JPH0242999A - ヌクレオチド配列を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｆユ３Ｚ≧し［す、用３５− 本発明は一つまたはそれ以上の変異ヌクレオチド配列の
存在または不在をその増幅または欠如により検出する方
法およびそのキットに関する。

本発明は、遺伝条件、素質または体細胞突然変異のため
の［ｌＮＡ　Ｅネ１の診断上のスクリーニングに特に関
係があり、なかんずく点突然変異の容易な検出のための
方法を提供する。また、そのＤＮＡまたはＲＮＡの分析
による感染病原菌の検出および型の検査に有用である。

従沫！す剋に １１Ｎ八レベルの特定の突然変異による数百の遺伝疾■
、がヒトに存在することが知られでいる。ある種のごれ
らの疾病の分子論的根拠はすでに知られており、現在突
然変５′この性質がまだ知られていないこれらの遺伝疾
＋１ｔのための分子論的根拠も研究によりや、速に明ら
かにされつつある。遺伝的条件のための正確な分子論的
根拠が知られていないものでもｌ交・を座位を持つｉｆ
ｆ伝的連関においてυＮ４プローブを用いるＲＦＬ１１
技術により、情報を与える家系にｍ体の異常または位置
の診断が提供されるであろう。このようにして現在例え
ばデュシエンヌ筋ジストロフィー、嚢胞性線維１よおよ
びなかんずくハンチングトン舞踏症がＲＦＬＩ＋技術を
用いて診断されている。しかしながら、そのような試験
は各々の条件に関して別々に実施する必要がありかなり
の星の仕事が必要とされ、各りの場合についてなかんず
（ＤＮＡ精製、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動
、ナザンブロンティング、ハイブリダイゼーション、ハ
イブリダイズした遺伝子プ「ｔ−プの検出および系統分
析を必要とする。ある種の他の遺伝条件は遺伝子に単一
点突然変異を伴う事が知られζいるが、各々のこれらの
条件は別々に分析されなければならないし、さらに、点
突然変異が不均質である場合特に困難である。このよう
に例えば４０以上の異なった点突然変異がβ−サラセミ
アを起こすことができ、少くとも５つ多分１２以上の点
突然変異が血友病Ａを起こすことができる。これらの不
均質条件に関し、現在各々の潜在する突然変異点が別々
に分析される必要があろう。このことは複数の制限酵素
による複雑なＲＦ　１．Ｐ単一型分析が含まれることに
なろう。

例えば皿しオンコジーン内の点突然変異のごとく、体細
胞中の多くの点突然変異が種々の癌の発生に含まれてい
る［Ｊ、　Ｌ、　Ｂｏｏｓ　ら、ネーチャー双７　２９
３（１９８７）］　。

セタス（Ｃｅｔｕｓ）　コーポレーションのヨーロッパ
特許出願第８７３０２１９６．８号（公開第２３７　、
３（１２号）はＡｉｔ　ｔｌ中に含まれる１つまたはそ
れ以上の核酸において配列中の少くとも１つのヌクレオ
チド変異の存在または不在を検出する方法を記載してお
り、その方法は： （ａ）−緒にまたは連続的に４つの異ったヌクレオチド
三リン酸、ヌクレオチド三リン酸の重合化剤、および前
記変異を含むと思われる各々の核酸の鎖のための１つの
オリゴヌクレオチド　プライマーでハイブリダイゼーシ
ョン条件下試料を処理し、各々の核Ｎ１５ｊ″（が検出
されるべき各りの５゛シつだ変異を含むようにし、各々
の核酸鎖と相補的である各々のプライマーの延長生成物
を合成し、前記プライマーまたはプライマー類は各々の
異なった変異を含む各々の核酸に実質的に相１＋Ｉｉ的
になるように選択されており、そのためそれがその和捕
物から分４ｔされた場合、１つのプライマーから合成さ
れた延長側生成物は他のプライマーの延長生成物の合成
のための８１ｉ型として働くことができ；（＋１）変性
条件下試キ１壱処理し、もし検出されるべき変５゛シが
存在するならその鋳型からプライマー延長４１′成物を
分画し； （ｃ）−緒にまたは連続的に前記４つのヌクレオチド三
リン酸、ヌクレオチド三リン酸の重合剤、およびオリゴ
ヌクレオチド　フ゛ライマーで３人ｊ′１を処理し、行
程（ｂ）で産生された各々の単一鎖を鋳型として使用し
てプライマー延長生成物が合成され、配列変異を含む核
酸がもし存在するなら検出可能になるほど増幅されるま
で十分な回数、行程（ｂ）および（ｃ）を繰り返し； （ｄ）工程（Ｃ）の生成物を１１りに固定し；（ｃ）ハ
イブリダイゼーション条・外下、プローブの配列が増幅
配列の領域と相補的である場合のみ増幅核酸配列でハイ
ブリダイズ可能な標識配列特異的オリゴヌクレオチド　
プ１コープで膜を処理し；および （ｆ＞核酸試料中の増幅配列へプローブがハイブリダイ
ズしたかどうかを検出することから成っている。

少くとも１つのヌクレオチド変異の存在または不在の検
定はある種の特定の状態においては別の方法でも達成さ
れるかもしれない０点突然変異が制限部位を創造または
破壊するような特異な場合においては（例えば譲状赤血
球性貧血）、増幅前または後に、制限酵素消化を用いら
れるであろう［Ｆ、Ｆ、　ＣＩ＋ｅｈａｂ　ら、不−千
＋　−３２９２９３，（１９８７）］。

さらに核酸配列の大規模な欠失に関しては、増幅のため
のプライマーはα−サラセミアを引き起こす２３ｋｂ欠
失のごとき疑われる欠失内の領域に対して調製されるで
あろうし；そのような場合欠失配列を増幅しない事で欠
失を６′在認し、そのような例はα−サラセミアの診断
Ｉ　Ｐ、　Ｆ、　Ｃｈｅｈａｂら、子−−ｙ−中−■卸
２９３．　（１９８７）　Ｉである。

ヨーロッパ特許公開第２３７　、３６２号は、ＲＦＩ、
１）（制限酵素切断片多型）および例えばＫａｎおよび
Ｄｏｚｙｓブロシーデインダス　オゲスザ　ナショナル
　アカデミ−オフ′　サイエンス（ＵＳ八）瓦。

５６３１　（１９７１１）　、　１ｌｕｂｉｎ　　およ
びＭａｎ、　　ランセット。

１９８５−１　７５（１９８５）、　Ｃａｎｎｅｒら、
プロシーデインゲス　オフ　ザ　ナショナル　アカデミ
−オフサイエ７ス（ＵＳＡ）、　　１１０．７８（１９
０３）、　Ｋｉｄｄら、ネーチャ＋、　　１０４．２３
０（１９８３）およびＰｉｒａＬｓｕ　ら、ニュー　イ
ングランド　ジャーナル　オフ　メディシン３０９．２
８４（１９１１３）に記載されているごとき対立形質特
異性オリゴヌクレオチド技術に対してある種の利点を持
っている。

ヨーロッパ特許公開第２３７　、３Ｇ２号が関心ある特
定の配列の無差別の増幅を含む方法を記載しているにも
かかわらず、はんの１つのヌクレオチドが異なる配列間
の区別を可能にするのに必要とされる標識配列特異性オ
リゴヌクレオチド　プローブの更なる使用および／また
は関心ある点突然変異が酵素認識配列を創造または破壊
する限られた場合の特異的制限酵素の使用および／また
は増幅ＤＮＡへの直接シーフェンシング法［Ｃ，Ｗｏｎ
ｇら、ネーチャー３３Ｑ、　３８１（１９Ｂ？）を参照
されたい１の使用を含む多数の時間がかかる更なる検出
工程を必要とするのは免れがたい。

発刊堕９を犬山、Ｌｙ上Ｊニケ問題ｌ＆ゲノムＤＮ＾の
ごとき核酸中の少くとも１つの単一塩基の相異を直接的
に検出する簡便な方法に対する要望があり、その検出工
程をＩυ小にすれば、作業者が熟練してなくても迅速に
正６’ｌ！におよび容易に実施できる方法となるであろ
う。

腓廿（蘇決ｔｋだＡ少王役 本発明は、適当にオリゴヌクレオチド　プライマーのヌ
クレオチド配列を選択することにより、疑わしい変異ヌ
クレオチドを含む配列または正常ヌクレオチドを含む対
応する配列のプライマー延長を選択的に達成ｒるかまた
はそのようなプライマーの延長を妨ぐごとが可能であり
、それ故、必要な検出方法がかなり簡便化される。

本発明の１つの様相に従うと、試料中に含まれる１つま
たはそれ以上の核酸中の少くとも１つの変異ヌクレオチ
ドの存在または不在を検出する方法が１．？（Ｉｔされ
、その方法は； −緒にまたは連続的に適当なヌクレオシド三リン酸、ヌ
クレオシド三リン酸の１【合剤および標的塩ジ古配列の
診断部分のための診断プライマーでハイブリダイゼーシ
ジン条外下試ｉ′ｌを処理し、１１；１記診断プライマ
ーのヌクレオチド配列は前記診断部分に対して実質的に
相補的になっており、診断プライマーの末端ヌクレオチ
ドは疑われる変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌク
レオチドに対して（旧＋Ｉｉ的なものであり、それによ
り、診断プライマーの延長生成物は診断プライマーの１
１７＋記末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応する
ヌク、オチドと相補的な場合合成され、診断プライマー
の前記末端ヌクレオチドが標的塩基配列の対応するヌク
レオチドが相補的でない場合は延長生成物は合成されな
い；および延長生成物が存在するかまたは不在であるが
より疑わしい変異ヌクレオチドの存在または不在を検出
する。

本発明の方法は点突然変異の存在または不在の検出に特
に関しているが、本方法は１つ以上のヌクレオチドの欠
失を含む欠失の存在または不在の検出、同様に、１つ以
上のヌクレオチドの置換の存在または不在の検出にも等
しく応用できる事が理解されなければならない、この点
で関連したヌクレオチド、特に関連した末端ヌクレオチ
ドを知る事が必要なだけであり、必要な診断プライマー
（頚）は適切にデザインできるであろう。

形成された延長生成物は例えば単一または二重鎖型の任
意の都合のよい型で検出されるであろう事が理解される
であろう。

得られる延長生成物は、もし望むなら米国特許第４６８
３１９５号および４６８３２０２号に記載されているご
とくポリメラーゼ連ガ°（反応（ｒ’ＣＲ）により、Ｐ
　ＣＴ特許公開Ｗ　Ｏ８７１０６２７０およびバイオテ
クノロジー６巻、　１９８１１年ＩＯ月に記載されてい
るごときＱ−ヘーク　レプリカーゼを使用し、ＰＣＴ特
許公開Ｗ　０８Ｂ／＋０３１５ニ記載されティるごとき
’、ｔ　ス；ｈ　（Ｓｉｓｋａ）二Ｉ−ボレーションの
転写に基ずく核酸増幅を使用し、また線状増幅を使用し
て増幅される事がさらに理解されるであろう、これに関
連して本明１ＪＩＩ書で使用される表現°°線状増幅゛
とは重合化の為の試薬および適切なヌクレオチド三リン
酸存在下、各々の診断部分のための単一のプライマーを
使用する増幅を称し、それにより、増幅は鋳型としての
試ｔ：を核酸の単一鎖の使用に基ずくプライマー延長に
影響される。

第１の特に好適な本発明の実施態様におい”ζ、その方
法は以下の工程からなっている：ｌ）　−諸にまたは連
続的に、適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三
リン酸のｙＩ【合化のための試薬、標的塩基配列の診断
部分のための診断プライマーおよび対応する増幅プライ
マーでハイブリダイゼーション条件下試料を処理し、前
記診断プライマーのヌクレオチド配列は前記診断部分と
実質的に相補的になっており、診断プライマーの末端ヌ
クレオチドは疑われる変異ヌクレオチドかまたは対応す
る正常ヌクレオチドと相補的になっており、それにより
＋１ｉｌ記診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的塩
基配列中の対応するヌクレオチドと相補的である場合診
断プライマーの延長生成物が合成され、前記診断プラ・
イマーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応する
ヌクレオチドと相補的でない場合延長生成物は合成され
ず；生成した診断プライマーの任意の延長生成物がその
相補体から分離した後は前記増幅プライマーの延長生成
物の合成のための鋳型として働くことができ； ２）　そのような延長生成物が形成されたものはその鋳
型からプライマー延長生成物を分離するため変性条件下
試料を処理し； ３）　工程（２）で産化された単一鎮生成物を、適切な
ヌクレオソド三リン酸類と一緒にまたは連続的に、ヌク
レオシド三リン酸の１「合化のための試薬、診断プライ
マーおよび増幅プライマーと先に定義したごとく接触口
゛しめ、それにより、可能ならば工程（２）で産生して
ｒｐ−鎖をＵｉ型としてさらなる延長生成物を合成し； ４）　工程（２）および（３）を十分な回数繰り返して
適切なヌクレオチド配列が検出可能になるまで増幅し；
および ５）　工程（イ）で１７られる増幅生成物の存在または
不在から、疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在
を検出する。

本発明の第２の実施態様においては、前記試オー１を、 （ａ）第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に４１１
　Ｍｉ的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診
断プライマーはｎｉ前記疑わしい変異ヌクレオチドに対
し相補的な末５＝１ヌクレオナトを持ら、および第２の
核酸配列の診断部分に対し実質的に相）＋Ｍ的な配列を
持つ第２の診断プライマー、第２の診断プライマーは疑
われる変異ヌクレオチドに相補的なものに対して相）＋
ｌｉ的な末端ヌクレオチドを持つ；かまたは （ｂ）第１の核酸配列の診断部分に実質的に相Ｉ’ｌｌ
的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プラ
イマーは前記疑わしい変異配列に対応する正常なヌクレ
オチドに対し相Ｊ＋Ｉｉ的な末端ヌクレオチドを持ら、
および第２の診断プライマーは第２の核酸配列の診断部
分に実質的に相補的な配列を持ら、第２の診断プライマ
ーは前記疑わしい変異ヌクレオチドに対応する正常ヌク
レオチドに相補的な末端ヌクレオチドを持つ； と−緒にまたは連続的に処理し、１′Ｉｉ記第１の診断
プライマーの末端ヌクレオチドおよび前記第２の診断プ
ライマーの末端ヌクレオチドは両方とも別のプライマー
の５′末端または両方３′末端であり、第１の核酸配列
は第２の核酸配列に対し、逆の向きである。

それ成木実施態様では、第２の診断プライマーは前に称
したごとくおよびこれ以後も増幅プライマーと考えられ
る。

この第２の実施Ｂ様は区別を可能にし特異性を増加−１
しめるであろう、なぜなら人為的生成物は発火薬が一ロ
ー・診断プライマーのみが使用される場合の単一末５：
１１よりもミスマツチしたオリゴヌクレオチドの関連あ
る末端（−船釣には３′−末端）にある事を必要とする
からである。

疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検出は例
えば後で記載するごとく達成されるであろう。

本発明の第３の実施態様において、疑われる変５“ヘヌ
クレオチドを含むＤＮＡからなる試料は増幅を受ける、
例えば本明細書に定義されたごとき線状増幅により、ま
たは例えば米国特許第４，６８３，１９５号および４，
６８３，２０２号、ｒｌｃＴ特許公開Ｗ　Ｏ８？１０６
２７０バイオテクノロジー、６巻、　１９８８年１０月
、またはＰＣＴ特許公開Ｗ　０８Ｂ／１０３１５に記載
されているごとくして、増幅生成物をハイブリダイゼー
ション条件下試料なヌクレオシド三リン酸およびヌクレ
オシド三リン酸の重合化剤の存在下、標的塩基配列の診
断部分のための診断プライマーで処理し・１１１１記診
断プライマーのヌクレオチド配列は前記診断部分に対し
実質的に相補的であり、診断プライマーの末端ヌクレオ
チドは疑われる変異ヌクレオチドかまたは対応する正常
ヌクレオチドに対し相補的である。

それ故、本発明のこの第３の実施態様では、所望の数の
サイクル通常の増幅が実施され、検出工程の前に、診断
プライマーとのハイブリダイゼーションが次の工程とし
て試みられる。増幅プライマーは用いる必要がない。

必要とされる重合のための試薬（類）の星がかなり減少
しく例えば少くとも十滅する）、使用されるヌクレオン
ド三リン酸の川もであり、かわりに多数のポリメラーゼ
連鎖反応（１’Ｃ１υ過夕１さ２＝を使用するのでこの
第３の実施態様は興味を引（。それ故、この第３の実施
態様ではかなりの費用の倹約が達成可能である。さらに
増幅工程はこの第３の実施態様に不利な点を与える事な
く通常の温度範囲で達成され、ただより温度に敏感に試
みられた診断プローブとのハイブリダイゼーションが一
度達成された事を必要とするので、さらに末端が不適合
（−船釣には３′−不適合）な診断プライマーの為の発
現の危険性を減少せしめる。この第３の実施態様はこの
ように非熟練者使用に対して潜在的に信４Ｉｎがおける
少々の事には大丈夫な方法を提供し、作業者の失敗をよ
り許容するものである。

最初の増幅はそれ自身の内部制御であるのでこの第；（
の実施態様はさらに余分のポリメラーゼ連１’ｉ反応制
御−工程に対する必要性も未然に妨く。

もし所望するなら診断プライマーは分解の危険性がない
（例えばＰＣＲのごとき高温環化技術）信号または標識
を運ぶことができる０例えば記載されているごとくアル
カリホスファターゼまたは西洋１ノサビ　ペルオ、トシ
ダーゼのごとき適当な標識化または信号発生部分を用い
°ζ標識できる。この点で丈土人囚　アクアチフス　山
９」ガ　刈り１国す）−から誘導されるホスファターゼ
のごとき標識化のための熱安定酵素の応用が興味があろ
う。

本発明の第４の好適な実施態様は本発明の第３の実施態
様を本発明の第２の実施態様で記載した２つの診断プラ
イマーを用いる特色を導入する事で改良したものであり
、第２の診断プライマーは潜在的に増幅プライマー、と
して肋（。

それ成木発明の第４の実施態様においては疑われる変異
ヌクレオチドを含むＤＮＡは増幅を受け、増幅された生
成物を： （ａ）　　第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相
補的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プ
ライマーは前記縁われる変異ヌクレオチドに対し相補的
な末端ヌクレオチドを持ち、および第２核酸配列の診断
部分に対し実質的に相補的な配列を持つ第２の診断プラ
イマー、第２の診断プライマーは前記縁われる変異ヌク
レオチドに対し相補的なヌクレオチドに対し相補的な末
端ヌクレオチドを持ち；または （ｂ）　　第１の核酸配列の診断部分に対し実質的に相
補的な配列を持つ第１の診断プライマー、第１の診断プ
ライマーは前記縁われる変異ヌクレオチドに対応する正
常ヌクレオチドに対し相！ｌｌｉ的な末端ヌクレオチ１
゛を持ら、および第２の核酸配列の診断部分に対し実質
的に相補的な配列を持つ第２の診断プライマー、第２の
診断プライマーは前記縁われる変異ヌクレオチドに対応
する前記正常ヌクレオナトに対し相補的なヌクレオチド
に対し相補的な末端ヌクレオチドを持っ；と−緒にまた
は連続的に処理し、前記第１の診断プライマーの末端ヌ
クレオチドおよび１１」記載２の診断プライマーは両方
とも別個のプライマーの５′末端が両方とも３′末端に
あり、第１の核酸配列は第２の核酸配列と相補的である
。

一般に前記第１の診断プライマーの末端ヌクレオチドお
よび前記診断プライマーの末端ヌクレオチドは各々その
別個のプライマーの３′末端にある。

本発明の第４の実施態様ばこのように先に定義した本発
明の第２および第３の実施態様の潜在的利点を合わせ持
っており、これらはなかんずく潜在的に特異性を増加せ
しめ、費用を倹約し、より丈夫な、使用者に！ＩＩＬみ
易い技術である。

疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検出は例
えば後で記載するごとく達成される。

増幅された生成物が前に定義したごとき（ａ）かまたは
（ｂ）で−度処理されると所望されるごとく一つまたは
それ以上の最終的サイクルに供される事が理解されるで
あろう、多数のサイクルが達成された場合、更なる生成
物が１ニドられるであろうし、これは診断プライマーの
延長生成物のハイブリッドである０本来のＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）プライマー　オリゴヌクレオチドお
よび添加した診断プライマー　オリゴヌクレオチドの相
対的比率に依存して種々の生成物が形成されるであろう
。

増幅が診断および増幅プライマー使用かまたは、例えば
本発明の第１および第２の実施態様またはヨーロッパ特
許公開節２３７．３６２号に記載されている増幅方法の
一部に記載されているごとき２つの診断プライマーの使
用により増幅が達成される場合、工程（ａ）その鋳型か
らプライマー延長生成物を分離するため変性せしめ、お
よび（ｂ）そのようにして得られた単一鎖を一緒にまた
は連続的に、適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシ
ド三リン酸の重合化剤、および別個のプライマーと接触
せしめて更なる延長生成物を合成する；を少くとも５回
（サイクル）から特にプライマーが本発明に１１１失を
与えることな（増幅に抵抗する不定の数まで好適には繰
り返す、さらに良好であるのは、もし試料がヒトゲノム
ＯＮ＾を含む場合、１５−６０例えば１５−３０回（サ
イクル）が用いられる。もし試＄１が細胞であるなら、
好適にはその中の核酸を試薬にＩυ露する為工程（ａ）
の前に加熱する。この工程で試薬添加に先たつ核酸の精
製を避ける。この点では、シ１（みられる増幅に先だっ
てたとえ試料からのＤＮＡ精製が行われても、以前の方
法よりもかなりの改良を本発明が示す事が理解されるで
あろう。

工程（ｂ）において工程（ａ）で生産された単一鎮およ
び適当なヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸
の重合化剤、プライマー（類）、例えば診断プライマー
（趙）および／または増幅プライマー（類）間の接触が
その鋳型からのプライマー延長生成物の分Ｎ（工程ａ）
に続くこれらの物質の反応混合物への添加によりまたは
反応混合物内にすでに存在している物質に依存して達成
されるであろう事が評価されるであろう、実際、任意の
１つまたは他の異ったヌクレオシド三リン酸および／ま
たは重合剤および／またはプライマー（類）、□例えば
診断プライマー（頬）および／または増幅プライマー、
は本発明の方法の任意の段階で添加できる。

本発明の第５の良好な実施態様に従うと、前に定義した
ごとく、鋳型としての試料核酸の単一鎖の使用に基づい
たプライマー延長により増幅が達成される方法が提供さ
れる。

それ故この実施態様では鋳型としての試料核酸の同一の
鎖の使用に基づいてプライマー延長が達成され、増幅プ
ライマーは存在しない、それ故増幅は指数的というより
算術的であり、指数的増幅はポリメラーゼ要求反応（Ｐ
ＣＲ）により少くとも理論的には可能である０本発明の
第５の実施ｍ様の利点は（また本明細書において線状増
幅と称される）入ろ的生成物がもし産生されてもそれ自
身指数的増幅に供される事ができない事である。

線状増幅は任意の通常の手段により達成され、およびヌ
クレオシド三リン酸の重合化剤の存在下相補ヌクレオシ
ド三リン酸の使用により達成されるであろうし、診断プ
ライマーおよび試料核酸間に十分な程度の相＋ｉｌｉ性
が存在する不定の長さのプライマー延長生成物を産生す
る。良好にはすべての相補ヌクレオシド三リン酸が用い
られた試料核酸がエンドヌクレアーゼ消化に供され、選
ＩＲされた制限エンドヌクレアーゼは決まった長さのプ
ライマー延長生成物の形成を充分可能にする部位で試料
核酸の切断を達成するのをｉ′α実にするためである。

しかしながら、都合よく線状増幅はｌのみ、都合よくは
２のみまたは好適には３ヌクレオシド三リン酸のみの存
在下達成されるので、その結合状態の診断プライマー（
即ち試料核酸にハイブリダイズしている）は１．２また
は３ヌクレオシド三リン酸の存在が許される限り延長で
きる。試料核酸中にヌクレオシド三リン酸が存在しても
、それに対する相補ヌクレオシドニリン酸が存在しない
と、プライマー延長は中止されるであろう。

もし望むなら線状増幅は配列の融点（Ｔｍ）でも達成さ
れる。この温度では試掌゛］核酸中の相補配列ヘハイブ
リダイズする診断プライマーは溶液中の遊茫の診断プラ
イマーと平衡になっており、それ故診断プライマー、（
任意の延長型で）は象、速にハイブリダイズし、試ｔ４
核酸から変性される。もし望むなら線状増幅はまた温度
を振動せしめても達成される。そのような温度振動は一
般的に配列の融点での急速な温度変動が含まれるであろ
う。

もし１゜２または３ヌクレオシ「三リン酸のみが存在す
ると、診断プライマーはこれらのヌクレオシドニリン酸
の存在がゆるされる限りでのみ延長されるであろう、前
に示したごとく、例えば診断プラ・イマーの３′末端と
試料しＬ酸中の対応するヌクレオシドニリン酸の間でミ
スマツチがある場合、プライマーの延長は達成されない
であろう、しかしながら、３′末端ヌクレオシド三リン
酸が試料核酸中の対応するヌクレオシドニリン酸と相補
的な場合、プライマー延長は達成されるであろう。

１．２または３ヌクレオシド三リン酸のみが使用され、
延長診断プライマーの末端ヌクレオシドニリン酸が一度
のみ使用される場合、ヌクレオシドとしてジデオキシヌ
クレオシドニリン酸の使用が便利であり、その使用によ
り、診断プライマー延長生成物の末端ヌクレオシドニリ
ン酸が構成されるであろう、この事は、診断プライマー
の明らかな終結延長の産生の手助けとなるであろう。

もし望むなら延長プライマー（頚）内へ取り込ませる目
的で、反応混合物中に存在する１つまたはそれ以上のヌ
クレオシドニリン酸を任意の便利な方法で標識またはマ
ークしてもよい、それ故例えば１つまたはそれ以上のヌ
クレオシドニリン酸は蛍光的に標識されるであろう０診
断プライマーの延長生成物の生成が延長生成物に取り込
まれた標識または印をつけたヌクレオシドニリン酸（珀
）を検出する事により検出できる場合、このヌクレオシ
ドニリン酸の標識化は本発明の第５の実施態様と関連し
て特に興味がもてる。取り込みがおごらないと延長生成
物が形成されず、標識または印をつけたヌクレオシドニ
リン酸は例えば洗い流されるであろう、特に、本発明の
第５の実施Ｂ様は人為的生成物の増幅の問題を回避でき
、標識化または印をつけたヌクレオシドニリン酸（頚）
の存在下、良好な区別が達成されるのを可能にする。

増幅が例えばＰＣＲの使用により達成された場合、人為
的生成物の産生でもその生成物は増幅され、それ故４ｍ
Ａ１１ｋまたは印をつけたヌクレオシドニリン酸の取り
込みはそれにより差別を減少させる。

前記のことに加え、診断プライマーは免疫学的結合対の
一部、（例えば抗原または抗体）または複合体形成対の
一部（例えばビオチン）を運んでいるのが望ましく、０
１記結合対または形成対の他の一部と結合せしめ、固相
上に補足する目的のためである。

本発明の更なる様相に従うと、試料中に含まれる１つま
たはそれ以上の核酸中の少くとも１つの変異ヌクレオチ
ドの存在または不在を検出するためのキットが堤供され
る、そのキットは：（１）　　標的塩基配列の各々の診
断部分のための診断プライマー、各々の診断プライマー
のヌクレオチド配列は前記診断部分に対し実質的に相？
＋Ｉｉ的にされており、診断プライマーの末端ヌクレオ
チドは疑われる変異ヌクレオチドまたは対応する正常ヌ
クレオチドに相補的であり、その使用の際標的Ｉ！！基
配列配列中応するヌクレオチドに前記診断プライマーの
末端ヌクレオチドが相補的な場合診断プライマーの延長
生成物が合成され、前記診断プライマーの末端ヌクレオ
チドが標的塩基配列の対応するヌクレオチドに相補的で
ない場合延長生成物は合成されない； （２）各々４つの異ったヌクレオシドニリン酸；および （３）　（２）のヌクレオシドニリン酸の重合化剤から
なっている。

便利なように本発明のキットはさらに、各々の診断プラ
イマーに対応する増幅プライマー、増幅プライマーのヌ
クレオチド配列は、その相補体から分子ｓ後、対応する
診断プライマーの延長生成物が増幅プライマーの延長生
成物の合成のための鋳型として働くようにされている０
例えば、本発明の、ト、トは先に定義した第２の実施態
様に関連して詳述された両方の組の診断プライマーから
なる。

もし望むなら本発明のキットはまた、適当な内部制御Ｊ
プライマーを含ませてもよい。

しかしながら、本発明のキ７）が各々の疑われる変異ヌ
クレオチドに関するＰＣＩＩ　（ポリメラーゼ連鎖反応
）プライマーおよび診断プライマー（後に定義されるご
とき）からなるのが特に良好である。もし望むなら本キ
ットはさらに本発明の第２の実施態様に関して前に詳述
した診断プライマーの両方の組を含んでもよい。

（１）、　（２）および（３）で詳述した各々の物質お
よび／または増幅プライマーは便宜士別の容器に包装さ
れるが、良好であるのはすべてのものが１つの容器に合
併され、それに分析される物質を添加する６便利ムよう
にその単一容器にはさらに緩衝液が含まれるであろう。

本発明のキットが本発明の第２の実施態様に関連して前
に詳述された両方の組の診断プライマー（ａ）および（
ｂ）を含む場合、診断プライマーの両方の組は一緒に単
一の容器には存在しないであろう。けれども、プライマ
ーの各々の組は別々の容器にはいった（２）および（３
）で詳述した各々の物質および／または増幅プライマー
とは一緒に存在しＣもよい、試験される試料がヨーロッ
パ特許公開第２３７．３（ｉ２号に従って最初に増幅ざ
゛れる場合、１つの容器に前記（２）および（３）の物
質と一緒に診断プライマー（類）と同様に都合よ＜　Ｐ
ＣＲプライマーも含まれていてもよい。しかしながらも
し望むなら、増幅が達成された後に使用するため別の容
器内に診断プライマー（頚）が存在していＣもよいであ
ろう。

本明細書で使用される術語°゛ヌクレオシド三リン酸°
°はＤＮ＾かまたはＲＮ＾に存在するヌクレオンＩ゛を
称し、それ故塩基としてアデニン、シ１−ンン、グアニ
ン、チミンおよびウラシルが取り込まれ、糖部分はデオ
キシリボースまたはリボースであるヌクレオシドを含ん
でいる。−射的に、デオキシリボヌクレオシドがＤＮＡ
ポリメラーゼと共に使用されるであろう、しかしながら
通常の塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよ
びウラシルの１つと塩基対形成ができる他の修飾塩基も
使用されるであろう、そのような修飾塩基は例えば８ア
ザグアニンおよびヒボキサンチンが挙げられる。

本明細書で使用される術語°”ヌクレオチドは１１ＮＡ
またはＲＮＡに存在するヌクレオチドを称し、それ故塩
基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよび
ウラシルが取り込まれ、糖部分はチオ；１−シリボース
またはリボースであるヌクレオチドを含んでいる。しか
しながら通常の塩基アデニン、ノドシン、グアニン、チ
ミンおよびウラシルの１つと塩基対形成ができる他の修
飾塩基も本発明で使用される診断プライマーおよび増幅
プライマーに使用できる。そのような修飾塩基には例え
ば８−アザグアニンおよびヒポ−１ｔサンチンが挙げら
れる。

本発明の方法が、全ての４つの異なったヌクレオチドを
含まない標的塩基配列の部分に隣接する疑われる変異ヌ
クレオチドの存在または不在の検出のために使用する場
合診断プライマーの延長生成物およびもし望むなら増幅
プライマーの延長」ニ成物は適当な対応するヌクレオシ
ド三リン酸のみの存在で形成され、４つの異なったヌク
レオシ１′三リン酸のすべては必要でない事が理解され
よう。

ヌクレオシド三リン酸の重合化のための試薬はプライマ
ー延長生成物の合成の達成に機能するであろう任意の化
合物または系（酵素を含む）である。この目的に適した
酵素には例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片、Ｔ４ＯＮ八ポリメ
ラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ、逆転写酵
素、および熱抵抗性酵素を含む他の酵素が挙げられる０
本明細書で使用する術語“熱抵抗酵素”とは熱に安定で
、熱抵抗性であり、正しい様式でヌクレオチドの結合を
触媒（容易に）し、各々の核酸鎖に（旧＋ｌｉ的なプラ
イマー、延長生成物を形成するものである。−殿的に、
各々のプライマーの３′末端から合成が開始され、鋳型
鎖の５′の方向に沿って合成が終結するまで進み、異っ
た長さの分子を産生ずる。しかしながら、例えば熱抵抗
性酵素のごとく前記と同一の方法を使いながら５′末端
から合成を開始し他の方向へ進む酵素もある０本発明の
方法゛で使用できる好適な熱抵抗酵素はテルムス　アク
アチフスｊ担圧暖　朋、眩肛ぜ旦から抽出、精製できる
ものである。この酵素は約８６．０００−９０，０００
ダルトンの分子量を持ち、ヨーロンバ特許公開第２３７
，３６２号（またヨーロッパ特許公開第２５８，０１７
号も参照されたい）に記載されている。テ匹人ノー　ア
クア九り入　功１０　ｒ　ｍ　ｌｊｓ　　性竪す旦す）
株ＹＴＩは制限を受けずに、アメリカン　タイプ　カル
チャー　コレクシジン、　（＋２３０１　　パークロン
　ドライフ、ロックビル、メリーラン巳ＵＳ＾）から＾
ＴＣＣ２５，１０４号として入手可能である。

本明細書で使用される表現“°診断部分°°とはその末
端ヌクレオチドとして潜在的な変異ヌクレオチドを含み
、その存在又は不在が検出されるべき標的塩基配列（後
で定義）の部分を意味する一般的に、前に記載したごと
く各々のプライマーの３′末端から１ライマー廷長生成
物の合成が一般的に開始されるであろうので、ｉ４′Ｉ
在的変）聞ヌクレオチドは診断部分の５′末端にあるで
あろう、しかしながら、診断プライマーの５′末端で合
成を開始し、Ｓｌｉ型１ｊ°１の３′方向へ合成が終結
するまで進行する重合化のための試薬を使用すると゛°
診断部分°°はその３′未０ぶに潜在的変異ヌクレオチ
ドを含むごとになるであろう、以下に示すこの点を考慮
し診断プライマーはまた適切に計画されるであろう。

本明細書で使用する表現゛標的塩基配列”°とは少くと
も１つの診断部分（前に定義した）を含むヌクレオチド
配列を、意味する０例えばβ−サラセミアの一回の試験
では標的配列は６０まで含み（例えば５０診断部分）、
各々の診断部分は１つの潜在的変異ヌクレオチドを含ん
でいる。

本明細書で使用される術語“オリゴヌクレオチドは２つ
またはそれ以上のデオ、トシリボヌクレオチドまたはり
ボヌクレオチドを含む（好適なのは３つ以上）分子とし
て定義される。その厳密な大きさは、反応温度、塩濃度
、ホルムアミドの存在および鎌型赤血球１１ｂＣ症のご
とき他の類似の突然変異体の存在などの多くの因子に依
存し、それは順次にオリゴヌクレオチドの最終的機能ま
たは使用に依存している。実際、オリゴヌクレオチドの
厳密な配列はまた後で記載するごとく多数の因子に依存
している。オリゴヌクレオチドは合成的またはクローニ
ングにより誘導される。

本明細書で使用される術語°“プライマー°°はオリゴ
ヌクレオチドを称し、制限消化後精製された自然に存在
するものでも合成的に産生されたものでもよく、核ｆＩ
！１）ｉに相？＋ｉ的なプライマー延長生成物の合成が
誘導される条件下に置かれると、即ら適切なヌクレオシ
ド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼのごとき重合化
剤の存在下、適切な緩衝液中（゛緩衝液“はｐｌ＋、イ
オン強度、コファクターを含む）、適切な温度で合成の
開始点として作用できるものである。

プライマーは増幅の際最高の効率をあげるように好適に
は単一鎖であるが、二重鎖でもよい、もし二重１’ｆな
らば、プライマーは延長生成物の３Ｊ４製に使用する前
に処理してその鎖を分離する。好適には、プライマーは
オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは
重合剤の存在下、延長生成物の合成の発火点となるため
十分長くなりればならない、プライマーの厳密な長さは
温度およびプライマー源および使用する方法などの多く
の因子に依有するであろう。例えば、標的配列の複雑さ
に依有するが、典型的には診断および増幅プライマーは
１２−３５ヌクレオチド（例えば１５−３５ヌクレオチ
ド）を含むが、それ以上またはそれ以下のヌクレオチド
を含む場合もあるかもしれない、短いプライマーは一般
的に低い温度を必要としＳｈ型と十分安定なハイブリッ
ド複合体を形成する。

本明細書で使用される術語“相補的°°とはヌクレオチ
ドに関連し、他の特定のヌクレオチドと塩基対をつくる
ヌクレオチドを意味する。それ故アデノシン三リン酸は
ウリジン三リン酸またはチミン三リン酸と相補的であり
、グアノシン三リン酸はシチジン三リン酸と相補的であ
る。チミジン三リフ酸およびグアノシン三リン酸はある
種の条件下塩基対ではあるが、本明細書の目的のタメに
は相補的と見なされない事を理解されたい、またシトシ
ン三リン酸およびアデノシン三リン酸もある種の条件下
塩基対であるが本明細書の目的のためには相補的と見な
されない事も理解されるであろう、同様の事がシトシン
三リン酸およびウラシル三リン酸にも応用される。

本明細書でのプライマーは増幅されるべき各々の特定の
配列の異ったｉｊ′ｉに°゛実質的に°°に相（１１１
的になるように’Ｍ　ｔｌ＜されている。この事はプラ
イマーはその別個の鎮にハイブリダイズするため十分に
相補的でなければならない事を、α味している。

それ故、プライマー配列はＳｌＩ型の厳密な配列を反映
する必要はない０例えば診断プライマーが３′末端ヌク
レオチドが疑われる変異ヌクレオチドまたは対応する正
常ヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含む場合
、プライマーの５′−末端に非相補的ヌクレオチドフラ
グメントが結合してもよく、ただし、プライマー配列の
残りの部分は標的塩基配列の診断部分と１１＋抽的であ
る。しかしながら、計通にはプライマーはｎＳ１に記載
したごと（前もって決められたプライマー末端に存在し
てもよい非相補的ヌクレオナト以外は厳密な相補性を持
っている。

しかしながら、ある環境下では非相補的３′−末端残基
存在下においても診断プライマー延長生成物の合成が誘
導されるのを理解されたい、この人ｌＳ的結果は非常に
低い温度を使用したとき（この場合温度を上げられる）
インキュベーション／アニーリングの＋＋５間が非常に
長すぎた場合（この場合時間を短くできる）、非常に高
い塩濃度を使用したとき（この場合塩濃度を減少できる
）、非常に高い酵素濃度の使用、非常に高いヌクレオシ
ドリン酸濃度の使用、誤ったｐｌ＋または正しくない長
さのオリゴヌクレオチドブライ”７−の使用などにより
引き起こされる。すべてのこれらの因子はヨーロッパ特
許公開第２３７　、３６２に３１論されている。

人為的生成物の主たる原因は多分反応温度を非常に低く
落らだままにしたためであり、このため厳重さが低下し
ている（例えば反応混合物の熱循環装：ｒ１．からの除
去により、短いけれど例えば重合化のための試薬を加え
るため（例Ｔａｑポリメラーゼ）、特に最初の反応サイ
クルにおいて）、前記のことに加え、Ｇ（グアノシン）
おびＣ（シチジン）残ノｋが特に豊富な診断プライマー
の使用によってもそのような人為的結果が生じる事が明
らかになった。ごの点でもし全体としてＧ／Ｃが豊富で
あるかまたは１？に関連する通常３′末端でＧ／Ｃが豊
富な場合診断プライマーの使用が困難となる。さらに診
断プライマーの通常関連する３′末端領域での塩基対生
成の正確な性質によりその使用において人為的結果が生
じる。それ故診断プライマーの関連する通常３′末端領
域の塩基対生成におけるＡｓ（アデノシン）の存在は特
に改良される傾向にあるが、一方Ｇｓ（グアノシン）の
存在はまだである。

さらに、診断プライマーの関連する通常３′末端でのミ
スマツチの正確な性質が人為的結果が得られるかどうか
の重要な因子であろう０例えばへへまたはＣＴミスマツ
チは通常ハイブリダイゼーシ！Ｉンに影響しないが、Ｇ
］’またはＡＴミスマンチはハイブリダイゼーシヨンに
かなりの程度影響し、人為的生成物を生成する結果とな
る。ハイブリダイゼータ４１フ間の結合性をさらに減少
−ｕしめプライマーを不安定化させるため診断プライマ
ー内へわざと１つまたはそれ以上のさらにミスマツチ・
口しめた残基を、またはもし望むなら欠失、または挿入
を導入する事により人為的結果を避ける事ができるであ
ろう。

更なるミスマツチを導入するには末端のミスマツｆ〜に
隣接するヌクレオチドの例えば１０のうら１つまたはそ
れ以ｈ（例えば６）Ｉ２えなければならない。−船釣に
は末端ミスマツチに加えたただ１つのミスマツチが例え
ば末端ミスマツチから１゜２または３塩基のところに位
置して必要とされる。

それ故、例えば正常ホモ接合、ヘテロ接合、αｌアンチ
トリプシンｊ！ｉ伝子のＺ対立形質に関して影響せしめ
たホモ接合の存在の決定に関連して、もし３′宋嬬ヌク
レオチドから第３番目のヌクレオチドを変化ｕ′シめて
使用の際ミスマツチを発生甘しめたら良好な結果を（す
る事が観察された。それ故例えば診断プライマーの３′
末端から３番目のヌクレオチドとしてへの代わりにＣを
存在ゼしめると正常ホモ接合、ヘテロ接合およびＺ対立
形質に関して影響せしめたへテロ接合を容易に区別する
事も可能になった０診断プライマーの最良のデザインは
前記の指標に基ずく端的な実験から決定されるであろう
、そのような実験は熟練した分子生物学者の能力による
。

本明細書で使用される術語°゛診断プライマー、とはヌ
クレオチド配列を持つプライマーを示し、その末端ヌク
レオチドは疑われる変異ヌクレオチドまたは対応する正
常ヌクレオチドと相補的となるようにＭＩＲされており
、そのため、診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的
塩基配列の対応する診断部分の適当な末端ヌクレオチド
と相補的な場合診断プライマーの延長生成物が合成され
るが、しかし、診断プライマーの末端ヌクレオチドが標
識塩基配列の対応する診断部分の適当な末端ヌクレオチ
ドと相同でない場合はそのような延長生成物は合成され
ない。

本明細書で使用される術語゛増幅プライマーとは診断プ
ライマーがハイブリダイズできる核酸ＩＪＹに対し和Ｊ
＋ｌｉ的である核Ｍ鎖にハイブリダイズできるプライマ
ーを称し、゛増幅プライマー、°゛はヌクレオチド配列
を持ら診断プライマー延長生成物へ、その相補体から分
離された後ハイブリダイズでき、そのため診断プライマ
ー延長生成物は増幅プライマー延長生成物の合成のため
の鋳型として働き、それにより増幅を容易にする。

それ故、少くとも一部として、ヨーロッパ特許公開第２
３７　、３６２号に記載されている方法のごとき増幅過
程の改良が本発明の請求の範囲に含まれ、改良において
は、もし存在すれば疑われる変異ヌクレオチドを含む配
列またはもし存在すれば対応する正常ヌクレオチドを含
む配列を選υ〈的に増幅する事を可能にし、そのため配
列決定、対立形質特異的オリゴヌクレオチドおよび制限
消化などを避は検出を簡素化する。それ故与えられたヌ
クレオチド変異（例えば点突然変）υのその存在または
不在はｌ）疑われるヌクレオチド変異に相補的な適当な
末端ヌクレオチドを持つ診断プライマーをデザインする
ことにより、増幅生成物の合成が疑われるヌクレオチド
生成物の存在の指標であろうし、および増幅生成物の不
在が疑われるヌクレオチド変賃の不在の指標であろう；
または２）対応する正常ヌクレオチドに相補的な適当な
末端ヌクレオチドを持つ診断プライマーをデザインする
事により、増幅物の合成が疑われるヌクレオチド変ｙ？
の不在の１ｈ標であろうし、増幅物の不在は疑われるヌ
クレオチド変異の存在の指標となるであろう；により検
出される。この点において本明細書で言及した゛適当な
末端ヌクレオチド°°とは使用によりもし可能ならば合
成を開始するプライマーの末端ヌクレオチドを意味する
。このため−船釣に重合化のための試薬はプライマーの
３′末端で合成を開始するので、適当な末端ヌクレオチ
ドは−ｍ的にはヌクレオチドの３′末端に存在する。

例えば与えられた点突然変異の存在または不在のｔｉｔ
認は、上に示した両方の変法（１）および変法（２）を
採用するごとにより得られるであろう。２つの方法のｔ
ｉｔみ合わせにより優性遺伝条件の分析に、および劣性
遺伝条件の１■体の検出に価（１σがあろうヘテロ１妾
合の検出のための方法も提供する。

好適な実施態様において本発明は同−試事＝１中の１つ
以上の疑われる変異ヌクレオチドの存在または不在の検
出も請求の範囲に含む０診断プライマー、の前もって決
定されたヌクレオチド配列に依存して選択的に配列を増
幅する本発明の能力は、多数の増幅生成物の区別を節単
に、正確におよび取り扱い者の最小の技術で可能にし、
そのため多くのヌクレオチド変賃のための単一試ｌ］の
スクリーニングのための力強い技術を提供する事が可能
になった０本発明はそれ故、種々の疾患につながる遺伝
性障害、素因および体細胞突然変異のごとき遺伝条件の
総合テストのためのＤＮＡまたはＲＮへの単一試料のス
クリーニングに特に関係している。

そのようなりＮ＾またはＲＮ八は例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓらにより〔モレキュラー　クローニング（１９Ｂ２）
、　２８０−２８１　）記載されているごとき種々の技
術を用いて、血液または絨毛または羊膜細胞から抽出さ
れる。さらに・遺伝的条件の分子論的基礎がより知られ
るようになれば、これらの更なる条件は簡単に本発明の
スクリーニング技術に含ませることができる。

多増幅生成物は種々の他の技術でも区別することができ
るであろう、それ故例えば各々の疑われる増幅生成物に
対するプローブが使用されるであろうし、各々のプロー
ブは異った区別可能な信号または信号を産生できる残基
を運んでいる。

そのような信号および信号を産生できる残基については
我々のヨーロッパ特許公開第２４６，８６４に詳細に儀
諭しであるが、多くの選択された微■元素で形成したマ
イクロビーズがプ【１−プに結合しである、ＷａＢ　Ｃ
０Ｇ、らの（ワールド　バイオテクノロジー　レポート
１９８Ｇ、　　第２巻、第２部３３−３７ページ、診断
学、健康管理令ｊｌ議事ｉ１１９１３Ｇ年Ｉ＋月、サン
フランシスコにて）固相増幅系も含まれる。特異的プロ
ーブの存在はＸ−線蛍光分析により検出できる。このよ
うな技術は単一ヌクレオチドのごときわずかな配列の相
違を区別するというより増幅化成物の存在を検出するこ
とだけが必要であるので一般的に簡単で端的に応用でき
るであろう。

増幅生成物を区別するより単純で良好な方法は、本発明
の過程の間生成する各々の増幅された生成物の長さが異
なるように増幅プライマーのヌクレオチド配列をＸ！沢
する事である。この点においては増幅生成物中に存在す
る塩基対の数は９９１！Ｉｉおよび増幅プライマーの離
れた距離により決められる。

それ故各々の潜在的変異ヌクレオチドが異なった長さの
潜在的増幅生成物を伴うように増幅プライマーをプライ
マできるであろう。

与えられた潜在的変異ヌクレオチドの存在または不在は
７１８合よく電気泳動技術によゲ（もそれ故検出され、
得られた異な−、た増幅生成物はその分子Ｍに従って分
布し、そのため例えばオートラジオグラフィーまたは蛍
光（★術により同定される。

異なった生成物の長さは７１ｉ−のヌクレオチドのみの
１１違であるが、しかし好適なのは長さが少くとも３ヌ
クレオチド分異なるであろう６本発明の方法は紫外線１
１α射によりオレンジ色の蛍光を発Ｌ７視覚化テキるエ
チジウム　プロミドのごとき挿入色素を使用しても良好
に達成される。それ故単一試料中の複数の潜在的変異ヌ
クレオチドの存在または不在が迅速、正確および容易に
決定される。

もし望むなら診断プライマー（類）および／または増幅
プライマー（類）は例えば蛍光発色団を使用して印また
は標識をつけられよう、それ故、試験の結果を電気泳動
から、例えばレーザースキャナーから読みとれるように
例えば各々の異ったプライマーまたは増幅プライマーが
異った蛍光発色団を運んでいてもよく、それ成木発明の
方法の自動化も可能にする。もしくは、増幅生成物の存
在または不在は単に選υく的にヌクレオシド三リン酸を
溶解できるが、しかし、ヌクレオチド配列（例えばＤＮ
Ａ）を溶解できない溶媒を使用して評価されるであろう
、トリクロロ酢酸（ＴＣ八）はそのような溶媒の例であ
る。それ故例えば、増幅生成物の存在または不在は増幅
反応混合物のＴＣＡ沈殿により決定されるであろう。適
当なヌクレオシド三リン酸の取り込みが指数関数的反応
で起ごった場合、診断プライマーの延長が起こらない場
合よりかなりの星のＴＣＡ不溶性物質が存在することに
なる。

不溶＋’ｌ物質の定量は既知の方法で達成されるであろ
う。それ故例えばヌクレオシド三リン酸を標、！１°ｉ
（しく例えば放射性または蛍光マーカー）、反応）１９
合物を例えば遠心分離し、存在する液体はデカン！・シ
て廃ｊ１ｊ　１、、液体または不冷性生成物を例えば放
射活性Ｒ１測または蛍光決定のごとき適切な検出技術に
かける。

本発明の更なる特色に従えば、本発明の方法に使用する
ための約５から５０ｂρのヌクレオチド配列が提供され
、前記配列の末端ヌクレオチドは既知の遺伝子障害に伴
う疑われる変異ヌクレオチドかまたは対応する正常ヌク
レオチドと相補的であり、前記配列の残りは疑われる変
５°ジヌクレオチドに間接する対応標的塩基配列かまた
は対応する正常ヌクレオチドと実質的に相（ｌｌｉ的で
あり、ｎ；１記ヌクレオ−１−ド配列は本発明の方法で
診断プライマーとして使用された場合標的塩基配列中の
対応するヌクレオチドと前記診断プライマーの末端ヌク
レオチドが相補的な診断プライマーの延長生成物が合成
され、前記診断プライマーの末端ヌクレオチドが標的塩
基配列中の対応するヌクレオチドに対し相補的でない時
は延長生成物は合成されない。

都合のよいように疑われる変異ヌクレオチドかまたは対
応する正常ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドは
ヌクレオチド配列の３′末端にある。

好適には、疑われる変異ヌクレオチドは対応する正常配
列の点突然変５゛シで生したものである。

前記ヌクレオチド配列は例えば１０から５０ｂｐｓ　（
例えばＩＯから３６ｂｐｓ）である。

本発明の４つの更なる特色に従うと、直ぐ上で定義した
ヌクレオチド配列を提供でき、ヌクレオチド配列の末端
ヌクレオチドば変異ヌクレオチドと相補的であり、対応
する正常ヌクレオチドが（ｉ）Ａ、　（ｉｉ）Ｇ　　（
ｉｉｉ）Ｃ，（ｉｖ）ＴまたはＵに各々変化した結果得
られたものである。

本発明の他の特色に従うと、前に定義した２つのヌクレ
オチド配列の組が提供され、１つの配列の末端ヌクレオ
チドは既知の遺伝子障害に伴う疑われる変異ヌクレオチ
ドと相補的であり、他の配列の末端ヌクレオチドは対応
する正常ヌクレオチドと相補的である。

さらに本発明の他の特色に従うと前に定義した標識また
はマーカー成分を運ぶヌクレオチド配列を含むプローブ
が提供される。

例により以下の既知の遺伝子障害を詳述し、疾患に関与
する突然変異および各々の突然変異に関連する文献を示
しである。

、表、遺伝疾患を起こす突然変異 Ａ常染色体性 疾患 アンチトロンビン■欠乏症 アミロイド性多発神経炎 アルファー１．アンチトリブンン欠乏症突然変異 Ｃ［、−ＴＧ Ｇ−４ＣＡ Ｇ−４ＧＣ Ｇ−ＧＧ 丁Ｇ−＋ＣＧ ＣＧ）ＣＡ ＧＡＴ−ＧＴＴ ＣＴ丁→ＣＴＣ ＧＧＣ−４７ＧＣ 参考文献 ＤｕｃｈａｎｇｅｉＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｆｋ
ｓｅａｒｃｈ１４：２４０８（１９８６） ｌ！１ａｅｄａ　Ｓ、ｉ、、　Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、′ｌ
ｅｄ。

３２９−３３８＜１９８６） Ｗａｌｌａｃｅ　’Ｉ　Ｒ，ろ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ　Ｉ
ｎｖｅｓｔ７８：６−１２（１９８６） Ｗａｌｌａｃｅ　Ｍ　Ｒ，Ｌ２Ｌ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
１ｎｖｅｓｔ７８：６−１２（１９８６） ＼ｕｋｉｈａ　　Ｔ、　　ｆ；４．、　　　Ｊ、Ｂｉｏ
１、Ｃｈｅｍ。

２６１　：１５９８９−１５９９４　（１９８６）Ｋｉ
ｄｄ　ＶＪ　４．、〜ａｔｕｔｅ ３０４　：　２３０−２３４　（１９８３）Ａｓｐ　２
５６−ａ１、エクソン■：未報告コドン５１の欠失 （正常）Ｍ　Ｍａｌｔｏｎ、　　印刷中Ａｒｇ”−Ｃｙ
ｓ、エクソン■：　Ｉ変異未報告９ アデノシン チ゛アミナーゼ欠乏症 ＣＧ→Ｃ八 ＡＡ→八Ｇ へｏｎｔｈｒｏｎ　ＤＴ、ｉ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ７６：８
９４−８９７（１９８５） Ｖａｌｅｒｉｏ　Ｄ４．、　　ＥＭＲＯＪ５：１１３−
１１９（１９８６） ｎｖｅｓｔ ＣＴ→ＣＧ ＧＴ−＋ＧＣ ＴＣ→ＣＣ ＴＣ→ＴＧ Ｃ１ａｄａｒａｓｉ、、　　Ｊ、　　Ｂｉｏ１、　Ｃｈ
ｅｍ２６２：２３１０−２３１５（１９８７）１１ａｎ
ｅｄａ　　Ｍ、　　ｊｑ、、　　Ｐｒｏｃ、　　ＮａＬ
１、　　八ｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ　８０：６３６６−６
３７０（１９８３）Ｓｈｏｅｌｓｏｎ　Ｓ、ら、、　Ｎ
ａＬｕｒｅ３０２：５４０−５４３　　（１９８３）Ｔ
Ｇ→ＴＴ イムノグロブリン カ、パ欠乏症 ＣＴ→ＣＣ ＣＧ→Ｃ八 Ｃ八−→Ｇ八 ＣＴ−）ＣＧ Ｔｓｕｊｉ　Ｓ、４．、　　Ｎ、Ｅｎｇ１、　　Ｊ、　
　門ｃｄ。

３１６：５７０−５７５（１９８７） Ｓｈｉｂａｓａｋｉ　　Ｙ、ｊ、、Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、
　　Ｉｎｖｅｓｔ７［ｉ：３７８−３８０（１９８５） Ｃｈａｎ　ＳＪ、４．、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ１、
　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　　ＵＳ八　８４：２１９４−２１９７（１９８
７）Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ−Ｎｏｒｄｇｒｅｎ　Ｊ、　　
９Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２３０：４５８−４６１（１９８
５）ＣＧ→ＴＴ レセプター欠乏症 鎌状赤血ｆ７に性貧血 ＧＧ→Ｇ＾ ＴＧ→ＴＴ へＧ→Δへ ＣＧ→ＴＧ ＣＧ−◆ＴＧ 乏症 ＴＧ−＋Ｔ八 ＧＡＧ−ＧＴＧ Ｌｅｈｒｍａｎ　　ＭＡｉ、、　　Ｃｅ１１４１ニア３
５−７４３（１９８５） Ｃｏｌｏｎ　１１１１　Ｍ、、　　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ
ＵＳ八　８３：６０４５−６０４７（１９８６）Ｄｉｌ
ｅｌｌａ　　ＡＧ　　　４．、　　Ｎａｔｕｒｅ３２２
ニア９９−８０３（１９８Ｇ） 旧１ｅｌｌａ　　ＡＧ　　　（：Ｊ、、　　ＮａＬｕｒ
ｅ３２７：３３３−３３６（１９８７） Ｒｏｍｅｏ　Ｇ、　ｑ、、　　Ｐｒｏｃ　Ｎａ１１８４
：２８２９２８３２（１’）８７）Ｗｉｌｌｉａｍｓ　
ＳＲ，４，、Ｊ、ｌ’１ｉｏ１．Ｃｈｅｍ２６２：２３
３２−２３３９（＋９８７）Ｃｈａｎ（ＨＪＣ，および
に、Ｉｎ １１２７−９（１９８１）； ０ｒｋｉｎ　Ｓ１１．−ら−、、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ
、Ｍｅｄ。

３Ｑ７３２−６　（１９８２）　；およびＣｏｎｎｅｒ
　ＢＪ１’ｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
ｌｌ５Ａ。

則、２７８−８２（１９８３） Ａｃａｄ　　５ｃｉ Ａｃａｄ　　５ｃｉ ＹＷ、Ｌａｎｃｅｔ　２゜ １３Ａ −ら− 疾患 β−サラセミア 文７矯紹界野 、１）非機能性ｍＲＮパ ノンセンス突然変異体 （１）　　コ　ト　ン１７（八−−Ｔ）（２）コドン３
９（Ｃ→Ｔ） （３）コドン１５（Ｃ→＾） （４）コドン３７（Ｇ→Ａ） （５）コドン１２＋（Ｇ→Ｔ） フレームソフト突然変異体 （６）−２フトン８ （７）−１コ（ン１６ （８）−１コドン４４ （９）−１コ１　ン８／９ （１０）−，１コドン４１／、１２ （ＩＩ）−１コドン６ （１２）＋　ｌ　　コ　ト　ン７１／７２（ｈ）ＩＩＮ
Ａプロセンシング突然変異体スプライス結合剤 （１）　ＩＶＳ　１位ＩＧＴ−ＡＴ ２６０；１２８１０−１２８８１４（１９８５）升す 蓑考スー献 Ｃｈ＋ｎ８　ＪＣ、ｉ　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１１．　　
八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＩＩｓ八　７６　：２８８６　（１９７９）Ｔｒｅｃａ
ｒＬｉｎ　ＲＦ　　ｉＪ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ６Ｆ
ｌ：１０１２（１９８１） およびＣＩ＋ｐｈａｂ、　ＦＦ、　４ １、ａｎｃｅｔ　　ｉ：３（１９８６）Ｋａｚａｚｉａ
ｎ、１ＩＩＩ　支［ｉｕｒ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏ１、　
　ｏｒｇ。

Ｊ、３：５９３（１９８４） Ｂｏｅｈｍ、ＣＤ　　；、　　ｌ１ｌｏｏｄ　６７：１
１８５（１９８６）Ｋａｚａｚｌａｎ　１Ｉｌｌ　４　
Ａｍ、　　Ｊ、　　ｔｌｕｍ、　　Ｇｅｎｅｔ。

３８；Δ８６０（１９８Ｇ） ０ｒｋｉｎ　Ｓｌｌ　　−％、、　Ｊ、　Ｒｉｏ１、Ｃ
ｈｅｍ。

２５６：９７８２　　（１９８１） Ｋａｚａｚｉａｎ　ｆｌｉｔ−ら−ＩＥｕｒ、ｍｏｌｅ
ｃ、Ｂｉｏ１、　ｏｒｇ。

Ｊ、３：５９３（＋９８４） Ｋｉｎｎｉｂｕｒ８ｈ、＾Ｊ　１Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５１０：５４２１（１９８２） Ｋａｚａｚｉａｎ　ｔｌｌｌ　−：ｒ　　Ｅｕｒ、ｍｏ
ｌｅｃ、［１ｉｏ１．　　ｏｒＢ。

Ｊ、３：５９３（１９８４） およびＷｏｎｇ　Ｃ６−Ｐｒｏｃ、Ｎ１Ｉｔ１．Ａｃａ
ｄ、５ｃｉＩＪｓＡ　　８３：Ｇ５２９（１９８Ｇ）Ｋ
ａｚａｚｉａｎ、１Ｉｌｌ　４　Ｅｕｒ、ｍｏｌｅｃ、
Ｂｉｏ１、ｏｒｆＸＪ　　３：５９３（１９８４） お、上グ　　Ｋｉｍｕｒａ、　　八　−４Ｊ、１ｌｉｏ
１．Ｃｈｅｍ。

２５８：２７４８（１９８３）。

Ｋａｚａｚｉ、１ｎ　　１Ｉｌｌ　　−ｑｙ　　Ａｍ、
Ｊ、ｌＩｕｍ、ＧｅｎｅＬ。

３５：１１０２８（１９８３ ）Ｃｈｅｎ　ＴＣ−（’）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａ
ｃａｄ、　　５ｃｉＵＳ八　８１：２Ｂ２１（１９８４
） ０ｒｋｉｎ、　　Ｓｌｌ　　　ｇ−Ｎａｔｕｒｅ２９６
　：　６２７　（１９８２）および位ＩＧＴ−＋ＴＴ コンセンサス変化 位５（Ｇ−（：） 位（Ｇ−すｒ） １位Ｇ（１゛−謝Ｃ） 内部ＩＶＳ 変化 ＶＳ　１位 １１０（Ｇ−弓） １νＳ２位 ７０５（Ｔ→Ｇ） ＩＶｓ　２位 ７４５（Ｃ１０） １νＳ２位 ６５４（Ｃ→Ｔ） Ｔｒｅｉｓ＋＋＋ａｎ　Ｒ，４Ｎａｔｕｒｅ　　３０２
：５９１Ｋａｚａｚｉａｎ、　）ＩＨ４Ｅｕｒ、ｍｏｌ
ｅｃ、Ｂｉｏｌ。

ｏｒｇ、Ｊ、　　３：５９３（１９８４）Ｏｒｋｉｎ、
　ＳＨ４，Ｎａｔｕｒｅ　２９６，６２７（１９８２）
およびＴｒｅｉｓｍａｎ、　Ｒ４ Ｃｅｌｌ　　２９；９０３（１９８２）Ｂｕｎｎ　ＨＦ
　４．ヘモグロビン二分子遺伝学および臣ｕ床、ρ、　
２８３　（サウンダース、フィラデルフィア１９８６） Ｋａｚａｚｉａｎ、Ｉｔ）ｌ　Ｍ、＋　Ｅｕｒ、ｍｏｌ
ｅｃ、Ｂｉｏｌ。

ｏｒｇ、Ｊ、　、３：５９３（１９８４）および０ｒｋ
ｉｎ。

Ｓｌ（ｉ、　Ｊ、Ｂｉｏ１、Ｃｈｅｍ、２５８ニア２４
９（１９８３）。

Ｐａｄａｎｉｌａｍ　ＢＪ＋　４１ｍｊ、Ｈｅｍａｔｏ
１２２：２５９（１９８６） 八ｎＬｏｎａｒａｋｒｓ　　ＳＥ、　　イｉ　　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａ＊１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：１１５４（１９８４）およびＡ
ｔｗｅｈ　ＧＦ　　−ら−Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅｓ。

１３ニア７７（１９８５） Ｋａｚａｚｉａｎ、ＩＩＩＩ　　＝　　［４ｕｒ、ｍｏ
ｌｅｃ、［３ｉｏ　にｏｒＩＨ。

Ｊ、３：５９３（１９８４）およびＴｒｅ’ｒｓｒａｒ
ｒｎ、　１１　１ＮａＬｕｒａ　３０２：５９１（１９
８３）Ｗｏｎｇ　Ｃ４Ｐｒｏｃ、ＮａＬ１、＾ｃａｄ、
　　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ８３：６５２９　（１’）８６）
および八Ｌｗｃｈ、　　ＧＦ　　６　　Ｎｕｃｌｃｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｔ！ｓ。

１３＋７７７（１９８５）。

０ｒｋｉｎ、５ｌ１６　　Ｎａｔｕｒｅ２９６：６２７
（１９８２）およびＡｔｗｅｈ　ＧＦｉ　Ａｍ、Ｊ、ｌ
ｌｕｍ、Ｇｃｎｅｔ：１１１　：８５　（１９８６） ＨａｓＬＩＩｓａｙ、Ｄ　　４　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　１ｉＣｓ。

９：１７７７　　（１９８１） １）ｏｂｋｉｎ、Ｃ；）　　Ｐｒｏｃ、ＮａＬ１、＾ｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＩｔＯ：１１８４（１９１（３） （ｌｒｋｉｎ、Ｓｌｌ　　４　ＮａＬｕｒｃ　２９６：
６２７（１９８２＞およびＴｒｅｉｓｍａｎ、　ｌン　
−Ｔ２２−　Ｎｉ１Ｌｕｒｅ３０２：５’１ｌ（１９８
３） Ｃ１＋ｃｎ８ＴＣ４Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１１．　　＾ｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＩＪｓ八　旧：２ｆ１２１　（１９８，１）１１Ｇ（Ｔ
−Ｇ） Ｆｅｉｎｇｏｌｄ　　ｌｉＡ　　４　　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ
、八ｃａｄ、５ｃｉ４４５；１５９（１９８５） コーディング領域置換 （１６）コドン２６　（Ｇ−シΔ） （１７）コｉ　ン２４（Ｔ→八） （１Ｂ）：ＩＦン２７（Ｇ　　−’ｒ）β°、βε β−βＫｎｏｓｓｏＳ ＴＩ＋ｃｉｎ　ＳＬ　　−ら−Ｊ、Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ
。

（印刷中１９８６）および０ｒｋｉｎ　Ｓｌｌ　　４Ｎ
ａｔｕｒｅ　３００ニアＧＢ（１９Ｂ２）Ｇｏｌｄｓｎ
＋ｉ　ｔＬ＋　　ｉｙ　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ１、　
　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　　８８；２３］８（１９８３）Ｏｒｋｉｎ　
５ＩＩｊ＋　Ｊ、［１ｌｏｏｄ　６４：３１１（１９８
４）（ｃ）転写性突然変５゛シ休 （１）−８８Ｃ→Ｔ ８７　　Ｃ−Ｇ （３）−３１＾→Ｇ ←Ｄ−２９八→Ｇ ＷｏｎＢ、Ｃ；ｒ　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ１、　　八
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳ八　１１１：６５２９（１９８６）Ｏｒｋｉｎ　Ｓ
ｌｌ　　９−１Ｊ、旧ｏ１．ｃｌ＋ａｍ。

２５９：＞１６７９（１９８４） Ｏｒｋｉｎ　Ｓｌｌ　　Ｍ　　Ｎａｔｕｒｅ　２９６：
（ｉ２７（１９１１２）およびｒｒｅｉｓｍａｎ　１＋
　　６　Ｎａｔｕｒｅ　３０２：５９１Ｔｔｒｋ’＋Ｉ
＋ａｒａ　’ｌ　　ｊ　　Ｂｌｏｏｄ　６７：５４７（
１９８６）八ｎＬｏｎ１１ｒａｋｉｓ　　ＳＥＡ　　　
Ｐｒｏｃ、ＮａＬ１、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：１１５４（１９８４）および２
Ｂ　八−＞Ｃ ２８八→Ｇ Ｎａｔ１、八ｃａｄ ’ｃｌａｎ（ＨＣ；ｙ　　Ｐｒｏｃ、 １３３：（ｉ５２９（１９８６） Ｓｕｒｒｅｙ　Ｓ　　−ら−Ｊ、Ｂｉｏ１、Ｃｈｅｍ。

２６０：６５０７（１９８５） Ｏｒｋｉｎ　Ｓｌｌ　　４ １１ニアＩ？２７（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ　　／１ｃｉｄｓ　　Ｉｒｅｓ。

、＋＋５八 （ｔｌ）ポリアデニル化突然変異体 へへ丁へへへ−→へへＣへへへ ０ｒｋｉｎ　　Ｓｌｌ　　　ら　　ＩＥｕｒ、ｍｏｌｃ
ｃ、１ｌｉｏｌ。

４：４５３（１９８５ ｏｒＢ、Ｊ。

（ｃ）欠失 （１）　　３’β（−６１９ｂｐ） （２）　　５’β（−１，３５ｋｂ） （３）　　β（−１０ｋｌ＋） ０　１１ｂＦ ０　１１ｂＦ ＳｐｒｉＬｚ、ＲＡ　４　　Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｒ、　Ｒｃｓ。

１０　：　８０２５　（１９８２）および０ｒｋｉｎ、
Ｓｌｌ　　５Ｐｒｏｃ、ＮａＬ１、八ｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ　　７６：２４００ｆ’ａｃｌｉｎｉｌａｍ
、ＩＩＪ　　４　１１１ｏｏｄ　Ｇ４：９４１（１９８
４）Ｇｉｌｖ＋ｎ、　　ＪＧ　　丘［１ｒ、Ｊ、ｌＩａ
ｅｍａｔ、５６；３３’１−１−＝β−１ナラセミア突
然変巽体 グ１コビン 疾トユ ズ４１変づ″（ Ｉ・リオセポスファ トイソメラーゼ欠乏症 へＧ→へＣ つ１コホルフィリノーゲン脱炭酸酵素欠乏症Ｇ−ＧＡ ＩＩ　Ｘ〜結合 灰１・Σ・。

血友矩員 逍−（ｋ了 因子■ 血友病１３ 因子■ 突然」Ｃ葭 ＣＧ−ＴＧ（２４） ＣＧ−→ＴＧ　（２６） ＣＧ→ＴＧ（１Ｂ） ＣＧ−シＣへ（２６） ＣＧ−酬Ｔｔ；（１８） ＣＧ→ＴＧ　（２２） ＣＧ→ＴＧ（２２） ＣＧ−＋Ｃ八 二り文献 Ｄａａｒ　　１０．：ｚ　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ目、へ
ｃａｄ、５ｃｉｆ１３ニア９０３−７９０７（１９８（
ｉ）Ｄｅ　Ｖｃｒｎｅｕｉｌ　Ｉｆ、ｉ、、５ｃｉｅｎ
ｃｅ２３４ニア３２−７３４（１９８Ｇ） ５考づζｄ仄 ＧｉＬｓｃｈｉｃｒ　　Ｊ、’＋、＋　　Ｎａｔｕｒｅ
’Ｊ１５：４２７−４３０（１９８５）八ｎＬｏｎａｒ
ａｋｉｓ　　５Ｉｉ９．、Ｎ、Ｅｎｇ１、Ｊ、Ｍｅｄ。

３１３：Ｆ１４２−８４８（１９８５）ＧｉＬｓｃｈｉ
ｅｒ　　Ｊ、　　；ｙ、、５ｃｉｔｉｎｃｃ２３２：１
４１５−１４１６（１９８６）Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ
　　Ｉ１、　ｉ。

Ｎ；＋Ｌｕｒａ　　３２４：３８０−３８２（１９８Ｇ
）Ｂｃｎｔｌｃｙ　　ＡＫ　　　４　　　Ｃｅ１ｌ　　
４５：３４３−３４８ＳＡ Ｔ−ＩＴＴ ＧＡ　−ＣＧ ｆｌｅｅｓ　ｎＪＧ　　−５，。

ＮａＬｕｒｏ　３１６：６４３ ｎａｖｙｓ　ＩＪ　　Ｍ、。

（＋９８７） ６４５（＋９８５）。

Ｂｌｏｏｄ　（ｉ９：＋４（１−１４３欠失の例は下記
文献にみられる； Ｆｏｅｒｒｅｓｔ　　ＳＭ、　　Ｃｒｏｓｓ　　ＧＣ，
５ｐｅｅｒ　　Ａ、　　Ｇａｒｄｎｅｒ−Ｍｅｄｗｉｎ
Ｄ　　Ｂｕｒｎ　Ｌ　　およびＤａｖ’ｒｅｓ　Ｋε　
（１９８７）デュシエンヌおよびヘラカー筋ジストロフ
ィーにおけるエクソンの選択的欠失Ｎａｔｕｒｅ　３２
０．６３Ｂ−６４０゜Ｋｏｅｎｉｎｇ　Ｍ、　Ｈｏ［ｍ
ａｎ　ＥＰ、　Ｂｅｒｔｓｅｌｓｏｎ　ＣＪ、　Ｍｏｎ
ａｃ。

ＡＰ、　Ｆｅｅｎｅｒ　Ｃおよびにｕｎｋｅｌ　ＬＭ　
（１９８７）デエンエンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）
　ｃＤＮ＾の完全クローニングおよび正常および怒染個
体のＤＭＤ遺伝子の予Ｄ１＆的遺伝子構成、Ｃｅ１ｌ　
５０．５０９−５１１゜Ｍａｌｈｏｔｒａ　ＳＢ　　１
ｌａｒｔ　　ＫＡ　　ＫＩａｍｕＬ　ＩＩＪ　　Ｔｈｏ
ｍａｓ　ＮＳＴＢｏｄｒｕｇ　ＳＥ、　Ｂｕｒｇｈｅｓ
　ＡＩＩＭ、　Ｂｏｂｒｏｗ　Ｍ、　ｌ１ｏｒｐｅｒ　
ＰＳ。

Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＭＷ、　Ｒａｙ　ＰＮ、およびＷｏ
ｒｔｏｎ　ＲＧ（１９８Ｂ）デュシェンヌおよびへンカ
ー筋ジストロフィー患者におけるフレームーンフト欠失
　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２゜７５５−７５９゜ Ｒｅａｄ　ＡＰ、　Ｍｏｕｎｔｔｏｒｄ　ＲＣ，Ｆｏｒ
ｒｅｓｔ　ＳＭ、　ＫｅｎｗｒｊｃｋＳＪ、　Ｄａｖｉ
ｓ　ＫＥ＋　および１ｌａｒｒｉｓ　Ｒ（１９８８）デ
ュシエンヌおよびペンカー筋ジストロフィーにおけるエ
クソン欠失の型、ｌｌｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ　８０．１５
２−１５６゜Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ　ＪＳ、　　Ｇｔ
ｂｂｓ　ＲＡ、　　Ｒａｎ１ｅｒ　ＪＥ＋　　Ｎｇｕｙ
ｅｎＰＮおよびＣａ５ｋｅｙ　ＣＴ　（１９８８）　　
多ＤＮＡ増幅によるＤＭＤ座位の欠失スクリーニング、
Ｎｕｃ、八ｃ　Ｒｅｓ、１６：２３゜１１１４１−１１
１５６゜ Ｒｏｂｅｒｔｓ　ＲＧ＋　Ｇｏｌｅ　ＣＧ、　１ｌａｒ
ｔ　ＫＡ、　Ｂｏｂｒｏｗ　ｎおよびＢｅｎｔｌｅｙ　
ＤＲ（１９８９）デュシェンヌおよびベラカー筋ジスト
ロフィーの迅速担体および胎児Ｍｄ断Ｎｕｃ。

Ａｃ　　Ｒｅｓ、　　　Ｌ７：２＋　　８１１　　ｍし
ばしば非常に少量のゲノムＤＮＡ　Ｌか分析のために入
手可能でない。関連する正常または変異ヌクレオチド配
列に対する診断プライマーの特異性はハイブリダイゼー
ション検定中ヌクレオチド配列のコピーの数を増加せし
める事により便利に評価できる事が知られている。この
事は例えば、正常配列が変異配列ヘアニールされたもの
からなる二重鎖°゛カセソビ構成する事により達成され
、相接する鎖の２つのヌクレオチドの間のミスマツチは
好適にはカセットの中央部に向かって存在している０次
にカセットのコピーが、プラスミド宿主への挿入続いて
のプラスミドの複製および所望の配列の単離により都合
よく得られるが、用いたすべての技術はこの分野ではよ
く知られているものである。この技術は都合よく図１０
に示しである。

本発明をより十分に理解してもらうため、以下に、例に
より付随する図を参照しながら記載する。

図中ニー図１（ａ）および１（ｂ）は本発明の第１の実
施態様を図示しており、図１（ｃ）は電気泳動的に示さ
れているそのような試験の典型的結果であり； 図２（ａ）および２（ｂ）は本発明の第２の実施態様を
図示しており； 図３は多増幅生成物を区別するだめの好適な方法を図示
しており； 図４（ａ）および４（ｂ）は本発明の第３の実施態様を
図示しており； 図５（ａ）および５（ｂ）は本発明の第４の実施態様を
図示しており； 図６（比例してはいない）はヒトα１抗トリプシン遺伝
子を示しており；および 図７は実施例１および２で得られたゲルを可視化した結
果を示している。

図８はゲルを可視化した結果を示しており、図中レーン
１−４は実施例３の結果を、レーン５−８は実施例４の
結果の比率を表わしており、レーン９はサイズマーカー
を表わしている。

図９は実施例４で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。

図１０は所望のＤＮＡ二重体を増幅するカセットプラス
ミド系の使用を図示している。

図１１は本発明の第５図の実施態様（線状増幅）を図示
している。

図１２は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。

図１３は実施例６で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。

図１は本発明の第１の実施態様の方法を図示している１
図１　（ａ）は正常ヌクレオチド（Ｎ）を含む変性ゲノ
ムＤＮＡ鎖を示し、その中の特定の位置に（例えば遺伝
子障害の結果による）疑われる変異ヌクレオチドが存在
しているであろう、ハイブリゼイション条件下、適当な
ヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン酸の重
合化のための試薬の存在下核酸鎖を正常ヌクレオチドに
対し相補的な３′−末端ヌクレオチドを持つ診断プロー
ブ（−Ｎ）を接触せしめると［ｆｆｌ　１　（ｂ）に示
したごと＜３′−の方向ち診断プライマーの鎖延長が生
じる。疑われる変異ヌクレオチドに３′−末端ヌクレオ
チドが相補的であるような診断プライマー（−Ｍ）を使
用してもそのような鎖延長は起こらない。診断プライマ
ーの任意の鎖延長生成物が次に変性され増幅プライマー
（Ａ）を変性生成物にハイブリダイズすると更に鎖延長
生成物が得られる事になる。鎖延長生成物を次に変性し
この過程を繰り返せば増幅が達成される０診断プライマ
ーで増幅されるゲノムＤＮ＾の領域は図１　（ｂ）にＤ
Ｇで示しである。この領域の診断生成物は図１（ｃ）の
ＤＧで示されるバンドに対応する。対照として図１（ａ
）でＰで示されるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プラ
イマー（Ｐ）を核酸鎖の別の位置または他の核酸鎖（例
えばヒトＤＮＡの他の染色体）に使用する。この別の部
位は図１（ｂ）でＰＣＲで示されており、この部位から
のＰＣＲ対照生成物は図１（ｃ）でＰＣＲで示されてい
るバンドに対応する。ＰＣＲで示されたバンドはＤＧで
示されたバンドにより表わされた生成物より大きいかま
たは小さい生成物を表わす事が理解されるであろう。

図１（ｃ）は図１　（ｂ）および１（ｂ）で示された方
法の結果をアガロースゲル電気泳動上分割されたバンド
の形で示しており、例えば点突然変異により起こされた
遺伝子障害に関して適切に−Ｍまたは−Ｎ診断プライマ
ーを使用して分析されている。試験された検体が遺伝子
障害の担体（Ｃ）である場合正常（Ｎ）ヌクレオチド配
列および変異ヌクレオチド配列（旧の両方に関してハン
ドが観察されている。正常ホモ接合体（Ｎ）では正常ヌ
クレオチド配列に関してはバンドの存在が示されたが、
変異ヌクレオチドに関してはバンドは存在しない〔（）
で示されている〕および疾、色を起こす突然変異〔遺伝
子障害の検体（Ｄ）］のホモ接合体では正常ヌクレオチ
ド配列に関してはハンドを示さず〔（）で示しである］
、変異ヌクレオチド配列に関してはバンドが存在してい
る。

図２は本発明の第２の実施態様を図示している。

二重鎖核酸の各々の鎖の為の診断プライマーが使用され
ている。（ａ）では診断プライマーは３′−末端ヌクレ
オチドが正常ヌクレオチドに対し相補的になるようにデ
ザインされている。方法は図１に関連して記載されたご
とくして進行せしめるが、もし関連するヌクレオチドが
存在するならば２つの異なった診断プライマーで増幅を
開始する。それ故この実施態様においては第２の診断プ
ライマーが図１の増幅プライマー（Ａ）と等価である。

それ故国２（ａ）における増幅はプライマー（−Ｎおよ
びＮ−）により開始されるであろうが、変異ヌクレオチ
ド配列に相補的な３′−末端ヌクレオチドを持つ診断プ
ライマー（−門およびト）では開始されない。

試料の核酸鎖に変異配列が存在するので図２（ｂ）では
逆の事が真実である。図２に示した方法を達成した結果
は図１（ｃ）に示したものと同じ方法で表わされるであ
ろうが、その中の正常および変異（Ｎおよびｈ）につい
てはそのような配列の紐に対応するであろう。図２にお
いて、文字Ｐは対照として使用されたＰＣＲプライマー
を表わす。

図３は多増幅生成物が区別される１つの方法を示してお
り、それにより遺伝条件の総合テストのために試験され
るＲＮ＾またはＤＮＡが単一試料で可能である。試料の
ＤＮＡまたはＲＮＡの２つの鎖（変性）が示してあり、
１、　　２および３の番号を付けた別々の３つの座位を
含んでいる。これらの座位から除かれた別の領域がＰＣ
Ｒ増幅に使用され対照として働く。座位（１）に関して
は２０−ｍｅｒ診断プライマー（５’−Ｎ３’）をさら
に２０ｍｅｒ（３’　Ｎ−５）診断プライマーと一諸に
使用される。もし座位（１）で増幅が起こったとしたら
３９−ｍａｒ増幅生成物が得られるであろう。図中３′
−末端ヌクレオチドが正常で試験試料中のヌクレオチド
と関連しているので増幅がおこるであろう。同様に、試
験試料中の関連ヌクレオチドが変異ヌクレオチドであり
、使用された診断プライマーがまた３′−末端変異ヌク
レオチドを運んでいれば増幅が起こるであろう。しかし
ながら試料中の関連ヌクレオチドと診断プライマーの３
′末端ヌクレオチドの間でミスマツチが起こればそのよ
うな増幅はおこらないであろう、座位（２）では診断プ
ライマーはもし増幅が起これば４９−ｍｅｒ増幅生成物
を得るようにデザインされており、座位（３）では診断
プライマーはもし増幅が起これば５９−ｍｅｒ増幅生成
物を得るようにデザインしである。

前記のことかられかるように増幅生成物ハンドサイズは
２つの診断プライマーのサイズの合計から１を引いたも
のであり、適切にデザインされた個々の診断プライマー
により単一反応容器中華−ＲｒＮ料での多くの試験を実
施するのが可能であり、興味ある各々の座位を特徴付け
る。診断プライマーのサイズの合計のサイズが増加する
と、増幅生成物は例えばアガロースゲル上で分割する事
が可能になる。もし診断プライマーが常法により標識化
または印をつけられると分解能の改良が可能になり例え
ばアクリルアミドゲルで分割される。図３において文字
Ｐは対照として使用されたＰＣＲプライマーを示してい
る。

図４は本発明の第３の実施態様を示しており、その中で
は例えば通常のＰＣＲプライマー、を用いて正常ヌクレ
オチド（その中の特定の位置に疑われる変異ヌクレオチ
ドが存在するであろう）を含む核酸配列の通常の増幅が
達成されている。同様にもし正常ヌクレオチドの代わり
に疑われる変異ヌクレオチドが存在していても通常の増
幅が実施される。増幅生成物は本発明の第３の実施態様
に関連して前に記載したごとくして診断プライマーと接
触せしめる。増幅生成物が前に記載したごとく正常ヌク
レオチドを含む核酸配列を含み、使用された診断プライ
マーが３′−末端正常ヌクレオチドの場合診断プライマ
ーの延長生成物が形成されるであろう〔通常のＰＣＲ増
幅により生成するヌクレオチド配列（以後ＰＣＩＩ対照
生成物と称する）を鋳型として使用し］　（適当なヌク
レオシド三リン酸およびヌクレオシド三リン酸の重合他
剤存在下）。

診断プライマー延長生成物の産生のための鋳型はすでに
増幅されているであろうので増幅プライマーは必要でな
い。図４（ｂ）でＤＧで示される診断プライマー延長生
成物の存在または不在はＰＣＲ対照生成物［図４（ｂ）
にＰＣＲで示しである］の存在と同様にして例えば電気
泳動技術により検出される。

ＰＣＲ対照生成物が変異ヌクレオチドを含み、使用され
た診断プライマーが変異ヌクレオチドと相補的な３′−
末端を持っている場合診断プライマー延長生成物がまた
形成されるであろう事を理解するであろう。

得られた生成物バンドは例えば図４（ｂ）に示したごと
く可視化される。記号Ｎ−，Ｍ−、Ｃ−、Ｎ、　　Ｄ。

ＤＧおよびＰＣＲは図１（ｃ）に関連して定義したとお
りである。しかしながら診断プライマー延長生成物バン
ドはＰＣＩＩ対照バンドよりも低い分子量を持っている
（図４ｂに示されている）。この場合ＰＣＲプライマー
の１つが診断プライマー延長生成物の増幅のための増幅
プライマーとして働くので対照バンドは真の内部対照を
表わす。ＰＣＲ対照生成物が変異゛ヌクレオチドを含み
、診断プライマーが３′末端正常ヌクレオチドを含む場
合逆に延長生成物は形成されない。

もし望むなら本発明の第３の実施態様は試験の最初に試
験される試料をＰＣＲプライマーのみでなく、診断プラ
イマーとも接触せしめて達成される。

それ故ＰＣＲ対照生成物の望まれる程度の増幅が達成さ
れるまで遅らせられた診断プライマーの使用は必要なく
なる。実際、診断プライマーは一緒にまたはＰＣＲズラ
イマーが用いられた後の任意の時間に使用できる。それ
故試験は例えば試験されるべき試料を１つの容器に単に
添加するだけで達成され、その容器にはＰｃｔ？プライ
マー、診断プライマー、適当なヌクレオシド三リン酸お
よびヌクレオシド三リン酸の重合化剤が含まれている。

得られた生成物および生成物バンドは前に記載したごと
く同様にして可視化でき図４に示しである。

図５は本発明の第４の実施態様を表わしたものであり、
通常の増幅が図４に関連して記載したごとくして達成さ
れる。このようにして得られた増幅生成物はハイブリダ
イゼーション条件下、（ａ）前に定義したごとき２つの
別々の診断プライマーで各々は３′−末端正常ヌクレオ
チドを持つまたは（ｂ）前に定義したごとき２つの診断
プライマーで各々は３′−末端変異ヌクレオチドを持つ
（図５８参照）と接触せしめる。単一サイクルに続く延
長生成物の形成は試料核酸が正常または疑われる変異ヌ
クレオチドを含むかどうかを示すであろうし、電気泳動
技術により図５ｂに示したものと同じバンドパターンが
得られる。しかしながら２つの診断プライマーが使用さ
れているが、１つの診断プライマーは他の診断プライマ
ーのための増幅プライマーとして働くことを理解された
い。それ故もし望むなら、得られる任意の延長生成物は
それ自身増幅に供される。それ故多数の更なるサイクル
後回５ｃ中の付加的なバンドで示されるもののごとき低
分子量生成物が最初のＰＣＲプライマーオリゴヌクレオ
チドおよび添加した診断プライマーの相対的比に依存し
た比で形成される。ＰＣＲ増幅生成物は診断プライマー
延長増幅生成物から例えばゲノム上のＰＣＲプライマー
の結合部位がら離れている距離を増加または減少せしめ
る事により容易に区別されるであろう。

もし望むなら本発明の第４の実施態様を試験されるべき
試料を試験の最初からＰＣＲプライマーのみでなく診断
プライマーと接触せしめて達成することができる。それ
故ＰＣＲ対照生成物の望まれる程度の増幅が達成される
まで遅らせられた診断プライマーの使用は必要なくなる
。実際、診断プライマーは一緒にまたはＰＣＲプライマ
ーが用いられた後の任意の時間に使用できる。それ故試
験は例えば試験されるべき試料を１つの容器に単に添加
するだけで達成され、その容器にＰＣＲプライマー診断
プライマー、適当なヌクレオシド三リン酸およびヌクレ
オシド三リン酸の重合化剤が含まれている。もし試験が
この方法で実施されると、上で参照したより分子量の低
い診断生成物が生成し、それにより図５に示した付加的
なバンドを与える事になる。

図６（比例していない）はこの分野でよく知られている
ヒトαｌ抗トリプシン遺伝子［Ｌｏｎｇ　Ｇ、Ｌ。

らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ　２３　ｐ４８２
８−４８３７（１９８４）］が描いてあり、なかんずく
別々にα１抗トリプシンタンパク質の潜在的ＳおよびＺ
突然変異を運んでいるエクソン■および■の相対的位置
を示している。

特に図はαｌ抗トリプシン遺伝子のエクソン■が描かれ
ており、コドンＧＡ＾がＧＴＡに突然変異しグルタミン
酸残基の代わりのアミノ酸２６４におけるバリン残基産
生を生じているＳ変異体の位置を示している。

下記の配列を持つプライマーＩ： ５’　　ＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧ
ＧＣ＾八ＡＴＧＧＧ　　３’　　　　　ｒ（α１抗トリ
プへン遺伝子の７４４０−７４６９位にハイブリダイズ
し、） および下記の配列を持つプライマー■：５’ＧＧＧＣＣ
ＴＣＡＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＧＴＧ
　　　３’　　　　Ｉｔまたは下記の配列を持つプライ
マーＩＩａ（ＩＩに基ずいたＬＴ３　’　　ミスマツチ
体）： ５’　　ＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣ
ＴＡＡＧＡＧＧＴＴ　　３’　　　Ｕａ（各々はα１抗
トリプシン遺伝子の７７７０−７７９９位の為にデザイ
ンされている） が都合よく使用できる。

図はさらにαｌ抗トリプシン遺伝子のエクソン■を１笥
いており、コドンＧＡＧがＡＡＧに突然変異し、グルタ
ミン酸残基の代わりにアミノ酸の３４２位でリジン残基
が産生されているＺ変異の位置が示しである。下記の配
列を持つプライマー■；５’　ＴＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡ
ＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧ　３’　　ｌ
［［（α１抗トリプシン遺伝子の９８９０−９９１９位
にハイブリダイズする） および下記の配列を持つプライマー■：５’ＧＡＧＡＣ
ＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＡＴＣＡＴＴＡＡＧ　
　　３’　　　　　ＩＶ（α１抗トリプシン遺伝子の１
００８１−１０１０９位にハイブリダイズする） が都合よく使用できる。塩基番号の詳細はＢｉｏｃｈｅ
ｓ＋υ４８２８−４８３７．１９８４に従った。

図７は実施例１および２で得られたゲルの可視化の結果
を示している。レーン１はエクソン■を含むプラスミド
をＡｌｕｌで切断したものを示し；レーン２はサイズマ
ーカーであり、バタテリオファージφＸ　１７４　ＯＮ
＾を）ｌａｅ　Ｉ［［で切断した；レーン３はエクソン
■をプライマー■および■による前に定義したごとき増
幅およびエクソンＶのプライマー■および■による前に
定義したごとき増幅であり同じ反応混合物から各々３６
０ｂｐおよび２２０ｂｐの生成物を得た。レーン４は前
に定義したごとくプライマー１および■ａを使用すると
エクソン■の増幅はおきない事を示しているが、プライ
マー■および■ではエクソンＶの増幅が達成されている
。

レーン５は負の対照でありプライマー１．　　ｎ、　　
Ｔｌｌおよび■が増幅の促進に効果的な条件下存在して
いるが、その中にゲノムＤＮ＾は存在していない。

図８はレーン１−３に実施例３の結果を、レーン５−８
には正常および突然変異診断プライマーを使用した結果
であり、実施例４に従った不安定化は影響していない。

およびレーン９はパイテリオファージφＸ１７４のサイ
ズマーカーを示している。

レーン１は配列： ５’ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴ
ＴＣＡＴＴＴＴ　　　Ｖのヌクレオチドを診断プライマ
ー、、前に定義したＩと称されるオリゴヌクレオチドを
増幅プライマーとして使用した結果を示している。使用
されたヒトゲノムＯＮへはヒトα１抗トリプシン遺伝子
の潜在的Ｓ突然変異点に存在し正常ヌクレオチド（Ａ）
を持つ正常ホモ接合体からのものである。期待される２
６７ｂＰ増幅生成物が明らかに認められる。

レーン２は配列： ５’ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴ
ＴＣＡＴＴＴＡ　　　　　ＶＴのヌクレオチドを診断プ
ライマーとしておよび１と称されるオリゴヌクレオチド
を前に定義したごとく増幅プライマーとして使用した結
果を示している。使用されたヒトゲノムＤＮＡはヒトα
１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｓ突然変異点に存在する
正常ヌクレオチド（Ａ）を持つ正常ホモ接合体からのも
のである。Ａ−Ａミスマツチの存在のため２６７ｂρ増
幅生成物は形成されない。レーン３はヒトア２ポリボタ
ンバクＩＢ遺伝子に基づいた対照バンドを示し使用され
た配列は ＡＡＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＴＴＴ
ＡＣＡＧＧ　　　　　ＸＩ［［および ＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＴＡＣＧＡＡＡＡＡＣＣ
ＡＣＴＴ　　　　　　　　ＸＩＶである。

レーン４は空のまま残しである。

レーン５は配列ｔ ５’　　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡ／ＩＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧ
ＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧ　　３’　　■のヌクレオチドを
実施例４の診断プライマーとして使用した結果である。

診断プライマーは潜在的Ｚ突然変異点の正常ヌクレオチ
ド（Ｃ）と塩基対形成が可能な３′末端ヌクレオチド（
Ｇ）を運んでいる。

使用された試料ＤＮ＾はヒトα１抗トリプシン遺伝子の
潜在的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）
を持つ正常ホモ接合体からのものである。

レーン６は配列： ５’ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣ
ＡＴＣＧＡＣＡ　　３’　　■のヌクレオチドを実施例
４において診断プライマーとして使用した結果を示して
いる。診断プライマーはＺ突然変異点の突然変異体ヌク
レオチド（Ｔ）と塩基対形成できる３′末端ヌクレオチ
ド（八）を運んでいるが、しかし他の点では試料ＤＮＡ
に対し完全に相補的である。使用された試料ＤＮＡはヒ
トα１抗トリプシン遺伝子の潜在的Ｚ突然変異点に存在
する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ正常ホモ接合体から
のものである。レーン７は式■のヌクレオチド配列を実
施例４において診断プライマーとして使用した結果であ
る。使用された試料ＤＮＡはヒトα１抗トリプシン遺伝
子障害により影響を受けたホモ接合体およびＺ突然変異
点の突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）を持つものからのも
のである。レーン８は式■のヌクレオチド配列を実施例
４において診断プライマー、として使用した結果を示し
た。

使用された試料ＤＮＡは、ヒトαｌ抗トリプシン遺伝子
障害により影響されたホモ接合体およびＺ突然変異点の
突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）を持つものからのもので
ある。レーン５−８に示した試験の各々で使用された増
幅プライマー、のヌクレオチド配列は前に定義した弐■
のものである。１５０ｂｐ増幅生成物の産生はＡ−Ｃミ
スマツチ（レーン６）の存在では十分に抑えられておら
ず、ＧＴミスマツチの存在（レーン７）ではより抑えら
れていない。

図９は実施例４で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。レーン１および１４はサイズマーカーバタテリオ
ファージＸ　１７４　ＤＮＡのＨａｅ　ｍによる切断を
示し；　レーン２は配列： ５’ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣ
ＡＴＡＧＡＣＧ　　３’　　ＩＸのヌクレオチドを診断
プライマーとして、ヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在
的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持
つ試料ＤＮＡ　（試料ＤＮＡは正常ホモ接合体から）の
存在下使用した結果を示している。診断プライマーは３
′末端から５番目のヌクレオチドに関して計画的な変更
物を（配列■に下線−Ｃの代わりにＡ）運んでいるが３
′−末端ヌクレオチド（Ｇ）は潜在的Ｚ突然変異点に存
在する正常ヌクレオチド（Ｃ）と塩基対形成できる。レ
ーン３は配列： ５’ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧ（：ＴＧＡＣ
ＣＡＴＡＧＡＣＡ　　　３’　　　Ｘのヌクレオチドを
診断プライマーとして、潜在的Ｚ突然変異点に存在する
正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ試料ＤＮＡ存在下（試料
ＤＮＡは正常ホモ接合体から）使用した結果を示してい
る。診断プライマーは３′末端から５番目のヌクレオチ
ドに関して計画された変更物（配列Ｘ中に下線−〇の代
わりにＡ）を運んでいるが３′末端ヌクレオチド（Ａ）
はもし存在するなら潜在的Ｚ突然変異点の突然変異体ヌ
クレオチド（Ｔ）と塩基対形成ができる；レーン４はヌ
クレオチド配列■（前に定義した）を診断プライマー、
として、Ｚ突然変異のためのへテロ接合体からの、およ
びそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝子障害を運ぶ
試料ＤＮＡの存在下で使用した結果を示している；レー
ン５はヌクレオチドＸ（前に定義した）を診断プライマ
ーとして、Ｚ突然変異のためのへテロ接合体からのおよ
びそれ故ヒトα１抗トリプシン欠乏症遺伝子障害を運ぶ
試料ＤＮＡの存在下で使用した結果を示している。

レーン６はヌクレオチド配列■（前に定義した）を診断
プライマーとして、ヒトα１抗トリプシン遺伝子障害で
影響されたホモ接合体からの試料ＤＮＡ存在下使用した
結果を示している。レーン７はヌクレオチド配列Ｘ（前
に定義した）を診断プライマーとして、ヒトα１抗トリ
プシン遺伝子障害で影響を受けたホモ接合体からの試料
ＤＮＡの存在下で使用した結果を示している。

レーン８は配列： ５’ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣ
ＡＴＣＧＣＣＧ　　　３’　　ＸＩのヌクレオチドを診
断プライマーとしてヒトα１抗トリプシン遺伝子の潜在
的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌクレオチド（Ｃ）を持
つ試料ＤＮＡ存在下で使用した結果を示している（試料
ＤＮＡは正常ホモ接合体から）。診断プライマーは３′
末端から３番目のヌクレオチドに関して計画的な変更物
（配列ＸＩに下線−Ａの代わりにＣ）を運んでおり、３
′末端（Ｇ）は潜在的Ｚ突然変異点に存在する正常ヌク
レオチド（Ｃ）と塩基対形成できる；レーン９は配列： ５’　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣ
ＣＡＴＣＧ！、Ｃ八　　３’　　ＸＩＩのヌクレオチド
を診断プライマーとして、潜在的Ｚ突然変異点に存在す
る正常ヌクレオチド（Ｃ）を持つ試料ＤＮＡの存在下で
（試料ＤＮＡは正常ホモ接合体から）使用した場合の結
果を示している。診断プライマーは３′末端から３番目
のヌクレオチドに関して計画的な変更物（配列ＸＩＩに
下線−Ａの代わりにＣ）を運んでおり、３′末端ヌクレ
オチド（Ａ）はもし存在するなら潜在的Ｚ突然変異点の
突然変異体ヌクレオチド（Ｔ）と塩基対形成できる；レ
ーン１０はヌクレオチド配列ＸＩ　（前に定義した）を
診断プライマーとして、Ｚ突然変異のためのへテロ接合
体から、およびそれ故ヒトαｌ抗トリプシン欠乏症遺伝
子障害を運ぶ試料ＤＮＡの存在下で使用した結果を示し
た；レーン１１はヌクレオチド配列ＸＩＴ（前に定義し
た）を診断プライマーとして、Ｚ突然変異のためのへテ
ロ接合体からのおよびそれ故、ヒトα１抗トリプシン遺
伝子を運ぶ試料ＤＮ＾の存在下で使用した結果を示した
。レーン１２はヌクレオチド配列ＸＴ　（前に定義した
）を診断プライマーとして、ヒトα１抗トリプンン欠乏
症遺伝子障害で影響せしめたホモ接合体からのＤＮＡ試
料の存在下で使用した結果を示している。レーン１３は
ヌクレオチド配列ＸＩ［（前に定義した）を診断プライ
マーとして、ヒトα１抗トリプシン遺伝子障害により影
響を及ぼしたホモ接合体からの試料ＤＮＡ存在下使用し
た結果を示す。

レーン２−１３の各々の場合、弐■の配列を増幅プライ
マー、として使用し、式ｘ■： 八ＡＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＴＴＴ
ＡＣＡＧＧ　　　　　　Ｘｍおよび弐ＸｒＶ ＣＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＴＡＣＧＡＡＡＡＡＣＣ
ＡＣＴＴ　　　　　　　ＸＩＶのヌクレオチド配列を対
照として使用した。対照に対応するハンドは図９におい
てＣの印がついており、ヒトアポリボクンバク？ｆＢ遺
伝子のエクソン２６からの５１０ｂｐ増幅生成物に対応
する。図１０はカセットプラスミド系の使用を例示して
いる。アムビシリン（八ｐ　ｒ　）およびテトラサイク
リン（Ｔｃ’）抵抗性を与える領域を持ち、同様にＥｃ
ｏＲ１、　ＢａｍＨｌおよびＳａ　ｌ　ｌ制限部位を持
つプラスミドｐＡＴ１５３をＦｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化する。正常および変異配列の両方が存在するた
めによるミスマツチしたヌクレオチド（中心部に）を持
つＤＮＡ二重部を含む合成カセットをＴＪＮＡ　リガー
ゼを用いて示したごとく宿主プラスミドに結合せしめる
。プラスミドは次に複製され、示したごと（に選択され
る。

本系は以下に更に詳しく例示される：合成りＮＡカセッ
トを調製する、各々はＥｃｏＲＩおよびＲａｍＨＩ制限
末端を持ち、中央部塩基対は変異ヌクレオチドのためミ
スマツチした２つのアニール化６５ｍｅｒｓを含んでい
る。これらのカセットを上に記載したごとくしてｐＡＴ
１５３プラスミド宿主に導入し、形質転換後、テトラサ
イクリン感受性クローンを単離しプラスミドを抽出する
。プラスミド抽出物は次に第２の形質転換に使用し、正
常または変Ｗ挿入物を持つクローンを提供する。クロー
ンが完全正常または突然変異体配列のどちらを含むかを
確認するため、各々約２μｇで配列決定しＮａＯＨ変性
後、Ｔ４ＤＮ＾ポリメラーゼ（シークエナーゼ、ＵＳバ
イオケミカルズ）およびコ２Ｐ末端標識プライマー、を
使用する。各々の型の少くとも一つの標４ｔおよび一つ
の変異が観察できていれば、各々の代表的クローンを大
量に増殖せしめ、プラスミドを抽出し、ＣｓＣ１グラジ
エントを用いて精製する。カセットを５ａｌｌで消化し
、フェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿後７０χエ
タノールで洗浄する。これでカセットはいつでも使用で
き、例えばポリメラーゼ連鎖反応において種々のオリゴ
ヌクレオチドの感度および特異性を決定する。

図１１は本発明の第５の実施態様（線状増幅）を例示し
ている。（ａ）においては正常ゲノムＤＮＡ配列が２つ
の診断プライマーと共に示されており、プライマーの１
つはその３′末端が正常ゲノムＤＮＡ配列に対し相補的
であり、第２のプライマーはその３′末端に疑われる変
異ヌクレオチドに相補的である。（ｂ）においては変異
ゲノムＤＮＡ配列が同一の２つの診断プライマーと一緒
に示しである。両方のゲノムＤＮＡ配列が相補的ハイブ
リダイゼーションを可能にする条件下プライマーと接触
せしめると、両方の場合ともハイブリダイゼーションが
起こるであろう。プライマー延長を可能にする条件下４
つすべてのヌクレオシド三リン酸を添加すると（ａ）で
は正常配列プライマー、および（ｂ）では変異配列プラ
イマーのみの延長体生成となり、他のプライマーの延長
はミスマツチのため妨げられている。

さらに（Ｃ）に示したごとく、ただ３つまたはそれ以下
の適当なヌクレオシド三リン酸が４つに代わって添加さ
れており、適当なプライマーの延長は適当なヌクレオシ
ド三リン酸の欠乏により与えられた点で妨げられている
。

図１２は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。

レーン１および２は正常ホモ接合体（聞）のＤＮＡに対
応し、レーン３および４はへテロ接合体（？ＩＳ）のＤ
ＮＡに対応し、レーン５および６は変更ホモ接合体（Ｓ
Ｓ）のＤＮＡに対応している。レーン１．３および５に
関してはオリゴヌクレオチドＸＸｎ　（正常）が使用さ
れ、レーン２，４及び６に関してはオリゴヌクレオチド
ＸＸＩ　（変異）が使用される。予期されたオリゴヌク
レオチド延長がレーン２または５に関して起こらなかっ
た。検出された生成物バンドは山形で示されている。

図１３は実施例６で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。

１番左のレーンは得られた生成物の大きさの確認のため
に使用されサイズマーカーを示している。

レーン１および２は正常ホモ接合体（ＭＭ）からの［ｌ
ＮＡに対応し、レーン３および４はへテロ接合体（ＭＺ
）からのＤＮＡおよびレーン５および６は変異ホモ接合
体（ＺＺ）からのＤＮＡに対応する。レーン１，３およ
び５に関してはプライマーＸＩＸおよびＸＩが使用され
；レーン１．２．４および６に関してはプライマーＸ１
１およびＸＸが使用された。予期されるごとくレーン２
または５に関してはプライマー延長が起こらなかった。

検出されたバンドは山型で示しである。

α−１−トリプシンＳ　　の　　　エクソン■）下の組
に描かれた塩基は各々の座位の正常配列を示している。

プライマー中下線を引かれた塩基はプライマーを不安定
化するため挿入された計画的なミスマツチを示している
。　　　　　はＬｏｎｇらにより帰属された通りである
（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　ｉ　ｓ　Ｌｒｙυ：５’　ＧＣＣ
ＴＧＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧ
ＧＴ　　ＸＸｌ５’　　ＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＧＡ
ＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡ　　　ＸＸｌｌ５’
　　ＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣ
ＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧａ３’　　ＧＡＡＧＧＡＣＧ
ＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡ
ＣＣｔａ＾八八ＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＡＴ
ＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡ　　　　３’
ｔＴＴＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＴＡ
ＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＴＴ　　　５’ＴＴＴ
ＴＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧＴＧ
ＧＴ　　　５’　　　ＸＸ［［１ＡＴＴＴＡＣＴＴＧＡ
ＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴ　　５’　
　ＸＸＩＶＣＡＣＡＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧＴＴＧ
ＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣ３
’ＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＧＴＡＣ＾八ＣＣＣＴＧ
ＡＣＴＣＣＧＧＧＴＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧ　　　５’
ＧＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴ
ＣＣＧＧＧ　　　５’ＴＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＧＴＡＣ
ＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＧＧＧ　　　５’α−１ト１
プシンＺ　　の　　（エク゛ンＶ）下の組に描かれた塩
基は各々の座位の正常配列を示している。プライマー中
の下線を引かれた塩基はプライマーを不安定化するため
挿入された計画的なミスマツチを示している。

５’　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣ
ＣＣＴＣＧＡＣＡ５’　　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣ
ＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＧ八ＣＧ５’　　ＣＣＧＴ
ＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴへＡＣＣＡＴＡＧＡＣ
八５’　　ＣＣＧＴＧＣＡＴ八八ＧＧＣＴＧへへＣＴＧ
ＡＣＣへＴＡＧＡＣＧ５’　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧ
ＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣぶ＾ＴＣＧＣＣＡ５’　　　ＣＣ
ＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧ
ＣＣＧ５’　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴ
ＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡ５’　ＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧ
ＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧ５’　　ＴＣ
ＣＡＧＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡ
ＣＣＡＴＣＧＡＣｇ３’　　ＡＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＧ
ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＴＡＧＣＴＧｃｇ
ＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣ
ＣＡＴＧＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣ３’ｃＴＣＴＴＴＣ
ＣＣＴＧＡ（：ＴＴＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＧＴＡＣＡ
ＡＡＡＡＴＣＴＣＣＧＧ　　５’ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴ
ＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＧＴＡＣ５’　　Ｘ
■ＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＣＣ
ＣＧＧＴＡＣ５’　　　ＸＶＩＩＩＣＴＣＡＴＴＣＣＣ
ＴＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧＧＴＡＣ５’　　
ＸＩＸＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣ
ＣＣＣＧＧＴＡＣ５’　　　ＸＸ本発明を以下の実施例
により例示するがそれに限定されるわけではない。実施
例において特に記載しない限り使用される物質は以下の
量または濃度である。

基質ＤＮＡ：　ｌｐｇ　　ヒトゲノムＤＮＡオリゴヌク
レオチド：各々適当なオリゴヌクレオチドについて１０
０ピコモル デオキシヌクレオシド三すン酸：各々の最終濃度１．５
ｍＭ 暖？ｌｉ液（反応混合物中での最終濃度）：６７ｎ＋Ｍ
）リス（ｐｉ（８，８ＨＣｆｆｉで）１６．６ｍＭ　　
硫酸アンモニウム ６．７ｍＭ　　塩化マグネシウム １０　　ｍＭ　　β−メルカプトエタノール６．７１ノ
ＭＥＤＴΔ 展開緩衝液：３５χフィコール７０−（フィコール７０
はショ糖およびエビクロロヒドリンの 共重合により作られた合成重合体、 共重合物は約７０．０００の平均分子量を持つ、ファル
マシアの製品） ２００＋＋＋Ｍ）リス−酢酸 １００　ｍＭ　　酢酸ナトリウム ５ｍＭＥＤＴＡ ０．２χ　ブロモフェノール　ブルー サイズマーカー：　Ｈａｅ　ｍで切断したバタテリオフ
ァージφＸ１７４　ＯＮＡ； 塩基対で表わしたバンドの大き さは以下のごとくである： １３５３　１０７８　８７２．６０３，３１０゜２８１
、２７１．２３４．１９４．１１８および７２ 実画Ｉ鉗Ｌ ｌｕｇのヒトゲノムＤＮＡ　、各１００ｐ１００ｐの上
で定義したオリゴヌクレオチドＩ［ＩＩ［［および■１
．５ｍＭ（最終濃度）の４種のデオキシヌクレオシド三
リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液を１．５社のス
クリューキャンプ微量遠心チューブ内で混合し、滅菌蒸
留水で体積を１００μｌに合わせた。チューブを密閉し
、沸騰水中に５分間置いた。反応は、１ユニツトの酵素
を含むＴａｑポリメラーゼ溶液１μｌ（アングリアン・
バイオチク社　ハンチ３を上記緩衝液で１ユニツト／μ
ｌに希釈したもの）を加えることにより開始させた。チ
ューブを５８°Ｃで４分間、続いて９１°Ｃで２分間イ
ンキエベートした。５８°Ｃ／９１’Ｃ加熱／冷却過程
を、さらに５サイクル行い、１ユニツトの酵素（上述）
をさらに添加した０次に、５８°Ｃ／９１’Ｃ加熱／冷
却過程をさらに６サイクル続け、さらに１ユニツトの酵
素（上述）を添加した。上記の加熱／冷却過程をさらに
６サイクル行い、さらに１ユニントの酵素（上述）を加
え、また５サイクル行い、ｌユニットの酵素（上述）を
さらに添加、またさらに２サイクル行いさらに１ユニツ
トの酵素（上述）を加えた。以上のサイクルに続いて５
８°Ｃで２０分間インキュベートした。

増幅した産物の検出は、１５μｌの反応混合液を５μｌ
のゲル泳動緩衝液と混合し、エチジウムブロマイド（２
ｐＺ／ｄ）を含むアガロースゲル（３％″“ＮｕＳｉｅ
ｖｅ″）電気泳動によって行なった。電気泳動はサイズ
マーカーと比較して行い、増幅産物の大きさが正しいこ
とを確認した。ゲルはトランスイルミネーター（波長３
００ｎｍ）上で可視化し、ポラロイド写真を撮影した。

第７図のレーン３は上で定義したプライマー■とプライ
マー■を用いたエクソン■の増幅により３６０ｂｐの産
物が生したもの、上で定義したプライマー■とプライマ
ー■を用いたエクソンＶの増幅により２２０ｂｐの産物
が生じた°ものを示している。

災胤桝ｌ 上で定義したプライマー■のかわりにプライマ−Ｉｌａ
を用いて実施例１を繰り返した。第７図のレーン４は本
実施例で得られたゲルを可視化した結果を示している。

上述のプライマー■とプライマー１１ａを用いた場合に
はエクソン■の増幅は見られないが、上述のプライマー
■およびプライマー■によるエクソン■の増幅によって
実施例１の場合と同様に同じ２２０ｂｐの産物が精製れ
れたことが示されている。

以上のように、実施例２はオリゴヌクレオチドの３′末
端のミスマンチがポリメラーゼ活性の開始を妨げる、あ
るいは少くとも実質的に抑制することを示唆している。

１　ｔｔｌのヒトゲノムＤＮＡ　、ｌｏＯｐｍｏｌｅの
後述の各オリゴヌクレオチド、各１．５ｍＭ（ｉ終濃度
）の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸、および上述
の最終濃度の緩衝液を１．５　ｄスクリューキャンプ微
量遠心チューブ内で混合し、滅菌蒸留水で体積を１００
μ！を合わせた。チューブを密閉し、沸騰水中に５分装
置いた。反応は１ユニツトの酵素を含むｌμｌのＴａｑ
ボリメラーゼン容液（アングリアン・バイオチク　バン
チ３を上述の緩衝液で１ユニツト／μｌに希釈したもの
）を添加することにより開始した。

チューブを５８°Ｃで４分間インキエベートし、次に９
１°Ｃで２分間インキヱヘートした。５８°Ｃ／９１°
Ｃ加熱／冷却過程をさらに５サイクル操り返し、その時
点でさらに１ユニントの酵素（上述）を添加した。続い
て、５８°Ｃ／９１°Ｃ加熱／冷却過程をさらに６サイ
クル行い、さらに１ユニツトの酵素（上述）を添加した
。上述の加熱／冷却過程をさらに６サイクル行なってさ
らに１ユニントの酵素（上述）を添加し、またさらに５
サイクル行いｌユニットの酵素（上述）をさらに加え、
さらに２サイクル行いｌユニットの酵素（上述）をさら
に添加した。

以上の過程に続いて５８°Ｃで２０分間インキュベート
Ｌ７た。

以下のテストは上述の過程に基づいて行なわれたもので
ある。

ａ）　使用したオリゴヌクレオチドは ５’　４ＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧ
ＴＴＣＡＴ丁ＴＴ　　　　Ｖおよび、上で定義したオリ
ゴヌクレオチドＩある。

用いたヒトゲノムＤＮＡは、ヒトαｌアンチトリプシン
の遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のもの
である二また、 ｂ）使用したオリゴヌクレオチドは ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＴＣ
ＡＴＴＴＡ　　　　　　Ｖｌおよび、上で定義したオリ
ゴヌクレオチドＩである。用いたヒトゲノムＤＮへは、
ヒトα１アンチトリプシンの遺伝的異常を持たない正常
ホモ二倍体細胞由来のものである。

増幅産物の検出は、１５μ！の反応混合液と、別の５μ
！のゲル泳動緩衝液を混合してエチジウムブロマイド（
２μ！／成）を含むアガロースゲル（３χ°“ＮｕＳｉ
ｅνｅ”）での電気泳動によって行なった。電気泳動は
、増幅産物のサイズが正しいことを確認するためにサイ
ズマーカー（第８図のレーン９）に対して行なった。ゲ
ルはトランスイルミネーター（波長３００ｎｍ）上で可
視化し、ポラロイド写真を撮影した。第８図のレーン１
および２は、この可視化の結果を示したものである。レ
ーンｌは、用いた試料ＤＮＡ内のＳ突然変異の可能性が
ある部位に対応するヌクレオチドと相補性のある３′末
端ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列■を用いた場
合に増幅が行なわれ、２６７ｂｐの増幅産物が生成され
ていることを示している。一方レーン２は、正常ホモ二
倍体細胞由来のＤＮＡ試料のＳ変異の可能性がある部位
内のヌクレオチド（Ａ）とミスマツチするヌクレオチド
（Ａ）を３′末端に持つ診断用プライマーを用い、診断
用プライマーの３′末端にミスマツチが生じる場合には
増幅が見られないことを示している。

１μ！のヒトゲノムＤＮＡ、１００ｐ１００ｐの後述の
各オリゴヌクレオチド、各１　、５ｍＭ　（最終濃度）
の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸、および上述の
最終濃度の緩衝液を１．５成スクリユーキヤンプ微量遠
心チエーブ内で混合し、滅菌蒸留水で体積を１００μｌ
に合わせた。チューブを密閉し、沸騰水中に５分装置い
た。反応は０．５ユニツトの酵素を含む１μｌのＴａｑ
ポリメラーゼン容７夜（アングリアン・バイオチク　バ
ッチ９を上述の緩衝液で０．５ユニツト／μ！に希釈し
たもの）を添加することにより開始した。チューブを６
０°Ｃで４分間インキユヘートし、次に９１°Ｃで２分
間インキユヘートした。６０’Ｃ／９１°Ｃ加熱／冷却
過程をさらに５サイクル繰り返し、その時点でさらに０
．５ユニントの酵素（上述）を添加した。続いて、６０
°Ｃ／９１”Ｃ加熱／冷却過すをさらに６サイクル行い
、さらに０．５ユニツトの酵素を添加した。上述の加熱
／冷却過程を６サイクル行い０．５ユニツトの酵素（上
述）をさらに加え、サラに５サイクル行い０．５ユニツ
トの酵素（上述）をさらに添加し、さらに３サイクル行
なった後、さらに０．５ユニントの酵素（上述）を添加
した。

以上の過程に続いて６０゛Ｃで２０分間インキユヘーヒ
トた。

以下のテストは上述の過程に基づいて行なったものであ
る： ａ）　用いたオリゴヌクレオチドは上述の■および■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチトリプ
シン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のも
のである： ｂ）　用いたオリゴヌクレオチドは上述のＸおよび■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトαｌアンチトリプ
ラン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来のも
のである： Ｃ）　用いたオリゴヌクレオチドは上述の■および■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトαｌアンチトリプ
シン　Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来の
ものである。

ｄ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のＸおよび■であ
り、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチトリプシ
ン　Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来のも
のである。

ｅ）　用いたオリゴヌクレオチドは上述の■および■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトαｌアンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ＺＺ）細胞由来のものであ
る。

ｆ）　用いたオリゴヌクレすチドは上述のＸおよび■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮ＾はヒトαｌアンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ＺＺ）細胞由来のものであ
る； ｇ）　用いたオリゴヌクレオチドは上述のＸＩおよび■
でり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチ１−リ
ブンン遺伝的異常を持たない正常ホモニ（，１体細胞由
来のものである： ｈ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のｘＩｌ［および
■であり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチト
リプシン遺伝的異常を持たない正常ホモ二倍体細胞由来
のものである： ｌ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のＸＩおよび■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮ＾はヒトα１アンチトリプ
シン　２アリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来の
ものである： ｊ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のＸ［Ｉおよび■
であり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチトリ
プシン　Ｚアリルに関してヘテロ二倍体である細胞由来
のものである： ｋ）用いたオリゴヌクレオチドは上述のに■お上び■で
あり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチトリプ
シン異常であるホモ二倍体（ＺＺ）細胞由来のものであ
る： １）　用いたオリゴヌクレオチドは上述のＸｎおよび■
であり、用いたヒトゲノムＤＮＡはヒトα１アンチトリ
プシン異常であるホモ二倍体（ＺＺ’）細胞由来のもの
である： 各テストにおいて、ヌクレオチド配列ＸＩ［ＩおよびＸ
ＩＶは増幅のコントロールとして用いた。

増幅産物の検出は、１５μｌの反応混合液と、別の５μ
ｌのゲル泳動緩衝液を混合してエチジウムブロマイド（
０，４５ｐｇ／ｍＱ）を含む１．４χアガロースゲルで
の電気泳動によって行なった。電気泳動は、増幅産物の
サイズが正しいことをＩ１１認するためにサイズマーカ
ーに対して行なった。ゲルはトランスイルミネーター（
波長３００ｎｍ）上で可視化し、ポラロイド写真を撮影
した。第９図のレーン２〜１３は、この可視化の結果を
示したものであり、レーンｌおよび１４はサイズマーカ
ーのバンドを示している。

レーン２〜７は、上述の反応条件下でプライマーが正常
ＤＮＡ試料と変異体ＤＮＡ試料を区別できるようにする
には、３′末端から５番目のヌクレオチドの変化による
診断用プライマー、の不安定化では十分に効果的ではな
いことをし示している。しかしながら、レーン８〜１３
ば、診断用プライマーの３′末端から３番目のヌクレオ
チドの変化が、プライマー、が正常ＤＮＡ試料と変異体
ＤＮ＾試料を区別できるようになるために効果的である
ことを示しており、これにより正常ホモ二倍体、ヘテロ
二倍体（キャリア）、あるいはヒトαｌアンチトリプシ
ン異常であるＺＺホモ二倍体の診断を行なうことができ
る。

本実施例の上述の実験は、不安定化させるための付加的
なヌクレオチド置換が導入されていない診断用プライマ
ー、および、不安定化のために３′末端から７番目のヌ
クレオチドを置換した（ＡからＣ）診断用プライマーを
用いても実施した。いずれの場合も診断用プライマーは
正常ＤＮＡ試料と変異体ＤＮＡ試料を区別するためには
十分に効果的ではなかった。不安定化のための付加的な
ヌクレオチド置換を有さない診断用プライマーに関して
は第８図のレーン５〜８に結果を示す。

工止皿ｉ オリゴヌクレオチドＸＸＩＩ（正常）およびＸＸ　Ｉ　
（変異体）をプライマー、として用いた。本実施例にお
いては、＾＋　Ｇ＋　およびＴのｄＮＴＰ混合液によっ
て、Ｃヌクレオシド三リン酸が必要となる前に７へ一ス
伸長したプライマーが得られる。これらのオリゴヌクレ
オチドのＴｌ１１は、Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（ＡＣＴ
）の公式から９４℃と計算されるが、これは２３１Ｗｅ
ｒまでのオリゴヌクレオチドに対してのみ適合すると考
えられており、ここでは７５°Ｃを選択した。

オリゴヌクレオチド（各３ｐｍｏｌｅ）の５′末端の水
酸基を、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１ｐＨ７，６，１０ｍＭ
　ＭｇＣＩｚ、　５ｍＭ　ｒｌＴＴ。

１００μＨスペルミジン、１００μＭ　ＥＯＴ＾を含む
８０μｌの反応溶液中で、ｄ”Ｆ　ＡＴＰ（アマジャム
２μＣｉ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（４ユ
ニント）を用いて標識した。キナーゼ反応は３７°Ｃで
２０分間行い、標識されたオリゴヌクレオチドは１５χ
ポリアクリルアミド変性ゲル７８Ｍ尿素で電気泳動する
ことにより確認した（前泳動５００Ｖ　　１時間、主泳
動８００Ｖ　４時間）。

プラスミドは、一つはヒトα１−アンチトリプシン遺伝
子のエクソン■のｓＲＮ域の正常配列（？ＩＭ）を含む
もので、もう一つ、は変異体ホモ二倍体（ＳＳ）に対応
する変異配列を含む、２種類を用いた。それぞれ可能な
型のＤＮＡ　２種について、６本のチューブを準備した
。ホモ二倍体には１　ｆｍｏｌｅの適当なプラスミドを
使用したが、ヘテロ二倍体は双方のプラスミドを０．５
ｆｍｏＩｅずつ使用することによってシュミレートした
。正常（ＸＸ　ｎ　’Ｉあるいは変異体（ＸＸ［）オリ
ゴヌクレオチド２００ｆｍｏｌｅ　（標識した溶液２　
ｐｌ　）を各々の型のＤＮＡに加えることによって各チ
ューブ内に２００倍過剰の標識オリゴヌクレオチドを調
製した。各チューブには、６．７ｍＭ　ＥＤＴＡ６．７
ｍＭ　ＭｇＣｈ、　６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｔｅｌ　ｐ
Ｈ８，８，１０ｍＭメルカプトエタノール、および１６
．６ｎ＋Ｍ　　硫酸アンモニウムを含む２０ｐｌの反応
溶液中に、最終濃度が各５ＩＩＭとなるように３　ｄＮ
ＴＰｓ、　Ａ、　Ｇ、およびＴ（ファルマシア）を加え
た。蒸発の影響を減じるため、それぞれ使用の際に反応
体積を３倍すなわち６０μｌとした。各チューブに３ユ
ニツトのＴａｑポリメラーゼ（シータス１．５ｍＭ　Ｍ
ｇＣＩｇ、　５０ｄ　ＫＣ１、１０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ
８，３，０，０１χゼラチンで５倍に希釈し、ｌユニン
ト／ｌｉｔとする）を添加する前に、チューブを５分間
沸騰水中につけ、氷上に置いた。チューブを１３０００
ｒｐＩ＋＋で２分間遠心し、２μ！のアリコートを５μ
ｌのホルムアミド／ブロモフェノールブルー染色剤に加
えた。次にチューブを７５°Ｃのウォーターバス中に置
いた。４時間後、チューブを取り出し、１分間１３００
０ｒｐｍで遠心して、さらに２ｐｌのアリコートを採っ
て５μｌの染色液に加えた。続いて、チューブを７５°
Ｃのウォーターバス内に戻した。６時間後チユーブを再
度取り出し、さらに３ユニツトのＴａｑポリメラーゼを
各チューブに添加して１３０００ｒｐｍで１分間遠心し
、蒸発を防ぐために１滴のライトミネラルオイル（シグ
マ）を加えたが、アリコートは採らなかった。そしてチ
ューブを７５°Ｃで一装置いた。最初の遠心の終わりか
ら計算して２４時間後、チューブをウォーターバスから
取り出し、１分間遠心して最後の２μ！のアリコートを
５μｌの染色液に加えた。全てのアリコートを前泳動（
５００ｖ　１時間）した１５χ変性ポリアクリルアミド
ゲル／８Ｍ尿素を用い、ＩＸＴＢＥ！１衝液（０，０８
９Ｍ　Ｔｒｉｓはう酸、０．０８９Ｍ　　はう酸、０．
００２門　ＥＤＴＡ）中で８８０ｖで５時間半電気泳動
を行なった。続いてゲルを低速感光フィルムで、スクリ
ーンを用いずに室温で一晩オートラジオグラフにかけた
。結果を第１２図に示す。

レーンｌおよび−ン２は正常ホモ二倍体（財）の、ＤＮ
Ａ、レーン３およびレーン４はへテロ二倍体（ＭＳ）の
ＤＮＡ、レーン５およびレーン６は変異体ホモ−倍体（
ＳＳ）のＤＮＡに対応する。レーン１，３．５ではオゴ
ヌクレオチドＸＸＩＩ（正常）が用いられ、レーン２，
４゜６についてはオリゴヌクレオチドＸＸＩ（変異体）
が用いられた。予想されたように、オリゴヌクレオチド
の伸長はレーン２あるいは５については起こらなかった
。検出された産物のバンドは■字形で示されている。

工施炎旦 ｌｎｇのカセットプラスミドＤＮＡ、各１００ｐ１００
ｐのオリゴヌクレオチドプライマー ＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ
ＡＧＣＡ＾　およびＴＡＴＧＣＧＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡ
ＴＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＡ　　。

各１．５ｍＭ（最終濃度）の４種のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸、および上述の最終濃度の緩衝液を１．５ｍ
ｌのスクリューキャップ微量遠心チューブ内で混合し、
滅菌脱イオン水（ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−０））で体積を
１００μ！に合わせた。チューブを密閉し、沸騰水中に
５分装置いた。反応は２ユニントのＴａｑポリメラーゼ
（シータス）を加えることによって開始し、蒸発を防ぐ
ために混合液をライトミネラルオイル（シグマ）で密閉
した。チューブを６０℃で４分間インキュベートし、続
いて９０°Ｃで２分間インキュベートした。この過程を
計３０サイクル繰り返した。

次に、６０ｐｌの反応溶液を分注し、６０ｐ輪ｏｌｅの
プライマーＸＩＸとＸＩ（正常）、あるいはプライマー
ｘ■とＸＸ（変異体）の何れかをそれに加えた。１ユニ
ツトのＴａｑポリメラーゼ（シータス）を加えてさらな
る反応を開始させた。混合液を９２°Ｃで２分間インキ
ュベートした後、６０°Ｃで４分間インキュベートした
。この過程を計４サイクル繰り返した。増幅産物の検出
は、反応混合物から採った１０ｔｔｌのアリコートをゲ
ル泳動“緩衝液”と混合した後、０　、５　ｐｇ／ｄエ
チジウムブロマイドを含む３ｚアガロースゲル（“’Ｎ
ｕＳｉｅｖｅ”’　ＦＩ’ＩＣバイオプロダクツ）での
電気泳動によって行なった。ゲルはトランスイルミネー
ター（波長３００ｎｍ）上で可視化し、ポラロイド写真
を撮影した。結果を第１３図に示す。左端のレーンは、
得られた産物のサイズを確認するために用いたサイズマ
ーカーを示している。レーン１および２は正常ホモ二倍
体（ＭＭ）由来のＤＮＡ、レーン３および４はへテロ二
倍体（？ＩＺ）由来の［ｌＮＡ、レーン５および６は変
異体ホモ二倍体（ＺＺ）由来のＤＮＡに対応する。レー
ン１，３．および５についてはプライマーＸ［Ｘおよび
ＸＩが用いられており、レーン２．４．および６に関し
てはプライマーＸｎおよびＸｘが用いられた。予想され
たように、レーン２あるいは５ではプライマーの伸長が
起こらなかった。検出された産物のバンドはＶ字型で示
している。

【図面の簡単な説明】

図１（ａ）および１（ｂ）は本発明の第１の実施態様を
図示しており、図１（ｃ）は電気泳動的に示されている
そのような試験の典型的結果であり二図２（ａ）および
２（ｂ）は本発明の第２の実施態様を図示しており； 図３は多増幅住成物を区別するための好適な方法を図示
しており； 図４（ａ）および４（ｂ）は本発明の第３の実施態様を
図示しており； 図５　（ａ）、　５　（ｂ）および５（ｃ）は本発明の
第４の実施態様を図示しており； 図６（比例してはいない）はヒトα１抗トリプシン遺伝
子を示しており；および 図７は実施例１および２で得られたゲルを可視化した結
果を示している。 図８はゲルを可視化した結果を示しており、図中レーン
１−４は実施例３の結果を、レーン５−８は実施例４の
結果の比率を表わしており、レーン９ばサイズマーカー
を表わしている。 図９は実施例４で得られたゲルの可視化の結果を示して
いる。 図１Ｏは所望のＤＮＡ二重体を増幅するカセットプラス
ミド系の使用を図示している。 図１１（、ｌ）、　１１（ｂ）および１１　（ｃ）は本
発明の第５の実施態様（線状増幅）を図示している。 図１２は実施例５で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。 図１３は実施例６で得られたゲルの可視化の結果を示し
ている。 図面の浄書（内容に変更なし） Ｒ々・７ Ｒ々・２ 〜・３・ Ｆ々・４ 〔 ｎヶ・６・ （ｓｔａｒｔｌ Ｌ　（ 瘤（為） Ｆｉｇ、５ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃａｌｌｇ ／ ｌ５ｏｌａｔｅ　ｐｌａｓｍｊ、ｄ ／ 〜、１１ ｒｅｑｕｌｒｅｍｅｎｔ Ｆｉｇ、　’１２ ］ 〉 手 ・続 平成昭和元年 ４月ｌフ日 ２、発明の名称 マクレオチド配列を検出する方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　インペリアル・ケミカル・インタ゛ストリー
ズ・ピーエルシー ４、代 理 人 別紙 １．　特許請求の範囲を次のように補正する。 「１．　　試料中に含まれる一種以上の核酸内の少なく
とも一つの変異ヌクレオチドの有無を検出する方法であ
って、以下の方法からなるもの：適当なヌクレオシド３
リン酸、ヌクレオシド３リン酸の重合のための試薬、お
よび標的塩基配列の診断領域のための診断用プライマー
によって、同時あるいは順に、ハイブリダイズ条件下で
試料を処理すること、ここにおいて該診断用プライマー
のヌクレオチド配列は該診断領域に実質的に相補的であ
り、診断用プライマーの末端のヌクレオチドは予想され
る変異ヌクレオチドあるいはそれに対応する正常なヌク
レオチドに相補的であり、それによって診断用プライマ
ーの該末端のヌクレオチドが標的塩基配列中の対応する
ヌクレオチドと相補的である場合には診断用プライマー
の伸長産物が合成され、診断用プライマーの該末端ヌク
レオチドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相
補的でない場合には伸長産物が合成されない：および、
伸長産物の有無から推測される変異ヌクレオチドの有無
を検出すること。 ２、以下に述べることを含む特許請求の範囲第１項記載
の方法： １）　適当なヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リ
ン酸の重合のための試薬、標的塩基配列の診断領域のた
めの診断用プライマー、および対応する増幅用プライマ
ーによって、同時あるいは順に、ハイブリダイズ条件下
で試料を処理することであって、該診断用プライマーの
ヌクレオチド配列は該診断領域に実質的に相補的であり
、診断用プライマーの末端のヌクレオチドは予ゼされる
変異ヌクレオチドあるいはそれに対応する正常なヌクレ
オチドに相補的であり、それによって診断用プライマー
の該末端のヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌ
クレオチドと相補的である場合には診断用プライマーの
伸長産物が合成され、診断用プライマーの該末端ヌクレ
オチドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補
的でない場合には伸長産物が合成されず二合成された診
断用プライマーの伸長産物は全て、その相補鎖から分離
した後に咳増幅用プライマーの伸長産物合成のための鋳
型として使用することができる。； ２）　変性条件下で試料を処理し、上記伸長産物が形成
された鋳型からプライマー伸長産物を分離すること： ３）　過程２）で産生された１本鎖を、適当なヌクレオ
シド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸の重合反応のため
の試薬、診断用プライマー、およびここで定義した増幅
用プライマーと、同時あるいは順に接触させ、それによ
って、可能な場合には過程２）で産生された１本鎖を鋳
型として用いてさらに伸長産物を合成させること＝４）
　過程２）および３）を十分な回数繰り返し、適当なヌ
クレオチド配列の増幅産物が検出できるようにすること
： ５）　過程４）で得られた増幅産物の有無から、推測さ
れる変異体ヌクレオチドの有無を検出すること。 ３、（ａ）第一の核酸配列の診断領域に本質的相補的な
塩基配列を有する第一の診断用プライマー該推測される
変異ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有する
第一の診断用プライマーおよび、第二の核酸配列の診断
領域に実質的に相補的な配列を有する第二の診断用プラ
イマー推測される変異ヌクレオチドに相補的な末端ヌク
レオチドを有する第二の診断用プライマー：あるいは、 （ｂ）第一の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配
列を有する第一の診断用プライマー、該推測される変異
ヌクレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相補的な末
端ヌクレオチドを有する第一の診断用プライマー、およ
び、第二の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配列
を有する第二の診断用プライマー、該推測される変異ヌ
クレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相補的な末端
ヌクレオチドを有する第二の診断用プライマー： の何れかで、同時あるいは順に試料を処理することを含
み、第一の診断用プライマーの該末端ヌクレオチド及び
第二の診断用プライマーの該末端ヌクレオチドが、　　
と　そ　ぞれのプーイマーのに　し　　　で　る　特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ４、　最初に、推測される変異ヌクレオチドを含む試料
核酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得られた
増幅産物を処理するための試料として用いることを含む
、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、　最初に、推測される変異ヌクレオチドを含む試料
核酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得られた
増幅産物を処理するための試料として用いることを含む
、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、　試料核酸処理を少なくとも一回繰り返し、それに
より同一の標的塩基配列を鋳型として用いて伸長産物の
線型増幅を行うことをさらに含む、特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ７、　推測される変異ヌクレオチドあるいは対応する正
常ヌクレオチドのいずれかと相補的である診断用プライ
マーの末端ヌクレオチドが、診断用プライマーの３′末
端にある、特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
れかに記載の方法。 ８、　試料がヌクレオシド３リン酸１．２、あるいは３
で処理され、それによって、生成される伸長産物がヌク
レオシド３リン酸１．２、あるいは３のみの存在で可能
な部位までしか伸長されてい、特許請求の範囲第６項記
載の方法。 ９　試料が３種のヌクレオシド３リン酸で処ＴＩされる
、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、塩基配列の末端ヌクレオチドが、既知の遺伝的異
常に関連した推測される変異ヌクレオチド、あるいはそ
れに対応する正常ヌクレオチドの何れかと相補的であり
、該配列の残りが推測される変異ヌクレオチドあるいは
対応する正常ヌクレオチドに隣接した対応する標的塩基
配列に実質的に相補的であり、該ヌクレオチド配列を本
発明の方法中で診断用プライマーとして用いる際に、診
断用プライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列の
対応するヌクレオチドに相補的である場合には診断用プ
ライマーの伸長産物が合成され、診断用プライマーの該
末端ヌクレオチドが標的塩基配列の対応するヌクレオチ
ドと相補的でない場合には伸長産物が合成されないよう
な、本発明の方法で使用される約５から５ｏｂｐのヌク
レオチド配列。 １１、酸末端ヌクレオチドがヌクレオチド配列３′末端
にある、特許請求の範囲第１０項記載のヌクレオチド配
列。 １２、推測される変異ヌクレオチドが対応する正常配列
の点変異の結果である、特許請求の範囲第１０項あるい
は第１１項記載のヌクレオチド配列。 １３、一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の遺伝的異
常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相補的であ
り、もう一つの塩基配列が対応する正常ヌクレオチドに
相補的である、特許請求の範囲第１０項から第１２項ま
でのいずれかに記載の二つのヌクレオチド配列の姐。 １４、試料中に含まれる一つ以上の核酸内の少なくとも
一つの変異ヌクレオチドの有無を検出するキントで、以
下のものを含むもの； １）　標的塩基配列の各診断領域のための診断用プライ
マー、各診断用プライマーのヌクレオチド配列は、該診
断領域に実質的に相補的であり、診断用プライマーの末
端ヌクレオチドは推測される変異ヌクレオチドあるいは
それに対応する正常ヌクレオチドに相補的で、使用の際
には、診断用プライマーの酸末端ヌクレオチドが標的塩
基配列中の対応するヌクレオチドと相補的である場合に
は診断用プライマーの伸長産物が合成され、診断用プラ
イマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応す
るヌクレオチドに相補的でない場合には伸長産物が合成
されないようなもの： ２）４種の異なるヌクレオシド３リン酸：および、３）
２）のヌクレオシド３リン酸の重合反応のための試薬。 １５、一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の遺伝的異
常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相補的で、
もう一つの配列の末端ヌクレオチドが対応する正常ヌク
レオチドに相補的である、標的塩基配列の各診断領域の
ための二つの診断用プライマーの組を含む、特許請求の
範囲第１４項記載のキット。１ 千続補正書 １、　ＩＬｒ／ｌ−の表示 平成１年特許願第５９４９２号 ２、発明の名称 ヌクレオチド配列を検出する方法 ３゜ 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 乙　称　　インペリアル・ケミカル・インダストリーズ
・ピーエルシー ４、代理人 住　所　　東京都千代田区人千町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６区 別紙 １、　特許請求の範囲を次のように補正する。 ｒ１、　　試料中に含まれる一種以上の核酸内の少なく
とも一つの変異ヌクレオチドの有無を検出する方法であ
って、以下の方法からなるもの：適当なヌクレオシド３
リン酸、ヌクレオシド３リン酸の重合のための試薬、お
よび標的塩基配列の診ｌ！１Ｉ８ＪＩ域のための診断用
プライマーによって、同時あるいは順に、ハイブリダイ
ズ条件下で試料を処理すること、ここにおいて該診断用
プライマーのヌクレオチド配列は該診断領域に実質的に
相補的であり、診断用プライマーの末端のヌクレオチド
は予想される変異ヌクレオチドあるいはそれに対応する
正常なヌクレオチドに相補的であり、それによって診断
用プライマーの該末端のヌクレオチドが標的塩基配列中
の対応するヌクレオチドと相補的である場合には診断用
プライマーの伸長産物が合成され、診断用プライマーの
該末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌクレ
オチドと相補的でない場合には伸長産物が合成されない
：および、伸長産物の有無から推測される変異ヌクレオ
チドの有無を検出すること。 ２、以下に述べることを含む特許請求の範囲第１項記載
の方法： １）　適当なヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リ
ン酸の重合のための試薬、標的塩基配列の診断領域のた
めの診断用プライマー、および対応する増幅用プライマ
ーによって、同時あるいは順に、ハイブリダイズ条件下
で試料を処理することであって、ｇｆｆ　ｄ断用プライ
マーのヌクレオチド配列は該診断領域に実質的に相補的
であり、診断用プライマーの末端のヌクレオチドは予忠
される変異ヌクレオチドあるいはそれに対応する正常な
ヌクレオチドに相補的であり、それによって診断用プラ
イマーの該末端のヌクレオチドが標的塩基配列中の対応
するヌクレオチドと相補的である場合には診断用プライ
マーの伸長産物が合成され、診断用プライマーの該末端
ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチド
と相補的でない場合には伸長産物が合成されず二合成さ
れた診断用プライマーの伸長産物は全て、その相補鎖か
ら分離した後に該増幅用プライマーの伸長産物合成のた
めの鋳型として使用することができる。： ２）　変性条件下で試料を処理し、上記伸長産物が形成
された鋳型からプライマー伸長産物を分離すること： ３）　過程２）で産生された１本鎖を、適当なヌクレオ
シド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸の重合反応のため
の試薬、診断用プライマー、およびここで定義した増幅
用プライマーと、同時あるいは順に接触させ、それによ
って、可能な場合には過程２）で産生された１本鎖を鋳
型として用いてさらに伸長産物を合成させること：４）
　過程２）および３）を十分な回数繰り返し、適当なヌ
クレオチド配列の増幅産物が検出できるようにすること
： ５）　過程４）で得られた増幅産物の有無から、推測さ
れる変異体ヌクレオチドの有無を検出すること。 ３、（ａ）第一の核酸配列の診断領域に木質的相補的な
塩基配列を有する第一の診断用プライマー該推測される
変異ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有する
第一の診断用プライマーおよび、第二の核酸配列の診断
領域に実質的に相補的な配列を有する第二の診断用プラ
イマー推測される変異ヌクレオチドに相補的な末端ヌク
レオチドを有する第二の診断用プライマー：あるいは、 （ｂ）第一の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配
列を有する第一の診断用プライマー、該推測される変異
ヌクレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相補的な末
端ヌクレオチドを有する第一の診断用プライマー、およ
び、第二の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配列
を有する第二の診断用プライマー、該推測される変異ヌ
クレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相補的な末端
ヌクレオチドををする第二の診断用プライマー： の何れかで、同時あるいは順に試料を処理することを含
み、第一の診断用プライマーの該末端ヌクレオチド及び
第二の診断用プライマーの該末端ヌクレオチドが、　　
と　そ　ぞれのプーイマーの１項記載の方法。 ４、　最初に、推測される変異ヌクレオチドを含む試料
核酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得られた
増幅産物を処理するための試料として用いることを含む
、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、　最初に、推測される変異ヌクレオチドを含む試料
核酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得られた
増幅産物を処理するための試料として用いることを含む
、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、　試料核酸処理を少なくとも一回繰り返し、それに
より同一の標的塩基配列を鋳型として用いて伸長産物の
線型増幅を行うことをさらに含む、特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ７、　推測される変異ヌクレオチドあるいは対応する正
常ヌクレオチドのいずれかと相補的である診断用プライ
マーの末端ヌクレオチドが、診断用プライマーの３′末
端にある、特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
れかに記載の方法。 ８、　試料がヌクレオシド３リン酸１，２、あるいは３
で処理され、それによって、生成される伸長産物がヌク
レオシド３リン酸１，２、あるいは３のみの存在で可能
な部位までしか伸長されてい、特許請求の範囲第６項記
載の方法。 ９、　試料が３種のヌクレオシド３リン酸で処理される
、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、塩基配列の末端ヌクレオチドが、既知の遺伝的異
常に関連した推測される変異ヌクレオチド、あるいはそ
れに対応する正常ヌクレオチドの何れかと相補的であり
、該配列の残りが推測される変異ヌクレオチドあるいは
対応する正常ヌクレオチドに隣接した対応する標的塩基
配列に実質的に相補的であり、該ヌクレオチド配列を本
発明の方法中で診断用プライマーとして用いる際に、診
断用プライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列の
対応するヌクレオチドに相補的である場合には診断用プ
ライマーの伸長産物が合成され、診断用プライマーの該
末端ヌクレオチドが標的塩基配列の対応するヌクレオチ
ドと相補的でない場合には伸長産物が合成されないよう
な、本発明の方法で使用される約５から５０ｂｐのヌク
レオチド配列。 １１、該末端ヌクレオチドがヌクレオチド配列３′末端
にある、特許請求の範囲第１０項記載のヌクレオチド配
列。 １２、１１Ｉ測される変異ヌクレオチドが対応する正常
配列の点変異の結果である、特許請求の範囲第１０項あ
るいは第１１項記載のヌクレオチド配列。 １３、一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の遺伝的異
常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相補的であ
り、もう一つの塩基配列が対応する正常ヌクレオチドに
相補的である、特許請求の範囲第１０項から第１２項ま
でのいずれかに記載の二つのヌクレオチド配列の組。 １４、試料中に含まれる一つ以上の核酸内の少なくとも
一つの変異ヌクレオチドの有無を検出するキットで、以
下のものを含むもの： １）　標的塩基配列の各診断領域のための診断用プライ
マー、各診断用プライマーのヌクレオチド配列は、該診
断領域に実質的に相補的であり、診断用プライマーの末
端ヌクレオチドは推測される変異ヌクレオチドあるいは
それに対応する正常ヌクレオチドに相補的で、使用の際
には、診断用プライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩
基配列中の対応するヌクレオチドと相補的である場合に
は診断用プライマーの伸長産物が合成され、診断用プラ
イマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応す
るヌクレオチドに相補的でない場合には伸長産物が合成
されないようなもの： ２）４種の異なるヌクレオシド３リン酸：および、３）
２）のヌクレオシド３リン酸の重合反応のための試薬。 １５、一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の遺伝的異
常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相補的で、
もう一つの配列の末端ヌクレオチドが対応する正常ヌク
レオチドに相補的である、標的塩基配列の各診断領域の
ための二つの診断用プライマーの祖を含む、特許請求の
範囲第１４項記載のキット。」 手続補Ｉｆ書（−７歳） 東成１年特ン１願第５９４９２号 ２、発明の名称 ヌクレオチド配列を検出する方法 ３、捕Ｗをする名 ・１７件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　インペリアル・ケミカル醗インダストリーズ
・ピーエルシー ４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新人手
町ビル　２０６区

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中に含まれる一種以上の核酸内の少なくとも一
   つの変異ヌクレオチドの有無を検出する方法であって、
   以下の方法からなるもの： 適当なヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸の
   重合のための試薬、および標的塩基配列の診断領域のた
   めの診断用プライマーによって、同時あるいは順に、ハ
   イブリダイズ条件下で試料を処理すること、ここにおい
   て該診断用プライマーのヌクレオチド配列は該診断領域
   に実質的に相補的であり、診断用プライマーの末端のヌ
   クレオチドは予想される変異ヌクレオチドあるいはそれ
   に対応する正常なヌクレオチドに相補的であり、それに
   よって診断用プライマーの該末端のヌクレオチドが標的
   塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的である場合
   には診断用プライマーの伸長産物が合成され、診断用プ
   ライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応
   するヌクレオチドと相補的でない場合には伸長産物が合
   成されない：および、伸長産物の有無から推測される変
   異ヌクレオチドの有無を検出すること。 ２、以下に述べることを含む特許請求の範囲第１項記載
   の方法： １）適当なヌクレオシド３リン酸、ヌクレオシド３リン
   酸の重合のための試薬、標的塩基配列の診断領域のため
   の診断用プライマー、および対応する増幅用プライマー
   によって、同時あるいは順に、ハイブリダイズ条件下で
   試料を処理することであって、該診断用プライマーのヌ
   クレオチド配列は該診断領域に実質的に相補的であり、
   診断用プライマーの末端のヌクレオチドは予想される変
   異ヌクレオチドあるいはそれに対応する正常なヌクレオ
   チドに相補的であり、それによって診断用プライマーの
   該末端のヌクレオチドが標的塩基配列中の対応するヌク
   レオチドと相補的である場合には診断用プライマーの伸
   長産物が合成され、診断用プライマーの該末端ヌクレオ
   チドが標的塩基配列中の対応するヌクレオチドと相補的
   でない場合には伸長産物が合成されず：合成された診断
   用プライマーの伸長産物は全て、その相補鎖から分離し
   た後に該増幅用プライマーの伸長産物合成のための鋳型
   として使用することができる： ２）変性条件下で試料を処理し、上記伸長産物が形成さ
   れた鋳型からプライマー伸長産物を分離すること： ３）過程２）で産生された１本鎖を、適当なヌクレオシ
   ド３リン酸、ヌクレオシド３リン酸の重合反応のための
   試薬、診断用プライマー、およびここで定義した増幅用
   プライマーと、同時あるいは順に接触させ、それによっ
   て、可能な場合には過程２）で産生された１本鎖を鋳型
   として用いてさらに伸長産物を合成させること： ４）過程２）および３）を十分な回数繰り返し、適当な
   ヌクレオチド配列の増幅産物が検出できるようにするこ
   と： ５）過程４）で得られた増幅産物の有無から、推測され
   る変異体ヌクレオチドの有無を検出すること。 ３、（ａ）第一の核酸配列の診断領域に実質的に相補的
   な塩基配列を有する第一の診断用プライマー、該推測さ
   れる変異ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有
   する第一の診断用プライマー、および、第二の核酸配列
   の診断領域に実質的に相補的な配列を有する第二の診断
   用プライマー、推測される変異ヌクレオチドに相補的な
   末端ヌクレオチドを有する第二の診断用プライマー：あ
   るいは、 （ｂ）第一の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配
   列を有する第一の診断用プライマー、該推測される変異
   ヌクレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相補的な末
   端ヌクレオチドを有する第一の診断用プライマー、およ
   び、第二の核酸配列の診断領域に実質的に相補的な配列
   を有する第二の診断用プライマー、該推測される変異ヌ
   クレオチドに対応する正常ヌクレオチドに相補的な末端
   ヌクレオチドを有する第二の診断用プライマー： の何れかで、同時あるいは順に試料を処理することを含
   み、第一の診断用プライマーの該末端ヌクレオチド及び
   第二の診断用プライマーの該末端ヌクレオチドが、それ
   ぞれのプライマーの双方の５側あるいは双方の３′側の
   何れかであり、第一の核酸配列が第二の核酸配列の裏向
   きである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、最初に、推測される変異ヌクレオチドを含む試料核
   酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得られた増
   幅産物を処理するための試料として用いることを含む、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、最初に、推測される変異ヌクレオチドを含む試料核
   酸の少なくとも一部を増幅し、それによって得られた増
   幅産物を処理するための試料として用いることを含む、
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、試料核酸処理を少なくとも一回繰り返し、それによ
   り同一の標的塩基配列を鋳型として用いて伸長産物の線
   型増幅を行うことをさらに含む、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ７、推測される変異ヌクレオチドあるいは対応する正常
   ヌクレオチドのいずれかと相補目的である診断用プライ
   マーの末端ヌクレオチドが、診断用プライマーの３′末
   端にある、特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
   れかに記載の方法。 ８、試料がヌクレオシド３リン酸１、２、あるいは３で
   処理され、それによって、生成される伸長産物がヌクレ
   オシド３リン酸１、２、あるいは３のみの存在で可能な
   部位までしか伸長されない、特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 ９、試料が３種のヌクレオシド３リン酸で処理される、
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、塩基配列の末端ヌクレオチドが、既知の遺伝的異
   常に関連した推測される変異ヌクレオチド、あるいはそ
   れに対応する正常ヌクレオチドの何れかと相補的であり
   、該配列の残りが推測される変異ヌクレオチドあるいは
   対応する正常ヌクレオチドに隣接した対応する標的塩基
   配列に実質的に相補的であり、該ヌクレオチド配列を本
   発明の方法中で診断用プライマーとして用いる際に、診
   断用プライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列の
   対応するヌクレオチドに相補的である場合には診断用プ
   ライマーの伸長産物が合成され、診断用プライマーの該
   末端ヌクレオチドが標的塩基配列の対応するヌクレオチ
   ドと相補的でない場合には伸長産物が合成されないよう
   な、本発明の方法で使用される約５から５０ｂｐのヌク
   レオチド配列。 １１、該末端ヌクレオチドがヌクレオチド配列の３′末
   端にある、特許請求の範囲第１０項記載のヌクレオチド
   配列。 １２、推測される変異ヌクレオチドが対応する正常配列
   の点変異の結果である、特許請求の範囲第１０項あるい
   は第１１項記載のヌクレオチド配列。 １３、一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の遺伝的異
   常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相補的であ
   り、もう一つの塩基配列が対応する正常ヌクレオチドに
   相補的である、特許請求の範囲第１０項から第１２項ま
   でのいずれかに記載の二つのヌクレオチド配列の組。 １４、試料中に含まれる一つ以上の核酸内の少なくとも
   一つの変異ヌクレオチドの有無を検出するキットで、以
   下のものを含むもの： １）標的塩基配列の各診断領域のための診断用プライマ
   ー、各診断用プライマーのヌクレオチド配列は、該診断
   領域に実質的に相補的であり、診断用プライマーの末端
   ヌクレオチドは推測される変異ヌクレオチドあるいはそ
   れに対応する正常ヌクレオチドに相補的で、使用の際に
   は、診断用プライマーの該末端ヌクレオチドが標的塩基
   配列中の対応するヌクレオチドと相補的である場合には
   診断用プライマーの伸長産物が合成され、診断用プライ
   マーの該末端ヌクレオチドが標的塩基配列中の対応する
   ヌクレオチドに相補的でない場合には伸長産物が合成さ
   れないようなもの： ２）４種の異なるヌクレオシド３リン酸：および、３）
   ２）のヌクレオシド３リン酸の重合反応のための試薬。 １５、一つの配列の末端ヌクレオチドが既知の遺伝的異
   常に関連した推測される変異ヌクレオチドに相補的で、
   もう一つの配列の末端ヌクレオチドが対応する正常ヌク
   レオチドに相補的である、標的塩基配列の各診断領域の
   ための二つの診断用プライマーの組を含む、特許請求の
   範囲第１４項記載のキット。