JPH02453A - ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドを
コードする遺伝子に関する。

［従来の技＃１１ ５−リポキシゲナーゼは、アラキドン酸から５−ヒドロ
ペルオキシ−６，８，１１，１４−エイコサテトラエノ
イック酸（５−ＨＰＥＴＥ）の形成を触媒し、さらにこ
れを５．６−オキシド−７，９，１１，１４−エイコサ
テトラエノイック酸（ロイコトリエンＡ４）に変換する
酵素である。ａイコトリエンＡ４はさらに他の酵素によ
ってペプチドロイコトリエンやロイコトリエンＢ４に変
換される。すなわち、５−リポキシゲナーゼはロイコト
リエンの生合成における最初の２段階を触媒し、またロ
イコトリエンとは構造が異なるがアラキドン酸から由来
するりホキシンの形成にも関与している。

ロイコトリエンおよびリボキシンの生物活性は未だ不明
の点が多い、しかし、現在、ロイコトリエンは、平滑筋
の収縮や炎症惹起に関して重要な役割を持っていること
が明らかになっている。その他の主な生物活性として、
気管支粘膜分泌物分泌亢進作用、インスリン分泌亢進作
用（膵ＩＩＩ）　。

黄体形成ホルモン分泌亢進作用（脳）、白崩球活性化作
用、サプレッサーＴ細胞の活性増強作用。

ナチュラルキラー細胞の活性増強作用、インターフェロ
ン産生増強作用等の生物活性がある。これらのうちいく
つかは、ある種の病態を改善できる可能性のある生物活
性である。ロイコトリエンおよびリボキシンの実際の利
用については骨随増殖性疾思等による後天的なりボシキ
ゲナーゼ欠損思書への適用などが考えられる。

５−リポキシゲナーゼを得る手段として報告されている
ものは、それぞれ、ヒト白血球［ブロシーディング−オ
ブーナショナル争アカデミックナサイエンス、米国、第
８２＠　、　８０４０頁（１９８５）　。

同第８２巻、　７５０５頁（１９８５）　、同第８３″
０．８５７頁（１！！８８）　］　、　ブタ白血球［ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカルψケミストリー、第２
６１巻、　Ｌ３８２頁（１９８８）］　、マウス骨骨内
由来スト細胞［プロシーディング・オブφナショナルー
アカデミツク昏サイエンス、米国、第８３巻、４１７５
頁（＋９８８）　］　、およびラット好塩基球性白血病
細胞Ｅプロスタグランジン、第２８巻、６８９頁（１９
８５）］から単離する方法である。これらの方法で単離
された５−リポキシゲナーゼは、活性発現のためにカル
シウムイオンを要求するという点では共通しているが、
他の活性化因子については異なった結果を示している。

さらにその分子槍についても、８０Ｋ（ヒ））、７２Ｋ
（ブタ）、７５Ｋ（マウス）、および７３Ｋ（ラット）
と異なり、それぞれが異なったポリペプチドからなって
いることを示唆している。

すなわち、ヒト５−リポキシゲナーゼは、現在までのと
ころ、ヒト白血球から単離精製する以外にその獲得４段
はない。

［発明が解決しようとする課題］ ヒｌ−５−リポキシゲナーゼをヒト白血球あるいは白血
球を産生ずる臓器から大量に単離精製し。

永続的に供給することは不可部に近い。

したがって、この発明の課題は、ヒト５−リポキシゲナ
ーゼポリペプチドを大量生産するためにそれをコードす
る遺伝子（ＤＮＡ）を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ この発ＩＩによれば、第１図に示すアミノ酸配列を有す
るヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドをコードする
遺伝子が提供される。

未発明者らは、ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチド
のアミノ酸配列を初めて決定し、これをコードする遺伝
子（相補的ＤＮＡ）を調製したものである。

ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドは、第１図に示
すアミノ酸配列を持つことが判明した。

一例を挙げると、ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチ
ドをコードするこの発明の遺伝子（相補的ＤＮＡ）は、
第２図に示す塩基配列を有する。

この相補的ＤＮＡは、第２図に示されるように、塩基番
号１から塩基＃号２０２５の合計２０２５塩広対からな
る。塩基番号１から３１ｆ？ｌｌ！開始遺伝培号に相当
する。ヒト５−リポキシゲナーゼボ）ペプチドのアミノ
酸配列を決定する遺伝暗号は塩基番号４から２０２２ま
でである。これは、第１図のヒト５−リポキシゲナーゼ
ポリペプチドの６７３アミノ酸残基に相当する。第２図
において、塩基番号２０２３から２０２５までは複製開
始遺伝暗号に相当する。

なお、第２図において、９５９は、ＴＧＡＴＡＡまたは
ＴＡＧのいずれでもよい、また、ＸおよびＹは、七れぞ
れ、複製開始遺伝暗号および複製停止Ｆ遺伝暗号と結合
している任意の塩基対を表わす、この廖、２！ｉ対の種
類および数は型費ではなく、バクテリア等の核外遺伝子
と連結するための適当な塩基対であればよい０例えば、
ＸおよびＹは、それぞれ、第３図および第４図に示す塩
１（配列を持つ。

この発明の相補的ＤＮＡはヒト由来の相補的ＤＮＡライ
ブラリーから免疫化学的方法またはプローブハイブリダ
イゼーション法を用いて得ることができる。免疫化学的
方法によれば、伝令ＲＮＡをＰＩ型にして合成された相
補的ＤＮＡを形質発現型バクテリオファージの遺伝子に
組換え、相補的ＤＮＡライブラリーを作製し、これをバ
クテリアに取り込ませて相当するポリペプチドを生産さ
せ、抗原抗体反応を目印にしてヒト５−リポキシゲナー
ゼに相当するポリペプチドを探り出し、目的の相補的Ｄ
ＮＡをＩＩｖることができる。

ブローブハイブリダイゼーシ、ン法によれば、ヒト５−
リポキシゲナーゼポリペプチドを化学的に分解し、その
所用のアミノ酸配列を化学的な方法で決定する。そのア
ミノ酸配列から予想される複数のＤＮＡ断片を化学的に
合成し、これをプσ−プとする。あるいは、免疫化学的
な方法で得られたクローンの挿入ＤＮＡをプローブとし
て使うこともできる。これらプローブを用い、相補的Ｄ
ＮＡライブラリーからプローブと相補的な塩基配列を持
つＤＮＡを得ることができる。

こうして得られた相補的ＤＮＡは、適当なベクター（プ
ラスミド、ファージ等）に挿入し、これを宿主となるバ
クテリア中で大量に生産させることができる。

なお、この発明の相補的ＤＮＡを得るための相補的ＤＮ
Ａライブラリーはヒト由来で５−リポキシゲナーゼ活性
のある臓器に由来するものであれば、いずれのものでも
よい６例えば、ヒト胎盤相補的ＤＮＡライブラリーやヒ
ト舖相補的ＤＮＡライブラリーを用いることができる。

これらライブラリーは重版されている。

このようにして、ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチ
ドを作るために必要な全ての遺伝情報を持つこの発明の
相補的ＤＮＡが得られる。

〔実施例〕

以下、この発明を実施例により説明する。以下の実施例
は、第２図におけるＸおよびＹがそれぞれ第３図および
第４図に示す塩基配列を有するＤＮＡの製造方法および
それを用いたヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドの
調製方法を説明するものである。

ヒト５−リポキシゲナーゼは、常法によりヒト白血球細
胞からドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動により単一のバンドを示すまで単離・精製した
。この精製ヒト５−リボキシゲナーゼ４００＃ｇをジチ
オスレイトールで還元し、６Ｍグアニジン増酸塩および
２ｍＭＥＤＴＡを含む０．４Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，１）に溶解したヨード［２（ｌ酢酸でカルボキシメ
チル化した。

このカルボキシメチル化５−リポキシゲナーゼポリペプ
チドを蒸留水で透析し、未反応の試薬を除去した後、９
Ｍ脱イオン化尿素１００％ｕに溶解した。この溶液に重
炭酸アンモニウムを加えるとともに最終濃度１Ｍ尿素お
よび０．１Ｍ重炭酸アンモニウムＣｐＨ８，０）となる
ように稀釈した。これにアクロモバクタ−・リティス由
来のリジンプロテアーゼ５０ｐ、ｇを直ちに加え、３７
℃で４時間反応させた。得られたペプチドを逆相液体ク
ロマトグラフィー（ウルトロパックＴＳＫ　　００５−
１２０Ｔカラム、０．１％トリフルオロ酢醜中アセトニ
トリルＯ〜８０％の濃度勾配）で分離した。ペプチドの
アミノ酸配列はアプライド・バイオシステム４７ＯＡガ
ス相シーケンサ−で分析した。得られた結果は、第１図
のアミノ酸配列中において下線で示した。

（ｂ）ヒト５−リポキシゲナーゼ 精製したヒト５−リポキシゲナーゼ（２００ｇ　ｇ　／
　９００牌文生理食墳水）を当量のフロイントの完全ア
ジュバントとよく混合して乳化させ、ウサギの背部皮下
１０＠所に注射した。この操作を２週間毎に合計４回繰
返し、３ケ月後に採血し、抗血清を得た。

この抗血清２０ｍＪ１をプロティンＡセファロースＣＬ
−４−Ｂ　（商品名）のカラムに吸着させ、３００ｍＭ
の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，１）を流し
た後、０．１Ｍグリシン塩＃緩衝液（ｐＨ３，０）と交
換し、溶出したＩｇＧ画分（１５ｍ文）を集めた。この
両分の緩衝液を常法によりＦＤ−１０カラム（商品名）
を用いて０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に交換し。

０．０５％ナトリウムアジドを加えて以後の使用のため
に保存した。

約ｌＯ＋個のバクテリオファージを含むヒト肺相補的Ｄ
ＮＡライブラリーを大腸菌Ｙｌ　０９０に吸収させて寒
天プレートに播き、４２℃で３．５時間培養した。予め
１０ｍＭイソプイソプロピルβ−オーチオガラクトビラ
水溶液に浸したニトＤセルロースフィルターをその寒天
上に置き、３７℃でさらに一晩培養した。増殖したバク
テリオファージはプラークを形成し、同時に大ｆＩ！菌
が生産したポリペプチドはニトロセルロースフィルター
１−に吸着された。

このフィルターをＴＢＳ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８，０）で
すすぎ、　　１０ｍ１Ｏ）＃ＩＲＩ　ｇＧ画分（２０％
（Ｖ／Ｖ）仔牛血清および実施例（ｂ）で得たＩｇＧ画
分０．４ｍ交を含む１０ｍ、ＱのＴＢＳ緩衝液）ととも
に室温で６時間培養した。その後、ＴＢＳ緩衝液、０，
１％（Ｖ／Ｖ）／：デー／トＰ−４０を含むＴＢＳ緩衝
液、およびＴＢＳＩ衝液の順でフィルターを洗い、２０
％（Ｖ／Ｖ）仔牛血清オヨび２０ｇ１２５■−プロティ
ンＡ　Ｃ１００μＣ５／ｒｎ！ｌ）を含む１０ｍ１のＴ
ＢＳ緩衝液とフィルターとを室温で２時間反応させた。

その後再びＴＢｓｗｉ衝液、０１ｌ％（Ｖ／Ｖ）　　ノ
ニデットＰ　−４０−Ｔ　Ｂ　Ｓ緩衝液、およびＴＢＳ
緩衝液の順でフィルターを洗い、乾燥後、−７０℃でイ
ンテンシフアイスクリーンを用いてオートラジオグラフ
ィーをおこなった。

ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドが存在するプラ
ークに相当するフィルター上にはｔ２ｒ■−プロティン
Ａが結合し、Ｘ線フィルムに黒点を生じた。この黒点を
生じたプラークのバクテリオファージを寒天プレートか
ら単離し、ヒト５−リポキシゲナーゼのクローンを得た
。

得られたバクテリオファージをベクターＭ１３ＭＰ１８
に挿入し、サブクローニングをおこない、常法（デオキ
シチェーンターミネーション法）によりＤＮＡの塩基配
列を決定した。

その結果、ＤＮＡの長さは３９７塩基対であり、第２図
の塩基配列の塩基番ｑｔｓ４９から２０２５までの１７
７塩基対と、複製停止暗号以降の第４図の塩基配列のう
ちの２２０塩基対を持っていることが判明した。塩基番
号１９２１から１９５３までの遺伝暗号と１９６９から
２０１９までの遺伝暗号は実施例（ａ）におけるペプチ
ドの分析結果［第１図に示すヒト５−リポキシゲナーゼ
ポリペプチド鎖の６４０残基から６５０残基および６５
６残基から６７２残基］と一致し、この３９７塩基対の
ＤＮＡはヒト５−リポキシゲナーゼの遺伝情報を持つこ
とが確認された。

定 実施例（ｃ）で得た３９７塩基対のＤＮＡ断片を常７人
により３１ｐで標識（約１０　　ｄｐｍ／μｇ）し、ヒ
ト胎盤相補的ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用
いた。

約１０４個のバクテリオファージを含むライブラリーを
大腸菌Ｙ１０９０に吸収させて寒天プレートに播き、３
７℃で一晩培養した。その後、２枚のニトロセルロース
フィルターを各々１分間ずつ寒天プレートの上に・戒せ
、このフィルターにバクテリオファージＤＮＡを吸着さ
せた。このフィルターを１．５Ｍ塩化すトリウムを含む
０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液上に置き、ＤＮＡを変性
させ、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍト
リス廖耐酸緩衝液ｐＨ８，０）上に置き中和させた。こ
のフィルターを乾燥後、８０℃で２時間加熱した。室温
に戻した後、５０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、５Ｘデン
ハルツ液（ｌｘは０．０２％フィコール、０．０２％ポ
リビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン）
、５ｘＳＳＰＥ　（ｌｘは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
ｌ　ｍＭＥＤＴＡ、ｌ　０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７，４））、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、および
１ｍＭ当り１１００ＪＬの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中
で４２℃で一晩反応させた。

Ｌ記反応溶液に、３２ｐで標識した３９７塩基対のＤＮ
Ａ　（１ｋｇ）を加えてさらに２４時間ハイブリダイゼ
ーション反応をおこなった。その後。

フィルターを０，１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む３
００ｍ、Ｑ（７）２ｘＳＳＣ（ｌｘは０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１５ｍＭクエン酸ナトリウム塩酸緩衝液
（ＰＨ７，０））により室温で３回５分間ずつ洗い、さ
らに０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む３００ｍｆ
Ｌの１ｘＳＳＣにより２回１時間ずつ洗い、さらに０．
１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む３００ｍ１（１）０
．２ｘＳＳＣにより６８℃で１回１時間洗った。フィル
ターを乾（１させ、−７０℃でインテンシフアイスクリ
ーンを用いて一晩オートラジオグラフィーをおこなった
。

ヒト５−リポキシゲナーゼの相補的ＤＮＡを挿入してい
るバクテリオファージＤＮＡには３２ｐで標識した３　
９７Ｊｆｉ基対のＤＮＡプローブが接合した。したがっ
てニトロセルロースフィルターに吸着されたバクテリオ
ファージＤＮＡのプラークに相当する部分はｘｉＩフィ
ルムに黒点を生じさせた。この黒点を生じたプラークの
バクテリオファージを寒天プレートから単離し、長さの
異なる挿入ＤＮＡを持つ３種のクローンを得た。それぞ
れ約１６００塩基対、約２２００ｆＪｌ基対、および約
２６００塩基対の挿入ＤＮＡを持ったクローンであった
（以下、それぞれ、入ｐｕ９ＡＳ、入ｐ１６ｓ、および
λｐ交５ＢＳという）。

得られたバクテリオファージをベクターＭ１３ＭＰ　１
８に挿入し、サブクローニングし、常法（デオキシター
ミネーション法）によりＤＮＡの塩基配列を決定した。

クローン入ｐ１５Ｂｓは２５５１塩基対を挿入ＤＮＡと
して含み、複製開始遺伝暗号ＡＴＧから複製停止遺伝暗
号ＴＧＡまでの２０７３塩基対を連続したオープンリー
ディングフレームとして持っていた。しかし、このＤＮ
Ａ中には第２図に示す塩基番号１２２９から１２７９ま
での５１個の塩基対が繰返されて塩基番号１２２８と１
２２９の間に存在していた。他のクローンλｐ１９Ａｓ
および入ｐ１６ｓの挿入ＤＮＡの塩基配列は、この繰返
し部分を除いてクローン入ｐ文５ＢＳの挿入ＤＮＡの塩
基配列と完全に重なり合った。したがってクローン入ｐ
文５ＢＳの挿入ＤＮＡが持つ５１（［１の塩基対の繰返
し構造は相補的ＤＮＡ合成時に生じた、本来のヒト５−
リポキシゲナーゼの相補的ＤＮＡには存在しない人工物
と結論付けられた０本来のヒト５−リポキシゲナーゼを
発現するための正しい相補的ＤＮＡは第２図に示したＤ
ＮＡ塩基配列である。第２図に示した相補的ＤＮＡは常
法によりクローンλｐ１５Ｂｓの挿入ＤＮＡの２箇所の
Ｘｍａｌ制限酵素の認識塩基配列ではさまれている部分
の４２２＃１基対（人工的に生じた５１＃１基対を含む
）のＤＮＡを同酵素で切り出し、クローン入ｐｕ６ｓま
たは入ｐ１９Ａｓの挿入ＤＮＡの２箇所のＸｍａｌ制限
酵素の認識塩基配列ではさまれている部分の３７１塩基
対（人工物を含まない）のＤＡＮと交換し、合成酵素Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにより合成した。第２図に示したＤＮ
Ａ塩基配列から誘導されるアミノ酸配列は第１図に示し
た通りである。実施例（ａ）で得られた結果は、ＤＮＡ
塩基配列から誘導されたアミノ酸配列と一致し、この相
補的ＤＮＡはヒト５−リポキシゲナーゼに相当すること
を示した。

（ｅ）ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチド■ ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドがバクテリアに
よって発現されるか否かを確認するために抗体選択試験
をおこなった。

第２図に示す相補的ＤＮＡの塩基番号１８４９から２０
２５までの１７７塩基対と第４図に示−す複製停止遺伝
暗号以降の２２０塩基対からなる３９７塩基対のＤＮＡ
が挿入された発現ベクター（バクテリオファージ入ｇｔ
ｌｌ）および挿入ＤＮＡのないバクテリオファージ入ｇ
ｔｌｌそれぞれ０．５ｘｌＯ’個を大腸菌Ｙ１０９０に
吸収させて、寒天プレートに播き、４２℃で３．５時間
培養した。予め１０ｍＭインプロピルβ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド水溶液に浸したニトロセルロースフィル
ターをその寒天プレート上に置き、３７℃でさらに一晩
培養した。

増殖したバクテリオファージはプラークを形成し、同時
に大ｍｉが産生じたポリペプチドはニトロセルロースフ
ィルターに吸着された。このフィルターをＴＢ　Ｓ緩衝
液ですすぎ、１０ｍ文の稀釈ＩｇＧ画分と室温で６時間
培養した。その後、ＴＢＳ縛１ｉ液、０．１％（Ｖ／Ｖ
）／：デッドＰ−４０を含むＴＢＳ緩衝液、ＴＢＳ！ｌ
衝液の順でフィルターを洗った。このフィルターを０．
１５Ｍ塩化ナトリウムを含むＯ，１Ｍグリシン塩酸緩衝
液（ｐＨ２，６）２ｍ文中で２０℃で１５分間振盪し、
結合した抗体を抽出した。

抽出液に２ｍ文の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
を加えて中和し、さらに２０％（Ｖ／Ｖ）好手血清およ
び０１０５％ナトリウムアジドを含むＴＢＳ緩衝液６ｍ
Ｍを加え、これをプロット試験に用いた。

ニトロセルロースフィルターに、ｊ！製したヒト５−リ
ポキシゲナーゼ１鉢ｇ、０．５鉢ｇ・１）　、　２５１
１　ｇを吸着させ、乾燥した後、ＴＢＳ緩衝液ですすぎ
２２０％（Ｖ／Ｖ）好手血清を含むＴＢＳ緩衝液に３０
分間浸した。このフィルターを」二足抗体抽出液（約１
０ｍＪｌ）中に浸し、−晩抗原抗体反応をおこなわせた
。これを、ＴＢＳ緩衝液、０．１％（Ｖ／Ｖ）／＝ニブ
−トＰ−４０を含むＴＢＳ緩衝液、ＴＢＳ緩衝液の順で
洗い。

２０％（Ｖ／Ｖ）好手血清と２０ｐＬ文　■−プロティ
アＡ　（１００ｇｃ　ｉ／ｍｕ）を含む１　Ｏｍ９゜の
ＴＢＳ緩衝液中で２時間室温で反応させた。その後、再
びＴＢＳ緩衝液、ｏ、ｉ％（Ｖ／Ｖ）ノニデットＰ−４
０を含むＴＢＳ緩衝液、ＴＢＳ緩衝液の順でフィルター
を洗い、乾燥後、−７０℃でインテンシフアイスクリー
ンを用いて一晩オートラジオグラフィーをおこなった。

第５図に示すように、３９７塩基対を挿入ＤＮＡとして
持つバクテリオファージ入ｇｔｔｔが大ｎ！ｔｘに作ら
せたポリペプチドと結合する抗体はヒト５−リポキシゲ
ナーゼポリペプチドと結合し、ｘｖｉフィルム上に黒点
として現われ、用量反応を示した（第５図（ａ））、Ｌ
かし、挿入ＤＮＡを持たないバクテリオファージ入［ｔ
ｌｌが大１賜菌に作らせたポリペプチドはＸ線フイルノ
１上に黒点を生じさせなかった（第５図（ｂ））。

この結果は３９７塩基対の挿入ＤＮＡを持つ／くクテリ
オファージ入ｇｔｌｌが大Ｉｌｌ菌にヒト５−リポキシ
ゲナーゼポリペプチドを発現させたことを示す。

［発明の効果］ 以上述べたように、この発明によれば、ヒト５−リポキ
シゲナーゼをコードする遺伝子が提供され、これにより
ヒト５−リポキシゲナーゼを大ｆに生産できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト５−リポキシゲナーゼポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す図、第２図は、ヒト５−リポキシゲナ
ーゼポリペプチドをコードするＤＮＡの１１１基配列を
示す図、第３図は、第２図におけるＸの塩基配列を示す
図、第４図は、第２図におけるＹの塩基配列を示す図、
第５図は、オートチジオグラフィーの結果を示す図。 第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 第１図に示すアミノ酸配列を有するヒト５−リポキシゲ
   ナーゼポリペプチドをコードする遺伝子。