液を
例２と同じように処理する。
ボキシル酸（Ｂ、Ｔ、Ｃ）次に０．６ｇのＥＤＣＩを添
加する。２０℃で１時間反応を続行させる。次に溶液を
例２と同じように処理する。
得られたポリカルボキシル酸デキストランには、重合体
１ｇあたり３．２ＸｌＯ−’モルのベンゼントリカルボ
キシル酸塩が含まれている。
１ｇあたり３．２ＸｌＯ−’モルのベンゼントリカルボ
キシル酸塩が含まれている。
このポリカルボキシル酸デキストラン０．５ｇを０．０
５ＭのＮａ（Ｊ’水２５Ｗｄｌ中に溶かす、１０％のヘ
モグロビン溶液を１０ｄ付加する。Ｏ，１Ｍのナトリウ
ムでｐＨを７．５に調整し、ＮａＣｌ水０．０５Ｍで４
０−にする。
５ＭのＮａ（Ｊ’水２５Ｗｄｌ中に溶かす、１０％のヘ
モグロビン溶液を１０ｄ付加する。Ｏ，１Ｍのナトリウ
ムでｐＨを７．５に調整し、ＮａＣｌ水０．０５Ｍで４
０−にする。
その後、５０ｍｇのＥＤＣＩを添加し、２０℃で２時間
反応を続行させる。ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ （ＬＫ
Ｂ、 Ｆｒａｎｃｅｌカラム上で得られたクロマトグラ
ムにて遊離ヘモグロビンが無くなっていることを確認す
る。第３図は、溶離体積に応じての光学濃度を表わして
おり、これにより遊離ヘモグロビンかもう全く無いこと
を確認することができる。この図においてｖＯの下の矢
印はカラムから排除された体積に相応し、Ｈｂの下の矢
印は、遊離ヘモグロビンすなわちカップリングを受けて
いないヘモグロビンの溶離体積に相当する。
反応を続行させる。ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ （ＬＫ
Ｂ、 Ｆｒａｎｃｅｌカラム上で得られたクロマトグラ
ムにて遊離ヘモグロビンが無くなっていることを確認す
る。第３図は、溶離体積に応じての光学濃度を表わして
おり、これにより遊離ヘモグロビンかもう全く無いこと
を確認することができる。この図においてｖＯの下の矢
印はカラムから排除された体積に相応し、Ｈｂの下の矢
印は、遊離ヘモグロビンすなわちカップリングを受けて
いないヘモグロビンの溶離体積に相当する。
共役体のｐ ｓｏは７１０Ｐａである（２５℃、Ｔｒｉ
ｓＯ，０５Ｍ、ｐＨ＝７．２ ：同じ条件の遊離ヘモグ
ロビンのＰ、、＝４３０Ｐａ）。
ｓＯ，０５Ｍ、ｐＨ＝７．２ ：同じ条件の遊離ヘモグ
ロビンのＰ、、＝４３０Ｐａ）。
泗」、ニブタントリカルボキシル酸デキストラン（デキ
ストランの分子！Ｌ１００ＯＯ）とヘモグロビンの共有
結合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリン
グ。
ストランの分子！Ｌ１００ＯＯ）とヘモグロビンの共有
結合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリン
グ。
重合体はｎ−ブタン１．２．３．４−テトラカルボキシ
ル酸（Ｂｕ、 Ｔ、 Ｃ，）を用いて例３と同様の方法
で調製される。得られたポリカルボキシル酸デキストラ
ンには、重合体１ｇあたり４×１Ｏ−４モルのブタント
リカルボキシル酸塩が含まれている。
ル酸（Ｂｕ、 Ｔ、 Ｃ，）を用いて例３と同様の方法
で調製される。得られたポリカルボキシル酸デキストラ
ンには、重合体１ｇあたり４×１Ｏ−４モルのブタント
リカルボキシル酸塩が含まれている。
このポリカルボキシル酸デキストラン０．６ｇを０．０
５ＭのＮａＣｌ水２５水中５溶かす。１０％のヘモグロ
ビン溶液１０−を加える。０．１ＭのすトリウムでｐＨ
を７．５に調整し、０．０５ＭのＮａＣｌ水で４０−に
する。
５ＭのＮａＣｌ水２５水中５溶かす。１０％のヘモグロ
ビン溶液１０−を加える。０．１ＭのすトリウムでｐＨ
を７．５に調整し、０．０５ＭのＮａＣｌ水で４０−に
する。
その後７０ｍｇのＥＤＳ Ｉを添加し、反応を２時間２
０℃で続行させる。ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（ＬＫＢ
、Ｆｒａｎｃｅｌカラム上で得られたクロマトグラムに
て、遊離ヘモグロビンが全く無くなっていることを確認
する。得られた共役体のＰ ｓｏは５４０Ｐａである（
２５℃，Ｔｒｉｓ Ｏ，０５Ｍ、 ｐＨ＝７．２．同
じ条件下での遊離ヘモグロビンＰ、。
０℃で続行させる。ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（ＬＫＢ
、Ｆｒａｎｃｅｌカラム上で得られたクロマトグラムに
て、遊離ヘモグロビンが全く無くなっていることを確認
する。得られた共役体のＰ ｓｏは５４０Ｐａである（
２５℃，Ｔｒｉｓ Ｏ，０５Ｍ、 ｐＨ＝７．２．同
じ条件下での遊離ヘモグロビンＰ、。
＝４３０Ｐａ）。
憇】；ベンゼンペンタカルボキシル酸−モノメトオキシ
ポリオキシエチレン（ポリオキシエチレンの分子量は５
０００）とヘモグロビンの共有結合共役体の合成。オキ
シヘモグロビンとのカップリング。
ポリオキシエチレン（ポリオキシエチレンの分子量は５
０００）とヘモグロビンの共有結合共役体の合成。オキ
シヘモグロビンとのカップリング。
アミノ化されたモノメトキシポリオキシエチレン（Ｍ
Ｐ ＯＥ−ＮＯ３，乾燥物質１ｇあたり２１０−’モル
のＮ）＋２１は、Ｍ、 ＬＥＯＮＡＲＤ他（「正四面体
Ｊ 、 １９８４年、 ４０．１５８１）に従って、Ｍ
ＰＯＥに対して臭化チオニルを作用した後アンモニア水
で置換させることによって調製される。
Ｐ ＯＥ−ＮＯ３，乾燥物質１ｇあたり２１０−’モル
のＮ）＋２１は、Ｍ、 ＬＥＯＮＡＲＤ他（「正四面体
Ｊ 、 １９８４年、 ４０．１５８１）に従って、Ｍ
ＰＯＥに対して臭化チオニルを作用した後アンモニア水
で置換させることによって調製される。
このＭ Ｐ ＯＥ−Ｎｔ（□を２ｇ、水５０−の中にン
容解させ、ｐＨを８に調整する。その後１．４ｇのベン
ゼンヘキサカルボキシル酸（Ｂ、Ｈ，Ｃ，）、次に０．
８ｇの塩酸Ｎ゛ −エチル−Ｎ（３−ジメチル−アミノ
プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を添加する。大
気温度で一晩１反応を続ける。次に混合物を、ＩＭのＨ
（Ｊ！水によりｐＨ１に酸性化する。この重合体を塩化
メチレンで抽出し、無水エーテルで沈降させる。
容解させ、ｐＨを８に調整する。その後１．４ｇのベン
ゼンヘキサカルボキシル酸（Ｂ、Ｈ，Ｃ，）、次に０．
８ｇの塩酸Ｎ゛ −エチル−Ｎ（３−ジメチル−アミノ
プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を添加する。大
気温度で一晩１反応を続ける。次に混合物を、ＩＭのＨ
（Ｊ！水によりｐＨ１に酸性化する。この重合体を塩化
メチレンで抽出し、無水エーテルで沈降させる。
次にこれをＤｏｗｅｘカラム、その後、ＡｃＡ ２０２
のＵｌｔｒｏｇｅｌカラム（ＩＢＦ、 Ｆｒａｎｃｅｌ
上のクロマトグラフィにより純化する。溶離液をナトリ
ウム水（ｐＨ９）に対し透析させ、重合体を凍結乾燥す
る。
のＵｌｔｒｏｇｅｌカラム（ＩＢＦ、 Ｆｒａｎｃｅｌ
上のクロマトグラフィにより純化する。溶離液をナトリ
ウム水（ｐＨ９）に対し透析させ、重合体を凍結乾燥す
る。
重合体１ｇあたり約１．５ＸＩＯ−’モルのベンゼンペ
ンタカルボキシル酸塩（Ｂ、Ｐ、（ｌを含むこの重合体
を０２ｇ、］、Ｏｍｌの水の中に溶かす。ｐＨを７に調
整し、１０％のヘモグロビン溶液１．０Ｊ次に１０ｍｇ
のＥＤＣＩを添加する。１時間反応させた後、混合物を
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４カラム（ＩＢＦ、 Ｆ
ｒａｎｃｅｉ上でのクロマトグラフィに付し、ヘモグロ
ビンの重合体共役体を純化させる。第４図は溶離体積に
応じての光学濃度の変化を示しており、これにより遊離
ヘモグロビンが全く無くなっていることを確認すること
ができる。 Ｖｏはカラムから排除された体積に相当し
、Ｈｂの下の矢印は、遊離ヘモグロビンすなわちカップ
リングを受けていないヘモグロビンに相応し、さらにＭ
Ｐ ＯＥ −Ｂ Ｐ Ｃの下の矢印は、ヘモグロビン
に結合されていない重合体の溶離体積に相当する。
ンタカルボキシル酸塩（Ｂ、Ｐ、（ｌを含むこの重合体
を０２ｇ、］、Ｏｍｌの水の中に溶かす。ｐＨを７に調
整し、１０％のヘモグロビン溶液１．０Ｊ次に１０ｍｇ
のＥＤＣＩを添加する。１時間反応させた後、混合物を
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４カラム（ＩＢＦ、 Ｆ
ｒａｎｃｅｉ上でのクロマトグラフィに付し、ヘモグロ
ビンの重合体共役体を純化させる。第４図は溶離体積に
応じての光学濃度の変化を示しており、これにより遊離
ヘモグロビンが全く無くなっていることを確認すること
ができる。 Ｖｏはカラムから排除された体積に相当し
、Ｈｂの下の矢印は、遊離ヘモグロビンすなわちカップ
リングを受けていないヘモグロビンに相応し、さらにＭ
Ｐ ＯＥ −Ｂ Ｐ Ｃの下の矢印は、ヘモグロビン
に結合されていない重合体の溶離体積に相当する。
この共役体のＰ、。は２４００Ｐａである（２５℃、Ｔ
ｒｉｓ Ｏ，０５Ｍ、 ｐ［（７，４；同じ条件下で
の遊離ヘモグロビンのＰ５゜＝ ４３０ Ｐａ）。
ｒｉｓ Ｏ，０５Ｍ、 ｐ［（７，４；同じ条件下で
の遊離ヘモグロビンのＰ５゜＝ ４３０ Ｐａ）。
■ ベンゼンジカルボキシル酸デキストラン（デキスト
ランの分子量は１００００ ：デキストランとポリカル
ボキシル酸塩部位の間のエステル結合）とヘモグロビン
の共有結合共（９体の合成。
ランの分子量は１００００ ：デキストランとポリカル
ボキシル酸塩部位の間のエステル結合）とヘモグロビン
の共有結合共（９体の合成。
オキシヘモグロビンとのカップリング。
ベンゼンジカルボキシル酸デキストランは７．５ｇのベ
ンゼン１．２．４トリカルボキシル無水物をｐＨ９の水
性媒質内で１５時間、３２ｇのデキストランと反応させ
ることにより調製される；その後ｐＨ７，２，０，２Ｍ
のリン酸塩緩衝液と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ２
０２ （ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃｅｌ カラム上での脱塩に
より溶液から、残留するベンゼン１．２．４−トリカル
ボキシル酸を除去する。
ンゼン１．２．４トリカルボキシル無水物をｐＨ９の水
性媒質内で１５時間、３２ｇのデキストランと反応させ
ることにより調製される；その後ｐＨ７，２，０，２Ｍ
のリン酸塩緩衝液と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ２
０２ （ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃｅｌ カラム上での脱塩に
より溶液から、残留するベンゼン１．２．４−トリカル
ボキシル酸を除去する。
水に対する長時間にわたる透析の後、重合体を含む溶液
を凍結乾燥させる。ポリカルボキシル酸デキストランは
、重合体１ｇあたり６３×１０−４モルのベンゼンジカ
ルボキシル酸塩（Ｂ、Ｄ、Ｃ，）を含んでいる。
を凍結乾燥させる。ポリカルボキシル酸デキストランは
、重合体１ｇあたり６３×１０−４モルのベンゼンジカ
ルボキシル酸塩（Ｂ、Ｄ、Ｃ，）を含んでいる。
これは、単量体１０個毎に２つのカルボキシル酸塩基か
ら成る２つの陰イオン基を含むほぼ１つの２部位に相当
する。
ら成る２つの陰イオン基を含むほぼ１つの２部位に相当
する。
ポリカルボキシル酸デキストランｌ１ｇを水２５〇−中
に溶かす。ｐＨを６５に調整し、１０％のヘモグロビン
溶液１５０ｄを付加する。次に１６０ｍｇの塩酸Ｎ′−
エチル−Ｎ（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（ＥＤＣＩ）を加え、反応を２０℃で２時間続行させ
る。
に溶かす。ｐＨを６５に調整し、１０％のヘモグロビン
溶液１５０ｄを付加する。次に１６０ｍｇの塩酸Ｎ′−
エチル−Ｎ（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（ＥＤＣＩ）を加え、反応を２０℃で２時間続行させ
る。
得られたヘモグロビン共役体は、新規な共役体である。
混合物は、遊離ヘモグロビン及び汚染物質を除去するた
めＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４ （ＩＢＦ、Ｆｒａ
ｎｃｅｌ上でクロマトグラフィを受ける。純化された共
役体のｐ ｓｏは、８７０Ｐａである（２５℃、Ｔｒｉ
ｓＯ８０５Ｍ、ｐＨ７，２：同じ条件での遊離ヘモグロ
ビンのＰｓｏ＝４３０Ｐａ）。
めＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４ （ＩＢＦ、Ｆｒａ
ｎｃｅｌ上でクロマトグラフィを受ける。純化された共
役体のｐ ｓｏは、８７０Ｐａである（２５℃、Ｔｒｉ
ｓＯ８０５Ｍ、ｐＨ７，２：同じ条件での遊離ヘモグロ
ビンのＰｓｏ＝４３０Ｐａ）。
憇ユニベンゼントリカルボキシル酸デキストラン（デキ
ストランの分子量はｉ ｏｏｏｏ−デキストランとポリ
カルボキシル酸塩部位の間の結合）とヘモグロビンの共
有結合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリ
ング。
ストランの分子量はｉ ｏｏｏｏ−デキストランとポリ
カルボキシル酸塩部位の間の結合）とヘモグロビンの共
有結合共役体の合成。オキシヘモグロビンとのカップリ
ング。
ベンゼントリカルボキシル酸デキストランは、１５時間
ｐＨ９の水性媒質内で２０ｇのデキストランとベンゼン
１，２．４．”５テトラ力ルボキシル２無水物２６ｇを
反応させることにより調製される二次に、リン酸塩緩衝
液０．２Ｍ、ｐＨ７，２と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａｃ
Ａ ２０２（ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃｅｌ上で脱塩すること
により溶液から残留するベンゼン１，２４．５テトラカ
ルボキシル酸を除去する。
ｐＨ９の水性媒質内で２０ｇのデキストランとベンゼン
１，２．４．”５テトラ力ルボキシル２無水物２６ｇを
反応させることにより調製される二次に、リン酸塩緩衝
液０．２Ｍ、ｐＨ７，２と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ Ａｃ
Ａ ２０２（ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃｅｌ上で脱塩すること
により溶液から残留するベンゼン１，２４．５テトラカ
ルボキシル酸を除去する。
水に対し長時間透析した後、重合体を含む溶液を凍結乾
燥する。ポリカルボキシル酸デキストランには、重合体
１ｇあたり１．１５ＸｌＯ−３モルのベンゼントリカル
ボキシル酸塩（Ｂ、Ｔ、Ｃ）が含まれている。
燥する。ポリカルボキシル酸デキストランには、重合体
１ｇあたり１．１５ＸｌＯ−３モルのベンゼントリカル
ボキシル酸塩（Ｂ、Ｔ、Ｃ）が含まれている。
ポリカルボキシル酸デキストラン５ｇを水２５−中に溶
かす。ｐＨを７０に調整し、１０％のヘモグロビン溶液
を１５〇−添加する。次に塩酸Ｎ′−エチル−Ｎ（３ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を
１２０ｍｇ添加し、２０℃で２時間反応を続行させる。
かす。ｐＨを７０に調整し、１０％のヘモグロビン溶液
を１５〇−添加する。次に塩酸Ｎ′−エチル−Ｎ（３ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を
１２０ｍｇ添加し、２０℃で２時間反応を続行させる。
遊離ヘモグロビンと汚染物質を除去するため、混合物を
旧ｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４ （ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃ
ｅｌカラム上でクロマトグラフィに付す。純化された共
役体のＰｓｏは２０００Ｐａである（２５℃，Ｔｒｉｓ
Ｏ，０５Ｍ、ｐ）（７，２：同じ条件下の遊離ヘモグロ
ビンのＰ ｓｏ” ４３０ Ｐａ）。
旧ｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４ （ＩＢＦ、Ｆｒａｎｃ
ｅｌカラム上でクロマトグラフィに付す。純化された共
役体のＰｓｏは２０００Ｐａである（２５℃，Ｔｒｉｓ
Ｏ，０５Ｍ、ｐ）（７，２：同じ条件下の遊離ヘモグロ
ビンのＰ ｓｏ” ４３０ Ｐａ）。
同様に、塩酸Ｎ′ −エチル−Ｎ（３ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）のような水溶性の
あるカルボジイミドの存在する中で、ベンゼンｌ、２．
４．５テトラカルボキシル酸とデキストランを用いて上
述の共役体を調製することも可能である。
ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）のような水溶性の
あるカルボジイミドの存在する中で、ベンゼンｌ、２．
４．５テトラカルボキシル酸とデキストランを用いて上
述の共役体を調製することも可能である。
例」−：
例５に記されている手順に従って、次の共役体を調製す
る： ベンゼンペンタカルボキシル・ポリエチレングリコール
とヘモグロビン ベンゼンテトラカルボキシル・ポリエチレングリコール
とヘモグロビン ベンゼントリカルボキシル・ポリエチレングＪコ・−ル
とヘモグロビン ベンゼンジカルボキシル・ポリエチレングリコールとヘ
モグロビン 態度： 例６及び７に記されている手順に従って、ベンゼントリ
カルボキシルポリエチレングリコールとヘモグロビンの
共役体を調製する。
る： ベンゼンペンタカルボキシル・ポリエチレングリコール
とヘモグロビン ベンゼンテトラカルボキシル・ポリエチレングリコール
とヘモグロビン ベンゼントリカルボキシル・ポリエチレングＪコ・−ル
とヘモグロビン ベンゼンジカルボキシル・ポリエチレングリコールとヘ
モグロビン 態度： 例６及び７に記されている手順に従って、ベンゼントリ
カルボキシルポリエチレングリコールとヘモグロビンの
共役体を調製する。
ベンゼントリカルボキシルポリエチレングリコールを調
製するためには、ジメチルホルムアミドのような媒質の
中でポリエチレングリコールとベンゼンテトラカルボキ
シル無水物を反応させる。次に、リン酸塩緩衝液（０，
２Ｍ、ｐＨ７２）と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ、 ＡｃＡ
２０２カラムｆＩＢＦＦｒａｎｃｅｌ上での脱塩により
残留するベンゼンテトラカルボキシル酸を？８液から除
去する。
製するためには、ジメチルホルムアミドのような媒質の
中でポリエチレングリコールとベンゼンテトラカルボキ
シル無水物を反応させる。次に、リン酸塩緩衝液（０，
２Ｍ、ｐＨ７２）と共にＵｌｔｒｏｇｅｌ、 ＡｃＡ
２０２カラムｆＩＢＦＦｒａｎｃｅｌ上での脱塩により
残留するベンゼンテトラカルボキシル酸を？８液から除
去する。
水に対する長時間にわたる透析の後、重合体を含む溶液
を凍結乾燥させる。
を凍結乾燥させる。
ポリカルボキシル酸ポリエチレングリコールを水中に溶
かす。ｐｌ＋を７．０に調整し、例えば１０％のヘモグ
ロビン溶液を加える。次に塩酸Ｎ″ −エチル−Ｎ（３
ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ
）を付加し、反応を２時間２０℃で続行させる。
かす。ｐｌ＋を７．０に調整し、例えば１０％のヘモグ
ロビン溶液を加える。次に塩酸Ｎ″ −エチル−Ｎ（３
ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ
）を付加し、反応を２時間２０℃で続行させる。
ｈ ｉｌ［ヘモグロビンと汚染物質を除去するため、混
合物をＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４１ＩＢＦ、Ｆｒ
ａｎｃｅｌ上でクロマトグラフィに付す。
合物をＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４１ＩＢＦ、Ｆｒ
ａｎｃｅｌ上でクロマトグラフィに付す。
同様に、前述の手順に従って、ベンゼンジカルボキシル
ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコールとベ
ンゼン１．２．４トリカルボキシル無水物を用いて）と
ヘモグロビンの共役体を調製する。
ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコールとベ
ンゼン１．２．４トリカルボキシル無水物を用いて）と
ヘモグロビンの共役体を調製する。
同様に、ジメチルホルムアミド内でジシクロへキシルカ
ルボジイミドｌ−ジメチルアミノピリジンが存在する中
で重合体のＯＨ官能基に対してベンゼンポリカルボキシ
ル酸を反応させることによって、ベンゼンポリカルボキ
シル酸ポリエチレングツコールを調製することもできる
。
ルボジイミドｌ−ジメチルアミノピリジンが存在する中
で重合体のＯＨ官能基に対してベンゼンポリカルボキシ
ル酸を反応させることによって、ベンゼンポリカルボキ
シル酸ポリエチレングツコールを調製することもできる
。
匿較旦ユ
この例は、リン酸塩陰イオン基がその上にあるＺ部位が
支持していないアルデヒド基との間で共有結合が打ち立
てられているヘモグロビン共役体を調製するため本発明
に基づく方法を使用することによって得られたＰ、。を
比較することをその目的とするものである。
支持していないアルデヒド基との間で共有結合が打ち立
てられているヘモグロビン共役体を調製するため本発明
に基づく方法を使用することによって得られたＰ、。を
比較することをその目的とするものである。
フランス特許出願明細書簡８６．０９６２５号の例１に
記されている手順に従って、約１００００の分子量の出
発デキストランをリン８％を含むリン酸２ナトリウムに
変換して、リン酸デキストランを調製する。
記されている手順に従って、約１００００の分子量の出
発デキストランをリン８％を含むリン酸２ナトリウムに
変換して、リン酸デキストランを調製する。
グリコシド１０（Ｌｍ位について１３のアルデヒドを得
るように過ヨウ素酸ナトリウムによりリン酸デキストラ
ンを活性化させる。
るように過ヨウ素酸ナトリウムによりリン酸デキストラ
ンを活性化させる。
この無水リン酸デキストランを、ｐＨ８で質量で１．５
の割合（デキストラン質量／ヘモグロビン質量）でヘモ
グロビンと反応させる：反応は２４時間４℃で続行させ
る。次にＮａＯＨ１Ｏ−３Ｎ中の％ａＢＨ４溶液を添加
する。Ｍｔｉｌ！ヘモグロビンが無（なっているか調べ
るため混合物をクロマトグラフィに例ず（ＴＳＫ Ｇ
３０００ＳＷ Ｂｅｃｋｍａｎカラム上でのＨＰ Ｌ
Ｃ）。
の割合（デキストラン質量／ヘモグロビン質量）でヘモ
グロビンと反応させる：反応は２４時間４℃で続行させ
る。次にＮａＯＨ１Ｏ−３Ｎ中の％ａＢＨ４溶液を添加
する。Ｍｔｉｌ！ヘモグロビンが無（なっているか調べ
るため混合物をクロマトグラフィに例ず（ＴＳＫ Ｇ
３０００ＳＷ Ｂｅｃｋｍａｎカラム上でのＨＰ Ｌ
Ｃ）。
フランス特許出願明細書簡８６．０９６２５号中に記さ
れている方法に従ってデオキシヘモグロビンに対して反
応を行うと、ヘモグロビン共（９体のＰ ｓｏは３３８
０Ｐａである（２５℃，ＴｒｉｓＯ，０５Ｍ、ｐＨ７，
２）。
れている方法に従ってデオキシヘモグロビンに対して反
応を行うと、ヘモグロビン共（９体のＰ ｓｏは３３８
０Ｐａである（２５℃，ＴｒｉｓＯ，０５Ｍ、ｐＨ７，
２）。
同じ条（キ下で、ｔｌ ＝ｉヘモグロビンのＰ、。は４
５０Ｐａである。
５０Ｐａである。
本発明の方法に従戦ってオキシヘモグロビンに対して反
応を行った場合、ヘモグロビン共役体のＰ ５０は４２
５Ｐａ（２５℃、Ｔｒｉｓ Ｏ，０５Ｍ、ｐＨ７，２
）。
応を行った場合、ヘモグロビン共役体のＰ ５０は４２
５Ｐａ（２５℃、Ｔｒｉｓ Ｏ，０５Ｍ、ｐＨ７，２
）。
同じ条件の下で遊離ヘモグロビンのＰ５ｏは４３０Ｐａ
である。
である。
この比較例は、酸素添加されたヘモグロビンを用いての
ヘモグロビン共役体の調製方法が、陰イオン電荷を含ま
ない２部位上に固定されていないアルデヒド基（カルボ
キシル又は０１１）との間で共有結合が打ちたてられる
場合には適用できないものである、ということを示して
いる。
ヘモグロビン共役体の調製方法が、陰イオン電荷を含ま
ない２部位上に固定されていないアルデヒド基（カルボ
キシル又は０１１）との間で共有結合が打ちたてられる
場合には適用できないものである、ということを示して
いる。
第１図は１重合体にカップリングされたヘモグロビンと
、天然（遊離）ヘモグロビンのｐ ｓｏの比較例を表わ
している。 第２図、第３図、第４図は、１離体積に応しての光学１
度を表わしている。 （図１中）■重合体にカップリングされた・＼モグロビ
ン、 ■天然ヘモグロビン。 Ｖ。 ■ｅ Ｄｏ ２ａ。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ■
、天然（遊離）ヘモグロビンのｐ ｓｏの比較例を表わ
している。 第２図、第３図、第４図は、１離体積に応しての光学１
度を表わしている。 （図１中）■重合体にカップリングされた・＼モグロビ
ン、 ■天然ヘモグロビン。 Ｖ。 ■ｅ Ｄｏ ２ａ。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ■
Claims (34)
- （１）酸素に対して遊離ヘモグロビンのものよりも低い
親和力を示し、血漿の中でその高分子共役体が酸素運搬
機能を果たさなくてはならない時間中生物分解性が全く
又はほとんど無いヘモグロビンの水溶性高分子共役体の
調製方法において、 −第１段階においては、重合体１鎖あたり少なくとも１
つのＺ部位の割合で重合体Ｐ上にＺ部位を固定させるこ
と；なお、重合体Ｐは水溶性をもち、無毒で好ましくは
非抗原性を有し血球適合型であり、しかもその分子量は
約１０００〜５０万好ましくは約１０００から１０万で
あり、単数又は複数の極性基好ましくはヒドロキシル基
、カルボキシル基又はアミン基を含んでいる。またＺ部
位は、一方では複数の基、硫酸塩及び／又はリン酸塩及
び／又はカルボキシル酸塩により支持されヘモグロビン
とのイオン結合を生成することを目的とする少なくとも
１つの負の電荷を含み、他方では、ヘモグロビンと共有
結合を生成することを目的とする少なくとも１つのカル
ボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含んでいる。又
かかる固定は以下の方法のいずれかを用いて行なわれる
： Ｙをアルデヒド、カルボキシル、アミン、 ヒドロキシル又はハロゲンといった活性剤を用いて活性
化可能な又は活性の官能基とし て、化合物Ｚ−Ｙを用いることにより、或いは、 重合体Ｐ上でＺ部位をラジカルグラフトす ることにより。 −次に、第２段階において、約５〜約９のｐＨの水性媒
質内で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップ
リングの後酸素添加された形から脱酸素された形へ可逆
的に移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒
質内で酸素添加された形のヘモグロビンと、単数又は複
数のＺ部位を有する重合体Ｐを反応させ、重合体が有し
ているＺ部位のうちの少なくとも１つとヘモグロビンの
間の少なくとも１つのイオン結合及び重合体が有する前
記同一Ｚ部位とヘモグロビンの間の少なくとも１つの共
有結合を形成させること： −上述の反応により場合によってイミン官能基が導き出
された場合、この官能基は、例えばＮａＢＨ＿４、Ｎａ
ＣＮＢＨ＿３、ジメチルアミノボラン又はＨＣＯＯＨを
用いての還元などによってアミン官能基に安定化されう
ること、を特徴とする方法。 - （２）１つの部位とヘモグロビンの間でイオン結合を生
成することを目的とする負の電荷（部位と重合体の間の
結合に関与せず又部位とヘモグロビンの間の共有結合に
も関与しないもの）の数と性質の関係が以下のようなも
のとなるようにＺ部位を重合体Ｐ上に固定することを特
徴とする、請求項（１）に記載の高分子共役体調製方法
： −各Ｚ部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオ
ン基を含んでいる場合、重合体の単量体１０個毎に少な
くとも１つのこのようなＺ部位がある： −硫酸塩及び／又はリン酸塩から成る少なくとも２つの
陰イオン基を含んでいる場合、重合体の鎖１つにつき少
なくとも１つのこのようなＺ部位がある： −各々のＺ部位がカルボキシル酸塩からの陰イオンを含
んでいる場合、同じＺ部位上に少なくとも２つのカルボ
キシル酸塩及び単量体５つ毎に少なくとも１つのこのよ
うなＺ部位が必要である； −Ｚ部位のうち少なくとも１つがカルボキシル酸塩から
の負の電荷を少なくとも３つ含んでいる場合、重合体１
鎖につき少なくとも１つのこのような部位がある。 - （３）１つの部位とヘモグロビンの間でイオン結合を生
成することを目的とする負の電荷（部位と重合体の間の
結合に関与せず又部位とヘモグロビンの間の共有結合に
も関与しないもの）の数と性質の関係が以下のようなも
のとなるように部位Ｚを重合体Ｐ上に固定することを特
徴とする、請求項（１）に記載の高分子共役体調製方法
； −Ｚ部位には硫酸塩又はリン酸塩で構成された唯一の陰
イオン基が含まれている場合、重合体鎖１つあたりこの
ようなＺ部位が少なくとも１つ、そして単量体１１個毎
に最高１つのＺ部位がある： −Ｚ部位にカルボキシル酸塩で構成されしかも部位と重
合体の間の結合にも重合体とヘモグロビンの共有結合に
も関与していない唯一の陰イオン基が含まれている場合
、重合体の鎖１つにつき少なくとも１つのこのようなＺ
部位がある； −Ｚ部位には、部位と重合体の間の結合にも重合体とヘ
モグロビンの間の共有結合にも関与せず２つのカルボキ
シル酸塩から生じる陰イオン電荷が２つ含まれている場
合、重合体の鎖１つあたり少なくとも１つのＺ部位そし
て単量体６つ毎に最高１つのかかるＺ部位がある。 - （４）重合体Ｐとヘモグロビンの間の共有結合は、Ｚ部
位が有する少なくとも１つのカルボキシル基、アルデヒ
ド基又はＯＨ基と脱酸された形にあるヘモグロビンのア
ロステリック部位内にあるヘモグロビンの少なくとも１
つのアミン特にヘモグロビンの２つのβ末端バリンのう
ちの少なくとも１つのアミンの間で打ち立てられること
を特徴とする、請求項（１）乃至（３）に記載の方法。 - （５）ヘモグロビン内部のＣＯＯ＾−基とＮＨ＿３基の
間の塩橋は、ヘモグロビンが脱酸された形にある場合、
無傷であることを特徴とする請求項（１）乃至（４）に
記載の方法。 - （６）重合体Ｐは、多糖、特に、そのアルキル基が２〜
４個の炭素原子を含んでいるヒドロキシアルキルでんぷ
ん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体、特に、ア
ミノ化されたデキストラン、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ポリメタクリレート及びその誘導
体、ポリペプチド、そのアルキレン基に２〜５個の炭素
原子が含まれているポリアルキレングリコール、特に、
ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール
の中から選ばれることを特徴とする、請求項（１）乃至
（５）に記載の方法。 - （７）重合体Ｐの平均分子量はそれがデキストラン及び
その誘導体で構成されている場合７００００以下である
こと、そしてそれがポリアルキレングリコール、ポリビ
ニルピロリドン又はポリアクリル酸メチルの中から選ば
れている場合、１００００以下であることを特徴とする
、請求項（１）乃至（６）に記載の方法。 - （８）Ｚ部位が、エステル、エーテル、アミド又はアミ
ン官能基を介して重合体に結びつけられていることを特
徴とする、請求項（１）乃至（７）に記載の方法。 - （９）Ｚ部位は、ＯＳＯ＿３Ｈ、ＯＰＯ＿３Ｈ＿２、Ｏ
−ＣＨ（ＣＯＯＨ）＿２、▲数式、化学式、表等があり
ます▼ 基（ｎは１から約４まで変化する）を含むか或いは又、
ピリドキサル硫酸、ピリドキサルリン酸、アデノシン三
リン酸、ホスホチロシン、ホスホセリン、イノシトール
ヘキサリン酸及びその誘導体、主鎖上に２〜１０個の炭
素原子を含むポリカルボン酸、少なくとも３つのカルボ
キシル官能基を含むベンゼンカルボン酸、２，３−ジホ
スホグリセリン酸塩からのものであることを特徴とする
、請求項（１）乃至（８）に記載の方法。 - （１０）重合体とヘモグロビンの間の共有結合が、重合
体上に固定されたＺ部位からのカルボキシル基及びヘモ
グロビンのＮＨ＿２基を用いて打ち立てられることを特
徴とする、請求項（１）乃至（９）に記載の方法。 - （１１）重合体Ｐとヘモグロビンの間のイオン結合がＺ
部位のカルボキシル酸塩基とヘモグロビンの間で打ち立
てられることを特徴とする、請求項（１）乃至（１０）
に記載の方法。 - （１２）約４００００の分子量のアミノ化されたデキス
トラン及びデキストラン１ｇあたり約２・１０＾−＾４
モルのベンゼンヘキサカルボン酸から重合体が得られて
いること、そしてイオン結合は、重合体とベンゼンヘキ
サカルボン酸の間の結合に関与していない、重合体上に
固定されたベンゼンペンタカルボン酸塩のカルボン酸塩
基を介して打ち立てられていること、又共有結合は、ベ
ンゼンヘキサカルボン酸と重合体の間の結合にも前記イ
オン結合にも関与していないベンゼンペンタカルボン酸
のその他のカルボキシル基と、ヘモグロビンのＮＨ＿２
基の間で打ち立てられることを特徴とする、請求項（１
）に記載の方 法。 - （１３）重合体は、約１００００の分子量のアミノ化デ
キストランとデキストラン１ｇにつき約３．５×１０＾
−＾４のベンゼンヘキサカルボン酸から得られること、
イオン結合は、重合体とベンゼンヘキサカルボン酸の間
の結合に関与していない、重合体上に固定されたベンゼ
ンペンタカルボン酸塩のカルボン酸塩基を介して打ち立
てられること、又、共有結合は、ベンゼンヘキサカルボ
ン酸と重合体の間の結合にも前述のイオン結合にも関与
していないベンゼンペンタカルボン酸のその他のカルボ
キシル基とヘモグロビンのＮＨ＿２基の間で打ち立てら
れること、を特徴とする、請求項（１）に記載の方法。 - （１４）重合体は、約１００００の分子量のアミノ化デ
キストランとデキストラン１ｇにつき約３．２×１０＾
−＾４のベンゼンテトラカルボン酸から得られること、
そして、イオン結合は、ベンゼンテトラカルボン酸と重
合体の間の結合に関与していない、重合体上に固定され
たベンゼントリカルボン酸塩のカルボキシル酸塩基を介
して打ち立てられること、又共有結合はベンゼンテトラ
カルボン酸と重合体の間の結合にも前記イオン結合にも
関与していないベンゼントリカルボン酸のその他のカル
ボキシル基とヘモグロビンのＮＨ＿２基の間で打ち立て
られることを特徴とする、請求項（１）に記載の方法。 - （１５）重合体は、約１００００の分子量のアミノ化デ
キストランと重合体１ｇあたり約４・１０＾−＾４モル
のテトラカルボキシルブタンから得られること、そして
イオン結合は、重合体とブタンテトラカルボン酸と重合
体の間の結合に関与しない、重合体上に固定されたブタ
ントリカルボン酸塩のカルボン酸塩基を介して打ち立て
られること、又共有結合は、ブタンテトラカルボン酸と
重合体の間の結合にも前記イオン結合にも関与しないブ
タントリカルボン酸のその他のカルボキシル基とヘモグ
ロビンのＮＨ＿２基の間で打ち立てられることを特徴と
する、請求項（１）に記載の方法。 - （１６）重合体は、約５０００の分子量のアミノ化され
たモノメトキシポリオキシエチレンと重合体１ｇあたり
約１．５×１０＾−＾４モルのベンゼンヘキサカルボン
酸から得られること、そして、イオン結合は、重合体と
ベンゼンヘキサカルボン酸の間の結合に関与しない、重
合体上に固定されたベンゼンペンタカルボン酸塩のカル
ボン酸塩基を介して打ち立てられること、又共有結合は
、ベンゼンヘキサカルボン酸と重合体の結合にも前記イ
オン結合にも関与しないベンゼンペンタカルボン酸のそ
の他のカルボキシル基とヘモグロビンのＮＨ＿２基の間
で打ち立てられること、を特徴とする、請求項（１）に
記載の方法。 - （１７）重合体は、約１００００の分子量のデキストラ
ンと重合体１ｇあたり約１．１５×１０＾−＾３モルの
ベンゼン−１，２，４，５テトラカルボン酸から得られ
ていること、そしてイオン結合は、重合体とベンゼン−
１，２，４，５テトラカルボン酸の間の結合に関与しな
い、重合体上に固定されたベンゼントリカルボン酸塩の
カルボン酸塩基を介して打ち立てられること、又共有結
合は、ベンゼン−１，２，４，５テトラカルボン酸と重
合体の結合にも前記イオン結合にも関与しないベンゼン
トリカルボン酸のその他のカルボキシル基とヘモグロビ
ンのＮＨ＿２基の間で打ち立てられることを特徴とする
、請求項（１）に記載の方法。 - （１８）第１段階が終わった時点で、Ｚ部位を有する重
合体は、ヘモグロビンとの反応に付される前に活性化さ
れることを特徴とする、請求項（１）乃至（１７）に記
載の方法。 - （１９）活性化は、ＯＨ官能基を例えば過ヨウ素酸酸化
によってアルデヒド基に変えることから成ることを特徴
とする、請求項（１）乃至（１８）に記載の方法。 - （２０）重合体の部位Ｚの活性化及びそのヘモグロビン
との反応が実際には同時であることを特徴とする、請求
項（１）乃至（１９）に記載の方法。 - （２１）重合体のＺ部位が、 −Ｚ部位がアルデヒド基を含まずヒドロキシル官能基を
含む場合には、例えばカルボニルジイミダゾールを用い
て活性化されること、 −又は、Ｚ部位がカルボキシル基を含む場合には、ペプ
チド合成で用いられる試薬を用いて活性化されること を特徴とする、請求項（１）乃至（２０）に記載の方法
。 - （２２）重合体とヘモグロビンの間の反応が、最高約５
％のメトヘモグロビンを導く時間より短い時間、好まし
くは１０時間未満で、しかもヘモグロビンを適切に保存
できるような温度、例えば３℃と３０℃の間の温度で行
なわれることを特徴とする、請求項（１）乃至（２１）
に記載の方法。 - （２３）エステル結合を介してＺ部位が重合体に結びつ
けられているヘモグロビン共役体の請求項（１２）から
（２２）までのいずれかに記載の調製方法において、 −第１段階において、重合体上にＺ部位を固定させるた
め、重合体が可溶性をもつ媒質内でＯＨ官能基を含む重
合体特にデキストラン又はポリエチレングリコールに対
して、特にベンゼン−１，２，４，５−テトラカルボキ
シル２無水物又はベンゼン１，２，４トリカルボキシル
無水物といった無水物の形のＺ部位を反応させること、 −第２段階においては、約５〜約９のｐＨの水性媒質内
で、ヘモグロビンが変性を受けず重合体とのカップリン
グの後、酸素添加された形から脱酸された形へと可逆的
に移行できるような条件の下で、脱酸されていない媒質
内で酸素添加された形のヘモグロビンと単数又は複数の
部位Ｚを有する重合体Ｐを反応させ、こうして一方では
ヘモグロビンと重合体が有する部位Ｚのうちの少なくと
も１つの間の少なくとも１つのイオン結合、他方ではヘ
モグロビンと重合体が有する上記の同じＺ部位の間の少
なくとも１つの共有結合を形成させること、 を特徴とする方法。 - （２４）請求項（３）に記載の方法により得られること
を特徴とする高分子共役体。 - （２５）酸素に対して遊離ヘモグロビンのものより低い
親和力を呈し、自ら血漿中の酸素運搬機能を果たさなく
てはならない時間中生物分解性が全く又はほとんど無い
ようなヘモグロビンの水溶性高分子共役体において −それが一方では、脱酸された形から酸素添加された形
へ可逆的に移行することのできるヘモグロビン、そして
他方では、極性基好ましくはヒドロキシル基、カルボキ
シル基又はアミン基を含む分子量約１０００〜５０万好
ましくは約１０００〜１０万の、非抗原性で血球適合型
であることが望まれる水溶性、無毒の重合体によって構
成されていること； −かかる重合体には、硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル
酸塩の基から選ばれた少なくとも１つの基により支持さ
れ重合体とのイオン結合を作り上げることを目的とする
負の電荷を少なくとも１つ含み、又ヘモグロビンとの共
有結合を作り上げることを目的とする少なくとも１つの
カルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基を含んでいる
単数又は複数のＺ部位が付いていること；−重合体Ｐは
、 一方では重合体が有するＺ部位の少なくと も１つの負の電荷とヘモグロビンの間に打ち立てられる
少なくとも１つのイオン結合を介して、 他方では、重合体Ｐが有する前記Ｚ部位の カルボキシル基、アルデヒド基又はＯＨ基のうちの少な
くとも１つとヘモグロビンの間に打ち立てられる少なく
とも１つの共有結合を介して ヘモグロビンに結びつけられていること、 −重合体とヘモグロビンの間の共有結合の数は、高分子
共役体の平均分子量が約７００００から約１００万好ま
しくは約７００００から約５０万となるようなものであ
り、負の電荷の性質及び数、部位の数及び単量体の数の
関係は以下のとおりであること： Ｚ部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一 の陰イオン基を含む場合には、重合体一鎖あたり少なく
とも１つのかかるＺ部位、そして単量体１１個毎に最高
１つの部位がある； Ｚ部位が、部位と重合体の間の結合にもヘ モグロビンと重合体の間の共有結合にも関与しないカル
ボキシル酸塩１つから成る唯一の陰イオン基を含む場合
、重合体一鎖につき少なくとも１つのかかるＺ部位があ
る； −Ｚ部位が、２つのカルボキシル酸塩からくる２つの陰
イオン電荷を含む場合、重合体一鎖につき少なくとも１
つのかかるＺ部位及び６つの単量体毎に最高１つのＺ部
位がある； ことを特徴とする高分子共役体。 - （２６）ヘモグロビンと重合体Ｐの間の共役結合が、Ｚ
部位により支持されている少なくとも１つのカルボキシ
ル基又はアルデヒド基又はＯＨ基と、ヘモグロビンのア
ロステリック部位内にあるヘモグロビンの少なくとも１
つのアミン特にヘモグロビンの２つのβ末端バリンのう
ちの少なくとも１つのアミンの間で打ち立てられること
を特徴とする、請求項（２５）に記載の高分子共役体。 - （２７）ヘモグロビンの内部ＣＯＯ＾−基及びＮＨ＿３
＾＋基の間の塩橋は、ヘモグロビンが脱酸された形にあ
るとき無傷であることを特徴とする、請求項（２５）及
び（２６）に記載の高分子共役体。 - （２８）重合体Ｐは、多糖、特に、そのアルキル基が２
個から４個の炭素原子を含んでいるヒドロキシアルキル
でんぷん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体特に
アミノ化されたデキストラン、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン、ポリメタクリレート及びその誘
導体、ポリペプチド、そのアルキレン基には２〜５個の
炭素原子が含まれているようなポリアルキレングリコー
ル、特に、ポリエチレングリコール及びポリプロピレン
グリコールの中から選ばれることを特徴とする、請求項
（２６）及び（２７）に記載の高分子共役体。 - （２９）重合体Ｐの平均分子量は、それがデキストラン
及びその誘導体で構成されている場合７００００以下で
あり、それがポリアルキレングリコール、ポリビニルピ
ロリドン又はポリアクリル酸メチルの中から選ばれる場
合には１００００以下であることを特徴とする、請求項
（２５）乃至（２８）に記載の高分子共役体。 - （３０）エステル、エーテル、アミド又はアミン官能基
を介してＺ部位が重合体に結びつけられていることを特
徴とする、請求項（２５）乃至（２９）に記載の高分子
共役体。 - （３１）Ｚ部位は、ＯＳＯ＿３Ｈ、ＯＰＯ＿３Ｈ＿２、
Ｏ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）＿２、▲数式、化学式、表等があ
ります▼ 基（なおｎは１から約４まで変化する）を含むか、又は
ピリドキサル硫酸、ピリドキサルリン酸、アデノシン三
リン酸、ホスホチロシン、ホスホセリン、６リン酸イノ
シトール及びその誘導体、主鎖上に２〜１０個の炭素原
子を含むポリカルボン酸、少なくとも３つのカルボキシ
ル官能基を含むベンゼンカルボン酸から生じていること
を特徴とする、請求項（２５）乃至（３０）に記載の高
分子共役体。 - （３２）重合体とヘモグロビンの間の共有結合が、ヘモ
グロビンのＮＨ＿２基と重合体上に固定された部位Ｚか
らのカルボキシル基に基づいて打ち立てられることを特
徴とする、請求項（２５）乃至（３１）に記載の高分子
共役体。 - （３３）重合体Ｐとヘモグロビンの間のイオン結合は、
ヘモグロビンとＺ部位のカルボキシル酸塩基の間で打ち
立てられることを特徴とする、請求項（２５）乃至（３
２）に記載の高分子共役体。 - （３４）重合体は、約１００００の分子量のデキストラ
ンであり、イオン結合は、ベンゼン１，２，４−トリカ
ルボキシル酸無水物と重合体の間の結合に関与していな
い、重合体上に固定されたベンゼンジカルボン酸塩のカ
ルボン酸塩基を介して打ち立てられること、そして、共
有結合は、重合体とベンゼン−１，２，４−トリカルボ
キシル無水物の間の結合にも前記イオン結合にも関与し
ていないベンゼンジカルボン酸塩のその他のカルボキシ
ル基と、ヘモグロビンのＮＨ＿２基の間で打ち立てられ
ており、ベンゼンジカルボン酸塩基の数は、単量体１０
個毎に約１つであることを特徴とする高分子共役体。
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Cited By (1)
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| JP2004509168A (ja) * | 2000-09-19 | 2004-03-25 | デクストロ−サン コーポレーション | 血液代用品としてのデキストラン−ヘモグロビン複合体 |
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