JPH02447A - ヒトリンホトキシン合成遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 本発明はヒトリンホトキシン合成遺伝子′ＩＣ＋関する
。特シζ、ヒトリンホトキシン全構成するアミノ酸やペ
プチドを交換することＫより、ヒトリンホトキシンの活
性が増強された改良ヒトリンホトキシンの製造研究が遺
伝子工学的に容易になし得ること全目的として、新規に
構築さｈたヒ）　ＩＪンホトキシン合成遺伝子に関する
ものである。

〔従来の技術〕

ヒトリンホトキシン及びこれ？コードするｃＤＮＡは公
知であり、第１図に示すアミノ酸及びＤＮＡ配列が報告
されている（　Ｎａｔｕｒｅ第３１２巻７２１〜７２４
ページ、１９８４年）。

しかしながら、ここに示されているのは天然に存在する
ヒトリンホトキシンのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列であり
、これ全そのまま遺伝子工学的手法ンζよるヒトリンホ
トキシンの改良研究：て使用するＫはかなり不便である
。例えばたんばく賀の構造活性相関の研究や、生物活性
を有するたんば〈質のアミノ酸やペプチド交換によって
活性増強をはかることを目的とした場合、遺伝子の変換
全可能とする適当な制限酵素認識部位をもたない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明はかかる状況に鑑み、前述の欠点を解決するため
になされたものであり、本発明のヒトリンホトキシン合
成遺伝子は次の特徴を有する。

６塩基対パリンドロームを認識する制限酵素であるＢｓ
５Ｈｎ、ＥｃｏＲＩ　、　Ｋｐｎｌ　、　Ｈｉｎｄｌｌ
、Ｘｈｏｌ　、　５ａｃｌ　、　Ｓｍａｌ　、　Ｈｐａ
ｌおよびＢａｍＨ［の認識部位をただ１個所有するよっ
て改変されている。

（２）　　本来のヒトリンホトキシンのアミノ酸配列を
変えることなく、コドンの変更により、１００ヌクレオ
チド鎖長を１つのブロックとして、その中に存在するダ
イレクトリピートが消去されている。

（４）連続したいずれの３０ヌクレオチドをとっても、
この中の６塩基対を越えるハリンドローム配列が消去さ
れている。

まだこのような特徴を有するヒトリンホトキシン合成遺
伝子の１例として、プラスミドｐＧＨ−Ｌ９への導入を
考慮して、５′−末端にｃ１ａｌ認識配列を有し、３′
−末端に５ａｌｌ認識配列を有するようにも配慮した。

〔問題点全解決するだめの手段〕

■１合成遺伝子の設計 遺伝子を化学的に合成するには、２０〜４０ヌクレオチ
ド鎖長のオリゴヌクレオチドを合成し、その結合（・て
よって遺伝子を構築するが、その段階における目的とし
ないオリゴヌクレオチド同志の会合を避けるためにダイ
レクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ　）　ｆ
可能な限り消去することなどを行なわなければならない
。また、合成遺伝子の特徴は、たんばく質の構造活性相
関の研究や、生物活性を有するたんばく質のアミノ酸や
ペプチド交換（（よって活性増強を計るなどを行うため
の遺伝子の変換を可能にする制限酵素認識部位を導入で
きることである。

（１）　　ヒトリンホトキシン遺伝子のヌクレオチド配
列 合成遺伝子の基本となるヌクレオチド配列は、そのたん
ばく質のアミノ酸配列のみが判明している場合には、そ
れぞれのアミノ酸に対する適当なコドンを選訳すること
により決定する。

方、目的のたんばく質の遺伝子のヌクレオチド配列ある
いは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列が決
定している場合にはその配列を合成遺伝子のヌクレオチ
ド配列の基本とする。

ヒトリンホトキシンの場合にはｃＤＮＡのヌクレオチド
配列が報告（ｍ１図）されているので（Ｎａｔｕｒｅ　
、第３１２巻７２１〜７２４ページ、　１９８４年）、
それを合成遺伝子設計の基本とした。

（２）　　合成遺伝子の５′−および３′−末端修飾さ
れた成熟ヒトリンホトキシンのＮ−末端のアミノ酸はロ
イシンであるが、翻訳開始を効率よく、しかも目的のＮ
−末端を得るためにメチオニンのコドンをロイシンのコ
ドンの上流に付加した。一方、翻訳の終結を完全にする
ために３′−末端にはナンセンスコドンに２つ直列に付
加した。

さらに構築した合成遺伝子をプラスミＰに挿入すること
を考慮し、プラスミドの５′−および３′−両付着末端
に対応する付着末端を遺伝子の両末端に付加する。ヒト
リンホトキシン遺伝子の場合はベクタープラスミドｐＧ
Ｈ−Ｌ９のＣ１ａ　ＴおよびＳａｌ　ｌ認識部位へ挿入
するのが好ましいので（第８図）、ヒトリンホトキシン
遺伝子の５７−末端にはＣｌａＩ認識配列、３′−末端
にはＳａｌ　ｒ認識配列を付加した（第２図）。

（３）　　制限酵素認識部位の挿入 遺伝子変換の一つの方法としてカセット変換があるが、
このためＫは適当な制限酵素認識部位の存在が必要であ
る。制限酵素認識部位は目的の遺伝子の任意の部位に一
ケ所であることが望ましいので、遺伝子を組込んだプラ
スミドのＤＮＡ配列も含めて遺伝子内の１ケ所のみを開
裂するＳＩＩ限酵素の選択が必要である。本発明のヒト
リンホトキシン遺伝子の場合には６塩基対・ぞリント°
ロームを認識する制限酵素全選択した。

ヒトリンホトキシン遺伝子内をコンピューター検索（Ｃ
より制限酵素認識部位全検索した結果、適当な部位は検
出されなかった。そこで、６塩基対認識の制限酵素につ
いて、ヌクレオチドの積換てより制限酵素認識部位の導
入が可能であるか調べた。第３図に例？示したように、
制限酵素Ｂ　ｓ　ｓ　Ｈ［１の認識配列はＧＣＧＣＧＣ
であり、この配列から可能なアミノ酸配列は図の様にな
り、これらの中からヒトリンホトキシンのアミノ酸配列
と一致するものを、選択するとＮ−末端ロインンから１
４．１５番目’／ＣＡｌａ−Ａｒｇという配列が一致す
る。そこでこの部位のヌクレオチド配列を見ると（）Ｃ
ＣＣＧＴであるので、これ全ＧＣＧＣＧＣに変更すれば
アミノ酸配列？変えることなくこの部位（・てＢｓ５Ｈ
■の認識部位全導入できたことてなる。

同様にして、ＥｅｏＲＩ、Ｂｉｎｄｌｌ、Ｋｐｎｌ　１
Ｘｈｏｌ　５Ｓａｅｌ　、　　Ｓｍａｌ、Ｈｐａ　Ｉ、
ＢａｍＨｌの認識部位が第２図に示す位置に導入された
。

（４）　ダイレクトリピートの消去 コンピューター全利用して５ヌクレオチド鎖長以上のダ
イレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐａａｔ）をヒ
トリンホトキシン遺伝子てついて検索すると、多数のｄ
ｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔが発見される。第４図に一例
を示したが、このような長鎖のｄｉｒｅｃｔｒｅｐｅａ
ｔが相互に近くに存在すると、合成したオリゴヌクレオ
チドのアニーリング２行ない、Ｔ４リガーゼにより結合
して遺伝子を構築する際て、Ｇｌｎ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏの
配列を含むオリゴヌクレオチドト５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕの配列を含むオリゴヌクレオチド°の相補鎖との間の
会合またはその逆の会合が起る可能性がある。これによ
り目的の遺伝子の構築が不可能となるので、アミノ酸配
列？変えることなくコドンの変更によりｄｉｒｅｃｔ　
ｒｅｐｅａｔ　’ｉ消去する。約１００ヌクレオチド鎖
長ｆ、１つのブロックとしてその中に存在するｄｉｒｅ
ｃｔ　ｒｅｐｅａｔをほとんど消去する。しかし、ヌク
レオチドの置換により新たにｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａ
ｔを生ずることがあるので、ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａ
ｔの検索、消去は数回操り返し行なって完全て消去した
。

（５）　　合成すべきオリゴヌクレオチド−＼の区切以
上の操作により合成すべき遺伝子のヌクレオチド配列が
決定したので、次は、実際に化学合成するオリゴヌクレ
オチドへの区切りである。

オリゴヌクレオチドの鎖長は手動で行なうか、自動合成
機？用いるか（てより異なるがヒトリンホトキシン遺伝
子の場合は自動合成機全用いること、合成後のオリゴヌ
クレオチｒの精製の容易さを考這して３０ヌクレオチド
°前後の鎖長とした（第２図νておけるＵ１〜Ｕ１８及
びＬ１〜Ｌ１８）。

人工遺伝子の最初の例はＫｈｏｒａｎａらにょるｔＲＮ
Ａ遺伝子の合成であり（Ｎａｔｕｒｓ　第２２７巻、２
７〜３・１（−・〕（１１９７０年）、この時、隣接す
るＤＮＡフラグメントが相補鎖と数塩基形成するようン
ζ重なり合うよう：てした　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒ
ｙｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　　と呼＋ｒれ
る遺伝子の構築が行なわれたが、現在までの各種の遺伝
子の合成のほとんどの例かこＩして習っている。本発明
のヒ）　ＩＪンホトキシン遺伝子の合成のためのオＩＪ
　＝＋’　ヌクレオチドの設計も同様にこの方法に従っ
た。

（６）　　パリンドローム配列の消去 合成すべきオリゴヌクレオチドの設計が終ったところで
調べなければならないのは、合成の基本となる同−断片
内のオリゴヌクレオチド領土１’（／ｆリントローム構
造があるとｈａｉｒ　ｐｉｎ構造全作るため目的のオリ
ゴヌクレオチド同志の会合が得られない。また、二本鎖
オリゴヌクレオチドの結合部位ＩＣパリンドローム構造
が存在すると同一二本鎖ＤＮＡの二；化が起り、目的の
ＤＮＡ間の結合が効率よく行われない。そこで第５図に
示すようにヌクレオチドの置換シてよってこれらの障害
？消去しなければならない。

以上の操作（でより合成すべき遺伝子の講造が設計され
たことしてなる。

■、オリゴヌクレオチドの合成とｎＭ オリゴヌクレオチドの合成は自動合成像と用いてホスフ
ァイト法により行つった。ヌクレオチドとしてはアデニ
ン−ダアニンー　シトシン−チミンヌクレオシドのβ−
シアンエチルホスホロアミダイトヲ用い、活性化剤には
テトラゾールを用いた。合成の終った自動合成機からは
保護基を有するオリゴヌクレオチドが得られるので、濃
アンモニア水中で６０℃、５時間加熱してアシル保護基
およびリン酸の保護基全除去する。かくして得られた目
的のオリゴヌクレオチドの５７−末端はソメトキシトリ
チル（ＤＭＴｒ　）基全有しているので、この脂溶性を
利用して逆相クロマトグラフィーによる分離を行なうこ
とが出来る（第７図ａ）。ＣＨ３０Ｎを溶剤とした直線
濃度勾配によりオリゴヌクレオチドを溶出した。続いて
、ＤＭＴｒ基を有するオリゴヌクレオチドｆ８０チ酢酸
中室温で２０分処理してＤＭＴｒ基を除去した。これに
より完全に保護基が除去されたオリゴヌクレオチドが得
られ、これをＨＰＬＣにより精製した。

ＨＰＬＣによる精製は最初に逆相のＨＰＬＣを行なって
不純物を除き（第７図ｂ）、続いて、イオン交換ＨＰＬ
Ｃによる分析を行なって純度を検定し、必要に応じて分
取を行なって精製する（第７図Ｃ）。この操作によりほ
ぼ１００チ純度のオリゴヌクレオチドが数ＯＤから１０
数ＯＤ得られる。

本発明のヒ）　ＩＪンホトキシン遺伝子については３５
種のオリゴヌクレオチド（第２図に示されたＵ１〜Ｕ１
７・Ｕｌ８及びＬ１〜Ｌ１８）が合成、精製された。

■、　ヒトリンホトキシン遺伝子の、構築遺伝子の構築
は、オリゴヌクレオチドの５′−リン酸化の後に約１０
０ヌクレオチド鎖長を１つのブロックとしてアニーリン
グし、Ｔ４　　りが−ゼにより第一段階の結合を行なっ
て二本鎖ＤＮＡ　ｆ　Ｏツクと得、つづいて、それらを
Ｔ４−９ガーゼで結合することにより行なわれる（第８
図）。

（１）　　リン酸化 ヒトリンホトキシン遺伝子の＋、−両鎖両路７−末端に
相当するオリゴヌクレオチド（Ｕｌ。

Ｌｌ　）’ｉ除いて、１６種のオリゴヌクレオチドそれ
ぞれをＡＴＰ存在下、ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てリン酸化を行なった。すなわち、０、１００　ｕｎｉ
ｔのオリゴヌクレオチドを９．５μｔの５０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ８，０）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ
２．１０ｍＭβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１
　ｍＭスペルミン、１ｍＭＡＴＰ　’ｉ金含有る緩衝液
に溶解し、３　ｕｎｉｔ　（０，５μｔ）のＴ４　ｆリ
ヌクレオチドキナーゼを加えて、３７℃で９０分インキ
ュベートすることによって、５′−末端がリン酸化され
たオリゴヌクレオチド°が得られる。

（２）　　オリゴヌクレオチドの結合（遺伝子の構築）
リン酸化を行なったオリゴヌクレオチド全約１００ヌク
レオチド鎖長のＤＮＡブロックになるように合し、６６
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，６）　−６，６ｍ
Ｍ＞ＡｇＣ１２−０，５ｍＭ　ＡＴＰ　とした混合物（
最終容積１００μｔ）を加熱（９０℃、３分）後徐冷し
、７００　ｕｎｉｔのＴ４　ＤＮＡリガーゼを加えて１
５℃で２時間インキュベートした。つづいて、フェノー
ル処理により除たんばく全行ない、エタノール沈澱法に
よりＤＮＡを回収した後に、１０ｍＭＴｒ１ｓ−ＨＣＩ
　（ｐｉ（ｓ、ｏ　）　−１鮨ＥＤＴＡを含む緩衝液の
少量に溶解し、電気泳動のマーカーであるブロム・フェ
ノール・ブルーを加えて１０％ポリアクリルアミドゲル
にアプライする。３００ｇルト定電圧で約２時間泳動を
行なった。泳動後、エチソウムブロミドで染色し、目的
とする鎖長のＤＮＡ　Ｋ対応する部分のゲルを切り取っ
た。次いでこのゲルを透析チューブに入れ電気泳動を行
ナッてゲルからＤＮＡ　ｉ溶出し、エタノール沈澱法に
よりＤＮＡを回収した。かくして得られたＤＮＡブロッ
ク全第１表に示す。

第１表　第−段階目のリゲーションと鎖長次に、　ＤＮ
Ａブロック■〜ｖを合して第−段階目のリゲーションと
同じ緩衝液の条件下、同じ量のＴ４すが−ゼを加えて２
０℃で２時間インキュベートした。フェノール処理、エ
タノール沈澱を行なった後に、５チポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行ない、目的のヒトリンホトキシン遺伝
子（５２２塩基対）に相当する鎖長のＤＮＡをゲルから
回収した。以上の操作により約５　ｐｍｏｌのヒトリン
ホトキシン遺伝子が得られた。

■、　ヒトリンホトキシン遺伝子のベクターへの挿入ヒ
トリンホトキシン遺伝子の発現のた衿プロモーターには
大腸菌のトリプトファンプロモーター（Ｔｒｐ）を採用
した。すなわち、Ｔｒｐプロモーターを用いた遺伝子発
現系としてヒト成長ホルモン遺伝子の発現のために構築
されたプラスミドｐＧＨ−Ｌ９　（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　第８１巻　５９５６
〜５９６０ベーノ（１９８４年））ヲヒトリンホトキシ
ン遺伝子挿入のだめのプラスミドベクターとして選択し
た。

プラスミドｐＧＨ−Ｌ９を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＳａ
ｌ　Ｉで消化し、１０チポリアクリルアミドゲル電気泳
動によりヒト成長ホルモン遺伝子全欠失したプラスミド
ベクター全分難した。このベクター（１μグ）と先に得
だヒトリンホトキシン遺伝子を６６　ｍＭ　’ｒｒｉｓ
−Ｈｃｚ　（ｐＨ７，６）、６．６　ｍＭ　崗ｃｔ２．
０５鮨ＡＴＰ１１０ｍＭβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ
ｎｏｌ　ｆ含む緩衝液に溶解した後Ｔ４リガーゼ３５０
ｕｎｉｔｉ加え、２０℃で２時間インキュベートすると
Ｔｒｐプロモーターの下流にヒトリンホトキシン遺伝子
を組込んだシラスミドｐＴＬｙｍが得られるので、エタ
ノール沈澱〈より回収した（第８図）。

■、　ヒトリンホトキシン遺伝子の発現（１１ｐＴＬｙ
ｍの大腸菌へのトランスホーメーション プラスミドの大腸菌へのトランスホーメーションはＣａ
２＋処理法を用いた。

Ｃａ２＋処理した大腸菌ＨＢＩＯＩの懸濁液１００　ｔ
ｔｔに氷冷下ｐＴＬｙｍ　ｆ加え、水冷Ｔ１０分放置し
た。

つづいて、培養液全４２℃で６０秒間加熱し、その後室
温にもどしだ。これに１ＮのＬ−Ｂｒｏｔｈ培養液を加
えて３７℃で４０分培養し、冷却遠心機により集菌して
上滑を捨て、再び０，３廐のＬ−Ｂｒｏｔｈ培養液に悲
濁した。つづいて、懸濁液の１００μｔづつをアンピシ
リン添加寒天培地上に塗抹し、それを３７℃で一昼夜培
養した。この操作によりｐＴＬｙｍによってトランスホ
ームされた大腸菌が寒天培地上にコロニー全形成する。

１μ２のベクターから出発して得たｐＴＬｙｍ　Ｋよっ
て１０個のコロニーが得られた（　ｐＴＬｙｍ−１〜ｐ
ＴＬｙｍ　−１０）。

（２）　　ヒトリンホトキシン遺伝子を含む大腸菌のス
クリーニング ｐＴＬｙｍによって大腸菌ＨＢＩＯＩのトランスホーマ
ントが得られたので、これらのトランスホーマントにヒ
トリンホトキシン遺伝子が含まれるかどうかｆ　ｒａｐ
ｉｄ　ｂｏｉｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　；　３６５〜３６７ページ、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　１９８２年発行）により分析した。

１０個のコロニーから大腸菌の一部ｉ　！Ｊ９ｃＡ液体
培地（５ｍｔ）に移植して３７℃で一昼夜培養する。培
養液から０．１　ｍｌ　ｆ採り遠心知より大腸菌を集め
、リゾチーム存在下１００℃で溶菌する。溶菌溶液の遠
心分離全行なって上清を採り、イソプロ・ぐノール沈澱
を２回繰返してプラスミドを得る。このプラスミドを適
当な緩Ｓ液に溶解して、制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ａｉ
ｌ　Ｋよる消化を行ない、フェノール処理の後Ｋ　］）
ＮＡ　ｋ回収した。回収したＤＮＡｔｌＯ％ｒリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって、５２２塩基対のＤｌｉ
Ａフラグメント（ヒトリンホトキシン遺伝子に相当）の
存在を確認した。その結果、ｐＴＬｙｍ−１、ｐＴＬｙ
ｍ−５、ｐＴＬｙｍ−８、ｐＴＬｙｍ−１０Ｋついてヒ
トリンホトキシン遺伝子の存在が確認された。

（３）　　ヒトリンホトキシン遺伝子の発現（その１）
ヒトリンホトキシン遺伝子の存在が確認された大腸菌ト
ランスホーマント、４種類についてヒトリンホトキシン
たんばく質の生成を調べだ。

Ｍ９ＣＡ培地中で培養した大腸菌１００μｔｆ再びＭ９
ＣＡ培地５ｍ１Ｋ移植し、３７℃で１時間培養する。こ
れに最終濃度４０μり／ｍｌとなるようにインドールア
クリル酸（ＩＡＡ）を加えてインダクションした後再び
培養を続け、２時間ごとに培養液の濁度（Ａ６６０　ｕ
ｍ　）″ｊｒ：測定した（第９図）。第９図中、屋１、
Ａｉ５、Ａ９はそれぞれｐＴＬｙｍ−１、ｐＴＬｙｍ−
５及びｐＴＬｙｍ−９で示される大腸菌トランスホーマ
ントを示し、ｐＧＨ−Ｌ９はヒトリンホトキシン遺伝子
を含んでいないシラスミドｐＧＨ−Ｌ９で形質転換した
大腸菌を示す。インダクション後８時間と２３時間の培
養液１１００μを採り遠心分離により集菌し、つづいて
、大腸菌をＳＤＳ存在下１００℃で溶菌した。この溶菌
液についてＳＤＳ　−１５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行ない、クマシーブリリアントブルーによる染
色後、ヒトリンホトキシンに対応するバンドの存在を確
認した（第１０図）。その結果、２１０００の分子量マ
ーカーたんばく質の近傍にたんばく質の存在が認められ
た。ゲルスキャナーによる分析の結果、このたんばく質
はインダクション８時間で大腸菌全たんばく質の３．５
７憾に相当し、２３時間では４．７９％に増加していた
。以上のようにヒトリンホトキシン遺伝子を大腸菌中で
発現させた結果、ヒトリンホトキシンが産生されている
ことが判明した。

（４）　　ヒトリンホトキシン遺伝子の発現（その２）
０．５％（ｗ／ｖ　）カザミノ酸及び４０μり／ｍｉア
ンピシリン全含有するＭ９培地（６？／ＺのＮａ２ＨＰ
Ｏ４゜３ｔ／！のＫ）１２Ｐ○４，２．５ｒ、／ＡのＮ
ａＣＡ　、　１９／ＩｋのＮＨ４Ｃｌ　、　０．２　％
　（ｗ／ｖ）のブドウ糖、　２ｍＭのＭｇＳＯ４，０，
１ｍＭのＣａＣｌ２及び１０ｑ／Ａの塩酸チアミン）５
ｍｌ中３７℃で約１２時間、前記Ｖの（１）　、　（２
）で調整したＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩの形質転換体、
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／ｐＴＬｙｍ　ｆ前培養し
た。次いでこの前培養液２　ｍｌを上記のカザミノ酸お
よびアンピシリン含有のＭ９培地２００　ｍｌに加え、
約２４時間振盪培養した。

培養後集菌した大腸菌をスタンダード・バッファーＣ３
０ｍＭトリス−ＨＣｔ（ｐｉ（ｓ、ｏ　、　３０　ｍＭ
のＮａＣｔ）で洗浄し、次いで５　ｍｌのスタンダード
・バッファーに懸濁し、０．１ｍＭのＰｈｅｎｙｌｍｅ
ｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ　、１０
　ｍＭのＥＤＴＡ　ｉ加えた。

次いで、上記葱濁液にリゾチームを１１ｅになるように
、リゾチーム１０■ｆｉｅ　Ｈ２Ｏの液を加え０℃３０
分間放置した。

次に、ドライアイスで冷したアセトンを用いて凍結融解
を５回くりかえし、２５０００　Ｙで１時間遠心した。

この上清をヒトリンホトキシンの粗抽出物とする。

尚、この方法はナガタらの方法（Ｎａｔｕｒｅ　＋第２
８４巻屋２７，３１６〜３２０に−）、　（１９８０年
））全参考に一部改良を加えた。

（５）　　ヒトリンホトキシン粗抽出物の抗腫瘍活性の
測定 ヒトリンホトキシンの粗抽出物を用い今回発現したヒト
リンホトキシンのおよその活性を測定した。

１）粗抽出物中のヒトリンホトキシン量の測定ヒトリン
ホトキシンの粗抽出物’ｅ　０．１　％　（ｗ／ｖ）の
ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｃ１５％
　（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド、０．４％（ｗ／ｖ　）ビ
スアクリルアミド、３７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８，８）〕で分析し、高滓ＭＤｕａｌ−ｗａｖｅ　ｌｅ
ｎｇｔｈＴＬＣ５ｃａｎｎｅｒ　Ｃ５−９００で含量を
測定したところ、粗抽出物中のヒトリンホトキシン含量
は約５〜８チであった。

２）抗腫瘍活性の測定 Ｂ、　Ｂ、　Ａｇｇａｒｗａｌらの方法（Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　第２６０巻、Ａ４２３４５−２３５４ベー
ノ、（１９８５年）〕　に基づいて行なった。

ヒトリンホトキシンの粗抽出物ｔ　０．１■から１０−
６巧までいくつかに希釈し、９６ｗｅｌｌミクロプレー
トに分注した。これに０．１　ｍｌのＬ−９２９細胞（
３Ｘ　１０　ｃｅｌｌｓ／ｍ／　）と、１μグ／ｍｌの
アクチノマイシンＤを加え、５　％　Ｃｏ２存在下、１
８時間培饗した。上清を廃棄した後、９６−ｗｅｌｌ　
ミクロプレートラ生理食塩水（０，９％　（ｖ／ｖ）の
ＮａＣ２）で２回洗浄した後、０．５　％　（ｗ／ｖ）
のクリスタルバイオレット（メタノール：水　１：４）
ｔ’ｌｏ。

μｔずつ分注し、２０分間放置する。

クリスタルバイオレット液を廃棄した後、生理食塩水で
３回ミクロプレート全洗浄し、次いで１　ｆｙ　（ｗ／
ｖ）のＳＤＳ水溶液’！ｒ　２００　ｔｔｔ加え３０分
間放置する。

放置したのち、この液’ｔ５４０ｎｍで吸光度を測定し
、これより活性を計算したところ、２〜４　ｘ　１０’
　ｕｎｉｔｓ／巧の細胞毒性を示した・３）　ヒトリン
ホトキシン粗抽出物の粗精製前記Ｖの（４）で調整した
粗抽出物全粗精製した。

精製にはＱ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ
　（ファル’？シア製）　ｔ　ｓ、　ｓ　ｍｔ使用した
カラムを用いた。

バッファーは２０ｍＭのトリス−Ｈｃｔ　（ｐＨ８，０
）、０、１　ｍＭのＰｈｅｎｙｌ−ｍｅ　ｔｈｙｌｓｕ
ｌ　ｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒ　ｉｄｅと０．０１％（ｗ
／ｖ）の１４ａＮ３ｆ用い、ＮａＣ４でＯＭから０．２
Ｍへのグラｌ−）エンドで４００　ｒｎｌで溶出した。

そのときの流速は３０ｍ１／ｈである。

粗抽出物を２０　ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ＰＦ（８，
０）で２倍に希釈したのちカラムによって粗精製を行な
った。

尚、この操作でヒトリンホトキシンは５倍に濃縮された
。この粗精製ヒトリンホトキシンの活性を測定したとこ
ろ、約１０６ｕｎｉｔｓ／■の細胞毒性を示した。

〔効果〕

上述のように、本発明のヒトリンホトキシン合成遺伝子
は、ヒトリンホトキシンを構成するアミノ酸やペプチド
の交換が、遺伝子工学的に容易になし得るように設計さ
れているので、遺伝子工学的手法による改良り／ホトキ
シンの製造研究に非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は既知のヒトリンホトキシンｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列を示し、第２図は本発明のヒトリンホトキシン
合成遺伝子のヌクレオチド配列の１例を示す。 第３図は制限酵素認識部位の導入の１例を示し、第４図
はダイレクトリピートの１　ｆＩＩを示ス。 第５図は・マリンドローム構造消去の１例を示し、第６
図はオリゴヌクレオチドの合成Ｅｋｔ示し、第７図はＨ
ＰＬＣによるオリゴヌクレオチドのＮＭを示す。 第８図は本発明のヒ）　ＩＪンホトキシン遺伝子の構築
例とプラスミドへの挿入を示す。 第９図は大腸菌トランスホーマントの増殖を示し、第１
０図はＳＤＳ　−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による生成ヒトリンホトキシンの確認を示す。図中Ｉ
ＡＡ　（Ｅ）はＩＡＡ無添加を示し、■はＩＡＡ添加を
示す。また矢印は２１０００の分子量マーカーの位置を
示す。 第１図へ ２、 特許出卯人三共株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の特徴を有するヒトリンホトキシン合成遺伝子 （１）６塩基対パリンドロームを認識する制限酵素であ
   るＢｓｓＨII、ＥｃｏＲ I 、Ｋｐｎ I 、ＨｉｎｄIII
   、Ｘｈｏ I 、Ｓａｃ I 、Ｓｍａ I 、Ｈｐａ I および
   ＢａｍＨ I の認識部位を１個所だけ有するように改変
   されている。 （２）本来のヒトリンホトキシンのアミノ酸配列を変え
   ることなく、コドンの変更により、１００ヌクレオチド
   錯長を１つのブロックとして、その中に存在するダイレ
   クトリピートが消去されている。 （３）連続したいずれの３０ヌクレオチドをとつても、
   この中の６塩基対を越えるパリンドローム配列が消去さ
   れている。 ２．５′−末端にＣｌａ I 認識配列を有し、３′−末
   端にＳａｌ I 認識配列を有する特許請求の範囲第１項
   記載のヒトリンホトキシン合成遺伝子。 ２、次のＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１項また
   は第２項記載のヒトリンホトキシン合成遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】