JPH0249718A - リポソーム製剤の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は薬物を封入したリボソーム製剤の精製法に関す
る。

従来の技術 リン脂質と薬物液とから薬物を封入したリボソームを形
成後は、一般に薬物封入リボソームと未封入の遊離薬物
とを分離する工程が必要である。

その分離技術としては、従来、セロファン袋膜による透
析法〔細胞工学、λ、１１３６（１９８３）］、超遠心
分離法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７．１７９２　
（１９７８）〕、ゲルろ過性［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　８　、３４４（１９６９））などが知られている。

上記のように、リボソームに未封入の遊離薬物を分離除
去する方法は、従来、いくつか見られるものの、いずれ
の方法も工業的スケールで実施するには不適当である。

例えば、セロファン袋膜を用いる方法は、処理対象液で
あるリボソーム懸濁液を袋膜に小分する作業が煩雑なこ
と、長時間の処理時間を要すること、品質が一定しない
こと、無菌化製造することが容易でないことなどの欠点
がある。超遠心分離法の場合、超遠心受器にリボソーム
懸濁液を小分は分注し、遠心分離した後、上清を廃液し
て沈降物を回収するという操作を数回くり返して遊離薬
物を除去する方法であり、やはり操作が煩雑となり、無
菌化処理も困難なことが予想される。さらに、リボソー
ムの種類（例えば、ＳＵＶ、ＲＥＶ）によっては、リボ
ソームが完全に沈降せず、上清の廃液時に流出し、完全
な回収が困難であることから、比較的粒径の大きいリボ
ソームに限られること、また、遠心沈降によるリボソー
ムの凝集が起こり、再分散後、凝集体を形成することが
懸念される。

一方、ゲルろ適法は、薬物を吸着するための吸管剤を充
填したカラムにリボソーム懸濁液を流通させ、未封入薬
物を吸着分離する方法であるが、カラム流通速度が比較
的遅いため、処理時間に長時間を要すること、カラム溶
離液により希釈されるので、後に濃縮工程が必要である
こと、吸着剤にリン脂質が吸着することも起こりうるの
で、空リボソーム等での前処理が必要であること、とき
には試料注入部位への物理的なブロッキングが認められ
ること、また、再使用するには吸着剤の再生処理（吸着
した薬物の再遊離除去処理）が必要であること、無菌化
処理（使用前の吸着剤の滅菌処理）が困難であることな
どの欠点がある。

発明が解決しようとする課題 上記のように薬物封入リボソーム製剤の製造法において
、未封入の遊離薬物を効率的に分離除去する方法はまだ
完成されていない。この工業的実施のためには、大量処
理が短時間で実施できること、無菌化処理が簡単にでき
ること、リボソーム製剤の製造と連結することができ一
貫した操作で、−日内に製品化できること、などの条件
をできるだけ満足する必要がある。

課題を解決するための手段 以上の点に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、
リボソーム製剤の製造における未封入薬物の分離除去に
はホローファイバー型透析器が工業的有利に利用できる
ことを知り、本発明を完成した。

すなわち、本発明は薬物を封入してなるリボソームと未
封入薬物とを含有してなる水性液をホローファイバーに
よる透析に付し、該ファイバーの外液中に未封入薬物を
分離除去することを特徴とするリボソーム製剤の精製法
である。

本発明でいう「薬物を封入してなるリボソームと未封入
薬物とを含有してなる水性液」は、水に薬物を封入して
なるリボソームが懸濁しており、同時にその水に薬物が
含有されている系であれば特に限定されない。一般には
リン脂質と薬物液を用いて自体公知の方法によって薬物
を封入するリボソームを調製した後に得られる液であっ
て、該ノポソームを懸濁し、かつ未封入の薬物を含有し
ている水性液が主対象となる。以下、本明細書では上記
の水性液を単に「リボソーム懸濁液」と称することもあ
る。薬物を封入するリボソーム製剤の調製において、現
在まで知られているリボソームの形成法では、未封入薬
物の発生は避は難い。そして、リボソーム製剤をＤ　Ｄ
　Ｓ　（Ｄｒｕｇ　ＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ）等
の目的で使用する場合、未封入薬物は予め除去しておく
ことが一般に望ましいことが多い。本発明の適用対象と
なりうるリボソームの種類は、Ｓ　Ｕ　Ｖ　（ｓｎ＋ａ
ｌｌ　　ｕｎｉｌａａ＋ｅｌｌａｒ　　ｖｅｓｉｃｌｅ
）。

Ｍ　Ｌ　Ｖ　（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　　ｖｅｓ
ｉｃｌｅ）、　　Ｌ　Ｕ　Ｖ　（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａ
ｍｅｌｌａｒ　　ｖｅｓｉｃｌｅ）、　　ＲＥ　Ｖ　（
ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　
　ｖｅｓｉｃｌｅ）あるいはＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　（ｓｔａ
ｂｌｅｐｌｕｒｉｌａ＋ｎｅｌｌａｒ　　ｖｅｓｉｃｌ
ｅ）のいずれてあってもよい。

次に、本発明に用いるホローファイバー型透析器は、半
透膜の材質からなり中空を有する繊維を一般に数千本を
束ねて形成し、かつ該繊維の外側に透析液を流通するよ
うに構成された装置をいう。

この例としては、公知のホローファイバー型人工腎臓と
同様に構成された透析装置があげられる。

ホローファイバーの材質は、リボソーム形成材料である
リン脂質と反応もしくは吸着を起こさないことを基準に
天然高分子膜またはその加工処理膜、再生高分子膜ある
いは合成高分子膜のなかから選択すればよい。

具体的には、天然高分子膜またはその加工処理膜として
はセロファン、架橋コラーゲンか、再生高分子膜として
は各種のセルロース系膜、たとえば、酢酸セルロース（
例、酢化５０％以上）、三酢酸セルロース、酢酸・酪酸
セルロース、ニトロセルロース、キュプロ・アンモニウ
ム・レーヨン膜等があげられる。

また合成高分子膜としては、ポリビニールアルコール、
ポリビニールピロリドン・メチレンビス。

４・フェニルイソシアネート（ＭＤＩ）、ポリエチレン
グリコールＭＤ［、ポリビスフェノール・カーボネイト
−ポリエチレンオキシド共重合体、ボッイオンコンプレ
ックス、ポリプロピレン、ボリビュルアセテート、ポリ
スルフォンカーボネイト、ポリエチレン、ポリアクリロ
ニトリル、ポリメチルメタクリレート膜等が検討されて
おり、これらの中でもポリビニルアルコールＭＤＩ、ｍ
ｌコラーゲンポリビスフェノール・カーボネイト・ポリ
エチレンオキシドポリビニルアセテート、ポリスルフォ
ンカーボネイト、ポリアクリルニトリル、ポリメチルメ
タアクリレート膜が本発明では好ましく用いられる。

ホローファイバー膜の透過性は尿素透析速度で表わした
ときの半減期が、セロファンと同等もしくは小であるこ
とが一般に好ましく、たとえばセロファンの半減期を１
とした場合、約０．２〜１の透過性を有するものが有利
に使用できる。

本発明において、ホローファイバーの透過性を選択する
基準は、使用する薬物の分子の大きさ等とも関係するの
でこの点について説明する。

まず、本リボソーム製剤の製造に用いられる薬物の種類
は、水溶性薬物であってマイクロカプセル化して使用す
る可能性を有するものが対象となり得る。水溶性の程度
は、たとえば、オクタツール／水で示される分配率の対
数値が１０以下であるものをいう。ホローファイバーは
、薬物を透過しリボソームを透過しないような孔径を有
するものを選択するが、薬物の透過性はファイバーの孔
径と薬物の分子の大きさに関係する。例えば、孔径６人
ではクレアチニン（分子ｆｆ１ｌ　ｌ　３）、　ｌ　５
人でビタミンＢ１２（分子量１，３５０）、２４人でビ
タミン（分子量５．２００）、３２人でチトクロームＣ
（分子ｆｆ１２４，０００）、　４６人でβ−イミ／グ
ロフリン（分子ｆｆ１３８，０００）、　５５人でアル
ブミン（分子ｆｆ１６０，０００）等に相当し、透析性
の目安になる。ホローファイバー型透析器の中空繊維膜
として一般によく使用されるキュプロ・アンモニウム・
レーヨンの場合、孔径が約２０人である。分子量３．０
００以下の薬物であれば約２０人の孔径を有するホロー
ファイバー膜で有効に透析される。

本発明にお（′Ｘでは、分子量が約１００〜約６万の薬
物が好ましい適用対象である。以下に、本発明方法にお
いて適用可能な薬物の例を分子量の範囲別に示す。

（１）分子ｆｆ１ｌｏｏ以上１０００以下（例）　　シ
スプラチン（ＣＤＤＰ）、カルポプラチン、イブ口ブラ
チン、テトラプラチン等の金属錯体。

マイトマイシン、アドリアマイシン、アンサマイト／ン
、アクチノマイシンあるいはその誘導体（例、９−チオ
メイタンシン）、プレオマイシン、Ａｒａ−Ｃ，ダウノ
マイシン等の制癌抗生物質、５−ＦＵ。

メトトレキセート、ＴＡＣ−７８８（イソブチル５−フ
ルオロ−６−（Ｅ）−フルフリリデンアミノオキン−１
，２，３，４，５，６−へキサヒドロ−２゜４−ジオキ
ソピリミジン−５−カルボキシレート。

特開昭５９−１３７８０号〕等の代謝拮抗剤、ＢＣＮＵ
、ＣＣＮＵ等のアルキル化剤；メルフアラン。

ミドキサントロン等の抗腫瘍剤、ゲンタマイシン。

ストレプトマイシン、カナマイシン、ジベカシン。

バロモマイシン、力不ンドマインン、リビドマイシン、
トブラマイシン９アミカシン、フラジオマイシン、シソ
マイシン等のアミノ配糖系抗生物質、スルペニシリン、
メシリナム、カルベニシリン、ピペラジリン、チカルシ
リン等のペニシリン類；チェナマイシン類；セフオチア
ム、セフスロジン、セフメツキシム、セフメタゾール、
セファゾリン、セフオタキシム、セフオペラゾン、セフ
チゾキシム、モキソラクタム等のセファロスポリン類等
のβ−ラクタム系抗生物質、ＴＲＨ類［ＴＲＨ，ＴＲＨ
アナログ（例、Ｌ−Ｎ−（２−オキソピペラジン−６カ
ルボニル）−Ｌ−ヒスチジル−し−チアゾリジン−４−
カルボキサミド、Ｌ−２−オキソオキサプリン−４−カ
ルボニル−し−ヒスチジル−しプロリンアミド、Ｌ−１
−ランス−５−メチル−２オキソオキサゾリジン−４−
カルボニル−し−ヒスチジル−し−プロリンアミド、Ｌ
−２−オキフチアゾリジン−４−カルボニル−し一ヒス
チジルーし一プロリンアミド、γ−ブチロラクトンーγ
−カルボニル−し−ヒスチジル−し−プロリンアミド、
２−ケトピペリジン−６−カルボニル−し−ヒスチジル
−し−プロリンアミド、３−オキソバーハイドロ−１，
４−チアジン−５−カルボニル−し−ヒスチジル−し−
プロリンアミド）これらＴ　ＲＨ、Ｔ　ＲＨアナログの
アミド基における水素原子がメチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−アミ
ル基、β−フェネチル基で置換された化合物、ならびに
これら化合物の酢酸塩、酒石酸塩など〕、エンケファリ
ン等のペプチド系薬物、アスピリン、ジフルニサール。

インドメタシン、ジクロフェナック、フエンブフエン、
スハンダク、アセメタシン、イブプロフェン、ナブキセ
ン、ケトプロフェン、フェノプロフェン。

フェノプロフェン、チアプロフェン、プラノプロフェン
、メフェナム酸、トルフエナム酸、フルフェナム酸、フ
ェニルブタシン、オキシフェン、ブタシン、ピロキシカ
ム、メピルゾーム、エモルファゾン等抗炎症剤、鎮痛剤
、解熱剤そして各種プロスタグランジン及びその誘導体
。

（２）分子量１０００以上２０００以下（例）グラミシ
ジンＤ、バシトラシン等のペプチド系抗生物質 （３）分子量２０００以上５０００以下（例）　　Ａ　
ＣＴ　Ｈ、ポリミキシンＢ、コリスチン等ペプチド系物
質 （４）分子量５０００以上１００００以下（例）ヘパリ
ン、レンチナン、ザイモサン、ＰＳ−に等の多糖類、イ
ンスリン、成長ホルモン等のペプチドホルモン （５）分子量１００００以上２００００以下（Ｍ）　　
インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン２
．ＴＮＦ等のリンホカイン類（６）分子量２００００以
上６００００以下（例）　　ＳＯＤ 次に、ホローファイバーは、通常、その中空内径が約１
５０〜２５０　ａｍ、膜厚さは約ｌＯ〜２０μｍの形状
を有するものが好ましく用いられる。

ホローファイバー型の透析器として用いる場合、表面積
の大きな一本のファイバーを使用してもよいが、大量処
理の目的をより容易に達成するためには、小膜面積のホ
ローファイバーを複数個並列または直列に連結して用い
るのが有利である。さらに、ホローファイバーを多数集
束して用いるのが好ましく、例えば、内径２００μｍで
有効長２３．５ｃｍのホローファイバーを９９００本集
束させることによって、透析面積１．・５Ｉ１１′の透
析器が得られ、この程度の表面積を有するものが実用的
に利用しうる。集束させたホローファイバーをさらに直
列または並列に連結させることにより、透析面積の拡大
をはかってもよい。

次に、本発明の透析処理法においては、ホローファイバ
ーの外側に液を流通させて、透過してきた薬物を系外に
除去させるが、この透析外液として単に水を用いてもよ
いが、そのリボソーム製剤の投与形態に合うような液を
用いるのが実用上、好都合である。すなわち、温血動物
が生理的に許容しつるような各種物質の水溶液、具体的
には、塩類（例、食塩）、糖類（例、ぶどう糖、マンニ
ット。

ソルビット）、アミノ酸類（例、グリシン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸）などの水溶液あるいはこれらの２
種またはそれ以上の混合溶液があげられる。

これらの中でも、生理食塩水は各種薬剤の静脈投与の際
に最も広く用いられている分散媒であり、本発明におい
ても有利に用いることができる。

本発明方法は、たとえば第１図（ａ）（ｂ）に示す装置
を用いて、次のような順序で実施できる。

第１図（ａ）に示す装置において、貯留容器■にリボソ
ーム懸濁液を仕込み、送液ポンプ■によって、送液バイ
ブ■を介して連結されているホローファイバー型透析器
■に液送される。該透析器■は第１図（ｂ）に示される
構造を有し、ホローファイバー■は接着固定部＠によっ
て集束された状態でケース■内に装着されており、該ケ
ース■は透析外液流入口■および流出口■を有し、ホロ
ーファイバーの外側に透析外液を通過させうる。

リボソーム懸濁液は、透析器■の流入口■に液送され、
ホローファイバー内に送り込まれ、流出口■から、送液
バイブ■を通して貯留容器■に戻る。一方、第１図（ａ
）の貯留容器■に仕込まれた透析外液は送液ポンプ■に
よって送液バイブ■を通して、前記のホローファイバー
型透析器の透析外液流入ロ■、流出ロ■、送液パイプ■
を通って、透析器外に流出させる。この透析外液は、必
要に応じて活性炭、イオン交換樹脂により薬物を吸着・
除去したのち、循環使用し得る。かくして、リボソーム
懸濁液中の遊離薬物はホローファイバーの膜を通過して
、透析外液中に溶解して、次第に系外に分離されていき
、精製されたリボソーム製剤を貯留容器■に回収するこ
とができる。

本発明において、ホローファイバー内液の圧力を透析外
液のそれよりも高くなるように制御しながら透析を続け
ると、遊離薬物の除去効率を高めることができる。この
差圧は一般に３００ｍｍＨｇまでに制御されるが、好ま
しくは約５０ｍｍＨｇ以下さらに好ましくは１０〜５０
ｍｍＨｇとなるように制御される。差圧を５０ｍｎ＋Ｈ
ｇ以上にすると、水の透過も大きくなり、リボソーム分
散液が濃縮されてくるので、未封入の遊離薬物の分散除
去と同時に濃縮を行なうことも可能である。ただ、過剰
の差圧下で濃縮を行なわせると、リボソーム内に封入さ
れている薬物が漏出してくることがあり好ましくない場
合がある。この差圧の制御方法は、たとえば第１図（ａ
）に示される装置において、リボソーム懸濁液送液バイ
ブ■および透析外液送液バイブ■にそれぞれ設置された
差圧調整バルブ［相］によって調整される。特に、高分
子量薬物（例、分子量１〜６万）の場合には、拡散透析
速度か遅いため、より効率を上げるためにホローファイ
バー膜内液を加圧して行なう中空繊維膜透析が有効であ
り、この場合、耐圧強度をもたせるために膜はやや厚い
方がよい。

リボソーム懸濁液と透析外液は、第１図（ａ）のように
、自流方式で流通させるのが一般的であるが、並流方式
も場合によっては採用できる。ホローファイバー透析器
は■に示すような装置を、さらに直列または並列で複数
個連結させることにより、さらに大量処理に適した装置
を用いてもよい。

一方、より実用的には第２図に示されるように、リボソ
ーム製造装置と、たとえば第１図（ｂ）に示されるホロ
ーファイバー透析装置とを直結させることによりクロー
ズドシステムで、リボソーム懸濁液の製造と未封入薬物
の分離除去を一貫処理でき、作業性を一段と向上させ得
る。この場合、ホローファイバー透析装置は、予め高圧
蒸気滅菌などの処理を施しておくことにより、精製され
たリボソーム製剤を無菌的に製造することができる。

夫施■ 以下に実験例及び実施例を示し、本発明を更に詳しく説
明するが、これらは何ら本発明を限定するものではない
。

実験例１ （１）　　ＲＥＶリボソームの製法 ｌＱ丸底フラスコ中に、０．５ｍＭ　６−ＣＦ（６カル
ポキンフルオレセイン）の生理食塩水溶液３００旋とリ
ン脂質（ジパルミトイルフォスファチジルコリン：　ジ
ステアリルフォスファチジルコ’）７＝９：１）６ｇを
クロロホルム：　ジイソプロピルエーテル（１：１）の
混合溶媒３００ｄに溶解した液を入れて混合し、次に浴
槽型超音波発生機（６０Ｗ）で２０分間超音波照射して
乳化した。これを、５５°Ｃの水浴加温下で真空ロータ
リーエバポレーターによって有機溶媒を徐々に留去して
、６−ＣＦを封入するＲＥＶリボソームの懸濁液を調製
した。本懸濁液にはリボソームに未封入の６−ＣＦが溶
解されている。

（２）透析法 対照透析法：　セロファン袋膜（内径２　ｃｍ、長さ１
Ｉ１１，０．０８ｍ’、スペクトラポア、ＳＩ’ＥＣＴ
ＲＵＭＭＥＤＩＣＡＬ　　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ、ＩＮ
Ｃ，’！！りにリボソーム懸濁ｌ夜３００旙を充填し、
これを生理食塩水溶１ｆｆｌ　１０Ｑ中に浸漬し、室温
下で撹拌しながら透析した。

本発明透析法：　キュプラ・アンモニウム・レーヨン使
用のホローファイバー型透析器（中空の平均内径２００
　ａｍ、有効表面積０８ｍ２、ＴＡＦＯＢＷ型、テルモ
！２）を用いて、リボソーム懸濁液循環流量１５０滅／
分、透析外液（生理食塩水）の流量５００滅／分で懸濁
液と透析外液との差圧がｌｏｍｍＨｇの条件でリボソー
ム懸濁液３００旙を処理した。

（３）透析分離除去の効果の測定 未封入の遊１！ｌ６−ＣＦの分離除去の効果は、分離除
去前のリボソーム懸濁液中の遊離６−ＣＦの含量に対す
る分離除去後の同含量の百分率（残存率）で表わした。

（４）遊離５−ＣＦの測定法 リボソーム懸濁液の０．１ｄを採取し、セントリザルト
（ＣｅｎＬｒｉｓａｒｔ　　１．　　Ｓ　Ｍ　１３２４
９　＋西独製）に入れ、生理食塩水１滅を加えて遠心分
離（２０００ｒｐｍ、　５分間）して、遊離６−ＣＦの
みを含有する上清の一定量を蒸留水で１００倍に希釈し
たのち、光路長１ｃｍの石英セルに入れ、蛍光分光器に
よって蛍光強度（励起波長４９４　ｒｕｎ、蛍光波長５
１５ｎｍ）を測定し、検量線から遊離６−ＣＦを定量し
た。検量線は、別に５−ＣＦの標準液の蛍光強度を測定
し作成した。

（５）結果 対照透析法と本発明透析法をそれぞれ適用したときの、
処理時間とｆ３−ＣＦ残存率との関係を表１に示す。

表ｌ ６−ＣＦ残存率（％） 時間（ｈｒ）　　０　０．０ｇ０．２５０．５　０．６
６　６　２４　４８　７２本発明　１００　２５　　３
　＜１．０　＜０．１烙 表１の結果から明らかなように、セロファン袋膜透析法
が、リボソーム中へ未封入の遊離６−ＣＦの残存率が７
２時間（３日）後に漸く０．８％以下になるのに対し、
本発明方法によると遊離６ＣＦの残存率は４０分間で０
．１％以下にすることができ、きわめて短時間で効率的
に分離除去できる。

さらに、前記の本発明の透析法において、有効表面積を
１．５ｍ”に増大したホローファイバーを使用した場合
は、処理時間２０分でも６−ＣＦ残存率を０．１％以下
にすることができ、さらに処理時間を短縮することがで
きた。

実験例２ 実験例１と同様の方法で調製した６−ＣＦ封入リボソー
ム懸濁液を用いて、超遠心分離（１２０００Ｘｇ、３０
分間）法と本発明法とによる未封入６−ＣＦ液の分離効
果について比較した。

その結果、超遠心分離法では、粒径の小さいリボソーム
が完全に沈降せずに上清中に浮遊し、傾斜分離操作中に
リボソームが流出し、損失量が大であった。また、分離
除去率は１回だけの超遠心分離処理では、５−ＣＦ残存
率が６．３％と大きく、洗浄と遠心分離の操作を３回繰
り返した後にはじめて１％以下となり、従って約９０分
もの処理時間を要し、大量処理が困難であった。これに
対し、本発明法は全ての種類のリボソームに適用でき、
リボソームをほとんど損失することなく、きわめて短時
間に大量処理できた。

実験例３ （１）　シスプラチン（ＣＤＤＰ）封入のＲＥＶの調製 実験例１のＲＥＶ調製法において、６−ＣＦの代わりに
ＣＤ、Ｄ　Ｐ（３００ｍｇ）を用いて同様の方法により
ＣＤＤＰを封入するリボソームを懸濁し、未封入のＣＤ
ＤＰを溶解する液を得た。

（２）透析法 対照透析法；　実験例１と同様に、セロファン袋膜にＣ
ＤＤＰ封入リボソーム懸濁液３００滅を充填し、同様の
処理をした。

本発明透析法：　実験例１と同様の条件で、ＣＤＤＰ封
入リボソーム懸濁液の３００−を処理した。

（３）透析分離除去の効果の測定 前記リボソーム懸濁液中の未封入の遊離０ＤＤＰ含量を
、実験例１の第（３）項に示したと同様の操作で、分離
除去前及び分離除去後において定量し、残存率を測定し
た。

（４）遊離ＣＤＤＰの測定法 遊１ｌｌＩＣＤＤＰの測定は実験例１の第（４）項に示
したと同様の操作で、ＣＤＤＰ封入リボソームと遊離Ｃ
ＤＤＰをセントリザルト（Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ　　ｌ
＋５Ｍ１３２４９．西独製）で分離し、遊離ＣＤＤＰの
み含有する上清のＯ，ｌｄを採取し、内部標準液０．１
ＴｎＩｌを加えて、その一定量を高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）法によって定量した。

＋（Ｐ　Ｌ　Ｃの条件を以下に示す。

カラム、日立ゲル３０１３Ｎ　　４　ｍｍφＸ１５ｃｍ
カラム温度：５０°Ｃ 分ｇｉ液：　０．０２Ｍ　　ＫＨ，ＰＯ４−ＨＣｌ２（
ｐＨ流速＋　０．９ｄ／分、　検出：ＵＶ２１０ｎｍ内
部標準液：ヒボキサンチン（４μｇ／ｄ　）水溶液表２
にその結果を示す。

表２ ＣＤＤＰ残存率（％） 時間（ｈｒ）　　０　０．０８０．２５０．３３　０．
５　６　２４　４８　７２この結果、セロファン袋膜透
析法の場合、未封入のｉ！ｔ４１ＥＣＤｏｐの分離除去
残存率が、７２時間後（３日）後にょうや＜０．８％に
なるのに対し、本発明法によると３０分後に０．２％に
することかでき、きわめて短時間に分離除去できる。

実施例１ シスプラチン（ＣＤＤＰ）の１　ｍｇ／ｒｒｄｌ生理食
塩水溶液５００厳とリン脂質（ジパルミトイルフオスフ
ァチジルコリン：　ジステアリルフオスファチシルコリ
ン＝９：］）ＩＯｇをクロロホルム゛　ジイソプロピル
エーテル（１：ｌ）の混合溶媒に溶解した溶液５００ｄ
とから、ＣＤＤＰ封入ＲＥＶリボソームを実験例１の方
法に準じて製造した。このリボソーム懸濁液をホローフ
ァイバー型透析器（有効表面積１．５ｍ”、キュプラ・
アンモニウム・レーヨン、テルモ製ＴΔＦ　　１５Ｗ型
）を用い、リボソーム懸濁液のホローファイバー内循環
流量１５０＋Ｊ／分、透析外液（生理食塩水）流ｆｆ１
５００滅／分リボソーム懸濁液の循環液流出側系路と透
析外液側との差圧を１１０ｍ１ｉＨに調整した。この条
件下で０．５時間処理することにより、未封入の遊離Ｃ
ＤＤＰを分離除去できた。その結果、遊離のＣＤＤＰを
含有せず、ＣＤＤＰの封入率２０％のリボソーム製剤を
得た。

実施例２ 実施例１と同様の方法で製造した、ＣＤＤＰ封入ＲＥ　
Ｖリボソーム懸濁液５００滅を、ホローファイバー型透
析器（有効表面積１−５　ｍ”＋キュプラ・アンモニウ
ム・レーヨン、テルモ５ＪＴＡＩ−１５Ｗ型）を用い、
リボソーム懸濁液の循環流出側系路の差圧調整バルブを
絞って圧力を高めて、透析外液側との差圧を７０ｍｍＨ
ｇにした。この条件下で０３時間処理し、未封入の遊離
ＣＤＤＰの残存率が０５％以下で、リボソームを分散す
る液量が初期量の８０％に濃縮されており、ＣＤＤＰの
封入率２０％のリボソーム製剤を得た。

実施例３ 前記実施例１と同様の方法で製造した、ＣＤＤＰ封入リ
ボソーム懸濁１夜１００　Ｃ７を調製した。

この懸濁液をホローファイバー型透析器（有効表面積１
　、５　ｍ’、キュプラ中アンモニウム・レーヨン、テ
ルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を２本並列に連結した透析器
を用いて、リボソーム懸濁液側と透析外液側の差圧をＩ
ＯｍｍＨｇに調整した条件下で、未封入ＣＤＤＰの分離
除去を行い、処理時間０．５時間で遊ｆｉｃＤＤＰを実
質的に含まず、ＣＤＤＰ封入率２０％のリボソーム製剤
を得た。

実施例４ ＣＤＤＰ　　０．６ｇを溶解した生理食塩水溶液６００
Ｍ１とリン脂質（ジバルミトイルフオスファチジルコリ
ン；　ジステアリルフォスファチジルコリン−９＋ｌＮ
２ｇを溶解した有ｎ、溶媒溶液〔クロロホルム　　ジイ
ソプロピルエーテル（１・１）］６００ｄとを真空乳化
機（アジホモミキサーＭ型、特殊機化工業製）に入れホ
モミキサー（回転数１５００　Ｏｒｐｍ、　３０分間）
で乳化し、６０’Ｃの加温及び減圧下でパドルミキサー
によって撹拌（８０回転／分）しながら、徐々に有機溶
媒を留去してＣＤＤＰを封入するＲＥＶリボソームを製
造した。

このリボソーム懸ｉＱｉ＆　ｌ　ｌ　５０蔵をホローフ
ァイバー型透析器（有効表面積１．５Ｔｌ”、キュプラ
・アンモニウム・レーヨン、テルモ製ＴＡＦ−１５Ｗ型
）を用い、リボソーム懸濁液循環流出ｆｉ！１５０−／
分、透析外液に生理食塩水を用い流ｆｆ１５０〇−／分
で前者と後者の差圧をｌｏＩＩＩｍＨｇに調整した条件
によって分離除去し、１．２時間でＣＤＤＰ封入率２０
％のリボソーム製剤（１１５０ｍｅ）を得た。

実施例５ 実施例４と同様のホローファイバー型透析器（透析表面
積１．５Ｃ、キュプラ・アンモニウム・レーヨン、テル
モ製ＴＡＦ−１５Ｗ型）を予め高圧蒸気滅菌した。この
透析器にリボソーム製造装置である真空乳化機（アジホ
モミキサーＭ型、特殊機化工業製）を直結し、実施例４
と同様の方法でリボソーム製造後直ちにクローズドシス
テム（第２図）で、リボソーム懸濁液をホローファイバ
ー内に循環させて透析外液に生理食塩水を用い、流量５
００ｄ／分で、リボソーム分散液と透析外液との差圧を
ｌｏｎｕｓＨｇに調整した。この条件で未封入の遊離Ｃ
ＤＤＰを分離除去し、無菌化リボソームを一貫処理で製
造した。このとき、透析時間は１時間で、ＣＤＤＰ封入
率２０％のリボソーム分散液（１０００ｄ）を得た。

実施例６ 卵黄レシチン１ｇを含有するクロロホルム溶液１ｏｏｙ
を５００成用ナス型コルベンに入れ、真空ロータリーエ
ハホレーターでクロロホルムを徐々に留去して、ガラス
壁にリン脂質の薄膜を形成させ、これに生理食塩水に溶
解した１ｍｇ／滅のＣＤＤＰ６０旙を加え、よく撹拌し
なからＣＤＤＰを封入し、ＣＤ’Ｄ　Ｐ液に分散された
ＭＬＶを製造した。この方法でＭＬＶを５バツチ製造し
、これらを合わせ得た３００滅をホローファイバー型透
析器（キュプラ・アンモニウム・レーヨン、有効表面積
０．８ｍ’、ＴＡＦＯ８型、テルモ製）を用い、リボソ
ーム循環流量１５０ｈ、Ｉｌ／分、透析外液流量（生理
食塩水）５００ｙ４／分で処理し、未封入の遊離ＣＤＤ
Ｐを分離除去して、０．３時間で封入率３％のリボソー
ム分散液（３００ｄ）を得た。

実施例７ 実施例１で用いられるｌ　ｍｇ／１ｒｔｌｃ　Ｄ　Ｄ　
Ｐの代わりに２００ｄｇ／ｄの５−フルオロウラシル（
５−ＦＵ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で
、５−ＦＵを封入するリボソーム懸濁液を得て、同じ透
析条件で未封入の遊離５−ＦＵを分離除去して、０．５
時間処理で封入率２２％のリボソーム分散１ｆｆ（３０
０りを得た。

実施例８ 実施例１で用いられる１　ｍｇ／ｍｌｃ　Ｄ　Ｄ　Ｐの
代わりに、２００ｄｇ／Ｍ／、のマイトマイシンＣ（Ｍ
ＭＣ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、Ｍ
ＭＣを封入するリボソーム製剤を得て、同じ透析条件で
未封入の遊Ｉ！ｌＩＭＭＣを分離除去して、０．５時間
処理で封入率２４％のリボソーム分散液（３００ｎｅ）
を得た。

実施例９ 実施例１で用いられるｌ　ｍｇ／ｌｉｃ　Ｄ　Ｄ　Ｐの
代わりに、５００ｄｇ／−のアクラルビシン（Ａｒａ−
Ｃ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ方法で、Ａｒ
ａ−Ｃを封入するリボソーム製剤を得て、同じ透析条件
で未封入の遊離Ａｒａ−Ｃを分離除去して、０８５時間
処理で封入率２０％のリボソーム分散液（３００成）を
得た。

実施例１０ 実施例１で用いられる１　ｍｇ／−〇　Ｄ　Ｄ　Ｐの代
わりに、２００ｄｇ／ｄのビスクロルエチルニトロソウ
レア（ＢＣＮＵ）を用いて、それ以外は実施例１と同じ
方法で、ＢＣＮＵを封入するリボソーム製剤を得て、同
じ透析条件で未封入の遊離ＢＣＮＵを分離除去して、０
．５時間処理で封入率２０％のリボソーム分散液（３０
０ｄ）を得た。

実施例１１ １８ｇのＤＰＰｃと２ｇのＤＳＰＣを２１０ビーカー内
でクロロホルムとイソプロピルエーテルの１：１の混合
溶液１０００ｄに溶解した。この溶液に浸透圧が生理食
塩水の浸透圧の１．９倍となるようにあらかじめ調製し
ておいた５００ｄｇ／ｍｅのＣＤＤＰ食塩水溶液を１０
００ｄ加え軽（混合した後、乳化機（３１２用ホモミキ
サー、特殊機化工業製）で６０分間乳化しＷ１０エマル
ジョンを作製した。このようにして得たエマルジョンを
同じホモミキサーを用いて、６０°Ｃ減圧下で有機溶媒
を留去することによりＬＵＶを得た。さらに得られたＬ
　Ｕ　Ｖの一部５００滅をホローファイバー型透析器［
ＡＭ−Ｎｅｏ　−２００１型、脂化成製。

ファイバー長駒２５ｃｍ、有効膜面積１．５ｍ２］中に
、約１５０ｄ／分の速度で注入し、透析外液として生理
食塩水をホローファイバーにかかる膜圧がＯとなるよう
に、約５００ｄ／分の速度で流すことにより、遊離のＣ
ＤＤＰを透析除去し、ＣＤＤＰが上記高張溶液と共に封
入されたリボソーム製剤を得た。

発明の効果 本発明によると、薬物を封入し７てなるリボソームど未
封入薬物とを含有してなる水性液から、未封入薬物を実
用的に有利に分離除去でき、リボソーム製剤の精製法と
して極めて有用である。すなわち、従来、採用されてき
た透析袋膜法、遠心分離法、ゲルろ適法に比較して、短
時間に大量処理が可能であること、透析装置の殺菌処理
が可能でありかつリボソーム製造装置と直結したクロー
ズドシステムを採用しうろこと、などにおいて極めて実
用に適した方法である。また、本発明方法を適用しても
、リボソームに損傷を与えることがなく、封入された薬
物の漏出を起こさないので、この点でも優れた方法であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）は、本発明に用いる装置の１例を示す。図
中、■はリボソーム懸濁液貯留容器、■はリボソーム懸
濁液送液ポンプ、■および■はリボソーム懸濁液の送液
パイプ、■はホローファイバー型透析器、■は透析外液
貯留容器、■透析外液送液ポンプ、■および■は透析外
液送液パイプ、■は差圧調整バルブをそれぞれ示す。 第１図（ｂ）は、第１図（ａ）中の■ホローファイバー
型透析器の拡大図を示す。■中空繊維膜（ホローファイ
バー）、ｏ中空繊維集束接着固定部、０ケース、■リボ
ソーム懸濁液流入口（透析前）、■Ｊボソーム懸濁液流
出口（透析後）、■透析外液流入ロ、■透析外液流出口
をそれぞれ示す。 第２図は、リボソーム製造装置にホローファイバー型透
析器を直結させ、薬物を封入するリボソームの調製と未
封入の薬物の分離を無菌的に一貫して実施できる装置の
一例を示す。図中、■リボソーム製造装置（真空乳化機
）、■リボソーム懸濁液、■ホローファイバー型透析器
、■リボソーム懸濁液循環送液ポンプ、■透析外液送液
ポンプ、■リボソーム懸濁液送液パイプ、■透析外液送
液パイプ、■中空繊維内側圧調整バルブ、■透析外液側
圧調整バルブ、１Φ透析外液貯留タンクをそれぞれ示す
。 第１図（ａ） 亨１図（ｂ） 代理人　　弁理士　台　１）　　弘

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）薬物を封入してなるリボソームと未封入薬物とを
   含有してなる水性液をホローファイバーによる透析に付
   し、該ファイバーの外液中に未封入薬物を分離除去する
   ことを特徴とするリボソーム製剤の精製法。
2. （２）ホローファイバー中の水性液圧を外液圧よりも高
   くなるように制御する請求項（１）記載の方法。
3. （３）差圧が３００ｍｍＨｇ以下である請求項（２）記
   載の方法。