JPS6387976A - シユ−ドラビ−ズウイルス組換え体およびそれを使用するタンパク質の製法 - Google Patents
シユ−ドラビ−ズウイルス組換え体およびそれを使用するタンパク質の製法Info
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- JPS6387976A JPS6387976A JP62177368A JP17736887A JPS6387976A JP S6387976 A JPS6387976 A JP S6387976A JP 62177368 A JP62177368 A JP 62177368A JP 17736887 A JP17736887 A JP 17736887A JP S6387976 A JPS6387976 A JP S6387976A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規ジュードラビーズ（Ｐｓｅｕｄｏｒａ’ｂ
ｉａｓ偽狂犬病）ウィルス組換え体およびかかる組換え
体を使用する所望のタンパク質の製法に関する。
ｉａｓ偽狂犬病）ウィルス組換え体およびかかる組換え
体を使用する所望のタンパク質の製法に関する。
遺伝子工学における発展により、１つの有機体または微
生物のゲノムから特定の遺伝子またはその一部分を含有
するＤＮＡフラグメントを単離しそしてこれらフラグメ
ントをベクターと呼ばれるもう一つのＤＮＡ分子中に挿
入することが可能となった。かくして創り出された組換
え体構造物を次に細菌、酵母、昆虫または動物細胞のよ
うな宿主に導入し、そこで増殖させ、そして所望の場合
はフラグメント挿入物によりコードされるタンパク質を
産生させる。宿主中における組換え体構造物の増殖にと
って必要な遺伝情報は一般にベクター分子により提供さ
れる。
生物のゲノムから特定の遺伝子またはその一部分を含有
するＤＮＡフラグメントを単離しそしてこれらフラグメ
ントをベクターと呼ばれるもう一つのＤＮＡ分子中に挿
入することが可能となった。かくして創り出された組換
え体構造物を次に細菌、酵母、昆虫または動物細胞のよ
うな宿主に導入し、そこで増殖させ、そして所望の場合
はフラグメント挿入物によりコードされるタンパク質を
産生させる。宿主中における組換え体構造物の増殖にと
って必要な遺伝情報は一般にベクター分子により提供さ
れる。
動物および昆虫の大規模な細胞培養物を使用する場合に
は固有の問題が存在するゆえに、この分野における努力
のかなりの部分が細菌および酵母を宿主有機体として使
用することに向けられてきた。しかしながら細胞培養技
術における近年の進歩により大規模培養が商業的に重要
なタンパク質を製造するための実行可能な手段となった
。動物および昆虫の細胞は、細菌または酵母系において
はしばしば利用不可能な精巧なタンパク質プロセシング
能力、例えばグリコジル化、メチル化、ホスホリル化お
よび砧と脂質の会合を提供する。多（のタンパク質産物
は活性化するにはグリコジル化またはさもな（ばプロセ
シングされねばならないので、かかる宿主中において増
殖および発現が可能な組換え体は種々の酵素、ホルモン
、抗原、抗体、および医学上または農業上または工業上
有用である他のタンノ々り質の製造にとって巨大なる希
望を与えるものである。動物および昆虫の細胞ならびに
他の宿主中において感染、複製およびタンパク質を発現
する能力を有するウィルスはかかる目的に関与する組換
え体の創出にとっての出発点を提供するものである。抗
原をコードする外来遺伝子を含有するように操作された
ウィルスもまた生ワクチンとして使用されうる。
は固有の問題が存在するゆえに、この分野における努力
のかなりの部分が細菌および酵母を宿主有機体として使
用することに向けられてきた。しかしながら細胞培養技
術における近年の進歩により大規模培養が商業的に重要
なタンパク質を製造するための実行可能な手段となった
。動物および昆虫の細胞は、細菌または酵母系において
はしばしば利用不可能な精巧なタンパク質プロセシング
能力、例えばグリコジル化、メチル化、ホスホリル化お
よび砧と脂質の会合を提供する。多（のタンパク質産物
は活性化するにはグリコジル化またはさもな（ばプロセ
シングされねばならないので、かかる宿主中において増
殖および発現が可能な組換え体は種々の酵素、ホルモン
、抗原、抗体、および医学上または農業上または工業上
有用である他のタンノ々り質の製造にとって巨大なる希
望を与えるものである。動物および昆虫の細胞ならびに
他の宿主中において感染、複製およびタンパク質を発現
する能力を有するウィルスはかかる目的に関与する組換
え体の創出にとっての出発点を提供するものである。抗
原をコードする外来遺伝子を含有するように操作された
ウィルスもまた生ワクチンとして使用されうる。
特にヨーロッパ特許出願第０，０７ Ｓ、６５６号では
。
。
切出しｖｐ−１遺伝子を有する５１ｍ１ａｎウイルス４
０（ｓｖ４０）、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２％およ
びＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコード
する遺伝子を用いて構成された組換えＤＮＡで形質転換
されたを椎動物細胞培養物中における肝炎表面抗原の製
造について論議されている。ＳＶ４０はサルのいくつか
の系統に感染するＤＮＡの小さなウィルスである。この
ものがヒトに対して病原性を有するか否かは知られない
が、しかし動物に腫瘍を惹起することが判明している。
０（ｓｖ４０）、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２％およ
びＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコード
する遺伝子を用いて構成された組換えＤＮＡで形質転換
されたを椎動物細胞培養物中における肝炎表面抗原の製
造について論議されている。ＳＶ４０はサルのいくつか
の系統に感染するＤＮＡの小さなウィルスである。この
ものがヒトに対して病原性を有するか否かは知られない
が、しかし動物に腫瘍を惹起することが判明している。
遺伝子工学によりハイブリッドワクジュアウィルスを構
成させて生ワクチンを得ることはＳｍ１ｔｈ氏他のｒＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 Ｔ７Ｓ
Ａ Ｊ８０ニア１５５〜７１５９（１９８３）に記載さ
れている。この著者らは、大きなりＮＡゲノムを有する
ウィルスであるワクシニアウィルス中へのインフルエン
ザウィルス赤血球凝集素遺伝子の挿入および発現につい
て論識している。チミジンキナーゼ遺伝子はウィルスの
複製にとって必須でないので該遺伝子中に外来遺伝子が
挿入されかくして同時に組換えウィルスの選択的製法が
提供された。操作されたワクシニアウィルスに感染した
細胞はグリコジル化された赤血球凝集素を産生じそして
このウィルスによりノ１ムスターをインフルエンザフィ
ルスの感染から免疫することに成功した。このワクシニ
アウィルスは多数の動物および鳥類種の細胞中で生育し
うる。
成させて生ワクチンを得ることはＳｍ１ｔｈ氏他のｒＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、 Ｔ７Ｓ
Ａ Ｊ８０ニア１５５〜７１５９（１９８３）に記載さ
れている。この著者らは、大きなりＮＡゲノムを有する
ウィルスであるワクシニアウィルス中へのインフルエン
ザウィルス赤血球凝集素遺伝子の挿入および発現につい
て論識している。チミジンキナーゼ遺伝子はウィルスの
複製にとって必須でないので該遺伝子中に外来遺伝子が
挿入されかくして同時に組換えウィルスの選択的製法が
提供された。操作されたワクシニアウィルスに感染した
細胞はグリコジル化された赤血球凝集素を産生じそして
このウィルスによりノ１ムスターをインフルエンザフィ
ルスの感染から免疫することに成功した。このワクシニ
アウィルスは多数の動物および鳥類種の細胞中で生育し
うる。
しかしながら、ワクシニアウィルスに関する一般的懸念
はそれがヒトに感染すること、および疾病を惹起するこ
とが知られている点である。
はそれがヒトに感染すること、および疾病を惹起するこ
とが知られている点である。
ＲｏＬｚｍａｎ氏他ｒｓｃｉｅｎｃｅＪ ２２９ ：
１２０８〜１２１４（１９８５）参照）は、ヒトおよび
動物に感染するウィルスの分子生物学に関する研究の中
心的目的の一つは、ウィルスケ゛ツムを特異的に修飾し
てそれをワクチンとして使用することであるか、または
遺伝子のベクターとして使用して該遺伝子の産物が伝染
性疾患に対する保護を提供することであると指摘してい
る。彼らは他の大きなりＮＡを有するウィルスであり、
ヒトの病原体でアルヘルはスシンプレツクスウイルスｉ
ｆｉ（Ｈｉ９Ｖ−１）を操作する戦略について記載し
ており、そして大きなりＮＡを有するウィルスを外来Ｄ
ＮＡのベクターとして使用するに際しての固有の問題点
について注意している。５ｈｉｈ氏他（ｒ Ｐｒｏｃ。
１２０８〜１２１４（１９８５）参照）は、ヒトおよび
動物に感染するウィルスの分子生物学に関する研究の中
心的目的の一つは、ウィルスケ゛ツムを特異的に修飾し
てそれをワクチンとして使用することであるか、または
遺伝子のベクターとして使用して該遺伝子の産物が伝染
性疾患に対する保護を提供することであると指摘してい
る。彼らは他の大きなりＮＡを有するウィルスであり、
ヒトの病原体でアルヘルはスシンプレツクスウイルスｉ
ｆｉ（Ｈｉ９Ｖ−１）を操作する戦略について記載し
ており、そして大きなりＮＡを有するウィルスを外来Ｄ
ＮＡのベクターとして使用するに際しての固有の問題点
について注意している。５ｈｉｈ氏他（ｒ Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＢＡＪ ８１
： ５８６７〜５８７０ 。
： ５８６７〜５８７０ 。
（１９８４）参照）はＨｓｖ −１を操作して、それに
感染した細胞にＢ型肝炎ウィルス表面抗原を産生および
排出させることについて記載している。
感染した細胞にＢ型肝炎ウィルス表面抗原を産生および
排出させることについて記載している。
ＨＥＷ−ｊはありふれたヒトの病原体であって、このも
のは潜伏状態で定着していて、しばしば感染再発、すな
わち顔面ヘルペスを生じる。潜伏状態および感染再発は
感染した人物が生存する間中持続する。
のは潜伏状態で定着していて、しばしば感染再発、すな
わち顔面ヘルペスを生じる。潜伏状態および感染再発は
感染した人物が生存する間中持続する。
５Ｖ−４０、ＨＥＩＶ−１，ワクシニアおよび少数の他
のもののＤＮＡが外来遺伝子を細胞環境中に導入および
発現させるためのベクターとして使用されうろことは確
立されているが、同様の能力を有し、しかし現在使用さ
れている多くのものの有する不都合を有しない他のウィ
ルスベクターを開発することが医学上、農業上および工
業上の共同体社会にとって大へん］ｉ要であろうことは
問題ない。
のもののＤＮＡが外来遺伝子を細胞環境中に導入および
発現させるためのベクターとして使用されうろことは確
立されているが、同様の能力を有し、しかし現在使用さ
れている多くのものの有する不都合を有しない他のウィ
ルスベクターを開発することが医学上、農業上および工
業上の共同体社会にとって大へん］ｉ要であろうことは
問題ない。
米国特許４，５１４，４９７号には、豚のワクチンとし
てシュードラビーズウィルスを使用することが開示され
ている。ジュードラビーズは大きなりＮＡを有するウィ
ルスであり、そしてアクジススキー病として知られた症
候を惹起する原の知られた病原体である。ワクチンとし
て使用するには、ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を
摘出または変更することによりそのウィルスを弱毒化さ
せた。このウィルスには何ら付加的な遺伝子は添加され
ず、そしてジュードラビーズに対してのみ豚をワクチン
予防した。
てシュードラビーズウィルスを使用することが開示され
ている。ジュードラビーズは大きなりＮＡを有するウィ
ルスであり、そしてアクジススキー病として知られた症
候を惹起する原の知られた病原体である。ワクチンとし
て使用するには、ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を
摘出または変更することによりそのウィルスを弱毒化さ
せた。このウィルスには何ら付加的な遺伝子は添加され
ず、そしてジュードラビーズに対してのみ豚をワクチン
予防した。
本発明は、ヒトの病原体としての記録は何らないが広い
範囲の宿主を有する豚ヘルはスウイルスであるシュード
ラビーズウィルスが細胞中における外来遺伝子の導入お
よび発現のためのベクターとして使用されうろことを示
すものである。本発明はシュードラビーズウィルスゲノ
ムのすべての必須部分を包含しそして場合により外来遺
伝子挿入物および生成したＥｃｏＲＩ部位を包含するも
のである。シュードラビーズウィルスＤＮＡを操作して
組換えウィルスを生成させることを記載する。特別の焦
点は、ｚ■糖タンパク質遺伝子のすぐ上流にある第１の
Ｘｈｏ Ｉ制限酵素、切断部位で始まりそして該遺伝子
の最後の塩基対のあとに終奎つイルスダノムの非必須領
域（以下Ｘｈｏ Ｉ ／ ｇＩｆｆ領域と称す）であっ
て、これまでウィルス感染力および複製にとって非必須
であることが知られていなかった領域 “を操作する
ことにあてられる。この領域の部分は欠失されることが
でき、そして代りにまたは付加的に外来遺伝子が挿入お
よび発現されうる。
範囲の宿主を有する豚ヘルはスウイルスであるシュード
ラビーズウィルスが細胞中における外来遺伝子の導入お
よび発現のためのベクターとして使用されうろことを示
すものである。本発明はシュードラビーズウィルスゲノ
ムのすべての必須部分を包含しそして場合により外来遺
伝子挿入物および生成したＥｃｏＲＩ部位を包含するも
のである。シュードラビーズウィルスＤＮＡを操作して
組換えウィルスを生成させることを記載する。特別の焦
点は、ｚ■糖タンパク質遺伝子のすぐ上流にある第１の
Ｘｈｏ Ｉ制限酵素、切断部位で始まりそして該遺伝子
の最後の塩基対のあとに終奎つイルスダノムの非必須領
域（以下Ｘｈｏ Ｉ ／ ｇＩｆｆ領域と称す）であっ
て、これまでウィルス感染力および複製にとって非必須
であることが知られていなかった領域 “を操作する
ことにあてられる。この領域の部分は欠失されることが
でき、そして代りにまたは付加的に外来遺伝子が挿入お
よび発現されうる。
その上、この領域内に含有される６ｍ遺伝子は細胞中で
その後にグリコジル化されることになるタンパク質をコ
ードしているので、この領域、そして特にその中に位置
する６ｍ遺伝子は外来遺伝子の挿入、およびそれにより
生成されたタンパク質の細胞性プロセシング特にグリコ
ジル化される可能性を提供するものである。本発明の組
換え体を医学上、農業上および工業上有用な酵素、ホル
そン、抗原および抗体のような所望のタンパク質の生産
に使用することも詳細に記載されする。本方法により産
生される抗原性タンパク質は診断用キットにおいておよ
びワクチン剤として有用である筈である。加えて、適当
な抗原の遺伝子を含有するように操作されたシュードラ
ビーズウィルスを生ワクチンとしての有用性を有する筈
である。終りに、本発明のもう一つの観点にはシュード
ラビーズウィルスゲノム中に独特の！！：ｃｏＲ工制限
傳素切断部位を生成させて、容易に操作のできる犬ぎな
ウィルス性ＤＮＡを有するベクターを得ることも包含さ
れる。
その後にグリコジル化されることになるタンパク質をコ
ードしているので、この領域、そして特にその中に位置
する６ｍ遺伝子は外来遺伝子の挿入、およびそれにより
生成されたタンパク質の細胞性プロセシング特にグリコ
ジル化される可能性を提供するものである。本発明の組
換え体を医学上、農業上および工業上有用な酵素、ホル
そン、抗原および抗体のような所望のタンパク質の生産
に使用することも詳細に記載されする。本方法により産
生される抗原性タンパク質は診断用キットにおいておよ
びワクチン剤として有用である筈である。加えて、適当
な抗原の遺伝子を含有するように操作されたシュードラ
ビーズウィルスを生ワクチンとしての有用性を有する筈
である。終りに、本発明のもう一つの観点にはシュード
ラビーズウィルスゲノム中に独特の！！：ｃｏＲ工制限
傳素切断部位を生成させて、容易に操作のできる犬ぎな
ウィルス性ＤＮＡを有するベクターを得ることも包含さ
れる。
その特別の観点において、本発明には場合により少くと
も１つの非必須領域の少くとも一部分が欠失していて（
よいシュードラビーズウィルスゲノム、および 所望のタンパク質をコーディングしておりかつ発現され
５る外来ＤＮＡフラグメント、からなっており、該外来
ＤＮＡフラグメントがケ゛ツムの非必須Ｘｈｏ Ｉ ／
８ｍ領域内から選択される地点でシュードラビーズウ
ィルスゲノム中に挿入されていることからなる組換えシ
ュードラビーズウィルスが包含される。外来ＤＮＡフラ
グメントはＸｈＯＩ／ｇｌ［領域のｇＩＩＩ遺伝子セグ
メント中に挿入されるのが好ましい。最も好ましくは、
遺伝子中に存在する残留するＡＴＧコドンから下流にあ
るこのセグメント中に挿入される。
も１つの非必須領域の少くとも一部分が欠失していて（
よいシュードラビーズウィルスゲノム、および 所望のタンパク質をコーディングしておりかつ発現され
５る外来ＤＮＡフラグメント、からなっており、該外来
ＤＮＡフラグメントがケ゛ツムの非必須Ｘｈｏ Ｉ ／
８ｍ領域内から選択される地点でシュードラビーズウ
ィルスゲノム中に挿入されていることからなる組換えシ
ュードラビーズウィルスが包含される。外来ＤＮＡフラ
グメントはＸｈＯＩ／ｇｌ［領域のｇＩＩＩ遺伝子セグ
メント中に挿入されるのが好ましい。最も好ましくは、
遺伝子中に存在する残留するＡＴＧコドンから下流にあ
るこのセグメント中に挿入される。
欠失は任意の非必須領域中でなされうる。ＸｈＯｌ ／
ｇ ＩＩ領領域 ｔｋ遺伝子領域およびｇＩ遺伝子領
域中における欠失が好ましい。最も好ましくは、ｘｈｏ
ｌ／ｇｌ領域の欠失部分はその領域のｇｌセグメント内
から選択される。
ｇ ＩＩ領領域 ｔｋ遺伝子領域およびｇＩ遺伝子領
域中における欠失が好ましい。最も好ましくは、ｘｈｏ
ｌ／ｇｌ領域の欠失部分はその領域のｇｌセグメント内
から選択される。
本発明はまた、ゲノムの非必須ｘｈｏｌ／ｇｉｌ！領域
の少くとも一部分が欠失しておりそして場合により少く
とも１つの他の非必須領域の少くとも一部分が欠失して
いてもよいシュードラビーズウィルスゲノムからなる組
換えシュードラビーズウィルスにも関する。Ｘｈｏ Ｔ
／ ｇ ｍ領域の欠失部分がその領域のｇＩＩＩセグ
メント内から選択されるのが好ましい。欠失がなされう
る他の非必須領域は、好ましくはｔｋ遺伝子領域および
ｇ１遺伝子領域である。
の少くとも一部分が欠失しておりそして場合により少く
とも１つの他の非必須領域の少くとも一部分が欠失して
いてもよいシュードラビーズウィルスゲノムからなる組
換えシュードラビーズウィルスにも関する。Ｘｈｏ Ｔ
／ ｇ ｍ領域の欠失部分がその領域のｇＩＩＩセグ
メント内から選択されるのが好ましい。欠失がなされう
る他の非必須領域は、好ましくはｔｋ遺伝子領域および
ｇ１遺伝子領域である。
さらに、本発明は場合により少くとも１つの非必須領域
の少くとも一部分が欠失していてもよいシュードラビー
ズウィルスゲノム、およびシュードラビーズウィルスゲ
ノムの残留する非必須領域中に生成されたＸｃｏＲ工部
位、からなる組換えシュードラビーズウィルスをも包含
する。ＥｃｏＲＩ部位はＸｈｏＩ／ｇＩＩＩ領域内から
選択される箇所で生成されるのが好ましい。より好まし
くは、このものはＸｈｏ Ｉ ／ ８ｍ領域のｇ１遺伝
子セグメント内から選択される箇所で生成される。最も
好ましくは、このものは残留するＡＴＧコドン配列の下
流にあるｓｇＩＩＩ遺伝子セグメント内から選択される
箇所で生成される。欠失は非必須である任意の領域でな
されうる。ＸｈＯＩ ／ ｇ’ｌｌｌ領域、ｔｋ遺伝子
領域およびｇＩ領領域おける欠失が好ましい。最も好ま
しくはＸｈｏ Ｉ ／ ８ｍ領域の欠失部分はその領域
のｇｌｌ［遺伝子セグメント内から選択される。
の少くとも一部分が欠失していてもよいシュードラビー
ズウィルスゲノム、およびシュードラビーズウィルスゲ
ノムの残留する非必須領域中に生成されたＸｃｏＲ工部
位、からなる組換えシュードラビーズウィルスをも包含
する。ＥｃｏＲＩ部位はＸｈｏＩ／ｇＩＩＩ領域内から
選択される箇所で生成されるのが好ましい。より好まし
くは、このものはＸｈｏ Ｉ ／ ８ｍ領域のｇ１遺伝
子セグメント内から選択される箇所で生成される。最も
好ましくは、このものは残留するＡＴＧコドン配列の下
流にあるｓｇＩＩＩ遺伝子セグメント内から選択される
箇所で生成される。欠失は非必須である任意の領域でな
されうる。ＸｈＯＩ ／ ｇ’ｌｌｌ領域、ｔｋ遺伝子
領域およびｇＩ領領域おける欠失が好ましい。最も好ま
しくはＸｈｏ Ｉ ／ ８ｍ領域の欠失部分はその領域
のｇｌｌ［遺伝子セグメント内から選択される。
終りに、本発明は
（１）所望のタンパク質をコーディングしておりかつ発
現されうる外来ＤＮＡＮラフメントを含有する組換えシ
ュードラビーズウィルスに細胞を感染させ、 （２） 所望のタンパク質が産生されるまで前記感染
した細胞を培養し、そして Ｃ） タンパク質を回収する、 ことからなるタンパク質の製法をも意図するものである
。本発明はまたこの方法により製造されたタンパク質を
も包含するものである。
現されうる外来ＤＮＡＮラフメントを含有する組換えシ
ュードラビーズウィルスに細胞を感染させ、 （２） 所望のタンパク質が産生されるまで前記感染
した細胞を培養し、そして Ｃ） タンパク質を回収する、 ことからなるタンパク質の製法をも意図するものである
。本発明はまたこの方法により製造されたタンパク質を
も包含するものである。
別に断わりなければ、図面は一定の比例寸法で示されて
はいない。
はいない。
第１図はｇＩＩＩ糖タンパク質遺伝子の研究に使用され
るＤＮＡ制限断片を示すシュードラビーズウィルス（ｐ
Ｈｖ）ゲノムの地図を示す。（Ａ）は独特の長い（σＬ
）および独特の短い（σＢ）領域、およびＵ８をはさむ
逆方向末端反復塩基配列（それぞれ工Ｒθおよび’ｒＲ
ｇ ）を示す？ＲＶのゲノムである。
るＤＮＡ制限断片を示すシュードラビーズウィルス（ｐ
Ｈｖ）ゲノムの地図を示す。（Ａ）は独特の長い（σＬ
）および独特の短い（σＢ）領域、およびＵ８をはさむ
逆方向末端反復塩基配列（それぞれ工Ｒθおよび’ｒＲ
ｇ ）を示す？ＲＶのゲノムである。
このゲノムは示されるように参考のために交差単位に分
割されている。（Ｂ）はＰＲＶゲノムのＢｍｌ工制限酵
素切断部位を示す。ｇｌ遺伝子は２個の隣接するＢａｍ
Ｈ工７ラグメントであるＢａｍＨニー２およびＢａｍＨ
ニー９の間に位置する。ｇ、ｍ遺伝子を含有する４、
３ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメントをφ）で拡大し、そ
して（Ｃ）で多数の制限酵素切断部位を記入しである。
割されている。（Ｂ）はＰＲＶゲノムのＢｍｌ工制限酵
素切断部位を示す。ｇｌ遺伝子は２個の隣接するＢａｍ
Ｈ工７ラグメントであるＢａｍＨニー２およびＢａｍＨ
ニー９の間に位置する。ｇ、ｍ遺伝子を含有する４、
３ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメントをφ）で拡大し、そ
して（Ｃ）で多数の制限酵素切断部位を記入しである。
（Ｃ＞においては、斜線の箱形はｇＫ［糖タンパク質遺
伝子に相当し、このものの配列を第２図に示す。この遺
伝子のｔｏＲＮＡによる転写およびその方向を矢印で示
す。
伝子に相当し、このものの配列を第２図に示す。この遺
伝子のｔｏＲＮＡによる転写およびその方向を矢印で示
す。
第２図はｇＩＩＩ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を示
す（非コード鎖）。この遺伝子の１９６ｂｐ上流および
９０ ｂｐ下流のＤＮＡ配列も示しである。
す（非コード鎖）。この遺伝子の１９６ｂｐ上流および
９０ ｂｐ下流のＤＮＡ配列も示しである。
配列の右側の数はヌクレオチド数を示す。相当するアミ
ノ酸を慣用の三文字コードを用いる各コドンの下にそれ
ぞれ示し、そして左側に番号を記載しである。
ノ酸を慣用の三文字コードを用いる各コドンの下にそれ
ぞれ示し、そして左側に番号を記載しである。
第３図は若干数のプラスミドを表示しそして（Ａ） ｐ
ＡＬＭ ２、ＣＢ） ｐＡＬＭｌｏおよび（Ｃ”） ｐ
ＡＬＭ １５を構成する経路を示す。プラスミド分子は
関連する要素および部位を示す壌として描かれている。
ＡＬＭ ２、ＣＢ） ｐＡＬＭｌｏおよび（Ｃ”） ｐ
ＡＬＭ １５を構成する経路を示す。プラスミド分子は
関連する要素および部位を示す壌として描かれている。
すべてのプラスミドは大腸菌（Ｌ ｃｏｌｉ） ｐＢＲ
５２２誘導体である。各プラスミドはｐＢＲ５２２に由
来するβ−ラクタマーゼ遺伝子（白地箱形）内に位置す
る独特のＰｓｔ１部位を有する。黒い矢印はｔａｃプロ
モーター／オはレータ−領域を示し、これに続いてバク
テリオファージラムダＣｒｏ遺伝子（黒い箱形）のアミ
ノ末端２３アミノ酸をコードするＤＮＡがくる。斜線を
した箱形はＰＲＶｇＩＩＩ糖タンパク質遺伝子を表わし
、関連する制限酵素部位を示す。ＣｒＯおよびｇＩＩＩ
の接合部でのＮｃｏ１部位中におけるＡＴＧコドンがｇ
ｌ［ｌ遺伝子の第１のアミノ酸を規定する。ｇＩＩＩ遺
伝子に直ちに続くかおよび／またはそれに先行する二本
線はｇＩＩＩ遺伝子の下流または上流に続＜ ＰＲＶＤ
Ｎム配列を示す。プラスミド構成のために除去されるか
または連結されたＤＮＡ ７ラグメントはプラスミド地
図の上に横棒で示す。各プラスミドの詳細な構成法は本
明細書に記載される。
５２２誘導体である。各プラスミドはｐＢＲ５２２に由
来するβ−ラクタマーゼ遺伝子（白地箱形）内に位置す
る独特のＰｓｔ１部位を有する。黒い矢印はｔａｃプロ
モーター／オはレータ−領域を示し、これに続いてバク
テリオファージラムダＣｒｏ遺伝子（黒い箱形）のアミ
ノ末端２３アミノ酸をコードするＤＮＡがくる。斜線を
した箱形はＰＲＶｇＩＩＩ糖タンパク質遺伝子を表わし
、関連する制限酵素部位を示す。ＣｒＯおよびｇＩＩＩ
の接合部でのＮｃｏ１部位中におけるＡＴＧコドンがｇ
ｌ［ｌ遺伝子の第１のアミノ酸を規定する。ｇＩＩＩ遺
伝子に直ちに続くかおよび／またはそれに先行する二本
線はｇＩＩＩ遺伝子の下流または上流に続＜ ＰＲＶＤ
Ｎム配列を示す。プラスミド構成のために除去されるか
または連結されたＤＮＡ ７ラグメントはプラスミド地
図の上に横棒で示す。各プラスミドの詳細な構成法は本
明細書に記載される。
第４図はｓｐｓポリアクリルナミドゲル上におけるタン
パク質の電気泳動パターンを示す。レーン１はプラスミ
ドｐＡＬＭ Ｓを担持する細菌の非誘導培養物から得ら
れたタン・４り質を示す。２．３および４レーンはそれ
ぞれプラスミドｐＡＬＭ３、ｐＡＬＭ ２およびｐＡＬ
Ｍ １０を担持する細菌の誘導された培養物から得られ
たタンパク質を示す。
パク質の電気泳動パターンを示す。レーン１はプラスミ
ドｐＡＬＭ Ｓを担持する細菌の非誘導培養物から得ら
れたタン・４り質を示す。２．３および４レーンはそれ
ぞれプラスミドｐＡＬＭ３、ｐＡＬＭ ２およびｐＡＬ
Ｍ １０を担持する細菌の誘導された培養物から得られ
たタンパク質を示す。
第５図は親ＰＲＶ、 ＰＲＶ −２およびＰＲ’７−１
０から抽出されたピリオンＩ）Ｎムのサザン・プロット
分析を示す。１．２および３レーンがそれぞれ親ＰＲＶ
％ＰＲＶ −２およびＰＲＶ −１０からのＤＮＡを含
有する。この図面にはまた４、 ３ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ
ｐＲｖ ７ラグメントの制限地図も示される。ｇＩＩ
Ｉ遺伝子は斜線、長方形で示す。ｍＲＮＡおよび転写の
方向は線の下の矢印により示される。プローブとして用
いられる。 ｐＡＬＭｌ ５により担持される＆６ｋｂ
Ｓｐｈｌ−Ｎｅｏ Ｉ ＤＮＡ ７ラグメントが地図の
下に示される。
０から抽出されたピリオンＩ）Ｎムのサザン・プロット
分析を示す。１．２および３レーンがそれぞれ親ＰＲＶ
％ＰＲＶ −２およびＰＲＶ −１０からのＤＮＡを含
有する。この図面にはまた４、 ３ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ
ｐＲｖ ７ラグメントの制限地図も示される。ｇＩＩ
Ｉ遺伝子は斜線、長方形で示す。ｍＲＮＡおよび転写の
方向は線の下の矢印により示される。プローブとして用
いられる。 ｐＡＬＭｌ ５により担持される＆６ｋｂ
Ｓｐｈｌ−Ｎｅｏ Ｉ ＤＮＡ ７ラグメントが地図の
下に示される。
第６図は下記遺伝子地図を示す、すなわち、（Ａ） Ｈ
ＴＬＶ ｉｆ ＤＮＡのゲノム配置、（Ｅ） ｅｎｖ遺
伝子産物のプロセシング部位（黒色逆三角形）を示すＨ
ＴＬｖＩＩＩエンベロープポリタンパク質遺伝子（ｅｎ
ｖ遺伝子）領域、 （Ｃ） ｅｎｖ遺伝子コーディング
領域の制限地図、Ｏ））キナーゼ化されたＳａｃ Ｉ／
’！ｈｒ１ｍリンカ−を有する１ｇ１’ｌＬ １．４３
ｋｂＨＴＬＶ ＩＩＩ ＤＮＡ７ラグメント（ｅｎｖ
コーディング領域からの）、（６）ｐＡＬＭ ２４構成
において（ロ）部分のＨＴＩＪＶ ｍ−リンカ−ＤＮＡ
フラグメントの挿入地点を示すｐＡＬＭ ２発現ベクタ
ーのシュードラビーズウィルスＤＮＡ部分。
ＴＬＶ ｉｆ ＤＮＡのゲノム配置、（Ｅ） ｅｎｖ遺
伝子産物のプロセシング部位（黒色逆三角形）を示すＨ
ＴＬｖＩＩＩエンベロープポリタンパク質遺伝子（ｅｎ
ｖ遺伝子）領域、 （Ｃ） ｅｎｖ遺伝子コーディング
領域の制限地図、Ｏ））キナーゼ化されたＳａｃ Ｉ／
’！ｈｒ１ｍリンカ−を有する１ｇ１’ｌＬ １．４３
ｋｂＨＴＬＶ ＩＩＩ ＤＮＡ７ラグメント（ｅｎｖ
コーディング領域からの）、（６）ｐＡＬＭ ２４構成
において（ロ）部分のＨＴＩＪＶ ｍ−リンカ−ＤＮＡ
フラグメントの挿入地点を示すｐＡＬＭ ２発現ベクタ
ーのシュードラビーズウィルスＤＮＡ部分。
第７図は下記のものを感染させた細胞の免疫沈殿抽出物
の電気泳動から得られる８Ｄ８ポリアクリルアミドゲル
上のタンパク質のパターンを示す。感染物は、レーン７
．８および９が親ＰＲＶ 、レーン１．２および３がＰ
ＲＶ −２、そしてレーン４．５および６がＰＲＶ −
２４である。レーン１．４および７はＲａｔｎｅｒ氏他
のｒＮａｔｕｒｅ Ｊ３１３：２７７〜２８４（１９８
５）に記載されるようＫ ＨＴＬｖ■遺伝子のｂｐ７１
９８〜８０５２を有するＢｇＩＩＩ〜ＢａｍＨエフラグ
メントにより生産されるタンパク質に対する抗血清と反
応させた。２．５および８レーンは血清４９０と反応さ
せた。３．６および９レーンはＭ２モノクローナル抗体
と反応させた。Ｍレーンは分子量標準物を示す。
の電気泳動から得られる８Ｄ８ポリアクリルアミドゲル
上のタンパク質のパターンを示す。感染物は、レーン７
．８および９が親ＰＲＶ 、レーン１．２および３がＰ
ＲＶ −２、そしてレーン４．５および６がＰＲＶ −
２４である。レーン１．４および７はＲａｔｎｅｒ氏他
のｒＮａｔｕｒｅ Ｊ３１３：２７７〜２８４（１９８
５）に記載されるようＫ ＨＴＬｖ■遺伝子のｂｐ７１
９８〜８０５２を有するＢｇＩＩＩ〜ＢａｍＨエフラグ
メントにより生産されるタンパク質に対する抗血清と反
応させた。２．５および８レーンは血清４９０と反応さ
せた。３．６および９レーンはＭ２モノクローナル抗体
と反応させた。Ｍレーンは分子量標準物を示す。
第８図は１％アガロース／ ＴＫＡゲル上のＤＮＡのＰ
日ｔｆ７ラグメントの電気泳動に続いてｐＡＬＭ１５か
ら得られるｇＩＩＩ特異的プローブとのハイブリット形
成（１，２および３レーン）により得られるパターン、
またはｂｐ５９２８〜８５９６を有するＨＴＬＶ ＩＩ
遺伝子のＫｐｎｒ７ラグメントであるＨＴＬ’Ｖ ＩＩ
エンベロープ特異的プローブとハイブリッド形成（４，
５および６レーン）することにより得られるパターンを
示す。Ｍレーンは分子量標準物を示す。ル−ンおよび４
レーンは親ＰＲＶからのＤＮＡを含有する。２および５
レーンはＰＲＶ −２からのＤＮＡを含有する。３およ
び６レーンはＰＲＶ −２４からのＤＮＡを含有する。
日ｔｆ７ラグメントの電気泳動に続いてｐＡＬＭ１５か
ら得られるｇＩＩＩ特異的プローブとのハイブリット形
成（１，２および３レーン）により得られるパターン、
またはｂｐ５９２８〜８５９６を有するＨＴＬＶ ＩＩ
遺伝子のＫｐｎｒ７ラグメントであるＨＴＬ’Ｖ ＩＩ
エンベロープ特異的プローブとハイブリッド形成（４，
５および６レーン）することにより得られるパターンを
示す。Ｍレーンは分子量標準物を示す。ル−ンおよび４
レーンは親ＰＲＶからのＤＮＡを含有する。２および５
レーンはＰＲＶ −２からのＤＮＡを含有する。３およ
び６レーンはＰＲＶ −２４からのＤＮＡを含有する。
第９図はｐＡＬＭ ２からのプラスミドｐＡＬＭ ７の
構成を示す。
構成を示す。
第１０図はプラスミドｐＡＬＭ １、ｐＭＬＥ １０３
４、ｐＣＴＪｌ ４０３およびｐＣＬｌ ４０４を示す
。この図はｐＣＬ １４０４の構成ルートを示す。
４、ｐＣＴＪｌ ４０３およびｐＣＬｌ ４０４を示す
。この図はｐＣＬ １４０４の構成ルートを示す。
第１１図はプラスミドｐＣＬ １４０４、ｐＺ １８６
およびｐＣＬ １４０５を示す。この図はｐＣＬ １４
０５の構成ルートを示す。
およびｐＣＬ １４０５を示す。この図はｐＣＬ １４
０５の構成ルートを示す。
第１２図はプラスミドｐＣＬ １４０５、ｐＡＬＭ １
およびｐＣＣ乙種４０７示す。この図面はｐＣＬ １４
０７の構成ルートを示す。
およびｐＣＣ乙種４０７示す。この図面はｐＣＬ １４
０７の構成ルートを示す。
＠１３図はＰＲ’７− Ｚ １中に存在するｇ ＩＩＩ
−１ａｃＺ融合物を直線状に表示したものである。中
央の図面は１１Ｇアガロース／ＴＥＡゲル上のＤＮＡの
Ｐｏｔ Ｉフラグメントを電気泳動し続いてｐＡＬＭ
１５から得られたＲ ＤＮＡ特異特異的−ジープまたは
ｐＭＬＢ １０３４から得られる１−ａｃ Ｚプローブ
とハイ “ブリッド形成させることにより得られるＤＮ
Ａのパターンを示す。ムおよびＣレーンのＤＮＡは親（
未変化）ウィルスから来ており、一方ＢおよびＤレーン
のＤＮＡはＰＲ’／ −２１から来ている。゛レーンム
およびＢはｐＡＬＭ１５からのｇ ＩＩＩ ＤＮＡとハ
イブリッド形成され、一方レーンＣおよびＤはｉｃＺプ
ローブとハイブリッド形成された。最下部にある図はそ
れぞれ下記のものを感染させた細胞の免疫沈殿抽出物の
電気泳動から得られる、ポリアクリルアミド８Ｄ８ゲル
上におけるタンパク質のパターンを示す。感染物は、レ
ーン１．２および３は親ＰＲ’７ 、そしてレーン４．
５および６はｐＨｖ −１である。レーン１および４は
抗血清４９０で沈殿させた。レーン２および５はＭ２モ
ノクローナル抗体を用いて沈殿させた。
−１ａｃＺ融合物を直線状に表示したものである。中
央の図面は１１Ｇアガロース／ＴＥＡゲル上のＤＮＡの
Ｐｏｔ Ｉフラグメントを電気泳動し続いてｐＡＬＭ
１５から得られたＲ ＤＮＡ特異特異的−ジープまたは
ｐＭＬＢ １０３４から得られる１−ａｃ Ｚプローブ
とハイ “ブリッド形成させることにより得られるＤＮ
Ａのパターンを示す。ムおよびＣレーンのＤＮＡは親（
未変化）ウィルスから来ており、一方ＢおよびＤレーン
のＤＮＡはＰＲ’／ −２１から来ている。゛レーンム
およびＢはｐＡＬＭ１５からのｇ ＩＩＩ ＤＮＡとハ
イブリッド形成され、一方レーンＣおよびＤはｉｃＺプ
ローブとハイブリッド形成された。最下部にある図はそ
れぞれ下記のものを感染させた細胞の免疫沈殿抽出物の
電気泳動から得られる、ポリアクリルアミド８Ｄ８ゲル
上におけるタンパク質のパターンを示す。感染物は、レ
ーン１．２および３は親ＰＲ’７ 、そしてレーン４．
５および６はｐＨｖ −１である。レーン１および４は
抗血清４９０で沈殿させた。レーン２および５はＭ２モ
ノクローナル抗体を用いて沈殿させた。
レーン３および６は大腸菌のβ−ガラクトシダーゼに対
する抗体を用いて沈殿させた。
する抗体を用いて沈殿させた。
第１４図はｐＡＬＭ３からのプラスミド１）ＡＬＭ ２
８の構成を示す。
８の構成を示す。
本発明の種々の観点にはウィルスゲ゛ツムの非必須領域
が欠失されるかおよび／またはそこに挿入物を有するシ
ェードラビーズウイルス（ＰＲＶ）が包含される。ゲノ
ムに変更がないＰＲＶはここでは親ＰＲＶまたは未変化
ＰＲＶと呼ばれる。ゲノムに変化のあるＰＲＶは組換え
ＰＩｆｆと呼ばれる。
が欠失されるかおよび／またはそこに挿入物を有するシ
ェードラビーズウイルス（ＰＲＶ）が包含される。ゲノ
ムに変更がないＰＲＶはここでは親ＰＲＶまたは未変化
ＰＲＶと呼ばれる。ゲノムに変化のあるＰＲＶは組換え
ＰＩｆｆと呼ばれる。
シェードラビーズｇＩＩＩ糖タンパク質遺伝子のすぐ上
流にある第１０Ｘｈｏ Ｉ制限酵素切断部位（以下「第
１のＸｈｏ Ｉ制限酵素切断部位」と称する）で始まり
そして該遺伝子の最後の塩基対のあとで終了ケ゛ツムの
非必須領域（以下ｘｈｏ １／ ｇ ＩＩＩ領域と称す
）に欠失および／または挿入があるＰＲＶが特に重要で
ある。ここで使用される「上流」なる用語は任意の所定
の遺伝子のｍＲＮＡの５′側にあると定義される。「下
流」とは任意の所定の遺伝子のｍＲＮＡの５′側にある
。
流にある第１０Ｘｈｏ Ｉ制限酵素切断部位（以下「第
１のＸｈｏ Ｉ制限酵素切断部位」と称する）で始まり
そして該遺伝子の最後の塩基対のあとで終了ケ゛ツムの
非必須領域（以下ｘｈｏ １／ ｇ ＩＩＩ領域と称す
）に欠失および／または挿入があるＰＲＶが特に重要で
ある。ここで使用される「上流」なる用語は任意の所定
の遺伝子のｍＲＮＡの５′側にあると定義される。「下
流」とは任意の所定の遺伝子のｍＲＮＡの５′側にある
。
本発明の出発物質として使用される特定のＰＲＶ菌株は
、それがｇＩ遺伝子領域を含有している限り、限定的で
ない。適当な菌株例には、Ｒｏｂｂｉｎｓ氏他のｒ、ｙ
、 Ｖｉｒｏｌ、Ｊ５８：３３９〜５４７（１９８６）
（Ｂｅｃｋｅｒ）； Ｂｅｎ Ｐｏｒａｔ氏他、「Ｊ
、 ＶｉｒｏＬＪ５７：１９１〜１９６（１９８６）（
ＫａおよびＢａｒｔｈａ） ；およびＬｏｍｎｉｃｚｉ
氏他、ｒＪ、 ＶｉｒＯｌ、 Ｊ ５２ ： １９８〜
２０５（１９８４）（ＫａおよびＢａｒｔｈａ ）に記
載されるＢｅａｋｅｒ菌株、Ｋａ菌株およびＢａｒｔｈ
ａ菌株が包含される。Ｂｅａｋｅｒ菌株が本発明で用い
られる好ましい菌株である。
、それがｇＩ遺伝子領域を含有している限り、限定的で
ない。適当な菌株例には、Ｒｏｂｂｉｎｓ氏他のｒ、ｙ
、 Ｖｉｒｏｌ、Ｊ５８：３３９〜５４７（１９８６）
（Ｂｅｃｋｅｒ）； Ｂｅｎ Ｐｏｒａｔ氏他、「Ｊ
、 ＶｉｒｏＬＪ５７：１９１〜１９６（１９８６）（
ＫａおよびＢａｒｔｈａ） ；およびＬｏｍｎｉｃｚｉ
氏他、ｒＪ、 ＶｉｒＯｌ、 Ｊ ５２ ： １９８〜
２０５（１９８４）（ＫａおよびＢａｒｔｈａ ）に記
載されるＢｅａｋｅｒ菌株、Ｋａ菌株およびＢａｒｔｈ
ａ菌株が包含される。Ｂｅａｋｅｒ菌株が本発明で用い
られる好ましい菌株である。
ｚｈｏｌ／ｇｌ領域はｐＲｖゲノム上およそα４のとこ
ろの４３ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメント内に位置する
（第１図参照）。この領域内に含有される８ｍ遺伝子は
ＰＲＶエンベロープ糖タンパク質をコードする構造遺伝
子である。ｇｌ遺伝子の完全な塩基対配列（非コード鎖
）を第２図に示す。
ろの４３ ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメント内に位置する
（第１図参照）。この領域内に含有される８ｍ遺伝子は
ＰＲＶエンベロープ糖タンパク質をコードする構造遺伝
子である。ｇｌ遺伝子の完全な塩基対配列（非コード鎖
）を第２図に示す。
この遺伝子の上流１９６ｂｐおよび下流９０ｂｐも第２
図に示されている。
図に示されている。
ｐｎｖ ＹツムのＸｈＯＩ／ｇＩＩ領域、および任意の
他の非必須領域が当業上知られた標準的ＤＮＡ組換え技
術、例えばＭａｎｉａｔｉｓ氏他のｒＭｏｌｅｃｕ’ｌ
ａｒＣ１ｏｎｉｎｇ 、ムＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌＪ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ。
他の非必須領域が当業上知られた標準的ＤＮＡ組換え技
術、例えばＭａｎｉａｔｉｓ氏他のｒＭｏｌｅｃｕ’ｌ
ａｒＣ１ｏｎｉｎｇ 、ムＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌＪ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ。
（１９８２）；Ｍｙｅｒｅ氏他、ｒｌｌ？ｃｉｓｎｃｅ
Ｊ ２２９ ： ２４２〜２４７（１９８５）；Ｅｏｔ
ｓｔｅｉｎ氏他、ｒ８ｃｉｅｎｃｅＪ２２９：１１９３
〜１２０１（１９８５）；Ｒｏｉｚｍａｎ氏他、ｒ８ｃ
ｉｅｎｃｓＪ２２９：１２０８〜１２１４（１９８５）
；およびＧｒａｈａｍ氏他、ｌＶｉｒｏ１ｏｇ７Ｊ ５
２ ： ４５６〜４６７（１９７３）記載の方法を用い
ることにより操作して本発明に必要とされる欠失および
挿入をなすことができる。一般的に表現すればこの操作
には、１つまたはそれ以上の制限酵素を用いてＰＲＶ
’ｙ’ツムを切断してゲ゛ツムフラグメントを生成させ
、続いて操作の目的であるべき領域を含有するフラグメ
ントを単離することが包含されよう。次にこのフラグメ
ントがベクター中にクローンされうる。任意の細菌性プ
ラスミドまたはバクテリオファージベクターは、もしそ
れが選択可能なマーカーを含有する限り利用されうる。
Ｊ ２２９ ： ２４２〜２４７（１９８５）；Ｅｏｔ
ｓｔｅｉｎ氏他、ｒ８ｃｉｅｎｃｅＪ２２９：１１９３
〜１２０１（１９８５）；Ｒｏｉｚｍａｎ氏他、ｒ８ｃ
ｉｅｎｃｓＪ２２９：１２０８〜１２１４（１９８５）
；およびＧｒａｈａｍ氏他、ｌＶｉｒｏ１ｏｇ７Ｊ ５
２ ： ４５６〜４６７（１９７３）記載の方法を用い
ることにより操作して本発明に必要とされる欠失および
挿入をなすことができる。一般的に表現すればこの操作
には、１つまたはそれ以上の制限酵素を用いてＰＲＶ
’ｙ’ツムを切断してゲ゛ツムフラグメントを生成させ
、続いて操作の目的であるべき領域を含有するフラグメ
ントを単離することが包含されよう。次にこのフラグメ
ントがベクター中にクローンされうる。任意の細菌性プ
ラスミドまたはバクテリオファージベクターは、もしそ
れが選択可能なマーカーを含有する限り利用されうる。
適当なプラスミドおよびバクテリオファージベクターに
は、それらに限定されるわけではないが、大腸菌プラス
ミドＴ）ＢＲ３２２，大腸菌ｐｓＣ１０１，バクテリオ
ファージλ、およびバクテリオファー：）Ｍ１３があげ
られる。酵母を含む他のベクター系も使用されうる。操
作の容易さから大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２が好まし
い。
は、それらに限定されるわけではないが、大腸菌プラス
ミドＴ）ＢＲ３２２，大腸菌ｐｓＣ１０１，バクテリオ
ファージλ、およびバクテリオファー：）Ｍ１３があげ
られる。酵母を含む他のベクター系も使用されうる。操
作の容易さから大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２が好まし
い。
ＰＲＶ ＤＮＡフラグメントをクローンされたプラスミ
ドまたはバクテリオファージベクターを用いる場合、Ｐ
ＲＶフラグメント内における欠失はエンドヌクレアーゼ
、エキソヌクレアーゼ等を用いる慣用の方法により遂行
されうる。挿入は所望の場合は、当業者に知られた方法
を用いてなすこともできる。かかる用途に利用されうる
プラスミドは、 ＡＴＣＣ寄託番号Ｎ［Ｌ６７１５１を
有する、大腸菌株ＮＦ １８２９により担持されるプラ
スミドｐＡＬＭ ２０である。このプラスミｒはＰＲＶ
のＢｅａｋｅｒ菌株から採取された８ｍ遺伝子（第１図
参照）を含有する４、３ｋｂＰｅｔ ｌ ＰＲＶフラグ
メントをＰｓｔ １部位でクローンされたＡｍｐＢ１Ｔ
ｅｔＲ％ｐＢＲ６２２プラスミドである。
ドまたはバクテリオファージベクターを用いる場合、Ｐ
ＲＶフラグメント内における欠失はエンドヌクレアーゼ
、エキソヌクレアーゼ等を用いる慣用の方法により遂行
されうる。挿入は所望の場合は、当業者に知られた方法
を用いてなすこともできる。かかる用途に利用されうる
プラスミドは、 ＡＴＣＣ寄託番号Ｎ［Ｌ６７１５１を
有する、大腸菌株ＮＦ １８２９により担持されるプラ
スミドｐＡＬＭ ２０である。このプラスミｒはＰＲＶ
のＢｅａｋｅｒ菌株から採取された８ｍ遺伝子（第１図
参照）を含有する４、３ｋｂＰｅｔ ｌ ＰＲＶフラグ
メントをＰｓｔ １部位でクローンされたＡｍｐＢ１Ｔ
ｅｔＲ％ｐＢＲ６２２プラスミドである。
所望の操作を外されたプラスミドまたはバクテリオファ
ージＤＮＡは次に慣用の方法を用いて選択され、そして
増殖目的のために標準的々形質転換法を用いて宿主細胞
または細菌中に導入されうる。プラスミドまたはバクテ
リオファージが増殖されうるいずれの宿主細胞または細
菌も使用されうる。例えば、操作されたｐＡＬＭ ２０
の場合、宿主細菌は大腸菌であろう。
ージＤＮＡは次に慣用の方法を用いて選択され、そして
増殖目的のために標準的々形質転換法を用いて宿主細胞
または細菌中に導入されうる。プラスミドまたはバクテ
リオファージが増殖されうるいずれの宿主細胞または細
菌も使用されうる。例えば、操作されたｐＡＬＭ ２０
の場合、宿主細菌は大腸菌であろう。
プラスミド中のＰＲＶフラグメントにおける欠失および
挿入がある組換えＰＲＶを生成させるには、標準的々同
時トランスフェクション操作が用いられうる。詳細には
、プラスミドまたはバクテリオファージを宿主細菌から
単離し、未変化ＰＲＶ ＤＮＡと混合しそして宿主細胞
中に同時トランスフェクションさせる。プラスミドまた
はバクテリオファージおよびＰＲＶ ＤＮＡが細胞中に
入り、そこで相同性組換えが起シ、ウィルスＤＮＡ中の
未変化領域と、プラスミドまたはバクテリオファージＤ
ＮＡからの相当する変化された領域との置換が生ずる。
挿入がある組換えＰＲＶを生成させるには、標準的々同
時トランスフェクション操作が用いられうる。詳細には
、プラスミドまたはバクテリオファージを宿主細菌から
単離し、未変化ＰＲＶ ＤＮＡと混合しそして宿主細胞
中に同時トランスフェクションさせる。プラスミドまた
はバクテリオファージおよびＰＲＶ ＤＮＡが細胞中に
入り、そこで相同性組換えが起シ、ウィルスＤＮＡ中の
未変化領域と、プラスミドまたはバクテリオファージＤ
ＮＡからの相当する変化された領域との置換が生ずる。
同時トランスフェクションおよび相同性組換えの効率を
高めるためには、プラスミドまたはバクテリオファー：
）ＤＮＡは未変化ＰＲＶ ＤＮＡとの混合に先立ち直線
状となされうる。プラスミドまたはバクテリオファージ
およびＰＲＶ ＤＮＡのトランスフェクションおよび続
く組換えウィルスの増殖に適する任意の宿主細胞が本発
明操作に利用されうる。次に組換えＰＲＶ ＤＮＡを細
胞中で複製させそして所望の組換えを受けたウィルスが
標準的方法を用いて選択されうる。
高めるためには、プラスミドまたはバクテリオファー：
）ＤＮＡは未変化ＰＲＶ ＤＮＡとの混合に先立ち直線
状となされうる。プラスミドまたはバクテリオファージ
およびＰＲＶ ＤＮＡのトランスフェクションおよび続
く組換えウィルスの増殖に適する任意の宿主細胞が本発
明操作に利用されうる。次に組換えＰＲＶ ＤＮＡを細
胞中で複製させそして所望の組換えを受けたウィルスが
標準的方法を用いて選択されうる。
一つの観点において、本発明には所望のタンパク質をコ
ーディングしておりかつ発現されつる外来ＤＮＡフラグ
メントを担持するように操作されたＰＲＶが包含される
。外来フラグメントは 。
ーディングしておりかつ発現されつる外来ＤＮＡフラグ
メントを担持するように操作されたＰＲＶが包含される
。外来フラグメントは 。
ゲノムの非必須ｘｈｏｌ／ｇＩＩＩ領域内から選択され
た地点でｐＲｖゲノム中に挿入される。との挿入はｘｈ
ｏ ｌ ／ ｇ Ｉ［Ｉ領域のｇＩＩＩ遺伝遺伝子セグ
メント表されるのが好ましい。より好ましくは、挿入は
残留するＡＴＧコドン配列から下流のこのセグメント中
になされる。ｇＩＩＩ遺伝子中のＡＴＧコドンの位置は
第２図に示される。ｇＩＩＩ遺伝子セグメントとはｓｇ
Ｉ［Ｉ糖タン・ξり質コーディング配列を意味する。
た地点でｐＲｖゲノム中に挿入される。との挿入はｘｈ
ｏ ｌ ／ ｇ Ｉ［Ｉ領域のｇＩＩＩ遺伝遺伝子セグ
メント表されるのが好ましい。より好ましくは、挿入は
残留するＡＴＧコドン配列から下流のこのセグメント中
になされる。ｇＩＩＩ遺伝子中のＡＴＧコドンの位置は
第２図に示される。ｇＩＩＩ遺伝子セグメントとはｓｇ
Ｉ［Ｉ糖タン・ξり質コーディング配列を意味する。
本発明はその態様のすべてにおいて、 ＰＲＶゲノムの
すべての必須領域が存在することを必要とする。しかし
ながら、そのゲノム内の非必須領域は、すべての態様に
おいて、全てまたは一部分が欠失されることができるが
、その必要があるわけではない。ここで使用される「必
須領域」とは、それの欠失がウィルス増殖の完全々中止
をもたらすことになるＰＲＶゲノムのすべての領域を指
す。ここで用いられる増殖にはウィルス感染力の複製お
よび放出が包含される。ウィルス増殖）停止は、そのウ
ィルスかへＡ／ ／ｅ ＋ウィルスまたは補足性細胞系
統を用いてさえも増殖でき彦い場合に起る。「ヘルパー
ウィルス」とは、定鶴によればそれ自身で増殖できない
同時感染性欠陥ウィルスの増殖に必要な遺伝子産物を提
供する。複製能のある感染性ウィルスである。かかるウ
ィルスはＴｏｐｌｅｙ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ’ ５Ｐｒｉ
ｎ（ｊｉｐｌｅ８０ｆ ＢａＣｔｅｒ１０’１０ｇ７″
「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎａ工ｍｍｕｎｉｔｙＪ ４．
（ｖｉｒｏｌｏｑｙ）、 Ｆ、 ＢｒｏｗｎおよびＧ、
Ｓ。
すべての必須領域が存在することを必要とする。しかし
ながら、そのゲノム内の非必須領域は、すべての態様に
おいて、全てまたは一部分が欠失されることができるが
、その必要があるわけではない。ここで使用される「必
須領域」とは、それの欠失がウィルス増殖の完全々中止
をもたらすことになるＰＲＶゲノムのすべての領域を指
す。ここで用いられる増殖にはウィルス感染力の複製お
よび放出が包含される。ウィルス増殖）停止は、そのウ
ィルスかへＡ／ ／ｅ ＋ウィルスまたは補足性細胞系
統を用いてさえも増殖でき彦い場合に起る。「ヘルパー
ウィルス」とは、定鶴によればそれ自身で増殖できない
同時感染性欠陥ウィルスの増殖に必要な遺伝子産物を提
供する。複製能のある感染性ウィルスである。かかるウ
ィルスはＴｏｐｌｅｙ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ’ ５Ｐｒｉ
ｎ（ｊｉｐｌｅ８０ｆ ＢａＣｔｅｒ１０’１０ｇ７″
「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎａ工ｍｍｕｎｉｔｙＪ ４．
（ｖｉｒｏｌｏｑｙ）、 Ｆ、 ＢｒｏｗｎおよびＧ、
Ｓ。
Ｗｉｌｓｏｎ、 ＠ 、 Ｇ、Ｓ、 Ｗｉｌｓｏｎ、
Ａ、Ａ、 ＭｉｌｅｓおよびＭ、Ｔ、 Ｐａｒｋｅｒ、
シリーズ （ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌ’ｋｉｎｓ
。
Ａ、Ａ、 ＭｉｌｅｓおよびＭ、Ｔ、 Ｐａｒｋｅｒ、
シリーズ （ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌ’ｋｉｎｓ
。
ＢａｌｔｉｍＯｒｅ 、米国メリーランド州 １９８４
）に記載されており、ウィルス学関係者にはよく知られ
ている。本発明に使用するのに適当人ヘルパーウィルス
の例には、未変化ＰＲＶのみならず欠失された領域中に
含有されその生竜物が組換えＰＲＶの増殖にとって必要
である遺伝子を発現する他のウィルスも包含される。「
補足細胞系統」とは、定義によればそれ自身で増殖でき
ない欠陥ウィルスの増殖に必要な遺伝子生産物を提供す
る細胞系統である。従ってここに定義される「非必須領
域」とは、それが欠失してもウィルス増殖が完全には停
止されない任意の領域のことである。ウィルス増殖の停
止はヘルｔＲ−ウィルスの助けを伴ってまたは伴うこと
なくそのウィルスが増殖できるところでは超もなかった
。ウィルスケ゛ツムの約４０％が非必須であると考えら
れている。
）に記載されており、ウィルス学関係者にはよく知られ
ている。本発明に使用するのに適当人ヘルパーウィルス
の例には、未変化ＰＲＶのみならず欠失された領域中に
含有されその生竜物が組換えＰＲＶの増殖にとって必要
である遺伝子を発現する他のウィルスも包含される。「
補足細胞系統」とは、定義によればそれ自身で増殖でき
ない欠陥ウィルスの増殖に必要な遺伝子生産物を提供す
る細胞系統である。従ってここに定義される「非必須領
域」とは、それが欠失してもウィルス増殖が完全には停
止されない任意の領域のことである。ウィルス増殖の停
止はヘルｔＲ−ウィルスの助けを伴ってまたは伴うこと
なくそのウィルスが増殖できるところでは超もなかった
。ウィルスケ゛ツムの約４０％が非必須であると考えら
れている。
好ましくは、欠失はＰＲＶケ゛ツムの非必須領域例エバ
Ｘｈｏ Ｉ ／ ｇＩＩＩ領域、米国特許第４，５１４
，４９７号に記載されるようなｔｋ遺伝子領域、および
Ｂｅｎ Ｐｃｒａｔ氏他、「Ｊ、 ｖｔ、ｒｏｌ、Ｊ
５７： １９１〜１９６（１９８６） ：およびＭｅｔ
ｔｅｎｌｅｉｔｅｒ氏他、「、ｒ、 ＶｉｒＯｌ、Ｊ５
３： ５２〜５７ （１９８５） 記載のｇｌ遺伝子
領域中でなされる。前記した領域中における欠失はその
ＰＲＶが感染および複製するためのヘル・ξ−ウィルス
または補足細胞系統の使用を必要とすることがないので
、かかる欠失が好ましい。ｘｈｏ １／ ｇＩＩＩ領域
の欠失部分はその領域のｇＴＩ！遺伝子セグメント内か
ら選択されるのが最も好ましい。
Ｘｈｏ Ｉ ／ ｇＩＩＩ領域、米国特許第４，５１４
，４９７号に記載されるようなｔｋ遺伝子領域、および
Ｂｅｎ Ｐｃｒａｔ氏他、「Ｊ、 ｖｔ、ｒｏｌ、Ｊ
５７： １９１〜１９６（１９８６） ：およびＭｅｔ
ｔｅｎｌｅｉｔｅｒ氏他、「、ｒ、 ＶｉｒＯｌ、Ｊ５
３： ５２〜５７ （１９８５） 記載のｇｌ遺伝子
領域中でなされる。前記した領域中における欠失はその
ＰＲＶが感染および複製するためのヘル・ξ−ウィルス
または補足細胞系統の使用を必要とすることがないので
、かかる欠失が好ましい。ｘｈｏ １／ ｇＩＩＩ領域
の欠失部分はその領域のｇＴＩ！遺伝子セグメント内か
ら選択されるのが最も好ましい。
挿入領域、すなわちｘｈｏｒ／ｇｌｌ！領斌の定義はこ
の領域が存在する未変化ケ゛ツムに基づくことは留意さ
れるべきである。非必須であるとして。
の領域が存在する未変化ケ゛ツムに基づくことは留意さ
れるべきである。非必須であるとして。
この領域は全体としてまたは一部分が欠失でき。
そして挿入はその領域の残留部分中に、または完全に欠
失された場合には、残留ケ゛ツム中の、ｘｈｏｌ／ｇＩ
ＩＩが存在する場合にそれが位置していた部分中に行わ
れうる。
失された場合には、残留ケ゛ツム中の、ｘｈｏｌ／ｇＩ
ＩＩが存在する場合にそれが位置していた部分中に行わ
れうる。
外来フラグメント挿入物は、所望のタンパク □質を
コードして訃りかつ発現されう石いずれの７ラグメント
でもよい。かかる挿入物の最大寸法は、少くとも６００
０、そして恐ら＜ １ｓｏｏ。
コードして訃りかつ発現されう石いずれの７ラグメント
でもよい。かかる挿入物の最大寸法は、少くとも６００
０、そして恐ら＜ １ｓｏｏ。
塩基対である未変化ＰＲＶのクローニング容量を任意の
ゲノム欠失において除去された塩基対の数に加算するこ
とにより判定される。［所望のタンパク質］は、それら
に限定されるわけではないが、酵素、ホルモン、抗原お
よび抗体でありうる。「発現されうる」なる語句は（１
）生成する組換えＰＲＶ ＤＮＡが転写制御領域および
翻訳開始コドン配列（ＡＴＧ ）を外来フラグメントの
コード領域の上流に含有すること、（２）外来フラグメ
ントのコーディング領域が翻訳開始コドン配列と共に読
み枠中にあること、そして（６）生産される所望のタン
パク質がＰＲＶ増殖と両立しうる（すなわち、その細胞
またはウィルスにとって致命的でない）こと、を必要と
する。上流の翻訳開始コドン配列は１組換えウィルスの
ＰＲＶケ゛ツム部分によるか、または所望に応じ、また
は欠失および／または挿入により必要とされる場合は翻
訳開始コドン配列挿入物のいずれかにより供給されうる
。第２図は未変化ＰＲＶ ｇＩｌｌ遺伝子内のＡＴＧコ
ドン配列の位置を示す。同様（で、上流の転写制御領域
は、残留ＰＲｖケ゛ツムによるか。
ゲノム欠失において除去された塩基対の数に加算するこ
とにより判定される。［所望のタンパク質］は、それら
に限定されるわけではないが、酵素、ホルモン、抗原お
よび抗体でありうる。「発現されうる」なる語句は（１
）生成する組換えＰＲＶ ＤＮＡが転写制御領域および
翻訳開始コドン配列（ＡＴＧ ）を外来フラグメントの
コード領域の上流に含有すること、（２）外来フラグメ
ントのコーディング領域が翻訳開始コドン配列と共に読
み枠中にあること、そして（６）生産される所望のタン
パク質がＰＲＶ増殖と両立しうる（すなわち、その細胞
またはウィルスにとって致命的でない）こと、を必要と
する。上流の翻訳開始コドン配列は１組換えウィルスの
ＰＲＶケ゛ツム部分によるか、または所望に応じ、また
は欠失および／または挿入により必要とされる場合は翻
訳開始コドン配列挿入物のいずれかにより供給されうる
。第２図は未変化ＰＲＶ ｇＩｌｌ遺伝子内のＡＴＧコ
ドン配列の位置を示す。同様（で、上流の転写制御領域
は、残留ＰＲｖケ゛ツムによるか。
またはここでもまた所望に応じて、または欠失および／
または挿入により必要とされる場合は、転写制御領域挿
入物のいずれかにより供給されうる。未変化ＰＲＶ Ｄ
ＮＡにおいては、転写制御領域はｇＩＩＩ糖タンパク質
遺伝子のすぐ上流にある第１のＸｈｏ ｌ制限酵素切断
部位で始まりそしてｇｌ［Ｉ遺伝子の第１の塩基対で終
るＰＲＶゲノムの領域内のｇＩＩＩ遺伝子の上流に位置
する。適桶な転写制御領域挿入物にはＲＮＡ ＩＩ！
瘍ウィルスの長い末端反復部分、および８Ｖ−４０ウイ
ルスの初期または後期プロモーターが包含される。かか
る制御領域はｌ’−Ｆｉ！ｐ８ｒｉｍ１３ｎｔａｌ Ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｏ’Ｇｅｎｅ Ｅｌｉｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎＪ Ｍ、 工ｎｏｕｙｅ χＭ
、 （ＡｃａｄｅｍｉｑＰｒｅｓ８１９８３）に記
載されている。
または挿入により必要とされる場合は、転写制御領域挿
入物のいずれかにより供給されうる。未変化ＰＲＶ Ｄ
ＮＡにおいては、転写制御領域はｇＩＩＩ糖タンパク質
遺伝子のすぐ上流にある第１のＸｈｏ ｌ制限酵素切断
部位で始まりそしてｇｌ［Ｉ遺伝子の第１の塩基対で終
るＰＲＶゲノムの領域内のｇＩＩＩ遺伝子の上流に位置
する。適桶な転写制御領域挿入物にはＲＮＡ ＩＩ！
瘍ウィルスの長い末端反復部分、および８Ｖ−４０ウイ
ルスの初期または後期プロモーターが包含される。かか
る制御領域はｌ’−Ｆｉ！ｐ８ｒｉｍ１３ｎｔａｌ Ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｏ’Ｇｅｎｅ Ｅｌｉｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎＪ Ｍ、 工ｎｏｕｙｅ χＭ
、 （ＡｃａｄｅｍｉｑＰｒｅｓ８１９８３）に記
載されている。
前記態様の組換え体の一例は以下に述べるＰＲＶ−２４
である。
である。
もう一つの観点においては、本発明にはＰＲＶを操作し
て非必須ＸｈＯＩ ／ ｇ Ｉ［Ｉ領域の全部または一
部を除去したものが包含される。この態様には、他の非
必須領域も全部または一部分欠失されることができるが
必ずしも必要ではない。
て非必須ＸｈＯＩ ／ ｇ Ｉ［Ｉ領域の全部または一
部を除去したものが包含される。この態様には、他の非
必須領域も全部または一部分欠失されることができるが
必ずしも必要ではない。
欠失部分に関する優先顆位は前記したとお如である。こ
の態様の例は以下に述べるＰＲＶ−２およびＰＲＶ−１
０である。
の態様の例は以下に述べるＰＲＶ−２およびＰＲＶ−１
０である。
もう一つの局面では、ＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位（コ
ーディング配列５’ −ＧＡＡＴＴＣ！−３’ ）がそ
の中に生成されたジュードラビーズ ウィルスケ゛ツム
を包含する組換えＰＲＶが提供される。このＥｃｏＲＩ
部位はＰＲＶゲノムの非必須領域中に位置する。ｘｈｏ
ｌ ／ ｇ ＩＩＩ領域、ｔｋ遺伝子領域およびｇｌ
遺伝子領域に挿入物を有する組換え体が好ましい。ｘｈ
ｏ Ｉ ／ ６ｍ領域において挿入された組換え体がよ
シ好ましい。最も好ましくは、挿入はＸｈｏ ｌ ／
ｇＩＩＩ領域の６ｍ遺伝子セグメント内に行われる。最
も好ましい態様にはＡＴＧコドン配列から下流の６ｍ遺
伝子セグメント中に挿入物を有する組換え体が包含され
る。あるいはまた、ＥｃｏＲＩ 部位は特定部位の突然
変異誘発によるか、またはＫＯＯＲ！部位を含有する合
成または天然の外来ＤＮＡフラグメントを挿入すること
によっても生成されうる。使用するには、このＥｃｏＲ
Ｉ部位を含有する組換え体をＥｃｏＲ１制限酵素で切断
し、そして標準的なりＮＡ組換え技術を用いて所望のＤ
ＮＡフラグメントを挿入す ゛る。ＰＲＶ−１およびＰ
ＲＶ−３２がかかる組換え体の例である。
ーディング配列５’ −ＧＡＡＴＴＣ！−３’ ）がそ
の中に生成されたジュードラビーズ ウィルスケ゛ツム
を包含する組換えＰＲＶが提供される。このＥｃｏＲＩ
部位はＰＲＶゲノムの非必須領域中に位置する。ｘｈｏ
ｌ ／ ｇ ＩＩＩ領域、ｔｋ遺伝子領域およびｇｌ
遺伝子領域に挿入物を有する組換え体が好ましい。ｘｈ
ｏ Ｉ ／ ６ｍ領域において挿入された組換え体がよ
シ好ましい。最も好ましくは、挿入はＸｈｏ ｌ ／
ｇＩＩＩ領域の６ｍ遺伝子セグメント内に行われる。最
も好ましい態様にはＡＴＧコドン配列から下流の６ｍ遺
伝子セグメント中に挿入物を有する組換え体が包含され
る。あるいはまた、ＥｃｏＲＩ 部位は特定部位の突然
変異誘発によるか、またはＫＯＯＲ！部位を含有する合
成または天然の外来ＤＮＡフラグメントを挿入すること
によっても生成されうる。使用するには、このＥｃｏＲ
Ｉ部位を含有する組換え体をＥｃｏＲ１制限酵素で切断
し、そして標準的なりＮＡ組換え技術を用いて所望のＤ
ＮＡフラグメントを挿入す ゛る。ＰＲＶ−１およびＰ
ＲＶ−３２がかかる組換え体の例である。
本発明のタンパク質は
（１）所望のタンパク質をコードしておシかっ発現され
つる外来ＭＡ７ラグメントを含有する組換えＰＲＶを細
胞に感染させ。
つる外来ＭＡ７ラグメントを含有する組換えＰＲＶを細
胞に感染させ。
（２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３） タンパク質を回収する、 ことにより製造される。ウィルスの感染およびタン・ξ
り質の生産には、 ＰＲＶを標準的表細胞培養条件下に
単に細胞に適用すればよい。タンパク質を回収するには
、標準的技術が用いられる。
細胞を培養し、そして （３） タンパク質を回収する、 ことにより製造される。ウィルスの感染およびタン・ξ
り質の生産には、 ＰＲＶを標準的表細胞培養条件下に
単に細胞に適用すればよい。タンパク質を回収するには
、標準的技術が用いられる。
細胞培養技術および回収法はＭａｎｉａｔｉｓ氏他、［
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ０１０ｎｉｎ、ｇ、 Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｇｏｌｄ １３ｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏａｃ
ｔ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ、 （１９８
２）： ＫｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩＭａｎｉｐｕｘ−ａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｋｘｐｒｓｓｓｌｏｎ、
Ｍ、工ｎｏｕｙｅ ＭＡ 。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ０１０ｎｉｎ、ｇ、 Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｇｏｌｄ １３ｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏａｃ
ｔ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ、 （１９８
２）： ＫｘｐｅｒｉｍｅｎｔａＩＭａｎｉｐｕｘ−ａ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｋｘｐｒｓｓｓｌｏｎ、
Ｍ、工ｎｏｕｙｅ ＭＡ 。
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３）：および
Ｒｏ’ｂｂｉｎｓ氏他、「Ｊ、 ２１ｏｌ Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎ、 ｊ ２： ４８５〜４９６（１９８４）に
記載されている。本発明で用いられる詳細な宿主細胞は
、それらが組換えＰＲＶ ＤＮＡを複製および発現せし
めるのであれば限定的なものではない。
Ｒｏ’ｂｂｉｎｓ氏他、「Ｊ、 ２１ｏｌ Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎ、 ｊ ２： ４８５〜４９６（１９８４）に
記載されている。本発明で用いられる詳細な宿主細胞は
、それらが組換えＰＲＶ ＤＮＡを複製および発現せし
めるのであれば限定的なものではない。
適当な細胞には動物および昆虫細胞が包含されるが、そ
れらに限定されるわけではない。好ましいものをあげれ
ば、マウス線維芽細胞、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、ウサ
ギ腎細胞、豚腎細胞、仔羊腎細胞、大賢細胞、豚腎細胞
、鶏胚線維芽細胞、ベビーハムスター腎細胞、ヒト繊維
芽細胞およびそれらの任意かつすべての組合せである。
れらに限定されるわけではない。好ましいものをあげれ
ば、マウス線維芽細胞、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、ウサ
ギ腎細胞、豚腎細胞、仔羊腎細胞、大賢細胞、豚腎細胞
、鶏胚線維芽細胞、ベビーハムスター腎細胞、ヒト繊維
芽細胞およびそれらの任意かつすべての組合せである。
最も好ましくは豚腎細胞、特に米国アイオワ州Ａｍｅｓ
のＮａｔｉｏｎ＆１−Ｖｅｔ、ｅｒｉｎａｒ７５ｅｒｖ
ｉｃｅｓ ＬａｂＯｒａ−ｔＯｒｉｅｓ から入手し
うるＰＫ１５である。
のＮａｔｉｏｎ＆１−Ｖｅｔ、ｅｒｉｎａｒ７５ｅｒｖ
ｉｃｅｓ ＬａｂＯｒａ−ｔＯｒｉｅｓ から入手し
うるＰＫ１５である。
抗原タンパク質をコーディングする外来遺伝子を含有し
ている前記牛脂換えウィルス、または前記方法によりか
かる組換え体から生産された抗原タンパク質の医薬的に
有効な量が製剤上受容されうる担体または希釈剤と一緒
にして哺乳類における疾患に対するワクチンとして使用
されうる。ワクチンとして使用されるには、抗原タンパ
ク質は純粋な形態である必要はなく、所望の場合は任意
のそしてすべての細胞部分および培養基を含有する細胞
抽出物から成ることもできる。投与すべき有用な薬用量
および投与様式はワクチン投与される哺乳類の年令１体
重、および予防接種が求められている病原体の種類の如
伺に応じ変化しよう。
ている前記牛脂換えウィルス、または前記方法によりか
かる組換え体から生産された抗原タンパク質の医薬的に
有効な量が製剤上受容されうる担体または希釈剤と一緒
にして哺乳類における疾患に対するワクチンとして使用
されうる。ワクチンとして使用されるには、抗原タンパ
ク質は純粋な形態である必要はなく、所望の場合は任意
のそしてすべての細胞部分および培養基を含有する細胞
抽出物から成ることもできる。投与すべき有用な薬用量
および投与様式はワクチン投与される哺乳類の年令１体
重、および予防接種が求められている病原体の種類の如
伺に応じ変化しよう。
かかるウィルスにより生産される抗原性タンパク質はま
た病原検出用キットにおける診断試薬としても使用され
つる。詳細には１体液試料中の病原体の存在は、タンパ
ク質を該タンパク質に対する抗体を含有することが疑わ
れる体液と接触させそして抗原−゛抗体複合物の形成を
判定することによυ検出されうる。複合物形成の判定は
、当業者に知られ、米国特許第４．５２Ｑｊ１３号に論
議されているｘｂｒｓＡ（酵素連結イムノンルベント法
）、ストリップ放射線免疫検定または間接免疫螢光法の
ような方法を用いて行われうる。
た病原検出用キットにおける診断試薬としても使用され
つる。詳細には１体液試料中の病原体の存在は、タンパ
ク質を該タンパク質に対する抗体を含有することが疑わ
れる体液と接触させそして抗原−゛抗体複合物の形成を
判定することによυ検出されうる。複合物形成の判定は
、当業者に知られ、米国特許第４．５２Ｑｊ１３号に論
議されているｘｂｒｓＡ（酵素連結イムノンルベント法
）、ストリップ放射線免疫検定または間接免疫螢光法の
ような方法を用いて行われうる。
以下の実験および実施例により本発明の種々の局面につ
いて説明するが１本発明はそれらに限定されるものでは
ない。別に断わりなければ部はすべて重量によるものと
し、そして温度は摂氏によるものとする。
いて説明するが１本発明はそれらに限定されるものでは
ない。別に断わりなければ部はすべて重量によるものと
し、そして温度は摂氏によるものとする。
一般的操作
米国アイオワ州ＡｍｅｓのＮａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅ
ｒｉｎａｒ７８ｅｒｖｉｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓから入手しうる豚腎細胞であるＰＫ１５を熱不活化
ウシ胎児血清１０％を補充したダル（ツコＯイーグル培
地中で生育させた。牛血溝および培地は０１８００社、
Ｇｒａｎｄ工５ｔａｎｄ、 Ｎ、Ｙ、から入手した。
ｒｉｎａｒ７８ｅｒｖｉｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓから入手しうる豚腎細胞であるＰＫ１５を熱不活化
ウシ胎児血清１０％を補充したダル（ツコＯイーグル培
地中で生育させた。牛血溝および培地は０１８００社、
Ｇｒａｎｄ工５ｔａｎｄ、 Ｎ、Ｙ、から入手した。
ＰＲＶのＢｅｃ）Ｃｓｒ菌株を用いたが、 ＰＲＶのど
の菌株でもうまくゆく。
の菌株でもうまくゆく。
細胞、ウィルスおよび培養条件はＲｏ’ｂｂｉｎｓ氏他
、「：ｆ、 Ｍｏｂ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎ、Ｊ ２：
４８５−４９６ （１９８４）に記載されている。
、「：ｆ、 Ｍｏｂ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎ、Ｊ ２：
４８５−４９６ （１９８４）に記載されている。
ｇ ｐ；Ｊ Ｚ ７ベローブ糖タン・ぞり質に特異的々
２種のモノクローナル抗体、す立わちＭｌおよびＭ１６
．は米国テネシー州、ナツシュビルのＶａｎ４ｅｒｂｉ
ｌｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ、τ、 Ｂｓｎ Ｐ
ｏｒａｔ氏から得た。モノクローナル抗体はＰＲＶのＫ
ａ菌株を用いて調製されたが、これらはＰＲＶのシｃｋ
ｅｒ菌株と実質上同じ反応性を示し、そして補体の非存
在下にウィルスを中和する。これらはまた感染した細胞
からのｇＩＩＩメタンゼク質を免疫沈殿させもする。Ｍ
ｌおよびＭ １６がここで使用されているがｓ ８ｍ遺
伝子生産物に対するいずれのモノクローナル抗体も使用
されつる。
２種のモノクローナル抗体、す立わちＭｌおよびＭ１６
．は米国テネシー州、ナツシュビルのＶａｎ４ｅｒｂｉ
ｌｔ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ、τ、 Ｂｓｎ Ｐ
ｏｒａｔ氏から得た。モノクローナル抗体はＰＲＶのＫ
ａ菌株を用いて調製されたが、これらはＰＲＶのシｃｋ
ｅｒ菌株と実質上同じ反応性を示し、そして補体の非存
在下にウィルスを中和する。これらはまた感染した細胞
からのｇＩＩＩメタンゼク質を免疫沈殿させもする。Ｍ
ｌおよびＭ １６がここで使用されているがｓ ８ｍ遺
伝子生産物に対するいずれのモノクローナル抗体も使用
されつる。
ウィルスの精製に用いられる操作はＢｅｎ Ｐｏｒａｔ
氏他、［”ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ ６０： ２９〜５７
（１９７４） Ｋ記載されている。この操作を改良して
、Ｎθｖｒ ］ｌｌｎｇ’１ａｎｄＮｕｃｌｅａｒ （
米国マサチューセッツ州、ボストン）から得られる５Ｈ
−グルコサミン１００μＣＩ／−が添加された３Ｈ−グ
ルコサミン標識ウィルスを調製した。免疫学的分析用の
細胞抽出物の製造技術はＲｏｂｂｉｎｇ氏他の［Ｊ、
Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎ、ｊ ｌ：４８５〜４９６
（１９８４）に記載されている。
氏他、［”ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ ６０： ２９〜５７
（１９７４） Ｋ記載されている。この操作を改良して
、Ｎθｖｒ ］ｌｌｎｇ’１ａｎｄＮｕｃｌｅａｒ （
米国マサチューセッツ州、ボストン）から得られる５Ｈ
−グルコサミン１００μＣＩ／−が添加された３Ｈ−グ
ルコサミン標識ウィルスを調製した。免疫学的分析用の
細胞抽出物の製造技術はＲｏｂｂｉｎｇ氏他の［Ｊ、
Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎ、ｊ ｌ：４８５〜４９６
（１９８４）に記載されている。
ウィルスＤＮＡの精製および分析操作は以下のとおシで
ある。すなわち、ＰＲＶ ＤＮＡをＢｅｎ ｐｏｒａｔ
氏他の「ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ 渇−： ２６５〜２７３
（１９７０）に記載されるようにしてＰＲＶヌクレオ
キャプシド１から精製した。かくして得られたＤＮＡを
ＥＩＯ１ｌｔｈ１３ｒｎ。
ある。すなわち、ＰＲＶ ＤＮＡをＢｅｎ ｐｏｒａｔ
氏他の「ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ 渇−： ２６５〜２７３
（１９７０）に記載されるようにしてＰＲＶヌクレオ
キャプシド１から精製した。かくして得られたＤＮＡを
ＥＩＯ１ｌｔｈ１３ｒｎ。
Ｅ、ｙｔ、、 ［Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、Ｊ ９８
： ５０５−５１７ （１９７５）に記載されるサザン
・プロット法にょう分析した。ＤＮＡ ／ ＤＮＡハイ
ブリッド形成は６ｏＸホルムアミド、ｐＨ６，５（Ｄ
１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ （ピ／−？ ラジン−Ｎ、Ｎ’
−ビス〔２−エタンスルホン酸））、５ＸＳａｃ （０
，７５Ｍ塩化ナトリウムオよび０．０７５Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｍ６．ｓ）、超音波処理した分生胸腺ＤＮＡ
（１００ｕｆ／ｍＬ ）および５×デンハルド（Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ）溶液（ｆｉｃｏｌｌ ４００ （Ｐｈａ
ｒｍｃｉａ社、米国ニューシャーシー州、Ｐｉｓｃａｔ
ａｙａｙ、 ）、牛血清アルブミンおよびポリビニルピ
ロリドン［ＳｉｇＩＩＩａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社、米国
ミズーリ州、セントルイス］の各０．１％）中で３７℃
で１６時間行われた。ＤＮＡプローブＦｉｓ２ｐ標識さ
れたヌクレオチドを用い、ニックトランスレーションに
より調製された。ハイブリッド形成されたニトロセルロ
ース膜を２ Ｘ ｓｓＣ（０，５Ｍ塩化ナトリウムおよ
び１０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７０）中で６５℃
でそれぞれ３０分間ずつ４回洗った。
： ５０５−５１７ （１９７５）に記載されるサザン
・プロット法にょう分析した。ＤＮＡ ／ ＤＮＡハイ
ブリッド形成は６ｏＸホルムアミド、ｐＨ６，５（Ｄ
１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ （ピ／−？ ラジン−Ｎ、Ｎ’
−ビス〔２−エタンスルホン酸））、５ＸＳａｃ （０
，７５Ｍ塩化ナトリウムオよび０．０７５Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｍ６．ｓ）、超音波処理した分生胸腺ＤＮＡ
（１００ｕｆ／ｍＬ ）および５×デンハルド（Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ）溶液（ｆｉｃｏｌｌ ４００ （Ｐｈａ
ｒｍｃｉａ社、米国ニューシャーシー州、Ｐｉｓｃａｔ
ａｙａｙ、 ）、牛血清アルブミンおよびポリビニルピ
ロリドン［ＳｉｇＩＩＩａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社、米国
ミズーリ州、セントルイス］の各０．１％）中で３７℃
で１６時間行われた。ＤＮＡプローブＦｉｓ２ｐ標識さ
れたヌクレオチドを用い、ニックトランスレーションに
より調製された。ハイブリッド形成されたニトロセルロ
ース膜を２ Ｘ ｓｓＣ（０，５Ｍ塩化ナトリウムおよ
び１０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７０）中で６５℃
でそれぞれ３０分間ずつ４回洗った。
次にニトロセルロース膜をコダックＸＡＲ−５フイルム
上オートラジオグラフイーさせた。
上オートラジオグラフイーさせた。
大腸菌プラスミドベクターが組換えＰＲＶ ＤＮＡの調
製に用いられた。これらは文字、数字または文字と数字
の混合物の直前に小文字のｐを有することにより表示さ
れる。ある種の実験には、ＰＲＶ ＤＮＡのフラグメン
トを大腸菌発現はフタ−中に挿入し、それによりかなり
の量のＤＮＡフラグメントそしてまたＰＲｖ遺伝子生産
物が生成されて、 ＤＮＡおよびタンパク質分析および
同時トランスフェクション遺伝子置換実験に使用される
。Ｌａｃリプレッサーの過剰生産を来たｔ１ａｃ１ｑ突
然変異を有するＦ′プラスミドを担持する大腸菌株ＮＦ
１８２９がＬａｃ発現ベクター中におけるＰＲＶ遺伝
子の発現を調節するのに使用された。
製に用いられた。これらは文字、数字または文字と数字
の混合物の直前に小文字のｐを有することにより表示さ
れる。ある種の実験には、ＰＲＶ ＤＮＡのフラグメン
トを大腸菌発現はフタ−中に挿入し、それによりかなり
の量のＤＮＡフラグメントそしてまたＰＲｖ遺伝子生産
物が生成されて、 ＤＮＡおよびタンパク質分析および
同時トランスフェクション遺伝子置換実験に使用される
。Ｌａｃリプレッサーの過剰生産を来たｔ１ａｃ１ｑ突
然変異を有するＦ′プラスミドを担持する大腸菌株ＮＦ
１８２９がＬａｃ発現ベクター中におけるＰＲＶ遺伝
子の発現を調節するのに使用された。
このことは、大腸菌におけるＰＲＶ ｇ、 ’ＪＪ遺伝
子の過剰の発現がＲｏｂｂｉｎｇ氏他の「：ｒ、 Ｖｆ
：ｒｏｌ、Ｊ ５８：３５９〜３４７ （１９Ｂ６）
に記載されるように細胞の生育停止を来たすので重要
である。
子の過剰の発現がＲｏｂｂｉｎｇ氏他の「：ｒ、 Ｖｆ
：ｒｏｌ、Ｊ ５８：３５９〜３４７ （１９Ｂ６）
に記載されるように細胞の生育停止を来たすので重要
である。
すべてのプラスミドはＭａｎｉａｔｉｇ氏他、「Ｍｏ１
−ｅｃｕｌａｒ Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ＭａｎｕａＪ Ｏｏｌ＋ｄ日ｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ、 （１９８
２）に記載される標準ＤＮＡ組換え技術を用いて構成さ
れた。
−ｅｃｕｌａｒ Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ＭａｎｕａＪ Ｏｏｌ＋ｄ日ｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ、 （１９８
２）に記載される標準ＤＮＡ組換え技術を用いて構成さ
れた。
ＰＲＶ ｇＩＩＩ遺伝子を含有するプラスミドの構成１
、 ｐＡＬＭ ２０ ＰＲＶ Ｂｅａｋｅｒ菌株からのＤＮＡ １０１” ｓ
および大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の２μ２ を別々
にＰｓｔ■で処理しそしてｐＢＲ３２２ＤＮＡを３７℃
で分生アルカリホスファターゼで３０分間処理した。
、 ｐＡＬＭ ２０ ＰＲＶ Ｂｅａｋｅｒ菌株からのＤＮＡ １０１” ｓ
および大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２の２μ２ を別々
にＰｓｔ■で処理しそしてｐＢＲ３２２ＤＮＡを３７℃
で分生アルカリホスファターゼで３０分間処理した。
これら試料を１％アガロース／ ＴＥＡゲルで分画させ
、そして直線化されたｐＢＲ３２２およびｐｒｔｖＤＮ
Ａから得られる約４．３ ’ｋｂに相当する領域をＩ）
Ｋ８１紙を用いて以下のようにして精製した。はじめに
、ＤＩ８１片を２ｍ ＮａＣＱ、 １０ミリモルトリス
（ｐＨ７，５）および１ ｔｎ １！ＤＴＡで洗い、２
回水洗しそして次にＴＥＡ中で平衡となした。ゲルを必
要なフラグメントの上と下で切断し、ＤＫ８１片を切断
ゲル内に置きそしてＤＮＡをＤＫ８１片上で電気泳動さ
せた。ＤＮＡが電気泳動されて入ったＤＫ８１片を水で
すすぎ、そしてＤＮＡを１．５ Ｍ ＮａＣ（！ 。
、そして直線化されたｐＢＲ３２２およびｐｒｔｖＤＮ
Ａから得られる約４．３ ’ｋｂに相当する領域をＩ）
Ｋ８１紙を用いて以下のようにして精製した。はじめに
、ＤＩ８１片を２ｍ ＮａＣＱ、 １０ミリモルトリス
（ｐＨ７，５）および１ ｔｎ １！ＤＴＡで洗い、２
回水洗しそして次にＴＥＡ中で平衡となした。ゲルを必
要なフラグメントの上と下で切断し、ＤＫ８１片を切断
ゲル内に置きそしてＤＮＡをＤＫ８１片上で電気泳動さ
せた。ＤＮＡが電気泳動されて入ったＤＫ８１片を水で
すすぎ、そしてＤＮＡを１．５ Ｍ ＮａＣ（！ 。
１０Ｈトリス（…７．５ ）および１ ｔｍ ＦＪ）Ｔ
Ａを用いて３７℃で２時間溶出させた。仁のＤＮＡを同
量のインプロパツール中室温で１時間沈殿させた。
Ａを用いて３７℃で２時間溶出させた。仁のＤＮＡを同
量のインプロパツール中室温で１時間沈殿させた。
この沈殿を遠心分離により集めた。得られるＲレットに
ＴＥＮ（１０１１ＩＩトリス（ｐ）１７．５）、１ｗＥ
ＤＴＡ、 １００Ｗ ＮａＣＱ ）を添加した。この溶
液を一２０℃で一夜エタノール沈殿させそして遠心分離
によシＲレットを回収した。
ＴＥＮ（１０１１ＩＩトリス（ｐ）１７．５）、１ｗＥ
ＤＴＡ、 １００Ｗ ＮａＣＱ ）を添加した。この溶
液を一２０℃で一夜エタノール沈殿させそして遠心分離
によシＲレットを回収した。
直線状となされたｐＢＲ３２２単離物を含有するはレッ
ト１００ｎｆおよび４．３ ＰＲＶ Ｐｓｔ ｒ ７ラ
グメント２００ ｎｆを、１０×リガ一ゼ緩衝液１μｅ
１１ｗｑ／艷の牛血清アルプミｙ （Ｓｉ発Ｃｈｅｍｉ
ｃａ１社から入手）１μＱ、リガーゼ１μ２および水を
１０μ２となるまで加えたものに加えた。室温で３時間
経過後、生成した連結混合物を前記した大腸菌株ＮＦ
１８２９中に形質転換した。次にこの細菌を’ｒｅｔプ
レート上３７℃で一夜培養した。Ｔｅｔプレートからの
レプリカ培養コロニーを次にＴｅｔおよびＡｍｐプレー
トの両方で培養した。ＴｅｔＲおよびＡｍｐ ｓ で
あるプラスミドを選択しそしてサザン・プロット法で分
析した。次にプラスミドＤＮＡをＰｓｔ ｌおよびＥｃ
ｏＲＩで消化し、１％アガロース／ ＴＥＡゲル上の電
気泳動にかけ、ニトロセルロースに移Ｌ、そしてニック
トランスレーションされたｐＡＬＭ １５を用いて探索
した。
ト１００ｎｆおよび４．３ ＰＲＶ Ｐｓｔ ｒ ７ラ
グメント２００ ｎｆを、１０×リガ一ゼ緩衝液１μｅ
１１ｗｑ／艷の牛血清アルプミｙ （Ｓｉ発Ｃｈｅｍｉ
ｃａ１社から入手）１μＱ、リガーゼ１μ２および水を
１０μ２となるまで加えたものに加えた。室温で３時間
経過後、生成した連結混合物を前記した大腸菌株ＮＦ
１８２９中に形質転換した。次にこの細菌を’ｒｅｔプ
レート上３７℃で一夜培養した。Ｔｅｔプレートからの
レプリカ培養コロニーを次にＴｅｔおよびＡｍｐプレー
トの両方で培養した。ＴｅｔＲおよびＡｍｐ ｓ で
あるプラスミドを選択しそしてサザン・プロット法で分
析した。次にプラスミドＤＮＡをＰｓｔ ｌおよびＥｃ
ｏＲＩで消化し、１％アガロース／ ＴＥＡゲル上の電
気泳動にかけ、ニトロセルロースに移Ｌ、そしてニック
トランスレーションされたｐＡＬＭ １５を用いて探索
した。
ｇＩＩＩ遺伝子を含有するＰＲＶゲ／ ムＤＮＡ （７
） ４．３ ｋｂＰｓｔ Ｉフラグメントを含有するク
ローンを単離してｐＡＬＭ ２０と表示した。
） ４．３ ｋｂＰｓｔ Ｉフラグメントを含有するク
ローンを単離してｐＡＬＭ ２０と表示した。
ＰＲＶ ｇＩＩＩ遺伝子中に欠失があるプラスミｒの構
成１、 ｐＡＬＭ ２ ｇＩＩＩに影響が及ぶ欠失ば大腸菌ｐＢＲ３２２から訪
導された発現プラスミドｐＡＬＭ ３を変えることＫよ
り構成された（第３図参照）。ｐＡＬＭ３はヨーロッパ
特許出願第０．１６２，７３８号に記載されている（ｐ
ＮＴ７／１２３と称されている）。このＢＰ−ＡＱ、１
６２，７３８号に記載されるように、プラスミドｐＡＬ
Ｍ ３ （ｐＮＴ ７／１２５ ）を担持する大腸菌株
に１２、ＮＦ １８２９は米国ミシガン州、Ａｎｎ Ａ
ｒｂｏｒのＩｎＶｉｔｒｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｃ、に寄託番号ＩＶＩ−１００４９の下に寄託
されている。
成１、 ｐＡＬＭ ２ ｇＩＩＩに影響が及ぶ欠失ば大腸菌ｐＢＲ３２２から訪
導された発現プラスミドｐＡＬＭ ３を変えることＫよ
り構成された（第３図参照）。ｐＡＬＭ３はヨーロッパ
特許出願第０．１６２，７３８号に記載されている（ｐ
ＮＴ７／１２３と称されている）。このＢＰ−ＡＱ、１
６２，７３８号に記載されるように、プラスミドｐＡＬ
Ｍ ３ （ｐＮＴ ７／１２５ ）を担持する大腸菌株
に１２、ＮＦ １８２９は米国ミシガン州、Ａｎｎ Ａ
ｒｂｏｒのＩｎＶｉｔｒｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｃ、に寄託番号ＩＶＩ−１００４９の下に寄託
されている。
ｐＡＬＭ ３において、Ｃｒ ｏ−ＰＲＶ ｇＩＩＩ
／％イブリツＰ遺伝子の転写はＬａｃ ＋）プレフサー
の制御の下ｔａｃプロモーターから指揮される。ｐＡＬ
Ｍ Ｂを含有する大腸菌株ＮＦ １８２９ ｅアンピシ
リン１００μυ側を含有するＬ−ブロス中で生育させた
。イソプロピルβ−Ｄ−チオがラクトピラノシドを最終
濃度１ｍＭとなるまで添加することＫより融合タンパク
質を訪導させた。インデューサーを添加して４時間後に
培養液３ ｍｌを収穫した。Ｃｒｏ−ＰＲＶ ｇＩＩＩ
融合タンノクク質を不溶性集合物として集めた。このタ
ンノぐり質を１０４８ＤＳ−／リアクリルアミ）％ゲル
上の電気泳動により分画し、クーマシーブルーで染色し
た。ｐＡＬＭ ３は、細胞総タン・ダク質の約３〜５チ
まで蓄積するかなりの量のＣｒｏ−ＰＲＶ ｇＩＩＩ融
合タン・９り質を生産する（第４図、レーン２ ） 、
ＤＮＡ配列分析により決定されるように、バクテリオ
ファージラムダＣｒｏタンノ９り質に由来するアミノ末
端２３アミノ酸がｇＩＩＩの第１のアミノ酸（Ｍｅｔ）
に融合している。
／％イブリツＰ遺伝子の転写はＬａｃ ＋）プレフサー
の制御の下ｔａｃプロモーターから指揮される。ｐＡＬ
Ｍ Ｂを含有する大腸菌株ＮＦ １８２９ ｅアンピシ
リン１００μυ側を含有するＬ−ブロス中で生育させた
。イソプロピルβ−Ｄ−チオがラクトピラノシドを最終
濃度１ｍＭとなるまで添加することＫより融合タンパク
質を訪導させた。インデューサーを添加して４時間後に
培養液３ ｍｌを収穫した。Ｃｒｏ−ＰＲＶ ｇＩＩＩ
融合タンノクク質を不溶性集合物として集めた。このタ
ンノぐり質を１０４８ＤＳ−／リアクリルアミ）％ゲル
上の電気泳動により分画し、クーマシーブルーで染色し
た。ｐＡＬＭ ３は、細胞総タン・ダク質の約３〜５チ
まで蓄積するかなりの量のＣｒｏ−ＰＲＶ ｇＩＩＩ融
合タン・９り質を生産する（第４図、レーン２ ） 、
ＤＮＡ配列分析により決定されるように、バクテリオ
ファージラムダＣｒｏタンノ９り質に由来するアミノ末
端２３アミノ酸がｇＩＩＩの第１のアミノ酸（Ｍｅｔ）
に融合している。
ｐＡＬＭ ３において、コーＰ配列はアミノ酸４７９の
後に天然の翻訳停止シグナル（ＴＧＡ）で終了し、続い
て約１０００ｂｐのＰＲＶ配列がくる。
後に天然の翻訳停止シグナル（ＴＧＡ）で終了し、続い
て約１０００ｂｐのＰＲＶ配列がくる。
ｐＡＬＭ ２ （第３Ａ図）はｐＡＬＭ ３を制限酵素
Ｓａｃ■で消化し、そして再連結することにより構成さ
れた。 ｐＡＬＭ ２はｇｌＩ［遺伝子内に４０２ｂｐ
内ｍ５ａｃ Ｉフラグメントの枠内欠失があり、そして
（ｐＡＬＭ ３について前記し念ように）先端の切れ之
タンパク質を産生ずる（第４図、レーン３）。
Ｓａｃ■で消化し、そして再連結することにより構成さ
れた。 ｐＡＬＭ ２はｇｌＩ［遺伝子内に４０２ｂｐ
内ｍ５ａｃ Ｉフラグメントの枠内欠失があり、そして
（ｐＡＬＭ ３について前記し念ように）先端の切れ之
タンパク質を産生ずる（第４図、レーン３）。
２、ｐＡＬＭｌｏ
ｐＡＬＭｌｏはＰＲＶのｇＩＩＩ遺伝子の一部分を含有
するもう一つの発現プラスミＰである（第３Ｂ図）。
するもう一つの発現プラスミＰである（第３Ｂ図）。
この場合、ｐｐｖのｇＩＩＩ遺伝子の約８７チが除去さ
れている。このものは以下のようにして構成される。す
なわち、第１のｐＡＬＩＪ Ｎを構成させて中間体とし
て用いる。ｐＡＬＭｌｌはｐＡＬＭ１２をｓｐｈ ｌで
消化しそして生成する一本鎖末端をＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのフレノウフラグメントの３７−ｓ／エキソヌクレア
ーゼ活性を用いて除去することにより構成された。大腸
菌ｐＢＲ３２２誘導体であるｐＡＬＭ１２の構成はヨー
ロツｉ！特許出願第ｏ、１６４７３８号（そこではｐ７
／１２３と呼ばれている）に記載されている。次にこの
ＤＮＡをＢａｍ［で消化しそして生成する２ ５００
ｂｐフラグメント’ｉ ｐＲＫ ４１２のＳｍａ ｉ
／ Ｂａｍ ＨＩ部位中に連結してｐＡＬＭｌｌを生成
させている。もう一つのｐＢＲ３２２誘導体であるｐＨ
Ｋ４１２の構成はヨーロッパ特許出願第Ｑ、１６２．７
３８号に記載されている（その中でｐＨＫ４１２と呼ば
れている） 、 ｐＡＬＭ ３ およびｐＡＬＭｌｌ
の両方のＤＮＡをＰｓｔ ＩおよびＸｈｏ ｌで消化し
た。生成するｐＡＬＭｌｌからの１８４０ｂｐフラグメ
ントおよびｐＡＬＭ ３からの３６７０ ｂｌ）フラグ
メントｔ−精製しそしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結した。杉皮されたプラスミドｐＡＬＭ １０はカル
ブキシ末端部分をコーＰする１８６ｂｐを除きすべての
ｇＩＩＩ遺伝子（上流ＤＮＡの２３５ｂｐ’ｅ含めて）
が欠落している。このものはｐＡＬＭ ３発現ベクター
のｔａｃプロモーター／オペレーターおよび翻訳エレメ
ントをも保有している。このものは誘導に際して伺らタ
ンパク質を生成しない（第４図、レーン４）。
れている。このものは以下のようにして構成される。す
なわち、第１のｐＡＬＩＪ Ｎを構成させて中間体とし
て用いる。ｐＡＬＭｌｌはｐＡＬＭ１２をｓｐｈ ｌで
消化しそして生成する一本鎖末端をＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのフレノウフラグメントの３７−ｓ／エキソヌクレア
ーゼ活性を用いて除去することにより構成された。大腸
菌ｐＢＲ３２２誘導体であるｐＡＬＭ１２の構成はヨー
ロツｉ！特許出願第ｏ、１６４７３８号（そこではｐ７
／１２３と呼ばれている）に記載されている。次にこの
ＤＮＡをＢａｍ［で消化しそして生成する２ ５００
ｂｐフラグメント’ｉ ｐＲＫ ４１２のＳｍａ ｉ
／ Ｂａｍ ＨＩ部位中に連結してｐＡＬＭｌｌを生成
させている。もう一つのｐＢＲ３２２誘導体であるｐＨ
Ｋ４１２の構成はヨーロッパ特許出願第Ｑ、１６２．７
３８号に記載されている（その中でｐＨＫ４１２と呼ば
れている） 、 ｐＡＬＭ ３ およびｐＡＬＭｌｌ
の両方のＤＮＡをＰｓｔ ＩおよびＸｈｏ ｌで消化し
た。生成するｐＡＬＭｌｌからの１８４０ｂｐフラグメ
ントおよびｐＡＬＭ ３からの３６７０ ｂｌ）フラグ
メントｔ−精製しそしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結した。杉皮されたプラスミドｐＡＬＭ １０はカル
ブキシ末端部分をコーＰする１８６ｂｐを除きすべての
ｇＩＩＩ遺伝子（上流ＤＮＡの２３５ｂｐ’ｅ含めて）
が欠落している。このものはｐＡＬＭ ３発現ベクター
のｔａｃプロモーター／オペレーターおよび翻訳エレメ
ントをも保有している。このものは誘導に際して伺らタ
ンパク質を生成しない（第４図、レーン４）。
ｇＩＩＩ遺伝子中に欠失がある組換えシューＰラビーズ
ウイルスの構成 １、 ＰＲＶ−２ 組換えシューＰラピーズウイルスＰＲＶ−２は以下のよ
うにして生成された。ｐＡＬＭ ２のＤＮＡ 全制限酵
素Ｎｃｏ ｌとインキュベーションすることにより消化
した。 ｐＡＬＭ ２から得られる生成するＮｃｏ Ｉ
消化ＤＮＡ １ ／Ｊｆ ？、Ｇｒａｈａｍ氏他の［Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙＪ５２ ： ４５６〜４６７（１９７３
）記載の操作を用いてｐｋ１５細胞中に親（未変化）
ＰＲＶ ＤＮＡからのＤＮＡ ２μｔと一緒に同時トラ
ンスフェクションさせた。トランスフェクションされた
細胞を３７℃で４時間インキュベーションし、生育培地
で洗い、そして６分間（１５チグリセリン）ショックに
かけた。細胞を再び培地で２回洗い、次に新たな生育培
地パッチ中に入れた。１２時間ｆｆｌ、ｇｔｎモノクロ
ーナル抗体Ｍ１およびＭ１６（それぞれ０．６μ≠濃度
まで）およびモルモット補体（５憾濃度まで）添加して
ｇＩＩＩ欠損組換えウィルスを富化させた。補体の存在
下または非存在下において、これらモノクローナル抗体
は親ＰＲＶの感染力を中和するか°、シかしもはやｇＩ
ＩＩタン／ｌり質を発現しないＰＲＶまたは先端の切れ
た形態のｇＩＩＩ糖タンノ臂り質を発現するＰＲＶは中
和しない０Ｍ１モノクロ一ナル抗体もＭ１６モノクロー
ナル抗体もＰＲＶ−２により発現された８ｍタンパク質
と反応しなかった。それぞれのトランスフェクションか
ら得られる総ウィルス生成物は、約３６時間後に完全な
細胞変性効果が観察されてから収穫した。集めたウィル
ス含有液体の一部分を希釈してＰＫ１５細胞上に塗布し
、プラークを形成させた。ＭｌおよびＭ１６モノクロー
ナル抗体と反応しなかつ念プラークをスクリーニングす
るためにＳｍｉ ｔｈ氏他のｒＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
ウイルスの構成 １、 ＰＲＶ−２ 組換えシューＰラピーズウイルスＰＲＶ−２は以下のよ
うにして生成された。ｐＡＬＭ ２のＤＮＡ 全制限酵
素Ｎｃｏ ｌとインキュベーションすることにより消化
した。 ｐＡＬＭ ２から得られる生成するＮｃｏ Ｉ
消化ＤＮＡ １ ／Ｊｆ ？、Ｇｒａｈａｍ氏他の［Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙＪ５２ ： ４５６〜４６７（１９７３
）記載の操作を用いてｐｋ１５細胞中に親（未変化）
ＰＲＶ ＤＮＡからのＤＮＡ ２μｔと一緒に同時トラ
ンスフェクションさせた。トランスフェクションされた
細胞を３７℃で４時間インキュベーションし、生育培地
で洗い、そして６分間（１５チグリセリン）ショックに
かけた。細胞を再び培地で２回洗い、次に新たな生育培
地パッチ中に入れた。１２時間ｆｆｌ、ｇｔｎモノクロ
ーナル抗体Ｍ１およびＭ１６（それぞれ０．６μ≠濃度
まで）およびモルモット補体（５憾濃度まで）添加して
ｇＩＩＩ欠損組換えウィルスを富化させた。補体の存在
下または非存在下において、これらモノクローナル抗体
は親ＰＲＶの感染力を中和するか°、シかしもはやｇＩ
ＩＩタン／ｌり質を発現しないＰＲＶまたは先端の切れ
た形態のｇＩＩＩ糖タンノ臂り質を発現するＰＲＶは中
和しない０Ｍ１モノクロ一ナル抗体もＭ１６モノクロー
ナル抗体もＰＲＶ−２により発現された８ｍタンパク質
と反応しなかった。それぞれのトランスフェクションか
ら得られる総ウィルス生成物は、約３６時間後に完全な
細胞変性効果が観察されてから収穫した。集めたウィル
ス含有液体の一部分を希釈してＰＫ１５細胞上に塗布し
、プラークを形成させた。ＭｌおよびＭ１６モノクロー
ナル抗体と反応しなかつ念プラークをスクリーニングす
るためにＳｍｉ ｔｈ氏他のｒＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
ＭｅｔｈｏｄｓＪ４０：２９７〜３０５（１９８１）記
載の黒色プラーク分析法を用いた。抗体と反応しなかっ
たプラーク（すなわち白色である）を採取し、そして続
く分析に先立ち単一プラーク単離を行うことにより２回
精製した。ＰＲＶ−２はかかる単離されたプラークの一
つの子孫からなる。
載の黒色プラーク分析法を用いた。抗体と反応しなかっ
たプラーク（すなわち白色である）を採取し、そして続
く分析に先立ち単一プラーク単離を行うことにより２回
精製した。ＰＲＶ−２はかかる単離されたプラークの一
つの子孫からなる。
２、Ｐ只ｖ−１０
ＰＲＶ−１０組換えウィルスは、ｐＡＬＭ １０をＰｓ
ｔｌを用いて直線状となしそして親ウィルスＤＮＡ 全
周いて同時トランスフェクションさせる以外は前記ＰＲ
Ｖ−２と実質的に同様にして生成および選択された。
ｔｌを用いて直線状となしそして親ウィルスＤＮＡ 全
周いて同時トランスフェクションさせる以外は前記ＰＲ
Ｖ−２と実質的に同様にして生成および選択された。
ｉ ＰＲＶ−２オよびＰＲＶ−１０の分析ＰＲＶ−２
オよびＰＲＶ−１０のＤＮＡを分析して、ｐＡＬＭ ２
およびｐＡＬＭ １０により限定される欠失が選択され
たウィルス中に交雑されていることが示された。親ＰＲ
Ｖも比較のために分析した。
オよびＰＲＶ−１０のＤＮＡを分析して、ｐＡＬＭ ２
およびｐＡＬＭ １０により限定される欠失が選択され
たウィルス中に交雑されていることが示された。親ＰＲ
Ｖも比較のために分析した。
ウィルスＤＮＡ ’ｉ一般的操作の項で記載されたよう
にしてヌクレオキャプシドから単離した。このＤＮＡを
Ｐｓｔ ｌおよびＸｈｏ ｌで消化し、１係アｊｆロー
スゲル上で分画させ、ニトロセルロースに移しそしてｐ
ＡＬＭ１５からの５２ｐ標識プローブ（第５図参照）と
ハイブリッＰ形成させた。第５図に包含される親ゲノム
の制限酵素地図に示されるように、ｇＩＩＩ遺伝子は４
．３ ｋｂ Ｐｓｔ ｌフラグメントのおよそ中心に位
置する。このＰｓｔ ｌフラグメント中には３個のｘｈ
ｏ １部位が存在する。
にしてヌクレオキャプシドから単離した。このＤＮＡを
Ｐｓｔ ｌおよびＸｈｏ ｌで消化し、１係アｊｆロー
スゲル上で分画させ、ニトロセルロースに移しそしてｐ
ＡＬＭ１５からの５２ｐ標識プローブ（第５図参照）と
ハイブリッＰ形成させた。第５図に包含される親ゲノム
の制限酵素地図に示されるように、ｇＩＩＩ遺伝子は４
．３ ｋｂ Ｐｓｔ ｌフラグメントのおよそ中心に位
置する。このＰｓｔ ｌフラグメント中には３個のｘｈ
ｏ １部位が存在する。
２個はその遺伝子の上流にそして１個はカルゲキシ末端
近くのｇｌｌ［コード配列内にある。ｇｌ［ｌ遺伝子の
２５０ｂｐ上流の部位およびｇＩＩＩ遺伝子内の部位に
より限定される１、４８ ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ ７ラグメ
ントがこの分析−にとって決定的に重要なフラグメント
である。３２Ｐ−標識ｐＡＬＭ１５をプローブとして用
いることにより、第５図のゲルパターンが観察された。
近くのｇｌｌ［コード配列内にある。ｇｌ［ｌ遺伝子の
２５０ｂｐ上流の部位およびｇＩＩＩ遺伝子内の部位に
より限定される１、４８ ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ ７ラグメ
ントがこの分析−にとって決定的に重要なフラグメント
である。３２Ｐ−標識ｐＡＬＭ１５をプローブとして用
いることにより、第５図のゲルパターンが観察された。
親）９ターンはレーン１に示される。１．３ｋｂおよび
（Ｌ９５ｋｂの２７ラグメントおよび１．４８ｋｂの内
部Ｘｈｏ ｌフラグメントに注目されたい。ｇＩＩＩｍ
遺伝円内１ｃ４０２ｂｐ欠失含有するＰＲＶ−２からの
ＤＮＡ （第５図、レーン２）では、１．３ｋｂおよび
０．９５ｋｂフラグメントは未変化であるが、１．４８
ｋｂ内部Ｘｈｏ ｌフラグメントは、１．１ｋｂフラグ
メントとして移動している。同様に、１．４８ｋｂ内部
Ｘｈｏ Ｉ ７ラグメントが正確に欠失しているＰＲＶ
−１０からのＤＮＡ （第５図、レ “−ン３）では
１．３およびα９５ｋｌ）フラグメントのみが示される
。
（Ｌ９５ｋｂの２７ラグメントおよび１．４８ｋｂの内
部Ｘｈｏ ｌフラグメントに注目されたい。ｇＩＩＩｍ
遺伝円内１ｃ４０２ｂｐ欠失含有するＰＲＶ−２からの
ＤＮＡ （第５図、レーン２）では、１．３ｋｂおよび
０．９５ｋｂフラグメントは未変化であるが、１．４８
ｋｂ内部Ｘｈｏ ｌフラグメントは、１．１ｋｂフラグ
メントとして移動している。同様に、１．４８ｋｂ内部
Ｘｈｏ Ｉ ７ラグメントが正確に欠失しているＰＲＶ
−１０からのＤＮＡ （第５図、レ “−ン３）では
１．３およびα９５ｋｌ）フラグメントのみが示される
。
ＰＲＶ−２＞よびＰＲＶ−１０のＤＮＡはそれぞれｇｎ
ｌの４０２ ｂｐ オよび８７チを欠くが、ＰＲＶ−２
オよびＰＲＶ−１０はなお正常圧感染し複製されるので
、ＰＲＶのｇＩＩＩ遺伝子またはそのタンノ譬り質生産
物はそのウィルスの感染力および複製に必要ではないと
結論づけられる。さらに、ｇｌ［ｌ遺伝子のすぐ上流の
Ｘｈｏ Ｉ部位からｇＩＩＩまでの領域の欠失によって
はウィルス複製は喪失されない、従って、ＰＲＶゲノム
のこれらの部分は欠失されることができ、そしてｇＩＩ
Ｉの場所に適正に入れられた遺伝子または遺伝子のフラ
グメントは発現されそれらの生産物は感染した細胞中に
おけるウィルス複製期間中に生産される筈である。従っ
てｐＡ１２、ｐＡＬＭｌｏおよびｐＡＬＭ ２０のよう
なプラスミドが組換えＰＲＶウィルスｖ４製用の出発物
質として用いられうる。
ｌの４０２ ｂｐ オよび８７チを欠くが、ＰＲＶ−２
オよびＰＲＶ−１０はなお正常圧感染し複製されるので
、ＰＲＶのｇＩＩＩ遺伝子またはそのタンノ譬り質生産
物はそのウィルスの感染力および複製に必要ではないと
結論づけられる。さらに、ｇｌ［ｌ遺伝子のすぐ上流の
Ｘｈｏ Ｉ部位からｇＩＩＩまでの領域の欠失によって
はウィルス複製は喪失されない、従って、ＰＲＶゲノム
のこれらの部分は欠失されることができ、そしてｇＩＩ
Ｉの場所に適正に入れられた遺伝子または遺伝子のフラ
グメントは発現されそれらの生産物は感染した細胞中に
おけるウィルス複製期間中に生産される筈である。従っ
てｐＡ１２、ｐＡＬＭｌｏおよびｐＡＬＭ ２０のよう
なプラスミドが組換えＰＲＶウィルスｖ４製用の出発物
質として用いられうる。
実施例 １
ＤＮＡのＨＴＬＶ ＩＩＩエンベロープコーディングフ
ラグメントを含有する組換えＰＲＶの構成 １、 ホスホリル化Ｓａｃ Ｉ／Ｂｇｌ ｎリンカ−の
調製Ｓａｃ Ｉ／Ｅｇｌ ｎ リンカ−は下記に示す
。
ラグメントを含有する組換えＰＲＶの構成 １、 ホスホリル化Ｓａｃ Ｉ／Ｂｇｌ ｎリンカ−の
調製Ｓａｃ Ｉ／Ｅｇｌ ｎ リンカ−は下記に示す
。
５’ ＧＡＧＣＴＣ’ＡＡＴＧＡＧＴ（”ＣＧＡ ３’
３’ ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡ（）ＧＣＴＣＴＡＧ
５’以下のものを適当な反応容器に加えた。
３’ ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡ（）ＧＣＴＣＴＡＧ
５’以下のものを適当な反応容器に加えた。
アニーリングされたリンカ−４，０μｔＩリヌクレオチ
Ｐ 水 ５
．５μ１ＭｇＣ１２，５０ｍＭジチオトレイトール）１
０１１１Ｍ ＡＴＰ１ＰＨ７，０１μｔこの混合物を３
７℃で１時間インキュベーションし、次に６５℃で５分
間加熱した。
Ｐ 水 ５
．５μ１ＭｇＣ１２，５０ｍＭジチオトレイトール）１
０１１１Ｍ ＡＴＰ１ＰＨ７，０１μｔこの混合物を３
７℃で１時間インキュベーションし、次に６５℃で５分
間加熱した。
２、 ｂｐ７１９８〜ｂｐ８６２ＢのＢｇｌ １１１
．４３ ｋｂ ＨＴＬＶＩ［ＩＤＮＡ ７ラグメントの
調製（ＩＩＩＴＬＶエンベロープポリタン−ぐり質遺伝
子コーティング領域の部分） １１１’Ｉ’ＬＶ Ｉｌｌ ＤＮＡの完全なヌクレオチ
ド配列はＲａｔｎｅｒ氏他のｒＮａｔｕｒｅＪ３１３：
２７７＝２８４（１９８５）に示されている。プラスミ
ドｐＬＯＲｏにより）ＩＴＬＶ ＩＩＩヌクレオチド源
が提供されているが、どの源でも適当であろう。］）Ｌ
ＯＲＯはｂｐ７１９６〜ｂｐ ８６２１のＨＴＬＶエン
ベロープポリタンノ臂り質遺伝子コーティング領域のフ
ラグメントヲ含有する。このフラグメント中には１３５
ｂｐの糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）および１４２
５ｂｐからなる糖タン・々り質４１（ｇｐ４１）の全部
が包含される。
．４３ ｋｂ ＨＴＬＶＩ［ＩＤＮＡ ７ラグメントの
調製（ＩＩＩＴＬＶエンベロープポリタン−ぐり質遺伝
子コーティング領域の部分） １１１’Ｉ’ＬＶ Ｉｌｌ ＤＮＡの完全なヌクレオチ
ド配列はＲａｔｎｅｒ氏他のｒＮａｔｕｒｅＪ３１３：
２７７＝２８４（１９８５）に示されている。プラスミ
ドｐＬＯＲｏにより）ＩＴＬＶ ＩＩＩヌクレオチド源
が提供されているが、どの源でも適当であろう。］）Ｌ
ＯＲＯはｂｐ７１９６〜ｂｐ ８６２１のＨＴＬＶエン
ベロープポリタンノ臂り質遺伝子コーティング領域のフ
ラグメントヲ含有する。このフラグメント中には１３５
ｂｐの糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）および１４２
５ｂｐからなる糖タン・々り質４１（ｇｐ４１）の全部
が包含される。
λＢＲ１０からＢｇｌ ＩＩ消化により得られたＨＴＬ
Ｖ ｍフラグメントをプラスミドｐＥＸＣの独特のＢｇ
ｌ ［部位中にクローンしてｐＬＯＲｏ−１を形成させ
た。
Ｖ ｍフラグメントをプラスミドｐＥＸＣの独特のＢｇ
ｌ ［部位中にクローンしてｐＬＯＲｏ−１を形成させ
た。
ｐＥＸＣはｐΔＲＯＰからのＰｓｔ Ｉ−Ｂｇｌ ｎ
７５グメントおよびｐＫＧＰ ３６．ｔｒｐからのＰｓ
ｔ ｌ フラグメントを結合させることにより構成され
た。ｐΔＲＯＰはＢｇｌ ■リンカーがＰｖｕ１部位中
に挿入されたｐＢＲ３２２の誘導体である。ｐＫＯＰ３
６．ｔｒｐを生成させるには、トリプトファン（ｔｒｐ
）プロモーター−オペレーターおよび、Ｃｈｒｉｓｔｉ
ｅ氏他の「Ｊ。
７５グメントおよびｐＫＧＰ ３６．ｔｒｐからのＰｓ
ｔ ｌ フラグメントを結合させることにより構成され
た。ｐΔＲＯＰはＢｇｌ ■リンカーがＰｖｕ１部位中
に挿入されたｐＢＲ３２２の誘導体である。ｐＫＯＰ３
６．ｔｒｐを生成させるには、トリプトファン（ｔｒｐ
）プロモーター−オペレーターおよび、Ｃｈｒｉｓｔｉ
ｅ氏他の「Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 Ｊ １４５：３３５〜３４１（１
９８０）記載のようにしてｐＬＤ １０２から誘導され
るシャインーダルガルノ配列をプラスミドｐＢＲ３２２
のＣ１ａ １部位中に挿入した。
９８０）記載のようにしてｐＬＤ １０２から誘導され
るシャインーダルガルノ配列をプラスミドｐＢＲ３２２
のＣ１ａ １部位中に挿入した。
次ＶｃｐＬＯＲｏ−Ｉ ＤＮＡ （１，２ｔｔｆ ）の
３部分（４ｏｏμｚずつ）をＢｇｌ Ｉｆ １００単位
を用いて３７℃で６時間消化した。ＤＮＡ ｔ’エタノ
ールの添加により沈澱させ、ＴＥ緩衝液（１０間トリス
−ＨＣｔ（ＰＨ“１８）、１ｆｌジナトリウムＥＤＴＡ
）２０μｌ中に再懸濁し、そしてＩ１８慢アガロース／
ＴＢＥ緩衝液ゲル上３０＆ルトで約１６時間電気泳動
した。
３部分（４ｏｏμｚずつ）をＢｇｌ Ｉｆ １００単位
を用いて３７℃で６時間消化した。ＤＮＡ ｔ’エタノ
ールの添加により沈澱させ、ＴＥ緩衝液（１０間トリス
−ＨＣｔ（ＰＨ“１８）、１ｆｌジナトリウムＥＤＴＡ
）２０μｌ中に再懸濁し、そしてＩ１８慢アガロース／
ＴＢＥ緩衝液ゲル上３０＆ルトで約１６時間電気泳動
した。
ＴＢＥ 紗衝液は５０ｍＭトリス−ＴＩＣｌ （ｐＨ１
！ ） 、５０鮨ホウ醗塩および２．５ｍＭノナトリウ
ムＥＤ’ｒＡからなる。ゲルをエチジウムプロマイｒ（
１μｆ／１ｈｌ）溶液中に浸漬することにより染色した
。ＤＮＡのパンＰをＵｖ光線により可視化した。１．４
３ｋｂのパンｙｔ−ゲルから切り出し、ゲルと会合して
いるＤＮＡの７ラグメントを７．５ Ｍ酢酸アンモニウ
ム中に１００ゴルトで２０全問電気溶出（ｅｌｅｃｔｒ
ｏ−６１ｕｔｉｏｎ ）させることにより回収した。Ｂ
ｇｌ Ｉｌｌ、 ４３ ｋｂ ＨＴＬＶＴ［ｔ ＤＮＡ
７ ラグメントを２．５容量のエタノールの添加によ
り沈澱させそしてＴＥ緩衝液１５μを中に再懸濁した。
！ ） 、５０鮨ホウ醗塩および２．５ｍＭノナトリウ
ムＥＤ’ｒＡからなる。ゲルをエチジウムプロマイｒ（
１μｆ／１ｈｌ）溶液中に浸漬することにより染色した
。ＤＮＡのパンＰをＵｖ光線により可視化した。１．４
３ｋｂのパンｙｔ−ゲルから切り出し、ゲルと会合して
いるＤＮＡの７ラグメントを７．５ Ｍ酢酸アンモニウ
ム中に１００ゴルトで２０全問電気溶出（ｅｌｅｃｔｒ
ｏ−６１ｕｔｉｏｎ ）させることにより回収した。Ｂ
ｇｌ Ｉｌｌ、 ４３ ｋｂ ＨＴＬＶＴ［ｔ ＤＮＡ
７ ラグメントを２．５容量のエタノールの添加によ
り沈澱させそしてＴＥ緩衝液１５μを中に再懸濁した。
ｌ Ｂｇｌ ＩＩ １．４３ ｋｂ ＥＴＬＶｌｌｌ
ＤＮＡ７ ラクメ７ ）とキナーゼ化されたＳａｃ
Ｉ／Ｂｇｌ ｎリンカ−との連結 キナーゼ化されたＳａｃ Ｉ／Ｂｇｌ ｎリンカ−を以
下のようにしてＥＴＬＶ ｌｌｌ７ラグメントに連結し
た。
ＤＮＡ７ ラクメ７ ）とキナーゼ化されたＳａｃ
Ｉ／Ｂｇｌ ｎリンカ−との連結 キナーゼ化されたＳａｃ Ｉ／Ｂｇｌ ｎリンカ−を以
下のようにしてＥＴＬＶ ｌｌｌ７ラグメントに連結し
た。
下記のものを適当な反応容器中に加える。
ＴＥ緩衝液中のＤＮＡ ７ラグメント
１５μｔ（前記２項記載〕 牛血清アルブミン） １０ ｍＭ ＡＴＰ％ＰＩ（７，０６ｔｔ１４０チポリ
エチレングリコール、 ２２．５μを
分子量サイズ８０００ キナーゼ化リンカ−５μを 水
５μｔＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＥＲＬｌ １雁位）
１μｔこの混合物を約１６時間インキュベー
ションし、生成するＤＮＡをエタノールで沈澱させそし
てＴＥ緩衝液１０μを中に再懸濁させた。次にＤＮＡｆ
：１００単位のＳａｃ Ｉを用いｍ ′ｆｆｋ１００
μＬにて３７℃で３時間消化した。生成するＨＴＬＶ
［１−リンカ−ＤＮＡフラグメントをエタノールで沈澱
させそしてＴＥ緩衝液１０μを中に再懸濁させた。この
フラグメントは第６図（Ｄ）に示される。
１５μｔ（前記２項記載〕 牛血清アルブミン） １０ ｍＭ ＡＴＰ％ＰＩ（７，０６ｔｔ１４０チポリ
エチレングリコール、 ２２．５μを
分子量サイズ８０００ キナーゼ化リンカ−５μを 水
５μｔＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＥＲＬｌ １雁位）
１μｔこの混合物を約１６時間インキュベー
ションし、生成するＤＮＡをエタノールで沈澱させそし
てＴＥ緩衝液１０μを中に再懸濁させた。次にＤＮＡｆ
：１００単位のＳａｃ Ｉを用いｍ ′ｆｆｋ１００
μＬにて３７℃で３時間消化した。生成するＨＴＬＶ
［１−リンカ−ＤＮＡフラグメントをエタノールで沈澱
させそしてＴＥ緩衝液１０μを中に再懸濁させた。この
フラグメントは第６図（Ｄ）に示される。
４．ｐＡＬＭ２とＥＴＬＶ ■−リンカー ＤＮＡ ７
５グメントを連結してｐＡＬＭ ２４の生成 適当な反応容器中に下記のものを添加した。
５グメントを連結してｐＡＬＭ ２４の生成 適当な反応容器中に下記のものを添加した。
Ｓａｃ Ｉ消化ｐＡＬＭ ２ （（ＬＯ７μｆ）、
Ｑ、２ ｌｉｔ水
２．３μｔ１０×りが−
ゼ緩漬液 １ μｔ１０ｍＭ Ａ
ＴＰ、 ｐ）１７．０ １ ｔ
ｉｔこの混合物を１２℃で２日間インキュペーショ／シ
た。ｐＡｌ、、Ｍ ２のｇＩ１１部分中ヘノＨＴＬｖｍ
−リンカ−フラグメントの挿入地点が第６図ｆｉｌに示
されている。
Ｑ、２ ｌｉｔ水
２．３μｔ１０×りが−
ゼ緩漬液 １ μｔ１０ｍＭ Ａ
ＴＰ、 ｐ）１７．０ １ ｔ
ｉｔこの混合物を１２℃で２日間インキュペーショ／シ
た。ｐＡｌ、、Ｍ ２のｇＩ１１部分中ヘノＨＴＬｖｍ
−リンカ−フラグメントの挿入地点が第６図ｆｉｌに示
されている。
５ 発現プラスミドｐＡＬＭ ２４の選択コンピテント
な大腸菌株ＮＦ １８２９の２００μｔを、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ氏他のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
。
な大腸菌株ＮＦ １８２９の２００μｔを、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ氏他のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
。
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｊ Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
％Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ％Ｎ、Ｙ、（
１９８２）記載の形質転換操作の下に前記４項記載のｐ
ＡＬＭ２４混合物５μｔと混合した。形質転換された細
菌の一部分をアンピシリン（２５μｔ７ｔｎｔ ） １
含有するＬ−寒天プレート上に塗布した。接種されたプ
レートを３７℃で約１６時間インキュベーションした。
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
％Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ％Ｎ、Ｙ、（
１９８２）記載の形質転換操作の下に前記４項記載のｐ
ＡＬＭ２４混合物５μｔと混合した。形質転換された細
菌の一部分をアンピシリン（２５μｔ７ｔｎｔ ） １
含有するＬ−寒天プレート上に塗布した。接種されたプ
レートを３７℃で約１６時間インキュベーションした。
生成する形質転換細胞をＬＢ−アンピシリン（１００μ
２７コ）を含有する寒天含有イトリ皿に再塗布した。プ
ラスミｙ ＤＮＡは単離され、クローンされ形質転換さ
れた細菌の培養液から調製された。このプラスミドはｐ
ＡＬＭ ２４ ′（第６図Ｅ）と表示される。
２７コ）を含有する寒天含有イトリ皿に再塗布した。プ
ラスミｙ ＤＮＡは単離され、クローンされ形質転換さ
れた細菌の培養液から調製された。このプラスミドはｐ
ＡＬＭ ２４ ′（第６図Ｅ）と表示される。
１、、 ｐＡＬＭ２４構成物の分析
ｐＡＬν２４からのＤＮＡ （２０μｔ）全８ｓｔ Ｉ
３０単位を用い合計１００μｔにおいて３７℃で２時
間消化した。生成するＤＮＡ ｆ：エタノールで沈澱さ
せ、ＴＥ ｉｆ）漬液１０μを中に再懸濁させ、そして
１１８ｑＩＩアがロース／ ＴＢＥゲルで６０デルトで
約１６時間電気泳動した。このゲルを前記したようにし
てエチジウムプロマイＰで染色しそしてＤＮＡの１．４
３ｋｂバンド（ＨＴＬＶ［ｌ ＤＮＡ−リンカ−フラグ
メント）の存在について立証し念。クロー／されたフラ
グメントの方向はプラスミＰＤＮＡ ２０ ｌｉｔをＨ
ｌｎｄＩＩｌ ４０単位を用い総１ｔ１００μｔにおい
て３７℃で２時間消化することにより検査した。ＤＮＡ
をエタ、ノールで沈澱させ、ＴＥ緩＠ｇ２０μを中に再
懸濁させそして前記したようにして電気泳動した。１ｏ
００ｂｐｆｆｉ有するＤＮＡのパンｒが存在することは
、クローンされたフラグメントが正しい方向にあること
およびその構底が完全であることを示している。
３０単位を用い合計１００μｔにおいて３７℃で２時
間消化した。生成するＤＮＡ ｆ：エタノールで沈澱さ
せ、ＴＥ ｉｆ）漬液１０μを中に再懸濁させ、そして
１１８ｑＩＩアがロース／ ＴＢＥゲルで６０デルトで
約１６時間電気泳動した。このゲルを前記したようにし
てエチジウムプロマイＰで染色しそしてＤＮＡの１．４
３ｋｂバンド（ＨＴＬＶ［ｌ ＤＮＡ−リンカ−フラグ
メント）の存在について立証し念。クロー／されたフラ
グメントの方向はプラスミＰＤＮＡ ２０ ｌｉｔをＨ
ｌｎｄＩＩｌ ４０単位を用い総１ｔ１００μｔにおい
て３７℃で２時間消化することにより検査した。ＤＮＡ
をエタ、ノールで沈澱させ、ＴＥ緩＠ｇ２０μを中に再
懸濁させそして前記したようにして電気泳動した。１ｏ
００ｂｐｆｆｉ有するＤＮＡのパンｒが存在することは
、クローンされたフラグメントが正しい方向にあること
およびその構底が完全であることを示している。
７、 ｆｆｉ換えＰＲＶ−２４の生成組換えＰＲＶ−
２４は、ＰＫ１５細胞のトランスフェクションに使用さ
れるＤＮＡ源がＮｅｏ Ｉで切断されたｐＡＬＭ ２４
と親ＰＲＶとから得られる以外はＰＲＶ−２およびＰＲ
Ｖ−１０の生成について前記したのと実質上同様の方法
で調製された。組換えウィルスは前記したようにモルモ
ット補体およびＭｌおよびＭ１６モノクローナル抗体の
存在下に感染培養物をインキュベーションすることによ
り富化された。組換えウィルスは前記した黒色プラーク
選択法により選択した。出現した合計約１８０００個の
プラーク（白および黒）から約４個の白色プラークが選
択された。得られた白色プラークの一つを次ｒｌｃ２回
の逐次的な単一プラーク単離により精表しそして生育さ
せてウィルスストックＰＲＶ−２４とした。
２４は、ＰＫ１５細胞のトランスフェクションに使用さ
れるＤＮＡ源がＮｅｏ Ｉで切断されたｐＡＬＭ ２４
と親ＰＲＶとから得られる以外はＰＲＶ−２およびＰＲ
Ｖ−１０の生成について前記したのと実質上同様の方法
で調製された。組換えウィルスは前記したようにモルモ
ット補体およびＭｌおよびＭ１６モノクローナル抗体の
存在下に感染培養物をインキュベーションすることによ
り富化された。組換えウィルスは前記した黒色プラーク
選択法により選択した。出現した合計約１８０００個の
プラーク（白および黒）から約４個の白色プラークが選
択された。得られた白色プラークの一つを次ｒｌｃ２回
の逐次的な単一プラーク単離により精表しそして生育さ
せてウィルスストックＰＲＶ−２４とした。
ａ ＨＴＬＶＩ［ｌに対する抗体と反応性である抗原
部位を有するＰＲＶ−２４ｇｌＩＩ／ＨＴＬＶ Ｉｆｆ
融合ｐ ７ ノｆり質の生産 ＰＲＶ−２４がＨ’ｒＬＶ Ｉグリコジル化抗原を含有
および発現することを証明するために、ＰＲＶ−２４な
らびにＰＲＶ−２オよびＰＲＶ Ｘｔ−α５ｍＣ１の５
Ｈ−グルコサミンの存在下にＰＫ１５細胞中で別々に生
育させた。感染１６時間後、細胞を燐醸塩緩衝された食
塩水中にかきおとし、そして遠心分離により集めた。感
染した細胞を、フェニルメチルスルホニルフルオライド
を１００μ紗１の濃度で含有するＲＩＰＡ緩衝液（１５
０ｍＭ ＮａＣ２１１０ｍＭト リ ス （ＰＨ７，９
） 、 １ タロ ト リ ト ｙ （Ｔｒｉｔ
ｏｎ） Ｘｌ ００．１嗟デオキシコレート、α１チド
デシル硫酸ナトリウム）中に懸濁することにより溶菌さ
せた。
部位を有するＰＲＶ−２４ｇｌＩＩ／ＨＴＬＶ Ｉｆｆ
融合ｐ ７ ノｆり質の生産 ＰＲＶ−２４がＨ’ｒＬＶ Ｉグリコジル化抗原を含有
および発現することを証明するために、ＰＲＶ−２４な
らびにＰＲＶ−２オよびＰＲＶ Ｘｔ−α５ｍＣ１の５
Ｈ−グルコサミンの存在下にＰＫ１５細胞中で別々に生
育させた。感染１６時間後、細胞を燐醸塩緩衝された食
塩水中にかきおとし、そして遠心分離により集めた。感
染した細胞を、フェニルメチルスルホニルフルオライド
を１００μ紗１の濃度で含有するＲＩＰＡ緩衝液（１５
０ｍＭ ＮａＣ２１１０ｍＭト リ ス （ＰＨ７，９
） 、 １ タロ ト リ ト ｙ （Ｔｒｉｔ
ｏｎ） Ｘｌ ００．１嗟デオキシコレート、α１チド
デシル硫酸ナトリウム）中に懸濁することにより溶菌さ
せた。
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘｌ ００は米国ミズーリ州セントルイ
スのＳｉｇＩＩＩａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社から得られる
。溶菌した細胞および懸濁液体を１０ＣＬＯＯＯＸｆで
３０分間遠心分離した。各試料から得られる上澄み液４
００μｔに別々の管中において４９０血清（ｐＡＬＭ３
により発現されたｅｒａ −ＰＲＶ ｇＩＩＩ融融合タ
ンノン質に対しウサギにおいて生成された、Ｐｌ”ｔＶ
のｇＩ［Ｉタンパク質に対するポリクローナル抗血清）
２０μｔ１ｇｐ１２０およびｇｐ４１遺伝子の部分を含
有する、Ｒａｔｎｅｒ氏他のｒＮａｔｕｒｅ Ｊ３１３
：２７７〜２８４（１９８５）記載の、ｂｐ ７１９８
〜８０５２ ノＨＴＬＶ ｍ遺伝子のＢｇｌ ｌ〜Ｂａ
ｍＥＩフラグメントにより生産されるタンノリ１に対す
る抗血清（抗ＨＴＬＶ ｉｌｌ血清）１０μｔ１および
Ｍ２抗体（ＰＲＶ糖タンパク質のｇ■族に対する抗体）
２０μｌｆ加えた。この混合物を氷上９０分間インキュ
ベートした。
スのＳｉｇＩＩＩａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社から得られる
。溶菌した細胞および懸濁液体を１０ＣＬＯＯＯＸｆで
３０分間遠心分離した。各試料から得られる上澄み液４
００μｔに別々の管中において４９０血清（ｐＡＬＭ３
により発現されたｅｒａ −ＰＲＶ ｇＩＩＩ融融合タ
ンノン質に対しウサギにおいて生成された、Ｐｌ”ｔＶ
のｇＩ［Ｉタンパク質に対するポリクローナル抗血清）
２０μｔ１ｇｐ１２０およびｇｐ４１遺伝子の部分を含
有する、Ｒａｔｎｅｒ氏他のｒＮａｔｕｒｅ Ｊ３１３
：２７７〜２８４（１９８５）記載の、ｂｐ ７１９８
〜８０５２ ノＨＴＬＶ ｍ遺伝子のＢｇｌ ｌ〜Ｂａ
ｍＥＩフラグメントにより生産されるタンノリ１に対す
る抗血清（抗ＨＴＬＶ ｉｌｌ血清）１０μｔ１および
Ｍ２抗体（ＰＲＶ糖タンパク質のｇ■族に対する抗体）
２０μｌｆ加えた。この混合物を氷上９０分間インキュ
ベートした。
それぞれに５ｔａｐｈ Ａ （各抗体容量×５）を加え
、続いて氷上１５分間インキュベーションした。
、続いて氷上１５分間インキュベーションした。
次にこの混合物を緩衝液Ｂ （１２０ｍＭＮａＣ２１５
０ｍＭ）リス（ｐＨａｏ）、およびＳｌｇＩＩＩａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａ１社の（Ｌ ５ ％ Ｎｏｎ１ｄｅｔ Ｐ
２Ｏ）、次にＩＭ Ｌｉｃｔを含有する緩衝液Ｂそして
終りに再び緩衝液Ｂで洗った。遠心分離により得られる
ペレット状となった５ｔａｐｈ Ａを各工程で集めた０
回収されたペレット状とされた５ｔａｐｈ Ａを５８（
３チドデシル硫酸ナトリウム、７００ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、１０ｍＭ ）リス緩衝液（Ｐｉ−１＆８
）、１チグリセリン＋ブロモフエノールブルー）２５
μを中に再懸濁させそして２分間沸騰させた。
０ｍＭ）リス（ｐＨａｏ）、およびＳｌｇＩＩＩａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａ１社の（Ｌ ５ ％ Ｎｏｎ１ｄｅｔ Ｐ
２Ｏ）、次にＩＭ Ｌｉｃｔを含有する緩衝液Ｂそして
終りに再び緩衝液Ｂで洗った。遠心分離により得られる
ペレット状となった５ｔａｐｈ Ａを各工程で集めた０
回収されたペレット状とされた５ｔａｐｈ Ａを５８（
３チドデシル硫酸ナトリウム、７００ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、１０ｍＭ ）リス緩衝液（Ｐｉ−１＆８
）、１チグリセリン＋ブロモフエノールブルー）２５
μを中に再懸濁させそして２分間沸騰させた。
この５ｔａｐｈ Ａ ｋ遠心分離によりペレット状とな
しそして次に上澄みを１０係ポリアクリルアミド／ＳＤ
８ゲル上で電気泳動した。次にこのゲルをメタノール／
酢醗中で固定し、Ｈ２Ｃ中で２回洗い、そして次に１Ｍ
サリチル酸ナトリウム中３０分間処理した。ゲルを乾燥
させ、増感紙を用いてコダックＸＡＲ５フルオライド週
間露元させた。
しそして次に上澄みを１０係ポリアクリルアミド／ＳＤ
８ゲル上で電気泳動した。次にこのゲルをメタノール／
酢醗中で固定し、Ｈ２Ｃ中で２回洗い、そして次に１Ｍ
サリチル酸ナトリウム中３０分間処理した。ゲルを乾燥
させ、増感紙を用いてコダックＸＡＲ５フルオライド週
間露元させた。
第７図に示されるように、約１０５．０００および８
Ｑ、ＯＯＯキロダルトンの特異的な糖タンパク質がＰＲ
Ｖ−２４ノ溶解物から血清４９ｏオヨヒ抗ＨＴＬｖＩＩ
Ｉ血清の両方により沈澱された。これらのタンパク質は
親ＰＲＶウィルスの溶解物から血清４９０によっては沈
澱されないが、しかしこの血清は９λ０００および７４
，０００の見かけの分子ｉｔヲ有するｇＩＩＩ特異的タ
ン／ｌり質を免疫沈澱させた。抗ＥＴＬＶ ＩＩ！血清
は親ＰＲＶ溶解物からいずれのタンパク質も沈澱させる
ことはできなかった。このことはＰＲＶ−２４がｇＩＩ
ＩおよびＨＴＬＶ ＩＩＩ ＶＣ対すル抗体の両方に対
し反応性である抗原部位を有するＰＲＶ ｇＩ［Ｉ／Ｈ
ＴＬＶ ＩＩＩ融合タンパク質を生成することを示して
いる。
Ｑ、ＯＯＯキロダルトンの特異的な糖タンパク質がＰＲ
Ｖ−２４ノ溶解物から血清４９ｏオヨヒ抗ＨＴＬｖＩＩ
Ｉ血清の両方により沈澱された。これらのタンパク質は
親ＰＲＶウィルスの溶解物から血清４９０によっては沈
澱されないが、しかしこの血清は９λ０００および７４
，０００の見かけの分子ｉｔヲ有するｇＩＩＩ特異的タ
ン／ｌり質を免疫沈澱させた。抗ＥＴＬＶ ＩＩ！血清
は親ＰＲＶ溶解物からいずれのタンパク質も沈澱させる
ことはできなかった。このことはＰＲＶ−２４がｇＩＩ
ＩおよびＨＴＬＶ ＩＩＩ ＶＣ対すル抗体の両方に対
し反応性である抗原部位を有するＰＲＶ ｇＩ［Ｉ／Ｈ
ＴＬＶ ＩＩＩ融合タンパク質を生成することを示して
いる。
９、ＰＲＶ −２４ゲノムの分析
さらに、ＰＲＶ −２４はＨＴＬＶ ［１ｅｎｖ遺伝子
の部分をコードするＤＮＡ配列を含有していることが示
された。ＤＮＡを前記の如く親ＰＲＶ、ＰＲＶ−２およ
びＰＲＶ −２４のピリオンから単離した。各ＤＮＡ（
６μｙ）４Ｐｓｔｌで消化した。この消化したＤＮＡを
ＴＥＡ中の１俤アがロースＴＥＡ （）リス、ＥＤＴＡ
、酢酸ナトリウム）ゲル３個２組中で電気泳動した。
の部分をコードするＤＮＡ配列を含有していることが示
された。ＤＮＡを前記の如く親ＰＲＶ、ＰＲＶ−２およ
びＰＲＶ −２４のピリオンから単離した。各ＤＮＡ（
６μｙ）４Ｐｓｔｌで消化した。この消化したＤＮＡを
ＴＥＡ中の１俤アがロースＴＥＡ （）リス、ＥＤＴＡ
、酢酸ナトリウム）ゲル３個２組中で電気泳動した。
先に記載したよ５にしてサデン・プロット法により分析
した。ＤＮＡ ｉニトロセルロースに移したのち、この
ニトロセルロース’ｔ−半分に切断して２個の同じプロ
ットを得た。一方のプロットｋ ｇ［ｌＩ特異的プロー
ブであるｐＡＬＭｌ５と−イブリツド形成させた。もう
一方のプロットを、Ｒａｔｎｅｒ氏他ｒ Ｎａｔｕｒｅ
Ｊ ３１３ ：２７７〜２８４（１９８５）に記載さ
れるＥＴＬＶ ＩＩＩ特異的なプローｆテ６ルＨＴＬＶ
Ｉ［Ｉグ／ Ａ ）ｂｐ ５９２８〜８５９６ Ｋｐｎ
１７ラグメントとノ〜イゾリツド形成させた。このプ
ロットを増感紙を用い一７０℃で２日間コダックＸＡＲ
フィルムに露光させた。その結果を第８図に示す。プロ
ーブとしてｇＩＩＩｔ−用いるプロットのオートラジオ
ダラムではａ３ｋｂｆｔ有するＰＲＶ−２４ＤＮＡ種へ
のＩ〜イプリツＰ形成が示された。このＤＮＡ Ｗｉは
親ＰＲＶ ＤＮＡより１ ｋｌ）大きくセしてＰＲＶ−
２ＤＮＡより１．４ｋｂ大きい。このことは挿入された
）ＩＴＬＶＩｌＩＤＮＡ配列の予想されるフラグメント
寸法に一致する。より重要なことに、１１ｉＴＬＶ ｉ
ｌｌプローブのみを用いる第２のプロットはＰＲＶ−２
４レーン中にａ３ｋｂ種への特異的な−イブリツド形成
を示した。親ＰＲＶまたはＰＲＶ−２の ゛いずれＫ
も何ら特異的なノ・イブリッド形成は見られなかった。
した。ＤＮＡ ｉニトロセルロースに移したのち、この
ニトロセルロース’ｔ−半分に切断して２個の同じプロ
ットを得た。一方のプロットｋ ｇ［ｌＩ特異的プロー
ブであるｐＡＬＭｌ５と−イブリツド形成させた。もう
一方のプロットを、Ｒａｔｎｅｒ氏他ｒ Ｎａｔｕｒｅ
Ｊ ３１３ ：２７７〜２８４（１９８５）に記載さ
れるＥＴＬＶ ＩＩＩ特異的なプローｆテ６ルＨＴＬＶ
Ｉ［Ｉグ／ Ａ ）ｂｐ ５９２８〜８５９６ Ｋｐｎ
１７ラグメントとノ〜イゾリツド形成させた。このプ
ロットを増感紙を用い一７０℃で２日間コダックＸＡＲ
フィルムに露光させた。その結果を第８図に示す。プロ
ーブとしてｇＩＩＩｔ−用いるプロットのオートラジオ
ダラムではａ３ｋｂｆｔ有するＰＲＶ−２４ＤＮＡ種へ
のＩ〜イプリツＰ形成が示された。このＤＮＡ Ｗｉは
親ＰＲＶ ＤＮＡより１ ｋｌ）大きくセしてＰＲＶ−
２ＤＮＡより１．４ｋｂ大きい。このことは挿入された
）ＩＴＬＶＩｌＩＤＮＡ配列の予想されるフラグメント
寸法に一致する。より重要なことに、１１ｉＴＬＶ ｉ
ｌｌプローブのみを用いる第２のプロットはＰＲＶ−２
４レーン中にａ３ｋｂ種への特異的な−イブリツド形成
を示した。親ＰＲＶまたはＰＲＶ−２の ゛いずれＫ
も何ら特異的なノ・イブリッド形成は見られなかった。
このことはＰＦｔＶ −２４がｇＩＩＩココ−ィング配
列と共に挿入されたＨＴＬＶ ｍエンベロープ配列を含
有することを示している。
列と共に挿入されたＨＴＬＶ ｍエンベロープ配列を含
有することを示している。
実施例 ２
ＥｃｏＲＩ部位を含有する組換えＰＲＶの構成ｔ ｐ
ＡＬＭｌの生成 この実施例はｐＡＬＭ２のＳａｃ Ｉ制限ひ素部位に新
規なＥｃｏＲＩ制限は累部位を挿入してプラスミドｐＡ
ＬＭ１を生成させることＫついて説明する。
ＡＬＭｌの生成 この実施例はｐＡＬＭ２のＳａｃ Ｉ制限ひ素部位に新
規なＥｃｏＲＩ制限は累部位を挿入してプラスミドｐＡ
ＬＭ１を生成させることＫついて説明する。
これらの実験は、ＰＲＶがそのＤＮＡゲノム中に何らＥ
ｃｏＲＩ部位を有しないが、ＥｃｏＲＩ部位の存在はｆ
ｆｉ織培養におけるウィルス生育にとって有害でないこ
とを示している。さらにこの実施例は、外来遺伝子を次
にＰＲＶ中に移すための好都合なＥｃｏＲＩ含有ベクタ
ーとしてのプラスミドｐＡＬＭ１のｖｊｌ製および使用
についても示す。
ｃｏＲＩ部位を有しないが、ＥｃｏＲＩ部位の存在はｆ
ｆｉ織培養におけるウィルス生育にとって有害でないこ
とを示している。さらにこの実施例は、外来遺伝子を次
にＰＲＶ中に移すための好都合なＥｃｏＲＩ含有ベクタ
ーとしてのプラスミドｐＡＬＭ１のｖｊｌ製および使用
についても示す。
ｇＩＩＩ遺伝子のＳａｃ １部位中に独特のＥｃｏＲＩ
部位を有するベクター全調製するためには、ｐＡＬＭ２
からそのＥｃｏＲＩ部位をはじめに除くことが必要であ
った（第９図参照）。従って、ｐＡＬＭ２をＥｃｏＲＩ
を用い３７℃で６０分間消化した。
部位を有するベクター全調製するためには、ｐＡＬＭ２
からそのＥｃｏＲＩ部位をはじめに除くことが必要であ
った（第９図参照）。従って、ｐＡＬＭ２をＥｃｏＲＩ
を用い３７℃で６０分間消化した。
次にこの反応混合物をＤＮＡの末端を充填するためのす
べての４１１のデオキシリボヌクレオチドの存在下にＤ
ＮＡポリメラーゼ■のクレノクフラグメントとインキ３
−イークヨンした。得られるＤＮＡのプラントエンドを
再び結合させた。何らＥｃｏＲＩ部位を有しないｐＡＬ
Ｍ２のこの誘導体はｐＡＬＭ７と呼ばれる。ｐＡＬＭ７
ＤＮＡをＳａｃ ｌを用い３７℃で６０分間消化した
。５’ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ ３’からなるポリヌ
クレオチドリンカーフ２グメントは、標準的なホスホル
アオダイト化学を用いＡｐｐｌｉｅａＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ ＤＮＡ合成器で合成しそして逆相高性能液体クロマ
トグラフィーにより精製した。とのり７カーＤＮＡを６
８℃で融解させ、再び徐々にアニーリングさせそして次
ＫＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて燐酸化した。
べての４１１のデオキシリボヌクレオチドの存在下にＤ
ＮＡポリメラーゼ■のクレノクフラグメントとインキ３
−イークヨンした。得られるＤＮＡのプラントエンドを
再び結合させた。何らＥｃｏＲＩ部位を有しないｐＡＬ
Ｍ２のこの誘導体はｐＡＬＭ７と呼ばれる。ｐＡＬＭ７
ＤＮＡをＳａｃ ｌを用い３７℃で６０分間消化した
。５’ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ ３’からなるポリヌ
クレオチドリンカーフ２グメントは、標準的なホスホル
アオダイト化学を用いＡｐｐｌｉｅａＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ ＤＮＡ合成器で合成しそして逆相高性能液体クロマ
トグラフィーにより精製した。とのり７カーＤＮＡを６
８℃で融解させ、再び徐々にアニーリングさせそして次
ＫＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて燐酸化した。
次にこの燐酸化したリンカ−をＴ ４ ＤＮＡリガーゼ
を用いてＳａｃ ｌ消化ｐＡＬＭ７ ＤＮＡ中に連結し
て、第１０図に示されるｐＡＬＭｌを生成させ念。ｐＡ
Ｌｈイ１の構造は制限酵素およびＤＮＡ配列分析により
証明された。このリンカ−は間隔配置によυ示されるよ
うに先端が切られたｇＩＩＩタンパク質の読み枠を保持
しておシ（第１０図参照）、そしてま九Ｓａｃ １部位
によシはさまれたＥｃｏＲ１部位を導入する。このリン
カ−は先端が切られた２■タン、Ｊり質に４個の余分の
アミノ酸を付加する。とのものはｐＡＬＭ１プラスミド
を担持する大腸菌を誘導させると、予想される融合タン
パク質を生成し念。
を用いてＳａｃ ｌ消化ｐＡＬＭ７ ＤＮＡ中に連結し
て、第１０図に示されるｐＡＬＭｌを生成させ念。ｐＡ
Ｌｈイ１の構造は制限酵素およびＤＮＡ配列分析により
証明された。このリンカ−は間隔配置によυ示されるよ
うに先端が切られたｇＩＩＩタンパク質の読み枠を保持
しておシ（第１０図参照）、そしてま九Ｓａｃ １部位
によシはさまれたＥｃｏＲ１部位を導入する。このリン
カ−は先端が切られた２■タン、Ｊり質に４個の余分の
アミノ酸を付加する。とのものはｐＡＬＭ１プラスミド
を担持する大腸菌を誘導させると、予想される融合タン
パク質を生成し念。
２ 組換えＰＲＶ −１の生成
ＰＲ”／がＥｃｏＲＩ部位を受容しうろことを証明する
ために、ＰＲＶ−２について前記したようにしてＰＸ１
５細胞を親ＰＲＶ ＤＮＡ オよびｐＡＬＭＩ ＤＮＡ
を用いて同時トランスフェクションさせるととによルＥ
ｃｏＲＩ部位を有するＰＲＶを生成させた。ｇ［ｌ遺伝
子生成物に欠けるウィルスを選択し、単離し、そしてま
た同じ方法で特徴をしらべた。かかる単離物の一つはＰ
ＲＶ−１と表示された。ＰＲＶ−１を次に組織培養液中
で生育させた。ＥｃｏＲＩ部位のウィルス複製に及ぼす
有害な作用は何ら観察されなかった。
ために、ＰＲＶ−２について前記したようにしてＰＸ１
５細胞を親ＰＲＶ ＤＮＡ オよびｐＡＬＭＩ ＤＮＡ
を用いて同時トランスフェクションさせるととによルＥ
ｃｏＲＩ部位を有するＰＲＶを生成させた。ｇ［ｌ遺伝
子生成物に欠けるウィルスを選択し、単離し、そしてま
た同じ方法で特徴をしらべた。かかる単離物の一つはＰ
ＲＶ−１と表示された。ＰＲＶ−１を次に組織培養液中
で生育させた。ＥｃｏＲＩ部位のウィルス複製に及ぼす
有害な作用は何ら観察されなかった。
実施例 ３
β−ガラクトシダーゼをコーディングする大腸菌遺伝子
を含有する組換えＰＲＶの構成この実施例はβ−ガラク
トシダーゼをコーディングする大腸菌遺伝子（ｌａｃｚ
遺伝子）およびｇＩＩＩ遺伝子のハイブリットの構成、
および通常はグリコジル化されない遺伝子産物を含有す
る融合タンパク質の発現およびグリコジル化について説
明する。さらに、この実施例はｇＩＩＩ遺伝子中に操作
され＆ ＥｃｏＲＩ部位の使用についても示す。
を含有する組換えＰＲＶの構成この実施例はβ−ガラク
トシダーゼをコーディングする大腸菌遺伝子（ｌａｃｚ
遺伝子）およびｇＩＩＩ遺伝子のハイブリットの構成、
および通常はグリコジル化されない遺伝子産物を含有す
る融合タンパク質の発現およびグリコジル化について説
明する。さらに、この実施例はｇＩＩＩ遺伝子中に操作
され＆ ＥｃｏＲＩ部位の使用についても示す。
ｔ ｐｃＬ１４０７の生成
ｐＡＬＭＩ ＤＮＡは実施例２に記載されるように合成
ＥｃｏＲ１部位を有する先端の切れ−ｈｇＩＩＩ遺伝子
を含有する。１ａｃＺ ＤＮＡ配列の源は大腸菌由来の
プラスミドｐＭＬＢｊＱ３４であシ、°このプラスミド
は１ａｃｚコ一デイング配列の始めに独特のＥｃｏＲ１
部位を含有するものである。ｐＭＬＢ１０３４はＴ、Ｊ
。
ＥｃｏＲ１部位を有する先端の切れ−ｈｇＩＩＩ遺伝子
を含有する。１ａｃＺ ＤＮＡ配列の源は大腸菌由来の
プラスミドｐＭＬＢｊＱ３４であシ、°このプラスミド
は１ａｃｚコ一デイング配列の始めに独特のＥｃｏＲ１
部位を含有するものである。ｐＭＬＢ１０３４はＴ、Ｊ
。
Ｓ ｉ １ｈａｖｙ氏他のｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ ＦｕｓｉｏｎｓＪ２５０〜２５１
頁（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ１９８４）Ｋ記載されている。ｐＡＬＭｉ
ＤＮＡを酵素ＥｃｏＲＩ オよびＰｓｔ ｌで消化し、
そしてこれもＰｓｔ ｌおよびＥｃｏＲＩで消化された
ｐＭＬＢ １０３４プラスミドＤＮＡ Ｋ連結した（第
９図参照）。ｐＭＬＢ１０６４からの５．５ ｋｂ Ｐ
ｓｔ １−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＡＬＭｌからの
１．７ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ−ＥｃｏＲエフラグメントに連
結させると、７．２ｋｂプラスミドｐｃＬ１４０３が生
成した◇１ａｃｚ遺伝子はｐｃＬ１４ｃ１５中のＥｃｏ
ＲＩ部位てｇＩＩＩ遺伝子に融合されるが、２個の遺伝
子は同じ読み枠中に存在しない・かがる構成物にコーデ
ィングされるタンノ々り質は、従って、ナンセンス融合
タンノ５り質を生成しよう。それゆえ４ヌクレオチド対
（ＮＴＰ’ｓ：Ｔ −Ｔ −Ａ −Ａ）を添加して２つ
の遺伝子を同じ枠に入れる。これはｐ（’Ｌ１４０３
ＤＮＡをＦｌ、ｃｏＲ／ｒで消化しそしテ？ｎ 化＃れ
たＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ！のフレノウフラグメン
トおよび４個のデオキシヌクレオチドとインキニベーシ
ョンして、ＥｃｏＲＩ切断にょシ残され九−本鎖末端を
充填することにょシ達成されたＯこのプラントエンドを
Ｔ４リガーゼによシ連結してｐＣＬｌ ４０４を生成さ
せた。このプラスミドは、大腸菌株ＮＦ１８２９を、変
化されたＤＮＡを含有するｐＣＬ１４０４で形質転換さ
せ、そしてＥｃｏＲＩでの消化に抵抗性であるプラスミ
ドＤＮＡを含有するアンピシリン抵抗性ニア０ニーを選
択することにより選択される。細菌のかかる単一コロニ
ーの１つを選択してｐｃＬｌ ４０４源として用いた。
Ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ ＦｕｓｉｏｎｓＪ２５０〜２５１
頁（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ１９８４）Ｋ記載されている。ｐＡＬＭｉ
ＤＮＡを酵素ＥｃｏＲＩ オよびＰｓｔ ｌで消化し、
そしてこれもＰｓｔ ｌおよびＥｃｏＲＩで消化された
ｐＭＬＢ １０３４プラスミドＤＮＡ Ｋ連結した（第
９図参照）。ｐＭＬＢ１０６４からの５．５ ｋｂ Ｐ
ｓｔ １−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＡＬＭｌからの
１．７ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ−ＥｃｏＲエフラグメントに連
結させると、７．２ｋｂプラスミドｐｃＬ１４０３が生
成した◇１ａｃｚ遺伝子はｐｃＬ１４ｃ１５中のＥｃｏ
ＲＩ部位てｇＩＩＩ遺伝子に融合されるが、２個の遺伝
子は同じ読み枠中に存在しない・かがる構成物にコーデ
ィングされるタンノ々り質は、従って、ナンセンス融合
タンノ５り質を生成しよう。それゆえ４ヌクレオチド対
（ＮＴＰ’ｓ：Ｔ −Ｔ −Ａ −Ａ）を添加して２つ
の遺伝子を同じ枠に入れる。これはｐ（’Ｌ１４０３
ＤＮＡをＦｌ、ｃｏＲ／ｒで消化しそしテ？ｎ 化＃れ
たＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ！のフレノウフラグメン
トおよび４個のデオキシヌクレオチドとインキニベーシ
ョンして、ＥｃｏＲＩ切断にょシ残され九−本鎖末端を
充填することにょシ達成されたＯこのプラントエンドを
Ｔ４リガーゼによシ連結してｐＣＬｌ ４０４を生成さ
せた。このプラスミドは、大腸菌株ＮＦ１８２９を、変
化されたＤＮＡを含有するｐＣＬ１４０４で形質転換さ
せ、そしてＥｃｏＲＩでの消化に抵抗性であるプラスミ
ドＤＮＡを含有するアンピシリン抵抗性ニア０ニーを選
択することにより選択される。細菌のかかる単一コロニ
ーの１つを選択してｐｃＬｌ ４０４源として用いた。
５−ブロモ−４−りはロー５−インドイル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（ｘ−Ｇａｌ）の存在下に寒天培地上で、形
質転換された細菌のコロニーを生育させ、そしてそのコ
ロニーがβ−ガラクトシダーゼ活性を有する結果として
青色であることに注意することにより、ｐＣＬｌ ４０
４を含有する細菌がｇｌｌ−１ａｃｚ融合タンパク質を
生成したことが示された。また、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下に生育
したｐｃＩｊ４０４含有細菌はポリアクリルアミド／Ｓ
Ｄ８ゲルで分析すると１３０ｋｂのタン／ミク質を生成
していた。
ラクトシド（ｘ−Ｇａｌ）の存在下に寒天培地上で、形
質転換された細菌のコロニーを生育させ、そしてそのコ
ロニーがβ−ガラクトシダーゼ活性を有する結果として
青色であることに注意することにより、ｐＣＬｌ ４０
４を含有する細菌がｇｌｌ−１ａｃｚ融合タンパク質を
生成したことが示された。また、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下に生育
したｐｃＩｊ４０４含有細菌はポリアクリルアミド／Ｓ
Ｄ８ゲルで分析すると１３０ｋｂのタン／ミク質を生成
していた。
未変化ｇＩＩＩ遺伝子を、ｇ Ｉ ＤＮＡ Ｋ融合した
１ａｃｚ遺伝子を含有するＤＮＡで置換するためＫは、
１ａｃｚ遺伝子を含有するＤＮＡ配列はＰＲＶゲノム中
のｇｌｌＦ配列に対して相同であるＤＮＡの領域によっ
て側面をはさまれていなければならない。
１ａｃｚ遺伝子を含有するＤＮＡで置換するためＫは、
１ａｃｚ遺伝子を含有するＤＮＡ配列はＰＲＶゲノム中
のｇｌｌＦ配列に対して相同であるＤＮＡの領域によっ
て側面をはさまれていなければならない。
ｐｃＬ１４０４のＮＣｏ ｌ−ＢａｍＨＩ ７２グメン
トｉｊ、１ａｃｚ遺伝子遺伝子上てその上流にあるｇ
Ｉｔ！ ＤＮＡ配列を含有する。しかしながら１ａｃｚ
遺伝子の下流末端に！Ｉ接したｇ ｌ［ＤＮＡ配列に存
在しない。これは以下のようにして矯正された。初めＫ
、 ｐＭＬＢ５２４ｎ導体であるｐＺ１８６＃（生成
された。Ｔ、Ｊ。
トｉｊ、１ａｃｚ遺伝子遺伝子上てその上流にあるｇ
Ｉｔ！ ＤＮＡ配列を含有する。しかしながら１ａｃｚ
遺伝子の下流末端に！Ｉ接したｇ ｌ［ＤＮＡ配列に存
在しない。これは以下のようにして矯正された。初めＫ
、 ｐＭＬＢ５２４ｎ導体であるｐＺ１８６＃（生成
された。Ｔ、Ｊ。
５ｉｌｈａｖｙ氏他のＥＸｐ’Ｆ３ ｒ ｉｍｅｎ ｔ
ａ ｗｉ ｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆ’ｕｓ １ｏｎｓ ｅ第
２８頁（Ｃｐｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ１９８４）記載のｐＭＬＢ ５２４を
その２個のＰｖｕ １１部位で切断し連結させて１個の
Ｐｖｕ １１部位を形成させた。
ａ ｗｉ ｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆ’ｕｓ １ｏｎｓ ｅ第
２８頁（Ｃｐｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ１９８４）記載のｐＭＬＢ ５２４を
その２個のＰｖｕ １１部位で切断し連結させて１個の
Ｐｖｕ １１部位を形成させた。
次にこのＰｖｕ Ｈ部位Ｋ ｐＭＬＢｌｏｌｏ Ａｈａ
Ｔｌ消化により得られる４、 ５ ｋｂ １ａｃｚ
７ 、ｙグメントを挿入し □た。プラスミドｐＭＬＢ
１０１０は米国メリーランド州ＦｒｅｄｅｒｉｃｋのＦ
ｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦ
ａｃｉｌｉｔｙから入手しうるが、しかしながら任意の
１ａｃＺ源で充分である・次Ｋ ｓ １ａｃｚ遺伝子の
一部分およびｐＢＲ３２２配列を含有するｐＣＬ １４
０４の４、７ ｋｂ Ｃ１ａ Ｉ−Ｐｓｔ Ｉ ７ラグ
メントをプラスミドｐＺ１８６からの４．Ｏｋｂ Ｃ１
ａ Ｉ−ｐｓｔ Ｉ ７ラグメントで置き代える。プラ
スミドｐ２１８６からのこの７２グメントが１ａｃｚ配
列と置き代わυ、そしてそのあとにＥＣｏＲＩ部位を付
加することになる。生成する（ｉ５ｋｂプラスミドは標
識されたｐＣＬｌ ４０５テおル（第１１図参照）。次
Ｖｃ ｐＣＬ１４０５ オヨＵｐＡＬＭ１プラスミドの
両方からのＤＮＡをＥｃＯＲＩおよびＰｓｔｌで消化し
そして得られるＤＮＡフラグメントをＴ４リガーゼで連
結した。得られるＤＮＡプラスミドを大腸菌株ＮＦ １
８２９中に形質転換した。アンピシリン抵抗性の細菌コ
ロニーを回収して８．８′Ｋｂプラスミドの存在につい
て分析した。これはｐｃＬｌ ４０５からの５．Ｏｋｂ
ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ７，７グメントとｐＡＬＭｌか
らの五８ｋｂ ＢｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉフラグメントの
融合を表わす。かかるプラスミドを含有する細菌を単離
し、生育させそしてそのプラスミドをｐｃＬｌ ４０７
と名づける（第１２図参照）。このプラスミドは今や１
ａｃｚ遺伝子に隣接しそしてそれを側面からはさむｇＩ
ＩＩ遺伝子配列を有する。実施例１記載の方法を用いて
、ｐｃＬ１４０７からのＤＮＡをＮｃｏ ｌで消化しそ
して得られるＤＮＡをＲＰＲＶからのＤＮＡと共にＰＫ
１５細胞中に同時トランスフェクションした。
Ｔｌ消化により得られる４、 ５ ｋｂ １ａｃｚ
７ 、ｙグメントを挿入し □た。プラスミドｐＭＬＢ
１０１０は米国メリーランド州ＦｒｅｄｅｒｉｃｋのＦ
ｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦ
ａｃｉｌｉｔｙから入手しうるが、しかしながら任意の
１ａｃＺ源で充分である・次Ｋ ｓ １ａｃｚ遺伝子の
一部分およびｐＢＲ３２２配列を含有するｐＣＬ １４
０４の４、７ ｋｂ Ｃ１ａ Ｉ−Ｐｓｔ Ｉ ７ラグ
メントをプラスミドｐＺ１８６からの４．Ｏｋｂ Ｃ１
ａ Ｉ−ｐｓｔ Ｉ ７ラグメントで置き代える。プラ
スミドｐ２１８６からのこの７２グメントが１ａｃｚ配
列と置き代わυ、そしてそのあとにＥＣｏＲＩ部位を付
加することになる。生成する（ｉ５ｋｂプラスミドは標
識されたｐＣＬｌ ４０５テおル（第１１図参照）。次
Ｖｃ ｐＣＬ１４０５ オヨＵｐＡＬＭ１プラスミドの
両方からのＤＮＡをＥｃＯＲＩおよびＰｓｔｌで消化し
そして得られるＤＮＡフラグメントをＴ４リガーゼで連
結した。得られるＤＮＡプラスミドを大腸菌株ＮＦ １
８２９中に形質転換した。アンピシリン抵抗性の細菌コ
ロニーを回収して８．８′Ｋｂプラスミドの存在につい
て分析した。これはｐｃＬｌ ４０５からの５．Ｏｋｂ
ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ７，７グメントとｐＡＬＭｌか
らの五８ｋｂ ＢｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉフラグメントの
融合を表わす。かかるプラスミドを含有する細菌を単離
し、生育させそしてそのプラスミドをｐｃＬｌ ４０７
と名づける（第１２図参照）。このプラスミドは今や１
ａｃｚ遺伝子に隣接しそしてそれを側面からはさむｇＩ
ＩＩ遺伝子配列を有する。実施例１記載の方法を用いて
、ｐｃＬ１４０７からのＤＮＡをＮｃｏ ｌで消化しそ
して得られるＤＮＡをＲＰＲＶからのＤＮＡと共にＰＫ
１５細胞中に同時トランスフェクションした。
変化されたｇＩＩＩ遺伝子を含有する組換えウィルスを
先に記載した方法により選択した。代表的なウィルスプ
ラークからのウィルスを単離し、ｆｌ＃Ｌそして分析し
た。このウィルスはＰＲＶ−２１と表示される。ＰＲＶ
−Ｚ １のＤＮＡのサザン分析によれば、このものはｇ
ｌ遺伝子を含有する４、３ｋｂ Ｐｓｔ ｌ ７ラグメ
ント内にｌａｃ ｚ％異かａカ。
先に記載した方法により選択した。代表的なウィルスプ
ラークからのウィルスを単離し、ｆｌ＃Ｌそして分析し
た。このウィルスはＰＲＶ−２１と表示される。ＰＲＶ
−Ｚ １のＤＮＡのサザン分析によれば、このものはｇ
ｌ遺伝子を含有する４、３ｋｂ Ｐｓｔ ｌ ７ラグメ
ント内にｌａｃ ｚ％異かａカ。
３、Ｏｋｂ挿入物を含有することが示された。グルコサ
オン１５識され、ＰＲＶ−Ｚ １に感染した細胞の抽出
物をβ−ガラクトシダーゼに対する抗血清を用いて免疫
沈殿させると、親ウィルスで感染したｆａｆ＠中には存
在しない１３０ｋｂグリコジル化タンパク質の存在が示
される（第１４図参照。
オン１５識され、ＰＲＶ−Ｚ １に感染した細胞の抽出
物をβ−ガラクトシダーゼに対する抗血清を用いて免疫
沈殿させると、親ウィルスで感染したｆａｆ＠中には存
在しない１３０ｋｂグリコジル化タンパク質の存在が示
される（第１４図参照。
従って、ＰＲＶ−２１で感染した細胞はβ−ガラクトシ
ダーゼに融合したｇＩＩＩｍタン上り質の小さなセグメ
ントからなるグリコジル化されたハイブリッドタンパク
質を生成する。
ダーゼに融合したｇＩＩＩｍタン上り質の小さなセグメ
ントからなるグリコジル化されたハイブリッドタンパク
質を生成する。
実施例 ４
ＥｃｏＲＩ部位を有する組換えＰＲＶの構成この実施例
は未変化ｇＩＩＩ遺伝子のＫｐｎ １部位中への合成Ｅ
ｃ ｏＲＩ部位の挿入、およびこの新規な遺伝子を含有
するＰＲＶ組換え体（ＰＲＶ−５２）の構成について記
載する。この新規なｇＩＩＩ遺伝子から生成されるｇＩ
ＩＩタンパク質は黒色プ２−り試験においてモノクロー
ナル抗体Ｍ１およびＭｌ６となお反応する。
は未変化ｇＩＩＩ遺伝子のＫｐｎ １部位中への合成Ｅ
ｃ ｏＲＩ部位の挿入、およびこの新規な遺伝子を含有
するＰＲＶ組換え体（ＰＲＶ−５２）の構成について記
載する。この新規なｇＩＩＩ遺伝子から生成されるｇＩ
ＩＩタンパク質は黒色プ２−り試験においてモノクロー
ナル抗体Ｍ１およびＭｌ６となお反応する。
１、 ｐＡＬＭ ３２の生成
ｐＡＬＭ３は前記したようにして構成された。このプラ
スミドはｔａＣプロモーターのすぐ上流にＥｃｏＲＩ部
位を含有しており、このものはｐＡＬＭ３ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで切断することによシ除去し、ＥｃｏＲＩ切断に
よシ残された一本鎖末端をＤＮＡポリメラーゼ■を用い
て充填しく実施例２参照λそしてＴ４リガーゼを用いて
線状プラスミドを連結させる。この再連結されたＤＮＡ
を大腸菌株ＮＦ１８２９に形質転換させ、そしてＥｃｏ
ＲＩによる切断に抵抗性を有するプラスミドを単離する
。
スミドはｔａＣプロモーターのすぐ上流にＥｃｏＲＩ部
位を含有しており、このものはｐＡＬＭ３ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで切断することによシ除去し、ＥｃｏＲＩ切断に
よシ残された一本鎖末端をＤＮＡポリメラーゼ■を用い
て充填しく実施例２参照λそしてＴ４リガーゼを用いて
線状プラスミドを連結させる。この再連結されたＤＮＡ
を大腸菌株ＮＦ１８２９に形質転換させ、そしてＥｃｏ
ＲＩによる切断に抵抗性を有するプラスミドを単離する
。
かかるプラスミドの一つを単離し、特性化しそしてｐＡ
ＬＭ−２８と命名した（第１４図参照）。ｇＩＩＩ遺遺
伝空中９９３ｂｐ位［１個のＫｐｎ １部位が存在して
おり、従ってこれがｐＡＬＭ ２ Ｂにおける唯一のＫ
ｐｎ １部位である。下部配列を有するＥＣ０１（Ｉ部
位を含有する合成りＮＡ リンカ−が調製された。
ＬＭ−２８と命名した（第１４図参照）。ｇＩＩＩ遺遺
伝空中９９３ｂｐ位［１個のＫｐｎ １部位が存在して
おり、従ってこれがｐＡＬＭ ２ Ｂにおける唯一のＫ
ｐｎ １部位である。下部配列を有するＥＣ０１（Ｉ部
位を含有する合成りＮＡ リンカ−が調製された。
５’−ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＴＡＣ−５’５ ’−ＣＴＡ
ＧＧＴＣＴＴＡＡＧ−５’このリンカ−を、Ｓａｃ １
部位中へのリンカ−挿入について実施例２で記載したと
同じ方法でｐＡＬＭ−２８のＫｐｎ １部位中に＃大し
た。ｇｌｌＴ遺伝子のＫｐｎ １部位に１個の、独特の
ＥｃｏＲＩ部位全部位するプラスミドｐＡＬＭ ３２を
単離した。ｐＡＬＭ３２中のＫｐｎ １部位も再生され
た。得られるｇＩＩＩココ−ィング配列はリンカ−挿入
の結果今や４個の付加的なコドンを含有する。
ＧＧＴＣＴＴＡＡＧ−５’このリンカ−を、Ｓａｃ １
部位中へのリンカ−挿入について実施例２で記載したと
同じ方法でｐＡＬＭ−２８のＫｐｎ １部位中に＃大し
た。ｇｌｌＴ遺伝子のＫｐｎ １部位に１個の、独特の
ＥｃｏＲＩ部位全部位するプラスミドｐＡＬＭ ３２を
単離した。ｐＡＬＭ３２中のＫｐｎ １部位も再生され
た。得られるｇＩＩＩココ−ィング配列はリンカ−挿入
の結果今や４個の付加的なコドンを含有する。
ｚ 組換えＰＲＶ−３２の生成
ｐＡＬＭ ３２中の新規なＥｆ！Ｉ遺伝子を組換えによ
り、前記と同じ標準的同時トランスフェクションを用い
てＰＲＶ−２のＤＮＡ中に挿入した。ＰＲＶ−２は実施
例２に記載されている。ＰＲＶ−２はＭｌま九はＭ１６
モノクローナル抗体と反応しない先端の切れたｇＩＩＩ
タンパク質を発現する。それゆえ、ＰＲＶ−２は「黒色
プラーク試験」で白色プラークを生ずる。ＰＲＶ−２Ｄ
ＮＡおよびｐＡＬＭ３２ ＤＮＡ を同時トランスフェ
クションさせたのち、黒色プラークを全プラークの約０
．５％の頻度で回収した。
り、前記と同じ標準的同時トランスフェクションを用い
てＰＲＶ−２のＤＮＡ中に挿入した。ＰＲＶ−２は実施
例２に記載されている。ＰＲＶ−２はＭｌま九はＭ１６
モノクローナル抗体と反応しない先端の切れたｇＩＩＩ
タンパク質を発現する。それゆえ、ＰＲＶ−２は「黒色
プラーク試験」で白色プラークを生ずる。ＰＲＶ−２Ｄ
ＮＡおよびｐＡＬＭ３２ ＤＮＡ を同時トランスフェ
クションさせたのち、黒色プラークを全プラークの約０
．５％の頻度で回収した。
黒色プラーク５個を採取し、精製しそして分析した。５
個のウィルス単離物のうち２個が分析によればｇｈｌの
Ｋｐｎ １部位に新規なＥｃｏＲＩ部位全部位すること
が判明した。ストックの１つを選択してＰＲＶ−５２と
称した。この実施例は完全な長さの８１ｍ遺伝子中に合
成ＥｃｏＲＩ部位を含有するＰＲＶベクターの構成を示
す。この新規な遺伝子は「黒色プラーク試験」でＭ ｉ
および１４１６モノクロ一ナル抗体と反応するｇＩＩＩ
タンパク質を発現する。さらに、本実施例はｇｌＩｌ欠
失のあるＰＲＶベクター（例えばＰＲＶ−２１ｉ Ｕ
ＰＲＶ−Ｉ Ｏ）を、スクリーニングに「黒色ゾラーク
試験」を用いるｇＩＩＩ遺伝子の挿入のためのはフタ−
として使用することについても教示するものである。
個のウィルス単離物のうち２個が分析によればｇｈｌの
Ｋｐｎ １部位に新規なＥｃｏＲＩ部位全部位すること
が判明した。ストックの１つを選択してＰＲＶ−５２と
称した。この実施例は完全な長さの８１ｍ遺伝子中に合
成ＥｃｏＲＩ部位を含有するＰＲＶベクターの構成を示
す。この新規な遺伝子は「黒色プラーク試験」でＭ ｉ
および１４１６モノクロ一ナル抗体と反応するｇＩＩＩ
タンパク質を発現する。さらに、本実施例はｇｌＩｌ欠
失のあるＰＲＶベクター（例えばＰＲＶ−２１ｉ Ｕ
ＰＲＶ−Ｉ Ｏ）を、スクリーニングに「黒色ゾラーク
試験」を用いるｇＩＩＩ遺伝子の挿入のためのはフタ−
として使用することについても教示するものである。
微生物の寄託
下記ウィルスおよびプラスミドが米国ＡＴＣＣに以下の
寄託番号の下に寄託されている。
寄託番号の下に寄託されている。
ＰＲＶ−Ｉ ＶＲ２１４２ＰＲＶ−２
ＶＲ２１４３ ＰＲＶ−１０ＶＲ２１４４ ＰＲＶ−２４ＶＲ２１４５ ＰＲＶ−３２ＶＲ２１４５ 本発明は寄託されたウィルスの範囲に限定されるもので
はない。
ＶＲ２１４３ ＰＲＶ−１０ＶＲ２１４４ ＰＲＶ−２４ＶＲ２１４５ ＰＲＶ−３２ＶＲ２１４５ 本発明は寄託されたウィルスの範囲に限定されるもので
はない。
第１図はシュードラビーズウィルス（ＰＲＶ）ゲノムの
地図を示す。ｃＡ）は独特の長い（ＵＬ ）および独特
の短い（Ｕｓ ）領域、およびＵ８をはさむ逆方向末端
反復塩基配列（それぞれ工ＲｓおよびＴＲ，）を示すＰ
ＲＶのゲノムである。（ｌはＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ
制限酵素切断部位を示す。ｇＩＩＩ遺伝子は２個の隣接
するＢａｍＨエフラグメントであるＢａｍＨＩ−２およ
びＢａｍＨＩ −９の間に位置する。ｇＩＩＩ遺伝子を
含有する４、５ｋｂ Ｐａｔ ｌフラグメントを（Ｂ）
で拡大し、そして（Ｃ）で多数の制限酵素切断部位を記
入しである。（Ｃ）においては、斜線の箱形はｇＩＩＩ
ｍり／ノック質遺伝子に相当し、このものの配 □列
を第２図に示す。この遺伝子のｍＲＮＡによる転写およ
びその方向を矢印で示す。 第２図はｇＩＩＩ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を示
す（非コード鎖）。この遺伝子の１９６ｂｐ上流および
９０ ｂｐ下流のＤＮＡ配列を示しである。 第３図は（Ａ） ｐＡＬＭ２、（Ｂ） ｐＡＬＭ １０
および（Ｃ）ｐＡＬ！、１１５を構成する経路を示す＠ 第４図はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上におけるタン
パク質の電気泳動パターン（写Ｘ）と、プラスミドｐＡ
ＬＭ３ 、ｐＡＬＭ２およびｐＡＬＭｌ ０の断片を示
す。レーン１はプラスミドｐＡＬＭ３を担持する細菌の
非誘導培養物から得られたタンパク質を示す。２．３お
よび４レーンはそれぞれプラスミドｐＡＬＭ３ 、 ｐ
ＡＬＭ２およびｐＡＬＭｌｏを担持する細菌の誇導され
た培養物から得られたタンパク質を示す。 ｇｓ図はｆｉ ＰＲＶ 、 ＰＲＶ−２およびＰＲＶ−
１０カラ抽出されたピリオンＤＮＡのサザン・プロット
分析ノぞターン（写真）（１，２および６レーンがそれ
ぞれ親ＰＲＶ ％ＰＲＶ−２およびＰＲＶ−１０からの
ＤＮＡを含有する）と４．５ｋｂ ｐｓｔ Ｉ ＰＲＶ
７ラグメントの制限地図を示す。ｇＩＩＩ遺伝子は斜
線長方形で示す。ｍＰＭＡおよび転写の方向を線の下の
矢印により示す。プローブとして用いられる１６ｋｂ８
ｐｈ １−Ｎｃｏ Ｉ ＤＮＡ ７ラグメントを地図の
下に示す。 Ｍ６図は下記遺伝子地図、すなわち、（Ａ）ＨＴＬＶｉ
Ｉ ＤＮＡのゲノム配置、（Ｂ） ｅｎｖ遺伝子産物の
プロセシング部位（黒色逆三角形）を示すＨＴＬＶ ｉ
ｌｌエンベロープポリタンパク質遺伝子（ｅｎｖ遺伝子
）領域、（Ｃり ｅｎｖ遺伝子コーディング領域の制限
地図、（→キナーゼ化されたＳａｃ ］ ／ Ｂｇｌ
ｌリンカ−を有するＢ７ｒｌ ｌ［ｔ ４３ ｋｂ Ｈ
ＴＬＶ ｍ ＤＮＡ７ラグメント（ｅｎｖコーディング
領域からの）、（乃ｐＡＬＭ２４構成において（Ｄ）部
分のＨＴＩ７ ［−リンカ−ＤＮＡ）２グメントの挿入
地点を示すｐＡＬＭ２発現ベクターの７ユ一ドラビーズ
ウイルスＤＮＡ１分、を示す。 第７図は下記のものを感染させた細胞の免疫沈殿抽出物
の電気泳動から得られるＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上のタンパク質のノぞターン（写真）を示す。ここで感
染物はレーン７．８および９がｆｉＰスレーン１．２お
よび３がＰＲＶ−２、そしてレーン４．５および６がＰ
ＲＶ−２４である。 Ｍレーンは分子量標準物を示す。 第８図は１％アガロース／ ＴＥＡゲル上のＤＮＡのｐ
ｓｔ Ｉ ７ラグメントの電気泳動に続いてｐＡＬＭ１
５から得られるｇＩＩＩ特異的プローブとのハイブリッ
ド形成（１，２および３レーン）によシ得られるノぐタ
ーン（写真）、またはＨＴＬＶ ｍエンベロープ特異的
プローブとハイブリッド形成（４，５および６レーン）
することくよシ得られるパターン（写真）を示す。Ｍレ
ーンは分子量標準物を示す。 第９図はｐＡ口、イ２からのプラスミドｐＡＬＭ７の構
成を示す。 第１０図はプラスミドｐＡＬＭ１、ｐＭＬＢ１０３４
、ｐＣＬ１０６４およびｐＣＬｌ ４０４を示す。この
図１２ｐＣＬ１４０４の構成ルートを示す。 第１１図はプラスミドｐＣＬ１４０４ 、ｐＺｊ ８６
およびｐＣＬｌ ４０５を示す。この図はｐＣＬｌ ４
０５の構成ルートを示す。 第１２図はプラスミドｐＣＬ１４０５ 、ｐＡＬＭｌお
よびｐｃＬ１４０７を示す。この図面はｐＣＬｌ ４０
７の構成ルートを示す。 第１３図は直線状に表示したＰＲＶ−２１中に存在する
ｇｌｌ−１ａｃｚ融合物とＰａｔ Ｉフラグメントを電
気泳動し続いてｐＡＬＭ １５から得られた親ＤＮＡ特
異的プローブと、またはｐＭＬＢ １０３４から得られ
る１ａｃｚプローブとハイブリッド形成させることＫよ
プ得られるＤＮＡのパターン（写真）（ＡおよびＣレー
ンのＤＮＡ ｔｉｔ、 、ａ （未変化）ウィルスから
来てお夕、−万ＢおよびＣレーンのＤＮＡ ハＰＲＶ−
２１から来てイル。レ−／ＡおよびＢ ｉｊｐＡＬＭ１
５からのｇ ｆｌ ＤＮＡとハイブリッド形成させ、一
方レーンＣおよびＤＦｉｌａｃｚ７’四−プとハイブリ
ッド形成させたものである）とそれぞれ下記のものを感
染させた細胞の免疫沈殿抽出物の電気泳動から得られる
、ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上におけるタンパク質
のパターン（写真）を示す。感染物は、レーン１．２お
よび３は親Ｐｌｒ（Ｖ 、そしてＬ’−７４，５お！び
６ｉＰＲＶ−１である。 第１４図はｐＡＬＭ３からのプラスミドｐＡＬＭ ２８
の構成を示す。 ［有］ 外２名 図面の序口（内容に変更なし） ＦＩＧ、 Ｉ Ｓ’ ＭＲＮＡ ３’ Ｆ ！ Ｇ、 ２−（１） αでαｌα℃α）απＯＭ：ＧｃＧα℃αテαテαπロ
ＧＧＣＧＴＡ ８４ＣＣＴ ＧＡｃＱ７ｒ ＣＧＣ
ＣＡＴ （ｍ ＣＧＣＣＡＣ％ ＣＡＴ ＩＭ Ａ？’
ＣＣＧＴ ’！’ＴＣ１２６ＣＴＧ ＡＴＴ ＣＡＩ：
α工ＯＣαゴαＫ ＧＣＧ Ｔ！Ｔ Ｔ’ｌＪ ＪｔＡ
Ａ ＣＣＯＣＧＡ ’ｒＧＧ １６１１２０２八１ａ
ＡｌａＡｌａＡｓｐＡｌａＧｌｕ’ｎ１ｒＧｌｕＧ↓ｙ
ｖａ上’ｒｙｒｒｎｒｒｒｐ＾ｒｇＦ Ｉ Ｇ、
２−（２） ０℃Ａπσ℃αＫＡπσ℃＾πＣＴＧα工＾π罵Ｃ℃ψ
℃＾π１５９６Ｆ Ｉ Ｇ、 ２−（，３） ４５４ Ｖａｌ Ｉｃｅ Ａｌａ Ｇｌｙ １１ｅ Ｇ
ｌｙ Ｘｌｅ Ｌａｕ Ａｌａ ＩＩｓ Ｖａｌ ｔａ
ｕ Ｖａｌ Ｘｌｅα℃α℃απα工αｍｅ ＣＣＡ
ＣＧＴ ＣＧＡＡＴＣＡＡＴ ＭＡα＾ａＣα込１６８
０１２α込α℃αカα℃πコαｚ’ｒｒＧππｃ；’ｒ
Ｇπコαくα刀α：’Ｃ１７２２ＦＩＧ、 ３ ＦｉＧ、４ ＦＩＧ、５ １２３ 一＾Ｌ−１５グローブ ＦＩＧ、６ ０ＣＩ ＦｊＧ、７ ＦＩＧ、８ Ｍ１２３ ４５６Ｍ イ［７−・ゾ プロー、′ Ｆ ｆ Ｇ、 ９ ＦＪＧ、ｆ○ ＦＩＧ、１１ ＣＯＲＩ ＦＩＧ、＋２ ＦＩＧ、＋３ （Ａ） Ａ８’ＣＤ １ｚ ３４５６
地図を示す。ｃＡ）は独特の長い（ＵＬ ）および独特
の短い（Ｕｓ ）領域、およびＵ８をはさむ逆方向末端
反復塩基配列（それぞれ工ＲｓおよびＴＲ，）を示すＰ
ＲＶのゲノムである。（ｌはＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ
制限酵素切断部位を示す。ｇＩＩＩ遺伝子は２個の隣接
するＢａｍＨエフラグメントであるＢａｍＨＩ−２およ
びＢａｍＨＩ −９の間に位置する。ｇＩＩＩ遺伝子を
含有する４、５ｋｂ Ｐａｔ ｌフラグメントを（Ｂ）
で拡大し、そして（Ｃ）で多数の制限酵素切断部位を記
入しである。（Ｃ）においては、斜線の箱形はｇＩＩＩ
ｍり／ノック質遺伝子に相当し、このものの配 □列
を第２図に示す。この遺伝子のｍＲＮＡによる転写およ
びその方向を矢印で示す。 第２図はｇＩＩＩ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を示
す（非コード鎖）。この遺伝子の１９６ｂｐ上流および
９０ ｂｐ下流のＤＮＡ配列を示しである。 第３図は（Ａ） ｐＡＬＭ２、（Ｂ） ｐＡＬＭ １０
および（Ｃ）ｐＡＬ！、１１５を構成する経路を示す＠ 第４図はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上におけるタン
パク質の電気泳動パターン（写Ｘ）と、プラスミドｐＡ
ＬＭ３ 、ｐＡＬＭ２およびｐＡＬＭｌ ０の断片を示
す。レーン１はプラスミドｐＡＬＭ３を担持する細菌の
非誘導培養物から得られたタンパク質を示す。２．３お
よび４レーンはそれぞれプラスミドｐＡＬＭ３ 、 ｐ
ＡＬＭ２およびｐＡＬＭｌｏを担持する細菌の誇導され
た培養物から得られたタンパク質を示す。 ｇｓ図はｆｉ ＰＲＶ 、 ＰＲＶ−２およびＰＲＶ−
１０カラ抽出されたピリオンＤＮＡのサザン・プロット
分析ノぞターン（写真）（１，２および６レーンがそれ
ぞれ親ＰＲＶ ％ＰＲＶ−２およびＰＲＶ−１０からの
ＤＮＡを含有する）と４．５ｋｂ ｐｓｔ Ｉ ＰＲＶ
７ラグメントの制限地図を示す。ｇＩＩＩ遺伝子は斜
線長方形で示す。ｍＰＭＡおよび転写の方向を線の下の
矢印により示す。プローブとして用いられる１６ｋｂ８
ｐｈ １−Ｎｃｏ Ｉ ＤＮＡ ７ラグメントを地図の
下に示す。 Ｍ６図は下記遺伝子地図、すなわち、（Ａ）ＨＴＬＶｉ
Ｉ ＤＮＡのゲノム配置、（Ｂ） ｅｎｖ遺伝子産物の
プロセシング部位（黒色逆三角形）を示すＨＴＬＶ ｉ
ｌｌエンベロープポリタンパク質遺伝子（ｅｎｖ遺伝子
）領域、（Ｃり ｅｎｖ遺伝子コーディング領域の制限
地図、（→キナーゼ化されたＳａｃ ］ ／ Ｂｇｌ
ｌリンカ−を有するＢ７ｒｌ ｌ［ｔ ４３ ｋｂ Ｈ
ＴＬＶ ｍ ＤＮＡ７ラグメント（ｅｎｖコーディング
領域からの）、（乃ｐＡＬＭ２４構成において（Ｄ）部
分のＨＴＩ７ ［−リンカ−ＤＮＡ）２グメントの挿入
地点を示すｐＡＬＭ２発現ベクターの７ユ一ドラビーズ
ウイルスＤＮＡ１分、を示す。 第７図は下記のものを感染させた細胞の免疫沈殿抽出物
の電気泳動から得られるＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上のタンパク質のノぞターン（写真）を示す。ここで感
染物はレーン７．８および９がｆｉＰスレーン１．２お
よび３がＰＲＶ−２、そしてレーン４．５および６がＰ
ＲＶ−２４である。 Ｍレーンは分子量標準物を示す。 第８図は１％アガロース／ ＴＥＡゲル上のＤＮＡのｐ
ｓｔ Ｉ ７ラグメントの電気泳動に続いてｐＡＬＭ１
５から得られるｇＩＩＩ特異的プローブとのハイブリッ
ド形成（１，２および３レーン）によシ得られるノぐタ
ーン（写真）、またはＨＴＬＶ ｍエンベロープ特異的
プローブとハイブリッド形成（４，５および６レーン）
することくよシ得られるパターン（写真）を示す。Ｍレ
ーンは分子量標準物を示す。 第９図はｐＡ口、イ２からのプラスミドｐＡＬＭ７の構
成を示す。 第１０図はプラスミドｐＡＬＭ１、ｐＭＬＢ１０３４
、ｐＣＬ１０６４およびｐＣＬｌ ４０４を示す。この
図１２ｐＣＬ１４０４の構成ルートを示す。 第１１図はプラスミドｐＣＬ１４０４ 、ｐＺｊ ８６
およびｐＣＬｌ ４０５を示す。この図はｐＣＬｌ ４
０５の構成ルートを示す。 第１２図はプラスミドｐＣＬ１４０５ 、ｐＡＬＭｌお
よびｐｃＬ１４０７を示す。この図面はｐＣＬｌ ４０
７の構成ルートを示す。 第１３図は直線状に表示したＰＲＶ−２１中に存在する
ｇｌｌ−１ａｃｚ融合物とＰａｔ Ｉフラグメントを電
気泳動し続いてｐＡＬＭ １５から得られた親ＤＮＡ特
異的プローブと、またはｐＭＬＢ １０３４から得られ
る１ａｃｚプローブとハイブリッド形成させることＫよ
プ得られるＤＮＡのパターン（写真）（ＡおよびＣレー
ンのＤＮＡ ｔｉｔ、 、ａ （未変化）ウィルスから
来てお夕、−万ＢおよびＣレーンのＤＮＡ ハＰＲＶ−
２１から来てイル。レ−／ＡおよびＢ ｉｊｐＡＬＭ１
５からのｇ ｆｌ ＤＮＡとハイブリッド形成させ、一
方レーンＣおよびＤＦｉｌａｃｚ７’四−プとハイブリ
ッド形成させたものである）とそれぞれ下記のものを感
染させた細胞の免疫沈殿抽出物の電気泳動から得られる
、ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上におけるタンパク質
のパターン（写真）を示す。感染物は、レーン１．２お
よび３は親Ｐｌｒ（Ｖ 、そしてＬ’−７４，５お！び
６ｉＰＲＶ−１である。 第１４図はｐＡＬＭ３からのプラスミドｐＡＬＭ ２８
の構成を示す。 ［有］ 外２名 図面の序口（内容に変更なし） ＦＩＧ、 Ｉ Ｓ’ ＭＲＮＡ ３’ Ｆ ！ Ｇ、 ２−（１） αでαｌα℃α）απＯＭ：ＧｃＧα℃αテαテαπロ
ＧＧＣＧＴＡ ８４ＣＣＴ ＧＡｃＱ７ｒ ＣＧＣ
ＣＡＴ （ｍ ＣＧＣＣＡＣ％ ＣＡＴ ＩＭ Ａ？’
ＣＣＧＴ ’！’ＴＣ１２６ＣＴＧ ＡＴＴ ＣＡＩ：
α工ＯＣαゴαＫ ＧＣＧ Ｔ！Ｔ Ｔ’ｌＪ ＪｔＡ
Ａ ＣＣＯＣＧＡ ’ｒＧＧ １６１１２０２八１ａ
ＡｌａＡｌａＡｓｐＡｌａＧｌｕ’ｎ１ｒＧｌｕＧ↓ｙ
ｖａ上’ｒｙｒｒｎｒｒｒｐ＾ｒｇＦ Ｉ Ｇ、
２−（２） ０℃Ａπσ℃αＫＡπσ℃＾πＣＴＧα工＾π罵Ｃ℃ψ
℃＾π１５９６Ｆ Ｉ Ｇ、 ２−（，３） ４５４ Ｖａｌ Ｉｃｅ Ａｌａ Ｇｌｙ １１ｅ Ｇ
ｌｙ Ｘｌｅ Ｌａｕ Ａｌａ ＩＩｓ Ｖａｌ ｔａ
ｕ Ｖａｌ Ｘｌｅα℃α℃απα工αｍｅ ＣＣＡ
ＣＧＴ ＣＧＡＡＴＣＡＡＴ ＭＡα＾ａＣα込１６８
０１２α込α℃αカα℃πコαｚ’ｒｒＧππｃ；’ｒ
Ｇπコαくα刀α：’Ｃ１７２２ＦＩＧ、 ３ ＦｉＧ、４ ＦＩＧ、５ １２３ 一＾Ｌ−１５グローブ ＦＩＧ、６ ０ＣＩ ＦｊＧ、７ ＦＩＧ、８ Ｍ１２３ ４５６Ｍ イ［７−・ゾ プロー、′ Ｆ ｆ Ｇ、 ９ ＦＪＧ、ｆ○ ＦＩＧ、１１ ＣＯＲＩ ＦＩＧ、＋２ ＦＩＧ、＋３ （Ａ） Ａ８’ＣＤ １ｚ ３４５６
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）場合により少くとも１つの非必須領域の少くとも一
部分が欠失していてもよいシュードラビーズウィルスゲ
ノム、および 所望のタンパク質をコーディングしており かつ発現されうる外来ＤＮＡフラグメント からなつており、該外来ＤＮＡフラグメントがゲノムの
非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域内から選択される箇所でシ
ュードラビーズウィルスゲノム中に挿入されていること
からなる組換えシュードラビーズウィルス。 ２）少くとも１つの非必須領域の少くとも一部分が欠失
した特許請求の範囲第１項記載の組換えシュードラビー
ズウィルス。 ３）非必須領域がＸｈｏ I ／ｇIII領域、ｔｋ遺伝子領
域およびｇ I 遺伝子領域からなる群から選択される特
許請求の範囲第２項記載の組換えシュードラビーズウィ
ルス。 ４）非必須領域がＸｈｏ I ／ｇIII領域からなる特許請
求の範囲第３項記載の組換えシュードラビーズウィルス
。 ５）非必須領域の欠失部分が第１のＸｈｏ I 制限酵素
切断部位で始まりそして第２のＸｈｏ I 制限酵素切断
部位で終る特許請求の範囲第４項記載の組換えシュード
ラビーズウィルス。 ６）非必須領域がＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子
セグメントからなる特許請求の範囲第４項記載の組換え
シュードラビーズウィルス。 ７）非必須領域の欠失部分が第１のＳａｃ I 制限酵素
切断部位で始まりそして第２のＳａｃ I 制限酵素切断
部位で終る特許請求の範囲第６項記載の組換えシュード
ラビーズウィルス。 ８）非必須領域がｔｋ遺伝子領域およびｇ I 遺伝子領
域からなる群から選択される特許請求の範囲第５項記載
の組換えシュードラビーズウィルス。 ９）選択された挿入地点が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域のｇ
III遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第１項記
載の組換えシュードラビーズウィルス。 １０）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第２項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １１）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第３項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １２）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第４項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １３）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第５項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １４）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第６項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １５）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第７項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １６）選択された挿入箇所が、Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内にある特許請求の範囲第８項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 １７）選択された挿入箇所が、残留するＡＴＧコドン配
列から下流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグ
メント内にある特許請求の範囲第１項記載の組換えシュ
ードラビーズウィルス。 １８）選択された挿入箇所が、残留するＡＴＧコドン配
列から下流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグ
メント内にある特許請求の範囲第２項記載の組換えシュ
ードラビーズウィルス。 １９）選択された挿入箇所が、残留するＡＴＧコドン配
列から下流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグ
メント内にある特許請求の範囲第３項記載の組換えシュ
ードラビーズウィルス。 ２０）選択された挿入箇所が、残留するＡＴＧコドン配
列から下流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグ
メント内にある特許請求の範囲第４項記載の組換えシュ
ードラビーズウィルス。 ２１）選択された挿入箇所が、ＡＴＧコドン配列から下
流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグメント内
にある特許請求の範囲第５項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ２２）選択された挿入箇所が、ＡＴＧコドン配列から下
流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグメント内
にある特許請求の範囲第６項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ２３）選択された挿入箇所が、ＡＴＧコドン配列から下
流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグメント内
にある特許請求の範囲第７項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ２４）選択された挿入箇所が、ＡＴＧコドン配列から下
流のＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝子セグメント内
にある特許請求の範囲第８項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ２５）外来ＤＮＡフラグメントがＳａｃ I ／ＢｇｌII
リンカーと連結されたＢｇｌII１．４３ｋｂＨＴＬＶI
IIＤＮＡフラグメントからなり、そしてＨＴＬＶIIIフ
ラグメントが欠失箇所に挿入される特許請求の範囲第７
項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ２６）ウィルスがＰＲＶ−２４である特許請求の範囲第
２５項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ２７）ウィルスが寄託番号ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２１４６
を有するＰＲＶ−２４である特許請求の範囲第２５項記
載の組換えシュードラビーズウィルス。 ２８）ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の少くとも
一部分が欠失しており、そして場合により少くとも１つ
の他の非必須領域の少くとも一部分が欠失していてもよ
いシュードラビーズウィルスゲノムからなる組換えシュ
ードラビーズウィルス。 ２９）Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の欠失部分がその領域のｇ
IIIセグメント内から選択される特許請求の範囲第２８
項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ３０）ｇIIIセグメントの欠失部分が第１のＳａｃ I 制
限酵素切断部位で始まりそして第２のＳａｃ I 制限酵
素切断部位で終る特許請求の範囲第 ２９項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ３１）Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の欠失部分が第１のＸｈｏ
I 制限酵素切断部位で始まりそして第２のＸｈｏ I 制
限酵素切断部位で終る特許請求の範囲第２８項記載の組
換えシュードラビーズウィルス。 ３２）ウィルスがＰＲＶ−２である特許請求の範囲第３
０項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ３３）ウィルスが寄託番号ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２１４３
を有するＰＲＶ−２である特許請求の範囲第３０項記載
の組換えシュードラビーズウィルス。 ３４）ウィルスがＰＲＶ−１０である特許請求の範囲第
３１項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ３５）ウィルスが寄託番号ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２１４４
を有するＰＲＶ−１０である特許請求の範囲第３１項記
載の組換えシュードラビーズウィルス。 ３６）他の非必須領域がｔｋ遺伝子領域およびｇ I 遺
伝子領域からなる群から選択される特許請求の範囲第２
８項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ３７）場合により少くとも１つの非必須領域の少くとも
一部分が欠失していてもよいシュードラビーズウィルス
ゲノム、および シュードラビーズウィルスゲノムの残留す る非必須領域中に生成されたＥｃｏＲ I 部位、からな
る組換えシュードラビーズウィルス。 ３８）少くとも１つの非必須領域の少くとも一部分が欠
失した特許請求の範囲第３７項記載の組換えシュードラ
ビーズウィルス。 ３９）非必須領域がＸｈｏ I ／ｇIII領域、ｔｋ遺伝子
領域およびｇ I 遺伝子領域からなる群から選択される
特許請求の範囲第３８項記載の組換えシュードラビーズ
ウィルス。 ４０）非必須領域がＸｈｏ I ／ｇIII領域からなる特許
請求の範囲第３９項記載の組換えシュードラビーズウィ
ルス。 ４１）非必須領域の欠失部分が第１のＸｈｏ I 制限酵
素切断部位で始まりそして第２のＸｈｏ I 制限酵素切
断部位で終る特許請求の範囲第４０項記載の組換えシュ
ードラビーズウィルス。 ４２）非必須領域がＸｈｏ I ／ｇIII領域のｇIII遺伝
子セグメントからなる特許請求の範囲第４０項記載の組
換えシュードラビーズウィルス。 ４３）非必須領域の欠失部分が第１のＳａｃ I 制限酵
素切断部位で始まりそして第２のＳａｃ I 制限酵素切
断部位で終る特許請求の範囲第４２項記載の組換えシュ
ードラビーズウィルス。 ４４）非必須領域がｔｋ遺伝子領域およびｇ I 遺伝子
領域からなる群から選択される特許請求の範囲第３９項
記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ４５）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第３７項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ４６）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第３８項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ４７）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第３９項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ４８）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第４０項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ４９）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第４１項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ５０）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第４２項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ５１）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第４３項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ５２）ＥｃｏＲ I 部位がゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇ
III領域内から選択される箇所で生成される特許請求の
範囲第４４項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ５３）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第３７項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ５４）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第３８項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ５５）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第３９項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ５６）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第４０項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ５７）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第４１項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ５８）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第４２項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ５９）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第４３項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ６０）ＥｃｏＲ I 部位が、残留するＡＴＧコドン配列
の下流にある、ゲノムの非必須Ｘｈｏ I ／ｇIII領域の
ｇIII遺伝子セグメント内から選択される箇所で生成さ
れる特許請求の範囲第４４項記載の組換えシュードラビ
ーズウィルス。 ６１）ＥｃｏＲ I 部位が残留するＫｐｎ I 制限酵素切
断部位で生成される特許請求の範囲第５３項記載の組換
えシュードラビーズウィルス。 ６２）ウィルスがＰＲＶ−３２である特許請求の範囲第
６１項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ６３）ウィルスが寄託番号ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２１４５
を有するＰＲＶ−３２である特許請求の範囲第６１項記
載の組換えシュードラビーズウィルス。 ６４）ウィルスがＰＲＶ−１である特許請求の範囲第５
９項記載の組換えシュードラビーズウィルス。 ６５）ウィルスが寄託番号ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ２１４６
を有するＰＲＶ−１である特許請求の範囲第５９項記載
の組換えシュードラビーズウィルス。 ６６）（１）細胞を特許請求の範囲第１項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ６７）（１）細胞を特許請求の範囲第２項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ６８）（１）細胞を特許請求の範囲第３項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ６９）（１）細胞を特許請求の範囲第４項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７０）（１）細胞を特許請求の範囲第５項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７１）（１）細胞を特許請求の範囲第６項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７２）（１）細胞を特許請求の範囲第７項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する、 ことからなるタンパク質の製法。 ７３）（１）細胞を特許請求の範囲第８項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７４）（１）細胞を特許請求の範囲第９項記載の組換え
シュードラビーズウィルスに感染させ、 （２）所望のタンパク質が産生されるまで前記感染した
細胞を培養し、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７５）（１）細胞を特許請求の範囲第１０項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７６）（１）細胞を特許請求の範囲第１１項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７７）（１）細胞を特許請求の範囲第１２項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７８）（１）細胞を特許請求の範囲第１３項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ７９）（１）細胞を特許請求の範囲第１４項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８０）（１）細胞を特許請求の範囲第１５項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８１）（１）細胞を特許請求の範囲第１６項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８２）（１）細胞を特許請求の範囲第１７項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８３）（１）細胞を特許請求の範囲第１８項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８４）（１）細胞を特許請求の範囲第１９項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８５）（１）細胞を特許請求の範囲第２０項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８６）（１）細胞を特許請求の範囲第２１項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８７）（１）細胞を特許請求の範囲第２２項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８８）（１）細胞を特許請求の範囲第２３項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ８９）（１）細胞を特許請求の範囲第２４項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ９０）（１）細胞を特許請求の範囲第２５項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ９１）（１）細胞を特許請求の範囲第２６項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ９２）（１）細胞を特許請求の範囲第２７項記載の組換
えシュードラビーズウィルスに感染させ、（２）所望の
タンパク質が産生されるまで前記感染した細胞を培養し
、そして （３）タンパク質を回収する ことからなるタンパク質の製法。 ９３）特許請求の範囲第６６項記載の方法により製造さ
れた生成物。 ９４）特許請求の範囲第６７項記載の方法により製造さ
れた生成物。 ９５）特許請求の範囲第６８項記載の方法により製造さ
れた生成物。 ９６）特許請求の範囲第６９項記載の方法により製造さ
れた生成物。 ９７）特許請求の範囲第７０項記載の方法により製造さ
れた生成物。 ９８）特許請求の範囲第７１項記載の方法により製造さ
れた生成物。 ９９）特許請求の範囲第７２項記載の方法により製造さ
れた生成物。 １００）特許請求の範囲第７３項記載の方法により製造
された生成物。 １０１）特許請求の範囲第７４項記載の方法により製造
された生成物。 １０２）特許請求の範囲第７５項記載の方法により製造
された生成物。 １０３）特許請求の範囲第７６項記載の方法により製造
された生成物。 １０４）特許請求の範囲第７７項記載の方法により製造
された生成物。 １０５）特許請求の範囲第７８項記載の方法により製造
された生成物。 １０６）特許請求の範囲第７９項記載の方法により製造
された生成物。 １０７）特許請求の範囲第８０項記載の方法により製造
された生成物。 １０８）特許請求の範囲第８１項記載の方法により製造
された生成物。 １０９）特許請求の範囲第８２項記載の方法により製造
された生成物。 １１０）特許請求の範囲第８３項記載の方法により製造
された生成物。 １１１）特許請求の範囲第８４項記載の方法により製造
された生成物。 １１２）特許請求の範囲第８５項記載の方法により製造
された生成物。 １１３）特許請求の範囲第８６項記載の方法により製造
された生成物。 １１４）特許請求の範囲第８７項記載の方法により製造
された生成物。 １１５）特許請求の範囲第８８項記載の方法により製造
された生成物。 １１６）特許請求の範囲第８９項記載の方法により製造
された生成物。 １１７）特許請求の範囲第９０項記載の方法により製造
された生成物。 １１８）特許請求の範囲第９１項記載の方法により製造
された生成物。 １１９）特許請求の範囲第９２項記載の方法により製造
された生成物。
Applications Claiming Priority (2)
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