JPH0243477B2 - - Google Patents
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- JPH0243477B2 JPH0243477B2 JP13063582A JP13063582A JPH0243477B2 JP H0243477 B2 JPH0243477 B2 JP H0243477B2 JP 13063582 A JP13063582 A JP 13063582A JP 13063582 A JP13063582 A JP 13063582A JP H0243477 B2 JPH0243477 B2 JP H0243477B2
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素を用いた生体成分の定量法
に関する。
に関する。
従来、生体成分、例えば血清中に微量に存在す
る胆汁酸等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成
分を例えば蛍光光度計等の検出器によつて直線検
出することが困難な場合には、酵素の触媒作用を
利用して、被測定成分の酵素の存在下に反応する
反応物を予め加えておいた試料液を担体に固定化
された酵素が充填されたカラム（これを固定化酵
素カラムと称する）に導き、そこで被測定成分と
反応物を反応させ還元型補酵素を生成させ、これ
を蛍光検出器により検出し、試料液中に含まれる
被測定成分の量を算出することが行われている。
る胆汁酸等を定量する際に、胆汁酸等の被測定成
分を例えば蛍光光度計等の検出器によつて直線検
出することが困難な場合には、酵素の触媒作用を
利用して、被測定成分の酵素の存在下に反応する
反応物を予め加えておいた試料液を担体に固定化
された酵素が充填されたカラム（これを固定化酵
素カラムと称する）に導き、そこで被測定成分と
反応物を反応させ還元型補酵素を生成させ、これ
を蛍光検出器により検出し、試料液中に含まれる
被測定成分の量を算出することが行われている。
例えば電磁波の定量においては、予めニコチン
酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD＋
と略す）を加えた試料液を、酵素3α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ（以下3α−HSD
と略す）が固定化された担体が充填された固定化
酵素カラムに通してそこで胆汁酸とNAD＋とを
反応させ、その結果、胆汁酸と等モル量の蛍光物
質NADHを生成させて該NADHを蛍光光度計で
検出するか、又は、上記で発生させたNADHを
レサズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用に
よつてNADに酸化させると同時にレサズリンを
還元させて蛍光物質であるレゾルフインを生成さ
せ、該レゾルフインの蛍光を測定することが行わ
れている。
酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下NAD＋
と略す）を加えた試料液を、酵素3α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ（以下3α−HSD
と略す）が固定化された担体が充填された固定化
酵素カラムに通してそこで胆汁酸とNAD＋とを
反応させ、その結果、胆汁酸と等モル量の蛍光物
質NADHを生成させて該NADHを蛍光光度計で
検出するか、又は、上記で発生させたNADHを
レサズリンの共存下で酵素ジアホラーゼの作用に
よつてNADに酸化させると同時にレサズリンを
還元させて蛍光物質であるレゾルフインを生成さ
せ、該レゾルフインの蛍光を測定することが行わ
れている。
しかしながら生体試料液が固定化酵素カラムを
通過しない場合に示す測定値であるブランク値を
測定しなければ正確な被測定成分量の定量が出来
ないものとなるので、従来はブランク値の測定の
為に固定化酵素カラムを設けない測定装置を別途
用意していた。しかしこの場合はブランク値の測
定及び固定化酵素カラムを通過した生体試料液の
検出値を求めるために、生体試料を２度に分けて
採取する必要があり、又検出器を別々にしている
ため秤量誤差を生じやすく、しかも測定時間が長
くなる欠点があつた。
通過しない場合に示す測定値であるブランク値を
測定しなければ正確な被測定成分量の定量が出来
ないものとなるので、従来はブランク値の測定の
為に固定化酵素カラムを設けない測定装置を別途
用意していた。しかしこの場合はブランク値の測
定及び固定化酵素カラムを通過した生体試料液の
検出値を求めるために、生体試料を２度に分けて
採取する必要があり、又検出器を別々にしている
ため秤量誤差を生じやすく、しかも測定時間が長
くなる欠点があつた。
本発明はかゝる欠点を解消することを目的とす
るものであり、その要旨とするところは、被測定
成分を含む生体試料液を固定化酵素カラムが接続
されている分岐流路と固定化酵素カラムが接続さ
れていない分岐流路に分流させ、固定化酵素カラ
ムが接続されている分岐流路を流れる生体試料液
をカラム内で固定化酵素と接触させて被測定成分
との反応を生じさせ、前記の各分岐流路を流通し
た生体試料液を合流させ、前記の各分岐流路を流
通した生体試料液を時間差をおいて同じ検出器に
到達させることにより生体試料液のブランク値及
び反応生成物を含有する生体試料液の検出値を順
次検出し、これらの検出値に基づいて被測定成分
量を定量することを特徴とする、固定化酵素を用
いた生体成分の定量法に存する。
るものであり、その要旨とするところは、被測定
成分を含む生体試料液を固定化酵素カラムが接続
されている分岐流路と固定化酵素カラムが接続さ
れていない分岐流路に分流させ、固定化酵素カラ
ムが接続されている分岐流路を流れる生体試料液
をカラム内で固定化酵素と接触させて被測定成分
との反応を生じさせ、前記の各分岐流路を流通し
た生体試料液を合流させ、前記の各分岐流路を流
通した生体試料液を時間差をおいて同じ検出器に
到達させることにより生体試料液のブランク値及
び反応生成物を含有する生体試料液の検出値を順
次検出し、これらの検出値に基づいて被測定成分
量を定量することを特徴とする、固定化酵素を用
いた生体成分の定量法に存する。
次に本発明固定化酵素を用いた生体成分の定量
法について図面を参照しながら更に詳細に説明す
る。
法について図面を参照しながら更に詳細に説明す
る。
１は緩衝液槽であり、槽内の緩衝液には酵素の
作用により被測定成分と反応しうる成分、例えば
胆汁酸分析の場合はNAD＋等が加えられている。
２は定流量ポンプであり、緩衝液を定流量で送液
するために設けられる。
作用により被測定成分と反応しうる成分、例えば
胆汁酸分析の場合はNAD＋等が加えられている。
２は定流量ポンプであり、緩衝液を定流量で送液
するために設けられる。
３は被測定成分を含む生体試料の注入器であ
り、注入器３内で生体試料と緩衝液とが合流す
る。生体試料と緩衝液は両者が均一に混合されて
生体試料液となる。生体試料液は注入器３を出た
後、分岐流路４，５に分流される。分岐流路４に
はコイル状の流通管路６を経て固定化酵素カラム
７が接続されており、又分岐流路５には前記流通
管路６と同径のコイル状の流通管路８が形成され
ている。分岐流路４，５は両者が並列に設けら
れ、ほゞ同程度の長さの流通路とされている。
り、注入器３内で生体試料と緩衝液とが合流す
る。生体試料と緩衝液は両者が均一に混合されて
生体試料液となる。生体試料液は注入器３を出た
後、分岐流路４，５に分流される。分岐流路４に
はコイル状の流通管路６を経て固定化酵素カラム
７が接続されており、又分岐流路５には前記流通
管路６と同径のコイル状の流通管路８が形成され
ている。分岐流路４，５は両者が並列に設けら
れ、ほゞ同程度の長さの流通路とされている。
分岐流路４に分流される生体試料液はコイル状
の流通管路６を経て固定化酵素カラム７に導入さ
れ、カラム７内で固定化酵素と接触することによ
りその触媒作用を受け、被測定成分が液中の反応
成分と反応して反応生成物を生成する。分岐流路
５に分流される生体試料液はコイル状の流通管路
８を経て流通する。コイル状の流通管路６，８は
例えば内径が0.2mm、長さが10mのステンレスチ
ユーブを巻回したものでこれによる圧力損失は固
定化酵素カラム７と検出器９によるよりも著しく
大きくなるので、分岐流路４，５の流量の比は
ほゞ１：１になる。
の流通管路６を経て固定化酵素カラム７に導入さ
れ、カラム７内で固定化酵素と接触することによ
りその触媒作用を受け、被測定成分が液中の反応
成分と反応して反応生成物を生成する。分岐流路
５に分流される生体試料液はコイル状の流通管路
８を経て流通する。コイル状の流通管路６，８は
例えば内径が0.2mm、長さが10mのステンレスチ
ユーブを巻回したものでこれによる圧力損失は固
定化酵素カラム７と検出器９によるよりも著しく
大きくなるので、分岐流路４，５の流量の比は
ほゞ１：１になる。
前記の各分岐流路４，５を通過した生体試料液
は合流される。合流路１０には検出器９が設けら
れており、前記の分岐流路５を流通した生体試料
液がまず検出器９に到達し、次いで若干の時間差
をおいて分岐流路４を流通した生体試料液が検出
器９に到達する。
は合流される。合流路１０には検出器９が設けら
れており、前記の分岐流路５を流通した生体試料
液がまず検出器９に到達し、次いで若干の時間差
をおいて分岐流路４を流通した生体試料液が検出
器９に到達する。
そして分岐流路５を流通した生体試料液がまず
検出器９に到達することにより生体試料液のブラ
ンク値が測定され、次いで若干の時間差をおいて
分岐流路４を流通した生体試料液が検出器９に到
達することにより反応生成物を含有する生体試料
液の検出値が順次得られる。
検出器９に到達することにより生体試料液のブラ
ンク値が測定され、次いで若干の時間差をおいて
分岐流路４を流通した生体試料液が検出器９に到
達することにより反応生成物を含有する生体試料
液の検出値が順次得られる。
検出器９による検出結果は記録計１１に記録さ
れる。
れる。
このようにして反応生成物を含有する生体試料
液の検出値及びブランク値を蛍光強度−時間曲線
として求め、その面積の差を計算すると共に、別
に測定した検量線から被測定成分の量を定量する
ことができる。検出器９を出た生体試料液は系外
に排出される。
液の検出値及びブランク値を蛍光強度−時間曲線
として求め、その面積の差を計算すると共に、別
に測定した検量線から被測定成分の量を定量する
ことができる。検出器９を出た生体試料液は系外
に排出される。
本発明方法によれば、固定化酵素カラムを通過
した生体試料液の検出値、及び、ブランク値はい
ずれも同じ装置における同じ検出器により測定す
ることができるので、生体試料の採者は一回で済
み、又秤量誤差も生じ難いものとなり、更に測定
時間を短縮することが可能となる。
した生体試料液の検出値、及び、ブランク値はい
ずれも同じ装置における同じ検出器により測定す
ることができるので、生体試料の採者は一回で済
み、又秤量誤差も生じ難いものとなり、更に測定
時間を短縮することが可能となる。
実施例
粒径約80ミクロンのセルロース微粒子を担体と
して用い、該微粒子５mlにイオン交換水５ml、
2M炭酸ナトリウム水溶液10mlを加えて撹拌した
のち、これに予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解
したアセトニトリル１mlを加え、激しく撹拌しつ
つ90秒間反応させた。こうして活性化させたセル
ロース微粒子をすばやく0.1M炭酸緩衝液（PH
9.5）、イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウム
を含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で洗浄したの
ち、3α−HSD44mgを溶解させた0.5M塩化ナトリ
ウムを含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）５mlを加
え、室温で２時間撹拌して反応させた。
して用い、該微粒子５mlにイオン交換水５ml、
2M炭酸ナトリウム水溶液10mlを加えて撹拌した
のち、これに予めシアン化ブロマイド２ｇを溶解
したアセトニトリル１mlを加え、激しく撹拌しつ
つ90秒間反応させた。こうして活性化させたセル
ロース微粒子をすばやく0.1M炭酸緩衝液（PH
9.5）、イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウム
を含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で洗浄したの
ち、3α−HSD44mgを溶解させた0.5M塩化ナトリ
ウムを含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）５mlを加
え、室温で２時間撹拌して反応させた。
次に上記の処理により3α−HSDを固定化した
微粒子表面上なお存在する活性点をブロツクする
ため、0.05％の−メルカプトエタノールを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で４℃で２
時間反応させた。
微粒子表面上なお存在する活性点をブロツクする
ため、0.05％の−メルカプトエタノールを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で４℃で２
時間反応させた。
かくして得られた酵素固定化微粒子を0.5Mの
塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH5.0）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で繰り返し洗浄したの
ち、長さ100mm、内径４mmのカラムに充填し、固
定化酵素充填カラムを用意した。
塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH5.0）、
イオン交換水及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で繰り返し洗浄したの
ち、長さ100mm、内径４mmのカラムに充填し、固
定化酵素充填カラムを用意した。
上記のようにして得たカラムを第１図のカラム
７として用い、１中にNAD＋199mgを含む
0.1Mピロリン酸緩衝液（PH9.5）を緩衝液槽１に
入れ、次いで定流量ポンプ２で1.2ml／分の流量
で送液し、送液が安定した時点で建康人の血清
0.01mlを注入器３から注入し、緩衝液と混合させ
た。かくして得られた試料液は２分されて分岐流
路４，５に夫々流通し、分岐流路５に分流した試
料液は内径２mm、長さ10mのコイル状の流通管路
８を経て流通し、又分岐流路４に分流した試料液
は内径２mm、長さ10mのコイル状の流通管路６か
ら固定化酵素カラム７を経て流通し、合流路１０
に達した。次いで検出器９に到達したが、この際
分岐流路５を流通した試料液は注入器３への注入
後20秒で検出器９に到達し、又分岐流路４を流通
した試料液は１，２分後に検出器９に到達した。
検出器９による検出は励起波長360nm、蛍光波長
460nmにより行ない、第２図に示す蛍光強度−時
間曲線を得た。この曲線からピーク(a)の面積−ピ
ーク(b)の面積の値を求め、これとは別に測定した
検量線から血中胆汁酸値8μモル／の値を得た。
７として用い、１中にNAD＋199mgを含む
0.1Mピロリン酸緩衝液（PH9.5）を緩衝液槽１に
入れ、次いで定流量ポンプ２で1.2ml／分の流量
で送液し、送液が安定した時点で建康人の血清
0.01mlを注入器３から注入し、緩衝液と混合させ
た。かくして得られた試料液は２分されて分岐流
路４，５に夫々流通し、分岐流路５に分流した試
料液は内径２mm、長さ10mのコイル状の流通管路
８を経て流通し、又分岐流路４に分流した試料液
は内径２mm、長さ10mのコイル状の流通管路６か
ら固定化酵素カラム７を経て流通し、合流路１０
に達した。次いで検出器９に到達したが、この際
分岐流路５を流通した試料液は注入器３への注入
後20秒で検出器９に到達し、又分岐流路４を流通
した試料液は１，２分後に検出器９に到達した。
検出器９による検出は励起波長360nm、蛍光波長
460nmにより行ない、第２図に示す蛍光強度−時
間曲線を得た。この曲線からピーク(a)の面積−ピ
ーク(b)の面積の値を求め、これとは別に測定した
検量線から血中胆汁酸値8μモル／の値を得た。
第１図は本発明方法の実施態様を示す説明図、
第２図は実施例において得られた蛍光強度−時間
曲線を示す。 符号の説明 １……緩衝液槽、２……定流量ポ
ンプ、３……注入器、４，５……分岐流路、６，
８……コイル状流通管路、７……固定化酵素カラ
ム、９……検出器、１０……合流路。
第２図は実施例において得られた蛍光強度−時間
曲線を示す。 符号の説明 １……緩衝液槽、２……定流量ポ
ンプ、３……注入器、４，５……分岐流路、６，
８……コイル状流通管路、７……固定化酵素カラ
ム、９……検出器、１０……合流路。
Claims (1)
- １ 被測定成分を含む生体試料液を固定化酵素カ
ラムが接続されている分岐流路と固定化酵素カラ
ムが接続されない分岐流路に分流させ、固定化酵
素カラムが接続されている分岐流路を流れる生体
試料液をカラム内で固定化酵素と接触させて被測
定成分との反応を生じさせ、前記の各分岐流路を
流通した生体試料液を合流させ、前記の各分岐流
路を流通した生体試料液を時間差をおいて同じ検
出器に到達させることにより生体試料液のブラン
ク値及び反応生成物を含有する生体試料液の検出
値を順次検出し、これらの検出値に基づいて被測
定成分量を定量することを特徴とする、固定化酵
素を用いた生体成分の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13063582A JPS5921396A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13063582A JPS5921396A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5921396A JPS5921396A (ja) | 1984-02-03 |
| JPH0243477B2 true JPH0243477B2 (ja) | 1990-09-28 |
Family
ID=15038958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13063582A Granted JPS5921396A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5921396A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60207597A (ja) * | 1984-03-31 | 1985-10-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
| JPS60241898A (ja) * | 1984-05-15 | 1985-11-30 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 |
-
1982
- 1982-07-26 JP JP13063582A patent/JPS5921396A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5921396A (ja) | 1984-02-03 |
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