JPH02487A - モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，それらの製造法およびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳泉直Ａ秤皿庄」 本発明は塩基性線維芽細胞増殖因子に特異的に結合する
モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、それらの製造法
およびそれらの用途に関する。

従来の技術 塩基性線維芽細胞増殖因子（本明細書において、ｂＦＧ
Ｆと略称することがある。）は主として下垂体より分泌
される分子器量１７０００の塩基性ポリベプチドポルモ
ンであり、当初ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞などの線帷芽細
胞に強い増殖促進作用を示す因子として分離された［Ｄ
、　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚ；ネイチ＋−（Ｎａ
ｔｕｒｅ）２４９：１２３（１９７４）］。

しかし、その後中胚葉由来の殆んど全ての細胞に対して
増殖促進作用を示すことが判明した［Ｄ。

Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら；ナショナル・キャンサ
ー・インスティテユート・モノグラフ　（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌＣａｎｃｅｒ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　Ｍｏｎｏ
ｇｒａｐｈ）　４８；　　Ｉ　０９（１９７８）］。中
でらｂＦＧＦの血管新生作用は細胞増殖作用と相まって
損傷、火傷の治療薬および血栓症、動脈硬化症などの予
防治療薬としての可能性を示すらのである。

発明が解決しようとする課題 天然に存在するヒトｂＦＧＰは極めて微遣であり、また
これをヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極
めて困難であった。さらにこれ迄ｂＦＧＦの定量法とし
て容易に使える方法は確立されておらず、これらの理由
からｂＦＧＦを医薬品として開発する上で欠かすことの
出来ないｂＦＧＦに関する性状などの基礎知見について
不明の点が非常に多い。

従って、ｂＦＧＰに関する多くの基礎知見、例えばｂＦ
ＧＩ’；’の生体内における分布やその産生様式などを
知ることができれば、該ｂＦＧＦの医薬品としての開発
が容易となる。

また、ｂＰＧＦの量を正確に知ることは、この蛋白質を
遺伝子組換え体から精製する際にも重要である。さらに
、ｂＦＧＦを投与した動物の血中ＦＧＦｅ度を追跡する
ことは非常に重要であるが、サンプル中に血清が混入す
るため従来の３Ｔ３細胞を用いた方法では測定出来ない
。通常、ｂＦＧＦの測定は血清濃度を下げて培養し、Ｄ
ＮＡ合成を低下させた３Ｔ３細胞にｂＦ　Ｇ　Ｆを加え
、ＤＮＡ合成能がどの程度回復するかにより逆算されろ
。

しかしながら、この方法は細胞を用いるため操作が微妙
で測定誤差が大きく、しかも結果を得るのに長時間を要
するという欠点を有する。従って、上記目的のために簡
便かつ正確なりＦＧＦの測定手段の開発が望まれている
。

課題を解決するための手段 上記実状にかんがみ、本発明者らはｂＦＧＦの実用的な
測定手段を見い出すべく種々検討した結果、その測定を
可能ならしめるｂＦ　Ｇ　Ｆに特異的に結合するモノク
ローナル抗体を作製し、　これに基づいてさらに研究し
た結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）、次の性質を有し、ｂＦＧＦに特異的
に結合するモノクローナル抗体。

（ａ）分子量；約１４０〜１６０キロダルトン（ｂ）酸
性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。

（ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧに属
する。

（２）、ｂＦＧＦで免疫した哺乳動物の牌臓細胞と、同
種または異種のリンパ球様細胞とからなるクローン化さ
れたハイプリドーマ。

（３）、ｂＦＧＦで免疫した哺乳動物の牌臓細胞と、同
種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クロー
ニングすることを特徴とする該脾臓細胞と該リンパ球様
細胞とからなるクローン化されたハイプリドーマの製造
法。

（４）、ｂＦＧＦで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同
種または異種のリンパ球様細胞とからなるクローン化さ
れたハイプリドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔
内で増殖し、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする該因子に特異的に結合
するモノクローナル抗体の製造法。

（５）、上記（１）項のモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするｂＦＧＦの精製法、および（６）、上記
（１）項のモノクローナル抗体を用いることを特徴とす
るｂＦＧＦの検出、定量法である。

哺乳動物に免疫するｂＦＧＦとしては、温血哺乳動物の
ｂＦＧＦ’であればいずれでもよい。また、そのムティ
ン（ｍｕｔｅｉｎ）でもよい。したがって、本明細書に
おいては、「塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）」
は、とくにことわりのない限り、そのムティンをも含む
こともある。

該哺乳動物のｂＦＧＦの代表例としては、たとえば、ウ
シのｂＦ　Ｇ　Ｐ　［プロシーデインゲス・イン・ザ・
ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンシズ（Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｆ、）　Ｕ
ＳＡ、第８２巻　第６５０７頁（１９８５年）］、ヒト
のｂＦ　Ｇ　Ｆ　［日本特願昭６１−２４１０５３号明
細書（ヨーロッパ特許出願公開第２３７，９６６号公報
）、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オー
ガナイゼイションージャーナル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　　Ｏｒｇａｎｉｚ
ａｔｉｏｎ　　（ＥＭ［３０）　Ｊｏｕｒｎａｌ）第５
巻、第２５２３頁（１９８６年）］などがあげられる。

さらに具体的には、 Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ｉ　ｌｅ　
−Ｈｉｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｖ　ａｌ　−Ａｓｐ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖ　ａ
ｌＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ　
　　（１）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
が好ましい。

さらに、一般式 ％式％ （［） ［式中、ＸはＴｈｒまたはＳｅｒを示し、Ｘｈ＜Ｔｈｒ
のときＹはＳｅｒを、ＸがＳｅｒのときＹはＰｒｏをそ
れぞれ示す。］で表わされるポリペプチドが好ましい。

ヒトのｂＦＧＦ（以下、ｈｂＦ　Ｇ　Ｆと略称すること
もある。）を得るには、たとえば上述のｈｂＦ’　ＣＦ
蛋白質のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（イ）ｈｂ
Ｆ　Ｇ　ＰをコードするＲＮＡを分離し、（ロ）該ＲＮ
Ａから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖
ＤＮＡを合成し、 （ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ニ）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばＤＮＡプローブを用いたコロニーハイ
ブリダイゼーション法、により目的とするＤＮＡを含有
するプラスミドを単離し、 （へ）そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、 （ト）該クローン化ＤＮＡをビークル中のブロモ−クー
の下流に連結する、 ことにより製造することができる。

ｈｂＦ　Ｇ　ＦをコードするＲＮＡは、種々のｈｂＦＧ
Ｆ産生細胞、例えばヒト下垂体由来細胞あるいはヒト線
維芽細胞から得ることができる。該ヒト線准芽細胞とし
ては、ＷＩ３８（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５）あるいは
ＩＭＲ９Ｑ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８６）などがあげ
られろ。上記細胞Ｗ１３８および１ＭＲ９０は、ジ・ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔ　ｈ
ｅ　　Ａ　ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）発行のカタログ・イン・セ
ル・ライング・アンド・ハイブリドーマズ（ｃａｔａｌ
ｏｇｕｅ　　ｏｆ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｌ　１ｎｅｓ　　＆
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）　　５　ｔｈ　　ｅｄｉｔｉｏ
ｎ、　ｌ　９８５に掲載されている。

このようにして得られた発現ベクターを、適当な宿主（
例、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞）に組み込み、得
られた形質転換体を培地１こ培養することにより、ヒト
のｂＦＧＦ’を製造することができる。

本発明におけるムティンとしては、本来、元のペプチド
あるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであり、
したがって該変異としては、アミノ酸の付加、構成アミ
ノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくと６１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のｂＦ
’ＧＰ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

波曲のアミノ酸への置換としては、少なくと６１個のｂ
ＰＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているら
のが挙げられる。

ｂＦＧＦに少なくとらＩｆｆ！Ｉのアミノ酸が付加して
いるムティンにおける少なくとも１個のアミノ酸として
は、ペプチドを発現する際に用いられる開始コドンに基
因するメチオニンや、シグナルペプチドは含まれないら
のである。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ｂＦＧＦの特徴を失わない限り何個でらよい
。さらに好ましくは、ｂＦ　Ｇ　Ｆと相同性（ホモロノ
ー）が認められており、同様の活性を示すタンパクのア
ミノ酸配列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ｂＦＧＦの少なくとも１個のｂＦＧＦ’構成アミノ酸が
欠損しているムティンにおける欠損している構成アミノ
酸の数としては、ｂＦ’ＧＦの汀する特徴を失わない限
り何個でもよい。

該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトｂＦＧ
Ｆのアミノ末端側ｌＯ残基：Ｍｅｔ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　Ｉ
ａ Ｌｅｕ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　！ｕ−Ａｓｐ Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｓ　ｅｒ ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側１４残基：Ｍｅｔ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ａ　Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ−
　Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ａ　Ｉａ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ。

ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側４１残基：ヒ）ｂＦＧＦの
カルボキシル末端側６Ｉ残基：などが挙げられる。

ｂＦＧＦの少なくとらＩｆｌｌのｂＦＧＦ構成アミノ酸
が別のアミノ酸で置換されているムティンにおける置換
される前の少なくともＩ（［！ＩのｂＦ　Ｇ　Ｆ’構成
アミノ酸の数としては、ｂＦＧＦの特徴を失わない限り
何個でもよい。

置換される萌の構成アミノ酸の例としては、ンステイン
、システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される府の構成アミノ
酸としてシスティン以外のらのとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリノン。バリンなどが挙げられる。

置換される萌の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロインン、イソロ
イシン、チロノン。フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリン。

スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。

置換される而の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは′：ｒｉ荷の
点で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつも
のを選ぶ。具体的には置換されろ市のアミノ酸がアスパ
ラギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸として
アスパラギンスレオニン、バリン、フェニルアラニン、
アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン、ア
ルギニンが好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される而の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン９グルタミン酸、ア
ルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される而の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロインン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換されるＨの元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。

本発明のムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つ
または３つが組み合わさったものでもよい。

該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール
・エフ・レイザー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及び
ジェイ・ビー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、　
）、ジエネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｉｉ
ｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス
社（１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス
（Ｓｍｉｔｈ、　　Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌ
ｌａｍ、　Ｓ、）、ジェネティック・エンジニアリング
：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　
１−３２頁に示されている。

該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、 （ａ）ｂＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種
形成させる（この１本鎖で代替えすべきシスティン用コ
ドン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチ
センス・トリプレットを包含する領域に対して上記ブラ
イマーは相捕的なものである。但し、当該コドンの他の
アミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス
・トリプレットとの不一致はこの限りでない。）、（ｂ
）ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ、突
然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を
形成させる、及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主（前出
と同様）を形質転換し、得られた形質転換体を培地に培
養することにより、ムティンを製造することができる。

該ｂＦにＦを免疫するに際しては、ｂＦ’ＧＦ’をキャ
リヤー蛋白との複合体としてから、これを免疫に用いて
らよい。

該キャリヤー蛋白としては、たとえばフロイントの完全
アジュバント（デイフコ社製）などが挙げられる。

キャリヤー蛋白複合体を用いる場合に、キャリヤー蛋白
とｂＦＧＦ’とのカップリング比率は、約５〜３０倍（
キャリヤー／ｂＦ　Ｇ　Ｆ　：重量比）で用いられる。

望ましくは約１５〜２０倍が用いられる。

また、ハプテンとキャリヤーとのカプリングには、種々
の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒド
やカルボジイミド等が好都合に用いられる。

ｂＦＧＦまたは蛋白複合体を用いて免疫するに際し、免
疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、ラット
、マウス等の実験動物が使われるが、モノクローナル抗
体を得るためには、ラット、マウスが好ましく、特にマ
ウスが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する
場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれ
のルートからでも可能であるが、主として皮下、腹腔内
、静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。

また、免疫間隔、免疫ｍ等ら可変度は高く、種々の方法
が可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、
最終免疫後、約１〜５回、好ましくは約２〜４日後に摘
出した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫用
は１回にペプチドがとして、マウス当り約０．１μｇ以
上、好ましくは約ＩＯμｇ〜３００μｇ用いることが望
ましい。又、牌臓を摘出する而に、部分採血を行い、血
中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融
合実験を行うことが望ましい。

上記胛臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘
出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンヂンーグアニン
ーホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ
″″）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−）の様なマー
カーを持った適切な同種または異種（好ましくは同種）
のリンパ球様細胞株との間で融合させる。リンパ球様細
胞株としては、ミエローマが好ましく、その例としては
ミエローマＰ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩ（市森　他ジャ
ーナル・才ブ・イムノロジカル・メソッド　８０５５（
１９８５））が挙げられろ。例えばケラ−およびミルス
タインらの方法［ネイチャー（Ｎａｉｕｒｅ）２５６：
　４９５（１９７５）］に準じて融合さ仕ることにより
製造される。たとえばミエローマ細胞と胛細胞とを約１
＝５の割合で、たとえばイスコツ培地とハムＦ−１２培
地を１＝１に混合した培地（以下ＩＨ培地と弥する。）
に懸濁させ、センダイウィルス、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられる。もちろんジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加え
ることら可能である。ＰＥＧの重合度は、ふつう約ｌ０
００〜６０００．時間は約０．５〜３０分、濃度は約１
０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例と
して、ＰＥＧ　　６０００を約３５〜５５％で約４〜Ｉ
Ｏ分処理することにより、効率よく融合させることが出
来る。融合細胞は、ヒボキサンチン−アミノプテリン−
チミジン培地［ＨＡＴ培地；ネイチャー、２５６，４９
５（１９７５）］等を用いて、選択的に増殖させること
が出来る。

増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫した
ペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ（Ｅ
　Ｉ　Ａ）法等の方法で調べることが出来るが、これら
の方法についても種々の変法が可能である。好ましい測
定法の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について
述べる。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗
マウスイムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリング
させておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血
清を加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下
においても同様。）で反応させる。この後、反応物をよ
く洗った後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチド
を常法に従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。

選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は、限界稀釈法等
によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化
された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い
抗体価の高いウェルの細胞を増やすことにより、免疫し
たペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローンが得られる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲＰＭ　Ｔ　−１６４０［Ｍｏｏｒｅ。

Ｇ、Ｅ、、　ｅｔ、　ａｌ、ジャーナル・才ブ・アメリ
カン・メディカル・アソシエーション（Ｊ、　　Ａｍ、
　　Ｍｅｄ。

＾５ｓｏｃ、）　　１９９．　５４９（１９６７）］に
約０．１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜ＩＯ
日間、好ましくは約３〜５日間培養することにより、培
養液から該モノクローナル抗体を得ることができる。ま
た、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水
を採取することにより抗体を取得するこ４とが出来る。

このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等
を前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１ｘｌ
Ｏ’　〜ＩｘｌＯ’個、好ましくは約５ＸＩ０５〜２Ｘ
１０’個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２
０日後、好ましくは約１０−１４日後に腹水液を採取す
る。

腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することが出来ろ。

このようにして、ｂＦＧＦに特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体が得られる。

本発明のモノクローナル抗体にあっては、免疫原のペプ
チドのｂＦ’ＧＦ’と特異的に結合する。

なお、本発明のモノクローナル抗体は、製造時に用いた
免疫原のペプチドとは異なるｂＦ（、Ｐと結合する場合
らある。

本発明のモノクローナル抗体は、免疫原ペプチドである
ｂＦＧＦあるいはそのムティンに対するモノクローナル
抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は、ｂｌ：’ＧＦ’（およ
びそのムティン）のみに抗体が結合するという性質を存
するｂＦ　Ｇ　Ｆに特異的に結合するモノクローナル抗
体である。

後述の実施例３に示されたように、ヒトｂＦＧＦを抗原
として用いた場合に、免疫グロブリンクラスがｒｇＭに
属するモノクローナル抗体が得られる場合がある。

本発明のモノクローナル抗体は、ｂＦＧＦに対し特異的
に結合することから、ｂＦＧＦ測定用試薬として極めて
有用である。さらに生体臓器、組織中のｂＦ’ＧＦの測
定を容易にすることは、ｂＦＧＦに関する基礎知見（例
えば生体内分布）を得る上からも極めて有用である。生
体臓器９組織中のｂＦＧＦの検出には通常酵素免疫測定
法（ＥＲＡ法）などによる定量、あるいは蛍光抗体法や
ラジオイムノアッセイ法（ＲＩ　Ａ法）が用いられる。

またこれらの臓器１組織中に存在するｂＦＧＦの大きさ
を知るにはタンパクのウェスタンブロッティング法が育
効である。この方法は臓器１組織由来の粗抽出液あるい
はその部分精製試料をアクリルアミド電気泳動した後、
メンブランフィルタ−にトランスファーし、［（ＲＰ結
合抗ｂＦＧＦ抗体で検出する。

また癌細胞の中には細胞自身がｂＦＧＦを産生じ、その
ｂＦＧＦにより増殖を続ける場合のあることが考えられ
る。このような癌に抗ｂＦ’ＧＦ’抗体を作用させると
増殖を促進するｂＦ’ＧＦか中和され、癌細胞の増殖阻
止、すなわち制癌物質としての作用が期待される。また
ｂＦ　Ｇ　Ｆを産生する癌では、抗体を用いてそのｂＦ
ＧＦを定量することができ癌の診断検査薬にも応用でき
る。さらに該抗体とｂＦＧＦとの結合能を利用し、抗体
アフィニティーカラムを作製してｂＦ’ＧＦの精製の試
薬としてｔｌ用することもできる。

ｂＩ’ＧＦ’を検出、定量するために用いられるＥＩＡ
法またはＲＩＡ法としては、例えば、精製した抗体を０
．１〜１０μｇ／ウェル、９６穴プラスチツクプレート
（例えばヌンク社、デンマークのイムノプレート）、ガ
ラスピーズ、プラスチックビーズなどの担体に固定する
。固定は、プラスチックの場合約４℃、−夜または室温
で約０．５〜４時間反応させることにより行われる。ガ
ラスの場合、例えばＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第８０巻。

第３５１３−３５１６頁（１９８３年）に記載したよう
な方法で固定する。その他、抗体固定のだめの各種プレ
ート（前述、ヌンク社等）の市販されているしのを使う
こともできる。

以上のようにして抗体を固定したプレート又はビーズに
抗原ｂＦＧＦ（またはそのムティン）を含む溶液を加え
吸着反応を行う。吸着反応は室温で約０．２〜２時間で
行われることらあるが、約４℃、−夜が望ましい。

抗原−抗体の結合反応の後、酵素標識（Ｅ　Ｉ　Ａの場
合）または放射標識（Ｒｒ　Ａの場合）した抗体を加え
吸着反応を行う。酵素としては、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（１−（ＲＰ）、アルカリ性フォスファターゼな
どがよく用いられ、放射標識としては１２ａＩがよく用
いられる。酵素標識のものについては、反応基質、例え
ば■ＩＲＰの場合２，２′アジノージ−〔３−エチルベ
ンゾチアゾリンスル７１ネート（６）　）　（２、２’
　−Ａｄｉｎｏ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈ
ｉａｚｏｌｉｎｅ　　５ｕｌｒｏｎａｔｅ（６）］）な
どを如え発色させ吸光度を測定する。放射標識のものは
、非結合の放射活性をシンチレーンヨンカウンターで測
定する。サンプルの吸光度または放射活性を既知の量の
ｂＦＧＦに対する値と比較することによって定量するこ
とができる。

上記の２種の抗体で抗原をはさみ込むサンドイッチＥＴ
Ａ法の池にも自体公知の競合的ＥＩＡ法間接的ＥｌΔ法
がより行なわれる。競合的ＥＩＡ法としては、抗体を担
体に固定し、酵素または放射標識した抗原ｂＦＧＦとサ
ンプルとを加えて、反応させ定量する。反応条件、標識
量の測定は、上述と同様に行なイつれる。間接的ＥｒＡ
法としては、サンプルと固定していない抗体とを反応さ
せ、未吸着の抗体を抗原固定のプレートと抗マウス標識
抗体によって定量する。反応条件、標識量の測定は、上
述と同様に行なイつれる。

ｂＦＧＦの精製のためには、精製した当該抗体を例えば
活性化したアガロースゲルピーズの様な適切な担体に常
法に従ってカプリングさせた後、カラムに充め、培養上
清或いは破さいした菌体等のｒｌｌｂＦＧＦを含む資料
を抗体アフイニティカラムにかけ、吸着させた後、洗浄
し、その後例えばＫＳＣＮ（チオノアン酸カリウム）の
様なカオトロピック試薬、或いはｂＦ　Ｇ　Ｐの失活の
ない程度の弱酸性条件で溶出させる方法等により、効率
よく精製できる。

抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを接種した
腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体
を適切な担体とカプリングさせろことにより、以下の様
な方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後にｂＦＧＦが特異的に効
率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なしのであれ
ばどの様なものでもよく、該担体としては、たとえばア
ガロース、セルロースまたはアクリルアミドのポリマー
が挙げられ、その−例として蛋白の一級アミンが結合し
易い様に活性化されたポリアクリルアミドゲルビーズ、
例えばアフィゲル−１０（バイオラド社製）などが以下
に述べる様な方法で好都合に用いられる。アフィゲル−
１０と抗体との反応は、約０．００１〜ＩＭ。

好ましくは約０．１Ｍのバイカーボネート等の緩衝液中
で反応を行なう。反応条件は約０°〜２０℃、約ＩＯ分
〜２４時間、種々のｐＨが可能であるが、好ましくは、
約４℃、約４時間、ｐＨ約３〜ＩＯの条件か用いられる
。混合するアフィゲル−１０と抗体の１比は、アフィゲ
ルＩ滅に対し抗体量が約５０ｍｇ位迄は多ければ多い程
多くの抗体がつくので、この範囲内でいくらでもよいが
、結合効率およびアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーにおける精製効率を考慮して約１０〜３０ｍｇの抗
体が好都合に用いられる。この様にしてできた抗体−担
体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗った後、数日
放置するか、らしくは最終濃度約００５〜０１０Ｍのエ
タノールアミン・塩酸グリシン等の一級アミンを存する
化合物を加え約４℃で約１〜４時間反応させる。あるい
は１〜５％生血ｔｎアルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク
質を４℃−夜叉応さける等の方法により、残存する未反
応の活性基をブロックした後、適切なカラムにつめるこ
とにより、抗体カラムとして使用できろ。

上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばｂ
ＰＧＦ蛋白質含育賞金を中性付近の緩衝液、たとえばリ
ン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カラム
に吸着させろ。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち
、ｂＦＧＦを溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液た
とえば酢酸溶液、ポリエチレングリコールを含む溶液、
試料にくらべ抗体により結合し易いペプチドを含む溶液
。

高濃度塩溶液などおよびこれらを組み合せた溶液などが
用いられ、ｂＦＧＦの分解をあまり促進しないものが好
ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。

必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行な
うことができる。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキシ
ンも含まない、実質的に純粋なりＦＧＦが得られる。本
発明の実質的に純粋なりＦＧＦとしては、蛋白質含量と
してｂＦＧＦを９０％（ｔｖ／ｖ）以上であるもの、さ
らに好ましくはｈｂＦＧＦを９５％（Ｗ／　Ｗ）以上で
あるものが挙げられる。

ここで得られるｂＦＧＦ蛋白質溶液は透析に付し、必要
によりこれを凍結乾燥により粉末とすることができる。

凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニトール、デ
キストロース、マルトース、グリセロールなどの安定剤
を加えることができる。

このようにして得られるｈｂｌ”ＧＦは線惟芽細胞の増
殖を促進させる作用、内皮細胞の増殖を促進さける作用
、血管を新生させる作用を有し、毒性は低いので、火傷
、創傷、術後組織などの治癒促進剤、あるいは血管新生
作用による血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用い
ることができる。また、細胞培養を促進させるための試
薬として用いることができる。

該ｈｂＦＧＦを医薬として用いるには、そのまま粉末と
して、または他の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤
、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤、カプ
セル剤、液剤、軟膏）として、温血哺乳動物（例、ヒト
、マウス、ラット、ハムスターウサギ、犬、ネコ）に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製しうろ。

該ｈｂＦＧＦを上記した医薬として用いる場合には、た
とえば上記した温血哺乳動物に、投与ルート、症状など
を考慮して、１Ｂ１約１ｎｇないし１００μｇ／　ｋｇ
の中から適当量を選ん・で投与される。

また、該ｈｂＦ　Ｇ　Ｆを細胞培養を促進させるための
試薬として用いる場合、培地Ｉｌ！あたり約０．０１−
１０μｇ、さらに好ましくは約０．１〜１０μｇとなる
ように培地に加えることが好ましい。

また、ｈｂＦＧＦのムティンも、上述のｈｂＦ　Ｇ　Ｆ
と同様に用いることができる。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏ
ｎ＋＋＋＋１ｓｉｏｎ　　ｏｎ　　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ
ｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づ（ものであり、その例
を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければし一体を示すものとする
。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　：相補的デオキシリボ核酸ＮＡ ＡＴＰ ＴＴＰ Ｇ　Ｔ　Ｐ ＣＴＰ ＴＰ ｄｒ ＤＴＡ ＤＳ １ｙ ｌａ ａｌ ｅｕ ｉｅ ｅｒ Ｔｈｒ ：アデニン ：チミン ：グアニン ：シトシン ：リボ核酸 ：デオキシアデノシン三リン酸 ：デオキシチミジン三リン酸 ：デオキングアノシン三リン酸 ・デオキシシチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ：チミジン ：エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム グリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ；イソロイシン ：セリン ：スレオニン Ｃｙｓ　　　　ニジスティン Ｍｅｔ　　　　：メチオニン Ｇｌｕ　　　　：グルタミン酸 Ａｓｐ　　　　＋アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　　：リジン Ａｒｇ　　　　：アルギニン Ｈｉｓ　　　　：ヒスチジン Ｐｈｅ　　　　：フエニールアラニン Ｔｙｒ　　　　：チロシン Ｔｒｐ　　　　ニトリブトファン Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ａｓｎ　　　　＋アスパラギン Ｇｌｎ　　　　：グルタミン 後述の参考例において、ヒトｂＦＧＦの構成アミノ酸の
番号は、萌述のアミノ酸配列（［ｒ）においてＸがＴｈ
ｒでありＹ　ｈ＜　Ｓ　ｅｒであるペプチドのＮ末端に
Ｍｅｔが付加したアミノ酸配列において、該Ｍｅｔを第
１番目として数えるものとする。

後述の実施例２（３）で得られたマウスＨｂＦ９９細胞
、マウスＨｂＦ’＋６１細胞およびマウスＨｂＦ　Ｉ　
６５細胞は、それぞれ、昭和６２年１月２８日から財団
法人発酵研究所（ｒＦｏ）に次の受託番号として寄託さ
れている。

マウスＩ−（ｂＦ９９細胞　：ＩＦＯ５０１２２マウス
ＨｂＦＩ　６１細胞：ＩＰＯ５０１２３マウスＩ（ｂＦ
　Ｉ　６５細胞：ＩＰＯ５０１２４また、後述の実施例
４で得られたマウスハイブリドーマ）（ｂＦＩ　２．Ｈ
ｂＰ５２．ＨｂＰ７８およびＨｂＦ９８は、それぞれ、
昭和６２年８月１７日からＩＦ’Ｏに次の受託番号とし
て寄託されている。

マウスＨｂＦ　Ｉ　２細胞：ＩＦＯ５０１４２マウスＨ
ｂＦ５２細胞：［ＰＯ５０１４３マウスＨｂＦ　７８細
胞：ＩＦＯ５０１４４マウス）ｒｂＦ　９８細胞：ＩＰ
ｏ　　５０１４５以下に示す参考例および実施例におい
て製造された形質転換体のうち、受託番号の付されてい
るものは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）および通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ■）に寄託
されている。それらの受託番号および受託臼を次の第１
表に示す。なお、第１表において、ＦＥＲＭ　　Ｐ番号
とＦＥＲＭ　　ＢＰ番号とが併記されているものは、当
初国内寄託がなされＰＥＲＭＰ番号で示される受託番号
が付され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切換
えられて、Ｆ’ＥＲＭ　　ＢＰ番号で示される受託番号
が付され、同研究所（ｒ’ＲＩ）に保管されている。

（以　下　余　白） 寒裏胤 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるしのではない。

参考例＋　　（ｈｂＦ　Ｇ　Ｐをコードする遺伝子を含
むプラスミドの構築） （１）ｃＤＮＡ含有プラスミドの単＃：ヒト包皮由来初
代培養細胞ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡをＩ）ＣＤベ
クター［Ｏｋａｙａｍａ　　ら、モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ａ
ｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、３，
２８０（１９８３）参照］に組み込んで作成した大腸菌
ｘ１７７６を宿主としたｃＤＮＡライブラリーをＮａｔ
ｉｏｎａｌ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｏｆ　　Ｃｈｉ
ｌｄ　　Ｈｅａｌｔｈａｎｄ　　）−１回ｍａｎ　　Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、の岡山博士より分与を受けた。このｃＤＮ
Ａライブラリーよりアルカリ法（Ｂ　ｉｒｌｂｏｊｍ。

Ｈ，Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ、Ｊ、ヌクレイツク・アシッズ・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）、　１　。

１５１３（１９７９）］でプラスミドＤＮＡを抽出し、
このＤＮＡを大腸菌Ｉ）　１−Ｅ　１に感染させ、約２
×１０＠個のｃｌｏｎｅよりなる大腸菌Ｄｒ（Ｉを宿主
としたｃＤＮＡライブラリーを作成した。

上記大腸菌ＤＨＩを用いたｃＤＮΔライブラリーをニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社。

１−（Ａ　Ｔ　Ｆフィルター）上に約５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’
　　ｃｌｏｎｅ／フィルターとなるように１０枚まき、
このフィルターをマスターフィルター七している各２枚
ずつを１組としたレプリカフィルター計２０枚を作成し
た。このレプリカフィルター上の大腸菌を０．５Ｎ　　
ＮａＯＨ溶液で溶かし、露出変性したプラスミドＤＮＡ
をフィルター上に固定した［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、
　＆　Ｉｌｏｇｎｅｓｓ、Ｄ、　Ｓ、　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７２，
３９６１（１９７５）］。

一方、Ｆ　、　Ｅ　ｓｃｈらにより報告されている［Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
　　８２゜６５０７（１９８５）］ウシ塩基性線維芽細
胞成長因子のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸Ｎｏ。

１３−２０（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ
　−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）およびアミノ酸Ｎｏ、８
９−９６　（Ｔｈｒ−Ａｓｐ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｃｙｓ　
−Ｐｈｅ　−ＰｈｅＰｈｅ−Ｇｌｕ）をもとに、これら
のアミノ酸配列に対応する塩基配列（一部のコドンは３
番目の文字を任意に固定し、た。それぞれ５′ＧＧＡ／
　ＴＣ′ｒ／ｃＴＴＡ／ＧＡＡ／ＧＴＧ以ＣＣＮＧＧ八
〇Ｇ、および５　ＴＣ／ＧＡへ／／ＧＡＡ〆　　　　Ａ Ａ／ＡＡＡ／ＧＣＡＴ／ＴＣＧＴＣＧＧＴ。

Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ−−下線を引いた
塩基は固定したものを示した。）を化学合成した。この
オリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造製）を用いて５０μＱの反応液［オリゴヌ
クレオチド０．１Ｍｇ。

５０ＩＩＩＭ　　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ　　ｐＨＢ、０．
Ｉ　ＯｍＭＭｇＣＩｔ、　　Ｉ　ＯｍＭ　　メルカプト
エタノール、５０ｐ　Ｃｉ　７−”Ｆ　　ＡＴＰ（＞　
５０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）。

３ユニツト　Ｔ４ボリヌクレオヂドキナーゼ］中で３７
℃１時間反応させ、オリゴヌクレオチドの５′末端を３
１ｐで標識した。

上記方法で標識したオリゴヌクレオチドニ種をプローブ
として、別々に、ＤＮＡを固定したレプリカフィルター
に会合させた。会合反応は、１０μＣｉのプローブを含
む５ＸＳＳＰＥ［Ｉ　８０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ　　
Ｎａ１ｌ、ＰＯ，、ＩｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐｉ−１７、
４）］、　５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　０　；　
Ｉ％ＳＤＳ。

１００μｇ／−変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０−中で、３
５℃１６時間行い、反応後フィルターを５ｘＳＳＣ［０
，Ｉ　５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０１５ＭＳ　ｏｄｉｕｎ
　　ｃｉｔｒａｔｅ］　Ｏ、Ｉ％ＳＤＳ溶液で室温で３
０分ずつ３回さらに４５℃３０分ずつ２回洗浄した［Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｔ
ｏｎｉｎｇ”Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｌｉｎｇ　　１ｌａｒｂ
ｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｐ。

３０９（１９８２月。

洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをとり、二
種類のプローブの両方に対して反応する菌株を一組２枚
のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重ね合４
つ仕ることにより探した。この方法により５　Ｘ　Ｉ　
Ｏｃｌｏｎｉｅｓより二種類のプローブに対して反応す
るｆ　ｆｆｇ　［Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｔ　
　Ｋ１２　　ＤＨＩ／ｐＴＢ６２７（ＩＦＯ＋４４９４
．ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２８０）］を得た。

（２）、上記（１）で得た菌株［Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈ
ｊａ　　ｃｏｌｉＫ１２　　ＤＩ口／ｐＴＢ６２７　（
Ｉ　ＦＯ１４４９４、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２８０）コ
よりプラスミドＤＮＡ（ｐＴＢ６２７）をアルカリ法〔
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ＾
ｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　Ｉ　、　１５１３
（１９７９））によって抽出精製した。

（３）、ｈｂＦ’ＧＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列
を、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法［Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ
Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、　　９
．　３０９（１９８１）］により決定し、その配列から
推定されるアミノ酸配列を第１図に示す。

参考例２　　（ｈｂＦ　Ｇ　Ｆをコードする遺伝子の大
腸菌における発現） ｈｂＦＧＦ発現用プラスミドｐＴｆ３６６９の構築：萌
記参考例１（２）で得られたｈｂＦＧＰ　ｃＤＮＡを含
むプラスミドｐＴＢ６２７を制限酵素ＡｖａｌおよびＢ
ａ１ｌで切断し、ｈｂＦ　Ｇ　Ｆをコードする領域を含
む０．４４Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片
のＢａ１ｌ切断部位（平滑末端）に、Ｔ、ＤＮＡリガー
ゼで８ｇｌｌｌリンカ−ｐＣＡＧＡＴＣＴＧを結合させ
て、０．４４ＫｂのＡｖａｌ　−ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片
を分離した。この０．４４Ｋｂ　　Ａｖａ１１３ｇｌｌ
ｌ　　ＤＮＡ断片にＴ、ＤＮＡリガーゼを反応させてＢ
ｇｌＩＩ切断部位どうしを結合させたのち、ｄＸＴＰ存
在下にＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント
）反応を行いＡｖａｌ切断部位を平滑化した。このＤＮ
Ａ断片に、リン酸化反応後の合成オリゴヌクレオヂド”
ＡＡ’ｌ’ＴＣＴＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣ”および
”ＧＣＡＡＴＧＣ１’ＧＧＣＡＴＡＧ”を７４ＤＮＡリ
ガーゼにより結合させＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｔで切
断して、約０．４６ＫｂＤＮＡ断片を調製した。一方、
ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ７８１
　（Ｋｕｒｏｋａｖａ、　Ｔ、らニュークレイツク・ア
シッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃΔｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
、　）Ｉ　Ｉ　、３０７７３０８５（＋　９８３））Ｄ
ＮＡをＰｓｔｌで切断し、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ反応
によって平滑化した。

８ｇｌｌｌリンカ−ｐＣＡＧＡＴＣＴＧをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ反応によって平滑末端に結合させたのちＥｃｏｎ
　ｒ　−ｒ３ｇｌ　ＩＩで切断して、ｔｒｐプロモータ
ーテトラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開
始部位を含む約３．２Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を分離した。

ｈｂＦＧＦをコードする遺伝子領域を含む前記０，４６
Ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ［ＤＮＡ断片と、この３．
２Ｋｂ　　ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により
結合させｈｂＦ　Ｇ　Ｆ発現用プラスミドｐＴＢ６６９
を構築した。

このプラスミドｐＴ８６６９を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることによりプラスミドｐＴＢ６６９を含む
菌株Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　１ＤＨＩ／
ｐＴＢ６６９を得た。

さらに、同様にして、ｐＴＢ６６９を用いて大腸菌　Ｋ
１２　　ＭＭ２９４．あるいはＣ６００を形質転換して
、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　Ｉｇ
ＭＭ２９４／１）ＴＢ６６９（ＩＦＯ１４５３２゜ＦＥ
ｎＭ　　ＢＰ　−１２８１）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｃ６
００／ｐＴＩ３６６９をそれぞれ得た。

参考例３　（ヒト塩基性線維芽紬胞増殖因子（ｈｂＦＧ
Ｆ）の精製） 参考例２で得られたＥｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ　Ｋ　ＩｇＭＭ２９４／Ｉ）Ｔ［３６６９（ＩＦＯ１
４５３，２゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２８１）を１％グル
コース。

０．４％カザミノ酸、８μｇ／ｌｎ１テトラサイクリン
を含むＭ９培地［ティ・マニアティス（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング・
ラボラトリー−ｖニュアル、（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ
、　ｅｔ　ａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
（１９８２）、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ
　　　Ｉｒａｒｂｏｒ　　　ＮＹ。

ＵＳＡ）］で培養し、Ｋ　１ｅｆｔ値が約２００の時点
で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／ｄになる
ように添加し、さらに４時間培養した。培養後、菌体を
集め、Ｉ／２０ｍの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ・ＨＣＩ、　
ｐＨ７，６，Ｉ　０％シュークロース溶液に懸濁した。

この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオライド（
ＰＭＳＦ）をＩａ＋Ｍ、　　ＥＤＴＡを１０ｍＭ、Ｎａ
Ｃ１を０　、１　Ｍ　、スペルミジン塩酸塩を璽ＯｍＭ
、リゾチームを１００μｇ／−（いずれも最終濃度）と
なるように添加し、０℃、４５分放置後、３０秒間超音
波処理を加えた。この溶液を１８００　Ｏｒｐｍ（サー
バル遠心機、５Ｓ３４ｏ−ター）３０分間遠心して上清
を得、菌体抽出液とした。

この抽出液２５滅（培養液５００ｄより調製）を２０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ７，６，０，２ＭＮａ
Ｃ１溶液で平行化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２．
ワットマン社）カラム、（径２ＸＩＯｃ＋ｎ）に通し、
抽出液中の核酸成分を除去した。カラムからの素通り液
および２０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣＩ、ｐＨ７，
６，０，２Ｍ　　ＮａＣｌ溶液でのカラム洗液を合わせ
て集めた（ＤＥＡＥ素通り画分４４ｄ）。

この画分１４−をヘパリンカラム５ｈｏｄｅｘ　　Ａ　
Ｆ−ｐａｋ　　　ＨＲ−８９４（８ｍＩＩＩＩＤｘ５ｃ
ｍ、昭和電工製）を装備した高速液体クロマト装置（ギ
ルソン社）にかけた。カラムを、２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−Ｉ−ｒｃｌｐＨ７，６溶液５次いで２０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，６，０，５Ｍ　　ＮａＣ１溶液で
洗った後、２０ｌｔｌＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ
７，６，バッファー中、０．５Ｍから２ＭのＮａＣｌの
直線勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　　ｇｒａｄｉｅｎｔ　　
ｅｌｕｔｉｏｎ、　６０！、流速１．０−／ｍ１ｎ）を
行った。

この操作により溶出されたｈｂＦ　Ｇ　Ｐは、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示し
、十分に精製されており、抗原として使用するのに好適
であることが判明した。なおｈｂＦＧＦの検定は以下の
条件で行った。

マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤ
ＭＥＭ培地でタンク９６六マイクロタイタープレート（
平底）に１穴あたり２Ｘ１０″個を０．２−の培地にて
播種して、培養し、翌日。

０．５％仔牛血清を含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地に交換した
。

３日間培地したのち０，５％ＢＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した菌体抽出液を１穴あたりＩＱ
μ添加して、培養し、２０時間後に’Ｈ−Ｔｄｒ（５Ｃ
ｉ／ａ＋ｍｏｌ、０．５ｍＣ１／藏　ＲＣＣＡｍｅｒｓ
ｈａｍ）を６穴に２μずつ加えた。６時間後に細胞を０
．２％トリプシン−〇、０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩
衝液（ＰＩ３Ｓ）処理ではがし、タイターチックセルハ
ーベスタ−を用いて、グラスフィルター上に細胞を捕集
し細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量をシンチレーシ
ョンカウンターにて測定した。

参考例４　（ムティンをコードする塩基配列を有する組
換えＤＮＡの製造） （１）、ヒトｂＦＧＦ遺伝子のＭ１３ベクターのクロー
ニング： 参考例２で得られたプラスミドｐＴ、Ｂ　６６９を制限
酵素ＥＣＯＲ［及びＢａｍＨＩで消化させた。ファージ
ベクターＭＩ３ｍｐ８（クレイ・メッシング（ＪＭｅｓ
ｓｉｎｇ）、メソッズ・イン・エンジ−モロジー１０１
．２０〜７８（１９８３））複製型（ＲＦ）ＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｌｌ１ｌｔｌで消化させ、予
めＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化させてあったｐＴＢ
６６９由来のヒトＩＧＦ’　　ＤＮＡ断片と混合した。

次に混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、連結ＤＮ
Ａを大腸菌−ＪＭＩ０５菌株の被感染能力のある菌体中
へ形質転換させ、ｘｇａｔを指示秤とするプレート上に
播き〔クレイ・メツシング等、ニュークレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅｓ、　）　（１９８１）９巻３０９−３２１頁〕、組
換えファージを含有するプラーク（白いプラーク）を拾
い上げ、組み換え部分の塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド合成鎖停止法（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　　ら、ヌク
レイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）９　、３０９（＋９８１））
によって決定して、ヒトｂＦＧＦＤＮＡが正確に挿入さ
れていることを確認した。

このＭ　１３　Ｐ　Ｏクローンから１本鎖ファージＤＮ
Ａを精製し合成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位
指向性変異誘発の鋳型として用いた。

（２）サイト特異的突然変異誘発 ０　、１　ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣ１
）ｐＨ８、０、Ｉ　ＯｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、５ｍＭジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存
在下に、５０μρ中で合成オリゴヌクレオチ５ｅｔ ＯＣＴ　＜３’ （ｃｙｓ２６をＳｅｒに変更するためのブライマー（制
限酵素Ｒｓａｌの認識配列が消失する。）〕４０ピコモ
ルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間処理した。５０
ｉＭ　　ＮａＣｌ、ｌ　、Ｏｎ＋Ｍ　トリス夏ｆｃＩ、
ｐＨ８，０％　１０ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ及び１０ｍＭ　
　β−メルカプトエタノールを含有する混合物５０μσ
中で、このキナーゼ処理されたブライマー（１２ピコモ
ル）を６７℃で５分、及び４２℃で２５分加熱すること
によって１本鎖（ｓｓ）Ｍ　ｌ　３−ＰＯＤＮＡ５μｇ
に雑種形成させた。アニーリングした混合物を次に水上
で冷却し、０　、５　ｍＭジデオキシヌクレオチド三燐
酸（ｄＮＴＰ）、８０ＩＩＩＭトリスーＭＣＩ、　　ｐ
Ｈ７，４、８ｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、１００１Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１，ＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ断片９単位、
０　、５　ｍＭ　　Ａ　Ｔ　Ｐ及びＴ４ＤＮＡリカーゼ
２単位を含有する反応混合物５０μａに添加し、３７℃
で３時間及び２５℃で２時間反応し、０．２ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ２ｕＱを加え反応を停止した。被感染能力のある
ＪＭ　　　１０５細胞の形質転換に使用し、菌を一夜成
育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮＡを単離した。この
５ｓＤＮＡをブライマー伸長の第二サイクルに鋳型とし
て使用し、ゲル精製されたＲＦ型ＤＮＡを被感染能力の
あるＪＭＩ　Ｏ５細胞中へ形質転換させ、寒天プレート
上に播き、−夜培養するとファージプラークが得られた
。

（３）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン７０を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので Ｈａｅ■ Ｃく３′ とする。（制限酵素Ｈａｅｌｌの認識配列が生成される
） （４）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン８８を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので ／ＭｕＴ ＡＧＴ　　＜３’ とする。（制限酵素Ａｌｕｌの認識配列が生成される） （５）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、システィン９３を暗号づ
けるらのからセリンを暗号づけるもので １ｎｆｌ ＴＣＣ＜３’ とする。（制限酵素１−１ｉｒ＋４Ｉの認識配列が生成
される） （６）突然変異誘発厚化されたプラークのふるい分けと
同定： 突然変異させたＭ１３−ＰＯプラークの入ったプレート
類（上記（１）項）並びに突然変異しないＭ１３−ＰＯ
ファージプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却
し、各プレートからのプラークを２枚のニトロセルロー
ス円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥
フィルターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルタ
ーの場合は１５分重ねて移した。次に０．２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ。

１．５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１００
に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に
０．５Ｍトリス−ＨＣ１，ｐＨ７、５、及び１．５Ｍ　
　ＮａＣｌに浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。

フィルター類を同様なやり方で２ＸＳＳＣ（漂県クエン
酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空
乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。重複フィルター
類をフィルター当たりｔｏｙのＤＮＡ雑種形成援衡液（
５ｘ　ｓ　Ｓ　Ｃ）、Ｉ）Ｈ７，０，４Ｘデンハード液
（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、１×＝各０．０２％
）、　Ｏ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　
）。

５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、０及び１００
μｇ／−の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時
間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドプライマ
ーを１０５ｃｐｍ／−に４２℃で２４時間雑種形成させ
た。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄用
緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を洗
った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝
液で洗い、突然変異化されないＭｌ３−ＰＯプラークを
含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射
能の存在について検査した。５ｓｃｅｔｉを段階的に低
下さ什、未突然変異〜１１３−ＰＯプラークをもつ対照
フィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフ
ィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．ｌＸ
５ＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃で
２〜３日露光してオートラジオグラフをとった。突然変
異したＭｌ３−ＰＯのプラーク１００００個と突然変異
されない対照プラーク１００個をキナーゼ処理しｊニオ
リボヌクレオチドプローブ１こよってふるい分けた。対
照プラークではプローブと雑種形成したものが全く存在
せず、一方突然変異されたＭ１３ＰＯプラーク３〜ＩＯ
個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−ＰＯプラークのＩＩＩＪを取り上げ、
ＪＭＩ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡを
つくり、菌体ペレットから２本ｍ（ｄｓ）ＤＮＡをつく
った。適当なオリゴヌクレオチドプライマーと５ｓＤＮ
Ａを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＴＧＣＣＣＹＳ２６）コドンがＴＣＴ（Ｓｅ
ｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（ｃｙｓ７０）コ
ドンがＡＧＣ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと、ＴＧ
Ｔ（ｃｙｓ８８）コドンが、ＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ
変換されたこと、ＴＧＴ（ｃｙｓ９３）コドンがＴＣＴ
（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認され
た。

変異したＭｌ３−ＰＯファージのうち、コドンＣｙｓ−
２６がＳｅｔになったものをＭｌ３−ＰＩ。

コドンＣＹＳ−７０がＳｅｔになったものをＭｌ　３−
Ｐ２．：ｌトンＣｙｓ−８８がＳｅｔになったものをＭ
ｌ　３−Ｐ３．コドンＣｙｓ−９３がＳｅｔになったも
のをＭｌ３−Ｐ４とした。

参考例５　ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝子
の大腸菌における発現： （１）　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ７３９の構築 前記参考例４で得られたＭｌ３−ＰＩのレプリカティブ
フォーム（ＲＦ’）を制限酵素ＥｃｏＲｒおよびＰｓｔ
ｌで切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域
を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１　（Ｋｕｒｏｋａｗａ、　Ｔ　、らニュークレイ
ツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃＩｅｉｃ　　Ａｃｊ
ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）−Ｕ工、　　３０７７−３０８５
（＋　９８３））ＤＮＡをＥｃｏｎ　ｌ　−Ｐｓｔ　ｒ
で切断して、ｔｒｐプロモーター、テトラサイクリン耐
性遺伝子およびプラスミド複製開始部位を含む約３．２
Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を分離した。ヒトｂＦＧＦのムティ
ンをコードする遺伝子領域を含む前記０．５Ｋｂ　　Ｅ
ｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩ　　ＤＮＡ断片と、この３．２Ｋ
ｂ　　ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により結合
させヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ７
３９を構築した。

このプラスミドｐＴＢ７３９を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させろことによりムティンをコードする遺伝子を
含有するプラスミドｐＴＢ７３９を含む菌株Ｅ　５ｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　ｉ　　Ｄ　ＨＩ　／　ｐＴ
Ｂ７３９（ＩＦＯ１４５７５，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６
４１）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記（１）で得られた形質転換体を、１％グルコース、
０．４％カザミノ酸、８μｇ／蔵テトラサイクリンを含
むＭ９培地で培養し、ＫＩｅｔｔ１５が約２００の時点
で、３βインドリ−ルアクリル酸を２５μｇ／ｒｎ１に
なるように添加し、さらに４時間培養した。培養後、菌
体を集め、Ｉ　／　２０　ｍの２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７，６，１０％シュークロース溶液に＠澗
した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ＰＭＳＦ）をＩｍＭ、ＥＤＴＡをＩ　ＯｍＭ、　
ＮａＣｌを０．１Ｍ、スペルミジン塩酸塩をｌ０ｍＭ、
リゾチームを１００μｇ／ｄ（いずれも最終濃度）とな
るように添加し、０℃、４５分放置後、３０秒間超音波
処理を加えた。この溶液を１８０００　ｒｐｍ（サーバ
ル遠心機。

５Ｓ３４０−ター）３０分間遠心して上清を得、菌体抽
出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 マウスＢΔＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤ
ＭＥＭ培地でタンク９６穴マイクロタイタープレート（
平底）に１穴あたり２ＸＩＯ’個を０．２−の培地にて
播種して、培養し、翌日。

０．５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。

３日間培養したのち０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥ培地で
５倍ずつ段階的に希釈した菌体抽出液を１穴あたり１０
ｕρ添加して、培養し、２０時間後に３Ｈ−チミジン（
５Ｃ４／ｍｍｏｌ、０．５ｍＣ１／蔵ＲＣＣＡ　ｍｅｒ
ｓｈａｍ）を各人に２μＱずつ加えた。６時間後に細胞
を０．２％トリプシン−〇、０２％ＥＤＴＡを含むリン
酸緩衝液（ＰＢＳ）処理ではがし、タイターチックセル
ハーベスタ−を用いて、グラスフィルター上に細胞を捕
集し細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量をシンチレー
ションカウンターにて測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ／ｐＴＢ７３９の菌
体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの２６位のＣｙｓが５ｅ
ｒｆ：置換されたムティンＣ８Ｉが得られた。

参考例６　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７４２の構築 前記参考例４で得られたＭ２Ｓ−Ｐ２のレプリカティブ
フォーム（ＲＦ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ
で切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域を
含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１ＤＮＡをＥｃｏＲ［−Ｐｓｔ　Ｉで切断して、ｔ
ｒｐブロモ−クー、テトラサイクリン耐性遺伝子および
プラスミド復製開始部位を含む約３．２ＫｂＤ　Ｎ　Ａ
断片を分離した。ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする
遺伝子領域を含む前記０．５ＫｂＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ
　　ＤＮＡ断片と、この３．２ＫｂＤ　Ｎ　Ａ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させヒトｂＦＧＦのム
ティン発現用プラスミド１）ＴＢ７−１２を構築した。

このプラスミドｐＴＢ７４２を用いて大腸菌ＤＩ１１を
形質転換させることによりムティンをコードする遺伝子
を含何するプラスミドｐＴＩ３７４２を含む菌株Ｅ　５
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｄ　ＨＩ　／　ｐ
ＴＢ７４２（ＩＦＯ１４５８４，ＦＥＲＭ　　ＢＰ１６
４２）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上ｌ＋Ｗを得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｂ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ／ｐＴＢ７４２の菌
体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位のＣｙｓがＳｅ
ｔに置換されたムティンＣＳ２が得られた。

参考例７　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌におけろ発現） （１）　　ヒトｂｒ”ＣＦのムティン発現用プラスミド
ｐＴＢ７４３の構築 前記参考例４で得られたＭ＋　３−Ｐ３のレプリカティ
ブフォーム（ＲＦ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ
ｒで切断し、ヒトｂＦＧＦ’のムティンをコードする領
域を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔ　ｒ
ｐ７８１　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで切断し
て、ｔｒｐプロモーター、テトラサイクリン耐性遺伝子
およびプラスミド複製開始部位を含む約３．２ＫｂＤＮ
Ａ断片を分離した。ヒトｂＦＧＦのムティンをコードす
る遺伝子領域を含む前記０．５ＫｂＥｃｏＲＩ　−Ｐｓ
ｔｌ　　ＤＮＡ断片と、この３．２ＫｂＤＮＡ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させヒトｂＦＧＦのム
ティン発現用プラスミドｐＴＢ７４３を構築した。

このプラスミドｐＴＢ７４３を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることによりムティンをコードする遺伝子を
含有するプラスミド１）ＴＢ７４３を含む菌株Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｈｌ　／ｐＴＢ７
４３（ＩＦＯ１４５８５，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６４３
）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ＤＨｌ／ｐＴＢ　７４３
の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの８８位のＣｙｓがＳｅ
ｒに置換されたムティンＣＳ３が得られた。

参考例８　（ヒトｂＦＧＰのムティンをコードする遺伝
子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７４４の構築 前記参考例４で得られたＭ１３−Ｐ４のレプリカティブ
フォーム（ＲＰ）を制限酵素Ｅｃｏｆｌ［およびＰｓｔ
［で切断し、ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする領域
を含む約０．５Ｋｂ　　ＤＮＡ断片を得た。

一方、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐｔｒｐ
７８１　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉで切断して
、ｔｒｐプロモーター７テトラサイクリン耐性遺伝子お
よびプラスミド複製開始部位を含む約３．２ＫｂＤＮＡ
断片を分離した。ヒトｂＦＧＰのムティンをコードする
遺伝子領域を含む前記０．５ＫｂＥｃｏｎ　Ｉ　−Ｐｓ
ｔｌ’　　ＤＮＡ断片と、この３．２ＫｂＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させヒトｂＦＧＦの
ムティン発現用プラスミドｐＴＢ７４４を構築した。

このプラスミドｐＴＢ７４４を用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換させることによりムティンをコードする遺伝子を
含有するプラスミドｐＴＢ７４４を含む菌株Ｅ　５ｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ　ｉ　　Ｄ　Ｈ１／　ｐ’ｒ
Ｂ７４４（ＩＦＯ１４５８６，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６
４４）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上滑を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ’活性を測定した。

その結果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ／ｐＴＢ７４４の菌
体抽出液は、ＰＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの９３位のＣｙｓがＳｅ
ｔに置換されたムティンＣ９４が得られた。

参考例９　（突然変異誘発厚化されたプラークのふるい
分けと同定） 参考例４で得られた突然変異させたＭ＋３−Ｐ２ファー
ジプラークの入ったプレート類並びに参考例４で得られ
た突然変異しないＭ＋３−Ｐ２ファージプラークの入っ
た２枚のプレートを４℃に冷却し、各プレートからのプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、
第一フィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プレー
ト上へ５分重ね、第二フィルターの場合は１５分重ねて
移した。次に０．２Ｎ　　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１及び０．２％トリトンＸ−１００に５分浸した厚手
のろ紙上へフィルター類を置き、次に０，５Ｍトリス−
ＨＣＩ、ｐｌ−１７、５、及び１．５Ｍ　　ＮａＣ１に
浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィルター類
を同様なやり方で２ｘｓｓｃｃｅＡ準クエン酸塩）に浸
したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉内で
８０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルター類をフィルター当たり１０蔵のＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、ｐＨ７，０，イ×デンハ
ード液（ポリビニルピロリドン、フィコール及び牛血清
アルブミン、ｌ×＝各０．０２％）。

０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭ
燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び　１００μｇ／
ｄの、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４時間、事
ｆｌｉ［種形成させた。次にオリゴヌクレオチドブライ
マーを１０　’ｃｐｍ用い４２℃で２４時間雑種形成さ
せた。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄
用緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を
洗った。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩
衝液で洗い、突然変異化されないＭｌ３−Ｐ２プラーク
を含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放
射能の存在について検査した。５ＳＣＪ５度を段階的に
低下させ、未突然変異Ｍ＋３−Ｐ２プラークをもつ対照
フィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフ
ィルター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．Ｉｘ
ＳＳＣであった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃で
２〜３日露光してオートラジオグラフをとった。突然変
異したＭｌ３−Ｐ２のプラーク１００００個と突然変異
されない対照プラーク１００個をキナーゼ処理したオリ
ゴヌクレオチドプローブによってふるい分けた。

対照プラークではプローブと雑種形成したものが全く存
在せず、一方突然変異されたＭｌ３−Ｐ２プラーク３〜
ＩＯ個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−Ｐ２プラークの１個を取り上げ、ＪＭ
Ｉ０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡをつく
り、菌体ベレットから２本８！（ｄｓ）ＤＮＡをつくっ
た。適当なオリゴヌクレオチドプライマーと５ｓＤＮＡ
を使用して塩基配列を解析した。

その結果、Ｔ　Ｇ　Ｃ（ｃｙｓ２６　）コドンがＴＣＴ
（Ｓｅｒ）コドンへ変換されたこと、ＴＧＴ（ｃｙｓ８
８）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｔ）コドンへ変換されたこと
、Ｔ　Ｇ　Ｔ（ｃｙｓ９３　）コドンがＴＣＴ（Ｓｅｒ
）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認された。

変異したＭｌ３−Ｐ２ファーノのうち、コドンＣｙｓ−
２６および−７０がＳｅｔになったものをＭｌ　３−Ｐ
　Ｉ　２．コドンＣｙｓ−７０および−８８がＳｅｒに
なったものをＭｌ３−Ｐ２３．コドンＣｙｓ−７０およ
び−９３がＳｅｔになったらのをＭｌ３−Ｐ２４とそれ
ぞれ称することとした。

参考例１０　　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦ’ＧＦのムティン発現用プラスミド
ｐＴＢ７６２の構築 前記参考例９で得られたＭｌ３−Ｐ２３のレプリカティ
ブフォーム（ＲＦ）を、参考例５（Ｉ）と同様に処理し
、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＩ３７
６２を構築した。

このプラスミドｐＴＢ７６２を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることによりムティンをコードする遺伝
子を含有するプラスミドｐＴＢ７６２を含む菌株Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＭＭ　２９４／Ｉ）
ＴＥ１０１（ＩＦＯ１４６１３，ＰＥＲＭ　　ＢＰ−１
６４５）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）　　Ｖ４体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性上記（２）
で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３）と同様の
方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／Ｉ）ＴＢ　
７６２の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦの７０位および８８位の
ＣｙｓがＳｅｔに置換されたムティンＣＳ２３が得られ
た。

参考例ＩＩ　　（ムティンをコードする塩基配列を有す
る組換えＤＮＡの製造） （１）、ヒトｂＦＧＦ遺伝子のＭ１３ベクターのクロー
ニング： 参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ［で消化させた。ファージベク
ターＭＩ３ｍｐ８（ジェイ・メッシングＵ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソッズ・イン・エンジ−モロジー
１０１．２０〜７８（＋　９８３））複製型（ＲＦ）Ｄ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲｒ及びＢａｍＨＩで消化させ、
予めＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩで消化させてあったｐＴ
８６６９由来のヒトｂＦＧＦ　　ＤＮＡ断片と混合した
。次に混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、連結Ｄ
ＮＡを大腸菌−ＪＭＩ０５菌株の彼感染能力のある菌体
中へ形質転換させ、Ｘｇａｌを指示秤とするプレート上
に播き〔ジエイ・メッシング等、ニュークレイツク・ア
ンッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、　）　（１９８１）９巻３０９−３２１頁〕、
組換えファージを含有するプラーク（白いプラーク）を
拾い上げ、組み換え部分の塩基配列をジデオキシヌクレ
オチド合成鎖停止法（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　　ら、ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　
Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）９．　３０９（１９８１）
）によって決定して、ヒトｂＦＧＦＤＮＡが正確に挿入
されていることを確認した。

このＭ　Ｉ　３−　Ｐ　Ｏクローンから１本鎖ファージ
ＤＮＡを精製し合成オリゴヌクレオチドを使用する特定
部位指向性変異誘発の鋳型として用いた。

（２）サイト特異的突然変異誘発 ０　、　Ｉ　ｍＭアデノシン酸燐酸（ＡＴＰ）、５０ｍ
Ｍヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣ
Ｉ）Ｉ）Ｈ８，０１１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｔ、５ｍＭジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の
存在下に、５Ｑｕ（ｌ中で合成オリゴヌクレオチド ５’−ＣＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＴ３′ 〔塩基配列中に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を生成し
、さらにＰｒｏ１４をＭｅｔに変更するためのプライマ
ー〕４０ピコモルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間
処理した。５０ｍＭ　　ＮａＣ１゜１．０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、Ｉ）＋（８，０、ＩＯｍＭＭｇＣＩ、及びｌ０
ｍＭ　　β−メルカプトエタノールを含有する混合物５
０μｅ中で、このキナーゼ処理されたブライマー（１２
ピコモル）を６７℃で５分、及び４２°Ｃで２５分加熱
することによって１本鎖（ｓｓ）Ｍｌ　３−ＰＯＤＮＡ
５μｇに雑種形成させた。アニーリングした混合物を次
に水上で冷却し、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド三
燐酸（ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス−Ｉ−（ｃＩ、　ｐ
ｌ−１７，４，８ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、１００ｍＭ　　
ＮａＣｌ、ＤＮＡポリメラーゼｌ　　Ｋｌｅｎｏｖ断片
９単位、０．５ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリカーゼ
２単位を含有する反応混合物５０μρに添加し、３７℃
で３時間及び２５℃で２時間反応し、０．２ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ２μＱを加え反応を停止した。被感染能力のある
ＪＭ　　１０５細胞の形質転換に使用し、菌を一夜成育
させ、培養基上澄液から５ｓＤＮＡを単離した。

このｓｓＤ　Ｎ　Ａをブライマー伸長の第二サイクルに
鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ型ＤＮＡを被感
染能力のあるＪＭＩ０５細胞中へ形質転換させ、寒天プ
レート上に播き、−夜培養するとファージプラークが得
られた。

（３）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、塩基配クリ中に制限酵素
Ｎｃｏｌの認識部位を生成し、同時にＧＩｙ９をＴｈｒ
に、５ｅｔｌＯをＭｅｔに変更するもので、 ５’−ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣ−３′ とする。

（４）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、塩基配列中に制限酵素Ａ
ｒ１ｎの認識部位を生成し、同時にＬｙｓ８７をコード
するコドンを停止コドンに変、更するもので ５’−ＴＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧ−３′ とする。

（５）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、塩基配列中に制限酵素１
４ｐａｆの認識部位を生成し、同時にＡｓｐ４２をＡｓ
ｎに変更するもので ５’−ＣＣＧＧＡＣＴＣＣＧＴＴＡＡＣＴＣＧＧ３′ とする。

（６）特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オリ
ゴヌクレオチドブライマーは、塩基配列中の制限酵素Ｈ
ｐａｒＩの認識部位を消失させ、同時にＡｒｇ！！５を
Ｇｌｎに変更するもので５’−ＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡ
ＣＴＣＣＧＴＣＡＡＣ−３’ とする。

（７）突然変異誘発厚化されたプラークのふるい分けと
同定： 突然変異させたＭｌ３−ＰＯプラークの入ったプレート
類（上記（＋）項）並びに突然変異しないＭｌ３−ＰＯ
ファージプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却
し、各プレートからのプラークを２枚のニトロセルロー
ス円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥
フィルターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルタ
ーの場合は１５分重ねて移した。次に０，２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ１，５Ｍ　　ＮａＣ１及び０．２％トリトンＸ−１
００に５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、
次に０．５Ｍ）リス−１−ＩＣＩ、ｐ）（７，５、及び
１．５Ｍ　　ＮａＣ１に浸したろ紙上へ更に５分重ねて
中和した。フィルター類を同様なやり方で２ｘＳＳＣ（
標準クエン酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い、乾
燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥さけた。重複
フィルター類をフィルター当たり１０ｍ１ｌのＤＮＡ雑
種形成緩衝液（５Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、ＩＩ）Ｈ７，０，
４ｘデンハード液（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、■×＝各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。

５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、Ｉ）８７．０及び１０
０μｇ／−の、変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃で４
時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチドプライ
マー１０　’ｃｐｍを４２℃で２４時間Ｎ。種形成させ
た。０．１％ＳＤＳと減少量のＳＳＣを含有する洗浄用
緩衝液中でそれぞれ３０分、５０℃でフィルター類を洗
った。フィルター類を、初めに２ｘＳＳＣを含んだ緩衝
液で洗い、突然変異化されないＭｌ３−ＰＯプラークを
含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射
能の存在について検査した。５ｓｃａ度を段階的に低下
させ、未突然変異Ｍ＋３−ＰＯプラークをらつ対照フィ
ルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフィル
ター類を洗った。ＳＳＣの使用最低濃度は０．ｌＸ５Ｓ
Ｃであった。フィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜
３日露光してオートラジオグラフをとった。突然変異し
たＭ１３ＰＯのプラーク１００００個と突然変異されな
い対照プラーク１００個を３２Ｐ−γ−ＡＴＰでキナー
ゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによってふるい
分けた。対照プラークではプローブと雑種形成したもの
が全く存在仕す、一方突然変異されたＭｌ３−ＰＯプラ
ーク３〜１０個がプローブと雑種を形成した。

突然変異Ｍ１３−ＰＯプラークの１個を取り上げ、Ｊ　
Ｍ　ｌ　０５培養基へ接種した。上澄液から５ｓＤＮＡ
をつくり、菌体ペレットから２本！１（ｄｓ）ＤＮＡを
つくった。適当なオリゴヌクレオチドブライマーと５ｓ
ＤＮＡを使用して塩基配列を解析した。

その結果、ＡＧＣ（Ｓｅｒｌ　Ｏ）コドンがＡＴＧ（Ｍ
ｅｔ）コドンへ変換されたこと、ＣＣＧ（Ｐｒｏ＋４）
コドンがＡ　Ｔ　Ｇ　（Ｍ　ｅＬ）コドンへ変換された
こと。

ＡＡＡ（ＬＹＳ８７）コドンがＴＡＡ（停止）コドンへ
変換されたこと、　ＧＡＣ（Ａｓｐ４２）コドンがＡＡ
Ｃ（Ａｓｎ４２）コドンへ変換されたこと、　ＣＧＧ（
Ａｒｇ４５）コドンがＣＡＧ（Ｇｉｎ４５）コドンへ変
換されたことがそれぞれ確認された。

変異したＭｌ　３−ＰＯファージのうち、コドン５ｅｒ
ｌＯがＭｅｔになったものをＭｌ３−ＰＮＩＯと、 コド７ＰｒａＩ４がＭ　ｅ　ｔになったものをＭｌ３−
ＰＨ１０と、 コドンＬｙｓ８７が停止コドンになったものをＭｌ３−
ＰＣ８６と、 コドンＡｓｐ４２がＡｓｎになったものをＭｌ３−ＰＤ
Ｎ４２と、 コドンＡｒｇ４５がＧｉｎになったものをＭｌ３−ＰＲ
Ｑ４５とそれぞれ称することとした。

参考例１２　（ヒトｂＦ’ＧＦのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）　ヒトＩＩＦ’ＧＦ’のムティン発現用プラスミ
ドｐＴＩ３７９５の構築 前記参考例１１で得られたＭｌ３−ＰＨ１０のレプリカ
ティブフォーム（ＲＦ）を、参考例５（１）と同様に処
理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
７９５を構築した。このプラスミドｐＴＢ７９５を用い
て大Ｉｌａ菌　ＭＭ２９４を形質転換させることにより
、ムティンをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ
ＴＢ７９５を含む菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｊＭＭ２９４／ｐＴＢ７９５（ＩＦＯ１４７００，Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ１６６０）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＰＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３
）と同様の方法でヒトｂＦＧＦ活性を測定した。その結
果、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７９５の菌体
抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。このようにして、ヒト
ｂＦＧＦのＰｒｏ２からＰｒｏ１４までが欠損したムテ
ィンＮＩ４が得られた。

参考例１３　（ヒトｂＦＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴ
Ｂ７９６の構築 萌記参考例１１で得られたＭＩ３−ＰＣ８６のレプリカ
ティブフォーム（ＲＦ）を、参考例５（Ｉ）と同様に処
理し、ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
７９６を構築した。このプラスミドｐＴＢ７９６を用い
て大腸菌　ＭＭ２９４を形質転換させることにより、ム
ティンをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＴＢ
７９６を含む菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４／ｐＴＢ７９６（ＩＦＯ１４７０１，ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ１６６１）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、ヒトｂＦＧＦのＬｙｓ８７以降のアミノ
酸を欠損したムティンＣ８６を含有する菌体抽出液を得
た。

参考例１４　（ヒトｂＦＧＰのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌における発現） （１）　　ヒトｂＦＧＰのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７９７の構築 萌記参考例１１で得られたＭ１３−ＰＤＮ４２のレプリ
カティブフォーム（ＲＦ’）を、参考例５（１）と同様
に処理し、ヒトｂＦＧＰのムティン発現用プラスミドｐ
ＴＢ７９７を構築した。このプラスミドｐＴＢ７９７を
用いて大腸菌　ＭＭ２９４を形質転換させることにより
、ムティンをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ
ＴＢ７９７を含む菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉＭＭ２９４／ｐＴＢ７９７（ＩＦＯ１４７０２，Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１６６２）を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３
）と同様の方法でヒｌ−ｂＦ　Ｇ　Ｆ活性を測定した。

その結果、Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ＭＭ２９４　／ｐＴＢ　
７９７の菌体抽出液は、ＦＧＦ活性を示した。このよう
にして、ヒトｂＦＧＦのＡｓｐ４２がＡｓｎに置換され
たムティンＤＮ４２が得られた。

参考例＋５　　（ヒトｂＦＧＰのムティンをコードする
遺伝子の大腸菌における発現） （１）ヒトｂＦＧＦのムティン発現用プラスミドｐＴＢ
８５５の構築 前記参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９のＤＮ
Ａを制限酵素Ｈｉｎａｌｌで切断し、ＥｃｏＲ■リンカ
−１）（５’−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ−３′）をＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応によって結合させた。さらに制限
酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで切断して、約０．３５ｋｂ
のＤＮＡ断片を分離した。このＤＮＡ断片とプラスミド
ｐｔｒｐ７８１をＥｃｏＲＩＰｓｔｌで切断して得られ
る約３　、２　ｋｂのＤＮＡ断片（参考例５（１））を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させヒトｂＦＧＦム
ティン発現用プラスミドｐＴＢ８５５を構築した。

このプラスミドｐＴＢ８５５を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより、ムティンをコードする遺
伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５５を含む菌株Ｅ、
　ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／Ｉ’１ＴＢ８５５を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上清を得、菌体抽出液とした。

（３）菌体抽出液のヒトｂＦＧＦ活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５（３
）と同様の方法でヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ活性を測定した。そ
の結果、Ｅ、　ｃｏＩｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８５５
の菌体抽出液は、ＦＧＰ活性を示した。

このようにして、ヒトｂＦＧＦのＰ「０２からＶａ１４
１までが欠損したムティンＮ４１が得られた。

参考例１６　（ヒトｂＰＧＦのムティンをコードする遺
伝子の大腸菌におけろ発現） （１）　　ヒトｂＦＧＦ’のムティン発現用プラスミド
ｐＴＢ８５６の構築 前記参考例２で得られたプラスミドｐＴＢ６６９のＤＮ
Ａを制限酵素Ｂａ１ｍ１−ＩＩで部分的に切断し、ｂＦ
ＧＰ遺伝子内にあるＢ、１ｍＨＩ認識部位のみを切断し
た。切断部位をｄＡ　Ｔ　Ｐ　、ｄＣＴ　Ｐ　、ｄＧ　
Ｔ　Ｐ　。

ｄＴＴＰ存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｆを用いて
平滑末端とし、Ｎｈｅｒリンカ−ｐ（５′ＣＴＡＧＣＴ
ＡＧＣＴＡＧ−３’）をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により
結合さ仕た。制限酵素Ｎｈｅｌで処理して、さらにＴ４
ＤＮＡリガーゼ反応により切断部位を結合させ、ヒトｂ
ＦＧＦ’のムティン発現用プラスミドｐＴＢ８５６を構
築した。

このプラスミドｐＴＢ８５６を用いて大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換させることにより、ムティンをコードする遺
伝子を含有するプラスミドｐＴＢ８５６を含む菌株Ｅ、
ｃｏｌｉ　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ８５６を得た。

（２）菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培養
し、上ｌＲを得、ヒトＩＧＦ’のＬｙｓ１３０以降のア
ミノ酸を欠損したムティンＣｌ２９を含有する菌体抽出
液を得た。

参考例１７ Ｈ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
　−５ｅｒ−ＯＨ（ｂＦＧＦ［Ｉ　４０−１４６］）の
製造Ｂ　ｏｃ　−Ｓ　ｅｒ（Ｂ　ｚ（）−樹ＲＦ１６９
６ｍｇ（０，７２ｍｍｏ（７ｇ樹脂）より、アプライド
・バイオシステムズ社（米国）４３０Ａ型全自動ペプチ
ド合成機にのせ、以下のアミノ酸を順次縮合及び脱Ｂｏ
ｃ反応に付した。

日ｏｃ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，
Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚ１２）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−
ＯＨ，Ｂｏｃ　−Ｐｒｏ−ＯＨＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ Ｆ３ｚＱ：　　ベンジル Ｂｏｃ：　　ｔ−ブトキシカルボニル Ｚ　：　ベンジルオキシカルボニル 斯くしてＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ（Ｂ
ｚρ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｚ）　−５ｅｒ（Ｂｚ１２）
−樹脂１．０８ｇを得た。このうち４００ｍｇをアニソ
ール０．５威及びツメチルスルフィド０．５−を含む弗
化水素５、Ｏｄ中で０℃で６０分間インキュベーション
し樹脂から取り出した。過剰の弗化水素を減圧留去し残
渣をＥ［，０で洗浄後、水３０ｄにて抽出し、凍結乾燥
して得られた粗製品を水５−に溶かしアンバーライトｒ
ＲＡ−４００（酢酸型）樹脂（カラム２　ｘ　５　ｃ＋
ａ、溶出液　水）でイオン交換を行い、溶出液を減圧濃
縮し、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社、カ
ラム２．５　ｘ　＋　２５ｃｍ、溶出液　１Ｎ酢酸）に
よるゲルろ過にて精製して、目的物を得た。収ｒ；ｉ　
　Ｉ　Ｉ　８ｍｇ（７８，８％）Ｒｆ　　Ｏ，２２（酢
酸エチル：酢酸：ブタノール：水＝１：Ｉ：Ｉ　　二■
　） ［α］　Ｄ　　８ピ（ｃ＝０．比　ＩＮ酢酸中）アミノ
酸分析値：　　Ｓｅｒ　２．０８．　Ｐｒｏ　１．０６
．　Ａｌａ　１．００、　Ｍｅｔ　１１．９ｇ、　Ｌｅ
ｕ　１．０３．　Ｌｙｓ　Ｏ，９９実施例１　（免疫） ＢＡＬＢ／Ｃマウス（♀４週退会に対しフロイント完全
アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）０．４１ＲＩｌに溶解
させた１０ｇｇの抗原ヒトｂＦＧＦ（参考例３で得られ
たしの。）を腹腔に注射した。３週間後に、フロインド
不完全アジュバントＱ　、　４　、ｄにとかしたＩＯμ
ｇの抗原ｈｂＦＧＦを腹腔に再投与した。さらに３週間
後に同様の追加免疫を行い、その２週間後に生理食塩水
に溶かした１０ｇｇのヒトｂＦＧＦを腹腔内に接種した
。

実施例２ （１）細胞融合 実施例１で示した免疫マウスより、抗原最終投与の４日
後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この細
胞は、イスコツ培地とハムＦ−１２培地をＩＩＩの比率
で混合した培地（以下ＩＨ培地と略す）に懸濁した。

マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８０１は、
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭｒ１６４０培地で５％
炭酸ガス、９５％空気の条件で継代培養した。

細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した
方法［ケーラー、Ｇ、およびミルスタイン。

Ｃ１：ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　　２５６．　４９
５（Ｂ７５）］に早じて行った。上記ミエローマ細胞２
．９　ｘ　Ｉ　０７個と上述した方法で得られた免疫さ
れたリンパ球１．５ＸＩｏ’個を混合、遠沈し、０．３
ｄのＩ　Ｈ培地に溶解した４５％ポリエチレングリコー
ル６０００（以下ＰＥＧ６０００）を滴下した。ＰＥＧ
　６０００溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴下
した。５分後３７℃に予温したＩ　Ｈ培地１分間に０．
５ｄずつ加えＩＯ−とした後、室温で６００回転１５分
遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％仔牛血
清を含む■Ｈ培地２００ｍ１に懸濁し、２４穴マイクロ
プレート（リンプロ社）に２−ずつ植えつけた。１日後
、ＨＡＴ（ヒボキサンチンＩ　ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍ、アミ
ノプテリン４ＸＩＯ″″？Ｍ、チミジンＩ　、６　Ｘ　
１０−５Ｍ）を含んだＩＨ培地（２０％仔牛血清含有）
（以下ＨＡＴ培地と称する。）を各ウェルにｌｄずつ添
加し、さらに３日おきに、培地の１／２量をＨＡ　Ｔ培
地と交換した。このようにして生育した細胞は雑種細胞
である。

（２）抗体産生細胞の検索 予め、ヒトｂＦＧＦを固定したポリスチレン製９６穴マ
イクロタイタープレートに、雑種細胞培養上清を１００
μＱずつ加え室温で２時間インキュベートした。培養上
清を除去、洗浄後２次抗体として西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ　’）標識抗マウスＴｇＧヤギ抗体（マ
イルス社）を加え室温で２時間インキュベートした。２
次抗体を除去し、よくウェル洗浄した後、反応基質を加
えた呈色反応を行った（Ｅ　Ｉ　Ａ法）。この方法によ
り３つのウェルに強い結合価が観察された。

（３）雑種細胞のクローニング これらのウェル中の細胞を、ｌウェルあたり０．５個と
なるように、予めＩＯ’ｆｌＪ／ウェルのマウス胸腺細
胞を栄養細胞としてまいておいた９６穴マイクロタイタ
ープレートにまき、クローニングを行った。その結果、
３つのクローン、マウスＨｂＦ９９細胞（ＩＦＯ５０１
２２）、マウスＨｂＦＩ６１細胞（ＩＦＯ５０１２３）
、マウスＨｂＦ１６５細胞（ＩＦＯ５０１２４）を得た
。

これらの細胞上清中の抗体価測定結果を第２表に示す。

第２表 表中、結果は、波長４９２ｎｍによる吸収を示す。

−は、測定せず。

クローニングされた細胞は、２０％仔牛血清を含むＩＨ
培地に１０％となるようジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）を加え液体窒素内に貯蔵した。

実施例３　（モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラ
ス） 実施例２で得られたマウス抗体サブクラス検出キット（
バイオラッド社）により各種標品免疫グロブリンと反応
させた。その結果を第３表に示す。

第３表 表中、＋は反応陽性を、 は反応陰性を示す。

第３表より、ＭｏＡｂ９９、ＭｏＡｂｌ　６１およびＭ
ｏＡｂ１６５はいずれら免疫グロブリンクラスがＩｇＭ
に属することが分かる。

実施例４ 実施例Ｉに記載の方法によって免疫したマウスＢＡ　Ｌ
　Ｂ／ｃから脾臓を採取し、実施例２（＋）、（２）お
よび（３）に記載の方法によってノ＼イブリドーマＨｂ
ｌ”１２（ＩＦ’０　５０１４２）、ＨｂＦ４５．Ｈｂ
Ｆ４７．ＨｂＦ５２（ｒＦｏ　　５０１４３）、ＨｂＦ
７８（■Ｆ０　５０１４４）およびＩ−（ｂＦ’　９８
　（Ｉ　Ｆｏ　　５０１４５）を得た。

ハイブリドーマＨｂＦ　Ｉ　２．ＨｂＦ４５．ＨｂＦ４
７　、ＬＩｂＦ　５２　、ＨｂＦ　７８．１−１ｂＦ　
９８について、それぞれ２ｘｌＯ’ｌＩｌの細胞を予め
ミネラルオイルを０．５蔵腹腔内に投与しておいたマウ
スに接種した。１０日後、１匹あたり２〜４ｄの腹水を
採取し、それぞれのハイブリドーマよりモノクローナル
抗体ＭｏＡｂｌ　２　、　ＭｏＡｂ４５　、　ＭｏＡｂ
４７ＭｏＡｂ５２．ＭｏＡｂ７８．ＭｏＡｂ９８を得た
。

実施例３に記載の方法に従って、これらモノクローナル
抗体の免疫グロブリンクラスを測定したところ、次の第
４表のように決定された。

第４表 実施例５ （１）放射標識ｈｂＦ　Ｇ　Ｆの調製 参考例２に記載した大腸菌ＭＭ２９４／ｐＴＢ６６９（
Ｉ　Ｆ’０　１４５３２．ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１２８１
）を用いて、３５Ｓにより放射標識されたｈｂＦＧＦを
以下の方法により得た。

上記大腸菌ＭＭ２９４／ｐＴＢ　６６９を参考例３に記
載した培地でＫｌｅｔｔ値が２００になるまで培養した
。この培養液をＭ　９　（Ｍ　ｅｔ−）培地に■１５１
投入した。Ｍ　９　（Ｍｅｔ−）培地は１％グルコース
、８βｇ／ｄテトラサイクリンを含むＭ９培地に以下の
組成でアミノ酸を添加した培地である。

Ｌ−チロンン ８３．９ Ｌ−バリン ９４．０ アミノ酸組成 Ｌ−アラニン Ｌ−アルギニン塩酸塩 Ｌ−アスパラギン　ｌ水和物 Ｌ−アスパラギン酸 Ｌ−システィン　２ナトリウム塩 し−グルタミン酸 Ｌ−グルタミン Ｌ−グリシノ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩　ｌ水和物 し−イソロイシン Ｌ−ロインン し−リジン塩酸塩 Ｌ−フェニルアラニン Ｌ−プロリン Ｌ−セリン Ｌ−スレオニン ２５．０　ｍｇ／Ｑ ２８．４ ３０．０ ８２．８ ７５．０ ５８４．０ ３０．０ ４２．０ ｔｏｓ、。

１０５．０ １４６．０ ６６．０ ４２．０ ９５．０ Ｍ　９　（Ｍ　ｅｔ−）培地でＫｌｅｔｔ値が２００に
なるまで培養し、３β　インドールアクリル酸を２５μ
ｇ／ｄになるよう添加し、さらに２時間培養を続けた。

この後、ｌ−を分取し、１０μＣｉの３５Ｓ−Ｍｅｔ（
比活性＞　Ｉ　０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を投与し３０
分培養した。培養後、集菌し参考例３に記載の方法に従
って菌体抽出液を得た。

また、参考例２に記載のベクタープラスミドｐｔｒｐ７
８　Ｉを有する大腸菌ＭＭ２９４についても同じ処理を
行い、標識菌体抽出液を得た。

（２）免疫沈降 プロティンＡ（ＢＲＬ社製）は、その使用書に従って調
製し１０％溶液を使用した。非標識大腸菌抽出液は大腸
菌ＭＭ　２９４　／ｐｔｒｐ７８１を参考例３に記載の
方法により得た。

実施例４で得た腹水１ｄを非標識大腸菌抽出液１００μ
ａと混合し、４℃１時間放置後、標識菌体抽出液（ＭＭ
　２９４　／Ｉ）ｔｒｐ７８１　　又はＭＭ２９．１／
ｐＴＢ６６９）をＩＯ’ｃｐｍ加え４℃−夜装置した。

プロティンＡ　Ｉ　０％溶液１００μＱに非標識大腸菌
抽出液１００μｇを加え混合し４℃−晩放置後、遠心し
、１００μＱのＮＥＴＢＮ液［１５０ｍＭ　ＮａＣ１，
５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　　ＴｒｉｓＣｌ（１）Ｈ
７，５）、Ｏ，１％１３ＳＡ、０．０５％ＮＰ４０（ノ
ニデット（Ｎｏｎ−ｉｄｅｔ）Ｐ　−４０）］に再！８
Ｉｌｉｉｌした。これに上記の処理をした標識抽出液と
腹水の混合物を加え混合し、４℃−晩装置した。これを
遠心し、沈殿物を５００μｅのＮＥＴＢＮ液に懸濁した
。この操作を５回繰り返し、吸着しない標識物質を除い
た後、最後に５０μσの電気泳動サンプルバッファーに
ＢＢし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳
動はＬａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、Ｋ。

の方法［Ｎａｔｕｒｅ、　　２２７．　６８０（１９７
０）］に従った。泳動後、ゲルを５０％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）に１時間浸し、蒸留水で３０分ずつ４回洗い
ＴＣＡを除いた後、ジメチルスルホキンド（ＤＭＳＯ）
に１時間浸した。この後、１０％　２．５ジフエニルオ
キサゾール（ＤＰＯ）を含むＤＭＳ　Ｏに１時間浸した
。蒸留水で３０分ずつ３回ゲルを洗った後、ゲルを乾燥
させた。これよリラジオオートグラムをとり免疫沈降パ
ターンを観察した。

これを第２図に示す。第２図より、モノクローナル抗体
ＭｏＡｂｌ　２　、　ＭｏＡｂ５２　、　ＭｏＡｂ７８
　。

ＭｏＡｂ９８は、菌体抽出液中のｈｂＦＧＦと結合する
ことがわかった。

実施例６ 実施例４で得られたモノクローナル抗体のうち実施例５
において免疫沈降を示した４抗体すなわちモノクローナ
ル抗体ＭｏＡｂｌ　２．ＭｏＡｂ５２゜ＭｏＡｂ７８お
よびＭｏＡｂ９８について抗体結合価を限界希釈法によ
り測定した。

すなわち、実施例４で得られたモノクローナル抗体Ｍｏ
Ａｂｌ　２．　ＭｏＡｂ５２．　ＭｏＡｂ７８またはＭ
ｏＡｂ９８を含む腹水液をそれぞれ１０％ウシ胎児血清
を含むＩＨ培地で希釈し、実施例２（２）に示したＥＩ
Ａ法によって希釈液中の抗体１を測定した。この結果を
第３図に示す。第３図において、−〇−−−−―は　Ｍ
ｏＡｂ１２についての結果を、−−一ローーーは　Ｍｏ
Ａｂ５２についての結果を、＋−は　ＭｏＡｂ７８につ
いての結果を、−一−−一−は　ＭｏＡｂ９８について
の結果をそれぞれ示す。

第３図から、これら抗体を含有する腹水は限界希釈値が
ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’以上であり、したがって、これら抗体
は、抗体結合価が非常に高いことが分かる。

実施例７　（抗原認識部位の決定） 実施例６において抗体結合価を測定した４抗体の抗原認
識部位を競合的結合阻害実験により検討した。

競合物として、参考例３で得られたｈｂＦＧＦ合成ペプ
チドＰｅｐｌ　：　Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　
−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（
Ｎ末アミノ酸２−１０にＴｙｒを付加したしの）〔レギ
ュラトリー・ベプタイズ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　　Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ）、１０．３０９−３１７（１９８５）
）、Ｐｅｐ２：　Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｔ（アミノ酸＋４２−１４７に相当
）（参考例１７で得られたもの）５および欠失型ｂＦＧ
ＦムティンすなわちムティンＮ１４（参考例！２で得ら
れたもの）、およびムティンＮ４１（参考例１５で得ら
れたもの）を用いた。

合成ペプチドは、！００μｇ／ｄの濃度に調製し、ｌＯ
％ＦＣ８を含むＩ　Ｈ培地〔イスコツおよびハムＦ−１
２混合培地（１：１））で希釈を行った。ムティンＮＩ
４およびＮ４１は、参考例１２（２）または１５（２）
にそれぞれ示した方法により得られた抽出液をｌＯ％Ｆ
Ｃ９を含むｒＨ培地で希釈して用いた。抗体量がＡ４１
５において０７〜１．０となるように実施例４で得た腹
水液について、ＭｏＡｂＩ　２．ＭｏＡｂ５２．ＭｏＡ
ｂ９８については、５ＸＩ０５倍に、ＭｏＡｂ７８は５
×１０’倍に希釈した。希釈液としては、１０％ＦＣ８
を含むＩ　Ｈ培地を用いた。希釈抗体液に希釈した競合
物を加え攪拌後、３７℃、３０分保温した。この液中に
含まれる未結合の抗体量を実施例２（２）に示すＥＴＡ
法によって測定した。

合成ペプチドを用いた場合の結果を、第４図。

第５図、第６図および第７図に示す。第４図はモノクロ
ーナル抗体ＭｏＡｂ１２についての結果を、第５図はモ
ノクローナル抗体ＭｏＡｂ５２についての結果を、第６
図はモノクローナル抗体ＭｏＡ　ｂｌ８についての結果
を、第７図はモノクローナル抗体ＭｏＡｂ９８について
の結果を示す。なお、これらの図において、−・−はｈ
ｂＦＧＦを、−−−０−−−−一はＰｅｐｌを、−−−
−−■−−−−−はＰｅｐ２をそれぞれ競合物として用
いた結果を示す。また図において、縦軸は発色剤の吸光
（波長４１５０Ｉ１１による）を示す。

第４図および第６図から、モノクローナル抗体ＭｏＡｈ
１２およびＭｏＡｂ７８は、Ｐ　ｅｐ　Ｉにより競合的
結合阻害を受けた。このことから、モノクローナル抗体
ＭｏＡｂ＋２およびＭｏＡｂ７８は、ｈｂＦＧＦのＮ末
端アミノ酸２〜１０を認識することが分かった。

第５図、第７図からＭｏＡｂ５２．ＭｏＡｂ９８は、こ
れらの合成ペプチドによって結合阻害を受けないことが
わかった。

これらの抗体の認識部位を決定するために、参考例１２
で得られたムティンＮＩ４および参オ例１５で得られた
Ｎ４１を用いた競合的阻害実験を前記と同様にして行な
い、第８図にＭｏＡｂ５２の結果を、第９図にＭｏＡｂ
９８の結果を示す。なお、これらの図において、−一１
−はｈｂＦＧＦを、〜−−−−−はムティンＮ１４を、
　−一一〇−−−　はムティンＮ４１をそれぞれ競合物
として用いた結果を示す。図において、縦軸は発色剤の
吸光（波長４１５ｎｍによる）を示す。横軸は参考例３
の方法によって得た大腸菌粗抽出液の総タンパク量を示
す。

第８図および第９図から、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ
５２．ＭｏＡｂ９８はムティンＮ＋４によって競合的結
合阻害を受けるが、ムティンＮ４１によって競合的結合
阻害を受けなかった。

このことから、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ５２および
ＭｏＡｂ９８は、ｈｂＦＧＦのアミノ酸第１５〜４１を
認識することが分かった。

次に、競合物としてウシ酸性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（ｂａＦ　Ｇ
　Ｆ　）（Ｒ＆　　Ｄ　　５ｙｓｔｅａ＋ｓ　　Ｉｎｃ
、社、Ｕ、Ｓ、Ａ、より購入〕および参考例３で得られ
たｈｂＦＧＦを用い競合的阻害実験を前記と同様にして
行ない、次の第５表に示す結果が得られた。数値は、未
結合の抗体量を実施例２（２）に記載の方法によるＥＴ
Ａの発色による吸光度を示す。

上記したことから、４種のモノクローナル抗体の認識部
位については次の第６表のようにまとめられる。

第６表 このことから、モノクローナル抗体Ｍ　ｏ　Ａ　ｂｌ　
２　、ＭｏＡｂ　５２９ＭｏＡｂ　７８およびＭｏＡ　
ｂ９８は、ウシ酸性ＦＧＦと交差反応しないことが分か
った。

表中“＋”は競合阻害のあったしの、“−”はなかった
ものを示す。

実施例８　腹水からの抗体の精製 実施例４の方法によりモノクローナル抗体Ｍ。

Ａｂｌ　２．ＭｏＡｂ５２．ＭｏＡｂ７８　　ＭｏＡｂ
９８を各々マウス１０匹ずつに接種し、腹水液２０〜３
０ｄを得た。腹水液は２００　Ｏｒｐｍ（日立冷却遠心
機）で遠心し、細胞などを除去した後、スビンコＳＷ２
　ｓローター（ベックマン社、米国）で４℃２時間遠心
し、不溶性のタンパクや脂肪等を除いた。上清に対し、
４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、水中
、１時間、緩やかに攪拌した。沈澱をザーバル５Ｓ３４
０−ター（デュポン、米国）を用い４℃、Ｉ５０００ｒ
ｐｍで遠心し、回収後、バッフｙ　−Ｉ　Ｃ２０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｒ（７，９）、４　Ｑｎ＋Ｍ　
ＮａＣ１）にタンパク濃度がＩθ〜１５ｍｇ／ｈ４とな
るように溶かし、バッファー１に対して４℃、−夜透析
した。この液を、バッファーｌによって平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースＤＥ５２（ワットマン、米国）に通し
、吸着させた。溶出はバッファーｌと０．４Ｍ　ＮａＣ
ｌを含むバッファー１との８度勾配により行った。イム
ノグロブリン画分を回収し、４０％飽和の硫酸アンモニ
ウム添加により沈澱させ、沈澱をバッファー２　（０、
１Ｍ　ＮａＨＣ０３）にタンパク濃度がＩＯ〜２０ｍｇ
／！になるようにとかし、バッファー２に対し、４℃で
二夜透析した。透析液は一夜ごとに交換した。

さらに、ハイドロキシアパタイトカラム（ＨＣ八−カラ
ム）によってさらに精製した。この時、開始バッファー
としてｌＯｎ＋Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）を用
い、溶出バッファーとしては５００ｍＭリン酸ナトリウ
ムバッフｙ−（ｐＨ６，８）を用いた。溶出は、開始バ
ッファーから溶出バッファーへの直線的濃度勾配により
行った。抗体を含む分画は、４℃に保存した。

実施例９　（抗体カラムを用いるｈｂＦＧＦムティンの
精製） アフィゲル１０（バイオラッド社製、米国）５−を焼結
フィルター上にとり、吸引下、１０倍容量の水冷イソプ
ロパツールで洗浄後、１０倍容量の水冷蒸留水で洗い、
反応器に移した。１５ｍｇのモノクローナル抗体ＭｏＡ
ｂ７８（実施例８のバッファー２．またはリン酸バッフ
ァーに溶解したもの）を５〜１５−加え、４℃−夜叉応
させた。反応液に０．０１Ｍになるようにモノエタノー
ルアミン（ｐＨ８，０）を加え、室温１時間反応させ、
未反応反応基を不活性化した。このあとゲルを実施例８
のバッファー２をゲルの１０倍容量用いて洗った。

その後、２ｄのゲルをカラムに詰め初期バッファー（２
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％ＮＰ４０）
で平衡化した。

一方、参考例８（２）で得られたムティンＣ３４を含む
形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｄ
ＨＩ／ｐＴＢ７４４の培養液の抽出液を、初期バッファ
ーで３倍に希釈し、希釈液を上記カラムに流速２０？＃
１／ｈで流し、吸着させた。吸着後、初期バッファー２
０−を用いてカラムを洗浄し、以後、高温バッフｙ−（
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（＋）Ｈ７，６）。

ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、ＬＭ　ＮａＣ１，０，０５％ＮＰ４
０）２０Ｉｎ１溶出バツフアーＡ（０，２Ｍ酢酸バッフ
ァー（ｐＨ４，５）、０．２Ｍ　ＮａＣＩ）２０ｕｔｌ
、溶出バッフｙ−Ｂ（０，２Ｍ酢酸（ＰＨ２，５）、Ｑ
、２Ｍ　ＮａＣ１）を順次通した。流速は２０ｄ／ｈで
全過程は４℃で行った。

ｉすられた両分につき、１７．２５％アクリルアミドの
電気泳動にかけた（　Ｌａｅｍｉｌｉ、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）２７７．６８０（１９７０））。染色は銀
染色法によった。結果を第１０図に示す。なお、第１０
図において、ＭＫは分子量マーカーの、Ａは粗抽出液の
、Ｂは素通り画分の、Ｃは高塩濃度バッファーによる溶
出画分の、Ｄは溶出バッファーＡによる溶出画分の、Ｅ
は溶出バッファーＢによる溶出画分の結果をそれぞれ示
す。Ｄ、Ｅ画分については、カラムから溶出後、すぐに
ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９，５）を加えて、Ｉ）Ｈ
７，５にした。各両分を参考例５（３）記載の方法によ
りＦＧＦの活性を測定した。結果を第７表に示す。なお
、第７表中、Ａ−Ｅは上述の第１Ｏ図のそれらと同様で
ある。

第７表 ０．６９ ’　ＦＧＦ活性は３Ｈ−チミジンの取り込みを指標に、
標亭品として用いたウシｂＦＧＦ（タカラ酒造に、に、
）当量で表わした。

上記したことから、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８を
用いた抗体カラムは、ｂＦＧＦムティンＣＳ　＝１を効
率よく吸着することが分かり、上記操作によりｂＦＧＦ
ムティンＣＳ４が精製できたのである。

実施例１０（ＥＩＡ法による、モノクローナル抗体を用
いるｈｂＰ　Ｇ　Ｆムティンの定量） （１）　　実施例４で得られたモノクローナル抗体７８
を腹水から実施例８の方法により精製した。

このようにして得られた抗体を２ｍＦ！、／１ｎ１以上
になるように濃縮し、次いで０．２Ｍリン酸ナトリウム
バッフｙ−（ｐＨ７，０）に対して透析した。

２　、８　ｍｇ／滅のモノクローナル抗体ＭＯΔｂ７８
１．４ｄに対し、Ｉｌ、５ｍｇ／ｄとなるようＮＮ’−
ジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）に溶解したＳ−
アセチルメルカプトサクシニックアンヒドリド（Ａ　１
ｄｒｉｃｈ社、米国）を５０μρ加えた。反応器の空気
を窒素ガスに置換し、密栓後、室温で一時間１？ｉ律し
、ＳＨ基を導入した。未反応のＳ−アセチルメルカプト
サクシニックアンヒドリドを１３０μＱの０．２ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆ！（ｐＨ４７，０）、Ｉ　３μ（！の０．
２ＭＥＤＴＡ、１３０μθの２Ｍヒドロキシアミン（ｐ
ｉ−１７、０）を加え室温１０分処理し、不活化した。

モノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８は、セファデックスＧ
−２５（径１　ｃｎ＋ｘ　８０　ｃｍ、ファルマシア社
、スエーデン）を充填したゲルろ過カラムにより分取し
た（流速　２０滅／ｈ）。

（２）西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下ｆ（ＲＰべ一
すンガーマンハイム社、西ドイツ、Ｇｒａｄｅ　　ｌ）
１０ｍｇを１．４−のＯ，ＩＭリン酸バッフｙ　−（ｐ
ｌ−１６，８）に溶解した。Ｎ−（４−カルボキソシク
ロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル　１４ｍｇを３３５μＱのＤＭＦに溶
解し、このうち１００μＱをＨＲＰ溶液に加えた。反応
器の空気を窒素置換し、密栓後、室温で１時間攪拌した
。この後、セファデックスＧ−２５を充填したゲルろ過
カラム（前出）により、マレイミド基を導入したＨ　Ｒ
Ｐ画分を分取した。

（３）上記（１）においてＳＨ基を導入した抗体ＭｏＡ
ｂ７８画分６−と上記（２）においてマレイミド基を導
入したＨｒ（Ｐ画分２ｄを混合し、コロジオンバッグ（
ザルトリウス社製、西ドイツ）を用いて減圧下、Ｉｄに
濃縮し、４℃、２０時間反応させた。反応後、ＨＲＰが
導入された抗体をウシトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社製
、スエーデン、径１ｃｍＸ　８０　ｃｍ）にかけ分離し
た（流速１０ｄ／ｈ）。溶出ピーク画分のうち抗体１分
子あたりのＨＲＰ数が最も多い両分は、２．４ＨＲＰ／
抗体であった。

これを次の（４）のＥＩＡに使用した。

（４）ＭｏＡｂ５２を上記（１）と同様の方法により精
製した。このＭｏＡ　ｂ　５２を１０μｇ／−又は２０
μｇ／ＭｌとなるようＰＢＳで希釈し、イムノプレート
（ヌンク社、デンマーク）に１００μａ／ウエル注入し
、４℃、−夜装置することにより吸着させた。吸着しな
かった抗体を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０
μ％メルチオレート、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むＰＢＳを２００μＱ／ウェル加え４℃−夜装置し
た。

（５）参考例３で得られたヒトｂＦＧＦを０．１％ＢＳ
Ａを含むＰＢＳで希釈した。上記（４）で作製したプレ
ートよりＢＳＡ溶液を取り除き、ＰＢＳで４回洗浄後、
希釈したヒトｂＦＧＦを１００μａ／ウェル加え、４℃
−夜吸着を行った。未反応のヒトｂＦＧＦを除去後、Ｐ
ＢＳで４回洗浄し、上記（３）で作製したＨＲＰ結合抗
体（ＨＲＰＭｏＡｂ７８）を０．１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓでｌ／３００希択し、１００μＱ／ウェル加え、室温
４時間反応させた。抗体を除去後、ＰＢＳで６回洗浄し
、パーオキシダーゼ基質（ＢｉｏＲａｄ社、米国）を１
００μＱ／ウェル加え発色、比色定量した。

（６）第１！図は、プレートに固定したモノクローナル
抗体Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　５２の虫が１μｇ／ウェル（−−
一〇−−−−−）、２μｇ／ウエノ喧−・−）である場
合のｂＰＧＦの検出曲線を示している。

横軸は、加えたｂＦＧＦａ度、縦軸ハＨＲＰ　−Ｍ。

Ａｂ７８によって発色した吸光度を表わす。この図より
、２μｇ／ウェルでＭｏＡｂ５２をプレートに吸着させ
た場合、０　、５　ｎｇ／−の濃度のｂＦＧＦを検出で
きることがわかった。

（７）上記（４）の方法でＭｏＡｂ９８をプレートに２
μｇ／ウェル吸着させ、上記（５）の方法でｂＦＧＦを
比色定量した。第１２図は、その結果を示す。

横軸、縦軸は上記（６）の第１１図と同じことを表わし
ている。この図から、ＭｏＡ　６９８はＭｏＡｂ５２と
同Ｅｐに少なくとらｏ　、　５　ｎｇ／−の濃度のｂＦ
ＧＦを検出できることがわかった。

実施例ＩＩ（ＥＴＡ法による、モノクローナル抗体を用
いるｈｂＦＧＦムティンの定 量） 参η例１３で得られたヒトｂＦＧＦムティン０８６を含
有する抽出液を、実施例９と同様に処理し、ムティンの
発現債を検討した。その結果、０８６は大腸菌内で微量
であるが発現していることがわかった。

実施例＋２（ＥＩＡ法による、モノクローナル抗体を用
いるｈｂＦＧＦムティンの定 量） 参考例＋４で得られたヒトｂＦＧＦムティンＣ１２９を
含有する抽出液を、実施例９と同様に処理し、検討した
。その結果、ムティンＣｌ２９は大腸菌内で微量生成し
ていることが分かった。

実施例１３　　（ウェスタンブロッティングによるｈｂ
ＦＧＰの検出） 参考Ｎ３記載の方法で得たｈｂＦ　Ｇ　Ｐを１７２５％
アクリルアミドゲル電気泳動（Ｌ　ａｅｍｍｌｉ、　Ｕ
　。

Ｋ、（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　　２７７．６８０−６
８５）した後、ザルドブロット（ザルトリウス社、西独
）を用い、ニトロセルロース膜上にトランスファーした
Ｃ　Ｋ　ｙｓｈｓｅ　−Ａ　ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ　、
ジャーナル・才ブ・バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄＢ　１ｏｐｈｙｓｉｃａｌ　
　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、　１０　２０３−２０９　（＋　
９８４））。この膜をＴＢＳ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、０．５Ｍ　ＮａＣＩ）で５分ず
つ２回洗い、４％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で室温１時間放
置し、膜上の未反応部分をブロックした。

０．０５％トウイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で
５分ずつ２回洗った。実施例４で得たモノクローナル抗
体ＭｏＡｂ１２．またはＭｏＡｂ７８を、１％ゼラチン
を含むＴＴＢＳで３０００倍希釈した液に、上記のニト
ロセルロース膜を入れ、室温で一夜反応させた。反応液
をとり除き、ＴＴＢＳで５分ずつ２回膜を洗い、その後
１％ゼラチンを含むＴＴ［３Ｓで３０００倍に希釈した
２次抗体、ＨＲＰｔｉ識抗マウスＩｇＧヤギ血清（バイ
オラッド社米国）を加え、室温で１時間反応を行った。

膜をＴＴＢＳで５分ずつ３回洗浄し、さらにＴＢＳで５
分ずつ２回洗い、その後、発色剤として０．０５％　４
−クロロ−１−ナフトール、０．０１５％過酸化水素を
加え１５分間反応を行った。

第１３図にモノクローナル抗体ＭｏＡｂ７８を１次抗体
として用いた時のウェスタンブロッティングの結果を示
す。レーンｌには１μｇのｈｂＦＧＦを、２には３００
ｎｇのｈｂＦＧＦを、３には１１００ｎのｈｂＦＧＦを
それぞれ泳動し、トランスファーしている。Ｍはマーカ
ーを表わし、左側の数字はその分子量である。

なお、上記ＭｏＡｂ７８のかわりにＭｏＡ　ｂ　Ｉ　２
を用いた場合も同じ応変でｂＦＧＦを検出することがで
きた。

発明の効果 本発明のモノクローナル抗体は、ｂＦＧＦに対し特異的
に結合するので、ｂＦＧＦ測定用試薬、ｂＦＧＦの精製
にａ利に使用できる。

さらに、本発明のモノクローナル抗体において、抗体結
合価の高いものは、ｂｐｃｐＩｉＪ＋＋定用試薬として
用いる際に、同時に用いる他の試薬例えば抗血清の使用
量が少なくて済む利点がある。また、ｂＦＧＦ’の精製
をより高度に行なうことができる利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例Ｉで得られたヒ）ｂＦＧＦをコードす
る塩基配列と、それから推定されるアミノ酸配列を示す
。 第２図は、実施例５で得られｆこポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による免疫沈降パターンを示す。 第３図は、実施例６で得られた抗体結合価を示す。 第４図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのＭｏＡ
ｂ１２に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第５図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのＭｏＡ
ｂ５２に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第６図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのＭｏＡ
ｂ７８に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第７図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのＭｏＡ
ｂ９Ｂに対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第８図は、実施例７で得られた、ｂＦＧＦ’ムティンの
ＭｏＡｂ５２に対する競合的阻害実験結果を示す。 第９図は、実施例７で得られた、ｂＦＧＰムティンのＭ
ｏＡｂ９８に対する競合的阻害実験結果を示す。 第１Ｏ図は、実施例９で得られた、電気泳動パターンを
示す。 第１１図は、実施例１０で得られた、ＭＱＡｂ５２、Ｈ
ＲＰ−ＭｏＡｂ７８を用いたＥｒＡによるｂＦＧＦの定
量結果を示す。 第１２図は、実施例１０で得られた、ＭｏＡｂ９８とＨ
ＲＰ−ＭｏＡｂ７Ｂを用いたｂＦＧＦの定量結果を示す
。 第１３図は、実施例１２で得られた、モノクローナル抗
体ＭｏＡｂ７８を用いたウェスタンブロッティングの結
果を示す。 纂 目 環状 ０．１ ０．５１．０　　　５．０１０　　　　５０１００十月
ｌ力　（ｐｇ／ｍｌ） −Ｌ先々物 （２ｇ７ｍ１） ０．１ ０．５１．０　　　５．０１０　　　５０抗倉物　（Ｐ
ｇ／ｍｌ） 禿を虐噛 （Ｐｇ／ｍｌ） 妖力肋 （ｍｇ／ｍｌ） ０．００５０．Ｏｌ ０．０５０．１ 妓δ咄 ０．５１．０ （ｍｇ／ｍ１） ５．０１０ ｂＦＧＦ　’→さ ／６　ｉ− （ｎｇ／ｍｌ） ・、＆− ｂＦＧＦ　；ｉ、ｔ （ｎｇ／ｍｌ）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）、次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖因子（
   ｂＦＧＦ）に特異的に結合するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン（ｂ）酸
   性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。 （ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧに属
   する。
2. （２）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むポリペプチドである請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体。
3. （３）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）で免疫
   した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球
   様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマ。
4. （４）、哺乳動物がマウスである請求項３記載のハイブ
   リドーマ。
5. （５）、リンパ球様細胞がミエローマである請求項３記
   載のハイブリドーマ。
6. （６）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むポリペプチドである請求項３記載のハイブリドー
   マ。
7. （７）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）で免疫
   した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球
   様細胞とを細胞融合し、クローニングすることを特徴と
   する該脾臓細胞と該リンパ球様細胞とからなるクローン
   化されたハイブリドーマの製造法。
8. （８）、哺乳動物がマウスである請求項７記載の製造法
   。
9. （９）、リンパ球様細胞がミエローマである請求項７記
   載の製造法。
10. （１０）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むポリペプチドである請求項７記載の製造法。
11. （１１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）で免
    疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ
    球様細胞とからなるクローン化されたハイブリドーマを
    液体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクロ
    ーナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを
    特徴とする、次の性質を有し、該因子に特異的に結合す
    るモノクローナル抗体の製造法： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン（ｂ）酸
    性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。 （ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧに属
    する。
12. （１２）、哺乳動物がマウスである請求項１１記載の製
    造法。
13. （１３）、リンパ球様細胞がミエローマである請求項１
    １記載の製造法。
14. （１４）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むポリペプチドである請求項１１記載の製造法。
15. （１５）、次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖因子
    （ｂＦＧＦ）に特異的に結合するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン（ｂ）酸
    性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。 （ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧに属
    する。 を用いることを特徴とするｂＦＧＦの精製法。
16. （１６）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 を含むポリペプチドである請求項１５記載の精製法。
17. （１７）、アフィニティークロマトグラフィーを行なう
    請求項１５記載の精製法。
18. （１８）、次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖因子
    （ｂＦＧＦ）に特異的に結合するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約１４０〜１６０キロダルトン（ｂ）酸
    性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。 （ｃ）免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧに属
    する。 を用いることを特徴とするｂＦＧＦの検出、定量法。
19. （１９）、ｂＦＧＦが、アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含むポリペプチドである請求項１８記載の検出法。
20. （２０）、酵素免疫測定法を行なう請求項１８記載の検
    出、定量法。