JPH02500879A - 組換えアビポックスウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアビポックスウィルス 本出願は１９８８年４月２５日出願の米国特許出願第１８６．０５４号のＣＩＰ 出願であり、このＣＩＰ出願はさらに１９８７年ｌＯ月２０日出願の米国特許出 願第ｔｔｏ、ａｓｓ号のＣＩＰ出願であり、これはさらに１９８７年８月２８日 出願の米国特許出願第０９０．７１１号のＣＩＰ出願である。

本発明は、合成組換えアビボッゲスウィルス（ｌＶｉｐＯＸｖ’１ｒｕｓ）を用 いて、非鳥類を椎動物を含むを椎動物において免疫応答を誘起する方法に関する 。さらに詳細に言えば、本発明はを椎動物、特に哺乳類において、を椎動物病原 体の抗原決定基をコードしかつ発現させるＤＮＡを含有する合成組換えアビポッ クスウィルスをを椎動物に接種することによって、を椎動物病原体に対する免疫 学的応答を誘起する方法、及びかかる修飾アビポックスウィルスから成るワクチ ン類に関する。さらに、本発明は、修飾アビポックスウィルス、その製造及び使 用方法、修飾アビポックスウィルスの製造において生産される、或いは中間体と して関与するＤＮＡ配列、及びかかる配列の製造方法に関する。

発明の背景 アビポックスウィルス、即ちアビポックスウィルスは、家禽に感染するポックス ウィルスと近縁の属である。

アビボックス属には、ファウルボックス（ｆｏｗｌ　ｐｏｘ）、カナクーボック ス（ｃａｎａｒｙ　ｐｏｘ）、ジニンコボックスＵｕｎｃ。

ｐｏｘ）・ビビョンボックス（ｐｉｇｅｏｎ　Ｉ）ＯＸ）％クエイルポツクス（ ｑｕａｉｌ　ｐｏｘ）　ｓスパロウボックス（ｓｐａｒｒｏｗ　ｐｏｘ）　ｓス ターリングボックス（ｓｔａｒｌｉｎｇ　ｐｏｘ）、及びターキーボックス（ｔ ｕｒｋｅｙ　ｐｏｘ）種が含まれる。ファウルボックス種はニワトリに感染する もので、水痘とよばれるヒトの病気と混同してはならない。アビボックス属は他 のポックスウィルスと多くの特徴が共通しており、を推動物のポックスウィルス としてワクシニアと同じ亜科に属する。ワクシニアとアビボックスを含むポック スウィルス類は、宿主の真核細胞内で複製する。これらのウィルス類はそれらが 大きいこと、複雑であること、及び細胞質内の部位で複製されることで特徴付け られる。

しかし、ワクシニアとアビボックスは異なる属であり、ウィルス分類国際委員会 （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏａ＋ｍ１ｔｔｅｅ　ｏｎＴａｘｏｎｏｍｙ 　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）の第４回報告書、インタービｏ。

ジー（Ｉｎｔｅｒｖｌｒｏｌｏｇｙ）　１７巻、４２乃至４４頁（１９Ｈ）に報 告されているように、おのおのの分子量、抗原決定基、及び宿主となる種が異な っている。

アビポックスウィルスは、ヒトを含む哺乳類などの非鳥類を推動物に増殖性の感 染はしない。さらに、哺乳類（ヒトを含む）の培養細胞に接種してもアビボック スは増殖しない。アビボックスを接種した哺乳類の培養細胞において、細胞毒性 作用のため細胞は死ぬが、ウィルスの増殖性感染の証拠は見られない。

哺乳類などの非鳥類を推動物に生きたアビボックスを接種すると、接種部分にワ クシニアの接種と類似した病巣が形成される。しかし、ウィルスの増殖性の感染 は起こらない。にもかかわらず、このようにして接種を受けた哺乳類がアビポッ クスウィルスに対して免疫学的に応答することが今回判明した。これは予想外の 結果である。

死滅病原体又はかかる病原体の精製抗原成分から成るワクチンは、有効な免疫応 答を誘起させるためには、ウィルス生ワクチンよりも大量に注入しなければなら ない。

このことは、生ウイルス接種がはるかに効率的なワクチン接種法であることによ る。比較的少量の接種でも、問題の抗原がウィルス複製時に増幅されることから 、有効な免疫応答を誘起させることができる。医学的観点から見れば、ウィルス 生ワクチンは死滅病原体又は精製抗原ワクチンを接種するよりも効果が大きく、 しかもより長時間持続する免疫性を付与する。従って、死滅病原体又はかかる病 原体の精製抗原成分より成るワクチンは、生ウィルスの時よりもワクチン物質を 大量に製造する必要がある。

既に述べてきたことから明らかなように、ウィルス生ワクチンを使用することは 医学的にもまた経済的にも利点がある。かかるウィルス生ワクチンのひとつとし て、ワクシニアウィルスから成るワクチンが挙げら°れる。このウィルスは、組 換えＤＮＡ法を用いて哺乳類病原体の抗原の遺伝子配列を示すＤＮＡを挿入する のに有用なウィルスのひとつであることが、従来技術において公知である。

従って、病原性生物の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列を含有する、任意の起 源の（例えば、ウィルス、原核生物、真核生物、合成）　ＤＮＡをワクシニアゲ ノムの非必須領域に挿入することによって、組換えワクシニアウィルスを作製す ることができる方法が従来技術において開発された。これらの方法で作製される ある種の組換えワクシニアウィルスは哺乳類に種々の哺乳類病原体に対する特異 的免疫を誘起させるために用いられており、これらに関しては全て米国特許第４ ．６０３，１１２号に記載されており、本明細書中に引用しである。

非修飾ワクシニアウィルスは、天然痘の予防接種に比較的安全でかつ有効なもの として使用されてきた長い歴史がある。しかし、天然痘根絶前の、非修飾ワクシ ニアウィルスが広く投与されていた時は、中程度の危険ではあるが、全身的ワク シニア感染という形で実際に合併症が起きる危険があり、特に湿疹又は免疫抑制 に罹患している者では危険が伴っていた。ワクシニア接種により生じる可能性の ある合併症として、稀ではあるが、ワクチン接種後の脳炎がある。これらの反応 のほとんどは、湿疹のような皮膚疾患、又は免疫系不全の者、又は家族に湿疹又 は免、疫反応不全の者がいる人達に接種したことが原因であった。ワクシニアは 生きたウィルスであり、通常、健常人に対しては無害である。しかし、接種後数 週間にわたり個人間で伝染する。正常の免疫応答が不全である者が接種、又は最 近接種を受けた者からの接触伝染により感染した場合、重大な結果をもたらすこ とがある。

従って、当技術における生ウィルスの接種の利点を有しながら既に述べた問題を 軽減又は消失させるような方法は、現行技術の状態をはるかに上回る望ましい利 点を持つことがわかる。このことは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として 公知の疾患が発症している現在において、極めて重要となっている。本疾患の犠 牲者は重大な免疫不全に罹患していて、他の者にとりでは安全な生ウィルスと直 接接触、または生ウイルス製剤から成るワクチン接種を最近受けた人と接触する ことにより伝染した場合、かかるウィルス製剤により簡単に傷害を受ける。

発明の目的 本発明の目的は、病原性生物に対してを推動物を免疫することができるワクチン にして、ウィルス生ワクチンの利点を有しつつ、特に非鳥類を推動物を免疫する ために用いた時、既に列挙したようなウィルス生ワクチンの欠点も死滅ウィルス ワクチンの欠点もほとんど又は全く有さないワクチンを供することである。

本発明はさらに、かかるワクチンに使用する合成組換えアビポックスウィルスを 供することを目的とする。

本発明はさらに、鳥類及び非鳥類を推動物において、哺乳類のような非鳥類を推 動物の場合には動物体内において感染したウィルスの産生を伴った増殖性の複製 を行うことのできない合成組換えアビポックスウィルスをを椎動物に接種するこ とによって、免疫応答を誘起させる方法を供することを目的とする。哺乳類のよ うな非鳥類を椎動物に接種した場合、かかるウィルスは、非ワクチン接種宿主に 広がる可能性を自己限定し低下させる。

本発明はさらに、を椎動物において抗原に対する免疫応答を誘起させる方法にし て、該を椎動物に対する病原体の抗原決定基を含有しかつ発現させる合成組換え アビポックスウィルスを含有するワクチンをを椎動物に接種することを含む方法 を供することを目的とする。

また、遺伝子産物をコードし、かつを推動物中でウィルスが増殖的複製をするこ となく遺伝子産物を発現させるＤＮＡを含有する組換えウィルスをを椎動物に接 種することによって、を推動物中で遺伝子産物を発現させる方法を供することも 本発明の目的である。

さらに、抗原をコードし、かつを推動物中でウィルスが増殖的複製をすることな く抗原を発現させるＤＮＡを含有する組換えウィルスをを椎動物に接種すること によって、抗原に対する免疫応答をを椎動物に誘起させる方法を供することも本 発明の目的である。

発明の説明 本発明の一つの態様は、アビボックスゲノムの非必須領域における病原体の抗原 をコードしかつ発現させる任意の起源のＤＮＡの存在によって、修飾された合成 組換えアビポックスウィルスをを椎動物に接種することによって、前記病原体に 対する免疫応答をを推動物中に誘起させる方法に関する。

別の態様においては、本発明はを椎動物の細胞内では増殖的複製はしないがかか る細胞中で遺伝子産物又は抗原を発現する組換えウィルスを用いて、を推動物中 で遺伝子産物を発現させる或いはを椎動物に抗原に対する免疫応答を誘起させる 方法に関する。

もう一つの態様においては、本発明は任意の起源、特に非アビボックス起源のＤ ＮＡをアビボックスゲノムの非必須領域に挿入することによって修飾した合成ア ビポックスウィルスに関する。

抗原をコードしかつ発現させる外来（即ち、非アビボックス）遺伝子を有する人 工的に修飾したアビポックスウィルス組換え体は、前記抗原に対するを椎動物宿 主の免疫応答の発生を誘起させて、外来病原体に対する免疫応答の発生を誘起さ せるが、かかる組換え体は、本発明においては、死滅或いは弱毒化させた生きた 生物を用いている従来のワクチンの欠点を、特に非鳥類を椎動物に接種して用い る時に、有さない新規なワクチンを作製するのに用いられる。

アビポックスウィルス類は鳥類又は鳥類の細胞系においてのみ増殖的に複製でき 、また継代することができることをここでもまた述べておく必要がある。鳥類宿 主細胞から採取した組換えアビポックスウィルスは、ワクシニアウィルスによる 哺乳類の接種と同様の方法で哺乳類のような非鳥類を椎動物に接種すると、接種 による病変が生じるが、アビポックスウィルスの増殖的複製は起こらない。この ような接種を受けた非鳥類を椎動物でアビポックスウィルスは増殖的複製を行わ ないにもかかわらず、ウィルスの発現は充分に起こり、その結果、接種された動 物はこの組換えアビポックスウィルスの抗原決定基及び該ウィルスの外来遺伝子 にコードされた抗原決定基に対して免疫学的に応答する。

鳥類に接種すると、かかる合成組換えアビポックスウィルスはその中に存在する 任意の起源の外来ＤＮＡによってコードされる抗原に対する免疫応答を誘起する ばかりでなく、宿主内でこのウィルスの増殖的複製を起こしてアビボックスベク ター自体に対する予想された免疫学的応答を引き起こす。

数人の研究者らが、組換えフフルルボックス、詳細には家禽を防護するための動 物用ワクチンとして使用するためのライラムを作製することを提案して来た。ボ イル（Ｂｏｙ　１　ｅ）及びクーパー（Ｃｏｕｐａｒ）、ジャーナル・オブ・ジ ェネティック・ピロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）、８７．１５９１ −１８００（１９１１８）及びビンズ（Ｂｌｎｎｓ）ら、イスラエル・ジャーナ ル・オブ：ベテリナクー・メディスン（Ｉｓｒ、　Ｊ、　Ｙｅｔ。

Ｍｅｄ、）　４２．１２４−１２７（１９８Ｅｌ）　、　哺乳類に特異的免疫を 誘起させる方法−として組換えアビポックスウィルスを使用することに関し、提 言されたことも全くなかつたし、また実際に報告されたこともなかった。

ステ４？クル（Ｓｔｉｅｋｌ）とマイヤー（Ｍａｙｅｒ）はフォートシニリッテ ・デア・メディツィン（Ｆｏｒｔｓｃｈｒ、　Ｍｅｄ）　９７（４０）、１７８ １−１７８８（１９７９）で、アビボックス、詳細にはファウルボックスウイル スのヒトへの注射について記載している。しかし、これらの研究は、癌の化学療 法の後遺症にかかっている患者における非特異性免疫を増強するために通常のフ ァウルボックスを使用することだけに関している。組換えＤＮＡ技術は全く用い られていない。を椎動物病原体の抗原をコードするＤＮＡをアビボックス中に挿 入することも、またを椎動物に特異的免疫を誘起させる方法についても全く示唆 されていない。その代わり、この先行技術はヒト宿主の一般的かつ非特異的な強 壮効果に基づいている。

遺伝子組換えを基礎としたより完全な検討を加えることによって、本発明の修飾 組換えウィルス類がいかに作製されるかの理解に役立つであろう。

遺伝子組換えは、一般にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の相同性部分を二つのＤＮ Ａらせん間で交換することである。

（あるウィルスでは、リボ接散（ＲＮＡ）がＤＮＡに置き代わることができる。

）核酸の相同性部分は、ヌクレオチド塩基の同じ配列を持つ核酸（ＲＮＡ又はＤ ＮＡ）の部分である。

遺伝子組換えは、感染した宿主細胞内で新規ウィルスゲノムの複製或いは産生時 に自然に起きることもある。

従って、ウィルス遺伝子間の遺伝的組換えは、二種以上の異なるウィルス又は他 の遺伝子構造体に同時に感染した宿主細胞内で起きるウィルス複製サイクル中に も起こりうる。第一のゲノムのＤＮＡ部分が、第一のウィルスゲノムＤＮＡと相 同のＤＮＡを有する同時感染した第二のウィルスゲノムの部分を組み立てる際に 交換して用いられる。

しかし、組換えは、また、完全には相同とは言えない異なるゲノムにおけるＤＮ Ａ部分間でも起こり得る。例えばかかる部分が第一のゲノムの部分内に遺伝子マ ーカー又は抗原決定基をコードする遺伝子が相同ＤＮＡの一部分に挿入されてい ること以外は別のゲノム部分と相同な第一のゲノム起源のものであるときは、組 換えはなお起こり得るしこの組換えによる産物も、その遺伝子マーカー又は遺伝 子の存在により検出できる。

挿入ＤＮＡ遺伝子配列が修飾感染性ウィルスによって良好に発現されるためには 二つの条件が必要となる。

まず第一に、修飾ウィルスが生存可能であり続けるためには、挿入は前記ウィル スの非必須領域内でなければならない。ファウルボックスもアビポックスウィル スもこれまで示唆されてきたところによると、ワクシニアウィルスに関して記述 されて来た非必須領域と類似の領域を有していない。したがって、本発明のファ ウルボックスの非必須領域は、ファウルボックスゲノムを断片に切断しこの断片 を大きさで分離しこれらの断片を増幅させるためのプラスミド構造体に挿入する ことによって発見された（プラスミドとは、大腸菌を含む多くの細菌で余剰の染 色体要素として見出された小さな環状ＤＮＡ分子である。抗原決定基遺伝子又は 他の遺伝子マーカーのようなりＮＡ配列をプラスミドに挿入する方法は、当技術 で周知であり、マニアチス（Ｍａｎｌａｔｌｓ）ら、モレキユラー・クローニン グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ）　：実験マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド・スプリングａ　／％−バー・ラボ ラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）二 ニーヨーク［１９Ｈ］に詳細に記載されている）。次に、遺伝マーカー及び／又 は抗原をコードする遺伝子をクローン化されたファウルボックス断片に挿入した 。所定の組換えに成功した断片は遺伝マーカー又は抗原の回収が良好であること によって実証でき、かかる断片はファウルボックスゲノムの非必須領域に挿入さ れたＤＮＡより成る断片であった。

挿入ＤＮＡ発現のための第二の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプ ロモーターの存在することである。

プロモーターは、発現させるＤＮＡ配列の上流に位置するように置かなければな らない。アビポックスウィルスの性質は充分に解明されておらずアビボックスプ ロモーターはこれまで当技術で同定されておらず、本発明の一部では他のポック スウィルスの公知のプロモーターを発現スプロモーターはまた、本発明の方法を 実施しかつ本発明の産物を作るために用いられ成功している。本発明によって、 ファウルボックスプロモーター、ワクシニアプロモーター及びエントモボックス プロモーターが組換えポックスウィルスの転写を促進することが判明した。

ボイル（Ｂｏｙｌｅ）とクーパー（Ｃｏｕｐａｒ）はジャーナル・オブ・ジェネ ティック・ビｏｏジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）６７．１５９１（１９ ８Ｂ）で、ワクシニアプロモーターが「（ファウルボックス）ウィルスで作用す ることが予測される」という推測を発表した。この著者らは、ファウルボックス ＴＫ遺伝子の場所を確認しクローン化（ボイル（Ｂｏｙｌｅ）ら゛、ピロロジー （Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１５Ｂ　、　８５５Ｊ８５［１９８７］）　して、これ をワクシニアウィルスに挿入した。このＴＫ遺伝子は発現したが、恐らくそれは 、ワクシニアポリメラーゼの機能によってこのファウルボックスＴＫプロモータ ーの配列が認識されたことによるのだろう。しかし、彼らの推測にもかかわらず 、この著者らはファウルボックスウイルスにワクシニアプロモーターを挿入する ことはしなかったし、またファウルボックスゲノム中で外来ＤＮＡ配列が発現す ることも観察しなかった。他のポックスウィルス由来のプロモーター、例えばワ クシニアプロモーターがアビボックスゲノム中で実際に遺伝子の転写を促進させ ることは本発明以前には公知でなかった。

好ましい実施例の説明 ファウルボックス及びカナジーボックスウイルスが、本発明の外来ＤＮＡを取り 込み組換えによって修飾される好ましいアビボックス種として特に用いられた。

ファウルボックスは、特にニワトリに感染するアビボックスの一種であるが、哺 乳類には感染しない。本明細書中でＰＰ−５と呼ばれるファウルボックス株は、 アメリカンやサイエンティフィック・ラボラトリーズ（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｌ ｅｎｔｉｆｌｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ）　（シエーリング社（ｓｃｈｅｒ ｔｎｇＣｏｒｐ、）の一部門）、マデイソン（Ｍａｄｌｓｏｎ）　％ワイオミン グ州、米国獣医免許番号１６５、通し番号３０３２１　、から入手可能なニワト リ胚由来の市販ファウルボックスウイルスワクチン株である。

本明細書中でＰＰ−１と呼ばれるファウルボックス株は、生後１日目のニワトリ のワクチンに用いるための改良ドウベット（Ｄｕｖｅｔｔｅ）株である。この株 はＯＤＣＰ：Ｐ２５／Ｃ１ｌ：Ｐ６７／２３０９オクト−バー１９８０と呼ばれ る市販ファウルボックスウイルスワクチン株であり、インステイチニートφメク ークス社（１ｎｓｔ１ｔｕｔｅ　Ｍｅｒｌｅｕｘｘ　Ｉｎｃ、）から入手可能で ある。

カナジーボックスはアビボックスの一つの種である。

ファウルボックスと同様に、カナジーボックスは特にカナリヤに感染するが、哺 乳類には感染しない。

本明細書中でＣＰと呼ばれるカナクーボックス株は、ＬＦ２　ＣＥＰ５２４２４ １０７５と呼ばれる市販カナクーボックスワクチン株であり、インステイチニー ト・メリークス社から入手可能である。

本発明の遺伝子組換えによってこれらのアビポックスウィルスに挿入されたＤＮ Ａ遺伝子配列には、原核生物由来のＬａｃ　Ｚ遺伝子、非鳥類（特に哺乳類）病 原体のひとつの抗原である狂犬病糖タンパク（Ｇ）遺伝子、アビポツクスウイル ス以外の病原性鳥類ウィルスの抗原であるターキーインフルエンザ赤血球凝集素 遺伝子、哺乳類ウィルスの一つであるウシ白血病ウィルスのｇｐ５１．３０エン ベロープ遺伝子、鳥類ウィルスの−っであるニューカッスル病ウィルス（テキサ ス（Ｔｅｘａｓ）株）の融合タンパク質遺伝子、哺乳類ウィルスであるネコ白血 病ウィルスのＰｅＬＶエンベロープ遺伝子、鳥類ウィルス／家禽の病気であるラ ウス関連ウィルスのＲＡＹ−１ｅｎｖ遺伝子、鳥類ウィルスであるチキン／ペン シルバニア（Ｃｈｉｃｋｅｎバク質（ＮＰ）遺伝子、鳥類ウィルスである感染性 気管支炎ウィルス（Ｍａｓｓ　４１株）のマトリックス遺伝子とベプロマー遺伝 子、哺乳類ウィルスである単純ヘルペスウィルスの糖タンパクＤ遺伝子（ｇＤ） が含まれている。

前記Ｌａｃ　Ｚ遺伝子の単離は、カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）らがメソッ ズ・インーエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｎ＋ｏ１ｏｇｙ）、 Ｌｕ、２９３−３０１１（１９１１：ｌ）に記載している。狂犬病Ｇ遺伝子の構 造は、例えば、アニリオニス（Ａｎｉｌｉｏｎｆｓ）ら、ネーチ＋　−（Ｎａｔ ｕｒｅ）２９４．２７５−２７８（１９８１）に開示されている。

ワクシニアへの組み込み及び本ベクター内での発現は、キー二４　（［１ｅｎｙ ）ら、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）３１２．１Ｂ：ｌ−１ｅ６（１９８４）に よって検討されている。ターキーインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子は、カワ才 力（Ｋａｖａｏｋａ）ら、ピロロジー（ＶｉｒｏｌｏｇＦ）１５８　、２１８− ２２７（１９１１７）にょって述べられている。ウシ白血病ウィルスｇｐ５１． ３０　ｅｎｖ遺伝子は、ライス（Ｒｌｃｅ）らがピロロジー（ＶｌｒｏｌｏｇＦ ）１３ｇ、８２−９１（１９１１４，）に記載している。ニューカッスル病ウィ ルス（テキサス株）の融合遺伝子は、プラスミツドｐＮＤＶ１０ｇとしてインス ティチニート・メリークス社がら入手可能である。ネコ白血病ウィルスｅｎｖ遺 伝子は、ギルホット（Ｇｕｌｌｈｏｔ）らがピロロジー（Ｖｌｒｏｌｏｇｙ）１ ８１　。

２５２−２５８（１９８７）に記載している。ラウス関連ウィルス１型は二つの クローン、ｐｅｎ　ＶＲＶＩＰＴとｍｐ１９ｅｎｖ（１９０）としてインスティ チニート・メリークス社から入手可能である。

チキンインフルエンザＮＰ遺伝子は、プラスミツドｐＮＰ　３３としてセイント ・ジニード小児研究病院（Ｓｔ、　ＪｕｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）のヨシヒロ・カワ才力（Ｙｏｓｈｌｈｌｒｏ　Ｋａ ｖａｏｋａ）から入手できる。ＩＢＶ　Ｍａｓｓ４１Ｗトリックス遺伝子及びペ ブロマー遺伝子の感染性気管支炎ウィルスのｃＤＮＡクローンは、プラスミツド ｐｌＢＶＭ８３として、インスティチニート・メリークス社から入手できる。

単純ヘルペスウィルスｇＤ遺伝子は、ワトソン（Ｖａｔｓｏｎ）らがサイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１８　、３８１−３８４（１９８２）に記載されている。

以下に更に詳細に記載した組換えアビポックスウィルスは、ワクシニアプロモー ター三種のうちのひとつを組み込む。ワクシニアのＡｖａ　Ｉ　Ｈ領域由来のＰ １プロモーターはワックスマン（ｗａｃｈｓｍａｎ）らがＪ、　ｏｒ　Ｉｎｆ、 　Ｄｌｇ。

■５　、１１８ｇ−１１９７（１９８７）に記載している。さらに詳細に言えば 、このプロモーターはＬ変異ＷＲワクシニア株のＡｖａ　ｌ　Ｈ（Ｘｈｏ　ｌ　 Ｇ）断片に由来し、この中で前記プロモーターは右から左への転写を指示する。

このプロモーターの地図上での位置はＡｖａ　Ｉ　Ｈの左端からおよそ１．８Ｋ ｂｐ（キロベースベア）、ワクシニアゲノムの左端からおよそ１２．５Ｋｂｐで あり、ＨｌｎｄｌｌＩ　Ｃ／Ｎ結合の約８．５Ｋｂｐにある。

このプロモーターの配列は、 （ＧＧＡＴＣＣＣ）−Ａ（ＷＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡπＡＴＡＴＡ ＡＴＡＧＴＣＴＡｍ−ＡＧ’ｒＡＧＧＧｒＡｆｌＡＴｒＡＡＴｒＴｒＡＴｒＧπ ＡＡＡ（ＴｒＧ−（ＡＡＴＴＣ）であり、上記配列中カッコ内の記号はリンカ− 配列である。

前記旧ｎｄｍＨプロモーター（本明細書中でｒＨＩ目及びｒｌｌＢＪとも呼ばれ る）は、標準的な転写マツピング法で明らかとなった。これは、下記の配列を有 する。

ＡＴｒＣＴＩＴＡＴｒＣＴＡＴＡＣＴｒＡＡＡＡＡＡＴＧｉＡＡＡＡＴＡＡＡＴ ＡＣＡＡＡＣＸＸｒｃｒ′ｒＧＡ２ＡＡＡＴｒＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡ ＴＣＡＴＡ−ＡＴｒ ＡｆｆＡＴｒＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴ霜■爪画Ｍπ。

この配列は、ローゼル（Ｒｏｓｅｌ）ら、ジャーナル・オブ・ビｏｏジーＵ、　 Ｖｌｒｏｌ、）８０．４８Ｂ−４４９（１９８Ｂ）によって読み取り枠の上流の 配列として記載されたものと同一である。

１１にプロモーターは、ライチック（Ｖｌｔｔｅｋ）、ジャーナル・オブ・ピロ ロジー（Ｊ、　Ｖｌｒｏｌ、）　４９．３７１Ｊ７８（１９Ｂ４）及びパーツレ ット（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ）　、Ｃらブロシーディングズ・オブ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８２．２０９Ｂ−２１００（１９８５）に記載の通りである。

本発明の組換えアビポックスウィルス類は、当技術で公知の合成ワクシニアウィ ルス組換え体を作製する前述の米国特許第４．８０３．１１２号に開示の方法と 同様に二段階で作製した。

最初に、・ウィルスに挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を、アビポックスウィルスの 非必須領域に相同のＤＮＡを挿入した大腸菌（Ｅ、　ｅｏｌｉ、）プラスミド構 造体に入れる。これとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに結 合させる。プロモーター・遺伝子結合物を次にプラスミド構造体中に入れ、アビ ボックスＤＮＡの非必須領域と相同のＤＮＡに対し両端で隣接させる。得られた プラスミド構造体を大腸菌内で増殖させて増幅させる。（プラスミドＤＮＡは、 外来遺伝物質を保有し増幅するために用いられるが、この方法は当技術で周知で ある。例えば、これらのプラスミド技術については、フレウェル（Ｃ１ｅｖｅｌ ｌ）がジャーナルーオブ・バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１ １０．６６７−６７６（１９７２）に記載している。宿主大腸菌から増幅プラス ミドを単離する技術は、これも当技術で周知であり、例えば、フレウェルらがプ ロシーディングズΦオブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ ８２．１１５９−１１８８（１９６９）に記載している。）大腸菌内で増殖後単 離した増幅プラスミド物質を次に第二段階に用いる。即ち、挿入すべきＤＮＡ遺 伝子配列を含有するプラスミドをアビポックスウィルス（ファウルボックス株Ｐ Ｐ−１又はＰＰ−５など）と共に例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のよう な培養細胞にトランスフェクションさせる。プラスミド中の相同ファウルボック スＤＮＡとウィルスゲノム間の組換えによって、このゲノムの非必須領域におい て非ファウルボックスＤＮＡ配列の存在によって修飾されたアビポックスウィル スが出来る。

本発明及び本発明の多くの利点については例示した以下の実施例でより理解が深 まることであろう。

実施例１　ファウルボックスＲＮＡ転写因子によるワクシニアプロモーターの認 識を示唆する過渡的発現のアッセイ ワクシニアウィルスプロモーター配列に結合し、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈ ＢＳＡｇ）をコードする配列を含有するいくつかのプラスミド構造体を作製した 。各プラスミドの５０μｇを、細胞１個当たり１Ｏｐｆｕのファウルボックスウ イルス又はワクシニアウィルスに感染したＣＥＰ細胞にトランスフェクションさ せた。感染を２４時間進行させ、次に、凍結・融解を三回連続繰り返して溶解さ せた。

この溶解質中の）ＩＢＳＡｇの量を、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の診断薬部（ＤｌａｇｎｏｓｔｌｃＰｉｖｌｓｌ ｏｎ）から市販されているオーストリアＣＡＵＳＲＩＡ）　ｌｌ−１２５Ｉキツ トを用いて評価した。ＨＢＳＡｇの有無を、製造者が事前に設定した陰性カット オフ値に対する未知検体の正味計数（バッググラウト値を減じた検体値）の比と して示す。これを、Ｐ／Ｎ（陽性／陰性）比として示す。

この結果を表１に示す。

異なるワクシニアプロモーター配列３［、つまり、ＤＮＡ複製前のワクシニア感 染初期に見られるＰ１プロモーター、ＤＮＡ複製開始後のワクシニア感染後期に 見られる１１にプロモーター、ワクシニア感染の初期及び後期の雨期に見られる 旧ｎｄｎＩ　Ｈ（ＨＨ）プロモーター、を用いた。これらのプロモーターについ ては、本明細書において既に記載しである。

上記データから、感染細胞の溶解質中に産生されたＨＢＳＡｇが、ファウルボッ クス又はワクシニア転写因子によってワクシニアプロモーターが認識された結果 であることが示唆される。

ｐＭＰＫ　２２．１８９　ファウルボックス　ＩＩＫプロモーター　１４ワクシ ニア　に結合したＳＡｇ２ ｐＰＤＫ　２２．５　ファウルボックス　ＩＩＫプロモーター　９２．６ワクシ ニア　に結合したＳＡｇ　５．８ｐＲｖ６６８　７ｙ？′Ｌ′ｙＮｙ９Ｘ　１１ ！２°−１−ｙ−Ｈｙ、４ワクシニア　に結合したＳＡｇ （プラスミド無い　ファウルボックス　１．１（プラスミド無い　ワクシニア　 １．８ＭＭＰＫ　２２．１ＢＳ　（ウィルス無い　１．８実施例２ＬＡＣＺ遺伝 子含有組換えファウルボックスウイルスｖＦＰ−１の作製 ファウルボックスウイルスの非必須領域内のひとつの断片を以下のようにしてそ の位置を同定して単離した。

ヌクレアーゼＢａ１ｌｌを用い、ＦＰ−５ＤＮＡの一重鎖末端のヘアピンループ を除去した。ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ（大）フラグメントを用いてプラ ントエンドを生じさせた。ループ除去後、Ｂｇｌ　ＩＩよる制限酵素消化によっ て前記断片を作製した。この消化によって一連のＰＰ−５断片ができたが、これ らはアガロースゲル電気泳動で分離した。

８．８ＫｂｐのＢｇｌ　ｍプラントエンドを有する断片を単離し、Ｂａ−旧とＳ ｓ＋ａ　Ｉで切断しである市販のプラスミドｐＵＣ９と連結させた。生成したプ ラスミドをＰＲＶＢ９ｇと命名した。

ファウルボックス断片の大きさを小さくするため、このプラスミドを旧ｎｄＩ［ ［で切断してさらに二つの断片を生じさせた。６．７Ｋｂｐの断片を捨て、残る ４、７Ｋｂｐの断片を二つ連結し新規プラスミドｐＲＶ６９９を作製した。

このプラスミドにＩＩＫプロモーターで転写促進されるＬａｃ　Ｚ遺伝子を組み 込むため、ｐＲＶ８９９をＥｅｏＲＶ　テ切断した。このＥｃｏＲＶは前記プラ スミドを１カ所でのみ切断する。このＩＩＫプロモーターで転写促進されるＬａ ｃ　ＺセグメントをプラントエンドのＰｓｔ　ｌ−Ｂａ５＋旧断片として挿入し 、新規プラスミドｐＲＶ７０２を作製した。このＬａｃ　Ｚクローンは、前記引 用文献中でカサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）らが記載しているようにｐＭｃ１ ８７１由来である。前記１１にプロモーターは％　Ｂａｓ旧リンカ−によりＬａ ｅ　Ｚ遺伝子の第８コドンに連結された。

米国特許第４．８０３．１１２号記載のワクシニアに関する組換え技術を用い、 このｐＲＶ７０２プラスミドを次にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖させ たファウルボックスウイルスＦＰ−５に組換えた。この時、ｖＦＰ−１を作製す るため以下の操作を用いた。ｐＲｗ７０２０ＮＡ５０μｇを全ゲノムファウルボ ックスＤＮＡ０．５Ｍｇと混合し、最終容量を１００μ４とした。２．５Ｍ　Ｃ ａＣＪ！　２を１０ｕ１ｓ及び４０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓｓ３００ｍＭＮａＣＪ２． １．４ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，１ｈＭ　ＫＣＩ、１２＋ｅＭデキストロースから調 整した２　Ｘ　ＨＥＢＳ緩衝液（ｐＨ７）１１０μ４をこれに添加した。室温に ３０分間装いた後、５　ｐｆｕ／細胞となるように希釈したファウルボックスウ イルスブール２００μｉを添加した後、この混合物を、初代ＣＢＦ単層を含む６ ０ｍディシニ上に接種した。この時、２％ウシ胎児血清＜ＦＢＳ）含有イーグル （Ｅａｇｌｅｓ）培地０．７　ｍも添加した。このプレートを８７℃で２時間イ ンキュベートした後、２％ＰＢＳ含冑イーグル培地３にを添加しプレートを３日 間インキュベートした。細胞を、凍結・融解を３回連続的に繰り返すことによっ て溶解させた後、新形成ウィルス粒子を組換え体存在下にアッセイした。

１１にプロモーターで転写促進されるＬａｃ　Ｚ遺伝子をファウルボックスｐｐ −ｓゲノム中に組み換えたことによる挿入が成功したことの証拠は％　Ｌａｃ　 Ｚ遺伝子の発現を試験することによりて得られた。Ｌａｃ　Ｚ遺伝子は酵素β− ガラクトシダーゼをコードし、この酵素はクロモゲンである５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を切断し青色のイ ンドリル誘導体を放出するＯ青色プラークを陽性組換え体として選択した。

Ｌａｃ　ＺのファウルボックスＦＰ−６ゲノムへの挿入とその発現の成功は、ｖ ＰＰ−１感染ＣＥＰ　、　ＢＳＣ（サル腎細胞株−ＡＴＣＣＣＣＬ２Ｇ）、ＶＥ ＲＯ（サＪｌ、腎細胞株−ＡＴＣＣＣＣＬ　８１）、及びＭＲＣ−５（ヒト二倍 体腔細胞株−ＡＴＣＣＣＣＬ　１７１）を用いた標準法及び市販の抗血清とのβ −ガラクトシダーゼの免疫沈降によっても確認した。

組換えウィルスｖＦＰ−１によるβ−ガラクトシダーゼの発現を、さらに、ウサ ギ及びマウスにこのウィルスを接種し、接種動物血清中のβ−ガラクトシダーゼ タンパクに対して生じた抗体の力価の接種後の上昇を測定しそれが良好であるこ とによって、インビボでも確認した。

特に、前記組換えｖＦＰ−１は宿主細胞不純物から精製され、ウサギ２匹の両側 のそれぞれ２カ所に皮肉接種した。

各ウサギは統計で１０”　ｐｆｕを接種された。

−週間おきに動物から採血し、その血清を市販の精製β−ガラクトシダーゼ標品 を抗原として用いたＥＬＩＳＡアッセイで検出した。

この組換えｖＦＰ−１を接種されたウサギとマウスの双方ともに、β−ガラクト シダーゼタンパクに対する免疫応答を生じていることがＥＬＩＳＡ法で検出され た。両種において、接種−週後にこの応答が検出できた。

実施例３　ファウルボックスウイルスＦＰ−５からの狂犬病Ｇ遺伝子及びＬＡＣ Ｚ含有組換えウィルスｖＦＰ−２の作製０．９ＫｂｐのＰｖｕ　ＩＩ断片をＦＰ −５から得、標準的手法によりｐＵｃ９の二つのＰｖｕ　ＩＩ郡部間挿入した。

生成した構造物ｐＲ１１１６８ｆｔ、２　Ｈｌｎｃ　１１部位を２カ所、およそ ａｏｂｐ離れた位置１：Ｐｖｕｎ断片内に非対称的に有しており、これによって この断片から長腕と短腕を形成させる。

オリゴヌクレオチドアダプターを、ＰＳｔｌ及びＢａｇ　Ｒ１部位を導入するた めの公知の技術を用いて、これらのＨ１ｎｃｎ部位間に挿入し、プラスミドｐＲ Ｖ８９４を作製した。

次に、このプラスミドをＰｓｔ　ＩとＢａｇ旧で切断し、既に述べた連結ｌｌＫ ワクシニアプロモーターを有するＬａｃ　Ｚ遺伝子を挿入して新規プラスミドｐ ＲＷ７００を作製した。

Ｐ１プロモーターで転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子を作製するため、狂犬病Ｇ遺 伝子の５′末端に近接したＢｇＪ！　１１部位（キーニイ（ＫｌｅｎＦ）ら、上 記引用文献参照）をプラントエンドにし、既に述べたＰ１プロモーターの一重鎖 部分を埋めたＥｃｏ　Ｒ１部位に連結した。

この構造体をｐＲＷ７００のＰｓｔ　Ｉ部位に挿入し、その中に外来遺伝子配列 Ｐ１−狂犬病ＣＩＩＫ−ＬａｃＺを有するｐＲＶ７３５．ｔプラス、ミドを作製 した。この挿入は、ＦＰ−５ドナ一配列のＰｖｕ　ＩＩ−旧ｎｅｌＩ長腕がＬａ ｃ　Ｚ遺伝子に対して３′側になるように、プラスミド中で位置づける。

得られた最終構造体は、既に述べた組換えファウルポックスウイルスｖＦＰ−２ 作製法によってニワトリ胚線維芽細胞に感染／コンフェクションさせることによ ってファウルボックスウイルスＦＰ−５と組み換えた。この組換えウィルスはＸ −ｇａｌ染色によって°選択した。

前記Ｌａｃ　Ｚ遺伝子と狂犬病Ｇ遺伝子の両者が適切に挿入されかつ発現された ことを、下記の様々な追加方法で確認した。

特異抗体を用いた免疫蛍光法によって狂犬病抗原の位置を決定すると、ｖＰＰ− ２ウイルスに感染した鳥類細胞又は非鳥類細胞表面上で狂犬病ウィルスが良好に 発現していることが示された。

既に述べたように、ｖＰＰ−２ウイルスに感染した鳥類又は非鳥類細胞にる狂犬 病抗原及びβ−ガラクトシダーゼの発現は、免疫沈降法で確認した。

本発明のｖＦＰ−２に関する実施態様が狂犬病Ｇ遺伝子及びβ−ガラクトシダー ゼ遺伝子を保育する組換えウィルスの成功例であることのもうひとつの証拠は、 ウサギ２匹にｖＰＰ−２ウイルスを接種することによって得られた。

二匹のウサギに対して１匹当たりＩ　Ｘ　１０”　ｐｆｕのｖＦＰ−２を皮肉に 接種した。１週問おきにウサギから採血して血清をＥＬＩＳＡで試験し、狂犬病 糖タンパク質及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質の特異抗体の存在を検出した 。

下記の表■に載せたように、ウサギ２０５は接種１週後において抗β−ガラクト シダーゼ抗体をＥＬＩＳＡ試験で検出可能な量で示した。これは２週目には４０ ００分の１の力価に上昇し、接種後５週まで持続した。抗原捕獲ＥＬＩＳＡアッ セイを用いるとウサギ２０５の血清は、接種後３週から１０週まで検出可能量の 抗狂犬病抗体を示した。

表　■ 狂犬病抗原及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質に前採血　抗β−ガラクトシダ ーゼ　０ １週　５００ ２−５週（各週）　４０００ ６週　５００ ９週　２５０ 前採血　抗狂犬病　０ ３週　２００ ６週　２００ １０週　１００ 本実施例は、前記狂犬病Ｇ遺伝子がＦＰ−５以外のファウルボックス株、特にＦ Ｐ−１と呼ばれるファウルボックスウイルスの別の株によって完全に発現される ことを示すものである。

実施例３のように、ｐｐ−ｓにおけるのと同様に０．９ＫｂＰのＰｖｕ　ＩＩ断 片が非必須領域を含有するとの仮定のちとに、ＦＰ−１からこの断片を得た。

この断片をｐＵＣ９の二つのＰｖｕ　ＩＩ部位に挿入し、ｐＲＶ７３１．１５Ｒ と命名したプラスミドを作製した。

このプラスミドは、Ｐｖｕ　ＩＩ断片内に約３０ｂＰ離れた非対称の位置に二つ の旧ｎｃＩＩ部位を有し、これによって、本断片の長腕と短腕を形成する。

市販のＰｓｔリンカ−１（５’　）−ＣＣＴＧＣＡＧＧ−（３’　）を二つの旧 ｎｃ１１部位に挿入してプラスミドｐＲＷ７４１を作製した。

ＨＨプロモーターで転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子をＰｓｔ　１部位でこのプラ スミドに挿入し、新規プラスミドｐＲＶ７４２Ｂを作製した。ＣＥＰ細胞の感染 ／トランスフェクションによってこのプラスミドをＦＰ−１と組み換えることに よって、ウィルスｖＰＰ−３を得た。

前記ＨＨプロモーターによって転写促進される読み取り枠のＡＴＧ翻訳開始コド ンを、ＨＨプロモーター内のＥｃｏＲＶ部位と前記狂犬病Ｇ遺伝子内の旧ｎｄＩ Ｉ［部位とをつなぐ合成オリゴヌクレオチドを用いて狂犬病Ｇ遺伝子の開始コド ン上に重ねた。かかるＨＨプロモーターによって転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子 の５′末端を公知の技術を用いいて修飾し、Ｐｓｔ　Ｉ部位をひとつ含有させた 後、この構造体をｐＲ１４１）Ｐｓｔ　１部位に連結させ１）ＲＶ７４２　Ｂを 作製した。このプラスミド中におけるこの構造体の位装置は実施例３で既に述べ たｐＲＶ７３５．１におけるものと同じである。

実施例２に述べたように、組換えを行った。生成した組換え体をｖＦＰ−３と呼 ぶ。

ｖＰＰ−３ウイルスに感染した鳥類及び非鳥類細胞の両者による狂犬病抗原の発 現は、既に述べた免疫沈降法及び免疫蛍光法で確認した。

本発明のｖＰＰ−３に関する実施態様が狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換えウィル スの成功例であることのもうひとつの証拠が、組換えウィルスをウサギ２匹に皮 肉接種することによって得られた。ウサギ２匹を１匹当たりＩ　Ｘ　１０８ｐｆ ｕのｖＰＰ−３で皮肉接種した。これらのウサギは双方ともに、典型的なボック ス病巣を生じ、これは接Ｎ５〜６日後に最大の大きさに達した。ウサギから毎週 採血して血清をＥＬＩＳＡで試験し、前記狂犬病糖タンパクに特異的な抗体の存 在を検出した。

５匹のラットそれぞれにｖＰＰ−３を５　Ｘ　１０７ｐｒｕ皮内接種した。全部 の動物に病巣が残った。

ウサギ及びラットともに、接種後２週までに検出可能なレベルの狂犬病に特異的 な抗体を産生じた。親のＰＰ−１ウイルスを皮肉接種された対照のウサギ２匹は 、検出可能なレベルの抗狂犬病抗体を全く示さなかった。この抗体の応答が実験 に用いた動物体内における狂犬病抗原の組換えウィルスによるデノボ合成によっ て誘起されたのではなくて、接種ウィルスと共に持ち込まれたか又は組換えファ ウルボックスウイルス膜に組み込まれたかによって偶然に狂犬病抗原が導入され て起こった可能性を除外するために、このｖＰＰ−３ウイルスを化学的に不活化 しウサギに接種した。

精製ウィルスを４℃で一晩、０．００１％のβ−プロピオラクトンの存在下に不 活化した後、遠心分離によりペレットとした。ペレットにしたウィルスを１０ｍ Ｍ　）リス緩衝液中に集めて超音波処理し、力価を検定して感染ウィルスが全く 残っていないことを確めた。ウサギ２匹に不活化ｖＰＰ−３を皮肉接種し、同量 の未処理の組換え体を別の２匹に皮肉接種した。病巣の大きさをモニターした。

未処理ｖＦＰ−３を受けたウサギ２匹共、接種後５日で４−５＋等級の典型的な 病巣を生じた。不活化ウィルスを接種したウサギもまた病巣を生じたが、これら は接種後５日で２＋等級であった。

ウサギを一週おきに採血し、血清をＥＬＩＳＡで試験し、狂犬病の特異抗体及び ファウルボックスの特異抗体の存在を調べた。結果を以下の表■に示した。

この試験においては、力価終末点（血清希釈の逆数として示す）を、抗原投与前 の血清の吸収値を差引いた後、恣意的に０．２と定めた。ウサギ２９５と３１８ は共に生きたウィルスを投与され、狂犬病糖タンパク及びファウルボックスウイ ルス抗原に対し免疫応答を生じた。ウサギ３０３と３２０もファウルボックスウ イルス抗原に対しては免疫応答を生じたがその力価は低かった。このウサギはど ちらも狂犬病糖タンパクに対して検出可能な応答を生じなかった。

この知見から、ウサギに生じた免疫応答が組換えウィルスが保有する狂犬病糖タ ンパク遺伝子のデノボ発現に起因し、接種ウィルス内に偶然に持ち込まれた糖タ ンパクに対する反応ではないことが示唆される。

組換えによってファウルポックスゲノム中に挿入された外来遺伝子の発現には、 プロモーターの存在が必要である。ＨＨプロモーターを欠いていること以外ｖＰ Ｐ−３と同一の組換え体ｖＦＰ−５を作製してこのことを示した。この組換え体 に狂犬病遺伝子が存在することを核酸のハイブリッド形成により確認した。しか し、このウィルスに感染したＣＥＰ細胞培地中に狂犬病抗原は全く検出されなか 製するか否かを決定するためのインビトロ継代実験鳥類１種及び非鳥類２種の３ 種の細胞系に対しＦＰ−１親株又は組換えｖＰＰ−３を接種して実験を行った。

ＣＥＰ　。

ＮＲＣ−５、及びＶＥＲＯ（７）　ソれぞれ２枚の皿に、ＰＰ−１又はｖＦＰ− ３を細胞当り１０ｐｆｕの接種の多重度で接種した。

３日後に・それぞれについて一枚の皿から細胞を採取シタ・凍結・融解を連続三 回繰り返し、前記ウィルスを放出させた後、同細胞系統の新鮮単層に再接種した 。これを％６回連続的に継代し、実験の最後に各継代の検体の力価を検定してＣ ＥＰ単層上におけるウィルス感染性を調べた。

結果を表ＩＶＡに示した。この結果から、ＣＥＰ細胞でＰＰ−１およびｖＰＰ− ３の双方の連続継代が可能であること、しかし、前記非鳥類細胞系統２種のいず れにおいても不可能であることが示唆された。感染性ウィルスは、ＶＥＲＯ又は ＮＣＲ−５細胞中において、３又は４継代後には検出できない。

二番目の皿は直接滴定で検出不能のウィルスが増幅後に許容ＣＥＰ細胞で検出で きるかどうかを決めるために用いられた。

３日後に、二番目の皿の細胞をかき取って採取し、この細胞の３分の１を溶解し 新鮮ＣＥＰ単層上に接種した。

細胞変性効果（ＣＰＥ）が最大となつた時又は接種後７日目に、この細胞を溶解 しウィルスの収率を滴定した。結果を表ＩＶＢに示す。ＣＥＰ細胞中における継 代を用いて存在るウィルスの全てを増幅した時、このウィルスは４又は５組代後 には検出できなかった。

絶えず感染している細胞を確立しようと試みたが失敗した。

さらに、非鳥類細胞において連続してウィルスが発現する証拠を検出することを 試みたが、上記のウィルスの力価の検定に用いた検体を標準イムノドツトアッセ イに使用した。このアッセイでは、抗ファウルボックス抗体及び抗狂犬病抗体を 用い、それぞれの抗原の存在を検出した。これらのアッセイの結果で力価検定の 結果を確認継ｆｔｌ　１１”　４．ｇ　４．１　ｕ　５．４　１．！！　＠、ｔ 　！、１　１Ｊ　・Ｊ　４．１　！’、１コ＠、４１．４１．０１４１．１４． ４４　１、Ｉ　Ｎ、Ｄｂｌｌ、０　１．！　１１．０　１．＋１５　＠４　Ｎ、 Ｄ　１１０　［Ｈ，Ｄ　Ｈ，Ｄ継代１　＠、４”　＠、１　１４　＠、５　１． １　＠、４！　７Ｊ　ＩＪ　＠、０　１Ｊ　１．１　１．８３　１！　＠、Ｉ　 Ｓ、＄　５．９　１．１　１１４１＠４ＪＬ、５Ｓｊ４．１１１ Ｓ　Ｌ、Ｓ　４．１　１１．ＯＬｌ　４．１　４．７実施例６　他のファウルボ ックスＦＰ−１組換え体：ｖＦＰ−６、ｖＦＰ−７、ｖＦＰ−８及びｖＰＰ−９ 組換えウィルスｖＰＰ−６とｖＰＰ−７を以下の操作で作製した。

ＦＰ−１の５．５Ｋｂｐ　ＰｖｕＩＩ断片をｐＵｃ９の二つのＰｖｕ　ＩＩ部位 間に挿入し、プラスミドＰＲ１１１７３１，１３を作製した。次に、このプラス ミドをその唯一の旧ｎｃｎ部位で切断し、ｌ１Ｂ−プロモーターを有しかつプラ ントエンドとした狂犬病Ｇ遺伝子を挿入してプラスミドｐＲＶ７４８Ａ及びｐＲ Ｖ７４８　Ｂを作製した。これらのプラスミドは、その挿入の向きが反対である ことを示している。プラスミドＩ）ＲＶ７４８ＡとＢを次に別々に用いて、ＰＰ −１ウイルスと共にＣＥＰ細胞にトランスフェクシヨンさせ、組換えによってそ れぞれｖＦＰ−６及びｖＰＰ−７を作製した。この遺伝子座を座ｆ７と名付けた 。

ＦＰ−１の１０Ｋｂｐ　Ｐｖｕ−ＩＩ破片をｐｔｌｃ９の二つのＰｖｕ　ＩＩ部 位間に挿入しｐＲＶ７８１．１５を作製した。このプラスミドを次に唯一のＢａ 履旧部位で切断し、次にＩＩＫプロモーターを有するＬａｃ　Ｚ遺伝子断片を挿 入し、この挿入の向きが逆であるｐＲＶ７４９ＡとｐＲＶ７４９　Ｂを作製した 。これらのドナープラスミドをＰＰ−１と組換えて、それぞれｖＦＰ−８及びｖ ＦＰ−９を得た。この遺伝子座を座ｆ８と名付けた。

ｖＰＰ−８及びｖＦＰ−９は、Ｘ−ｇａｌによって検出されるＬａｃ　Ｚ遺伝子 を発現した。ｖＰＰ−６とｖＰＰ−７は、狂犬病特異抗血清によって検出される 狂犬病Ｇ遺伝子を発現した。

実施例７　狂犬病生ウィルスによる攻撃から動物を保護するためのｖＰＰ−３に よる免疫 メスのＳＰＦマウス（４−Ｂ週齢）２０匹のグループを、マウス１匹当たり０． ７乃至１ｆ、７　ＴＣＩＤ５ｏの範囲の投与量で足証にｖＰＰ−３５０μ４を接 種した（ＴＣＩＤ５−ち組織培養感染量は、組織培養細胞の５０％が細胞変性効 果を受ける量である）。接種後１４４日目各群のマウス１０匹を層殺し、血清検 体をＲｐｐｔ試験のアッセイ用に採取した。残りの１０匹のマウスに対し、狂犬 病０７８株を大脳に１０ＬＤ５０の量で接種して攻撃した後、１４４日目生存数 を数えた。

結果を以下の表ＶＡに示した。

６．７　１．９　８７１０ ４．７　１．８　０／ｌ。

２．７　０．４　０／１０ インヒビジヨン）試験、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓｌｎ　Ｒ ａｂｌｅｓ　ｓ第３版、ＷＨＯジュネーブで測定。

本実験を１２．ＳＬ、５ｏの量の狂犬病ウィルスで攻撃して繰り返した。結果を 下記の表ＶＢに示す。

４．７　２．１　２／１０ ２．７　０．Ｂ　Ｏ／８ ０．７　０．８　０１８ イヌ、ネコ６２匹に対して、組換えｖＰＰ−３の１０　ｇ　ｌ。

ＴＣＩＤ５ｏの８倍量を一回静脈接種し免疫した。さらに、年齢および体重が同 等のイヌ２匹とネコ４匹を非ワクチン接種対照群とした。−週おきに全動物から 採血した。９４日目に、各イヌに対してインスティチ二−ト・メリークス社から 入手した狂犬病ウィルスＮＹ株の唾液腺ホモジネート０．５城を２回、側頭筋に 接種して攻撃した。総投与量は大脳経路によるマウスＬＤ５ｏの１万倍に相当し た。ネコ６匹を同様に、同ウィルスサスペンションの０．５５１ｉ！を２回、首 の筋肉に接種して攻撃した。単２１匹当たりの総投与量は、大脳経路のマウスＬ Ｄ５ｏの４万倍に相当した。

動物を毎日観察した。非ワクチン接種の動物は全て、狂犬病の症状を示して表■ に示した日に死亡した。ワクチン接種を受けた動物は攻撃に対して生き残り、対 照動物の最後の１匹が死亡した３週間後まで観察した。結果を以下の表■に示し た。

表　■ ネコ７０１６　ｖＦＰ−３”　０　２．２ｂ　２．４　２．４　１．５　＋ＴＩ Ｏｃ　０　０　０　０　０　ｄ／１２Ｔ４１　ｃ　０　０　０　０　０　ｄ／１ ３Ｔ４２　ｃ　０　０　０　０　０　ｄ／１２イヌ４２６　ｖＦＰ−３００，８ １，０１，１１，２＋４２７　ｖＦＰ−３０Ｌ、Ｓ　２．８２．２１．９　＋５ ５　ｃ、ｏ　ＯＯ００ｄ／１５ ８２４０　ｃ　０　０　０　０　０　ｄ／１６ａ−ｖＦＰ−３を接種したネコ、 イヌ共に８１ｏｇｘｏＴＣＩＤｓｏ量を静脈に投与した。

ｄ−死亡動物／攻撃後死亡するまでの日数。

さらに、組換えウィルスｖＦＰ−２とｖＦＰ−３を幾つかの異なる経路でウシに 接種する実験を行つた。

接種動物に対し、抗狂犬病抗体を６．１４．２１．２ｇ及び３５日に試験した。

以下の表■Ａに示すように、全動物が狂犬病抗原に対し血清学的反応を示した。

＋有意差なし を再接種され、この狂犬病抗原に対し既往反応を示した。

１４２１番を除くウシ全てに対し、ワクチン再接種による追加免疫を行った。１ ４２１番のウシには再度筋注で接種した。

ＲＦＰＩ力価を５５．５７．６３．７０．７７及び８８Ｅ］後に測定した。

結果を表■Ｂに示した。

表■Ｂ 日数　５５　５７　８３　７０　７７　１１８ウシ番号 １４１９　１．７　１．５　２．９　２．９　２．８　２．９１４２０　１．０ 　０．５　１．９　．２．３　２．２　２．０１４２１　１．３　１．２　２． ９　２．７　２．５　２．５１４２Ｂ　１．０　０．７２．４　２．５　２．５ 　２．２１４２３番の動物のデータがｖＦＰ−２による以外、全てのデータはｖ ＦＰ−３である。

ウシ、ネコ及びウサギも既知量のファウルボックスウイルスを皮肉接種し、約１ 週後に動物からかさぶたを採取した。これらを破砕後生理的食塩水中に懸濁し、 ウィルス量を測定するために力価を検定した。

残存量の感染ウィルスしか回収できなかった。このことから、インビボでは全く 増殖性感染が起こらないことが示唆される。

実施例８　ｖＰＰ−３によるニワトリの接種組換えフ７ウルボックスウイルスｖ ＰＰ−３をニワトリに接種し、このベクターの増殖的複製を許容する系における 組換えファウルボックスウイルスによる外来ＤＮＡの発現を示した。

白色レグホーンニワトリに対し、ｖＰＰ−３を１０ｇ　ｌ。

ＴＣ！Ｄ５ｏの９倍量で筋肉から、又はｖＰＰ−３をｌｏｇｌｏＴＣＩＤ５゜の ３倍量で真に貫通させて接種した。血液検体を採取し、ワクチン接種２１日後に 狂犬病抗体力値をＲＦＦＩ試験で調べた。接種したニワトリの２１日目の力価は 、対照群の２１日目の力価に比し非常に高かった。すなわち、非感染対照群の平 均力価は０．８であったが、筋肉接種したニワトリの平均は１．９、貫通接種し たニワトリの平均は１．２であ本発明の組換えアビポックスウィルスを用いて鳥 類病原体に対して鳥類を免疫させることができる。

したがって、ファウルボックスウイルスＦＰ−１由来でＡ／ターキー／アイルラ ンド八へ７１１／１１３（ＴＹＨＡ）の旧ｎｄｎ［Ｈプロモーターで転写促進さ れる赤血球凝集素遺伝子（Ｈ５）を含有する新規プラスミドｐＲＶ７５９　（下 記に記載）を用いて、親ウィルスＰＰ−１に同時に感染しているＣＥＦ細胞にト ランスフェクトさせた。組換えファウルボックスウイルスｖＦＰ−１１を本明細 書中で既に述べた技術によって得た。

ｖＰＰ−１１感染細胞による赤血球凝集素分子の合成は、特異的抗Ｈ５抗体と標 準的手法を用い、代謝により放射性標識した感染細胞溶菌液からの免疫沈降で確 認した。分子量約６３Ｋｄ　（キロダルトン）の赤血球凝集素前駆体の特異的免 疫沈降と分子量４４および２３Ｋｄの２つの分解生成物が明らかとなった。非感 染ＣＥＰ細胞または親つィルスＦＰ−１感染細胞の溶菌液からはこのようなタン パクは全く沈降しなかった。

組換えファウルボックスｖＰＰ−１１に感染した細胞中で産生されるＨＡ分子が 細胞表面上で発現されることを調べるために、免疫蛍光による研究を行った。組 換えファウルボックスウイルスｖＦＰ−１１に感染したＣＥＰ細胞は表面を強く 蛍光染色した。親ウィルスＰＰ−１に感染した細胞では、全く蛍光が検出されな かった。

プラスミドｐＲＶ７６９を以下のようにして作製した。

ｐＲＶ７４２Ｂ　（実施例４参照）をＰｓｔ　Ｉによる部分消化で直線状としこ の断片をＥｃｏＲＶで再切断し狂犬病Ｇ遺伝子を除去し、約３．４Ｋｂりの残存 断片上にＯＨプロモーターを残した。これをアルカリホスファターゼ処理して、 ＡＴＧにおいてこのＨ１ｌプロモーターとＴＹＨＡを結合するため合成オリゴヌ クレオチドを挿入しｐＲＶ７４４を作製した。

このプラスミドをＤｒａ　Ｉで部分消化し直線状となし、この直線状断片をＳａ ｌ　ｌで切断して大きい方の断片を再び単離しアルカリホスファターゼ処理した ・最後に、カッ才力らがピロロジー、１５８．２１ｇ−２２７（１９８７）で開 示したように、この単離されたＴＹＨＡのＳａｌ　Ｉ−Ｄｒａ　Ｉコード配列を ｐＲＶ７４４ベクターに挿入することによってｐＲＶ７５９を作製した。

組換えファウルボックスウイルスｖＦＰ−１１の免疫原性を調べるため、ニワト リと七面鳥でワクチン接種と攻撃実験を行った。

無菌白色レグホーンに対し、２日齢および５週齢において、家禽にファウルボッ クスウイルスを商業的にワクチン接種する際に用いられる倍量（ｄｏｕｂｌｅ’ 　ｎｅｅｄｌｅ）で真鯛穿刺してワクチン接種を行った。ｖＦＰ−１１を６×１ ０５ｐｆｕ含有する約２μｉを各ニワトリに投与した。年長のニワトリはワクチ ン接種前に採血し、また、全てのニワトリに対し、攻撃前および２週後に採血し た。

比較のため、もう一群のニワトリに不活性化Ｈ３Ｎ２株の油中水型エマルジョン から成る従来のＨ５ワクチンを接種した。

不活性化Ｈ３Ｎ２ワクチンは、１１日齢胚のニワトリ卵で増殖したＡ／？ラード （Ｍａｌ　１ａｒｄ）／ＮＹ／１８９７８２（Ｈ５Ｎ２）から調製した。ＨＡ力 価８００１０．１　ｊｔｉ！および感染力値１０８・５１０．１ｍの感染した漿 尿液を０．１％プロピオラクトンで不活性化し、ストーン（Ｓｔｏｎｅ）ら、エ ビアン・ディジージス（Ａｖｌａｎ　０１８％　２２，６６６−８７４（１９７ ｇ）およびブルッグ（Ｂｒｕｇｈ）ら、プロシーディングズ・オン・セカンド・ インターナショナルシンポジウム・オン・エビアン・インフルエンザ（Ｐｒｏｃ 、　５ｅｃｏｎｄ　Ｉｎｔｅｒ、　Ｓｙｍ、　ｏｎ　Ａｖｉａｎ　Ｉｎｆｌｕｅ ｎｚａ）、２８Ｂ−２９２（１９８６）に記載の如く、油中水型エマルジョン中 に懸濁した。０．２　ｍの容量のワクチンを静脈経路で２日齢、５週齢のＳＰＰ 白色レグホーンニワトリの大腿筋肉内側皮膚に投与した。

３群、４群のニワトリに対しては、親ウィルスｐｐ−ｔを投与するか、全くワク チンを投与しなかつた。

各ニワトリの外鼻孔に０．１　ｍを投与し、病原性の高いＡ／ターキー／アイル ランド７１８７ｇ／Ｈ（Ｈ５ＮＩｉ）またはＡ／チック（Ｃｈｉｃｋ）／ペン（ Ｐｅｎ）八３７０／１１８（Ｈ５Ｎ２）インフルエンザウィルスをＬＤ　の約１ ０”倍量でニワトリに攻撃させた。２日齢ニワトリはワクチン接種後６週目に攻 撃し、５適齢ニワトリはワクチン接種後５週目に攻撃した。ニワトリは、顔面お よびトサカの膨潤およびチアノーゼ、さらに足の出血（こうしたニワトリはしば しば立つことができなかった）などによって示唆される病気の徴候、麻痺および 死亡について毎日観察した。死亡のほとんどが感染後４〜７日に起きた。感染後 ３日目に、各生存ニワトリの気管および総排出腔から線棒で検体を取り、胚発生 卵に接種してウィルスのスクリーニングを行った。野牛型または組換えファウル ボックスウイルスを接種したニワトリは、真鯛に典型的な病巣を発症した。針を 刺した部位に３日目までに膿庖が形成され、細胞浸潤がかさぶた形成とともに続 き、７日目までに回復した。二次的な病巣は形成されず、非ワクチン接種の接触 したニワトリに伝染した証拠は全く見られなかった。攻撃実験の結果を表■に示 し、関連血清学的所見を表■に示す。

月以上もニワトリは防御された。

ｖＦＰ−１１により発現されたＨ５は、また七面鳥において防御的免疫応答を誘 起する。異系交配白色七面鳥を、２日齢、４週齢において、既に述べたように真 鯛接種によりワクチン接種した。結果を表Ｘに示した。

相同Ｔｙ／Ｉｒｅウィルスによる攻撃に対し、有意の生存が双方の年齢群で見ら れた。非ワクチン接種の接触七面鳥をワクチン接種七面鳥と一緒に飼い、組換え ウィルスの伝染を試験した。これらの七面鳥は攻撃に耐え生存することがなかっ た。

実施例１１　ニワトリインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）ｆｆｉ伝子発現ファ ウルボックスＦＰ−１組換えｖＰＰ−１２の作製プラスミドｐＮＰ＄３は、イン フルエンザウィルス　チキン／ペンシルバニア／ｌ／８３核タンパク質遺伝子（ ＮＰ）のｃＤＮＡクローンを含有する。およそ１．６ＫｂｐのＮＰ遺伝子の５′ と３′末端のみが決定されていた。ＮＰをプラントエンドとした５　’　Ｃ１ａ 　Ｉ　−ＸｈｏＩ　３　’断片として、ＰＮＰ３３からＳ厘ａ　Ｉで消化したｐ ＵＣ９の３′末端のＥｃｏ　Ｒ１部位に移し、ｐＲ１７１４を作製した。ＮＰの 翻訳開始コドン（ＡＴＯ）は下記のアンダーラインを付したＡｈａ　ｎ部位を有 していた：ＡＴＧＧＣＧＴＣ，既に述べたワクシニアＨ６プロモーターを、二重 鎖合成オリゴヌクレオチドでこのＮＰに結合した。この合成オリゴヌクレオチド は、Ｅｃｏ　ＲＶ部位からそれのＡＴＣまでのＨｅ配列を含有し、Ａｈａ　ＩＩ ｎ部位ＮＰコード配列に入れた。オリゴヌクレオチドはｐＵＣ９に挿入するため に、Ｂａｇ＋旧とＥｃｏ　Ｒ１切断の両方に利用可能であるように合成し、ｐＲ ｖ７５５を作成した。Ｂａｇ旧適合末端から始まる二重鎖合成オリゴヌクレオチ ドの配列（ＡＴＣはアンダーラインを引いた）は： Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＧ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　ＣＣＧ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　 Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　Ａ　Ｉ　Ｇ　ＣＧ　Ｔ　Ｃf ＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＴ ＡＡであった。

ｐＲｖ７５５のＡｈａ　ｎによる直線型部分消化産物を単離し、Ｅｃｏ　Ｒ１で 切断した。ＡＴＧでＡｈａ　ＩＩで一回切断しさらにＥｃｏ　Ｒ１で再び切断し たｐＲｗ７５５の断片を単離し、ホスファターゼ処理後、以下のｐＲＶ７１４を 消化産物のベクターとして用いた。

ｐＲＶ７１４のＡｈａ　ＩＩ直線部分消化産物をＥｃｏ　Ｒ１で再切断した。Ｎ Ｐコード配列含有の約ｔ、ｅｘｂｐ　ＡｈａＩＩ　−Ｅｃｏ　Ｒ１単離断片を上 記のｐＲＶ７５５ベクターに挿入してｐＲＷ７５７を作製した。

完全Ｈ６プロモーターは、Ｅｃｏ　ＲＶ部位の上流（３′側）の配列を添加する ことによって形成した。プラスミドｐＲＷ７４２Ｂ（実施例４に記載）は、ｐＵ Ｃ９’のＮｄｅ　１部位とともに切断されたＥｃｏ　ＲＶ部位の下流（３′側） のＨ６配列を有していた。ｐＲＶ７４２　Ｂ　Ｅｃｏ　ＲＶ−Ｎｄｅ　Ｉ　Ｋ片 をホスファターゼで処理し、下記のｐＲＶ７５７断片のベクターとして用いた。

ｐＲＶ７６７の直線部分Ｅｃｏ　ＲＶ消化産物を単離後、Ｎｄｅ　Ｉで消化し再 び単離した。このｐＲＶ７５７断片をｐＲ１１１７４２Ｂベクターに挿入しｐＲ Ｖ７５ｇを形成した。ｐＲＶ７５ｇのＥｃｏ　Ｒ１断片はＨ８プロモーターによ る全ＮＰを含み、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントでプラントエン ドにした後、ｐＲＷ７３１．１３　Ｈｌｎ　ｃ　ＩＩｎ部位挿入しｐＲＷ７ＢＯ を作製した。

ｐＲＷ７Ｂ１．８　Ｈｌｎｃ　ｎ部位は、実施例６でｖＰＰ−６とｖＰＰ−７の 作製に用いたＦＰ−１座である。

ファウルボックスＦＰ−１を救援ウィルスとして用い、プラスミドｐＲｗｙｅｏ をインビトロ組換え試験で使用した。子孫プラークをアッセイし、インシトゥ　 プラークハイブリッド形成を用いてプラークを精製した。遺伝子の発現を・ヤギ のポリクローナル抗ＮＰ抗血清を用いた免疫沈降実験で確認した。ｖＰＰ−１２ に感染したＣＥＰ細胞の溶解液から特異的に沈降したこのタンパク質の大きさは およそ５５にＤであり、報告されたインフルエンザウィルスの核タンパク質の範 囲内であった。

Ａ／Ｔｙｒ／Ｉｒｅ／１３７ｇ／８３からの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子について は、ｖＦＰ−１１（実施例９）の作製で既に述べた。二重組換え体を作製するの に際し、先ず）ＩＡ遺伝子をプラスミドｐＲ１７３１，１５を用いて、ｖＰＰ− ８の作製のところで定義した座ｆ８に移した。

ｖＦＰ−１１の作製に用いたプラスミドはｐＲＶ７５９であった。

Ｈ６プロモーターに結合した赤血球凝集素遺伝子を、Ｐｓｔ　Ｉ部分消化によっ てこのプラスミドから移した。この断片を次にＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ フラグメントでプラントエンドとしｐＲｗ７Ｂ１．１５プラントエンドのＢａｇ 旧部位に挿入してｐＲＶ７７１を作製した。

プラスミドＰＲＶ７７１を次に、救援ウィルスとしてｖＰＰ−１２を用いるイン ビトロ組換え試験に用いた。ｖＰＰ−１２組換えウィルスは、プラスミドｐＲＶ ７３１．１３において定義した座ｆ７でＨｅプロモーターに連結した核タンパク 質遺伝子を含有する。両方の挿入部を有する組換えプラークを選択し、インシト ウ　ハイブリッド形成でプラークを精製して赤血球凝集素の表面発現をプロティ ンＡ−β−ガラクトシダーゼ結合イムノアッセイで確認した。両方の遺伝子の発 現を二重組換えウィルスＶＦＰ−１５と感染細胞溶解液からの免疫沈降によって 確認した。

実施例１３　組換えカナクーボックスウイルスの作製以下の実施例では、カナク ーボックスゲノムの非必須挿入座４個の確認と組換えカナジ−ボックスウィルス ４種ｖＣＰ−１６、ｖＣＰ−１７、ｖＣＰ−１９およびｖＣＰ−２０の作製につ いて示す。

組換えカナクーボックスｖＣＰ−１６を以下のように作製した。

３．４ＫｂｐのＰｖｕ　ＩｆカナリクーックスＤＮＡ断片をｐＵＣ９にクローン 化し、ｐＲＶ７Ｂ４．２を生じさせた。Ｅｃｏ　Ｒ１部位がこの断片内に非対称 に１カ所だけ見出され、短腕７００　ｂｐ、長腕２．７Ｋｂｐが生じた。このプ ラスミドをＥｃｏ　Ｒ１で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメン トを用いてプラントエンドとした。プラントエンドのＨｅ／狂犬病Ｇ遺伝子を次 にこの部位に連結し、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）を形質転換するのに用いた。生 成したプラスミドｐＲＶ７７５をインビトロ組換え試験に用いた。免疫スクリー ニングで陽性の子孫プラークを選択し、プラークを精製した。生成した組換え体 をｖｃｐ−ｔｏと命名し、挿入座を０３と名付けた。

上記の作製に用いたプラスミドｐＲＩ＋ｌ７６４．２は、前記Ｅｃｏ　Ｒ１部位 からの約２．４ＫＭ離れた唯一のＢｇｌ　ＩＩ部位を含有していた。同一のクロ ーニング方針を用いて、Ｈ６／狂犬病Ｇ遺伝子をこの部位でプラスミドｐＲＶ７ ８４．２に連結しｐＲＩＪ７７４を作製した。このプラスミドを用いて、Ｃ４と 命名した挿入座を持つ組換え体ｖＣＰ−１７を作製した。

プラスミドｐＲＶ７８４．５は、カナクーポ−／　りＸ　ＤＮＡ　ｆ）　８５０ ｂｐのＰｖｕ　ｎ断片を有し、片方の末端から４００ｂｐの断片内に非対称な唯 一のＢｇｌ　１１部位を有している。先に述べたクローニング手法と同一手法を 用いて、Ｈｅプロモーターに連結した狂犬病Ｇ遺伝子をこの部位に挿入しｐＲ１ ７７を作製した。作製された安定組換えウィルスをＶＣＰ−１９と命名し、挿入 座を０５と名付けた。

プラスミドｐＲＶ７１３４．７は、片方の末端から３００塩基離れた唯一のＢｇ ｌ　ＩＩ部位を持つ１．２ＫｂｐＰｖｕｌ［断片を含有する。

このプラスミドをＢｇｌ　ｍで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグ メントでプラントエンドとした。プラントエンドでＩＩＫプロモーターで転写促 進されるＬａｃ　Ｚ遺伝子を挿入してプラスミドｐＲＶ７７８を作製した。この プラスミドを用いて作製した安定組換えウィルスをｖＣＰ−２０と命名し、挿入 座をＣＢと名付けた。

プラスミドｐＮＤＶ１０８はＮＤＶテキサス株の融合遺伝子ののｃＤＮＡクロー ンであり、約３．３ＫｂｐのＨｐａ　Ｉ　ｃＤＮＡ断片から成り、融合タンパク 質をコードする配列とｐＢＲ３２２のＳｅａ　１部位にクローン化されるＮＯＶ をコードしたもう一つの配列を含有する。下記に、挿入プラスミドの作製段階を 述べる。

（１）　プラスミドｐｃＥ１１の作製 ｐｐｖ挿入ベクターのｐｃＥｉｔは、ｐＲＷ７３１．１３の旧ｎｃ１１部位にポ リリンカーを挿入することによって作製した（座ｆ７と命名）　、　ｐＲＶ７３ １．１３は、ＦＰ−ＩＤＮＡの５．５Ｋｂｐ　Ｐｖｕ■断片を含有する。非必須 塵は、既に実施例６で述べた安定組換え体ｖＦＰ−６の作製において旧ｎｃＩＩ 部位で定義した。ＨＩｎｃＩ［部位に挿入したポリリンカーは以下の制限酵素部 位を有している。つまり、Ｎｒｕ　Ｉ　、　Ｅｃｏ　Ｒ１％５ａｃＩ％Ｋｐｎ　 ＩＳＳｍａ　ＩＳＢａｇ旧、Ｘｂａ　Ｉ　ｓ　ＨｌｎｃＩ［，５ａｌｌ。

Ａｃｅ　Ｉ　ｓ　Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｓｐｈ　Ｉ　ｓ　ＨｌｎｄＩ［［およびＨｐａ 　Ｉである。

（２）　プラスミドｐｃＥ１９の作製 このプラスミドは、ｐｃＥｌｌをさらに修飾したもので、ワクシニアウィルス転 写終結信号ＡＴＴＴＴＴＮＴ（Ｌ、ニーエン（Ｙｕｅｎ）およびＢ、モス（Ｍｏ ｓｓ）、ジャーナル中オブービロロジー、６０．３２０−３２３［１９８６］） 　（、：（７）場合Ｎ　ハＡ　テあル）カｐｃＥ１１のＳａｃ　ＩとＥｃｏ　Ｒ １部位間に挿入されており、その結果Ｅｃｏ　Ｒ１部位が消失している。

（３）　ＮＤＶコード配列の挿入 融合タンパク質遺伝子の５′末端のヌクレオチド２２個以外の全てを含有する１ 、８Ｋｂｐのゲルで精製したＢａｇ旧断片をｐｕｃｔｇのＢａ■旧部位に挿入し 、ｐｃＥｌＢを形成した。

このプラスミドを、コード配列の５′末端の上流の１２塩基のところでベクター を切断するＳａｌ　Ｉで消化した。

クレノーフラグメントで末端を埋め、このプラスミドをさらに、Ｓａｌ　Ｉ部位 の１８塩基上流で切断する旧ｎｄＩ［Ｉで消化した。好ましい実施態様のところ で既に述べたワクシニアウィルスＨ６プロモーター及び両端にポリリンカー配列 を含有し、かつゲルで精製した１４６塩基のＳＩａ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ断片を このベクターに連結し、大腸菌細胞に形質転換した。生成プラスミドをｐｃＥｌ Ｂと命名した。

ＮＤＶ融合タンパク質遺伝子の開始ＡＴＧコドンをＨ６プロモーターの３′末端 に配列させ、かっＮＤＶの５′末端から欠けているヌクレオチド２２個をｐＣＥ １６に補うため、相補的合成オリゴヌクレオチドをＥｃｏ　ＲＶとＫｐｎ　１部 位を末端とするよう設計した。このオリゴヌクレオチド配列は５’　ＡＴＣ−Ｃ ＧＴ−ＴＡＡ−ＧＴＴ−ＴＧＴ−ＡＴＣ−ＧＴＡ−ＡＴＧ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−Ａ ＧＡ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−ＡＣＣ−ＡＧＧ−ＡＴＣ−ＣＣＧ−ＧＴＡ−Ｃ３’であ った。

作製したｐｃＥｌＢを次にＥｃｏ　ＲＶとＫｐｎ　Ｉで消化した。

Ｅｃｏ　ＲＶ部位は、Ｈｅプロモーター内で開始ＡＴＧの２４塩基上流に生じる 。Ｋｐｎ　１部位は、ＮＤＶコード配列内で前記ＡＴＧの２９塩基下流に生じる 。

オリゴヌクレオチドをアニールし、リン酸化し、前記の直線型プラスミドに連結 させた。得られるＤＮＡを大腸菌細胞を形質転換するのに用いた。このプラスミ ドをｐｃＥｌｇと命名した。

このＮＤＶコード配列をＦＰＶ挿入ベクターに挿入するために、ｐｃＥｔｇ（ポ リリンカー領域で切断）のゲルで精製した１、９Ｋｂｐ　ＳｍａＩ　−Ｈｌｎｄ 　ｍ断片を上述のｐｃＥｌＢの７ＪＫｂｐＳｅａ　Ｉ−旧ｎｄ　ＩＩＩ断片に連 結した。転写終結信号は、Ｓ■ａ１部位の下流１６塩基に生じる。得られたプラ スミドをｐｃＥ２０と命名した。

プラスミドｐｃ８２０を、フ７ウルボックスウイルスＦＰ−１を救援ウィルスと して用いるインビトロ組換え試験に使用した。得られた子孫をＣＥＦ単層に塗布 し、このプラークを、ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を用いたβガラクト シダーゼ連結プロティンＡイムノスクリーンに供した。陽性染色プラークを選択 し、プラークの精製を４回行った後、単一集団とした、この組換え体をｖＰＰ− ２９と命名した。

ＦｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子は、ｐ７０４Ｐ１５Ｅポリタンパク質をコードする配列 を含有する。ＦｅＬＶ遺伝子はまず、この遺伝子の５′側にワクシニアＨ６プロ モーターを並置させてプラスミドｐｓＤ４６７ｖｃに挿入させた。プラスミドｐ ｓＤ４６７ｖｃは、ワクシニア赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含有する１８０２ ｂｐのＳａｌ　Ｉ　／Ｈ１ｎｄ　ｍ断片を最初に９００１ｇベクターに挿入する ことによって誘導した。ＨＡ遺伝子の位置については既に４５１−４８２　、［ １９８ｇ］）。ＨＡ遺伝子産物をコードする読み取り枠の大半は欠損しており（ ヌクレオチド４４３からヌクレオチド１３１１）　、Ｂｇｌ　ｎ　・ＳＩａ　Ｉ 　ａＰｓｔ　ＩおよびＥｇａ　Ｉ制限酵素部位を含有する多重クローニング部位 を挿入した。得られるｐｓ０４Ｂ７ｖｃプラスミドは、マルチクローニング部位 の４４２ｂｐでこれらの制限部位の４９１ｂｐ下流のワクシニア隣接腕を含有し ている。これらの隣接腕は遺伝物質をマルチクローニング部位に挿入して、ワク シニアウイルスコペンハーゲン株の）ＩＡ部位へ組換えることができる。得られ た組換え子孫はＨＡ陰性であつた。

Ｈｅプロモーターは好ましい実施態様で既に述べた完全配列より成る４つのオー バーラツプオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによっ合成した。得られ た１３２塩基より成る断片は、５′末端にＢｇｌ　ＩＩ制限部位を有し、３′末 端にＳｍａ　Ｉ部位を持っていた。　Ｂｇｌ　ＩＩと５Ｉｌａ　Ｉ制限部位を介 してこれをｐｓＤ４６７ｖｃに挿入した。得られたプラスミドをｐＰＴ１５と命 名した。Ｈ６プロモーターのすぐ下流にあるｐＰＴ１５の唯一のＰｓｔ　１部位 にこのＦｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子を挿入した。生成したプラスミドをｐＦｅＬＶＩ Ａと命名した。

ＦＰ−１組換え体の作製のため、２．４ＫｂｐのＨｅ／ＰｅＬＶ　ｅｎｖ配列を Ｂｇｌ　ｍ消化とＰｓｔ　１部分消化でｐＰｅＬＶＩＡから切り離した。

Ｂｇｌ　ｎ部位は［１プロモ一ター配列の５′境界にある。

Ｐｓｔ　１部位はエンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結信号の４２０ ｂｐ下流にある。

この２．４Ｋｂｐ　Ｈｅ／ＰｅＬＶ　ｅｎｖ配列をＢａｍ旧およびＰｓｔ　Ｉ消 化ｐｃＥｌｌに挿入した。ＦＰ−１挿入ベクターｐｃＥ１１は、マルチクローニ ング部位を非必須器ｎｃＩＩ部位に挿入することによりｐＲＷ７３１．１３から 得た。この挿入ベクターは、ＦＰ−１ゲノムの座ｒ７で外来遺伝子を保有するＦ Ｐ−１組換え体を産生できる。組換えＰＰ−１／ＰｅＬＶ挿入プラスミドをここ でｐＦｅＬＶＦＩと命名した。二の構造体はＡＴＣ置換に対して完全ＡＴＧを与 えない。

完全ＡＴＣ：ＡＴＧ構造体を作るため、約１．４ＫｂｐのＮｒｕ　Ｉ／Ｓｓｔ　 ＩＩ断片１個をワクシニアウィルス挿入ベクターｐＰｅＬＶ１ｃから誘導した。

　Ｎｒｕ　１部位は、ＡＴ（ｉから２４ｂｐ上流の位置のＨｅプロモーターに生 じる。Ｓｓｔ　ＩＩ部位は、ＡＴＧから１．４Ｋｂｐ下流で翻訳終結信号のｔＫ ｂｐ上流に位置する。このＮｒｕ　Ｉ　／Ｓｓｔ■断片を、Ｓｓｔ　ＩＩ消化と Ｎｒｕ　Ｉ部分消化で作製した９、９Ｋｂｐ断片に連結した。この９．９Ｋｂｐ 断片は、ｐＵＣベクター配列である５、５ＫｂｐのＦＰ−１隣接腕、ｅｎｖ遺伝 子の下流部分に当る１、４Ｋｂｌ）のＦｅＬＶ配列、およびＨ６プロモーターの ５′側のほとんどの配列（約１００ｂｐ）を含有している。得られたプラスミド をｐＦｅＦＬＶＰ２と命名した。

ＡＴＧ構築のためのこのＡＴＧをヌクレオチド配列分析で確認した。

もうひとつのＦＰ−１挿入ベクターｐＦｅＬＶＦ３は、推定免疫抑制領域（シア ンシオロ（Ｃ１ａｎｃ１ｏ１ｏ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３０　 、４５３−４５５［１９８５１）　（：ｌ−ド配列のヌクレオチド１５４８から ｌＢ２８まで）に相当するＰｅＬＶ　ｅｎｖ配列を除去することによって、ｐＰ ｅＬＶＦ２から誘導した。これは、約ＩＫｂｐのＳｓｔ　Ｉｆ　／Ｐｓｔ　Ｉ断 片（上述の部位）をワクシニアウィルス挿入ベクターｐＦｅＬＶＩＤから単離す ることによって完成した０このプラスミドｐＦｅＬＶＩＤは、免疫抑制領域（ヌ クレオチド１５４８から１６２８まで）に相当するｅｎＶ配列がオリゴヌクレオ チドによる突然変異誘発によって欠損していたことを除いては、ｐＰｅＬＶｌｃ と同様であった（マンデツキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ）、プロシーデイングズ・オブ ・ナショナルφアカデミーーオブ・サイエンシズＵＳＡ％８３゜７１７７−７１ ８１［１９８７］）。ヌクレオチド１５４８から１８２８までを欠損している１ ＫｂｐのＳｓｔ　ｎ　／Ｐｓｔ　Ｉ断片を、ｐＦｅＬＶＦ２から誘導した残りの Ｈ８：ＦｅＬＶ　ａｎｙ遺伝子を含有するｌＯ，４ＫｂｐのＳｓｔ　ｎ　／Ｐｓ ｔ　Ｉ　断片へ挿入シタ。

挿入プラスミドｐＦｅＬＶＰ２とｐＦｅＬＶＰ８は、救援ウィルスＦＰ−１のイ ンビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の子孫をＣＥＰ単層に塗付し、組換 えウィルスをＣＥＰ単層上のプラークハイブリッド形成によって選択した。ハイ ブリッド分析により同定した組換え子孫を選択し、プラーク精製を４回行い均質 集団とした。全ＦｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子を保有するＦＰ−１組換え体をｖＦＰ− ２５と命名し、免疫抑制領域の欠損した全遺伝子を含有するＰＰ−１組換え体を ｖＦＰ−３２と命名した。この二つの組換え体は共にウシの抗ＰｅＬＶポリクロ ーナル血清（アンチボディーズ社（Ａｎｔｌｂｏｄｌｅｓ　％Ｉｎｃ、）　、デ ィービス（Ｄａｖｉｓ）　、カリフォルニア）を用いた免疫沈降によって、適切 な遺伝子産物を発現していることが示された。これらのＰＰ−１組換え体がＣＲ ＦＫ細胞株（＾ＴＣＣ１１ＣＣＬ９４）中で前記の外来ＦｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子 を発現することも重要であり、この細胞株はネコ由来である。

カナクーボックス（ＣＰ）組換え体の作製のため、前記のＨ８：ＰｅＬＶ　ｅｎ ｖ配列を含有する２、２Ｋｂｌ）断片を、Ｓｌａ　１とＨｐａ　Ｉ消化によって ｐＦｅＬＶＦ２から切り離した。このＳＩａ　１部位は、Ｈ６プロモーター配列 の５′境界にある。

Ｈｐａ　１部位は、エンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結信号の下流 １８０ｂｐに位置している。

２．２ＫｂｐのＨｅ／ＦｅＬＶ　ｅｎｖ配列を挿入プラスミドｐＲＶ７６４．２ の非必須Ｅｃｏ　Ｒ１部位に挿入し、続いてＥｃｏ　Ｒ１部位をプラントエンド にした。この挿入ベクターはＣＰゲノムの座Ｃ４中に外来遺伝子を保有する０２ 組換え体を産じさせる。この組換えＣＰ挿入プラスミドをここでｐＦｅＬＶｃＰ ２と命名した。

この構造体は、ＡＴＧ置換に対して完全ＡＴＧを１個提供する。

挿入プラスミドｐＦｅＬＶｃＰ２を、救援ウィルスとしてＣＰを用いるインビト ロ組換え試験に用いた。この組換え体の子孫をＣＥＰ単層に塗布した後、ウシ抗 ＦｅＬＶ市販ポリクローナル血清（アンチボディーズ社、デービス、カリフォル ニア）を用いたβガラクトシダーゼ結合プロティンＡイムノスクリーン法により 、組換えウィルスを選択した。

染色陽性プラークを選別し、プラークの精製を４回行った後、均質集団とした。

完全ＰｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖｃＰ−３６と命名した。

実施例ＩＢ　ラウス関連ウィルスタイプ１　（ＲＡＹ−１）エンベロープ（ｅｎ ｖ）遺伝子を発現するファウルボックスウイルス組換え体ｖＦＰ−２２の作製 ＲＡＶ−１エンベロープ遺伝子のクローンｐｅｎｖＲＶＩＰＴは、Ｍｌ：１Ｂｌ Ｂ中に［ｐｎ　Ｉ　−８ａｃ　Ｉ断片としてクローン化された配列をコードする １、１ＫｂｐのＲＡＹ−１ｅｎｖ　ＤＮＡを含有している。この断片は５′末端 はそのままであるが、３′側の配列一部を欠損しており、以下の操作に用いられ た。ゲルで精製した１、ＩＫｂｐのｐｅｎｖＲＶ　Ｉから誘導したＥｃｏ　Ｒ１ −Ｐｓｔ　Ｉ断片を、ｐＵＣ９のＥｃｏ　Ｒ１とＰｓｔ　１部位に挿入し、ｐＲ Ｉｆ７５Ｇを作製した。このプラスミドをＫｐｎ　Ｉと）１１ｎｄＩ［［で消化 し、ベクター中のＡＴＧの５９塩基上流で切断した。既に述べたワクシニアＨ６ プロモーターを含有する１４Ｂ塩基対のＫｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ断片を挿入 し、プラスミドｐｃ８Ｂを作製した。

ＲＡＹ　ｅｎｖ遺伝子の開始ＡＴＧが、外来配列の欠損したＨ６プロモーターの ３′末端に隣接していることを確認するために、末端のＥｃｏ　ＲＶとＢａｎ　 ｎ部位で二つの相補的合成オリゴヌクレオチドを作製した。このオリゴヌクレオ チド配列は、 Ａ　ＴＣ−ＣＧＴ−ＴＡＡ−ＧＴＴ−ＴＧＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡ−ＡＴＧ−ＡＧＯ −ＣＧ　Ａ−ＧＣＣ−３’であった。

プラスミドｐｃＥ８を、Ｈ６プロモーター内でＡＴＧの２４塩基上流で切断する Ｅｃｏ　ＲＶ及びＲＡＹ　ｅｎｖをコードする配列内でＡＴＧの７塩基下流で切 断するＢａｎ　ｎで消化した。このＤＮＡ断片を連結し大腸菌細胞の形質転換に 用いた。得られたプラスミドｐｃＥ７は、最終構築のためのＨｅプロモーターと 正確な５′配列を与えた。

クローン■ｐ１９ｅｎｖ（１９０）は、制限酵素によるマツピングで全ＲＡＹ− １ｅｎｖ遺伝子を含有することがわかった。全遺伝子を含有する５ｐ１９ｅｎｖ （１９０）の１．９ＫｂｐのＫｐｎ　Ｉ　−３ａｃ　Ｉ断片をｐＵｃｌｇのＫｐ ｎ　ＩとＳａｃ　Ｉ部位に挿入し、ｐｃＩｌ：３を形成した。このプラスミドを 、ＲＡＶ−１をコードする配列内で開始ＡＴＧの１３２塩基下流で切断するＨｐ ａ　Ｉ及びこの遺伝子の３′末端で切断するＳａｃ　Ｉで消化した。既に述べた ＦＰＶ挿入ベクターｐｃＥ１１をＳｍａ　ＩとＳａｃ　Ｉで消化し、このプラス ミドをポリリンカー領域で切断した。ｐｃＥ３のＨｐａ　ｌ−８ａｃ断片でｐｃ Ｅｌｌで連結し、ｐｃＥ１４を作製した。

プラスミドｐＣＥ７を次にＸｈｏ　Ｉと旧ｎｄｎ［で消化し、Ｈｅプロモーター と正確な５′配列を含む３３２塩基対断片を生じさせた。プラスミドｐＣＥ　１ ４を、このベクターのポリリンカー領域で切断する旧ｎｄＩ［及びコード配列で 切断するＸｈｏ　Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＣＥ７から得た旧ｎｄＩＩＩ− Ｘｈ。

Ｉ断片と連結し、最終ＲＡＶ−１工ンベロープ遺伝子構造体のｐｃＥ１５を形成 した。

このプラスミドを、ファウルボックスｐｐ−ｔを救援ウィルスとするインビトロ 組換え試験に用いた。組換え体子孫をＣＥＰ単層に塗付し、抗ＲＡＶ−１ポリク ローナル血清を用いたβ−ガラクトシダーゼ連結プロティンＡイムノアッセイで プラークをスクリーニングした。染色陽性プラークを選別後４回プラークの精製 を行い、単一集団を得た。産生された組換え体をｖＰＰ−２２と命名した。ｖＰ Ｐ−２２感染ＣＥＰ溶解液を用いた免疫沈降実験から、エンベロープ遺伝子の遺 伝子産物２（Ｉｌに対応する見掛けの分子量７６．５Ｋｄと３０Ｋｄを有する２ つのタンパクが特異的に沈降していることが示された。前駆体遺伝子産物は全く 見られなかった。

予備試験で、ｖＰＰ−２２接種ニワトリでこのＲＡＶ−１エンベロープ遺伝子産 物に対する免疫応答が誘起された。

実施例１７　ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）のｇｐ５１．３Ｑエンベロープ（ｅ ｎｖ）遺伝子を発現するアビポックスウィルス組換え体の作製 （１）　ｐＢＬＶＰＩとｐＢＬＶＦ２の作製プラスミドｐＢＬＶＦ１とｐＢＬＶ Ｆ２はＢＬＶのｇｐ５１．３０ｅｎｖ遺伝子を含有する。両プラスミドにおいて 、ＢＬＶ　ｅｎｖ遺伝子はワクシニアウィルスＨ８プロモーターの転写制御下に あり、ファウルボックス隣接腕（座ｆ７）間でクローンされる。

この二つのプラスミドのヌクレオチド配列は、コドン２８８位と２６９位を除い て等しい。（ｐＢＬＶＦｌはこれらの二つの位置でアミノ酸Ａｒｇ−８ｅｒ含有 タンパクをコードし、一方、ｐＢＬＶＰ２はアミノ酸Ｇｉｎ−Ｔｈｒ含有タンパ クをコードする。） ｐＢＬＶＦｌとＩ）ＢＬＶＦ２を以下の手順で作製した。プラスミドｐＮ８９７ −１は全ＢＬＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドであるが、これをＢａｇ旧 で切断し、Ｍｓｔ　ＩＩで部分的に切断した。ｇｐ５１．３０遺伝子を全て含む ２．３Ｋｂｐ断片をアガロースゲル上で単離し、スティッキーエンドを大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）で埋めた。Ｐｓｔ１リンカ−を断 片の末端に連結し、Ｐｓｔ　Ｉ消化した後に、ｐＴＰ１５のＰｓｔ　Ｉ部位（実 施例１５）に連結した。これによって、ＢＬＶ遺伝子がワクシニアプロモーター Ｈｅに隣接して配置される。（ｐＴＰ１５は、ワクシニアゲノムの非必須座でク ローン化されたワクシニアＨ６プロモーターを含有する。） このプラスミドを次にＥｃｏ　ＲＶで切断し、Ａｖａ　ＩＩで部分切断する。５ ．２Ｋｂｐ断片を単離し、オリゴヌクレオチド５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴ ＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＣＧＡＣＧ−３’と５’　−Ｇ ＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣ ＧＧＡＴ−３’を用いてこのプラスミドを再び環状とした。これによって、ＢＬ Ｖ遺伝子とＨ６プロモーター間の不要塩基を除去する。

得られたプラスミドをＰｓｔ　Ｉで切断しＢｇｌ　ＩＩで部分切断し、プロモー ターＨ６で転写促進されるＢＬＶ遺伝子を含有する１、７Ｋｂｐ断片を、既に述 べたファウルボックスウイルス挿入ベクターｐｃＥｌｌのＢａｇ旧−Ｐｓｔ１部 位に座ｒ７を用いてクローン化した。これによって、１（６プロモーターを持つ ＢＬＶ遺伝子がファウルボックス隣接腕間に配置される。このプラスミドをｐＢ ＬＶＰｌと命名した。

同一の手順を用いてｐＢＬＶＦ２を作製したが、Ｈ６プロモーターを有するＢＬ Ｖ遺伝子をｐｃＥｌｌにクローニングする前にインビトロ突然変異誘発操作をさ らに行った。この突然変異誘発は、下記の手順で行った。

プラスミドｐＮＳ９７−１をＸ■ａＩで切断しＳｔｕ　Ｉで部分切断した。５． ２Ｋｂｌ）断片を単離し、オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＣＡ ＡＡＣＴＣＣＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＡＧＧ−３’と５’−ＣＣ ＴＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣ−３’ を用いて、このプラスミドを再び環化した。これによって、コドン２８８と２８ ９のヌクレオチド配列がＣＧＣ−ＡＧＴからＣＡＡ−ＡＣＴに変化する。

（２）組換えウィルス類の作製 前記プラスミドＩ）ＢＬＶＦＩとｐＢＬＶＦ２を、ＦＰ−１を救援ウィルスとし て用いたインビトロ組換え試験に用いた。組換え子孫はインシトゥ　プラークハ イブリッド形成で選択し、この基準で集団が純粋であると判定されたら、プラー クをＢＬＶｇｐ特異モノクローナル抗体調製物を用いたβガラクトシダーゼ・プ ロティンＡイムノアッセイでスクリーニングした。プラスミドｐＢＬＶＦ１とｐ ＢＬＶＦ２からそれぞれ作られた組換え体ｖＰＰ２３とｖＦＰ２４は共に、イム ノスクリーンで染色陽性を示し、感染細胞表面上で免疫学的に認識可能な糖タン パクが発現されていることを示唆していた。

プラス−ミードｐＢＬＶＫ４とｐＢＬＶＫ８４ｔ、ツレツレ、Ｗ　記（７）ＢＬ Ｖ　ｅｎｖ　ｇｐ５１．ＩＯ遺伝子とＢＬＶ　ｇｐ５１．３０開裂マイナス遺伝 子が含有している。両遺伝子ともに、ｐＲＶ７ｆ１４．２の唯一のＥｃｏ　Ｒ１ 部位（座Ｃ３）　（ｐＲＩＪ７ｆ１４．２については、実施例１３１；述べられ ている）にクローン化され、ワクシニアＨ６プロモーターの転写制御下にある。

このプラスミドは以下の手順で誘導された。ｐＢＬＶＰｌとｐＢＬＶＦ２を制限 酵素旧ｎｄＩ［Ｉで切断した。オリゴヌクレオチドＢＫＬ　１（ＡＧＣＴＴＧＡ ＡＴＴＣＡ）をこの部位にクローン化し、ＢＬＶ遺伝子の３′側にＥｃｏ　Ｒ１ 部位を作製する。このＢＬＶ遺伝子の５′側にもＥｃｏ　Ｒ１部位があるので、 これらのプラスミド（ｐＢＬＶＫｌとｐＢＬＶＫ２）をＥｃｏ　Ｒ１テ切断し、 Ｈ６プロモーターで転写促進されるＢＬＶ遺伝子を含有する断片をｐＲＷ７６４ ．２のＥｃｏ　Ｒ１部位にクローン化した。得られたプラスミドをそれぞれ、ｐ ＢＬＶＫ４とｐＢＬＶＫ６と命名した。これらのプラスミドを、カナクーボック スを救援ウィルスとしたインビトロ組換え試験に用いた。組換え体を選別し、イ ムノアッセイで検出されたこの糖タンパクの表面における発現を基準として精製 した。プラスミドｐＢＬＶＫ４とｐＢＬＶＫ６からのそれぞれの組換え体をｖｃ Ｐ２７とｖＣＰ２ｇと名付けた。

ファウルボックス組換え体ｖＦＰ２ｓとｖＰＰ２４を、さまざまな経路でヒツジ とウシに接種した。動物に二回接種し、二回目は一回目の４５日後とした。血清 検体を第一回接種の５週間後と第二回接種の２週後に採取した。ｇｐ５１に対す る抗体を競合的ＥＬＩＳＡ試験で測定し、力値は競合を５０％阻害する血清希釈 の逆数として表わした。結果を表ＸＩに示した。

検査したいずれの種も一回目の接種後には検出可能な免疫応答を示さなかった。

ヒツジもウシも共に第二回接種後に大幅な抗体上昇を示した。

ａ２カ所に皮肉接種。

ス遺伝子を発現するファウルボックスウイルスＰＰ−１組換えｖＦＰ−２８の作 製 プラスミドｐｌＢＶＢ［Ｒ３は、Ｍａｓｓ４１株のマトリックス遺伝子の感染性 気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）ｃＤＮＡクローンを含有する。ｐｌＢＶＢ８３の８ Ｋｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ１断片は、上流（５′側）にベブロマー遺伝子を持つマトリ ックス遺伝子を含有し、さらにその上流にＥｃｏ　ＲＶ部位がある。プラスミド ＰＲＶ７１５は、ｐＵＣ９の二つのＰｖｕ　ＩＩ部位を結合するＥｃｏ旧リンカ −を有している。　ｐｌＢＹＭ６３由来のｇＫｂｐのＥｃｏ　Ｒ１断片をｐＲｖ ７１５Ｅｃｏ　Ｒ１部位に挿入し、ｐＲＶ７８Ｂを作製した。プラスミドｐＲＶ ７６ｇの５′側Ｅｃｏ　Ｒ１部位を欠損したプラスミドｐＲｗ７７ｅを作製し、 このマトリックス遺伝子下流（３′側）の唯一のＥｃｏ　Ｒ１部位を残した。単 離したｐＲＩｆ７８３のＥｃｏ　Ｒ１部分消化直線型産物を、Ｅｃｏ　ＲＶで再 び切断した。最大の断片を単離し、ＤＮＡポリメラーゼｌのクリノウフラグメン トでプラントエンドとし、自己連結してｐＲＷ７７Ｂを産生じた。構造体ｐＲＶ ７７Ｂは全ＩＢＹペブロマー遺伝子と全マトリックス遺伝子を持ち、このマトリ ックス遺伝子のあとに唯一のＥｅｏ　Ｒ１部位が続く。

約０．９Ｋｂｐのマトリックス遺伝子の５′及び３′末端だけの配列が決定され ていた。翻訳開始コドン（ＡＴＣ）に始まるマトリックス遺伝子の５′配列には 、以下のアンダーラインを付したＲｓａ　Ｉ部位を含有する。

ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＴＡＣ，既に述べたＨ６プロモータ ーを合成オリゴヌクレオチドでこのマトリックス遺伝子に結合した。この合成オ リゴヌクレオチドはＥｃｏ　ＲＶ部位からＡＴＧまでのＨ６配列を含有しており 、一番目のＲｓａ　１部位を介してマトリックスコード配列に挿入した。このオ リゴヌクレオチドは、ｐＵｃ９に挿入できるようにＢａ厘旧とＥｃｏ　Ｒ１端を 持つように合成され、ｐＲＶ７７２を作製した。

Ｅｃｏ　Ｒ１末端はＲｓａ　１部位の３′側となる。Ｂａｇ旧適合末端から始ま る、この二重鎖合成オリゴヌクレオチド（ＡＴＧはアンダーラインで示した）の 配列は ＧＡｇＡＴＡｒＡＡ６ＡＴＣＸＴ楊箪ＡＡＣＧＡＧＡＣＡＡＡ而ＡＣＧＣＩＤＡ ＴＡ世ＡＡＴ面ＣＡＡＡＣ＾ＴＡＧＣＡＴｒＡＣＡｍＡＡＣＡ■ＡＡである。

ｐＲＶ７７２のＲｓａ　Ｉ部分消化直線型産物を単離し、Ｅｃｏ　Ｒ１で再切断 した。このＲｓａ　１部位で１回切断しＥｃｏ　Ｒ１で再切断した箇所を持つｐ ｌ？Ｖ７７２断片をホスファターゼ処理し、以下のｐＲＷ７７Ｂ消化産物のベク ターとして用いた。

単離したｐＲＶ７７Ｂの直線状Ｒｓａ　１部分消化産物をＥｃｏ　Ｒ１で再び切 断した。Ｅｃｏ　Ｒ１部位はマトリックス遺伝子の３′末端をすぐ越えたところ にある。上記のＲｓａ　１部位からのマトリックスをコードする配列を含有する 約０．８ＫｂｐのＲａｓ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒ１単離断片を上記のｐＲ１１７７２ ベクターに挿入し、ｐＲＶ７８３を作製した。完全なＨ６プロモーターは、Ｅｃ ｏ　ＲＶ部位の５′に配列を添加することによって形成した。Ｈ６プロモーター の５′末端はプラントエンドにしてｐＵｃ９のＳａｌ　１部位に挿入しＥｃｏ　 Ｒ１部位を生じさせるＨｌｎｆ　Ｉ部位であったが、このＨｅプロモーターの５ ′　はｐＵＣ９の旧ｎｄＩ［部位である。この５′Ｈ６プロモーターを含有する 旧ｎｄｍ−Ｅｃｏ　ＲＶ断片をｐＲＶ７８３　Ｈｌｎｄ　ｍとＥｃｏ　ＲＶ部位 の間に挿入し、ｐＲＶ７８Ｂを作製した。　ｐＲＷ７８Ｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１断片は Ｈ６プロモーターを持つ完全マトリックス遺伝子を含有しており、ＤＮＡポリメ ラーゼＩのクリノウフラグメントでプラントエンドにし、ｐＲＶ７３１．１５の プラントエンドのＢａｇ旧部位（座ｆ８）へ挿入してｐＲＷ７８９を作製した。

このｐＲＶ７３１．１５　Ｂａｍ旧部位は、実施例６でｖＰＰ−８の作製に用い たＦＰ−１座である。

プラスミドｐＲＶ７８９をｖＦＰ−２８の作製に用いた。組換えプラークを選別 しインシトゥ　プラークハイブリッド形成で処理した。

予備試験において、ｖＦＰ−２８を接種したニワトリはＩＢＶマトリックスタン パクに対する免疫応答が誘起した。

感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）　Ｍａｓｓ４１のｃＤＮＡクローンｐＩＢＶ ＭＢ３とそのサブクローンｐＲＷ７７ｆｔは、実施例１８におけるｖＦＰ−２６ の作製に関して既に説明した。サブクローンｐＲＶ７７Ｇは４Ｋｂｐ　ＩＢＹペ ブロマー遺伝子を含有し、この遺伝子のあとに、３′末端に唯一のＥｃｏ　Ｒ１ 部位を持つマトリックス遺伝子を持つ。約４ＫｂｐのＩＢＹヘプロマー遺伝子の ５′と３′末端の配列だけが決定されていた。唯一のＸｂａ　１部位で二つの遺 伝子に分離される。翻訳開始コドン（ＡＴＣ）で始まるペブロマー遺伝子の５′ 末端は、以下のアンダーラインを付したＲｓａ　１部位を有する。

ＡＴＣＴＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＴＣＴＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧ　ＡＣＴＣＴＴＴＴ ＧＴＧＴＧＴＡＣ，既に述べたＨ６プロモーターを、合成オリゴヌクレオチドで ペブロマー遺伝子に結合した。この合成オリゴヌクレオチドは、Ｎｒｕ　１部位 からＡＴＣに至るＨｅプロモーター配列を含有しており、その第一番目のＲｓａ 　Ｉ部位を介してペプロマーコード配列に挿入された。このオリゴヌクレオチド を、ｐＵｃ９に挿入するためにＲａｓ旧及びＥｃｏ　Ｒ１に適合する末端を合成 し、ｐＲＷ７Ｂｇを作製した。Ｅｃｏ　Ｒ１末端はＲｓａ　１部位の３′となる 。Ｂａｇ旧適合末端で始まる二重鎖合成オリゴヌクレオチドの配列（ＡＴＧはア ンダーラインで示した）は ＣＡＴ口墓ＣＧＡＴＡｆｌＡＡｆｌＡＴＣＧＴ［ＡＡＣＡＣＣＴＣＴｒＡＣＣＩ Ｉ；ＣＴＡＴＡｔＥＡＡＴｒＣＡＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴｒＡＣＡＡＣＣＡｆｌＡ ＧＡＡＴｒＡ（ＴＡＧＴ［ｉＡｍＡＣＧ ＡＡＴＧＡＴＣＡ−ＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡ丁１である。単離されたｐＲＶ７ ６ｇの直線型Ｒｓａ　１部分消化産物をＥｃｏ　Ｒ１で再び切断した。上記のＲ ｓａ　１部位で１カ所切断し、ＥｃｏＨにより再切断された部位を含むｐＲＶＴ ６８断片を単離し、ホスファターゼで処理し、以下のｐＲＶ７７Ｂ消化産物のベ クターとして用いた。

単離されたｐＲＷ７７Ｂの直線型Ｒｓａ　１部分消化産物をＥｃｏ　Ｒ１で再び 切断した。上記のＲｓａ　１部位で１回切断しＥｃｏ　Ｒ１部位までを含有する ５ＫｂｐのｐＲＷ７７Ｂ断片を単離した。

この断片は、上記のペプロマーＲｓａ　Ｉ部位からマトリックス遺伝子の３′末 端のＥｃｏ　Ｒ１部位に至るＩＢＶ配列を含有する。このｐＲｗ７７Ｂ断片を上 記のｐＲＶ７６ｇベクターに挿入し、ｐＲ１１１７８８を作製した。このマトリ ックス遺伝子を上述のＸｂａ　１部位に移した。４ＫｂｐのｐＲＶ７８８　Ｎｒ ｕ　ｌ−Ｂａ５旧プラント工ンド断片をｐＲＶ７８０　Ｎｒｕ　Ｉ−Ｂａｇ旧プ 旧ソラントエンドベクター入することによって、５’Ｈ６プロモーターをＮｒｕ 　１部位に付加し、Ｉ）ＲＶ７９０を作製した。ベクターｐＲＶＴＢＯについて は実施例１１で述べてあり、簡単に言えば、非必須ＦＰ−１座ｆ７に隣接するＨ ６プロモーターで転写促進されるワクシニアインフルエンザ核タンパク質である 。

このｐＲＷ７６０ベクターは、Ｎｒｕ　１部位から核タンパク質末端のＢａａ旧 までの３′Ｈ６配列を除去することによって作製された。ｐＲＶ７９０は、ｐＲ Ｖ７３１．１３　Ｈ１ｎｃＩＩ部位中のＨ６プロモーター保有ＩＢＶペブロマー である。ドナープラスミドｐＲＶ７９０をＰＰ−１と組み換え、ｖＦＰ−３１を 生成した。ｖＦＰ−３１感染細胞から調製したＣＥＦ溶解液を用いて免疫沈降実 験を行い、分子量約１８ＱＫｄの前駆体タンパクが少量、および９０Ｋｄの分解 生成物が少量、特異的に沈降していることが示された。

実施例２０　単純ヘルペスウィルスｇＤを発現するファウルボックスウイルスＦ Ｐ−１組換えｖＰＰ−３０の作製単純ヘルペスウィルス（Ｈ８Ｖ）　ｌ型株ＫＯ ８糖タンパクＤ遺伝子（ｇＤ）をｐＵｃ９のＢａ１ｌ旧部位に、５’Ｂａｍ旧連 結Ｈｐａ　ＩＩから３’Ｂａｍ旧連結Ｎｒｕ　Ｉまでの断片としてクローン化し た。５′末端はｐＵｃ９　Ｐｓｔ１部位に隣接している。翻訳開始コドン（ＡＴ Ｇ）で始まるＨ９ＶｇＤの５′配列は、以下のアンダーラインを付したＮｅｏ　 １部位を含有する。

Ａ画（８）（８）口聰双Ａ回旭ＧＧ冗實Ａｍτ■刑鄭ＡＴＡ刑−（８）黒人面９ 既に述べたワクシニアＨ６プロモーターを合成オリゴヌクレオチドでＨ３ＶｇＤ 遺伝子に結合させた。Ｎｒｕ　ＩからＡＴＧに及びさらにｇＤコード配列のＮｃ ｏ　１部位に至るＨｅプロモーターの３′部分を含有する。このオリゴヌクレオ チドは、Ｐｓｔ　Ｉ適合５′末端を持つように合成した。ｐＵＣ９のｇＤクロー ンをＰｓｔ　ＩとＮｅｏ　Ｉで切断し、５’）ＩＳＶ配列を除去し、合成オリゴ ヌクレオチドと置き換えることによって、ｐＲＶ７８７を得た。この二重鎖合成 オリゴヌクレオチドの配列は、 龜（８）ＡＴ＾庇町楯π研Ａ丁岨婁八回へ）ＡＣｘｒｒｃＡＧＣ［ＡＴＡＧＧＣ ＡＡＴＴＣＡＡＡ（：ＡＴＡＧＣＡ貫ＡＣＣＣＴＣＣＡｇ−ＣＡＧＣＴＡＧＡＴ ｒＡ［ＡＴｒｌＴＡＴＩＷｒＡＧＴｒＡＴＡｉＡＧＧ＾αｃＴＣｃＡＴＣＴＡＡ ＴｃＣＡＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＡπＡＴＣＣＴＧＡＧ ＧＴＡＣテある。

ｐＲＷ７８７をＮｒｕ　ＩとＢａａ旧で消化するとＮｒｕ　１部位からＨＳＶｇ Ｄコード配列を通りＢａａ　ｆｉ１部位に至る３′Ｈ６プロモーターを含有する 約１．３Ｋｂｐの断片ができる。このｐＲＶ７ＢＯベクターをＮｒｕ　ｌとＢａ ａ旧で切断することについては、実施例１１で述べた。この１．：１Ｋｂｐ断片 をｐＲｗｙｅｏベクターに挿入しｐＲＶ７９１を作製した。このｐＲｖ’ｙａｔ ベクターは、ｐＲｖ７３１．１８の非必須ＦＰ−Ｉ　Ｈｌｎｃ　Ｉｆ部位（座１ １）に、完全ワクシニワプロモーターで転写促進されるＨ！３ＶｇＤ遺伝子を含 有する。

ドナープラスミドｐＲＶ７９１をＦＰ−１と組み換えてｖＦＰ−８０を得た。糖 タンパクの表面発現が、プロティンＡ−β−ガラクトシダーゼ連結イムノアッセ イ及びＨ９Ｖ−１特異血清を用いた組換えプラーク中で検出された。

実施例２１　−ポックスウィルスベクター中における外来遺伝子の発現制御のた めのエントモボックスプロモーターの使用 （ａ）　ＩＪｒ月　昆虫のポックスウィルス（ポックスウィルス）は現在エント モポックスウィルス亜科（Ｅｎｔｏｓｏ−ｐｏｘｖｌｒｉｎａｅ）に分類されて おり、甲虫類（Ｃｅｌｅｏｐｔｅｔａ）、鱗翅類（Ｌｉｐｉｄｏｐｔｅｒａ）　 、直切類（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）の目に属する昆虫から単離されるエントモポ ックスウィルスにそれぞれ対応する三つの属（Ａ％Ｂ％Ｃ）にさらに細く分類さ れる。本来エントモポックスウィルスは宿主範囲が狭く、如何なるを推動物中で も複製しないことが知られている。

本研究で用いたエントモポックスウィルスは、元々インド産の感染したアムサク タ・モーレイ（Ａ■ｓａｃｔａｍｏｏｒｅ１）　（鱗翅類：アークチルダニ（ａ ｒｃｔｌｌｄａｅ））の幼生から単離したものである（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔ ｓ）とグラナトス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）、ジャーナルーオブ・インバーチルレー ト・パソロジー（Ｊ、　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏｌ、）　１２．１４ １−１４：１［１９８Ｂ］）。このウィルスはＡｍＥＰＶと命名されており、Ｂ 属の種型である。

野生型ＡｓＥＰＶをＲ，グラナトス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）博士（ボイス・トンプ ソン争インスティチュート（Ｂｏｙｃｅ　Ｔｈｏ■ｐｓｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ）、コーネル大学（Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｕｎｌｖｅｒｓｌｔｙ））から、感染した エスチグメヌ・アクレア（Ｅｓｔｉｇ■ｅｎｅ　ａｃｒｅａ　）の幼生由来感染 血リンパとして入手した。このウィルスはりマンドリア・ジスパー（Ｌｙｗａｎ ｔｒｌａ　ｄｌｓ　ｅｒ）　（ｖイマイガ）の卵巣組織由来の無を椎細胞系統で あるＩＰＬＢ−ＬＤ６５２Ｙ中で複製することがわかった（グッドウ［１９７８ ］）。この細胞を、４％ウシ胎児血清及び４％ニワトリ血清を添加したＩＰＬ− ５２８培地で２８℃で増殖させた。

野生型ウィルスをＬＤ８５２Ｙ細胞でプラークアッセイしＮＶｌと命名したプラ ーク１個を以下の実験のため選択した。

この単離物は、感染サイクル後期の感染細胞の細胞質において・数多くの閉鎖体 （ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｌｅｓ：　０Ｂｓ）を産生ずる。

（ｂ）　プロモーター同定　ＡｍＥＰＶプロモーターの同定とマツピングを以下 のようにして完了した。最近感染したＬＤ６５２Ｙ細胞（感染後４８時間）の総 ＲＮＡを単離し１３２Ｐで標識される最初のｅＤＮＡ鎖を作製するのに用いた。

このｅＤＮＡは、Ａｇ＋ＥＰＶの制限消化物含有プロットのプローブとして用い た。このサザンプロットで２．６ＫｂのＣ１ａ　Ｉ断片上に強いシグナルが検出 され、この断片が強く発現された遺伝子をコードすることを示していた。本断片 をプラスミドベクターにクローン化し、そのＤＮＡ配列を決定した。

配列データの分析は４２Ｋｄのポリペプチドをコードすることのできる読み取り 枠を明らかにした。感染４８時間後における総ＲＮＡのインビトロ翻訳と５ＤＳ −ＰＡＧＥによる生成物の分離によって、約４２Ｋｄのポリペプチドが１個明ら か来遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスの作製エントモボックスプロモ ーターがを椎動物ポックスウィルス系で機能するか否かを調べるため、以下のプ ラスミドを作製した。５′末端でＢｇｌ　ｍ部位に隣接する４２に遺伝子翻訳開 始シグナル（以下でＡｍＥＰＶ４２にプロモーターと呼ぶ）の５′側の１０７塩 基及びＥｃｏ　Ｒ１部位で終結するＢ型肝炎ウィルスブレＳ２のコード領域の３ ′末端の最初の１４塩基を含有するオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。下 記にこのＡｍＥＰＶ４２にプロモーター配列を述べる。

ＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＡＴＡＧＡＡＡ ＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＧＧＧ ＡＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡ！ ＬｆｆＬこのＡｍＥＰＶ４２にプロモーターを以下のようにしてＢ型肝炎ウィル ス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）に連結した。赤血球凝集素（ＨＡ）分子をコードす るツクシニアウイルスゲノムの非必須領域におけるワクシニアウィルス腕（ＨＡ 腕については、実施例１５で記載；ＨＡ領領域シダ（Ｓｈｉｄａ）がピロロジー 、旦、４５１−４８２［１９８Ｂ］に記載）に隣接した、プレＳ２コード領域（ タイプａｙｗがガリバー）　（Ｇａｌｉｂｅｒｔ）らによって記載、ネーチャー 、且辷、８４Ｂ−６５０［１９７９］）及びＢ型肝炎ウィルス表面抗原を含有す るｐＵＣプラスミドを作製した。

前述のオリゴヌクレオチドを、ＨＢＶｓＡｇのコード領域の唯一のＥｃｏ　Ｒ１ 部位及びＨＡワクシニア腕の唯一のＢｇｌ　ｎ部位を用いてこのプラスミド中に 挿入した。得られた組換えワクシニアウィルスをｖＰ５４７と命名した。

エントモボックス４２にプロモーターの制御下における挿入ＨＢＶｓＡｇのコー ド配列の発現を、イムノアッセイを用いて確認した。哺乳類細胞系統Ｂ５Ｃ−４ ０の当量培養液を親ワクシニアウィルス又は組換えｖＰ５４７で感染させた。感 染後２４時間で細胞を溶解させ、この溶解液を順次希釈してニトロセルロース膜 にのせた。この膜を最初はヤギ抗ＨＢＶ血清でインキュベートシ、次いで、　■ プロティンＡとインキユベートした。洗浄後この膜をＸ線フィルムに露光させた 。陽性シグナルがｖＰ５４７　ｇ染培養液で検出されたが、親ウィルス感染培養 液では検出されず、哺乳類細胞中のワクシニアウィルスによって、ＡｓＥＰＶ４ ２にプロモーターが！１！識されることを示唆していた。

上記の結果を、感染哺乳類細胞中でＨＢＶｓＡｇを検出するためのオースリアア ッセイ（詳細については実施例１を参照）を用いて確認した。ＡｓＥＰＶ４２Ｋ またはワクシニアウィルスＨ６プロモーターに結合したＨＢｓＡｇ含有ワクシニ アウィルス組換え体を用いてＢ１０−４０細胞を感染させ、ｓＡｇ発現レベルを オースリア試験でアッセイした。表Ｘ■に示すように、４２にプロモーターを用 いたＨＢｓＡｇ発現レベルが顕著であることがデータかられかる。

ｖＰ４１０　対照　１．０ ｖＰ４８１　Ｈ［ｌ　２４．３ ｖＰ５４７　４２Ｋ　４４．９ さらに、を椎動物ポックスウィルス環境下におけるＡ■ＥＰＶ４２にプロモータ ー制御の一時的特性を確認するための実験を行った。後期ウィルス転写を阻害し 、これによってＤＮＡ複製を阻害するシトシンアラビノシド４０μｇｌＩ１１の 存在または非存在下において、Ｂ１０−４０細胞の当量培養液をｖＰ５４７で感 染させた。感染２４時間後においての発現レベルをオースリア試験でアッセイし た。この結果から、この４２にプロモーターがワクシニアウィルス複製系中の初 期プロモーターとして認識されることが示唆された。

哺乳類の系における外来遺伝子の発現にＡｉＥＰＶ４２にプロモーターを使用す ることが無を椎動物の系における遺伝子発現にオートグラファ・カリホルニカ（ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｔｏｒｎｉｃａ　）ＮＰＶポリへドリンプロモー ターを使用すること（ラッコウ（Ｌｏｃｋｏｖ）とサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ） 　、バイオテクノロジー（Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　６．４７−５５［１ ９８ｊｌ］）とは明らかに異なることに注目すべきである。ポリへドリンプロモ ーターは、哺乳類細胞中の転写機構によっては認識されない（ティラ（Ｔｊｌａ ）、ビｏｏジー、１２５．１０７−１１７［１９８３］）。哺乳類細胞において Ａ■ＥＰＶ４２にプロモーターを使用することが、昆虫以外のウィルスベクター 中の外来遺伝子を非無を椎細胞中で発現させるのに昆虫ウィルスプロモーターが 利用された最初の例である。

アビポックスウィルス類が同様に４２にエントモボックスプロモーターを認識す るかどうかを調べるため、下記の実験を行った。ＣＥＰ細胞の同一の培養液に対 し、細胞１個当たり１ｏｐｆｕのファウルボックスウイルス、カナクーボックス ウイルス、又はワクシニアウィルスを接種し、同時に１）　４２にプロモーター に連結したＩＩＢＶプレー　Ｓ　２＋ｓＡｇコード配列を含有するプラスミド４ ２に、１７、又は２）既に述べたワクシニアウィルスＨ６プロモーターに連結し たＨＢＶｓＡｇのコード配列を含有するプラスミド１）ＭＰ１５．５ｐｓＰのど ちらかのプラスミド２５ｇで形質転換した。

２４時間後に培養液を凍結して細胞を溶解させ、オーストリア試験を用いて溶解 液におけるＨＢＶｓＡｇの存在を分析した。

表Ｘ■に示した結果を定量的に検討すべきである。この結果、ファウルボックス およびカナクーボックス双方の転写機構が４２にプロモーターを認識でき、かつ 、連結ＨＢＶｓＡｇコード配列の転写を可能とすることが示唆される。

発現レベルはワクシニアウィルスＨ６プロモーターで得られるよりも低いが、陰 性対照で得られたバックグラウンドレベルよりも充分に高い。

表　ｘｍ 無し　４２Ｋ　７．８ 無し　Ｈｅ　７．２ ワクシニア　７．２ ４〜６週齢マウス２０匹の群の足踏に２つの組換え体（ａ）　ｖＦＰ−６（実施 例６に記載したファウルボックス狂犬病組換え体）及び（ｂ）　ｖｃＰ−１８（ 実施例１３に記載したカナクーボックス狂犬病組換え体）のどちらかの所定量希 釈液５０乃至１００μｌを接種した。

１４日に各群からマウス１０匹を層殺し血清を採取した。

実施例７に記載したＲＦＦｒ試験を用いて血清中の抗狂犬病力価を計算した。各 群の残りのマウス１０匹に対し、実施例７で用いた狂犬病ウィルスｃｖｓ株を脳 内接種ルて攻撃した。各マウスは、マウスのＬＤ５ｏの１６倍に相当する３０μ ４を投与された。２′８白に生存マウスを調べ、５０％防御量（ＰＤ５ｏ）を計 算した。結果を表ＸＩＶに示す。

ｖＦＰ−６の接種から判明したマウスの防御レベルは、実施例７で検討したファ ウルボックス組換え体ｖＦＰ−３の接種で示された結果を確認するものである。

ｖｃＰ−１８の接種よりでもたらされる防御レベルはかなり高い。算出ＰＤ５゜ を基準とした時、狂犬病の攻撃に対する防御においては、ファウルボックス狂犬 病組換え体よりもカナクーボックス狂犬病組換え体の方が１００倍有効である。

ファウルボックスｖＰＰ−６カナクーボックスｖＣＰ−１６接種量　ＲＦＰＩ　 生存率　接種量　ＲＦＦＩ　生存率力価　力価 ５．５　１．８　５７１Ｇ　４．５　１．９　８７１０８．５　Ｇ、７　０／１ ０　２．５　１．ｆ　Ｉ／１０１．５　０．８　０／１０　０．５　０．４　０ ／１０ＩＰＤ　−６，１７１ＰＤ　−４，１８ａウイルスの力価は１０ｇ１ｏＴ ＣＩＤ５ｏで表わした。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色してファウルボックス （ＰＰ−１）感染ＣＥＦ溶解液中に存在するタンパク質種を染色することによっ て、見掛けの分子量２５．８ＫＤの主要な分子種が明らかとなった。このタンパ ク質は非感染細胞溶解液中には存在しなかったｄ感染後特定の時期に合成された タンパク質を３５ｓ−メチオニンで放射性標識するパルス実験から、ＰＰ−１誘 発タンパクが豊富にあることが示され、かつ、このタンパクが感染後６時間から ５４時間までに合成されることが示唆された。ピークレベルでは、このＦＰ−１ ２５，８ＫＤのタンパク質は、細胞溶解液中に存在する総タンパクのおよそ５％ から１０％までを占める。

ＰＰ−１誘発２５．８ＫＤタンパク質が多量に存在することから、この遺伝子産 物をコードする遺伝子が強力なＦＰ−１プロモーターエレメントによって制御さ れていることが示唆された。ポックスウィルス組換え体内における外来遺伝子発 現への使用に関して、このプロモーターエレメントの位置を決定するために、感 染５４時間後にＰＰ−１感染ＣＥＰ細胞からポリゾーム調製物を得た。ｌ１ＮＡ をこのポリゾーム調製物から単離して、ウサギ網状赤血球のインビトロ翻訳系に 用いた時、主に２５．８ＫＤのＦＰ−１タンパク質を産生した。

このポリゾームＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとして用いる 最初のｃＤＮＡ鎖合成の鋳型として用いた。

この最初のｃＤＮＡ鎖を、ＦＰ−１ゲノム消化産物のサザンプロット分析におけ るハイブリッド形成プローブとして用いた。これらのハイブリッド形成分析の結 果から、前記２５．８ＫＤタンパク質をコードする遺伝子がｌｏ、５Ｋｂｐ　Ｈ ｌｎｄＩ［［断片に含まれていることが示唆された。次にこのゲノムＨ１ｎｄｍ 断片を単離して市販ベクターｐＢＳ　（ストラフタジーン（ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）、う・ジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア）に連結し、このクロ ーンをｐＦＰ２３に−１と命名した。

ｐＦＰ２３に−１の消化物のプローブとして最初のｃＤＮＡ鎖を用いテハイブリ ッド形成分析を行ったところ、２５．８ＫＤタンパク質遺伝子が３．２Ｋｂｐの Ｅｃｏ　ＲＶ小小片片位置することが判明した。この断片をｐＢＳ中でクローン 化し、ｐＦＰ２３に−２と命名した。

約２．４ＫｂｐのこのＰＰ−Ｉ　Ｅｃｏ　ＲＶ断片の塩基配列はサンガーのジデ オキシチェインターミネータ−法（サンガー（Ｓａｎｇｅｔ）等、プロシーディ ングズ・オフ・ナショナル豐アカデミ−・オフ・サイエンシズＵＳＡ、　７４． ５４８３−５４１ｉ７０９７７］）で決定した。配列の分析から、分子量２５． ８ＫＤの遺伝子産物をコードする読み取り枠（ＯＲＰ）が明らかになった。この ＯＲＦをｐＢＳベクター中でバクテリオファージＴ７ポリメラーゼによりインビ トロランオフ転写すると、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳系（プロメガ・バイ オチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）、マジソン（Ｍａｄｌｓｏｎ）　％ ライスコンシン）に用いた璃合見掛けの分子量２５．ＩＩＫＤのポリペプチド種 を産生ずるＲＮＡ種が得られた。このポリペプチドは、５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル上で、ＦＰ−１感染ＣＥＰｓ溶解液中で観察される豊富な２５．８ＫＤ のタンパク質と泳動度が同じである。これらの結果から、これが、ＰＰ−１が誘 発した多量に存在する２５４Ｋ［遺伝子産物をコードする遺伝子であることが示 唆される。

■、　ＦＰ−１およびワクシニア組換え体においてネコ白血病ウィルスＦｅＬＶ ）ｅｎｖ遺伝子を発現させるためのＦＰ−１２５，１１ＫＤ遺伝子の上流プロモ ーターエレメントの使用ＦＰ−１２５，１１ＫＤ遺伝子制御領域（ＦＰ　２５． ８にプロモーター）及び２１ｂｐの２５．８ＫＤ遺伝子コ一ド配列を含有する２ ７０ｂｐＥｃｏ　ＲＶ／Ｅｃｏ　Ｒ１断片をｐＦＰ２３に−２から単離した。ｐ ＦｅＬＶ２５．８ＦＬとｐＦｅＬＶ　２５．８１Ａを誘導するために用いたＦＰ 　２５．８にプロモーター領域のヌクレオチド配列を以下に示す。この２７０個 のヌクレオチド配列は、２５．８ＫＤ遺伝子産物の開始コドン（ＡＴＧ）の上流 の２４９個のヌクレオチドとコード配列の最初の２１ｂｐを示す。

５’　−ＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＴＡＧ ＴＧＴｒＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡ−ＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＧ ＡＡＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＡＴＡＧＧＡＴＡ（ＴＴＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＴｒＡ ＴＡ−ＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＴｒＣＴＡＴＡＴＡｍＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡ ＣＡＡＡｔＩＸ冴ＡＴＡＡＧＴＴｒＡＴ−ＡＴＧＡＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＡＴＡ ＧＴＧＡＧＴＡＴＡ貫ＡＴＡＡＧＴＡＴＧＣＧＧＧＡＡＴＡＩＩＴＩＩＩＩ；Ａ Ｔｒ−ＴＡＡＣＡＧＣＧＴＡＣＧＡ■刑ＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣ鳩Ｗ ＡＴＡＧＣＡＴＡＡＡπＵ−ＴｒＣ−３’ この断片をプラントエンドとしてＰｅＬＶ　ｅｎｖ配列を含有するＳｍａ　Ｉ消 化ＦＰ−１挿入ベクター（ｐＰｅＬＶＦｌ　：実施例１５参照）へ挿入した。こ の挿入ベクターは、ＦＰ−１ゲノムのｒ７座による組換えを可能とした。このＦ Ｐ　２５．８にプロモーター上流配列をＰｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子の５′側に挿入 しそれらが正しい配向であることを配列分析で確認した。この挿入は、ＡＴＧ置 換に対して完全＾ＴＯを付与することはないが、しかし、前記２５．８ＫＤ遺伝 子によって提供されたＡＴＧはこのＦｅＬＶ　ｅｎｖ　ＡＴＧの枠外にあるので 、融合タンパクは形成されない。ＦｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子の上流にＰＰ２５．８ ＫＤプロモーターを含有するＦＰ−１挿入プラスミドをｐＦｅＬＶ２５．８Ｐｌ と命名した。

ワクシニアウィルス挿入ベクターｐＦｅＬＶＩＡはＦｅＬＶ遺伝子を保有してお り（実施例１５参照）、このベクターを用いて同様の構造体を調製した。このＨ ｅプロモーターを、Ｂｇｌ　ｎとＳｅａ　Ｉによる消化でｐＦｅＬＶＩＡから切 断した。

Ｂｇｌ　ＩＩ制限部位をプラントエンドとした後、ＰＰ２５．８にプロモーター を含有するプラントエンド化Ｅｃｏ　ＲＶ／Ｅｃｏ　Ｒ１断片（２７０塩基）を ＦｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子の５′側に隣接するように挿入した。この構造体を配列 分析で確認した。この組換え体にもＡＴＧ置換に対して完全なＡＴＧはないが、 ２５．８ＫＤ遺伝子のＡＴＧはＰｅＬＶ遺伝子のＡＴＧを持つ枠内にはない。ワ クシニア（コペンハーゲン株）挿入ベクターはＦｅＬＶ遺伝子の５′側に隣接す る２５．８ＫＤ遺伝子上流領域を保有しておりＩ）ＦｅＬＶ２５．８１Ａと命名 した。

この挿入プラスミドｐＰｅＬＶ２５．８Ｆ１とｐＦｅＬＶ２５．１ｌＩＡを、救 援ウィルスとしてのＦＰ−１（ｐＰｅＬＶ２５．ＩＩＰｌ）とワクシニアウイル スコペンハーゲン株（ｐＦｅＬＶ２５．８１Ａ）によるインビトロ組換えに用い た。この組換えの子孫を適当な細胞単層に塗付後、組換えウィルスをβガラクト シダーゼ連結プロティンＡイムノスクリーンとウシ抗ＦｅＬＶ血清（アンチボデ ィーズ社、デービス、カリフォルニア）によって選択した。予備的結果から、こ のＰＰ２５．ｌｌＫプロモーターがポックスウィルス組換え体中における外来遺 伝子の発現を制御できることが示唆された。

アビボックス組換え体２種ｖＦＰ−６とｖｃＰ−１６（実施例６と実施例１３に 記載）を１８日齢ニニワトリ胚１日齢ニワトリおよび２８日齢ニワトリに接種し 、これらのニワトリの反応を３つの基準、すなわち１）５１１化率、ワクチンに 対する反応および死亡率に及ぼすワクチンの影響、２）狂犬病糖タンパク質で誘 起された免疫応答、３）ファウルボックス抗原で誘起された免疫応答、に基づい て評価した。以下に実施した実験を記す。

Ａ、安全性試験　１８日齢２０匹を１群とし、これらの漿膜腔にｖＦＰ−６また はｖｃＰ−１６のいずれかのｌｏｇｌｏＴＣＩＤ５ｏの３．０または４．０倍量 を接種した。岬化後ニワトリを１４日間観察し、血清を採取した。ニワトリ胚に 接種した組換え体２種は卵の畔化率に全く影響を及ぼさず、またニワトリは１４ 日の観察期間において健常のままであった。

１日齢のＳＰＦニワトリ１０匹からなる群に対し、筋注で前記組換え体のいずれ かのｌｏｇｌｏＴＣＩＤ５ｏの３．０倍量を接種した。ニワトリを２８日間観察 し、接種後１４日と２８日において血清検体を採取した。いずれの組換え体でも 接種部位でワクチン反応は全く見られず、ニワトリは２８日の観察期間中健常で あった。

２８日齢ニワトリ１０匹から成る群に対し、組換えウィルスのいずれかを接種し た。投与量は、筋肉経路で３゜０１０ｇ１ｏＴＣＩＤ５ｏまたは皮膚（真鯛）経 路で８．０１ｏｇ１ｏＴＣＩＤ５゜のいずれかとした。ニワトリを２８日間観察 し、接種後１４日と２８日に血清検体を採取した。いずれの組換え体を筋注して も、反応は全く見られなかった。皮膚接種によりファウルボックスは極めて小さ いワクチン反応が生じたが、病巣の大きさは異なっていた。カナクーボックス接 種によって、接種部位に通常の皮膚病巣が生じた。病巣部は全て、実験終了時ま でに退縮した。

Ｂ、免疫反応　実施例７で先に述べたＲＰＰＩ試験を用いて、狂犬病糖タンパク に対する抗体レベルを評価した。各群の結果を、２３．４１Ｕを含有する標準血 清をちととし各血清の力価幾何平均を国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｕｎｌｔｓ）　（ＩＵ）に換算して表わした。最小陽性レベルをＩＩＵと定め、 陽性ニワトリのパーセントをめるに用いた。アビポックスウィルス類に対する抗 体を、ファウルボックスウイルス株を抗原として用い、たＥＬＩＳＡ法で検査し た。各血清検体を２０分の１および８０分の１に希釈した。陽性血清と陰性血清 を用いて標準曲線を描いた。最小陽性レベルは、種々の値の陰性血清の平均プラ ス２標準偏差で算出した。

血清学的検査結果を、ｖＦＰ−６については表Ｘｖに、ｖｃＰ−１８については 表ＸＶＩに示した。

ｖＰＰ−６またはｖＣＰ−１６のいずれかを接種した胚で、狂犬病抗原またはフ ァウルボックス抗原に対する限定された血清学的反応が観察された。前記ファウ ルボックスベクターは、カナクーボックスよりも多くのニワトリにおいて両方の 抗原に対する血清学的反応を誘起したが、この反応もやはりさまざまであった。

１日齢でｖＰＰ−６を接種されたニワトリは、良好な血清学的反応を示し、全て のニワトリが接種後２８日までに狂犬病抗原およびファウルボックス抗原に対し 血清陽性であった。ｖｃＰ−１６接種に対する反応ははるかに低く、２８日目で 狂犬病糖タンパクに対しニワトリの４０％が血清陽性でありアビボックス抗原に 対しニワトリの１０％が血清陽性であった。

２８日齢で筋肉経路でｖＦＰ−６を接種したニワトリは、接種後１４日までに両 方の抗原に対して１００％のセロコンバージョンをしていた。皮膚接種後ニワト リの大部分もセロコンバージョンしていたが、狂犬病抗原およびアビボックス抗 原の双方に対し得られた力価は低かった。既に述べたように、筋肉および皮膚経 路の双方でｖｃＰ−１６を接種されたニワトリはさまざまな反応を示し、筋肉内 接種の狂犬病に対し、最大７０％のセロコンバージョンを示した。カナソーボッ クス接種後のアビボックス抗原に対する低レベルのセロコンバージョンは、二の ウィルス類間の血清学的近縁性の程度を反映しているのかもしれない。

前記の結果から、ｖＰＰ−６およびｖＣＰ−１８の両方ともにある年齢域のニワ トリに接種しても青金であることが示唆された。ファウルボックスベクターｖＦ Ｐ−６は、ニワトリにおける免疫反応惹起に関しより効果的であるように思われ る。しかしアビポックスウィルスであるファウルボックスおよびカナクーボック スの両方の組換え体は、卵中における免疫化に有効であるということは重要であ る。

実施例２５　子豚にｖＦＰ−６を接種することの安全性と免疫１群子豚３匹から 成る２群に対し、２投与経路のひとつで組換えｖＦＰ−６を接種した。

ａ）子豚３匹に筋肉内接種で８．１１ｏｇ、ｏＴＣＩＤ５ｏを投与し、ｂ）子豚 ３匹に経口接種で同量を投与した。

全動物から週間隔で採血後、同経路・同投与量で３５日目に追加接種した。子豚 の臨床徴候を毎日観察した。血清は、ＥＬＩＳＡ法および血清中和検査で抗ファ ウルボックス抗体を調べた。狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験でアッセイした。

子豚は全て良好な健康状態を保ち、接種後病巣部は全く見られなかった。体温曲 線は正常で、接種動物と非接種動物間で全く違いがなかった。

ＥＬＩＳＡおよび血清中和で測定したところ、筋肉内経路および経口経路で接種 を受けた子豚の両方ともが、ファウルボックス抗原に対する血清学的反応を誘起 した。二次接種後において、二次反応が著明であった（結果を示さず）。ＲＦＰ Ｉ試験で測定すると、全子豚が狂犬病糖タンパクに対する免疫学的反応を発症し 、両経路による追加効果は顕著である。これらの結果を表Ｘ■に示す。

前記結果から、フ７ウルボックス／狂犬病組換え体の接種が子豚において無害で あること、およびこの組換え体は経口または筋肉内接種による狂犬病糖タンパク に対し顕著な免疫応答を誘起させることができることが示唆される。

表　Ｘ■ 下記日数における狂犬病抗体（ＲＦＦＩ力価）ワクチン接種　動物　１４　２１ 　２８　３５ｂ４２　４９経　路　番号 ９８４　２．４ａ２．２　２．１　２．２　３　３１、Ｍ、　９８５　２．５　 ２．７　２．６　２．４　３　３９８Ｂ　２．２　２．０　２．１　２Ｊ　３　 ３９８７　Ｂ　２　２．１　２　３　３ 経口　９８８　２．９　２．４　２．２　２．４　２．７　２．５９ｇ９　２． ８　２　１．７　１．８　２．４　２．５ａ力価はＲＦＦＩ試験における蛍光ウ ェル数の減少が５０％を超えるときの最大希釈率の常用対数で表わした。

ｂ動物は３５日目に２回目の接種を受けた。

手続補正書輸発） 平成１年　７月ａｔ日

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．遺伝子産物を脊椎動物中で発現させる方法にして、遺伝子産物をコードし、 かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることなく遺伝子産物を発現させる ＤＮＡを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することを含む方法。
2. ２．前記ウイルスがボックスウイルスである請求項１に記載の方法。
3. ３．前記ウイルスがアビボックスウイルスである請求項２に記載の方法。
4. ４．前記アビボックスウイルスが、ファウルボックスウイルス及びカナリーボッ クスウイルスから成る群から選択される請求項３に記載の方法。
5. ５．前記ウイルスを前記脊椎動物に皮下、皮内、筋肉注射、経口又はイン　オバ ム（ｉｎ　ｏｖｕｍ）で導入することによって、前記脊椎動物に接種する請求項 １に記載の方法。
6. ６．脊椎動物中で抗原に対する免疫応答を誘起させる方法にして、抗原をコード し、かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることなく抗原を発現させるＤ ＮＡを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することを含む方法。
7. ７．前記ウイルスがボックスウイルスである請求項６に記載の方法。
8. ８．前記ウイルスがアビボックスウイルスである請求項７に記載の方法。
9. ９．前記アビボックスウイルスが、ファウルボックスウイルス及びカナリーボッ クスウイルスから成る群から選択される請求項８に記載の方法。
10. １０．前記ウイルスを前記脊椎動物に皮下、皮内、筋肉注射、経口又はイン　オ バムで導入することによって、前記脊椎動物に接種する請求項６に記載の方法。
11. １１．脊椎動物中で脊椎動物病原体に対する免疫応答を誘起させる方法にして、 病原体の抗原をコードし、かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることな く病原体の抗原を発現させるＤＮＡを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種 する方法。
12. １２．前記ウイルスがボックスウイルスである請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記ウイルスがアビボックスウイルスである請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記アビボックスウイルスが、ファウルボックスウイルス及びカナリーボ ックスウイルスから成る群から選択される請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記脊椎動物が哺乳類であり、かつ前記脊椎動物病原体が哺乳類病原体で ある請求項１１に記載の方法。
16. １６．前記抗原が狂犬病Ｇ抗原、ウシ白血病ウイルスのｇｐ５１．３０エンベロ ープ抗原、ネコ白血病ウイルスのＦｅＬＶエンベロープ抗原、及び単純ヘルペス ウイルスの糖タンパクＤ抗原から成る群から選択される請求項１５に記載の方法 。
17. １７．前記哺乳類が、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ウシ、ヒツジ及びブタから 成る群から選択される請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記ウイルスを前記脊椎動物に皮下、皮内、筋肉注射、経口又はイン　オ バムで導入することによって、前記脊椎動物に接種する請求項１１に記載の方法 。
19. １９．脊椎動物中で脊椎動物病原体に対する免疫応答を誘起させる方法にして、 病原体の抗原をコードしかつ発現させるＤＮＡを含有する組換えアビボックスウ イルスを脊椎動物に接種する方法。
20. ２０．前記脊椎動物が哺乳類であり、かつ前記脊椎動物病原体が哺乳類である請 求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記抗原が狂犬病Ｇ抗原、ウシ白血病ウイルスのｇｐ５１、３０エンベロ ープ抗原、ネコ白血病ウイルスのＦｅＬＶエンベロープ抗原、及び単純ヘルペス ウイルスの糖タンパクＤ抗原から成る群から選択される請求項１９に記載の方法 。
22. ２２．前記脊椎動物が鳥であり、かつ前記脊椎動物病原体が鳥類病原体である請 求項１９に記載の方法。
23. ２３．前記抗原が、鳥類インフルエンザ赤血球凝集素抗原、ニューカッスル病ウ イルスの融合タンパク質抗原、ラウス関連ウイルスのＲＡＶ−１エンベロープ抗 原、鳥類インフルエンザウイルスの核タンパク質抗原、感染性気管支炎ウイルス のマトリックス抗原、及び感染性気管支炎ウイルスのペプロマー抗原から成る群 から選択される請求項２２に記載の方法。
24. ２４．アビボックスゲノムの非必須領域に非アビボックス起源のＤＮＡを含有す る組換えアビボックスウイルス。
25. ２５．前記ＤＮＡの発現のための非アビボックスプロモーターをさらに含有する 請求項２４に記載のウイルス。
26. ２６．非アビボックスプロモーターがワクシニアプロモーターである請求項２５ に記載のウイルス。
27. ２７．前記ワクシニアプロモーターが、ＨＨ、ｌｌＫ、及びＰｉから成る群から 選択される請求項２６に記載のウイルス。
28. ２８．非アビボックスプロモーターがエントモボックスプロモーターである請求 項２５に記載のウイルス。
29. ２９．前記ＤＮＡの発現のためのアビボックスプロモーターをさらに含有する請 求項２４に記載のウイルス。
30. ３０．前記ＤＮＡが哺乳類病原体の抗原をコードする請求項２４に記載のウイル ス。
31. ３１．前記抗原が、狂犬病抗原、狂犬病Ｇ抗原、ウシ白血病ウイルスのｇｐ５１ 、３０エンベロープ抗原、ネコ白血病ウイルスのＦｅＬＶエンベロープ抗原、及 び単純ヘルペスウイルスの糖タンパクＤ抗原から選択される請求項３０記載のウ イルス。
32. ３２．前記ＤＮＡが、鳥類病原体の抗原をコードする請求項２４に記載のウイル ス。
33. ３３．前記抗原が、鳥類インフルエンザ赤血球凝集素抗原、ニューカッスル病ウ イルスの融合タンパク質抗原、ラウス関連ウイルスのＲＡＶ−１エンベロープ抗 原、鳥類インフルエンザウイルスの核タンパク質抗原、感染性気管支炎ウイルス のマトリックス抗原、及び感染性気管支炎ウイルスのペプロマー抗原から成る群 から選択される請求項３２に記載のウイルス。
34. ３４．前記アビボックスウイルスがファウルボックスウイルスである請求項２４ に記載のウイルス。
35. ３５．前記アビボックスウイルスがカナリーポックスウイルスである請求項２４ に記載のウイルス。
36. ３６．任意の起源のＤＮＡとこのＤＮＡを発現するためのエントモボックスプロ モーターを中に含有する組換えボックスウイルス。
37. ３７．前記ウイルスがアビボックスウイルスである請求項３６に記載のウイルス 。
38. ３８．前記ウイルスがワクシニアウイルスである請求項３６に記載のウイルス。
39. ３９．任意の起源のＤＮＡとこのＤＮＡを発現するためのアビボックスプロモー ターを中に含有する組換えワクシニアウイルス。