JPS63109785A - 成熟型ヒトプロテインｓをコ−ドするｄｎａを含むベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、プロティンＳ及びプロティンＳ生産のための
組換えＤＮＡ技術の使用に関する。

凝固カスケードは、損傷時に生じる多くの血漿タン、Ｒ
り質を含む一連の反応である。この血漿タンパク質の一
種であるプロティンＳは損傷の特定部位以外の場所で、
血液の凝固が生じないように手助けをしている。プロテ
ィンＳは血液凝固経路において、活性化プロティンＣに
よりひきおこされる活性化■因子と■因子の切断のコフ
ァクター（補助因子）である。

（従来技術） 近年ｊ７プ（Ｃｏｍｐ　）　ラ（１９８４、ジャーナル
クリニカルインベスティゲーション（Ｊ、Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、）　７４．２０８２　）　）−！、プロ
ティンＳ欠乏は循環系の血栓症をおこすことを示唆した
。またシ、＄　７　／ｌｚ　ツ（Ｓｃｈｗａｒｚ　）ら
（１９８４，ブラッド（Ｂｌｏｏｄ　）　６４：１２９
７　’ｊは、循環系血栓症は遺伝的なプロティンＳ欠乏
によるものであると示唆した。

（発明の構成） 本発明は、成熟型のプロティンＳをコードするＤＮＡＩ
含むベクターを特徴とする。下記の詳細な説明から明ら
かになるように、１成熟屋のプロティンＳ″は、先行配
列をもたない生物学的に活性なプロティンＳ分子のこと
である。従つてここで用いられるこの言葉は、少なくと
も成熟型のプロティンＳを＝−ドするのみでなく、ヒト
のみならず他（たとえばウシ）の先行配列あるいは、雑
種凰の先行配列もコードし得るＤＮＡ配列（ゲノムより
好ましくはｃＤＮＡ）を包含するに十分広い意味を表わ
す。

本発明のベクターは、哺乳類細胞、たとえば層面類動物
（たとえばマウス）細胞を生物学的に活性なヒトプロテ
ィンＳを、治療及び診断目的で用いるために、生産する
ように変換するのに用いられる。プロティンＳは遺伝的
プロティンＳ欠乏の治療に使用され得ろばかりか、プロ
ティンＳがコファクターであるプロティンＣと一緒に投
与され。

その抗血栓性活性を高めろ。プロティンＳとプロティン
Ｃは、共に血栓性酵素である組織プラスミノーゲン活性
剤（ｔ−ＰＡ）と−緒に投与され、その活性を増強し、
必要なｔ−ＰＡＯ量を好都合に減らすことができる。

本発明の他の性質及び利点は次の実施態様項の説明及び
特許請求の範囲から明らかになる。

好ましい実施態様の説明 まず簡単に図面について説明する。

第１図はクシプロティンＳクローンｐＢＬＳ−２４００
の全長の制限地図である。

第２図は、ウシプロティンＳをコードする、ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列及びプロティンＳのアミノ酸配列であ
る。Ｇｌａは、ｒ−カルボキシグルタミン酸を示す。９
３番のＡＳｐはβ−ハイドロキシアスパラギン酸にハイ
ドロキシル化され、４５８番のＡｓｎはグリコクル化さ
れている（矢印）。

矢印は、成熟型の血漿のプロティンの出発点、を示す。

ポリアデニル化シグナルは下線で示す。

第３図は、ヒトプロティンＳのＣＤＮＡクローンの制限
図である。（Ａ１部分は、ヒトプロティンＳをコードす
る単離されたλｇｔ　１１　ｃＤＮＡクローンを示す。

旧）プロティンＳのｃＤＮＡの部分制限図である。太線
は、プロティンＳをコードする配列を示″ｔ５ 第４図は、ヒトプロティンＳをコードするｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及びその予測されるアミノ酸配列である
。矢印は、成熟型の血漿タン／セフ質の出発点を示す。

１１コのＮＨ２末端のグルタミン酸残基は、カルボキシ
ル化（Ｇｌ　ａ　）されていると考えられる。３つのグ
リコジル化可能部位がある。すなわち、ＡＳｎ残基４５
８．４６８．４８９である。２つの推定されろポリアデ
ニル化シグナルは下線で示される。

第５，６及び７図は−ｐＵＣ９ＸＢＨ８の構成に使われ
る断片１，２及び３のそれぞれの部製法を図示した。な
お、第５図中、挿入部分はＴａｑ　１部位のみが示され
℃いる。

第８図は、ｐＵｃｇＸＢＨ８の構成を図示する。

第９図はヒトプロティンＳをコードするＤＮＡを含む発
現ベクターＣ８ＭとＣ８Ｓの構成を図示する。

一般的手法 下記に示す例において、ウシプロティンＳのアミノ酸配
列は決定され、また完全なりシブロチインＳをコードす
るｃＤＮＡ配列は成熟型のクシプロティンＳの一部分に
対して調製したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし
たクローンから単離された。このクローンに由来する断
片は１次いで完全な成熟型のヒトプロティンＳをコード
するｃＤＮＡ配列を含むクローンの同定のためプローブ
として使われる。開孔類細胞での発現を促進するために
、ウシプロティン５ＯｃＤＮＡの先行配列をコードする
ＤＮＡは、ヒトプロティン５ｃＤＮＡにスプライスして
接合される。この段階をさらに詳細に説明する。

ウシプロティンＳアミノ酸配列の決定 プロティンＳ断片は、酵素的及び化学的切断によりもた
らされ、その断片はダールバック（Ｄａｈｌ−ｂａＯｈ
　）らにより（１９８６、ジェイビオルケム（Ｊ、Ｂ１
０１．Ｃｈ６ｍ、）印刷中）　記述すｆｌタヨ５　ｔｃ
ケルろ適法と逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製された。アミノ酸配列は、ベックマン８
９０Ｃスピニングカツプシークエンサーあるいは、アプ
ライド・バイオシステム気相クークエンサーで決定され
た。またペプチドのアミノ酸組成は、ベックマン６３０
０アミノ酸分析装置で決定された。

これらのデータは、６４３個の断片のうちの９断片中に
含まれる６００個のアミノ酸の同定と配置な可能にした
。約１３０個の断片が、スピニングカップまたは気相シ
ークエンサーで分析された。

配列中の断片の順序は１定的に決定された。プロティン
Ｓの大部分について少なくとも、２度配列決定された。

２つの混成したオリゴヌクレオチド−プローブが合成さ
れた。プローブｌはアミノ酸残基８５〜９３をコードす
る２３−ｍａｒであり、グローブ２は５９５−６００の
残基をコードする２０−ｍｅｉｒである。

５’　−ＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＯＡＴＴ／
１ＣＡ−３’　ニブロープＩＧｅ　　Ｇ　　　ＧＧ ５’　ＡＣ′ｒＴＣＯＡＴＡＣＡＡＣＣＴｒＧＡＴＡ−
３’　：　フｏ　−、／　２ｃ　　　　ＧＣＣＧ ウシプロティンＳのｃＤＮＡ ウシ肝！！１ｌｉＱＤＮＡライブラリー（ｐＢＲ３２２
中）は、標準的技術によってスクリーニングさねた（グ
ルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　）　　とホグネス
（Ｈｏｇｎｅｓｓ　）　１９７５、グログ、ナトル、ア
カド。

サイ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、）　７２　；　３９６１）。

ａ　計１０５個の組換え体が、２個のオリゴヌクレオチ
ドグローブによってスクリーニングされた。１つのクロ
ーン、ｐＢＬｓ−２００は、プローブ１を使って同定さ
れた。配列分析は、アミノ酸残基４４〜１０４をコード
する挿入部分があることを示した。プローブ２により、
６個のクローンが同定された。しかし２個には、１５０
個以下のヌクレオチド長さの挿入部分があり、これらの
２個についてはそれ以上は検討していない。他の４個の
クローンは、カルボキシ末端側アミノ酸配列１０５残基
と３′　翻訳領域の７６ヌクレオチドをコードする同等
な挿入部分を含んでいた。これらの同等な４個のクロー
ンの１つｐＢＬｓ−４００は、ｐＢＬＳ−２００と共に
ライブラリの再スクリーニングに使われた。１５個のク
ローンはｐＢＬＳ−４００へ、１個はｐＢＬＳ−２００
へ、１個は両者へハイブリダイズされた。後者のクロー
ンｐＢＬｓ−２４００（第１図に示す）は、約２．４ｋ
ｂのｃＤＮＡ挿入部分をもっており、全プロティンＳの
全コード配列を含むことを示唆した。そのヌクレオチド
配列の決定のために、このプラスミドＤＮＡ６０ｐＰを
Ｐｓｔｌ　　により分解した。

ｃＤＮＡ挿入部分を、単離し、自己連結（ｓｅｌｆ・１
ｉｇａｔｉｏｎ　）　Ｌ、超音波処理及び末端イじ復を
行なった。３００−６００塩基対のサブ７ラグメントが
単離され、ファージＭ１３ｍｐ８の複製型のＳｍａ　１
　　部位に連結された。これは続いて　Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｋ　１２−ＪＭ　１０１を変換するのに使用
された。４２個の白いプラークを無作為に抽出し、テン
プレートＤＮＡを作製するために用い、配列を決定し、
２３７９ヌクレオチドからなる連続配列を得た（第２図
）。

オープンリーディングフレームを保持するためには、更
なるヌクレオチドが５９５−６０００部位に導入されね
ばならない。この領域は、数回ずつ両方のＤＮＡ鎖（ス
トランド）について配列が、きめられ、明らかに、ＴＧ
ＴＡＡＡＡＴＧＧＴ配列（部位５２９−６０１）が与え
られた。この領域に相当するタンパク質配列分析は、Ｃ
ＭＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列を与え、おそら
くｃＤＮＡライブラリーの作成中に１ヌクレオチド。

（ＡＩが部位５９５−５９９において人為的に削除され
たことを示す。

λｇｔｌｌ中のヒト胎児の肝臓ｃＤＮＡライブラリーは
、グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ　）とホ７−＋ｒ　ｙ　（Ｈ
Ｏｆ−ｍａｎ）（１９８３，ジーン（Ｇｅｎｅ　）　２
５：２６３　）の方法を修飾、すなわちラペイル（Ｌａ
ｐｅｙｒｅ　）と了ナルリック（ＡｎａｌｒｉＣ）　（
１９８５、：）−ン（Ｇｅｎｅ　）　、　３７．２１５
　）により記載された類似の方法により調製した。この
ライブラリーは、平均１８００個のヌクレオチドの長さ
の挿入部分をもつ６×１０個以上の組換え体を含む。プ
ラークはこの増幅されたライブラリーからの標準的技術
によりてスクリーニングされた。ウシプロティンＳのｃ
ＤＮＡクローン、ｐＢＩ、Ｓ−２４００（第１図）と、
ヒトプロティンＣのｃＤＮＡクローンからのニック訓訳
ＤＮＡ断片がプローブとして用いられた。

ヒトλｇｔｌｌ　　ライブラリーからの約Ｉ　Ｘ　１０
６個のプラークが、ｐＢＬｓ−２４００（第１図）から
ノｓｐｈ　ｌ　−８ａｃ　ｌ断片（アミノ酸−２９−６
２０をコードする）を使用して、スクリーニングされた
。４個のポジティブクローン、Ｍ２Ｓ、Ｍ３）゜Ｍ３３
．Ｍ４８（第３図）は、プラークで精製され性質が調べ
られた。これらのクローンは、ウシプロティン５ＣＤＮ
Ａ配列と比較して、ヒトプロティンＳをコードすること
が立証され、これらは高い相同性をもっていることが示
された。クローンＭ４８ＳからノＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ
断片（アミノ酸３）１−４０３をコードする）は、λｇ
ｔｌｌ　　ライブラリーからの１８００万個のプラーク
をスクリーニングするσ）ＶＣ使用された。３９１固の
ポジティブクローンが同定された。ｍＲＮＡの５′領域
をコードする挿入部分を含む、これらのヒトクローンを
区別でるために、５′末端配列を含むｐＢＬＳ−２４０
０のＤＮＡ断片、たとえば５ｐｈｌ−Ａｖａ口断片との
連続的ハイブリダイゼーシヨンが行ナワれた。４個のク
ローンが、ウシｃＤＮＡの５′部位をコードする配列と
ハイブリダイズした。これらのうち３個は続いて同じも
のであることが示された。これらのクローンは、Ｍ１１
７Ｓ（第３図）で代表されるが、ウシ配列と比較して明
らかなように、先行ペプチドの最初から２６個のアミノ
酸をコードする領域を欠いている。

ヒトプロティンＳのｃＤＮＡ配列 クローン化されたプロティンＳのｃＤＮＡは。

全体で３．３４４ｂｐを含み、先行配列のアミノ酸−１
５からＳｅｒ　（アミノ酸６３５）に続く終末コドンま
でのアミノ酸をコードする。

ヒトプロティン５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とこれか
ら誘導されたアミノ酸配列を第４図に示した。ｃＤＮＡ
は１，１４８ｂｐの３′末端非翻訳性の領域をふくみ、
ウシのｃＤＮＡより８２６　ｂｐ長い。

ウシとヒトのプロティンＳのｃＤＮＡローンの相同性は
、ウシＣＤＮＡの３′非ｐ訳性領域からポリ＋Ａ＋テー
ルまでの全てにわたつみられるが、ボＩ月Ａ）テールに
はみらね、ない。ノーザンプロットのデータは、ヒトプ
ロティンＳのｍＲＮＡＫはただ１つの主分子量の分子種
があることを示唆した。５′末端に非翻訳性領域がある
可能性は除外され得ないカ３′末端番である非翻訳性領
域はヒトとウシのプロティンＳのｍＲＮＡの大きさのち
がいσ）ｆべてを説明できると思われる。

りｅｌ−ン化されたヒトプロティンＳのＤＮＡ配列の全
体は、ウシｃＤＮＡ配列とならべてみると、ウシ配列と
大きく異なる２４４ｂｐの５′末端配列を含むことがわ
かる。成熟したヒトとウシのプロティンＳの核酸配列の
全般的相同性は、８７．５％であり、タンパク質では８
１．６％である。

ｐＵｃｇＸＢＨ３の構成 ヒトプロティンＳのｃＤＮＡを発現ベクターに挿入する
ために、完全な先行配列と共にユニークな制限ｍ素部位
をヒトプロティンＳクローンの５′及び３′両末端に人
工的にほどこした。

制限酵素部位Ｘｈｏｌ　は天然では極めてまれであり、
ヒトプロティンＳをコードする配列中には存在しない。

ヒトプロティンＳのＣＤＮＡは、先行ペプチドの全体を
コードしなかつたこと及びこのペプチドは翻訳後の修飾
に必要なものであると考えられることから、ウシプロテ
ィンＳの先行配列ヲヒトプロテインＳのｃＤＮＡに連結
し、ヒトｃＤＮＡを可能なかぎり保存した。クシの先行
配列はまた、ヒトの配列よりも対応するｈ歯類起原の配
列に近似するから、削孔動物の発現系が用いられるとき
発現の可能性ビニ程上の有利さを確保できる。

ウシとヒトのプロティンＳのＣＤＮＡ配列における制限
酵素部位の分布の性質により、最終的な構成の５′及び
３′末端に必要なｘｈｏｌ　　部位をいれて、ヒトのｃ
ＤＮＡ中にウシ先行配列を加工するＫは、多段ステップ
の製法が必要である。用いられた工程は第５図から第８
図に図示し、以下のように実行された。

１、ウシ先行配列（ピース１）の構成 第５図に示すように、ウシプロティンＳのＣＤＮＡりａ
−ンｐＢ−Ｌ、、Ｓ−２４００に！、酵素ＡＶｒ　［１
のユニーク部位で制限化された。次の実験での直鎖のＤ
ＮＡのセルフライゲーションを防ぐため、末端リン酸は
、細菌のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で除去した
。２個の合成オリゴヌクレオチドＢ　Ｄ　３８２　（５
’　−ＣＴＡＧＧＡＣＣＣＴＯＡＴＯ−３／）とＢ　Ｄ
　３８３　（５’　−ＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧＧＴＣ−
３′）は、末端りん酸基を含むが、直鎖１）ＢＬＳ２４
００の存在下にアニールされ連結された。望ましい構成
は、ｐＢＬＳ２４００のＡｖｒ［１部位に挿入すしたア
ニールしたオリゴヌクレオチドの二量体を含み、ＸｈＯ
ｌ　部位がもたらされているものである。

この構成は、ｐＢＬｓ２４００Ｘと呼ばれ、ＸｈＯｌと
Ｔａｑｌ　で消化された。こうして、８７　ｂｐ　ｓ／
末端断片を、ラングリッジ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ　）ら
（１９８０、アナルビオゲム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、
　）１０３：２６４−２７１　）の方法を修飾した低融
点（ＬＭＰ）アガロースゲルで下記の如く単離された。

この８７Ｍ片はイニシエイターのメチオニンヲ有し、ク
シプロティンＳの先行シグナル配列をコードする。これ
を「ピース１」と命名した。

ＤＮＡ抽出 ＱＮ＋−水及びＱＮ＋−ブタノールを以下の方法で作製
した。ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロミド（
ＱＮＢｒ）　１７）　２　？を１ｏｏｙのｎ−ブタノー
ル、１００ｄの水及び５０μＬアンチ７オームＡ（シグ
マ）に溶解し、はげしく攪拌し、−晩分離させろ。上層
をＱＮ＋−ブタノール、下層をＱＮ＋−水と呼び別々に
ビンにつめる。

操作は以下の段階を経る。

低融点（ＬＭＰ）アガロースゲルからバンドを切り出し
、約３分間、７０℃で融かす。同量のＱ　Ｎ＋−水とＱ
Ｎ＋−ブタノールを加える。渦巻式に攪拌し、小遠心器
で１〜２分遠心する。ブタノール（上）層を新しい試験
管に入れ、ＱＮ”−水・アガロース層を７０°Ｃで２〜
３分間再加熱し、もう７度Ｑ　Ｎ＋−ブタノールで再抽
出する。合わせたブタノール層に楠容の０．４　Ｍ　Ｎ
已ａｔを加え、混合液を渦巻式に攪拌し、小遠心器で乎
早く遠心し、水（下、）層は新しい試験管に移す。クロ
ロホルムで抽出し、エタノールでＤＮＡを沈澱させる。

ヒトプロティンＳのｃＤＮ、ＡとウシプロティンＳ先行
配列（ピース１）を結合するために、Ｔａｑ１部位をヒ
トＣＤＮＡの適当な部位て作成した。

この変異を行うために、ヒトプロティンＳのｃＤＮＡク
ローン１１７８−ｌｌ７８−１（からｐｔＪｃｘｓ　　
にサブクローン化された２、２００ｂｐＥＣＯＲＩ断片
）をＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌで分解した。ｓ　ｓ　ｏ　
ｂｐ断片がＬＭＰアガロースゲルで単離され、Ｒｓａｌ
でさらに分解された。１６００ｂｐ断片もＬＭＰアガロ
ースゲルから単離され、次に示すピース３の構成に用い
られた。生じた３８０ｂｐ断片は、ＬＭＰ了ガロガロー
スゲル単離され、予めＳｍａｌとＨｉｎｄ鳳で分解され
たベクターｍｐ１８に連結され、　ｍｌ）　１８−２０
ｒｉを得た。ｍｐｌｓ−２０ｒｉ　　の−重鎖を単離し
、適当な塩基対を以下に示すように合成オリゴヌクレオ
チドＢＷ３６３を用いる部位指向性ミエータジェネシス
により変化させた。この変異はハイプリダイゼーシ、ン
分析により同定され、ｍｐ１８−２ｍｕｔ　と命名され
たクローンが大量に調製された。

ヒトプロティンＳのｃＤＮＡに追加の’ｒａｑ１部位を
構成するために、３．４μ？のｍｌ）１８−２ｏｒｉ　
と１．４μｔのキナーゼ処理オリゴヌクレオチドＢＷ３
６３ （５’　−ＴＧＡＡＧＣＣＴＧＴＴＧＧＴＴＯＧＡＣＡ
ＡＡＡＣＴＣＴＴＣＣ−３’　）を３０μｔの０．２Ｍ
　）ＩＪｘ塩酸、　ｐＨ７，５、０，１ＭＭｇｅｔ２．
０．５ＭＮａＣ４，１０ｍＭＤＴＴ中で６５℃１０分間
アニールし、室温で２時間以上冷却した。

ファージＤＮＡの第２の鎖は、５０μｔの緩衝液（２０
ｍＭ）リス、ｐＨ７，５；’　　　　　　　”ち＃１０
　ｍＭ　ＭｇＧｔ２；、　１０　ｍＭ　ＤＴＴ　；それ
ぞし２．５ｍＭノｄＡＴＰ　、　ｄｃＴＰ　、　ｄＧＴ
Ｐ　、　ｃｌＴＴＰ　）を５ｐＬの２０ｍＭＡＴＰ　、
１　μｔのＴ４リガーゼ（４００，０００単位）、３．
５　ｐＬノＦ、、　Ｃｏ１１　　ＤＮＡポリメラーゼ、
フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片（１４単位）、１０．
５μｔの蒸留水を加えることにより合成した。この混合
物を室温で１５分間放置し。

ついで１５℃で一夜放置した。

上の開始と伸長反応により２本鎖化されないベクターの
バックグラウンド量を減らすために、上の伸長反応液２
０μ乙に５８μｔの水と２０μｔの緩衝液（１，ｓＭ　
Ｎａ０ｔ　；　０．２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６
；１５％グリセｏ　−ｋ　、　ｌ　μ４　（７）　Ｅ。

ｃｏｌｉ、　ｔＲＮＡ　（２μ／μＬ）；１μｔの８１
ヌクレアーゼ（２，６５単位）な含む）を加えた。３７
℃で３０分間反応させ、１ｐｔの５０９　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａと５０ｐｔのＴＥ（）１３３）０ｍＭ、ｐＨ８；ＥＤ
ＴＡｌｍＭ）を加えて１反応をとめた。この混合物をウ
ニノール・クロロホルムで抽出し、水層かもエタツール
でＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡは１０μｔのＴ
Ｅで溶解された。

このＳ１処理による伸長反応は、適格なＪＭｌ　０１　
Ｅ、Ｃｏ１１に入れて形質転換させた。　変異株は、Ｓ
１処理伸長反応からのプラークを含むプレートでろ紙リ
フトを用いて同定された。合成オリゴヌクレオチドＢＷ
３６３はキナーゼ反応により３２Ｐ−ＡＴＰで高特異的
活性をもつ形にかえられ、０．７４ＭＮａＣ４；　０．
０５ＭＮａＨ２ＰＯ，、ｐＨ７，４；　５ｍＭＥＤＴＡ
　；　　５倍デンハート溶液；０．１％ＳＤＳ；１００
μ？／−トルクＲＮＡを含む溶液中でハイプリダイゼー
タ１ンプロープとして用いられた。ハイプリダイゼータ
１ンは、４０℃で一夜なされた。ろ紙は１ｘＳＳＣ１０
，１％ＳＤＳを数回用いて５７℃で洗浄された。このろ
紙をオートラジオグラフィーＫかけ、これを、培養プレ
ートにのせ、強くハイブリダイズしているプラークを拾
い上げ、５ｄの培養液中で一夜培養した。

プラスミドミニープレブ（微量調製）を行ない、７アー
ジの２重鎖Ｒｆ型を単離し、ＤＮＡ配列分析により変異
株を同定した。７アージＤＮＡをＥｃｏＲｌとＨｉｎｄ
ｌで分解し、新しい変異株を含む４００　ｂｐ断片をＬ
ＭＰアガロースゲルから単離した。このＤＮＡ断片を予
めＥｃｏＲｌ　とＨｉｎｄ　ｌ　　で分解されたｐｕｃ
ＩＢ中にクローン化した。この新しいプラスミドはｐｔ
ｙｃ１ｓｍｕｔ２Ｓと名付けられた。

内部に制限化されないＴａｑ　１部位を含む４３０ｂｐ
Ｔａｑ　１−Ｐｖｕ［断片からなるＤＮＡは、以下）Ｊ
ｉ領でｐＵｏ　１８ｍｕｔ　２　Ｓノ４９０　ｂｐ　Ｅ
ｃ。

Ｒ１−Ｐｖｕ（ＩＤＮＡ断片から作成された。全量１０
μｔの中に４　ｇ　□　ｂｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片１μ？を
含むアリコート溶液を、５５℃で、０．８単位のＴａｑ
ｌを用いてそれぞれ１５分、２０分、２５分、３０分、
３５分間切断した。２７μを中に４９０　ｂｐＤＮＡ断
片を各々４μ？含む溶液を４つ用意し、６５℃で１５分
間、それぞれ０．８　、１．６　、２．４　。

３．２単位のＴａｑ　１で制限切断させた。２７μを中
に４９ＱｂｐＤＮＡ断片４μ？を含む溶液を４ＤＮＡ断
片４μ？を含む溶液を２つ用意し、６５’Ｃ１５分間、
３．９単位の’ｒａｑｌ　で制限切断した。

酵素分解のあと、それぞれの溶液中のＤＮＡは、０．９
％ＬＭＰ−ｒガロースグルで電気泳動され、４３０　Ｊ
）断片を含むバｙドをゲルからけずりとリ、保存した。

断片の純度を調べ、ピース３（下記）に連結させるのを
促進てるため、この４３０ｂｐＤＮＡ断片シ言Ｈｉｎｄ
ｌで制限切断され、生じる３　３０　ｂｐ断片を単離し
た。この断片を「ピース２」と名付けた。

構成を完成させるために、クローンの３′末端はＸｈＯ
ｌ　　クローニング部位をつくるべく変化させる必要が
ある。これをなしとげるために、２個のオリゴヌクレオ
チドがつくられた。これらは、アニーリングされると、
３’ＥｃｏＲ［部位に連結できるリンカ−を形成でき、
欠損しているヌクレオチドと終床ユドンをおきかえ、Ｘ
ｈｏｌ　　部位を加えることができる。これは、上述し
た１１７８−１から単離された１６００ｂｐＨｉｎｄｌ
−ＥｃｏＲｌ及び合成オリゴヌクレオチドＥＯ３４７（
５’　−ＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＯ−３’　
）とＥＣ３４８（５’−ＧＣＴＣＧＡＧＯＴＴＡＡＧ−
３’　）を用いてなされた。

オリゴヌクレオチドは、上で述べたと同様の技法を用い
て、アニーリングされ、１６００ｂｌ）Ｈｉｎｄｌ−Ｅ
ＣＯＲ１断片と連ｉｇｎだ。連結（ライゲージ冒ン）の
あと、ＤＮＡは、Ｈｉｎｄｌとｘｈｏ　１で切断さｎ、
１６００ｂｐＤＮＡ［片６；ＬＭＰアガロースゲルから
単離された。このＤＮＡ断片は、ｐＵＣｇＸ（Ｓｍａｌ
で分解さｆｌり１）ＵＯ３にＸｈＯ１ｌＪンカーを連結
したもの）を予めＨｉｎａ量とＸｈｏｌで切断されたも
のの中ヘクローン化された。キメラプラスミドは制限分
析により同定され、１つのクローンを単離し大量に成、
育させた。　　□このプラスミドは、つ（・でＨｉｎｄ
ｌとｘｈｏｌで切断され、１６００ｂｐ挿入部分がＬＭ
Ｐアガロースゲルから単離された。この１６０　Ｑｂｐ
　Ｈ１ｎｄ１１−Ｘｈｏｌ　　ＤＮＡ断片は「ピース３
」と名Ｎけられた。

ピース１とピース２を一緒に連結させ、ＸｈｏｌとＨｉ
ｎｄ鳳で切断し、１．４％ＬＭＰアカロースケルで電気
泳動し、４３０ｂｐＤＮＡ断片をゲルからかきとった。

この断片を予めＸｈＯｌとＨｉｎｄ躍で切断しておいた
ｐＵｏｇＸ　　に連結させた。このキメラプラスミドは
、制限分析により同定され、クローン（ｐＵｃ９Ｘ−Ｈ
ｌ−２８）を４を離した。

ｐＵＣ９Ｘ−Ｈｌ−２８は、ＨｉｎｄｌとＸｈＯｌとで
制限切断され、４３０ｂｐＤＮＡ断片は、ＬＭＰアガロ
ースゲルから単離された。この断片はピース３に連結さ
れ、生じるＤＮＡはＸｈＯｌで切断され、０．８％ＬＭ
Ｐアガロースゲルで電気外勤された。２０００ｂｐＤＮ
Ａ断片がゲルからかきとられ、予めｘｈｏｌで分解され
、ＢＡＰで処理さハ、たＵＣ９Ｘ中にクローン化された
。望ましいクローンは、制限分析により同定され、１つ
のクローン（ｐＵｃｇＸＢＨ８）は大量に単離された。

発現ベクター中へのプロティンＳの挿入ｐＵｃｇＸＢＨ
８中の修飾されたＣＤＮＡは、追補ないかなる哺乳動物
、最も好ましくはｉ歯動物類の上皮細胞の発現ベクター
中へ挿入されつる。

好ましい発現ベクターは、ウェイ（Ｖ／ｅｉ）ら（前記
）やシウング（Ｈｓｉｕｎｇ　）ら（１９８４、ジャー
ナルオプモレキスラーアンドアプライドジェネテ４　り
ｘ　（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ａｐｐ、Ｇ６ｎ８ｔ
、　２：４９７）に記載のＢＰＶベクターである。この
ベクター（第９図）はマウスのメタロチオネインプロモ
ーター（ＭＴ）を含み、挿入された遺伝子はここから転
写され、該ベクターはクシパピロマウイルスＤＮＡ（Ｂ
ＰＶ）も含み、これは哺乳動物への感染に有効に作用す
る。ＣＬＨ３ａｘＢＰＶはまたＳＶ４０から誘導される
ポリアデニル化配列を含み、これはベクター中へ挿入さ
れた遺伝子の発現に影響を与える。図示された発現グラ
スミドは、またＥ　、　ｃｏｌ　ｉプラスミドｐＭＬの
一部分を含み、これは前核生物と真核生物のシステムの
間を行き来（シャトル）可能にでる。宿主細胞中でこれ
らのプラスミドの維持には何の選別も必要ではなく、高
いコピーナンバー（約１００コピー／細胞）で維持され
る。

ｐＵｃＱＸＢＨ３中のＸｈＯｌ　で挿入（リンカ−）さ
れたプロティンＳ配列は、Ｘｈｏｌ　　による切断およ
び挿入部分のバンドをアガロースゲルからけずりとるこ
とにより単離された。この断片は１次に２つのＢＰＶベ
クターのそれぞれのＸｈＯｌ　部位ｆｃクローン化され
た。これらのベクターはＥ、・ｃｏｌ　ｉストレインＭ
Ｃ１０６１中に形質転換すれ、大量忙培養された。ＤＮ
ＡＩ！ＩＩ乳動物への感染に先立ちＧｓＧｔバンド法（
密度勾配遠心）により精製された。発現ベクター中での
プロティンＳの挿入部分の５′から３′末端への方向づ
けは、数多くの制限＃素の組を用いてしらべた。最終的
なベクターの構成は第９図に示した。便宜上、発現ベク
ターの名称は、ＣＬｚ８ＸｈｏＢＰＶＰｒｏＳ　につい
てｆｔＧＥ３Ｍ　　０ＬＨ３ｈｘＢＰＶＰｒｏＥ３につ
いてｋｔＣ８Ｓのように略しである。

開孔動物類上皮細胞への感染 別々の５日を用いて、マウスの０１２７細胞への２組の
感染（トランス７エクシ四ン）を以下の様に行った。

シウング（Ｈｓｉｕｎｇ　）ら（同上）の方法でマウス
Ｃ１２７細胞（市販されている）ｆｆダルベツコ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ　）　ノ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）Ｋｌ
θ％クク胎児血清ｔ、ｌＱｍＭグルタミンを加えた培地
で維持した。ＤＮＡ感染はウイルガー（Ｗｉｌ−ｇｅｒ
　）ら（１ｇ７７　、セル（ｃｅｌｌ）１１：２３３の
方法を修飾したシウング（Ｈ４ＥＩｉｕｎｇ　）ら（同
上）の方法で行った。りん酸カルシウム沈殿ＤＮＡ１Ｏ
−２０μ？を６〜８時間、３７℃で１×１０６　個の細
胞と新鮮な培養液中で放置した。培地を除去し、細胞を
ｌ　Ｑ　ｍＭ　＋Ｊン酸緩衝化生編含塩水ＣＰＢＳ）ｐ
Ｈ７，０中２０％グリセロールで１〜２分間室温にて処
理し、ＰＢＳで２回洗浄したのち、新鮮なりＭＥを加え
た。細胞（ｃｒ、、ｚｓｘと基金）は、ついで３７℃に
放置され、２４時間ｉｆｆ培地をかえ、その後３〜４日
間ごとに培地を交換した。

プロティンＳの発現 感染の１０日後に、培地中のヒトプロティンＳをＥＬＩ
ＳＡ法でテストした。この方法では、ウサギ抗ヒトプロ
ティンＳ坑血清を１／１００００希釈して、これをウェ
ル当りｚｏｏｐｔ用いてマイクロタイターウェル（イム
ロン）ヲコートシた。コートは室温下−夜なされた。Ｐ
ＢＳ／ツイーンを含む緩衝液を用いてウェルを十分洗い
、ＰＢＳ（りん酸緩衝化生理含塩水）に溶解した２％ウ
シ血清丁ルプミン（ＢｓＡ　）の２００μＬで２時間か
けてブロックした。洗浄ののち、これらのウェルに０８
Ｍ感染細胞からの培地２００μｔづつを加えた。その培
地は室温にて４時間数！（インキユベート）された。洗
浄後、２００μｔのヤギ抗ヒト−プロティンＳがウェル
に加えられ％室温下に一夜放ｔＩｔすれた。ウェルを再
び洗浄し、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結
合させた２００μＬのクサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を加えた
。

室温で２時間放置後洗浄し、ＨＲＰ基質のオルトフェニ
レンジアミン（ＯＰＤ）２００μｔを加えた。ＨＲＰ反
応を３Ｍ　Ｈ２ＳＯ，５０μｔを加えてとめた。その後
マイクロタイターウェルを、マイクロタイターウェルリ
ーダーで４９２μｍで読みとった。結果は下表に示した
が、プロティンＳが感染細胞から産生されていることが
示された。感染細胞は表中ＣＬ２ｓＸＡＩＡ”、ＣＬ２
ＢＸＢＩＡ”’二ＣＬ２８ＸＢＩＢ　　、ＣＬ２ｇＸＢ
ｚＣ（５’。

ＣＬ２８ＸＢ２Ａ（６’として示されている。

ＣＬ２８ＸＡＩＡ　　　　　Ｏ，３９６０ＣＬ２８ＸＢ
ＩＡ”’　　　０．５５５　　　　　　２．１ＣＬ２８
ＸＢＩＢ”　　　０．６４９　　　　　　３．２ＣＬ２
８ＸＢ２Ｇ　　　　　０８７１９　　　　　　　　４．
０ＣＬ２８ＸＢ２Ａ　　　　　０．６７’ｌ　　　　　
　　　　３．５精裂と用途 上述の感染細胞から産生されたヒトプロティンＳは、そ
の細胞から及び／または培地から従来の方法、例工ば、
コンブ（ｃｏｍｐ　）ら（１９８４、ジェイ・クリンー
インベスト（Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ　）７４．２
０８２　）によりＭ製される。こうして産生されたヒト
プロティンＳは、鴫乳類細胞から得られたことから、ｃ
、−ｉ合性タンパク質や細鉋註及びウィルス性病原体を
含まない。

治療用の応用 ヒトプロティンＳは、凍結乾燥され、使用前に生理含塩
水で衿溶解される。生理含塩水中のプロティンＳは、規
則的Ｋ（例えば毎週）、プロティンＳを遺伝的に欠損し
ているヒト患者に投与され。

こｉらの患者にみられる循環系の血栓症の防止に用いら
れる。投与は、他の抗血栓薬、例えば組織プラスミノー
ゲン活性化剤で用いられている投与法が用いられろ。最
も好ましくは、大量静脈注射または、静脈法式であろう
。以下の例でより詳しく説明する。

例１゜ プロティンＳを欠損するヒト患者を長期間維持するため
に、１５０ダの凍結乾燥プロティンＳを生理含塩水に溶
解し、シリンジの中に入れ、これは、プロティンＳの犬
蚤を患者に静脈注射で投与するのに用いられる。処［は
週−回である。

例２゜ 心臓血栓の迅速な溶解に対する注入による治療のため、
凍結乾燥ｔ−ＰＡを約１００１１１ｆ／時、凍結乾燥プ
ロティンＣを約１．０！ｎｇ１時、および凍結乾燥プロ
ティンＳを約２．０！Ｒ９７時の割合で生理含塩水に溶
解して、−緒にあるいは別々の注入ラインを通して、３
時間にわたり静脈から同時に圧入した。

例３・ 血管環部の血栓のゆっくりした溶解を目的とする注入処
置のために、生理含塩水にとかした凍結乾燥ｔ−ＰＡを
約１０ｍｇ／時、凍結乾燥プロティンＣを約１．０η／
時凍結乾燥プロティンＳ？約。

２、０　Ｒ９／時の割合で、−緒にあるいは別々の注入
ラインを通して、１２〜２４時間をかけて同時に静脈か
ら注射した。

診断への応用 ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体をプロティ
ンＳに対してつくり、プロティンＳ欠損症と疑われろ患
者の体液１例えば血清、尿中のプロティンＳの定量のた
めに１慣用の免疫アッセイ法に用いることができる。

寄託 グラズミト”０３Ｍを含むＥ、ｃｏｌｉ（ｉｔ［ｉ胞は
、アメリカンタイプカルチャーコレクシ璽ン、メリーラ
ンド州ロックビルに寄託され、ＡＴＣＯ寄託番号６７１
６３が与えられた。

特許の譲受人、インチグレイティド・ジェネティクス社
は、ＡＴＣＣは、永久て寄託を行う寄託機関であり、も
し特許が得られたなら公共に対し提供できることができ
ることを明言する。寄託された物質が公共に対して提供
されることについての全ての制約は、％許が得られたと
き、取かえすことなく除外される。この微生物は特許出
願中でも特許庁長官が３７ＣＦＲ１，４及び３５ＵＳＣ
１２２のもとに資格を認めた者は入手できる。寄託され
た微生物は、それが生存できるに必要な世話をされ、そ
の寄託された微生物の試料の供給の最後の要求があって
から最低５年間は汚染されることばないよう、またいか
なる場合も寄託されてから最低３０年間或は特許の有効
期間中のいずれか遅く満了する期間の間維持される。受
託者が寄託条件のために要求された試料の供給ができな
いとき、特許の譲受人は、再寄託の義務のあることを認
識している。

他の態様は以下の特許請求の範囲に示され℃いる。

【図面の簡単な説明】

第１図はウシプロティンＳクローンｐＢＬＳ−２４００
の全長の制限地図である。 第２図は、クシプロティンＳをコードする、ＣＤＮＡの
ヌクレオチド配列及びプロティンＳのアミノ酸配列な示
す図である。 第３図は、ヒトプロティンＳのＣＤＮＡクローンの制限
地図である。 第４図は、ヒトプロティンＳをコードするｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及びその予測されるアミノ酸配列を示す
図である。 第５図、６図及び７図は、夫々、ｐＵＯｇＸＢｆ（Ｓの
構成に使われる断片１．２及び３の！！Ｉｉ！製法を示
す図である。 第８図は、ｐＵＯ９ＸＢＨ８の構成を示す図である。 第９図は、ヒトプロティンＳをコードするＤＮＡを含む
発現ベクターＣ８ＭとＣ８Ｓの構成を示す図である。 （外４名） 図面の浄書（内容をこ変更なし） ｔａ＋　ｌｓａ　Ａｌａ　Ｃ１１ｓ　ｔａｕ　Ａｌｅ　
ｔａｕ　Ｖ）ＬＬ　Ｔｍ　Ｐｒｏ　Ｖａｎ　Ｌａｕ　（
２１ｕ　ＡＬａ　ｆｉａｎ　Ｐｒｏｅｒａ　ＣＴＣａａ
　’ｒａ＝　ａｒｃ　ａｚ　Ｃｎ　ａｒｃ　ａτｃｃｅ
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甲ＧＪｒ＋　聯Ｓｉｒ　Ｃｙｓα―Ｖａｎ　Ｖａｎ　ｋ
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ａｐ　　２５３ｏＡａｖｏａｍＸＴＷｃｇａｒｒｃｒ＋
テｍ　ＧＩＧ　ｌ：　Ｃｌテ（０：Ｔ！ＧＡＸ：（ｆＴ
Ｇｃ　　１０５０Ｔｙｒ−陣ｌ軸４勾ｔａｕ　ｈｅ　Ｇ
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Ｒ＊　酬１−２８８７「カニｘＡＩＡｍａｚＴ！Ｇａス
店ににに℃にληテπλαλａ猟ｆｆ１ＧぼＴＩＣ１１
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禦ｎ１−１麺埴目麺　シロλ′！ｏａＭｒに１ＧＧｌｌ
ｌＩｌｉπゴｑＣａ＾０＾罰ス０＾ａσにπにゴＫＣｘ
テ〃＾にλ　Ｄ５ＧｌｕＡｓｎ（ｎｙ！ｊｌＪＬａ＋Ｇ
１ｕ’！ｈｒｌｙｓ１ｍ）１ｈ１ムＧｌｙＰｔ＋ｅＰｍ
ＡｅｇｌｐＶｌａ１３９３ＣｐＡｊＡＴαλコｑ℃αｘ
＝Ｎ＾ａλχ面αスαλ℃℃αゴαＺｊＪ＾−１４）９
ａｒｒ　？！ｐＡｓｎ　ｔａｕＦｋ　隼Ｇｌｎ　Ｇｌｙ
　ＡＬａ　ｋｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　ＬＦ　Ｇｌｕ　ｎａ
　ｎａ　Ｇ３ｒ＋　６＋　　４２１１にＣｌおｍＴＩＣ
ｘｃｍｏ晶αλαゴπゴＧにＪＡｌ’ＧＧ＾にτにτＯ
＾０＾　１イ５（ｎｙ　ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｚｌｅ　Ｅ−
α−１ｈ　出ｊＩｌａ　ｋｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　ｋｔ＋
　埴ｄ！ｊａｒ　ｊａｒに−０１４８απ？：ｒαλに
テαズ係ｍ　ＣＸ：　Ｘ１１ＣＪプ（ｒ　Ｍｒ　Ｍｒ　
ＧＩＩＸπ＝原αゴＧＩＩ２１α唖ＦＩＧ、４すの１−
２ ”１６００　ｂｐ ＦＩＧ　７

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）成熟型ヒトプロテインＳをコードするＤＮＡを含
   むベクター。
2. （２）成熟型ヒトプロテインＳをコードするｃＤＮＡ。
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のベクターで感染され
   た（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）哺乳動物細胞。
4. （４）細胞が類上皮細胞である特許請求の範囲第３項記
   載の哺乳動物細胞。
5. （５）細胞が齧歯類細胞である特許請求の範囲第３項記
   載の哺乳動物細胞。
6. （６）細胞がマウス細胞である特許請求の範囲第５項記
   載の哺乳動物細胞。
7. （７）Ｃ＿４−結合性タンパク質を含まない生物学的に
   活性なヒトプロテインＳ。
8. （８）ベクターがウシパピローマウイルスゲノムの感染
   性領域の少なくとも６９％をさらに含む特許請求の範囲
   第１項記載のベクター。
9. （９）ベクターが当該パピローマウイルスゲノムのすべ
   てを含む特許請求の範囲第８項記載のベクター。
10. （１０）成熟型ヒトプロテインＳをコードする当該ＤＮ
    Ａが真核細胞のメタロチオネイン遺伝子のプロモーター
    の転写制御下にある特許請求の範囲第１項記載のベクタ
    ー。
11. （１１）当該ベクターが成熟型ヒトプロテインＳの当該
    ＤＮＡのＣ末端をコードする末端と、当該ウシ・パピロ
    ーマウイルスゲノムＤＮＡの間に、ＳＶ＿４＿０ＤＮＡ
    の断片を含む特許請求の範囲第１０項記載のベクター。