JPH0242988A - 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物及び該微生物を用いるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物及び該微生物を用いるｌ−アミノ酸の製造法Info
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- JPH0242988A JPH0242988A JP63194031A JP19403188A JPH0242988A JP H0242988 A JPH0242988 A JP H0242988A JP 63194031 A JP63194031 A JP 63194031A JP 19403188 A JP19403188 A JP 19403188A JP H0242988 A JPH0242988 A JP H0242988A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が組み
込まれている組換えＤＮＡ、［組換えＤＮＡを有するバ
リン、ロイシン又はイソロイシン生産Ｍｔ用いるＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの製造法に関す
るものである。
込まれている組換えＤＮＡ、［組換えＤＮＡを有するバ
リン、ロイシン又はイソロイシン生産Ｍｔ用いるＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの製造法に関す
るものである。
発酵法によシム−バリン、Ｌ−ロイシｙ又ｈＬ−イソロ
イ、シンを製造しようとする場合、野生株は殆ど菌体外
にＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを生
産しないので、野生株に人工的に突然変異を生起せしめ
てＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生産
能を付与する方法がとられている。
イ、シンを製造しようとする場合、野生株は殆ど菌体外
にＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを生
産しないので、野生株に人工的に突然変異を生起せしめ
てＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生産
能を付与する方法がとられている。
Ｌ −ｚ４ リフ、 Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシ
ン生産能を有する人工変異株としては、ブレビバクテリ
ウム属又は、コリネバクテリウム属、又はセラチア属Ｏ
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又ｕＬ−イソロイシンのアン
タボニス）Ｋ耐性を有ｆるｆ真珠等が従来よシ知られて
いる。その内容はＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イ
ソロイシン生産ＶＣ８与するキイ酵素であるところのア
セトヒドロキシ酸シンターゼが末端生産物であるＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン及び／又はＬ−イソロイシンと、Ｌ
−バリン、Ｌ−ロイシン及び／又はＬ−インロイシ／の
アンタがニストによるフィードバック阻害を受けにくく
なった変異株を用いるものである。
ン生産能を有する人工変異株としては、ブレビバクテリ
ウム属又は、コリネバクテリウム属、又はセラチア属Ｏ
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又ｕＬ−イソロイシンのアン
タボニス）Ｋ耐性を有ｆるｆ真珠等が従来よシ知られて
いる。その内容はＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イ
ソロイシン生産ＶＣ８与するキイ酵素であるところのア
セトヒドロキシ酸シンターゼが末端生産物であるＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン及び／又はＬ−イソロイシンと、Ｌ
−バリン、Ｌ−ロイシン及び／又はＬ−インロイシ／の
アンタがニストによるフィードバック阻害を受けにくく
なった変異株を用いるものである。
ところが、上記のＬ−バリン、Ｌ−ロイ７ン又はＬ−イ
ソロイシン生産菌の限界は、アセトヒト０キシ酸シンタ
ーゼをコードする遺伝子がゲノム当シ１個であシ、いか
にフィードバック阻害を解除しても酵素自身の最大活性
に自ら限界がある。
ソロイシン生産菌の限界は、アセトヒト０キシ酸シンタ
ーゼをコードする遺伝子がゲノム当シ１個であシ、いか
にフィードバック阻害を解除しても酵素自身の最大活性
に自ら限界がある。
又、各々の生産菌でのフィードバック阻害の解除も容易
ではない。
ではない。
本発明は、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイクン又はＬ−イソロイ
シンの生合成系の代謝調箪の人為的制御もしくは打破に
よって成立している従来のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又
はＬ−イソロイシン生産方法の限界の一つである生合成
系の分子数の制限、即ち、遺伝子の制限という欠点を解
除し、更にはフィードバック阻害の解除を容易にすると
いう方法を提示するものである。具体的には、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイ７ン又はＬ−インロイクン生合成の共通の
キイ酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼのＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンによるフィード
バック阻害の解除とその遺伝子数の増強を目的とし九、
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを製造
する方法について明らかにするものである。
シンの生合成系の代謝調箪の人為的制御もしくは打破に
よって成立している従来のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又
はＬ−イソロイシン生産方法の限界の一つである生合成
系の分子数の制限、即ち、遺伝子の制限という欠点を解
除し、更にはフィードバック阻害の解除を容易にすると
いう方法を提示するものである。具体的には、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイ７ン又はＬ−インロイクン生合成の共通の
キイ酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼのＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンによるフィード
バック阻害の解除とその遺伝子数の増強を目的とし九、
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを製造
する方法について明らかにするものである。
本発明者らは、上記問題点について鋭意検討の結果、ブ
レビ属細菌よシ得たアセトヒドロキシ酸シンターゼをコ
ードするＤＮＡ断片を組み込んだ自立増殖可能な１ラス
ミドをコリネホルムのグルタミン酸生産菌（グレピパク
テリウム・ラクトフッ−メンタムなど）に保有せしめる
事によシ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイ
シン生産能が向上することを見いだした。
レビ属細菌よシ得たアセトヒドロキシ酸シンターゼをコ
ードするＤＮＡ断片を組み込んだ自立増殖可能な１ラス
ミドをコリネホルムのグルタミン酸生産菌（グレピパク
テリウム・ラクトフッ−メンタムなど）に保有せしめる
事によシ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイ
シン生産能が向上することを見いだした。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
は、ブレビバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡより得る
ことができる。この上うにアセトヒドロキシ酸シンター
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片等遺伝情報を担ったＤＮＡを
与えるものをＤＮＡ供与菌と称する。
は、ブレビバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡより得る
ことができる。この上うにアセトヒドロキシ酸シンター
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片等遺伝情報を担ったＤＮＡを
与えるものをＤＮＡ供与菌と称する。
ＤＮＡ供与菌としては、バリン、ロイシン又はイソロイ
シンのアンタゴニストに対するｉｔ＆などの変異を付与
することによシ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イ
ソロイシンまたはその前駆体の生合成活性が高まったよ
うな変異株を用いれば更によい、バリン、ロイシン又は
イソロイシンのアンタゴニストの例としては、α−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸、アミノヘキシルイソ吉草酸
、イソロイシンハイドロキサメート、２−チアゾールア
ラニン、β−ハイドロキシロイシン、トリクロロアラニ
ン、ｒ−メチルリジン等がある。
シンのアンタゴニストに対するｉｔ＆などの変異を付与
することによシ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イ
ソロイシンまたはその前駆体の生合成活性が高まったよ
うな変異株を用いれば更によい、バリン、ロイシン又は
イソロイシンのアンタゴニストの例としては、α−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸、アミノヘキシルイソ吉草酸
、イソロイシンハイドロキサメート、２−チアゾールア
ラニン、β−ハイドロキシロイシン、トリクロロアラニ
ン、ｒ−メチルリジン等がある。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子を得るには、ＤＮ
Ａ供与菌よシ染色体ＤＮＡを分離後、適当にこれを切断
し、得られた染色体ＤＮＡ断片を適当なプラスミドに挿
入した後、この組み換えプラスミドをブレビバクテリウ
ム属細菌のアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株に導入
し、アセトヒドロキシ酸シンターゼ生成能を獲得した形
質転換株を採取すればよい。
Ａ供与菌よシ染色体ＤＮＡを分離後、適当にこれを切断
し、得られた染色体ＤＮＡ断片を適当なプラスミドに挿
入した後、この組み換えプラスミドをブレビバクテリウ
ム属細菌のアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株に導入
し、アセトヒドロキシ酸シンターゼ生成能を獲得した形
質転換株を採取すればよい。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子をツレビ・譬りテ
リウム属細菌の菌体内で自律複製できるベクタープラス
ミド上に挿入してブレビバクテリウム属細菌のＤＮＡ受
容菌に導入すれば、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−
イソロイシン生産能の向上した株を得ることができる。
リウム属細菌の菌体内で自律複製できるベクタープラス
ミド上に挿入してブレビバクテリウム属細菌のＤＮＡ受
容菌に導入すれば、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−
イソロイシン生産能の向上した株を得ることができる。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子としては、野生型
のものを用いることができるし、更に変異型の遺伝子を
用いることもできる。変異型遺伝子としては、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンてよるフィード
バック阻害の程度が軽減されたアセトヒドロキシ酸シン
ターゼをコードするように変異されたものが特に好まし
い。
のものを用いることができるし、更に変異型の遺伝子を
用いることもできる。変異型遺伝子としては、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンてよるフィード
バック阻害の程度が軽減されたアセトヒドロキシ酸シン
ターゼをコードするように変異されたものが特に好まし
い。
変異型の遺伝子を得るには、ＤＮＡ供与菌を変異処理シ
てもよいが、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子をベ
クタープラスミドに挿入して得た組み換えＤＮＡをＤＮ
Ａ受容菌に導入し、得られた形質転換株を変異処理した
方が変異型遺伝子が得られる可能性が高い、更に、上記
組み換えＤＮＡ自体を生体外で変異処理すれば、変異型
遺伝子が得られる効率が最も高い。
てもよいが、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子をベ
クタープラスミドに挿入して得た組み換えＤＮＡをＤＮ
Ａ受容菌に導入し、得られた形質転換株を変異処理した
方が変異型遺伝子が得られる可能性が高い、更に、上記
組み換えＤＮＡ自体を生体外で変異処理すれば、変異型
遺伝子が得られる効率が最も高い。
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンによる
フィードバック阻害の程度がよシ軽減されたアセトヒド
ロキシ酸シンターゼをコードスル変異型遺伝子を選別す
る方法は、ＤＮＡ供与菌及び上記組み換えＤＮＡが導入
された形質転換株のいずれの場合も、また組み換えＤＮ
Ａを変異処理したときは、変異処理した組み換えＤＮＡ
をＤＮＡ受容菌に導入して形質転換株を得た後、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニ
ストに耐性を獲得したＤＮＡ供与菌または形質転換株を
選別すればよい。
フィードバック阻害の程度がよシ軽減されたアセトヒド
ロキシ酸シンターゼをコードスル変異型遺伝子を選別す
る方法は、ＤＮＡ供与菌及び上記組み換えＤＮＡが導入
された形質転換株のいずれの場合も、また組み換えＤＮ
Ａを変異処理したときは、変異処理した組み換えＤＮＡ
をＤＮＡ受容菌に導入して形質転換株を得た後、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニ
ストに耐性を獲得したＤＮＡ供与菌または形質転換株を
選別すればよい。
アンタゴニストに耐性を獲得したＤＮＡ供与菌又は形質
転換株がＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシ
ンによるフィードパ、り阻害の程度がよシ軽減されたア
セトヒドロキシ酸シンターゼをコードする変異型遺伝子
を有するものであることを確認するためには、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシフ又Ｆｉ Ｌ −イソロイシンのアンタ
ゴニストに耐性を獲得したＤＮＡ供与菌または形質転換
株よ）ｊ７１宜酵素液を調製し、ピルビン酸を基質とし
て種々の濃度のＩ、 −／？リン、Ｌ−ロイシン又はＬ
−イソロイシンの存在下に上記酵素液による２アセト乳
酸の生成量を測定する。高濃度のＬ −ノＺリン、Ｌ−
ロイシン又はＬ−インロイクンの存在下でも２アセト乳
酸の生成活性が高い酵素液がＬ−ノ４ リフ、Ｌ−ロイ
シン又はＬ−イソロイシンによるフィードバック阻害の
程度がよｐ＠減され九アセトヒドロキシ酸７ンターゼを
含有する。
転換株がＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシ
ンによるフィードパ、り阻害の程度がよシ軽減されたア
セトヒドロキシ酸シンターゼをコードする変異型遺伝子
を有するものであることを確認するためには、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシフ又Ｆｉ Ｌ −イソロイシンのアンタ
ゴニストに耐性を獲得したＤＮＡ供与菌または形質転換
株よ）ｊ７１宜酵素液を調製し、ピルビン酸を基質とし
て種々の濃度のＩ、 −／？リン、Ｌ−ロイシン又はＬ
−イソロイシンの存在下に上記酵素液による２アセト乳
酸の生成量を測定する。高濃度のＬ −ノＺリン、Ｌ−
ロイシン又はＬ−インロイクンの存在下でも２アセト乳
酸の生成活性が高い酵素液がＬ−ノ４ リフ、Ｌ−ロイ
シン又はＬ−イソロイシンによるフィードバック阻害の
程度がよｐ＠減され九アセトヒドロキシ酸７ンターゼを
含有する。
ＤＮＡ供与供与形質転換株または組み換えＤＮＡに変異
を与えるには、Ｎ−メチル−「−ニトロ−Ｎ−二トロン
グアニジンまたは亜硫酸等の変異誘起剤にＤＮＡ供与供
与形質転換株又は組み換えＤＮＡを晒すかあるいはＤＮ
Ａ供与供与形質転換株又は組み換えＤＮＡ Ｋ Ｘ線、
紫外線、ｒｍ等を照射する等の方法がある。尚、このよ
うな遺伝子に変異を与える方法は、アセトヒドロキシ酸
シンターゼ以外のいかなる遺伝子についても効率よい変
異方法として利用できる。また宿主がプレビパクテリク
ム以外の例えばエシェリヒア・コリ、コリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌、バチルス・ズブチリス等であっても
、上記の遺伝子に変異を与える方法は利用できる。
を与えるには、Ｎ−メチル−「−ニトロ−Ｎ−二トロン
グアニジンまたは亜硫酸等の変異誘起剤にＤＮＡ供与供
与形質転換株又は組み換えＤＮＡを晒すかあるいはＤＮ
Ａ供与供与形質転換株又は組み換えＤＮＡ Ｋ Ｘ線、
紫外線、ｒｍ等を照射する等の方法がある。尚、このよ
うな遺伝子に変異を与える方法は、アセトヒドロキシ酸
シンターゼ以外のいかなる遺伝子についても効率よい変
異方法として利用できる。また宿主がプレビパクテリク
ム以外の例えばエシェリヒア・コリ、コリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌、バチルス・ズブチリス等であっても
、上記の遺伝子に変異を与える方法は利用できる。
また、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子のプロモー
ターオペレーターとして、宿主菌野生型のものを用いる
こともできるし、更にプロモーターオペレーターの変異
株由来のものを用いることもできる。また更に、すでに
他種遺伝子を効率よく発現することが知られている強力
なプロモーターを使用することも可能である。また、プ
ロモーターオペレーターＤＮＡは他生物由来もしくは化
学的に合成されたものであってもよい、また、１ラスミ
ド上で得られた変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼは
、再び宿主染色体へ導入することも可能でろって、ま九
、他の生物由来もしくは化学的に合成された遺伝子の場
合も同様の操作を行うことができる。
ターオペレーターとして、宿主菌野生型のものを用いる
こともできるし、更にプロモーターオペレーターの変異
株由来のものを用いることもできる。また更に、すでに
他種遺伝子を効率よく発現することが知られている強力
なプロモーターを使用することも可能である。また、プ
ロモーターオペレーターＤＮＡは他生物由来もしくは化
学的に合成されたものであってもよい、また、１ラスミ
ド上で得られた変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼは
、再び宿主染色体へ導入することも可能でろって、ま九
、他の生物由来もしくは化学的に合成された遺伝子の場
合も同様の操作を行うことができる。
風下余白
〔実施例〕
以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。
実施例１
（１） 染色体ＤＮＡの調製
グレピパクテリウム・ラクト７アーメンタムのＬ−Ｍａ
ｌ生産菌を５９ ＩＬＩｏＣＭ２Ｇ培地（ポリペプトン
１０＆、Ｙ、Ｅ、１０！ｉ、グルコース５１ 、 Ｎａ
ＣＬ５Ｉを含む）に植菌し、３１℃で一晩振盪培養を行
り、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体ｌｌをリゾチ
ウム−ＳＯＳで溶菌させたのちフェノール法によシ染色
体ＤＮＡを抽出精製し最終的に５ＩＩｇのＤＮＡを得た
。
ｌ生産菌を５９ ＩＬＩｏＣＭ２Ｇ培地（ポリペプトン
１０＆、Ｙ、Ｅ、１０！ｉ、グルコース５１ 、 Ｎａ
ＣＬ５Ｉを含む）に植菌し、３１℃で一晩振盪培養を行
り、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体ｌｌをリゾチ
ウム−ＳＯＳで溶菌させたのちフェノール法によシ染色
体ＤＮＡを抽出精製し最終的に５ＩＩｇのＤＮＡを得た
。
（２） ヘ／ ターＤＮＡ ＯＩｊＩ製ベクターとし
てｐＡＪ２２０ （５４４５ｂｐ ）を用い、そのＤＮ
Ａを常法に従い調製した。
てｐＡＪ２２０ （５４４５ｂｐ ）を用い、そのＤＮ
Ａを常法に従い調製した。
（３）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入（１）で得た染
色体ＤＮＡ３０ Ａｌ ｔ−８ａｕ３Ａ Ｉで部亦切断
し、更に２〜６キロベースを切シ出した。−万ペクｆｉ
−ＤＮＡ １μ１ｆｌｌｌｌａ工ンドヌクレアーゼＢａ
ｍ１ｉｌで完全に切断した０以上両者をタカラライダー
７声ンキットを用いて結合した。
色体ＤＮＡ３０ Ａｌ ｔ−８ａｕ３Ａ Ｉで部亦切断
し、更に２〜６キロベースを切シ出した。−万ペクｆｉ
−ＤＮＡ １μ１ｆｌｌｌｌａ工ンドヌクレアーゼＢａ
ｍ１ｉｌで完全に切断した０以上両者をタカラライダー
７声ンキットを用いて結合した。
（４） アセト上Ｐｅ１ｄＰＶ＃１クンターゼ遺伝子
のククー二ンダ アセトヒドロキク酸７ンターゼ活注を欠失してル要求株
）を受容１として用いた。
のククー二ンダ アセトヒドロキク酸７ンターゼ活注を欠失してル要求株
）を受容１として用いた。
形質転換法としては、特開昭６１−１４９０８２号公報
に記載されているグｕ ） ７＃９スト法ｔ−用＾九、
形質転換株の中からトリメトプリム抵抗性でかつ、イン
ロイクン、バリン非要求性となった４株を得た・ （５） 形質転換株のプラスミド解析上述の４株よｐ
す／チーム・８ＤＢによ５ｆ１１ｍ１液を調製し、ＤＮ
Ａを回収した。
に記載されているグｕ ） ７＃９スト法ｔ−用＾九、
形質転換株の中からトリメトプリム抵抗性でかつ、イン
ロイクン、バリン非要求性となった４株を得た・ （５） 形質転換株のプラスミド解析上述の４株よｐ
す／チーム・８ＤＢによ５ｆ１１ｍ１液を調製し、ＤＮ
Ａを回収した。
アガロース電気泳＃によタデラスンドＤＮムを分析し九
ところ、いずれもｐＡＪ２２０より大きなプラスミドで
約３ｋｌ）＋２）ＤＮＡ断片が挿入されていることが明
らかとなった。これらプラスミドの一つをｐＡＪ２２０
Ｖ３と命名した。
ところ、いずれもｐＡＪ２２０より大きなプラスミドで
約３ｋｌ）＋２）ＤＮＡ断片が挿入されていることが明
らかとなった。これらプラスミドの一つをｐＡＪ２２０
Ｖ３と命名した。
（６）再形質転換
ターゼ遺伝子がクローン化されたことが明らかになりた
。
。
表−１
よって、上述の３ ｋｂのＤＮＡ断片上に７セトヒドロ
キシ酸シンターゼ遺伝子が存在していることは明らかで
ある。
キシ酸シンターゼ遺伝子が存在していることは明らかで
ある。
（７） 形質転換株のアセトヒドロキシ酸シンターゼ
活性被検株を生産培地（Ａ）で約１８時間培養した歯体
から超音波処理により溶菌液を調製し、これを１５．０
０Ｏｒ、ｐ、ｒｎ、 ２０分間遠心して上清を得た。
活性被検株を生産培地（Ａ）で約１８時間培養した歯体
から超音波処理により溶菌液を調製し、これを１５．０
０Ｏｒ、ｐ、ｒｎ、 ２０分間遠心して上清を得た。
この上清を粗酵素液として用い、６５ ｍＭりん酸バッ
フｙ−１００ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む反応液中
で酵素反応を行い、生じたアセト乳酸をアセトインに変
換したのち、２−ナフトールで発色させて波長５３０ｎ
ｍで定量した。
フｙ−１００ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む反応液中
で酵素反応を行い、生じたアセト乳酸をアセトインに変
換したのち、２−ナフトールで発色させて波長５３０ｎ
ｍで定量した。
表−１にその測定結果を示した。
この結果、ｐＡＪ２２０Ｖ３に７セトヒドロ中７酸シン
菌 株 Ｎｏｎ＠Ｌ−１１＊ Ｌ−Ｌｍ
ｕ Ｌ−ＶａｌＡＪ１２４０３
Ｎ、Ｄ。
菌 株 Ｎｏｎ＠Ｌ−１１＊ Ｌ−Ｌｍ
ｕ Ｌ−ＶａｌＡＪ１２４０３
Ｎ、Ｄ。
ＡＪ１２４０３／ｐＡＪ２２０Ｖ３ １００ １０１
１１９ １０８ＡＴＣＣ１３８６９１００６０６７６
ＯＮＤ：検出できず。数字は、アミノ酸無添加時の活性
を１００とした時の相対活性値優）を示した。
１１９ １０８ＡＴＣＣ１３８６９１００６０６７６
ＯＮＤ：検出できず。数字は、アミノ酸無添加時の活性
を１００とした時の相対活性値優）を示した。
（８） ｐＡＪ２２０Ｖ３ Ｏ制限酵素切断地図挿入
された約３ｋｂ（２）ＤＮＡ断片中にはＥａｏＲマ、Ｐ
ｓｔｌサイトが少なくとも２ケ所及びＢａ１ｌ、ｇｃｏ
Ｒｌ。
された約３ｋｂ（２）ＤＮＡ断片中にはＥａｏＲマ、Ｐ
ｓｔｌサイトが少なくとも２ケ所及びＢａ１ｌ、ｇｃｏ
Ｒｌ。
Ｂａ１ｌサイトが１ケ所存在する。これらの簡単な制限
酵素地図を図−１に示した。
酵素地図を図−１に示した。
実施例２
（υ 野生株の形質転換株によるＬ−バリン生腫注プレ
ビパクテリクム・ラクト７アーメンタムの野生株ＡＴＣ
Ｃ１３８６９及びブレビバクテリウム・７うにＩ、 −
ｔＪ ＩＪンの顕著な生産性が認められた。
ビパクテリクム・ラクト７アーメンタムの野生株ＡＴＣ
Ｃ１３８６９及びブレビバクテリウム・７うにＩ、 −
ｔＪ ＩＪンの顕著な生産性が認められた。
表−２
菌 株
Ｌ−バリン（み／ｌｌ）＊
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＡＪ２２０Ｖ３ （ＡＪ１２４
０４） ７ＡＪ１５１０／ｐＡＪ２２０Ｖ
３ （ＡＪ１２４０５） １１ＡＴＣ
Ｃ１３８６９０ ＡＪ１５１０
０＊生産培跡）ニゲルコースｉｏｏ
、９．硫酸アンモニウム４５Ｉ、すｙ＠１カリウム１．
Ｐ、＠酸マグネシウム１１ 、 ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０
０，０１１、ＭｎＳＯ４”７Ｈ２００，０１，Ｆ、豆濃
（総窒素量）０．１５．９．ピオチン１００ Ｅｌ 、
ヒｐ ミｙ Ｂ 、ｔＪ［１ｍ！ ｔｘ３００ ＡＩ
Ｋ ｇ Ｉｆ 水を加しテｒｔ ７．２ （ＫＯＨ）
にｖＩ４１ＥＬり後ＩＬとし、５０ｄ容の坂ロコルベン
フラスコに２０１１１分注し、オートクレイプ殺菌エエ
５℃−１０ｍｉｎを行い、別に乾熱殺菌した炭酸カル７
ウムＩＩを加えた。
０４） ７ＡＪ１５１０／ｐＡＪ２２０Ｖ
３ （ＡＪ１２４０５） １１ＡＴＣ
Ｃ１３８６９０ ＡＪ１５１０
０＊生産培跡）ニゲルコースｉｏｏ
、９．硫酸アンモニウム４５Ｉ、すｙ＠１カリウム１．
Ｐ、＠酸マグネシウム１１ 、 ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０
０，０１１、ＭｎＳＯ４”７Ｈ２００，０１，Ｆ、豆濃
（総窒素量）０．１５．９．ピオチン１００ Ｅｌ 、
ヒｐ ミｙ Ｂ 、ｔＪ［１ｍ！ ｔｘ３００ ＡＩ
Ｋ ｇ Ｉｆ 水を加しテｒｔ ７．２ （ＫＯＨ）
にｖＩ４１ＥＬり後ＩＬとし、５０ｄ容の坂ロコルベン
フラスコに２０１１１分注し、オートクレイプ殺菌エエ
５℃−１０ｍｉｎを行い、別に乾熱殺菌した炭酸カル７
ウムＩＩを加えた。
実施例３
（１） スレオニンデアミナーゼとの共存にょるＬ−
イソロイシン生産性 プレピパクテリクムフラパムの野生株ＡＪ１５１０Ｋ
ｐＡＪ２２０Ｖ３と、Ｌ−イアｏイ７ンに脱感作したに
、ｅｏｌｉのスレオニンデアミナーゼ遺伝子１１ｖＡ”
をＡＪ１２４０６では、表−３に示すようにスレオニン
デアミナーゼ（ＴＤ ）とアセトヒドロキシ酸シンター
ゼ（ＡＨＡＳ ）との比活性が共に野生株に対して上昇
し、表−４に示すようにそれぞれを単独に導入した場合
に比べてＬ−インロイ７ンの生産性の増加が認められた
。
イソロイシン生産性 プレピパクテリクムフラパムの野生株ＡＪ１５１０Ｋ
ｐＡＪ２２０Ｖ３と、Ｌ−イアｏイ７ンに脱感作したに
、ｅｏｌｉのスレオニンデアミナーゼ遺伝子１１ｖＡ”
をＡＪ１２４０６では、表−３に示すようにスレオニン
デアミナーゼ（ＴＤ ）とアセトヒドロキシ酸シンター
ゼ（ＡＨＡＳ ）との比活性が共に野生株に対して上昇
し、表−４に示すようにそれぞれを単独に導入した場合
に比べてＬ−インロイ７ンの生産性の増加が認められた
。
表−３
ＡＪ１５１０／ｐＡＪ２２０Ｖ３（ＡＪ１２４０５）
１２．８ＡＪ１５１０／ｐＤＲＩＡ４（ＡＪ１２３５
８） １３５．７ＡＪ１５１０
３５．２５．１１ １．０４ １．１０ 表−４ ０，０１，Ｐ、豆ａ（総窒素量）０．６．！ｉ’、ピオ
チン５０μＩ、ビタミンＢ、塩酸塩３〜に蒸留水を加え
て−を８．３ （ＫＯＨ）に調整した後ＩＬとし、５０
ダ容の坂ロコルペンフラスコに２０１ｕ分注し、オート
クンイブ殺菌１１５℃−１５ｍｉｎを行い、別に乾熱殺
菌した炭酸カルシウムＩＩｉを加えた。
１２．８ＡＪ１５１０／ｐＤＲＩＡ４（ＡＪ１２３５
８） １３５．７ＡＪ１５１０
３５．２５．１１ １．０４ １．１０ 表−４ ０，０１，Ｐ、豆ａ（総窒素量）０．６．！ｉ’、ピオ
チン５０μＩ、ビタミンＢ、塩酸塩３〜に蒸留水を加え
て−を８．３ （ＫＯＨ）に調整した後ＩＬとし、５０
ダ容の坂ロコルペンフラスコに２０１ｕ分注し、オート
クンイブ殺菌１１５℃−１５ｍｉｎを行い、別に乾熱殺
菌した炭酸カルシウムＩＩｉを加えた。
図−１はプラスミドｐＡＪ２２０Ｖ３の制限酵素切断地
図を示す。 ＡＪ１５１０／ｐＤＲＩＡ４．ｐＡＪ２２０Ｖ３（ＡＪ
１２４０６）ＡＪ１５１０／ｐＡＪ２２０Ｖ３（ＡＪ１
２４０５）ＡＪ１５１０／ｐＤＲＩＡ４（＾Ｊ１２３５
８）Ｊ１５１０
図を示す。 ＡＪ１５１０／ｐＤＲＩＡ４．ｐＡＪ２２０Ｖ３（ＡＪ
１２４０６）ＡＪ１５１０／ｐＡＪ２２０Ｖ３（ＡＪ１
２４０５）ＡＪ１５１０／ｐＤＲＩＡ４（＾Ｊ１２３５
８）Ｊ１５１０
Claims (25)
- （１）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子を組み込ん
だ自律増殖可能なプラスミッドまたはファージ。 - （２）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子がブレビバ
クテリウム属細菌由来の遺伝子である第（１）請求項記
載のプラスミッドまたはファージ。 - （３）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が野生型遺
伝子である第（１）請求項記載のプラスミッドまたはフ
ァージ。 - （４）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が変異遺伝
子であって、フィードバック阻害が解除されている遺伝
子である第（１）請求項記載のプラスミッドまたはファ
ージ。 - （５）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が本来の、
もしくは他遺伝子のプロモーター支配下にある遺伝子で
ある第１請求項記載のプラスミッドまたはファージ。 - （６）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が本来の、
もしくは他遺伝子のトリメトプリム耐性遺伝子のプロモ
ーター支配下にある遺伝子である第（１）請求項記載の
プラスミッドまたはファージ。 - （７）第（１）請求項から第（６）請求項記載のプラス
ミッドまたはファージを保有する微生物。 - （８）微生物がブレビバクテリウムである第（７）請求
項記載の微生物。 - （９）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンを生産
するブレビバクテリウムである第（７）請求項記載の微
生物。 - （１０）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンの生
合成のリプレッションが解除されたブレビバクテリウム
である第（７）請求項記載の微生物。 - （１１）微生物がコリネホルムのグルタミン酸生産菌で
ある第（７）請求項記載の微生物。 - （１２）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンを生
産するコリネホルムのグルタミン酸生産菌である第（７
）請求項記載の微生物。 - （１３）微生物がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムである第（７）請求項記載の微生物。 - （１４）微生物がブレビバクテリウム・フラバムである
第（７）請求項記載の微生物。 - （１５）微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムで
ある第（７）請求項記載の微生物。 - （１６）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンを生
産するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムであ
る第（７）請求項記載の微生物。 - （１７）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンを生
産するブレビバクテリウム・フラバムである第（７）請
求項記載の微生物。 - （１８）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンを生
産するコリネバクテリウム・グルタミクムである第（７
）請求項記載の微生物。 - （１９）プラスミド上のアセトヒドロキシ酸シンターゼ
遺伝子を染色体上に転移させた微生物。 - （２０）微生物がブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムである第（１９）請求項記載の微生物。 - （２１）微生物がブレビバクテリウム・フラバムである
第（１９）請求項記載の微生物。 - （２２）微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムで
ある第（１９）請求項記載の微生物。 - （２３）微生物がバリン、ロイシン、イソロイシンの生
産能を高めるようなプラスミドもしくはファージを保持
している第（７）請求項又は／及び第（１９）請求項記
載の微生物。 - （２４）プラスミッドが第（１）請求項のプラスミッド
と共存可能である第（２３）請求項に記載されているプ
ラスミッド。 - （２５）第（７）請求項から第（２３）請求項までの菌
株を培養し、培養液からＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ
−イソロイシンを単離することを特徴とするＬ−バリン
、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの製造法。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP63194031A JP2748418B2 (ja) | 1988-08-03 | 1988-08-03 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
| EP89114207A EP0356739B1 (en) | 1988-08-03 | 1989-08-01 | Recombinant DNA, microorganism carrying said recombinant DNA, and process for producing L-amino acids by the use of said microorganism |
| DE68925083T DE68925083T2 (de) | 1988-08-03 | 1989-08-01 | Rekombinante DNS, diese rekombinante DNS enthaltender Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäure unter Verwendung dieses Mikroorganismus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63194031A JP2748418B2 (ja) | 1988-08-03 | 1988-08-03 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242988A true JPH0242988A (ja) | 1990-02-13 |
| JP2748418B2 JP2748418B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=16317788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63194031A Expired - Fee Related JP2748418B2 (ja) | 1988-08-03 | 1988-08-03 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0356739B1 (ja) |
| JP (1) | JP2748418B2 (ja) |
| DE (1) | DE68925083T2 (ja) |
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