JPH05155758A

JPH05155758A - ヘモグロビン内包脂質小胞体の製造方法

Info

Publication number: JPH05155758A
Application number: JP3350484A
Authority: JP
Inventors: Satoru Tokuyama; 悟徳山; Takahiro Masuko; 孝宏益子; Osamu Nakachi; 理仲地; Hidetoshi Tsuchida; 英俊土田
Original assignee: Research Institute for Production Development; Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp; Research Institute for Production Development
Priority date: 1991-12-11
Filing date: 1991-12-11
Publication date: 1993-06-22

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、ヘモグロビンを内包する粒径30〜
300nm の脂質小胞体と内包されなかったヘモグロビンと
が混在する液を分離する際に中空糸膜を用いて透析する
ヘモグロビン内包脂質小胞体の製造方法において、膜孔
径が６nm以上、かつ100nm 以下の中空糸膜を用いて透析
することを特徴とするヘモグロビン内包脂質小胞体の製
造方法である。【効果】ヘモグロビンを内包する脂質小胞体と内包され
なかったヘモグロビンを含有する液において、孔径６〜
100nm の中空糸膜モジュールを利用することによって、
内包されなかったヘモグロビンを完全に分離・除去する
ことができる。従来のゲル濾過法のように別途濃縮工程
を必要とせず、超遠心分離法のように脂質小胞体を損傷
させることなく、また、従来の膜分離法のように脂質小
胞体を損失することもないなど優れており、短時間に大
量処理が可能となり、工業的にも極めて実用的な方法で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人工赤血球として有用
であるヘモグロビン内包脂質小胞体の調製において、脂
質小胞体内に内包されなかったヘモグロビンを迅速に分
離し、ヘモグロビン内包脂質小胞体を製造する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】現在まで知られている一般の脂質小胞体
調製方法において、使用したヘモグロビン全てを脂質小
胞体内に内包する調製方法は存在しない。脂質小胞体内
に内包されなかったヘモグロビンは生体内で腎臓等に負
担をかけるので好ましくない。従って、リン脂質とヘモ
グロビン溶液を混合しヘモグロビンを封入した脂質小胞
体を形成した後、脂質小胞体内に内包されなかったヘモ
グロビンを分離することは、遊離ヘモグロビンによる生
体内での腎毒性を防止する上で必要である。

【０００３】従来の分離技術としては、ゲル濾過法 (Bi
ochemistry ８，344(1969))、超遠心分離法 (Biochemi
stry 17, 1792(1978)) などが知られている。また、中
空糸膜を利用した分離方法としては、薬物を封入してな
るリポソームと未封入薬物とを含有してなる水性液をホ
ローファイバーによる透析に付し、該ファイバーの外液
中に未封入薬物を分離除去することを特徴とするリポソ
ーム製剤の精製方法が知られている（特開平2-49718 号
公報）。この方法では、分子量約60,000以下の薬物を分
離することが主目的であり、従って、分子量約64,000〜
65,000のヘモグロビンと、ヘモグロビンを内包したリポ
ソームとを分離しようとしても不可能であった。

【０００４】そのほかにヘモグロビンを内包した脂質小
胞体と内包されなかったヘモグロビンとの分離に血漿分
離器を利用した方法が知られている（特開平3-173813
号) 。この血漿分離器は、一般には中空糸膜を束ねたモ
ジュール型であり、その材質は蛋白質の吸着が少ない材
質（セルロースジアセテート、ポリビニルアルコール、
ポリプロピレン、セルローストリアセテート、ポリメチ
ルメタクリレート、ポリエチレン、ポリスルホンなど）
で構成されている。その中空糸膜の孔径は200 〜400nm
である。

【０００５】この中空糸膜分離法を用いて脂質小胞体と
ヘモグロビンに分離することが従来試みられてきたが、
この方法では、閉鎖系回路装置を作製することができ、
無菌的な処理が実現できるものの、この方法に使用され
る中空糸膜の孔径が脂質小胞体の粒径に対して大きいた
め、分離しようとする脂質小胞体の粒径は中空糸膜孔径
以上の大きさを有している必要があり、粒子径の小さい
脂質小胞体 (30〜300nm)にこの中空糸膜分離法を利用す
る場合、脂質小胞体自身が中空糸膜を透過してしまい、
脂質小胞体の回収率が低下するという問題点があり、厳
密に脂質小胞体とヘモグロビンを分離できないという問
題点を有していた。

【０００６】膜孔径が100nm 以下の中空糸膜は、蛋白質
とウィルスとの分離除去を目的にした利用方法が知られ
ている（特開平2-290228号) 。該中空糸膜は、一般の医
療分野では、血漿中のアルブミンなどの比較的分子量の
小さい蛋白質と免疫複合体などの大分子量物質とに分離
する際に用いられる公知の中空糸膜である。しかし、該
中空糸膜を脂質小胞体の製造に利用することは未だ知ら
れていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、ヘモグロビン内包脂質小胞体溶液の製造の
際、中空糸膜モジュールを利用した脂質小胞体内に内包
されなかったヘモグロビンを分離・除去する方法におい
て、脂質小胞体溶液と内包されなかったヘモグロビンと
を厳密に分離する方法を、完成することである。工業的
に行うためには、大量の処理が短時間で完了し、かつ製
造した脂質小胞体の損失がないなどの条件を満足するこ
とが必要である。

【０００８】本発明の目的は、粒子径を特定の大きさに
調整した脂質小胞体を含有する懸濁液から、脂質小胞体
内に内包されなかったヘモグロビンを効率的に取り除
き、工業的に行うことができるヘモグロビン内包脂質小
胞体の製造方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヘモグロビン
を内包した粒子径30〜300nm の脂質小胞体と内包されな
かったヘモグロビンとが混在する液を分離する際に中空
糸膜を用いて透析するヘモグロビン内包脂質小胞体の製
造方法において、膜孔径が６nm以上かつ100nm以下の中
空糸膜を用いて透析することを特徴とするヘモグロビン
内包脂質小胞体の製造方法である。

【００１０】本発明でいう脂質小胞体は、いわゆる「リ
ポソーム」のことである。本発明でいう、「ヘモグロビ
ンを内包した粒子径30〜300nm の脂質小胞体と内包され
なかったヘモグロビンを内包する液」は、ヘモグロビン
を封入してなる粒子径30〜300nm の脂質小胞体が水また
は水溶液に懸濁しており、その水または水溶液にヘモグ
ロビンが混在している混合液である。

【００１１】ヘモグロビンを内包した粒子径30〜300nm
の脂質小胞体と内包されなかったヘモグロビンを含有す
る液は、リン脂質あるいはリン脂質を主成分とする脂質
とヘモグロビン溶液を用いて公知の方法によってヘモグ
ロビンを封入する脂質小胞体を調製した後に得られる液
である。脂質小胞体を調製する方法は、例えば、ヴォル
テキシング（Vortexing)法、超音波照射法、高圧吐出
法、高圧押出法などを利用することができる。本発明の
適用対象となる脂質小胞体の種類・組成は特に限定がな
く、脂質小胞体膜枚数が単層か多重層、あるいはその混
合系かについても特に限定されない。

【００１２】本発明でいうところのヘモグロビンは、混
血動物の赤血球に含まれるヘモグロビンであって、例え
ば、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサ
ギ、サルなどの赤血球より公知の方法で精製されるヘモ
グロビンである。また、本発明で用いる「膜孔径が６nm
以上かつ100nm 以下の中空糸膜」は、半透膜の材質から
なり中空を有する繊維であって、該中空糸膜の表面に開
いた無数の孔径が６nm以上であり、かつ100nm 以下のも
のである。

【００１３】膜口径が６nm以上であることの必要性は、
ヘモグロビンの中空糸膜透過性と関係する。つまり、膜
孔径が６nm以下では、分子量約64,000〜65,000のヘモグ
ロビンの透過率が10％未満となり、内包されなかったヘ
モグロビンの分離が困難になる。また、膜孔径が100nm
以下であることの必要性は、脂質小胞体の膜透過性に関
係する。つまり、膜孔径100nm 以上では、粒子径30〜30
0nmに調製した脂質小胞体が中空糸膜を通過してしま
い、脂質小胞体とヘモグロビンの分離ができない。

【００１４】この中空糸膜の材質としては、蛋白質の膜
吸着が少なく、かつ、脂質小胞体脂質と吸着が少ないも
のが望ましく、天然高分子膜、合成高分子膜などから選
択することができ、具体的には、エチレンビニルアルコ
ール共重合体、ポリメチルメタクリレート、セルロース
ジアセテート、ポリアクリロニトリル、ポリスルホンな
どである。

【００１５】本発明に適用される中空糸膜は、モジュー
ル化された水処理用、血漿成分分離用中空糸膜を利用す
ることにより、ヘモグロビン内包脂質小胞体と内包され
なかったヘモグロビンの完全分離をより簡便に解決する
ことができる。このモジュール化された中空糸膜は、一
般に各社より市販されているホローファイバーを利用す
ることができる（マイクローザ：旭化成、カスケードフ
ロー：旭メディカル、エバフラックス：クラレ、プラズ
マックス：東レ、など）。

【００１６】次に、本発明の中空糸膜モジュールを利用
した脂質小胞体と内包されなかったヘモグロビンの分離
方法及びヘモグロビン内包脂質小胞体の濃縮方法につい
て説明する。内包されなかったヘモグロビンを分離する
ため、それ自体公知の方法で調製した脂質小胞体懸濁液
を、通常中空糸膜モジュール内側に流通させる。中空糸
膜モジュールの外側は、特に透析外液を流通させる必要
はないが、透析外液を流通させる場合は、人などの生体
に生理的に許容しうる水溶液を用いる。具体的には生理
食塩水などの等張溶液、あるいは糖類（ブドウ糖、マン
ニット、ソルビットなど）やアミノ酸類（アスパラギン
酸、グリシン、グルタミン酸など）を含有する等張溶液
である。また、透析外液を中空糸膜外側に流通させる場
合、中空糸膜の内側と外側との差圧は、内側の圧力を高
くする必要がある。差圧は、使用最大許容圧まで制御さ
れるが、ヘモグロビンの透過効率を高めるために100mmH
g から使用最大許容圧の圧力で行うのがよい。また、逆
に脂質小胞体懸濁液を中空糸膜モジュール外側に流通さ
せ、中空糸膜モジュール内側に透析外液を流通させるこ
とも可能である。この場合、外側の圧力を内側の圧力よ
り高くして行えばよい。

【００１７】透析は、水の透過も大きくなるので脂質小
胞体の濃縮も同時に進行される。透析液中に内包されな
かったヘモグロビンが存在している場合は、脂質小胞体
溶液の脂質濃度が10ｇ／dl程度に濃縮された時点で懸濁
液の減少した液量と同等の上記の等張水溶液を添加し再
び透析を行う。この操作を数回から数十回繰り返すこと
により、内包されなかったヘモグロビンを完全に分離す
ることができる。透析液中にヘモグロビンが検出されな
くなった時点で脂質小胞体懸濁液の濃縮を開始する。濃
縮は、等張水溶液の脂質小胞体懸濁液への添加を停止し
て透析を行えば良い。濃縮の完了は、脂質濃度が目的と
する濃度になるまで、あるいは中空糸膜モジュールの差
圧が許容差圧に到達するまで行うことができる。

【００１８】本発明方法は、例えば第１図に示す装置で
内包されなかったヘモグロビンを分離することができ
る。第１図において、貯留タンク３に入れた脂質小胞体
懸濁液は、送液ポンプ４により、送液パイプ６を介し中
空糸液モジュール８の中空糸膜内側に送液され、送液パ
イプ７を介して再び貯留タンク３に戻る。未内包ヘモグ
ロビンは、モジュール８の膜の内側から外側に透析さ
れ、透析液送液パイプ９を介して透析液貯留タンク10に
回収する。

【００１９】中空糸膜モジュールの内外の差圧は圧力ゲ
ージ５で読み取ることができる。貯留タンク３内の脂質
小胞体懸濁液量が減少し、圧力ゲージ５がモジュール８
の許容圧に達したら、貯留タンク１内の等張液を送液ポ
ンプ２を介して貯留タンク３に送液する。第１図に示し
た装置は閉鎖回路であり、従って、各貯留タンク１、
３、10には滅菌フィルター付き空気抜き弁11が設けてあ
る。

【００２０】大量処理を行う場合、中空糸膜モジュール
の膜表面積の大きなものを単一で用いてもよいが、より
迅速に行う場合、膜面積の小さいモジュールを数百から
数千本束ねたものを数個組み合わせて行えば、より迅速
な処理が行える。無菌的な処理を実現するためには、装
置を閉鎖系にして行えば良い。

【００２１】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。尚、％は重量
％である。調製例１超音波照射法によるヘモグロビン内包脂質
小胞体の調製水添卵黄レシチン、コレステロール、ステアリン酸から
なる組成比７／５／２（モル比）の脂質 180ｇをストロ
マーフリーヘモグロビン溶液 1,200ml (濃度：20g/dl)
に混ぜ、アルゴンガス雰囲気下、時々冷却しながら超音
波照射 (出力60Ｗ）により、脂質小胞体懸濁液を調製し
た。得られた脂質小胞体懸濁液1,000mlは、0.20μm の
滅菌カートリッジフィルターで５kg/cm²以下の差圧で濾
過した。得られた脂質小胞体の粒径を粒径分布測定装置
（PacificScientific : NicompModel 730HPL) で測定し
たところ、190 ±50nmの均一の粒径分布を示した。また
脂質小胞体内に内包されたヘモグロビンは使用したヘモ
グロビンの43％であり、残りの内包されなかったヘモグ
ロビンは57％であった。

【００２２】実施例１調製例１によって得られた脂質小胞体懸濁液500ml に、
生理食塩水500ml を加え、中空糸膜モジュール（膜材
質：エチレンビニルアルコール共重合体、膜孔径：10n
m、有効膜面積：1.0m²、クラレ製：エバフラックス２
Ａ）の中空糸膜モジュールを用いて、膜内外の差圧が50
0mmHg になるよう脂質小胞体懸濁液の循環流量を調製し
透析を行い、懸濁液量が初期量の75％に減少したところ
で、懸濁液に生理食塩水250ml を加え、これを数十回繰
り返した。この条件下で３時間透析を行ったところ、透
析液は10リットルに達した。透析液に透過してきた物質
は、ヘモグロビンのみで脂質小胞体は存在しなかった。
また、得られたヘモグロビン内包リボソーム溶液中に
は、未内包のヘモグロビンは検出されなかった。また、
得られたヘモグロビン内包脂質小胞体溶液に、生理食塩
水を添加することをやめて透析することで、濃縮したと
ころ、脂質濃度12g/dlの脂質小胞体粒径分布 191±53nm
の単一分布を示す溶液を得ることができた。

【００２３】比較例１調製例１によって得られた脂質小胞体懸濁液500ml に、
生理食塩水500ml を加え、血漿分離器（膜材質：ポリビ
ニルアルコール、膜孔径：200nm 、有効膜面積：0.3
m²、クラレ製プラズマキュアーＭ）の中空糸膜モジュ
ールを用いて実施例１と同様の条件で、３時間透析を行
ったところ、透析液は６リットルであり透析液中には、
ヘモグロビンの他に脂質小胞体の混在が認められた。そ
の割合をリン脂質の濃度から求めたところ26％に達し、
その粒径分布は 160±60nmであった。得られたヘモグロ
ビン内包脂質小胞体溶液中には、未内包のヘモグロビン
は存在しなかったが、その粒径分布は初期値より大きく
なり 210±61nmとなった。

【００２４】調製例２高圧押出法によるヘモグロビ
ン内包脂質小胞体の調製卵黄レシチン、コレステロール、ステアリン酸からなる
組成比７／７／１（モル比）の脂質100gを、ヘモグロビ
ン溶液1,000ml(濃度：30g/dl) に混ぜ、これを高圧の濾
過装置（ダイセル化学（株）製：平幕テスト機Ｐ−28)
を用いて、孔径５、１、0.8 、0.45、0.2 μm のポリカ
ーボネート材質のフィルターを遂次通過させ、脂質小胞
体懸濁液950ml を調製した。この時の脂質小胞体の粒径
分布を調製例１の測定装置で測定したところ 202±62nm
であった。また、脂質小胞体内に内包されたヘモグロビ
ンは、使用したヘモグロビンの31％であり、残りの内包
されなかったヘモグロビンは69％であった。

【００２５】実施例２調製例２によって得られた脂質小胞体懸濁液400ml に生
理食塩水400ml を加え実施例１と同等の中空糸膜モジュ
ールを用い、同様の条件で３時間透析を行ったところ、
得られた透析液 9.3リットル中にはヘモグロビンのみし
か存在せず、脂質小胞体の膜透過は認められなかった。
また、得られたヘモグロビン内包脂質小胞体溶液は、粒
径も初期値とほとんど変わらず 203±60nmであり、脂質
濃度13g/dlであった。

【００２６】比較例２調製例２によって得られた脂質小胞体懸濁液 400mlをゲ
ルカラム（ゲル：セファロースＣＬ−４Ｂ；ファルマシ
ア製：カラム径 100mm×カラム長さ1200mm) で分離した
ところ、分離に８時間要した。また、得られたヘモグロ
ビン内包脂質小胞体溶液は 2,520mlとなり、その脂質濃
度は 1.6g/dlであった。

【００２７】調製例３高圧押出法によるヘモグロビ
ン内包脂質小胞体の調製ジミリストイルホスファチジルコリン、コレステロー
ル、ジミリストイルホスファチジルグリセロールからな
る組成比７／７／３（モル比）の脂質120gをヘモグロビ
ン溶液1,000ml(濃度：30g/dl) に混ぜ、調製例２と同じ
方法で脂質小胞体懸濁液940ml を調製した。この時の脂
質小胞体の粒径分布を調製例１の測定装置で測定したと
ころ 171±72nmであった。また、脂質小胞体内に内包さ
れたヘモグロビンは、使用したヘモグロビンの39％であ
り、残りの内包されなかったヘモグロビンは61％であっ
た。

【００２８】実施例３調製例３によって得られた脂質小胞体懸濁液 400mlに生
理食塩水 400mlを加え、中空糸膜モジュール（膜材質：
ポリメチルメタクリレート、膜孔径：100nm 、有効膜面
積：1.2m²、東レ製：プラズマックスＱＳ）の中空糸膜
モジュールを用いて実施例１の条件で３時間透析を行っ
た。透析液11リットル中の脂質小胞体濃度と得られたヘ
モグロビン内包脂質小胞体の濃度をリン脂質定量から求
め、脂質小胞体の透過率を計算すると２％未満であっ
た。また、ヘモグロビン内包脂質小胞体液中の未内包ヘ
モグロビンは、全く認められず、その粒径分布もほとん
ど変化しなかった。

【００２９】比較例３調製例３によって得られた脂質小胞体懸濁液 400mlに、
生理食塩水400mlを加え、血液濾過法に用いられる中空
糸膜モジュール (膜材質：キュプラ・アンモニウム・レ
ーヨン、分画分子量：44,000 (阻止率95％以上）、有効
膜面積：1.0m²、テルモ製クリランスＳ）の中空糸膜モ
ジュールを用いて、実施例３の条件で３時間透析を行っ
たところ、透析液10リットル中には脂質小胞体の存在は
認められなかったが、ヘモグロビンの透析率も悪く５％
以下であり、脂質小胞体と未内包ヘモグロビンの分離は
できなかった。

【００３０】

【発明の効果】本発明によると、ヘモグロビンを内包す
る粒径30〜300nmの脂質小胞体と内包されなかったヘモ
グロビンを含有する液において、孔径６〜100nm の中空
糸膜モジュールを利用することによって、内包されなか
ったヘモグロビンを完全に分離・除去することができ、
ヘモグロビン内包脂質小胞体溶液の製造方法として極め
て有用である。すなわち、従来のゲル濾過法のように別
途濃縮工程を必要とせず、超遠心分離法のように脂質小
胞体を損傷させることなく、また、従来の膜分離法のよ
うに脂質小胞体を損失することもないなど優れており、
短時間に大量処理が可能となり、工業的にも極めて実用
的な方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いる装置の１例を示す線図であ
る。

【符号の説明】

１・・等張液貯蔵タンク、２・・等張液送液ポンプ、３
・・脂質小胞体懸濁液貯留タンク、４・・脂質小胞体懸
濁液送液ポンプ、５・・圧力ゲージ、６、７・・脂質小
胞体懸濁液送液パイプ、８・・中空糸膜モジュール、９
・・透析液送液パイプ、10・・透析液貯留タンク、11・
・滅菌フィルター付き空気抜き弁。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者仲地理茨城県牛久市下根町1044−10 (72)発明者土田英俊東京都練馬区関町南２−10−10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘモグロビンを内包する粒径30〜300nm の
脂質小胞体と内包されなかったヘモグロビンとが混在す
る液を分離する際に中空糸膜を用いて透析するヘモグロ
ビン内包脂質小胞体の製造方法において、膜孔径が６nm
〜100nm の中空糸膜を用いて透析することを特徴とす
る、ヘモグロビン内包脂質小胞体の製造方法。