CH679933A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung betrifft ein rekombinantes Virus zur Expression eines Genprodukts in einem Vertebraten, welches Virus eine DNA enthält, die das Genprodukt ohne replikative Vermehrung des Virus in dem Vertebraten codiert und exprimiert. 



  Avipox oder Avipoxvirus ist eine Vögel infizierende, nahe verwandte Gattung von Pockenviren. Die Gattung Avipox schliesst die Arten Geflügelpocken, Kanarienpocken, Schneehuhnpocken, Taubenpocken, Wachtelpocken, Spatzenpocken, Starpocken und Truthahnpocken ein. Die Art Geflügelpocken infiziert Hühner. Sie darf nicht mit der menschlichen Erkrankung Windpocken verwechselt werden. Die Gattung Avipox hat viele gemeinsame Merkmale mit anderen Pockenviren und ist ein Mitglied derselben Unterfamilie, Pockenviren von Vertebraten, wie Vaccinia. Pockenviren, einschliesslich Vaccinia und Avipox, replizieren innerhalb eukaryotischer Wirtszellen. Diese Viren sind gekennzeichnet durch ihre Grösse, Komplexität und durch ihre Replikation im Cytoplasma.

  Allerdings gehören Vaccinia und Avipox zu verschiedenen Gattungen und sind in ihren jeweiligen Molekulargewichten, ihren antigenen Determinanten und in ihrer Wirtsspezifität verschieden; vgl. Intervirology, Bd. 17, Seiten 42-44, Fourth Report of the International Commitee on Taxonomy of Viruses (1982). 



  Avipoxviren infizieren nicht unter Vermehrung nicht-vogelartige Vertebraten, wie Säugetiere einschliesslich Menschen. Des weiteren vermehrt Avipoxvirus sich nicht, wenn man Säugetier- (einschliesslich Menschen-) Zellkulturen beimpft. In solchen Säugetier-Zellkulturen, die mit Avipox infiziert sind, sterben die Zellen wegen eines cytotoxischen Effekts ab, zeigen aber keine Hinweise auf eine virale Infektion unter Vermehrung. 



  Die Impfung eines nicht-vogelartigen Vertebraten wie z.B. eines Säugetiers mit lebenden Avipocken führt  zur  Bildung  einer  Läsion an  der  Impfstelle,  die  an  eine  Impfung  mit  Vac cinia  erinnert.  Es führt aber zu keiner produktiven viralen Infektion. Allerdings ist nun gefunden worden, dass ein auf diese Weise geimpftes Säugetier immunologisch auf das Avipoxvirus reagiert. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis. 



  Impfstoffe, die aus abgetötetem Pathogen oder gereinigten antigenen Komponenten solcher Pathogene zusammengestellt sind, müssen in grösseren Mengen als Lebendvirus-Impfstoffe injiziert werden, um eine effektive Immunantwort hervorzurufen. Der Grund ist, dass Impfung mit Lebendvirus eine viel effizientere Methode der Impfung ist. Ein vergleichsweise kleines Inoculum kann eine effektive Immunantwort hervorrufen, weil das betreffende Antigen während der Replikation des Virus vermehrt wird. Aus medizinischer Sicht bieten Lebendvirusimpfstoffe eine effektivere und länger anhaltende Immunität als eine Impfung mit einem abgetöteten Pathogen oder gereinigten Antigenimpfstoff.

  Daher erfordern Impfstoffe, die aus abgetötetem Pathogen oder gereinigten antigenen Bestandteilen solcher Pathogene zusammengesetzt sind, eine Produktion von grösseren Mengen des Impfstoffmaterials, als es mit Lebendvirus gebraucht wird. 



  Aus der vorangegangenen Diskussion ist klar, dass es medizinische und wirtschaftliche Vorteile für den Gebrauch von Lebendvirus-Impfstoffen gibt. Ein solcher Lebendvirus-Impfstoff enthält Vacciniavirus. Es ist bekannt, dass dieses Virus benutzt werden kann, um mittels rekombinanten DNA-Methoden DNA zu inserieren, die genetische Sequenzen der Antigene von Säugetierpathogenen darstellt. 



  Daher wurden im Stand der Technik Verfahren entwickelt, die die Herstellung von rekombinanten Vacciniaviren durch die Insertion von DNA aus einer beliebigen Quelle (z.B. virale, prokaryotische, eukaryotische, synthetische) in eine nicht-essentielle Region des Vacciniagenoms erlauben, einschliesslich von DNA-Sequenzen, die für antigene Determinanten eines pathogenen Organismus codieren. Bestimmte rekombinante Vac ciniaviren, die mittels dieser Verfahren hergestellt wurden, wurden benutzt, um spezifische Immunität in Säugetieren auf eine Vielfalt von Säugetierpathogenen hervorzurufen, die in der US-A 4 603 112 beschrieben sind, auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird. 



  Unverändertes Vacciniavirus hat eine lange Geschichte eines relativ sicheren und wirkungsvollen Gebrauchs zur Impfung gegen Pocken. Vor der Ausrottung der Pocken allerdings, als unmodifiziertes Vacciniavirus weithin verabreicht wurde, gab es ein geringes, aber reales Risiko von Komplikationen in Form einer generalisierten Vacciniainfektion, besonders bei Patienten, die an Ekzemen oder Immunsuppression litten. Eine weitere seltene, aber mögliche Komplikation, die aus der Impfung mit Vaccinia folgen kann, ist postvaczinale Encephalitis. Die meisten dieser Reaktionen ergaben sich bei der Impfung von Personen mit Hautkrankheiten, wie Ekzemen, oder mit einem geschwächten Immunsystem, oder von Individuen in Haushalten, in denen andere ein Ekzem oder eine geschwächte Immunantwort hatten. Vaccinia ist ein Lebendvirus und ist normalerweise harmlos für eine gesunde Person.

  Allerdings kann es zwischen Individuen mehrere Wochen lang nach der Impfung übertragen werden. Wenn eine Person mit einer Schwächung der normalen Immunantwort entweder durch Impfung oder durch Ansteckung durch eine frisch geimpfte Person infiziert wird, können die Folgen ernst sein. 



  Somit ist verständlich, dass ein Verfahren, welches in der Vorgehensweise die Vorteile von Lebendvirus-Impfung einschliesst, jedoch die vorher angesprochenen Probleme vermindert oder ausschliesst, ein höchst wünschenswerter Fortschritt über den gegenwärtigen Stand der Technik wäre. Dies ist heute um so mehr mit dem Vordringen der als "acquired immune deficiency syndrome" (AIDS) bekannten Krankheit von Bedeutung. Opfer dieser Erkrankung leiden an schwerer Immundysfunktion und können leicht durch eine normalerweise sichere Lebendviruspräparation getroffen werden, wenn sie ent weder direkt oder über den Kontakt mit einer Person, die kurz zuvor mit einem derartigen Lebendvirus-Impfstoff immunisiert worden ist, in Kontakt mit einem solchen Virus kommen. 



  Die Erfindung ist im Anspruch 1 definiert. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. 



   Diese Erfindung ermöglicht, einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der in der Lage ist, Vertebraten gegen pathogene Organismen zu immunisieren, und der die Vorteile eines Lebendvirus-Impfstoffs hat und der wenige oder keine der Nachteile sowohl eines Lebendvirus-Impfstoffs als auch eines abgetöteten Virus-Impfstoffs hat, besonders, wenn er zum Immunisieren von nicht-vogelartigen Vertebraten verwendet wird. 



  Insbesondere ermöglicht diese Erfindung, synthetische rekombinante Avipoxviren zur Verwendung in solchen Impfstoffen zur Verfügung zu stellen. 



  Diese Erfindung ermöglicht, noch ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in vogelartigen und nicht-vogelartigen Vertebraten auf ein Antigen durch Impfung des Vertebraten mit einem synthetischen rekombinanten Avipoxvirus zur Verfügung zu stellen, das sich im Fall der nicht-vogelartigen Vertebraten, wie z.B. Säugetiere, nicht unter Vermehrung unter Produktion von infektiösem Virus repliziert. In diesem Fall begrenzt das Virus sich selbst und reduziert die Möglichkeit der Verbreitung auf nicht-geimpfte Wirte. 



  Des weiteren ermöglicht diese Erfindung ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten auf ein Antigen zur Verfügung zu stellen, wobei das Verfahren die Impfung des Vertebraten mit einem Impfstoff umfasst, der synthetisches rekombinantes, die antigenen Determinanten  eines Pathogens für den Vertebraten einschliessenden und exprimierenden Avipoxvirus enthält. 



  Ausserdem ermöglicht die Erfindung, ein Verfahren zur Expression eines Genprodukts in einem Vertebraten durch Impfung des Vertebraten mit einem rekombinanten Virus zur Verfügung zu stellen, der  das  Genprodukt  ohne  replikative  Vermehrung  des  Virus  in  dem  Vertebraten  codiert  und  exprimiert. 



  Schliesslich ermöglicht die Erfindung, ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten auf ein Antigen durch Impfung des Vertebraten mit einem rekombinanten, DNA enthaltenden Virus zur Verfügung zu stellen, das das Antigen ohne replikative Vermehrung des Virus in dem Vertebraten codiert und exprimiert. 



  In einer Hinsicht steht die Erfindung im Zusammenhang mit einem Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Vertebraten auf ein Pathogen durch Impfung des Vertebraten mit einem syntetischen, rekombinanten Avipoxvirus. Dieser Virus ist modifiziert durch die Gegenwart - in einer nicht-essentiellen Region des Avipoxgenoms - von DNA aus einer beliebigen Quelle, welche ein Antigen des Pathogens codiert und exprimiert. 



  In einer weiteren Hinsicht steht die Erfindung im Zusammenhang mit einem Verfahren zur Expression eines Genprodukts oder zur Auslösung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Vertebraten mit einem rekombinanten, sich nicht replikativ in den Zellen des Vertebraten vermehrenden Virus, das aber das Genprodukt oder das Antigen in den Zellen des Vertebraten exprimiert. 



  In einer weiteren Hinsicht steht die Erfindung im Zusammenhang mit einem syntethischen, rekombinanten Avipoxvirus, das durch Insertion von DNA aus einer beliebigen Quelle, insbesondere aus einer  Nicht-Avipoxquelle, in einer nicht-essentiellen Region des Avipoxvirus-Genoms modifiziert ist. Synthetisch modifizierte Avipoxvirus-Rekombinanten, die exogene (d.h. Nicht-Avipox) Gene tragen, die ein Antigen codieren und exprimieren und die bei einem Vertebratenwirt eine Immunantwort auf das Antigen und deshalb auf das exogene Pathogen hervorrufen, werden besonders zur Impfung nicht-vogelartiger Vertebraten als neue Impfstoffe benutzt, die die Nachteile üblicher, abgetötete oder attenuierte lebende Organismen benutzende Impfstoffe vermeiden. 



  Es muss noch einmal bemerkt werden, dass Avipoxviren sich nur replikativ vermehren können in bzw. passagiert werden können durch Vogelarten oder Vogelzellinien. Die rekombinanten, aus Vogelwirtszellen gewonnenen Avipoxviren rufen eine Impfungsläsion ohne replikative Vermehrung des Avipoxvirus hervor, wenn man nicht-vogelartige Vertebraten, wie Säugetiere, in einer der Impfung von Säugetieren mit Vacciniavirus entsprechenden Weise impft. Trotz des Fehlens einer replikativen Vermehrung des Avipoxvirus in solch einem geimpften nicht-vogelartigen Vertebraten geschieht genügend Expression des Virus, so dass das geimpfte Tier immunologisch auf die antigenen Determinanten des rekombinanten Avipoxvirus und auch auf die antigenen Determinanten antwortet, für die die im Virus enthaltenen exogenen Gene codieren. 



  Bei Impfung einer Vogelart ruft ein solches synthetisches rekombinantes Avipoxvirus nicht nur eine Immunantwort auf die Antigene hervor, die auf der exogenen DNA aus einer beliebigen Quelle enthalten sein können, sondern führt auch zu replikativer Vermehrung des Virus in dem Wirt unter Auslösung einer erwarteten Immunantwort auf den Avipoxvektor per se. 



  Verschiedene Forscher haben vorgeschlagen, rekombinante Geflügelpocken speziell zum Gebrauch als Veterinär-Impfstoffe für den Schutz von Geflügelbeständen herzustellen; vgl.  Boyle und Coupar, J. Gen. Virol. Bd. 67 (1986), Seiten 1591-1600, und Binns et al., Isr. J. Vet. Med., Bd. 42 (1986), Seiten 124-127. Es sind aber weder Vorschläge noch tatsächliche Berichte zum Gebrauch von rekombinanten Avipoxviren zum Erzeugen einer spezifischen Immunität in Säugetieren bekanntgeworden. 



  Stickl und Mayr, Fortschr. Med. 97 (40) (1979), Seiten 1781-1788 beschreiben die Injektion von Avipox-, insbesondere Geflügelpockenviren in Menschen. Allerdings beziehen sich diese Untersuchungen nur auf den Gebrauch von gewöhnlichen Geflügelpocken, um die nicht-spezifische Immunität in Patienten zu verstärken, die an den Nebenwirkungen von Krebs-Chemotherapie leiden. Keine rekombinanten DNA-Techniken sind dabei angewendet. Es gibt keinen Hinweis über einen Avipoxvirus, in das für Antigene von Vertebratenpathogenen codierende DNA inseriert worden ist, oder über ein Verfahren zur Auslösung spezifischer Immunität in Vertebraten. Statt dessen hängt der Stand der Technik von einem allgemeinen und nicht-spezifischen stimulierenden Effekt auf den menschlichen Wirt ab. 



  Eine vollständigere Diskussion der Grundlagen der genetischen Rekombination hilft zum Verständnis, wie die modifizierten rekombinanten Viren der vorliegenden Erfindung hergestellt worden sind. 



   Genetische Rekombination ist allgemein der Austausch homologer Abschnitte von Desoxyribonucleinsäure (DNA) zwischen  zwei Strängen von DNA. (In bestimmten Viren kann Ribonucleinsäure [RNA] die DNA ersetzen). Homologe Abschnitte einer Nucleinsäure sind Abschnitte der Nucleinsäure (RNA oder DNA), die dieselbe Sequenz der Nucleotidbasen haben. 



  Genetische Rekombination kann natürlicherweise stattfinden während der Replikation oder der Erzeugung neuer viraler Genome innerhalb der infizierten Wirtszelle. Daher kann gene tische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyklus in einer mit zwei oder mehr verschiedenen Viren oder anderen genetischen Konstruktionen coinfizierten Wirtszelle stattfinden. Ein DNA-Abschnitt aus einem ersten Genom wird beim Aufbau des Abschnitts des Genoms eines zweiten, coinfizierenden Virus, in welchem die DNA homolog zu der aus dem ersten viralen Genom ist, ausgetauscht. 



  Allerdings kann Rekombination auch zwischen Abschnitten von DNA in verschiedenen, nicht vollkommen homologen Genomen stattfinden. Wenn solch ein Abschnitt aus einem ersten Genom mit einem Abschnitt eines anderen Genoms homolog ist (mit Ausnahme beispielsweise der Anwesenheit eines genetischen Markers oder eines Gens, das für eine antigene, in einen Abschnitt der homologen DNA inserierte Determinante codiert) kann immer Rekombination stattfinden. Die Produkte dieser Rekombination lassen sich dann durch die Anwesenheit jenes genetischen Markers oder Gens nachweisen. 



  Erfolgreiche Expression der als DNA eingeführten genetischen Sequenz des modifizierten infektiösen Virus erfordert zwei Bedingungen: 



  Erstens muss die Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virus stattfinden, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Weder für Geflügelpocken noch für andere Avipoxviren wurden bis jetzt nicht-essentielle Regionen analog zu den für Vacciniavirus beschriebenen, gezeigt. Entsprechend wurden für die vorliegende Erfindung nicht-essentielle Regionen von Geflügelpocken durch Spaltung des Geflügelpocken-Genoms in Fragmente, anschliessende Trennung der Fragmente nach Grösse und Insertion dieser Fragmente in Plasmidkonstrukte zur Vermehrung aufgefunden. Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle, die als extrachromosomale Elemente in vielen Bakterien einschliesslich E. coli gefunden werden.

  Verfahren zur Insertion von DNA-Sequenzen, wie Genen für an tigene Determinanten oder andere genetische Marker in Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und im einzelnen beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). Analog wurde bei der Insertion von genetischen Markern und/oder Antigene codierenden Genen in die clonierten Geflügelpockenfragmente vorgegangen. Die erfolgreich rekombinierten Fragmente (wie durch erfolgreiche Wiedergewinnung des genetischen Markers oder Antigens gezeigt wurde), waren diejenigen, die in eine nicht-essentielle Region des Geflügelpockenvirus inserierte DNA enthielten. 



  Die zweite Bedingung zur Expression inserierter DNA ist die Gegenwart eines Promotors in der korrekten Beziehung zu der inserierten DNA. Der Promotor muss so angeordnet sein, dass er vor der zu exprimierenden DNA-Sequenz liegt. Weil Avipoxviren nicht gut charakterisiert sind und Avipox-Promotoren bislang nicht identifiziert waren, sind bekannte Promotoren von anderen Pockenviren erfolgreich als Teil der vorliegenden Erfindung vor der zu exprimierenden DNA inseriert worden. Geflügelpocken-Promotoren können ebenso erfolgreich benutzt werden, um die Verfahren erfindungsgemäss auszuführen und die Produkte herzustellen. Erfindungsgemäss wurde gefunden, dass mit Geflügelpocken-Promotoren, Vaccinia-Promotoren und Entomopox-Promotoren Transkription in rekombinanten Pockenviren gestartet wird. 



  Boyle and Coupar, J. gen. Virol., Bd. 67 (1986), Seite 1591, vermuten, dass von Vaccinia-Promotoren "erwartet werden kann,  dass sie in (Geflügelpocken)-Virus arbeiten". Die Autoren lokalisierten und clonierten ein Geflügelpocken-TK-Gen (Boyle et al., Virology, Bd. 156 [1987], Seiten 355-365) und inserierten es in Vacciniavirus. Dieses TK-Gen wurde vermutlich wegen der Erkennung der Geflügelpocken-TK-Promotorsequenz durch Vaccinia-Polymerase exprimiert. Trotz ihrer Vermutung inserierten die Autoren allerdings weder einen beliebigen Vaccinia-Promotor in das Geflügelpockenvirus noch beobachte ten sie irgendeine Expression einer fremden, in dem Geflügelpocken-Genom vorhandenen DNA-Sequenz. Vor der vorliegenden Erfindung war nicht bekannt, dass Promotoren aus anderen Pockenviren, wie z.B. Vaccinia-Promotoren, tatsächlich die Expression eines Gens in einem Avipoxgenom ansteuern. 



  Es wurden besonders Geflügelpocken und Kanarienpockenviren als bevorzugte, mittels Rekombination durch Einbau exogener DNA modifizierte Avipoxarten benutzt. 



  Geflügelpocken ist eine Art von Avipox, die insbesondere Geflügel, nicht aber Säugetiere infiziert. Der als FP-5 bezeichnete Geflügelpockenstamm ist ein kommerzieller, aus Hühnerembryonen stammender Geflügelpockenvirus-Impfstamm, und von American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.), Madison, WI, United States Veterinary License No. 165, Serial No. 30 321, erhältlich. 



  Der hier als FP-1 bezeichnete Geflügelpockenstamm ist ein Duvette-Stamm, der zum Gebrauch als Impfstoff in Eintagsküken modifiziert ist. Der Stamm ist ein kommerzieller Geflügelpocken-Impfstamm, der als O DCEP 25/CEP67/ 2309 October 1980 bezeichnet und von Institute Merieux, Inc. erhältlich ist. 



  Kanarienpockenvirus ist eine andere Art von Avipoxvirus. Analog zu den Geflügelpocken infiziert Kanarienpockenvirus besonders Kanarienvögel, nicht jedoch Säugetiere. Der hier als CP bezeichnete Kanarienpockenstamm ist ein kommerzieller Kanarien-Impfstamm, der als LF2 CEP 524 241 075 bezeichnet und von Institute Merieux, Inc. erhältlich ist. 



  Die in diesen Avipoxviren durch genetische Rekombination eingefügten DNA-Sequenzen schliessen folgendes ein: Das lac Z-Gen prokaryotischen Ursprungs; das Toll wutglykoprotein (G)-Gen, das ein Antigen eines nicht-vogelartigen (spezifisch säugetierartigen) Pathogens codiert; das Truthahn-Influenzahämagglutinin-Gen, das für das Antigen eines von einem Avipoxvirus verschiedenen pathogenen Vogelvirus codiert; das gp51,30-Hüllgen des Rinderleukämievirus, einem Säugetiervirus; das Fusionsprotein-Gen des Newcastle Disease Virus (Texasstamm), einem Vogelvirus; das FeLV-Hüllgen des Katzenleukämievirus, einem Säugetiervirus, das RAV-1 env-Gen des Rous-assoziierten Virus, das eine Vogelvirus/Geflügelkrankheit ist; das Nucleoprotein (NP)-Gen des Hühner/Pennsylvania/1/83 Influenzavirus, einem Vogelvirus; das Matrixgen und Peplomergen des infektiösen Bronchitisvirus (Stamm Mass 41), einem Vogelvirus;

   und das Glykoprotein D-Gen (gD) des Herpes simplex Virus, einem Säugetiervirus. 



  Die Isolierung des lac Z-Gens ist beschrieben von Casadaban et al., Methods in Enzymology, Bd. 100 (1983), Seiten 293-308. Die Struktur des Tollwut G-Gens ist z.B. von Anilionis et al., Nature, Bd. 294 (1981), Seiten 275-278 beschrieben. Sein Einbau in Vaccinia und Expression in diesen Vektor werden von Kieny et al., Nature, Bd. 312 (1984), Seiten 163-166 diskutiert. Das Truthahn-Influenzahämagglutinin-Gen ist beschrieben von Kawaoka et al., Virology, Bd. 158 (1987), Seiten 218-227. Das Rinderleukämievirus gp51,30 env-Gen wurde beschrieben von Rice et al., Virology, Bd. 138 (1984), Seiten 82-93. Das Fusionsgen von Newcastle Disease Virus (Texasstamm) ist erhältlich vom Institute Merieux, Inc., als Plasmid pNDV 108. Das Katzenleukämievirus env-Gen wurde von Guilhot et al., Virology, Bd. 161 (1987), Seiten 252-258 be schrieben.

  Das Rous-assoziierte Virus Typ 1 ist erhältlich vom Institute Merieux, Inc., als zwei Clone penVRVIPT und mp19env (190). Hühnerinfluenza NP-Gen ist erhältlich von Yoshihiro Kawaoka vom St. Jude Children's Research Hospital als Plasmid pNP 33. Ein infektiöser Bronchitisvirus cDNA Clon des IBV Mass 41-Matrix-Gens und Peplomergens ist erhältlich vom Institute Merieux, Inc. als Plasmid pIBVM63. 



  Das Herpes simplex Virus gD-Gen ist beschrieben von Watson et al., Science, Bd. 218 (1982), Seiten 381-384. 



  Die rekombinanten Avipoxviren, die nachstehend näher beschrieben werden, schliessen einen von drei Vacciniapromotoren ein. Der Pi-Promotor aus dem Ava I H-Abschnitt von Vaccinia ist beschrieben von Wachsman et al., J. of Inf. Dis., Bd. 155 (1987), Seiten 1188-1197. Insbesondere ist dieser Promotor aus dem Ava I H(Xho I G)-Fragment aus dem L-varianten WR Vacciniastamm abgeleitet, in dem der Promotor die Transkription von rechts nach links steuert. Die Kartenposition des Promotors ist etwa 1,3 Kbp (Kilobasenpaare) vom linken Ende von Ava I H, etwa 12,5 Kbp vom linken Ende des Vacciniagenoms und etwa 8,5 Kbp links von der Hind III C/N  Verbindungsstelle. Der Promotor hat folgende Sequenz:
 
 (GGATCCC)-ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGT-
 AGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG-(AATTC),
 
 wobei die Symbole in Klammern Linkersequenzen sind. 



  Der Hind III H-Promotor (auch "HH" und "H6") wurde durch Standardtranskriptions-Kartierungstechniken festgelegt. Er hat die Sequenz:
 
 ATTCTTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAA
 TAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATT
 ATTTCATTATCGCGATATCCGT
 TAAGTTTGTATCGTAATG.
 



  Die Sequenz ist identisch mit der, die als 5 min seitig des offenenen Leserahmens H6 von Rosel et al., J. Virol., Bd. 60 (1986), Seiten 436-449, beschrieben ist. 



  Der 11K-Promotor ist von Wittek, J. Virol., Bd. 49 (1984), Seiten 371-378 und C. Bertholet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), Seiten 2096-2100, beschrieben. 



  Die rekombinanten Avipoxviren werden in an sich bekannter Weise in zwei Schritten zusammengebaut und analog zu jenen, die in dem vorstehend erwähnten US-Patent 4 603 112 zur Herstellung synthetischer Rekombinanten von Vacciniavirus beschrieben sind. 



  Zuerst wird die in das Virus zu inserierende DNA in ein E. coli Plasmid eingebaut, in das zu einem Abschnitt von nicht-essentieller DNA des Avipoxvirus homologe DNA eingebaut wurde. Getrennt davon ist die zu inserierende DNA-Gensequenz mit einem Promotor ligiert worden. Die Promotor-Gen-Verbindung wird danach in die Plasmidkonstruktion eingefügt, so dass die Promotor-Gen-Verbindung auf beiden Seiten von DNA flankiert ist, die homolog zu einem nicht-essentiellen Abschnitt von Avipox-DNA ist. Die daraus hervorgehende Plasmidkonstruktion wird danach durch Wachstum in E. coli  Bakterien vermehrt. (Plasmid-DNA wird benutzt, um exogenes genetisches Material zu tragen und zu vermehren; Diese Methodik ist bekannt. Beispielsweise sind diese Plasmidtechniken beschrieben von Clewell, J. Bacteriol., Bd. 110 [1972], Seiten 667-676.

  Die Techniken der Isolierung von amplifiziertem Plasmid aus dem E. coli-Wirt sind ebenfalls bekannt und beispielsweise von Clewell et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 62 [1969], Seiten 1159-1166, beschrieben). 



  Das nach dem Wachstum in E. coli isolierte amplifizierte Plasmidmaterial wird nun für den zweiten Schritt benutzt. Dazu wird das die zu inserierende DNA-Gensequenz enthaltende Plasmid in eine Zellkultur (z.B. Hühnerembryofibroblasten) zusammen mit dem Avipoxvirus (wie z.B. Geflügelpockenstamm FP-1 oder FP-5) transfiziert. Rekombination zwischen homologer Geflügelpocken-DNA in dem Plasmid und dem viralen Genom führen zu einem Avipoxvirus, das durch die Gegenwart von Nicht-Geflügelpocken DNA-Sequenzen in einem nicht-essentiellen Abschnitt seines Genoms modifiziert ist. 



  Ein besseres Verständnis der Erfindung und ihrer zahlreichen Vorteile wird man aus den folgenden Beispielen haben, die zur Veranschaulichung gegeben werden. 


 Beispiel 1 
 


 Transiente Expressionsversuche zeigen die Erkennung von Vaccinia-Promotoren
 durch Geflügelpocken RNA-Transkriptionsfaktoren 
 



  Eine Anzahl von Plasmidkonstruktionen wurde hergestellt, die die codierende Sequenz für Hepatitis B Virus Oberflächenantigen (HBSAg) verbunden mit Vacciniavirus-Promotorensequenzen enthielten. Mit 50  mu g jedes Plasmids wurden CEF-Zellen (Hühnerembryofibroblasten) transfiziert, die mit 10 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) Geflügelpockenvirus oder Vacciniavirus pro Zelle infiziert waren. Man liess die Infektion 24 Stunden weiterlaufen und lysierte dann die Zellen durch drei nachfolgende Zyklen von Einfrieren und Auftauen. 



  Die Menge von HBSAg in dem Lysat wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen AUSRIA II - <1><2><5>J Kit von Abbott Laboratories, Diagnostic Division, abgeschätzt. Die Gegenwart oder Abwesenheit von HBSAg ist als Verhältnis der Nettowerte (Probe minus Hintergrund) der unbekannten Probe zu dem negativen, vom Hersteller vorbestimmten Ausschlusswert ausgedrückt. Das führt zu einem P/N (Positiv/Negativ)-Verhältnis. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. 



  Es wurden drei verschiedene Vaccinia-Promotorsequenzen benutzt: Der früh in der Vacciniainfektion vor der DNA-Replikation erkannte Pi-Promotor; der 11K-Promotor, der spät in der Vacciniainfektion nach dem Einsetzen der DNA-Replikation erkannt wird; und der Hind III H (HH)-Promotor, der sowohl früh wie spät in der Vacciniainfektion erkannt wird. Diese Promotoren sind vorstehend beschrieben. 



   Die Daten zeigen, dass das in den Lysaten von infizierten Zellen produzierte HBSAg das Ergebnis der Erkennung von Vaccinia-Promotoren entweder durch Geflügelpocken- oder Vaccinia-Transkriptionsfaktoren ist. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle I 
<tb>Head Col 01 AL=L: Plasmid 
<tb>Head Col 02 AL=L: Virus 
<tb>Head Col 03 AL=L: Beschreibung 
<tb>Head Col 04 AL=L:

  P/N-Verhältnis 
<tb> <SEP>pMP 131piR2 <SEP>Geflügelpocken
Vaccinia <SEP>SAg mit Pi-Promotor
verbunden <SEP>1,8
9,1 
<tb> <SEP>pMPK 22.13S <SEP>Geflügelpocken
Vaccinia <SEP>SAg mit 11K-Promotor
verbunden <SEP>14
2 
<tb> <SEP>pPDK 22.5 <SEP>Geflügelpocken
Vaccinia <SEP>SAg mit 11K-Promotor
verbunden <SEP>92,6
5,6 
<tb> <SEP>pRW 668 <SEP>Geflügelpocken
Vaccinia <SEP>SAg mit HH-Promotor
verbunden <SEP>77
51,4 
<tb> <SEP>kein Plasmid <SEP>Geflügelpocken <SEP>1,1 
<tb> <SEP>kein Plasmid <SEP>Vaccinia <SEP>1,3 
<tb> <SEP>pMPK 22.13S <SEP>(kein Virus) <SEP>1,3 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 2 
 


 Konstruktion eines das lac Z-Gen enthaltenden rekombinanten Geflügelopckenvirus vFP-1 
 



  Ein Fragment in einem nicht-essentiellen Abschnitt des Geflügelpockenvirus wurde wie folgt lokalisiert und isoliert. 



  Mit Nuclease Bal 31 wurde die einzelsträngige endständige Haarnadelstruktur von FP-5-DNA entfernt. Das Klenow (grosse) Fragment der DNA-Polymerase I wurde zur Bildung glatter Enden verwendet. Nach Entfernung der Haarnadelstruktur wurden  Fragmente hergestellt durch Verdau mit der Restriktionsendonuclease Bgl II. Dieser Verdau führt zu einer Reihe von FP-5-Fragmenten, die durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt wurden. 



  Ein stumpfendig 8.8 Kbp BglII-Fragment wurde isoliert und mit dem kommerziell erhältlichen Plasmid pUC 9 ligiert, das mit Bam HI und Sma I gespalten worden war. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde pRW 698 genannt. 



  Um die Grösse des Geflügelpockenfragments zu verringern, wurde dieses Plasmid mit Hind III gespalten, wobei zwei weitere Fragmente erzeugt wurden. Ein 6.7 Kbp-Fragment wurde verworfen, und das übrigbleibende 4.7 Kbp-Fragment wurde mit  sich selbst ligiert, so dass sich ein neues, als pRW 699 bezeichnetes Plasmid, ergab. 



  Um ein am 11K-Promotor gestartetes lac Z-Gen in dieses Plasmid einzubauen, wurde pRW 699 mit Eco RV gespalten, das das Plasmid nur an einer Stelle spaltet. Das lac Z-Fragment unter der Kontrolle des 11K-Promotors wurde danach als stumpfendiges Pst I-Bam HI-Fragment inseriert und ergab ein neues Plasmid, das pRW 702 genannt wurde. Der lac Z-Clon stammt von pMC 1871, wie beschrieben von Casadaban et al., a.a.O. Der 11K-Promotor wurde an das achte Codon des lac Z-Gens mittels eines Bam HI-Linkers ligiert. 



  Mit Rekombinationstechniken, wie denjenigen, die für Vaccinia in der US-A 4 603 112 beschrieben sind, wurde das Plasmid pRW 702 mit dem Geflügelpockenvirus FP-5 rekombiniert, das auf CEF wuchs, wobei die folgenden Verfahren benutzt wurden, um vFP-1 herzustellen. 50  mu g pRW 702 DNA wurde in einem Endvolumen von 100  mu l mit 0,5  mu g von Gesamtgenom-Geflügelpocken-DNA gemischt. Dazu wurden gefügt: 10  mu l 2,5 molar CaCl2 und 110  mu l 2 x HEBS-Puffer (pH 7), der hergestellt wurde aus 
 
 40 mMol Hepes
 300 mMol NaCl
 1,4 mMol Na2HPO4
 10 mMol KCl
 12 mMol Dextrose.
 



  Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 200  mu l einer Geflügelpockenvirussuspension (verdünnt auf 5 pfu/Zelle) hinzugefügt und die Mischung auf 60-mm-Schalen, die einen primären CEF Monolayer enthielten, geimpft. Ausserdem wurden 0,7 ml Eagles-Medium, das 2% fötales Kälberserum (FBS) enthielt, zur gleichen Zeit hinzugefügt. Die Platten wurden 2 Stunden bei  37 DEG C bebrütet, danach wurden weitere 3 ml Eagles-Medium mit 2% FBS zugesetzt und die Platten 3 Tage lang bebrütet. Die Zellen wurden lysiert durch drei folgende Zyklen von Einfrieren und Auftauen; die Virusnachkommenschaft wurde danach auf die Anwesenheit von Rekombinanten untersucht. 



  Ein Nachweis einer erfolgreichen Einfügung des 11K-Promotor-lac Z-Gens durch Rekombination in das Genom von Geflügelpocken FP-5 wurde dadurch geführt, dass auf Expression des lac Z-Gens getestet wurde. Das lac Z-Gen codiert das Enzym  beta -Galactosidase, das das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl- beta -D-galactosidase (X-gal) spaltet und dabei ein blaues Indolylderivat freisetzt. Blaue Plaques wurden als positive Rekombinanten ausgewählt. 



  Ausserdem wurde die erfolgreiche Einführung von lac Z in das Genom von Geflügelpocken FP-5 und seine Expression bestätigt durch Immunpräzipitation des  beta -Galactosidaseproteins mittels kommerziell verfügbarer Antiseren und Standardverfahren, die vFP-1 infizierte CEF, BSC (Affennierenzellinie - ATCC CCL26), VERO (Affennierenzellinie - ATCC CCL81) und MRC-5 (diploide menschliche Lungenzellinie - ATCC CCL171) benutzen. 



  Weiter wurde die Expression der  beta -Galactosidase durch das rekombinante Virus vFP-1 in vivo bestätigt. Dazu wurden Kaninchen und Mäuse mit dem Virus geimpft. Der Anstieg in den Titern der gegen das  beta -Galactosidaseprotein gerichteten Antikörper in dem Serum der geimpften Tiere wurde gemessen. 



  Insbesondere wurde das rekombinante vFP-1 von Wirtszellverunreinigungen gereinigt und intradermal an zwei Stellen auf jeder Seite von zwei Kaninchen eingeimpft. Jedes Kaninchen erhielt insgesamt 10<8> pfu. 



  Den Tieren wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen. Die Seren wurden für einen ELISA-Test benutzt, der eine kommerziell erhältliche Präparation von gereinigter  beta -Galactosidase als Antigenquelle benutzt. 



  Sowohl die mit dem rekombinanten vFP-1 geimpften Kaninchen als auch die Mäuse zeigten eine im ELISA-Test nachweisbare Immunantwort auf das  beta -Galactosidaseprotein. In beiden Arten  war die Antwort eine Woche nach der Impfung feststellbar. 


 Beispiel 3 
 


 Konstruktion des Tollwut G-Gen und lac Z enthaltenden rekombinanten
 Virus vFP-2 aus Geflügelpockenvirus FP-5 
 



  Ein 0,9 Kbp Pvu II-Fragment wurde aus FP-5 erhalten und mittels Standardverfahren zwischen die beiden Pvu II-Stellen in pUC 9 eingefügt. Die daraus hervorgehende Konstruktion, als pRW 688.2 bezeichnet, besitzt asymmetrisch in dem Pvu II-Fragment zwei etwa 30 bp voneinander entfernte Hinc II-Stellen und bildet daher einen langen und einen kurzen Arm des Fragments. 



   Unter Benutzung bekannter Techniken wurden zwischen diese Hinc II-Stellen Oligonucleotidadaptoren eingesetzt, um  Pst I- und Bam HI-Stellen einzuführen und auf diese Weise das Plasmid pRW 694 herzustellen. 



  Dieses Plasmid wurde nun mit Pst I und Bam HI gespalten und  das mit dem vorstehend beschriebenen 11K Vacciniapromotor verbundene lac Z-Gen eingefügt. Man erhielt das neue Plasmid pRW 700. 



  Zur Herstellung eines vom Pi-Promotor gesteuerten Tollwut G-Gens wurde die Bgl II-Stelle, die 5 min proximal zum Tollwutgen liegt (vgl. Kieny et al., a.a.O.), an den Enden glatt gemacht und an die aufgefüllte Eco RI-Stelle des vorstehend beschriebenen Pi-Promotors ligiert. 



  Diese Konstruktion wurde in die Pst I-Stelle von pRW 700 eingefügt und ergab das Plasmid pRW 735.1, das damit die fremde Gensequenz Pi-Tollwut G-11K-lac Z enthält. Dieses Insert ist so innerhalb des Plasmids angeordnet, dass der lange Pvu II-Hinc II-Arm der FP-5 Donorsequenz auf der 3 min -Seite des lac Z-Gens liegt. 



  Die so erzeugte fertige Konstruktion wurde mit Geflügelpockenvirus FP-5 durch Infektion/Transfektion von Hühnerembryofibroblasten (durch Verfahren wie vorstehend beschrieben)  rekombiniert. Man erhielt das rekombinante Geflügelpockenvirus vFP-2. Dieses rekombinante Virus wurde nach Anfärbung mit X-gal ausgewählt. 



  Die korrekte Insertion und Expression sowohl des lac Z-Marker-Gens wie des Tollwut G-Gens wurde mit einer Anzahl zusätzlicher, nachstehend beschriebener Verfahren, überprüft. 



  Ein Immunfluoreszenznachweis des Tollwutantigens durch spezifische Antikörper zeigte erfolgreich die Expression des Tollwutantigens auf der Oberfläche von vogelartigen und nicht-vogelartigen, mit vFP-2 Virus infizierten Zellen an. 



  Wie zuvor wurde die Expression des Tollwutantigens und der  beta -Galactosidase durch vogelartige und nicht-vogelartige, mit vFP-2 Virus infizierte Zellen durch das Immunpräzipitationsverfahren bestätigt. 



  Ein weiterer Nachweis, dass die Ausführungsform vFP-2 dieser Erfindung ein erfolgreiches rekombinantes Virus ist, das die Gene für Tollwut G und  beta -Galactosidase trägt, wurde durch Impfung von zwei Kaninchen mit vFP-2 Virus erreicht. Beide Kaninchen wurden intradermal mit 1 x 10<8> pfu vFP-2 pro Kaninchen beimpft. Beide Kaninchen entwickelten typische Pockenläsionen. Den Kaninchen wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen; die Seren wurden durch ELISA getestet, um die Anwesenheit der für das Tollwutglykoprotein und das  beta -Galactosidaseprotein spezifischen Antikörper nachzuweisen. 



  Wie nachstehend in Tabelle II dargestellt, zeigte Kaninchen 205 nachweisbare Mengen von anti- beta -Galactosidase-Antikörper im ELISA-Test 1 Woche nach der Impfung. Diese Menge stieg nach 2 Wochen auf einen Titer von 1 in 4000, der 5 Wochen lang nach der Impfung aufrechterhalten wurde. Benutzte man einen Antigencapture ELISA-Test, zeigten Seren aus Kaninchen 205 nachweisbare Mengen von anti-Tollwut-Antikörpern zwischen 3 und 10 Wochen nach der Impfung. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle II
Antikörperproduktion durch Kaninchen 205 gegen Tollwutantigen und  beta -Galactosidase-Protein 
<tb>Head Col 01 AL=L: Zeit 
<tb>Head Col 02 AL=L:

  Antikörpertiter
(Kehrwert der Serumverdünnung) 
<tb> <SEP>Vorbluten anti- beta -Galactosidase <SEP>0 
<tb> <SEP>Woche 1 <SEP>500 
<tb> <SEP>Wochen 2-5 (jede) <SEP>4000 
<tb> <SEP>Woche 6 <SEP>500 
<tb> <SEP>Woche 9 <SEP>250 
<tb> <SEP>Vorbluten anti-Tollwut <SEP>0 
<tb> <SEP>Woche 3 <SEP>200 
<tb> <SEP>Woche 6 <SEP>200 
<tb> <SEP>Woche 10 <SEP>100 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 4A 
 


 Konstruktion eines rekombinanten Virus vFP-3 mit einem Tollwut G-Gen 
 unter Promotorkontrolle aus Geflügelpockenvirus FP-1 
 



  Diese Ausführungsform zeigt, dass das Tollwut G-Gen vollständig auch durch andere Stämme von Geflügelpocken als FP-5, insbesondere durch einen anderen, als FP-1 bezeichneten Stamm von Geflügelpockenvirus exprimiert wird. 



  Wie in Beispiel 3 wurde ein 0,9 Kbp Pvu II-Fragment aus FP-1 unter der Annahme erhalten, dass, wie in FP-5, das Fragment einen nicht-essentiellen Abschnitt enthalten würde. 



  Dieses Fragment wurde zwischen die beiden Pvu II-Stellen von pUC 9 eingefügt und das Plasmid mit der Bezeichnung pRW 731.15R erzeugt. 



  Dieses Plasmid besitzt asymmetrisch innerhalb des Pvu II-Fragments zwei etwa 30 bp voneinander entfernte Hinc II-Stellen und bildet so einen langen und einen kurzen Arm dieses Fragments. 



  Ein kommerziell erhältlicher Pst I-Linker
 
 (5 min ) - CCTGCAGG - (3 min )
 
 wurde zwischen die beiden Hinc II-Stellen eingefügt und ergab das Plasmid pRW 741. 



  Ein von dem Promotor HH abhängiges Tollwut G-Gen wurde in dieses Plasmid in die Pst I-Stelle eingefügt und erzeugte das neue Plasmid pRW 742B. Durch Rekombination dieses Plasmids mit FP-1 nach Infektion/Transfektion von CEF-Zellen wurde das Virus vFP-3 erhalten. 



  Das ATG Translationsstartcodon des von dem HH-Promotor gesteuerten offenen Leserahmens wurde dem Startcodon des Tollwut G-Gens überlagert, indem ein die Eco RV-Stelle in dem HH-Promotor und die Hind III-Stelle in dem Tollwut G-Gen überlagerndes synthetisches Oligonucleotid benutzt wurde. Das 5 min -Ende dieses Tollwutgens unter dem HH-Promotor wurde in an sich bekannter Weise so modifiziert, dass es eine Pst I-Stelle enthielt. Die Konstruktion wurde danach mit der Pst I-Stelle von pRW 741 ligiert und ergab pRW 742B. Die Orientierung der Konstruktion in dem Plasmid ist die gleiche wie in dem vorher in Beispiel 3 diskutierten pRW 735.1. 



  Die Rekombination wurde gemäss Beispiel 2 ausgeführt. Die daraus hervorgehende Rekombinante wurde vFP-3 genannt. 



  Die Expression von Tollwutantigen sowohl in vogelartigen wie in nicht-vogelartigen, mit vFP-3 Virus infizierten Zellen wurde durch Immunpräzipitation und Immunfluoreszenztechniken (wie weiter oben beschrieben) bestätigt. 



  Ein weiterer Beweis, dass die Ausführungsform vFP-3 dieser Erfindung ein erfolgreiches rekombinantes, die Gene für Tollwut G exprimierendes Virus ist, wurde durch intradermale Impfung von Paaren von Kaninchen mit dem rekombinanten Virus erhalten. Zwei Kaninchen wurden intradermal geimpft mit je-  weils 1 x 10<8> pfu vFP-3. Beide Kaninchen entwickelten typische Pockenläsionen, die eine maximale Grösse 5 bis 6 Tage nach der Impfung erreichten. Den Kaninchen wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen und die Seren durch ELISA getestet, um die Anwesenheit von für das Tollwutglykoprotein spezifischen Antikörpern nachzuweisen. 



   Ausserdem wurden 5 Ratten intradermal jeweils mit 5 x 10<7> pfu vFP-3 geimpft. Alle Tiere entwickelten Läsionen. 



  Sowohl die Kaninchen als auch die Ratten entwickelten nachweisbare Mengen von für Tollwut spezifischen Antikörpern innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung. Zwei Kontrollkaninchen, die intradermal mit dem Ausgangs-FP-l-Virus geimpft waren, zeigten keine nachweisbaren Mengen an anti-Tollwut-Antikörpern. 



  Um die Möglichkeit auszuschliessen, dass die Antikörperantwort auf die Einführung von Tollwutantigen zurückzuführen ist, das zufällig von dem Impfvirus mitgetragen wurde oder in die Membran des rekombinanten Geflügelpockenvirus integriert war, statt auf, wie vorgeschlagen, de novo Synthese von Tollwutantigen durch das rekombinante Virus in dem Tier, wurde das vFP-3-Virus chemisch inaktiviert, und damit wurden Kaninchen geimpft. 



  Das gereinigte Virus wurde über Nacht bei 4 DEG C in Gegenwart von 0,001%  beta -Propiolacton inaktiviert und danach durch Zentrifugieren pelletiert. Das pelletierte Virus wurde in mit 10 mM Tris gepufferter Kochsalzlösung aufgenommen, ultraschallbehandelt und titriert, um sicherzustellen, dass kein infektiöses Virus übriggeblieben war. Zwei Ratten wurden intradermal mit inaktiviertem vFP-3 und zwei mit einer entsprechenden Menge von unbehandeltem rekombinantem Virus beimpft. Die Grösse der Läsionen wurde festgestellt. 



  Beide Kaninchen, die unbehandeltes vFP-3 erhalten hatten, entwickelten typische Pockenläsionen, die 5 Tage nach der Beimpfung als 4-5+ eingestuft wurden. Kaninchen, die mit inaktiviertem Virus beimpft waren, entwickelten ebenso Läsionen, doch diese wurden 5 Tage nach der Impfung als 2+ eingestuft. 



  Den Kaninchen wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen und die Seren durch ELISA auf die Gegenwart von für Tollwut spezifischen Antikörpern und für Geflügelpocken spezifischen Antikörpern getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=9 
<tb>Title: Tabelle III 
<tb>Head Col 02 to 05 AL=L: Lebendes vFP-3 
<tb>Head Col 06 to 09 AL=L: Inaktiviertes vFP-3 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Kaninchen: 
<tb>SubHead Col 02 to 03 AL=L: No. 295 
<tb>SubHead Col 04 to 05 AL=L: No. 318 
<tb>SubHead Col 06 to 07 AL=L: No. 303 
<tb>SubHead Col 08 to 09 AL=L:

  No. 320 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Antikörper: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Tollwut: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>FP: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Tollwut: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>FP: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Tollwut: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>FP: 
<tb>SubHead Col 08 AL=L>Tollwut: 
<tb>SubHead Col 09 AL=L>FP: 
<tb> <SEP>getestet:
Woche P.I 
<tb> <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 
<tb> <SEP>2 <SEP>250 <SEP>4000 <SEP>500 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>50 <SEP>0 <SEP>1000 
<tb> <SEP>3 <SEP>1000 <SEP>4000 <SEP>500 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>2000 
<tb> <SEP>4 <SEP>1000 <SEP>4000 <SEP>2000 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>2000 
<tb> <SEP>5 <SEP>4000 <SEP>4000 <SEP>2000 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>2000 <SEP>0 <SEP>4000 
<tb> <SEP>6 <SEP>4000 <SEP>4000 <SEP>4000 <SEP>4000 <SEP>0 <SEP>2000 <SEP>0 <SEP>2000 
<tb></TABLE> 



  In diesem Test wurde der Titer-Endwert (ausgedrückt als Kehrwert der Serumverdünnung) willkürlich als 0,2 gesetzt,  nachdem die Absorptionswerte aller Seren vor der "Belastungsinfektion" abgezogen waren. Die Kaninchen 295 und 318, die das lebende Virus erhalten hatten, entwickelten eine Immunantwort auf das Tollwutglykoprotein und auf Geflügelpockenvirusantigene. Die Kaninchen 303 und 320 entwickelten ebenfalls eine Immunantwort auf Geflügelpockenvirusantigene; der Titer war jedoch niedriger. Keines dieser Kaninchen entwickelte eine nachweisbare Antwort auf das Tollwutglykoprotein. 



  Dieser Befund bestätigt, dass die in dem Kaninchen hervorgerufene Immunantwort auf die de novo Expression des in dem rekombinanten Virus enthaltenden Tollwutglykoproteingens zurückzuführen ist und nicht eine Antwort auf irgendein zufällig in dem Impfvirus mitgetragenes Glykoprotein ist. 


 Beispiel 4B 
 


 Konstruktion des rekombinanten Virus vFP-5, das nichtangesteuerte Tollwut
 G-Gene enthält,  aus Geflügelpockenvirus FP-1 
 



  Die Expression eines fremden, durch Rekombination in das Geflügelpockengenom inserierten Gens, erfordert die Anwesenheit eines Promotors. Dies wurde gezeigt durch die Herstellung einer weiteren Rekombinante vFP-5, die mit vFP-3 mit Ausnahme der Weglassung des HH-Promotors identisch ist. Die Gegenwart des Tollwutgens in dieser Rekombinante wurde durch Nucleinsäurehybridisierung bestätigt. Kein Tollwutantigen wurde jedoch in mit dem Virus infizierten CEF-Zellkulturen festgestellt. 


 Beispiel 5 
 


 Versuche mit in vitro Passagieren zum Nachweis, ob-Geflügelpockenvirus
  in nicht-vogelartigen Zellen repliziert. 
 



  Ein Versuch wurde durchgeführt, bei dem drei Zellsysteme (eines vogelartig und zwei nicht-vogelartig) mit dem parentalen FP-1-Stamm oder mit rekombinanten vFP-3 beimpft wurden. Jeweils zwei Schalen mit CEF, MRC-5 oder VERO wurden mit FP-1 oder vFP-3 mit einer Eingangsmultiplizität von 10 pfu pro Zelle beimpft. 



  Nach 3 Tagen wurde jeweils eine Schale geerntet. Das Virus wurde durch drei aufeinanderfolgende Zyklen von Einfrieren  und Auftauen freigesetzt und auf einen frischen Monolayer derselben Zellinie wieder geimpft. Dieses wurde über sechs aufeinanderfolgende Passagen wiederholt; am Ende des Experiments wurden Proben jeder Passage auf Virusinfektiosität auf CEF-Monolayern titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IVa zusammengefasst. Sie zeigen, dass eine Reihenpassage sowohl von FP-1 als auch vFP-3 in CEF-Zellen möglich ist, aber in keiner der beiden nicht-vogelartigen Zellinien. Infektiöses Virus konnte nicht in VERO- oder MRC-5-Zellen nach 3 oder 4 Passagen nachgewiesen werden. 



  Die zweite Schale wurde benutzt, um festzustellen, ob Virus, das nicht durch direkte Titration nachweisbar war, nach Amplifikation in permissiven CEF-Zellen nachgewiesen werden konnte. Nach 3 Tagen wurden Zellen aus der zweiten Schale durch Abschaben geerntet, ein Drittel dieser Zellen lysiert und auf einen frischen CEF-Monolayer geimpft. Wenn der volle cytopathische Effekt (CPE) erreicht war oder 7 Tage nach der Infektion, wurden die Zellen lysiert. Die Virusausbeute wurde titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IVB zusammengefasst. Wurde Passage in CEF-Zellen benutzt, um ein etwa vorhandenes Virus zu vermehren, konnte kein Virus nach vier oder fünf Passagen nachgewiesen werden. 



   Versuche, eine permanent infizierte Zelle zu etablieren, schlugen fehl. 



  In einem weiteren Versuch, Hinweise einer andauernden viralen Expression in nicht-vogelartigen Zellen zu entdecken, wurden die vorstehend zur Virustiterbestimmung benutzten Proben in einem Standardimmunodottest eingesetzt, bei dem anti-Geflügelpocken-Antikörper und anti-Tollwut-Antikörper benutzt wurden, um die Anwesenheit des jeweiligen Antigens nachzuweisen.

  Die Ergebnisse dieser Tests bestätigen die Titrationsergebnisse. 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle IVA
Passagierversuch 
<tb>Head Col 01 AL=L: Virus zur Beimpfung 
<tb>Head Col 02 to 04 AL=L: FP-1 
<tb>Head Col 05 to 07 AL=L: vFP-3 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Zelltyp: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>CEF: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>VERO: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>MRC-5: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>CEF: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>VERO: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>MRC-5: 
<tb> 
<tb>SubHead Col 01 to 07 AL=L:

  Passage 
<tb> <SEP>1 <SEP>6.6<a> <SEP>4.8 <SEP>4.9 <SEP>6.6 <SEP>5.4 <SEP>6.2 
<tb> <SEP>2 <SEP>6.7 <SEP>2.9 <SEP>3.7 <SEP>6.5 <SEP>4.2 <SEP>5.1 
<tb> <SEP>3 <SEP>6.4 <SEP>1.4 <SEP>1.0 <SEP>6.4 <SEP>1.7 <SEP>4.4 
<tb> <SEP>4 <SEP>6.1 <SEP>N.D<b> <SEP>N.D <SEP>6.2 <SEP>N.D <SEP>1.0 
<tb> <SEP>5 <SEP>6.4 <SEP>N.D <SEP>N.D <SEP>6.3 <SEP>N.D <SEP>N.D 
<tb> <SEP>6 <SEP>5.7 <SEP>N.D <SEP>N.D <SEP>5.9 <SEP>N.D <SEP>N.D 
<tb> 
 a - Virustiter in log10 pfu pro ml
b - nicht nachweisbar
  
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle IVB
Vermehrungsversuch 
<tb>Head Col 01 AL=L: Virus zur Beimpfung 
<tb>Head Col 02 to 04 AL=L:

  FP-1 
<tb>Head Col 05 to 07 AL=L: vFP-3 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Zelltyp: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>CEF: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>VERO: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>MRC-5: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>CEF: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>VERO: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>MRC-5: 
<tb> 
<tb>SubHead Col 01 to 07 AL=L: Passage 
<tb> <SEP>1 <SEP>6.4<a> <SEP>6.2 <SEP>6.4 <SEP>6.5 <SEP>6.3 <SEP>6.4 
<tb> <SEP>2 <SEP>7.5 <SEP>6.3 <SEP>6.0 <SEP>6.5 <SEP>6.3 <SEP>5.5 
<tb> <SEP>3 <SEP>6.2 <SEP>6.7 <SEP>5.3 <SEP>5.9 <SEP>6.1 <SEP>6.3 
<tb> <SEP>4 <SEP>5.6 <SEP>4.6 <SEP>3.9 <SEP>5.7 <SEP>4.8 <SEP>5.8 
<tb> <SEP>5 <SEP>6.3 <SEP>4.1 <SEP>N.D <SEP>6.1 <SEP>4.7 <SEP>4.7 
<tb> <SEP>6 <SEP>6.2 <SEP>N.D<b> <SEP>N.D <SEP>6.2 <SEP>N.D <SEP>N.D 
<tb> 
 a - Virustiter in log10 pfu pro ml
b - nicht nachweisbar
  
<tb></TABLE> 


 Beispiel 6 
 


 Zusätzliche Rekombinanten von Geflügelpocken FP-1:

   vFP-6, vFP-7, vFP-8 und vFP-9 
 



  Die rekombinanten Viren vFP-6 und vFP-7 wurden nach folgenden Verfahren hergestellt. 



  Ein 5,5 Kbp Pvu II-Fragment von FP-1 wurde zwischen die beiden Pvu II-Stellen in pUC 9 eingefügt und ergab das Plasmid pRW 731.13. Dieses Plasmid wurde anschliessend an einer singulären Hinc II-Stelle gespalten und an den Enden stumpf gemachtes, vom HH-Promotor abhängiges Tollwut G-Gen eingefügt, was die Plasmide pRW 748A und B ergab, die die beiden entgegengesetzten Orientierungen des Inserts darstellen. Die Plasmide pRW 748A und B wurden dann getrennt benutzt, um CEF-Zellen zusammen mit FP-1 Virus zu infizieren und ergaben durch Rekombination vFP-6 bzw. vFP-7. Dieser Genort wird nun als Genort f7 bezeichnet. 



  Ein 10 Kbp Pvu II-Fragment von FP-1 wurde zwischen die beiden Pvu II-Stellen von pUC 9 eingefügt und ergab pRW 731.15. Dieses Plasmid wurde anschliessend an einer singulären Bam HI-Stelle-gespalten und anschliessend ein vom 11K-Promotor  abhängiges lac Z-Genfragment eingefügt, was pRW 749A und B erzeugte, die die entgegensetzten Orientierungen des Inserts darstellen. Rekombination dieser Donorplasmide mit FP-1 führte zu vFP-8 bzw. vFP-9. Dieser Genort wird nun als Genort f8 bezeichnet. 



  vFP-8 und vFP-9 exprimierten (wie mittels X-gal nachgewiesen) das lac Z-Gen. vFP-6 und vFP-7 exprimierten das Tollwut G-Gen, wie durch ein Tollwut-spezifisches Antiserum nachgewiesen wurde. 


 Beispiel 7 
 


 Immunisierung mit vFP-3 zum Schutz von Tieren gegen eine Belastungsinfektion 
 mit lebenden Tollwutviren 
 



  Gruppen von 20 weiblichen 4 bis 6 Wochen alten SPF-Mäusen wurden mit 50  mu l vFP-3 auf der Pfotenfläche mit Dosen im Bereich 0,7 bis 6,7 TCID50 pro Maus beimpft. (Die TCID50 oder tissue culture infectious dose ist diejenige Dosis, bei der 50% der Gewebekulturzellen einen cytopathischen Effekt erleiden). 14 Tage nach der Impfung wurden 10 Mäuse aus jeder Gruppe geopfert und Serumproben für RFFI-Tests gesammelt. Die übrigen 10 Mäuse wurden einer Belastungsinfektion durch Beimpfung mit 10 LD50 des Tollwutstamms CVS über den intracerebralen Weg ausgesetzt und die Überlebenden 14 Tage nach der Belastungsinfektion berechnet. 



  Die Ergebnisse sind in Tabelle VA zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle VA 
<tb>Head Col 01 AL=L: Dosis vFP-3 
log10 TCID50 
<tb>Head Col 02 AL=L: Tollwutantikörper 
Titer log10
Verdünnung* 
<tb>Head Col 03 AL=L: Überlebensrate 
<tb> <SEP>6,7 <SEP>1,9 <SEP>8/10 
<tb> <SEP>4,7 <SEP>1,8 <SEP>0/10 
<tb> <SEP>2,7 <SEP>0,4 <SEP>0/10 
<tb> <SEP>0,7 <SEP>0,4 <SEP>0/10 
 * Gemessen als RFFI-(Rapid Fluorescent Focus Inhibition) Tests, Laboratory Techniques in Rabies, Third Ed., 354-357, WHO Genf.
  
<tb></TABLE> 



  Das Experiment wurde mit 12,5 LD50 des Tollwutvirus als Belastungsinfektion wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VB zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle VB 
<tb>Head Col 01 AL=L: Dosis vFP-3 
log10 TCID50 
<tb>Head Col 02 AL=L: Tollwutantikörper 
Titer log10
Verdünnung* 
<tb>Head Col 03 AL=L: Überlebensrate 
<tb> <SEP>6,7 <SEP>2,8 <SEP>5/10 
<tb> <SEP>4,7 <SEP>2,1 <SEP>2/10 
<tb> <SEP>2,7 <SEP>0,6 <SEP>0/8 
<tb> <SEP>0,7 <SEP>0,6 <SEP>0/8 
 * Siehe Tabelle VA
  
<tb></TABLE> 



  Zwei Hunde und zwei Katzen wurden mit einer einzigen subkutanen Impfung mit 8 log10 TCID50 des rekombinanten vFP-3 immunisiert. Zusätzlich wurden 2 Hunde und 4 Katzen von entsprechendem Alter und Gewicht als nicht-geimpfte Kontrollen gehalten. Allen Tieren wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen. Am Tag 94 wurde jeder Hund einer Belastungsinfektion durch Beimpfung in den Schläfenmuskel mit zwei Dosen von 0,5 ml eines Speicheldrüsenhomogenats des NY-Stamms von Tollwutvirus (vom Institute Merieux, Inc. erhältlich) ausgesetzt. Die Gesamtdosis entsprach 10 000 Mäuse LD50 über einen intrazerebralen Weg. Die sechs Katzen wurden auf ähnliche Weise einer Belastungsinfektion durch Beimpfung in den Nackenmuskel mit zwei Dosen von 0,5 ml der gleichen Virussuspension ausgesetzt. Die Gesamtdosis pro Tier entsprach 40 000 Mäuse LD50 über einen intrazerebralen Weg.

   Die Tiere wurden täglich beobachtet. Alle nicht-geimpften Tiere starben am in der Tabelle VI angezeigten Tag an Tollwutsymptomen. Die geimpften Tiere überlebten die Belastungsinfektion und wurden 3 Wochen lang nach dem Tod des letzten Kontrolltieres beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=9 
<tb>Title: Tabelle VI 
<tb>Head Col 01 to 02 AL=L: Überleben/Tier 
<tb>Head Col 03 AL=L: Impfung 
<tb>Head Col 04 to 08 AL=L: Titer nach Impfung am Tag 
<tb>Head Col 09 AL=L: Zeitpunkt des Todes 
<tb> 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>0: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>14: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>21: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>28: 
<tb>SubHead Col 08 AL=L>94: 
<tb> <SEP>Katzen 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>7015:

  <SEP>vFP-3<a> <SEP>0 <SEP>2.2<b> <SEP>2.4 <SEP>2.4 <SEP>1.5 <SEP>+ 
<tb> <SEP>7016 <SEP>vFP-3 <SEP>0 <SEP>1.7 <SEP>1.9 <SEP>2.0 <SEP>1.3 <SEP>+ 
<tb> <SEP>8271 <SEP>c<c> <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>d/13<d> 
<tb> <SEP>T10 <SEP>c <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>d/12 
<tb> <SEP>T41 <SEP>c <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>d/13 
<tb> <SEP>T42 <SEP>c <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>d/12 
<tb> <SEP>Hunde <SEP>426 <SEP>vFP-3 <SEP>0 <SEP>0.8 <SEP>1.0 <SEP>1.1 <SEP>1.2 <SEP>+ 
<tb> <SEP>427 <SEP>vFP-3 <SEP>0 <SEP>1.5 <SEP>2.3 <SEP>2.2 <SEP>1.9 <SEP>+ 
<tb> <SEP>55 <SEP>c <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>d/15 
<tb> <SEP>8240 <SEP>c <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>0 <SEP>d/16 
<tb> 
 a - Die mit vFP-3 geimpften Katzen und Hunde erhielten 8 log10 TCID50 über den subkutanen Weg.
b - Titer ausgedrückt als log10 der höchsten Serumverdünnung,

   die eine Reduktion von mehr als 50% in der Anzahl der fluoreszierenden Vertiefungen in einem RFFI-Test ergibt.
c - Nicht-geimpfte Kontrolltiere.
d - Tier starb/Tag des Todes nach der Belastungsinfektion.
  
<tb></TABLE> 



  In weiteren Experimenten wurden die rekombinanten Viren vFP-2 und vFP-3 zur Beimpfung von Rindern über mehrere verschiedene Wege benutzt. 



  Geimpfte Tiere wurden auf anti-Tollwutantikörper an den Tagen 6, 14, 21, 28 und 35 getestet. Alle Tiere zeigen eine  serologische Antwort auf das Tollwutantigen. Dies ist in Tabelle VII A gezeigt. 
<tb><TABLE> Columns=8 
<tb>Title: Tabelle VIIA
Antikörpertiter in mit vFP-3 geimpften Säugetieren (Rinder) anti-Tollwut neutralisierende Antikörper
RFFI-Test log10 Verdünnung 
<tb>Head Col 01 AL=L: Rind Nr. 
<tb>Head Col 02 AL=L:

  Tag 
<tb>Head Col 03 AL=L: 0 
<tb>Head Col 04 AL=L: 6 
<tb>Head Col 05 AL=L: 14 
<tb>Head Col 06 AL=L: 21 
<tb>Head Col 07 AL=L: 28 
<tb>Head Col 08 AL=L: 35 
<tb> <SEP>7.3 log10 TCID50 
<tb> <SEP>1420 (intradermal) <SEP>negativ <SEP>0.6 <SEP>2 <SEP>1.7 <SEP>1.8 <SEP>1.7 
<tb> <SEP>8 log10 TCID50 
<tb> <SEP>1419 (subkutan) <SEP>negativ <SEP>1.6 <SEP>2.2 <SEP>2.1 <SEP>2.1 <SEP>1.9 
<tb> <SEP>8 log10 TCID50 
<tb> <SEP>1421 (intramuskulär) <SEP>negativ <SEP>0.9 <SEP>2.2 <SEP>2.2 <SEP>1.8 <SEP>1.7 
<tb> <SEP>7.3 log10 TCID50 
<tb> <SEP>1423 (intramuskulär) <SEP>negativ <SEP>0.9 <SEP>1.1+ <SEP>1+ <SEP>1+ <SEP>1.1+ 
<tb> 
 + nicht signifikant
  
<tb></TABLE> 



  Alle Rinder wurden am Tag 55 nach der Impfung wieder geimpft mit 8 log10 TCID50. Sie zeigten eine anamnetische Antwort auf das Tollwutantigen. In der Verstärkernachimpfung wurden alle Rinder subkutan geimpft ausser Nr. 1421, das wieder intramuskulär geimpft wurde. RFFI-Titer wurden bestimmt an den Tagen 55, 57, 63, 70, 77 und 86.

  Die Ergebnisse sind in Tabelle VIIB zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=8 
<tb>Title: Tabelle VIIB 
<tb>Head Col 01 AL=L: Rind Nr. 
<tb>Head Col 02 AL=L: Tag 
<tb>Head Col 03 AL=L: 55 
<tb>Head Col 04 AL=L: 57 
<tb>Head Col 05 AL=L: 63 
<tb>Head Col 06 AL=L: 70 
<tb>Head Col 07 AL=L: 77 
<tb>Head Col 08 AL=L: 86 
<tb> <SEP>1419 <SEP>1.7 <SEP>1.5 <SEP>2.9 <SEP>2.9 <SEP>2.6 <SEP>2.9 
<tb> <SEP>1420 <SEP>1.0 <SEP>0.5 <SEP>1.9 <SEP>2.3 <SEP>2.2 <SEP>2.0 
<tb> <SEP>1421 <SEP>1.3 <SEP>1.2 <SEP>2.9 <SEP>2.7 <SEP>2.5 <SEP>2.5 
<tb> <SEP>1423 <SEP>1.0 <SEP>0.7 <SEP>2.4 <SEP>2.5 <SEP>2.5 <SEP>2.2 
<tb></TABLE> 



  Alle Daten beziehen sich auf vFP-3 ausser bei Tier 1423, wo sie sich auf vFP-2 beziehen. 



  Rinder, Katzen und Kaninchen wurden auch intradermal mit bekannten Mengen von Geflügelpockenvirus geimpft. Wundschorf  wurde von den Tieren nach etwa 1 Woche gesammelt. Dieser wurde zermahlen, in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und zur Bestimmung der Virusmengen titriert. 



  Nur Restmengen an infektiösem Virus konnten nachgewiesen  werden. Dies zeigt, dass keine Infektion unter Vermehrung in vivo erfolgte. 


 Beispiel 8 
 


 Impfung von Hühnern mit vFP-3 
 



  Hühner wurden mit rekombinantem Geflügelpockenvirus vFP-3 geimpft, um die Expression von Fremd-DNA durch ein rekombinantes Geflügelpockenvirus in einem System zu zeigen, das eine replikative Vermehrung des Vektors gestattet. 



  Weisse Leghornhühner wurden intramuskulär mit 9 log10 TCID50 vFP-3 oder durch Flügeldurchstechen mit 3 log10 TCID50 vPP-3 geimpft. Blutproben wurden für einen RFFI-Test auf Tollwutantikörpertiter 21 Tage nach der Impfung entnommen. Titer am Tag 21 in geimpften Hühnern waren signifikant höher als Titer in den Kontrollen am Tag 21. Der Durchschnittstiter der  nicht-infizierten Kontrollen betrug 0,6, derjenige der intramuskulär geimpften Vögel 1,9, derjenige der Flügel-durchstochenen Vögel 1,2. 


 Beispiel 9 
 


 Truthahninfluenza H5 HA-Antigen exprimierende rekombinante Geflügelpocken vFP-11 
 



  Vogelarten können mit den rekombinanten Avipoxviren der Erfindung gegen Vogelpathogene immunisiert werden. 



  So wurde das nachstehend beschriebene neue Plasmid pRW 759, das sich vom Geflügelpockenvirus FP-1 ableitet und ein Hämagglutiningen (H5) von A/Truthahn/Irland/1378/83 (TYHA)  unter der Kontrolle des Hind III H-Promotors enthält, zur Transfektion von gleichzeitig mit dem Elternvirus FP-1 infizierten CEF-Zellen, benutzt. Rekombinantes Geflügelpockenvirus vFP-11 wurde durch die weiter vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten. 



  Die Synthese eines Hämagglutininmoleküls in mit VFP-11 infizierten Zellen wurde durch Immunpräzipitation von über den Stoffwechsel radiomarkierten, infizierten Zellysaten unter Benutzung eines spezifischen anti-H5-Antikörpers und Standardverfahren bestätigt. Die spezifische Immunpräzipitation von Vorstufen-Hämagglutinin mit einem Molekulargewicht von ca. 63 kd (Kilodalton) und zwei Spaltprodukten mit einem Molekulargewicht von 44 und 23 kd wurde gezeigt. Keine derartigen Proteine wurden aus einem Lysat von nicht-infizierten CEF-Zellen oder von mit Elternvirus FP-1 infizierten Zellen ausgefällt. 



   Zum Nachweis, dass das in den mit dem rekombinanten Geflügelpocken vFP-11 infizierten Zellen produzierte HA-Molekül an  der Zelloberfläche exprimiert wurde, wurden Immunfluoreszenz-Untersuchungen durchgeführt. Mit dem rekombinanten Geflügelpockenvirus vFP-11 infizierte CEF-Zellen zeigten eine  starke Fluoreszenzfärbung an der Oberfläche. In mit dem Elternvirus FP-1 infizierten Zellen wurde keine Fluoreszenz gemessen. 



  Das Plasmid pRW 759 wurde wie folgt hergestellt:
 pRW 742B (vgl. Beispiel 4) wird durch teilweisen Verdau mit Pst I linearisiert und das Fragment nachgespalten mit Eco RV, um das Tollwut G-Gen zu entfernen, wobei der HH-Promotor an dem verbleibenden Fragment von etwa 3,4 Kbp bleibt. Nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase wird ein synthetisches Oligonucleotid eingefügt, damit der HH-Promotor mit TYHA am ATG verbunden werden kann, was zu pRW 744 führt. 



  Dieses Plasmid wurde durch teilweisen Verdau mit Dra I linearisiert; das linearisierte Fragment wurde mit Sal I gespalten und das grössere Fragment wiedergewonnen und mit alkalischer Phosphatase behandelt. 



  Schliesslich wurde pRW 759 erzeugt durch Einfügen des isolierten Sal I-Dra I-Fragments hergestellt, das die codierende Sequenz von TYHA enthält, in den pRW 744 Vektor, wie von Kawaoka et al., Virology, Bd. 158 (1987), Seiten 218-227 gezeigt wurde. 


 Beispiel 10 
 


 Immunisierung mit vFP-11 zum Schutz von Vögeln gegen eine Belastungsinfektion 
 mit lebendem Influenzavirus 
 



  Zum Nachweis der immunogenen Wirkung von rekombinantem Geflügelpockenvirus vFP-11, wurden Impf- und Belastungsinfektion-Experimente in Hühnern und Truthühnern durchgeführt. 



  Spezifisch pathogenfreie (SPF) weisse Leghornhühner wurden im Alter von 2 Tagen und 5 Wochen durch Durchstechen der Flügelhaut mit einer Doppelnadel geimpft, wie sie für übliche Impfung von Hühnern mit Geflügelpockenvirus benutzt wird. 



  Etwa 2  mu l vFP-11 mit 6 x 10<5> pfu wurde jedem Vogel gegeben.     Den älteren Vögeln wurde vor der Impfung Blut entnommen, und allen Vögeln wurde vor der Belastungsinfektion und 2 Wochen später Blut entnommen. 



  Zu Vergleichszwecken wurde eine zweite Gruppe von Hühnern mit einem üblichen H5-Impfstoff beimpft, der aus einem inaktivierten H5N2-Stamm in einer Wasser-in-\l-Emulsion besteht. 



  Inaktiverter H5N2-Impfstoff wurde aus A/Mallard/NY/189/82 (H5N2) Influenzavirus gewonnen, das in 11 Tage alten befruchteten Hühnereiern gezogen war; die infizierte Allantoisflüssigkeit mit einem HA-Titer von 800/0,1 ml und einem infektiösen Titer von 10<8,5>/0,1 ml wurde mit 0,1% Propiolacton inaktiviert und in einer Wasser-in-\l-Emulsion, wie bei Stone et al., Avian Dis., Bd. 22 (1978) Seiten 666-674 und Brugh et al., Proc. Second Inter. Sym. on Avian Influenza (1986), Seiten 283-292 beschrieben, suspendiert. In 0,2 ml Volumen wurde der Impfstoff 2 Tage und 5 Wochen alten SPF weissen Leghornhühnern über den subkutanen Weg unter die Haut auf der Innenseite des Schenkelmuskels verabreicht. 



  Eine dritte und vierte Gruppe von Hühnern erhielt parenteral ursprüngliches Virus FP-1 bzw. keinen Impfstoff. 



  Hühner wurden einer Belastungsinfektion unterworfen mit ca. 10<3> LD50 des hochpathogenen A/Turkey/Ireland/1378/83 (H5N8) oder A/Chick/Penn/1370/83 (H5N2) Influenzavirus durch Verabreichung von 0,1 ml auf die Nasenlöcher jedes Vogels. Zwei Tage alte Vögel wurde einer Belastungsinfektion 6 Wochen nach der Impfung ausgesetzt und 5 Wochen alte Vögel wurden einer Belastungsinfektion 5 Wochen nach der Impfung ausgesetzt. Die Vögel wurden täglich auf Krankheitssymptome beobachtet, die sich durch Anschwellen und Cyanose des Gesichts und des Kammes und durch Blutungen an den Füssen (solche Vögel konnten häufig nicht stehen), Lähmung und Tod anzeigten. Die meisten Todesfälle geschahen zwischen 4 und 7 Tagen nach  der Infektion. 3 Tage nach der Infektion wurden Abstriche aus der Trachea und der Cloaca aus jedem lebenden Huhn auf Virus getestet durch Beimpfung von befruchteten Eiern.

  Die Hühner, die entweder mit Wildtyp oder rekombinantem Geflügelpockenvirus geimpft waren, entwickelten typische Läsionen am Flügelnetzgewebe. Einer Pustelbildung bis zum 3. Tag um jeden Nadelstich herum folgte eine zelluläre Infiltration mit Schorfbildung und Erholung nach 7 Tagen. Es wurden keine sekundären Läsionen gebildet, und es gab keinen Hinweis auf eine Verbreitung auf nicht-geimpfte Hühner, die in Kontakt kamen.

  Die Ergebnisse des Belastungsinfektions-Experiments sind in Tabelle VIII und die damit verbundenen serologischen Befunde in Tabelle IX zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Title: Tabelle VIII
Durch in Geflügelpocken exprimiertes H5 vermittelter Schutz von Hühnern 
<tb>Head Col 01 AL=L: Belastungsinfektion 
<tb>Head Col 02 AL=L: Impfstoff 
<tb>Head Col 03 AL=L: Alter der 
Hühner 
<tb>Head Col 04 AL=L: Schutz
Krank/Tot/Gesamt 
<tb>Head Col 05 to 06 AL=L:

  Virus 
<tb> 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Trachea: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Cloaca: 
<tb> <SEP>Ty/Ireland (H5N8) <SEP>Geflügelpocken-H5 (vFP-11) <SEP>2 Tage <SEP>0/0/10 <SEP>0/10 <SEP>0/10 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>0/0/5 <SEP>0/5 <SEP>0/5 
<tb> <SEP>inaktivierter H5N2 <SEP>2 Tage <SEP>0/0/9 <SEP>0/9 <SEP>0/9 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>0/0/5 <SEP>0/5 <SEP>0/5 
<tb> <SEP>Geflügelpocken-
Kontrolle <SEP>2 Tage <SEP>10/9/10 <SEP>2/6 <SEP>3/6 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>4/3/5 <SEP>0/5 <SEP>4/5 
<tb> <SEP>Kein <SEP>2 Tage <SEP>10/9/10 <SEP>2/7 <SEP>5/7 
<tb> <SEP>2 Tage* <SEP>2/1/2 <SEP>2/2 <SEP>2/2 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>2/2/5 <SEP>0/5 <SEP>1/5 
<tb> <SEP>Ck/Penn (H5N2) <SEP>Geflügelpocken-H5 (vFP-11) <SEP>2 Tage <SEP>0/0/10 <SEP>8/10 <SEP>0/10 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>0/0/6 <SEP>5/6 <SEP>2/6 
<tb> <SEP>inaktivierter H5N2 <SEP>2 Tage <SEP>0/0/8 <SEP>2/8 <SEP>0/8 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>0/0/5 <SEP>3/5 

   <SEP>0/5 
<tb> <SEP>Geflügelpocken-
Kontrolle <SEP>2 Tage <SEP>10/1/10 <SEP>10/10 <SEP>10/10 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>5/0/5 <SEP>5/5 <SEP>5/5 
<tb> <SEP>Kein <SEP>2 Tage <SEP>9/3/9 <SEP>9/9 <SEP>9/9 
<tb> <SEP>2 Tage* <SEP>2/2/2 <SEP>2/2 <SEP>2/2 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>5/2/5 <SEP>5/5 <SEP>5/5 
<tb> <SEP>* Vier nicht geimpfte Vögel wurden zusammen mit der Geflügelpocken-H5-Gruppe von 10 Vögeln gehalten und aufgezogen, um die Ausbreitung von Geflügelpocken-H5 nachzuweisen. 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=11 
<tb>Title: Tabelle IX
Durch Impfung mit vFP-11 oder einem inaktivierten Influenzavirusimpfstoff hervorgerufene Antikörperbildung 
<tb>Head Col 01 AL=L: Belastungs-
infektion 
<tb>Head Col 02 AL=L: Impfstoff 
<tb>Head Col 03 AL=L: Alter der Hühner 
<tb>Head Col 04 to 07 AL=L: HI Titer auf (a) 
<tb>Head Col 08 to 11 AL=L:

   Festsetzung der Infektiosität 
<tb>SubHead Col 04 to 05 AL=L: Ty/Ireland 
<tb>SubHead Col 06 to 07 AL=L: Ck/Penn 
<tb>SubHead Col 08 to 09 AL=L: Ty/Ireland 
<tb>SubHead Col 10 to 11 AL=L: Ck/Penn 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Post-1: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Post-2: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Post-1: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>Post-2: 
<tb>SubHead Col 08 AL=L>Post-1: 
<tb>SubHead Col 09 AL=L>Post-2: 
<tb>SubHead Col 10 AL=L>Post-1: 
<tb>SubHead Col 11 AL=L>Post-2:

   
<tb> <SEP>Ty/
Ireland (H5N8) <SEP>Geflügelpocken-H5 <SEP>2 Tage <SEP>15<(c)> <SEP>156 <SEP>&lt <SEP>65 <SEP>70 <SEP>2,500 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>100 <SEP>480 <SEP>&lt <SEP>20 <SEP>160 <SEP>10,000 
<tb> <SEP>inaktiviertes H5N2 <SEP>2 Tage <SEP>30 <SEP>70 <SEP>30 <SEP>50 <SEP>65 <SEP>1,000 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>350 <SEP>600 <SEP>180 <SEP>200 <SEP>240 <SEP>2,500 
<tb> <SEP>Geflügelpocken <SEP>2 Tage <SEP>&lt <SEP>160<(1)(b)> <SEP>&lt <SEP>20 <SEP>&lt <SEP>300<(1)> 
<tb> <SEP>Kontrolle <SEP>5 Wochen <SEP>&lt <SEP>1280<(2)> <SEP>&lt <SEP>60 <SEP>&lt <SEP>10,000<(2)> 
<tb> <SEP>kein <SEP>2 Tage <SEP>&lt <SEP>80<(1)> <SEP>&lt <SEP>20 <SEP>&lt <SEP>300<(1)> 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>&lt <SEP>2000<(3)> <SEP>&lt <SEP>60 <SEP>&lt <SEP>70<(3)> 
<tb> <SEP>Ck/Penn <SEP>Geflügelpocken-H5 <SEP>2 Tage <SEP>15 <SEP>600 <SEP>&lt <SEP>90 <SEP>&lt <SEP>70 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>80 <SEP>2500 <SEP>&lt 

   <SEP>300 <SEP>&lt <SEP>2,500 
<tb> <SEP>inaktiviertes H5N2 <SEP>2 Tage <SEP>60 <SEP>300 <SEP>20 <SEP>70 <SEP>10 <SEP>400 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>300 <SEP>500 <SEP>100 <SEP>200 <SEP>150 <SEP>1,500 
<tb> <SEP>Geflügelpocken <SEP>2 Tage <SEP>&lt <SEP>60<(6)> <SEP>&lt <SEP>120 <SEP>&lt <SEP>40 
<tb> <SEP>Kontrolle <SEP>5 Wochen <SEP>&lt <SEP>90 <SEP>&lt <SEP>140 <SEP>&lt <SEP>40 
<tb> <SEP>kein <SEP>2 Tage <SEP>&lt <SEP>60<(6)> <SEP>&lt <SEP>160 <SEP>&lt <SEP>25 
<tb> <SEP>5 Wochen <SEP>&lt <SEP>160<(3)> <SEP>&lt <SEP>150 <SEP>&lt <SEP>70 
<tb> 
 (a) Den 5 Wochen alten Vögeln wurde vor der Impfung Blut entnommen, das in HI- und Neutralisationstests geprüft wurde; keiner enthielt nachweisbare Mengen an Antikörper; die Ergebnisse sind nicht gezeigt.

  Den 2 Tage alten Hühnern wurde 6 Wochen nach Impfung (Post-1) und den 5 Wochen alten Vögeln wurde 5 Wochen nach Impfung (Post-1) Blut entnommen; beiden Gruppen wurde 2 Wochen nach der Belastungsinfektion (Post-2) Blut entnommen. Die Zahlen stellen gemittelte Antikörpertiter aus der gleichen wie in Tabelle I beschriebenen Gruppe von Hühnern dar.
(b) Die Zahlen in Klammern geben an, wieviele die Belastungsinfektion überlebten:
&lt = weniger als 10.
(c) Hämagglutinationshemmungstests (HI) wurden in Mikrotiterplatten ausgeführt, wobei Rezeptor-zerstörende-Enzym-behandelte Seren verwendet wurden (4 HA-Einheiten von Ty/Ire-Virus, und 0,5% Hühnererythrocyten wie beschrieben bei Palmer et al., Immun. Series Nr. 6, 51-52, U.S. Dept. Health, Education and Welfare [1975]).

  Die Infektivitäts-Neutralisierungstests wurden ausgeführt, indem 10<3>EID50 von Ty/Ire-Virus mit Verdünnungen der Seren für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiniert wurden, dem eine Impfung mit Aliquots in befruchtete Eier folgte. Viruswachstum wurde bestimmt durch Hämagglutinationstests nach Bebrütung der Eier für 2 Tage bei 33 DEG C.
  
<tb></TABLE> 



  Hühner, die mit dem rekombinanten Geflügelpocken-H5 (vFP-11) oder dem inaktivierten H5N2-Influenzaimpfstoff in Adjuvans     beimpft wurden, waren vor der Belastungsinfektion mit dem homologen Ty/Ire (H5N8) Influenzavirus und dem verwandten, aber unterscheidbaren Ck/Penn (H5N2)-Influenzavirus geschützt. Im Gegensatz dazu zeigte die Mehrheit der Vögel, die mit dem Ausgangs-FPV beimpft waren oder keinen Impfstoff erhalten hatten, klinische Anzeichen von hochpathogener Influenza einschliesslich eines Anschwellens und einer Cyanose  im Gesicht und Kamm, Blutungen an den Füssen und Lähmungen. Die Mehrheit dieser Vögel starb. Die geimpften Vögel schieden keine nachweisbaren Mengen von Ty/Ire, aber Ck/Penn aus. 



  Sowohl die inaktivierten als auch die rekombinanten Impfstoffe induzierten HI und neutralisierende Antikörper auf Ty/Ire, doch die Mengen an Antikörper, die von der Geflügelpocken-H5-Rekombinante vFP-11 vor der Belastungsinfektion induziert waren, hemmten nicht HA oder neutralisierten das heterologe Ck/Penn H5. Ungeachtet dessen waren die Hühner vor einer Belastungsinfektion sowohl mit Ty/Ire als auch mit Ck/Penn-Influenzaviren geschützt. 



  Durch Impfung mit vFP-11 induzierte Immunität gegen H5-Influenza dauerte mindestens 4 bis 6 Wochen und war kreuzreagierend. Zum Nachweis der Dauer und Spezifität der Antwort wurde eine Gruppe von 4 Wochen alten Hühnern in das Flügelnetzgewebe mit vFP-11 wie zuvor beschrieben geimpft und in monatlichen Abständen mit dem kreuzreagierenden Ck/Penn-Virus einer Belastungsinfektion ausgesetzt. Wiederum waren keine HI-Antikörper vor der Belastungsinfektion nachweisbar. Ungeachtet dessen waren die Vögel auch nach 4 Monaten geschützt. 



  Ausserdem induziert das durch vFP-11 exprimierte H5 eine schützende Immunantwort in Truthühnern. Weisse Outbread-Truthühner wurden im Alter von 2 Tagen und 4 Wochen durch Beimpfung am Flügelnetzwerk wie vorbeschrieben beimpft. Die  Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=9 
<tb>Title: Tabelle X
Durch in vFP-11 exprimiertem H5-HA vermittelter Schutz von Truthühnern 
<tb>Head Col 01 AL=L: Impfstoff 
<tb>Head Col 02 AL=L: Alter der 
Vögel 
<tb>Head Col 03 AL=L: Schutz
krank/tot/
gesamt 
<tb>Head Col 04 to 05 AL=L: Virusnachweis 
<tb>Head Col 06 to 07 AL=L: HI-Antikörper 
Ty/Ire 
<tb>Head Col 08 to 09 AL=L:

  Neutralisierende 
Antikörper log10 
zu Ty/Ire 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Trachea: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Cloaca: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Post-1: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>Post-2: 
<tb>SubHead Col 08 AL=L>Post-1: 
<tb>SubHead Col 09 AL=L>Post-2: 
<tb> <SEP>vFP-11 
Rekombinante <SEP>2 Tage <SEP>1/1/5 <SEP>5/5 <SEP>3/5 <SEP>&lt10 <SEP>160 <SEP>&lt1 <SEP>4.32 
<tb> <SEP>4 Wochen <SEP>2/1/6 <SEP>2/6 <SEP>0/6 <SEP>&lt10 <SEP>640 <SEP>1.05 <SEP>4.16 
<tb> <SEP>Kontakt <SEP>2 Tage <SEP>2/2/2 <SEP>2/2 <SEP>2/2 <SEP>&lt10 <SEP>tot <SEP>&lt1 <SEP>tot 
<tb> <SEP>Kontrollen <SEP>4 Wochen <SEP>2/2/2 <SEP>2/2 <SEP>2/2 <SEP>&lt10 <SEP>tot <SEP>&lt1 <SEP>tot 
<tb></TABLE> 



   In beiden Altersgruppen wurde eine signifikante Überlebensrate gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen Ty/Ire-Virus beobachtet. Nicht geimpfte Kontaktkontrollvögel wurden zusammen mit den geimpften Vögeln gehalten, um eine Verbreitung des rekombinanten Virus zu prüfen. Diese Vögel überlebten die Belastungsinfektion nicht. 


 Beispiel 11 
 


 Konstruktion der das Hühnerinfluenza-Nucleoprotein (NP)-Gen exprimierenden
 Geflügelpockenvirus FP-1-Rekombinante vFP-12 
 



  Das Plasmid pNP33 enthält einen cDNA-Clon des Influenzavirus Hühner/Pennsylvania/1/83 Nucleoproteingens (NP). Nur die 5 min - und 3 min -Enden des etwa 1,6 Kbp langen NP-Gens wurden sequenziert. NP wurde aus pNP 33 in mit Sma I verdautem pUC 9 überführt als ein stumpfendiges 5 min  Cla I-Xho I 3 min -Fragment, wobei die pUC 9-Eco RI-Stelle am 3 min -Ende war, wodurch pRW 714 erzeugt wurde. Das Translationsstartcodon (ATG) von NP enthält die folgende unterstrichene Aha II-Stelle: ATGGCGTC. Der vorher beschriebene Vaccinia H6-Promotor wurde mit NP mittels eines doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids verbunden. Das synthetische Oligonucleotid enthielt die H6-Sequenz von der Eco RV-Stelle bis zum ATG und bis zur NP codierenden Sequenz an der Aha II-Stelle.

  Das Oligonucleotid wurde mit Enden, die mit Bam HI und Eco RI kompatibel waren, zur Insertion in pUC 9 synthetisiert und führte zu pRW 755. Beginnend an dem mit Bam HI kompatiblen Ende, mit dem ATG unterstrichen, ist die Sequenz des doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids die folgende:
 
 GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG
 GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA
 



  Das lineare Produkt eines teilweisen Verdaus von pRW 755 mit  Aha II wurde isoliert und nachgespalten mit Eco RI. Das pRW 755-Fragment, das einen einzigen Aha II-Schnitt am ATG enthielt und mit Eco RI nachgespalten war, wurde isoliert,  mit Phosphatase behandelt, und als Vektor für das Verdauungsprodukt von pRW 714 (siehe nachstehend) benutzt. 



  Das isolierte, lineare Produkt eines Partialverdaus mit Aha II von pRW 714 wurde mit Eco RI nachgespalten. Ein die codierende Sequenz für NP enthaltendes isoliertes Aha II-Eco RI Fragment von etwa 1,6 Kbp wurde in den pRW 755 Vektor eingesetzt und führte zu pRW 757. Der vollständige H6-Promotor wurde gebildet, indem die Sequenzen oberhalb (5 min ) der Eco RV-Stelle hinzugefügt wurden. Das Plasmid pRW 742B (beschrieben in Beispiel 4) hatte die H6-Sequenz unterhalb (3 min ) der Eco RV-Stelle mit den Sequenzen bis zu der Nde I Stelle in pUC 9 entfernt. Das mit Phosphatase behandelte Eco RV-Nde I Fragment von pRW 742B wurde als Vektor für das pRW 757-Fragment (siehe nachstehend) benutzt.

  Das isolierte lineare Produkt eines Partialverdaus von pRW 757 mit Eco RV wurde nach einer Spaltung mit Nde I wiedergewonnen; dieses Fragment enthält den H6-Promotor von der Eco RV-Stelle über NP bis zu der Nde I Stelle in pUC 9. Das pRW 757-Fragment wurde in den pRW 742B-Vektor inseriert und bildete pRW 758. Das Eco RI Fragment von pRW 758, das das vom H6-Promotor abhängige vollständige NP enthält, wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I an den Enden glattgemacht und in die Hinc II-Stelle von pRW 731.13 inseriert und ergab pRW 760. Die Hinc II StelIe von pRW 731.13 ist der FP-1-Genort, der in Beispiel 6 zur Konstruktion von vFP-6 und vFP-7 verwendet wurde. 



  Unter Benutzung von Geflügelpocken FP-1 als auffangendem Virus wurde das Plasmid pRW 760 für einen in vitro Rekombinationstest verwendet. Die Plaques der Nachkommenschaft wurden getestet und gereinigt mittels in situ Plaquehybridisierung. Expression des Gens wurde durch Immunpräzipitationsstudien unter Benutzung eines polyclonalen Ziegen-anti-NP-Antiserums  bestätigt. Die Grösse des Proteins, das insbesondere aus einem Lysat von mit vFP-12 infizierten CEF-Zellen präzipi tiert wurde, war etwa 55 kD, was innerhalb des veröffentlichten Bereichs von Influenzanucleoproteinen liegt. 


 Beispiel 12 
 


 Produktion einer Vogelinfluenza-Nucleoprotein (NP)- und Hämagglutinin (HA)-Gene
 exprimierenden Doppelrekombinante vFP-15 von Geflügelpockenvirus 
 



  Das Hämagglutinin (HA)-Gen aus A/Tyr/Ire/1378/83 wurde im Zusammenhang mit der Konstruktion von vFP-11 (Beispiel 9) beschrieben. Bei der Herstellung der Doppelrekombinante wurde das HA-Gen zuerst in den zuvor bei der Herstellung von vFP-8 unter Benutzung des Plasmids pRW 731.15 beschriebenen  Locus f8 gebracht. 



  Das zur Konstruktion von vFP-11 benutzte Plasmid war pRW 759. Das mit dem H6-Promotor verbundene Hämagglutiningen wurde aus diesem Plasmid durch einen partialen Verdau mit  Pst I entfernt. Dieses Fragment wurde dann an den Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I glattgemacht, in die glattgemachte Bam HI-Stelle von pRW 731.15 inseriert und ergab so pRW 771. 



  Das Plasmid pRW 771 wurde dann in einem in vitro Rekombinationstest unter Benutzung von vFP-12 als auffangendem Virus eingesetzt. Das rekombinante Virus vFP-12 enthält das mit dem H6-Promotor verbundene Nucleoproteingen am Genort f7, wie er im Plasmid pRW 731.13 definiert ist. Rekombinante Plaques, die nun beide Insertionen enthielten, wurden ausgewählt und mittels in situ Hybridisierung und Oberflächenexpression des Hämagglutinins plaque-gereinigt, was durch einen Protein-A- beta -galactosidase-verbundenen Immuntest bestätigt wurde. Die Expression beider Gene wurde durch Immunpräzipitation aus mit dem doppelrekombinanten Virus vFP-15 infizierten Zellysaten nachgewiesen. 


 Beispiel 13 
 


 Konstruktion von rekombinanten Kanarienpockenviren 
 



  Das folgende Beispiel zeigt die Identifizierung von vier nicht-essentiellen Insertions-Loci in dem Kanarienpockengenom und die Konstruktion von vier rekombinanten Kanarienpockenviren vCP-16, vCP-17, vCP-19 und vCP-20. 



  Die Kanarienpocken-Rekombinante vCP-16 wurde wie folgt hergestellt. 



  Ein 3,4 Kbp Pvu II Fragment von Kanarienpocken-DNA wurde in pUC 9 cloniert und führte zu pRW 764.2. Es wurde eine singuläre Eco RI-Stelle gefunden, die asymmetrisch in dem Fragment mit einem kurzen Arm von 700 bp und einem langen Arm von 7,2 Kbp liegt. Das Plasmid wurde mit Eco RI verdaut und unter Verwendung von Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I glattendig gemacht. Das glattendige H6/Tollwut G-Gen wurde danach mit dieser Stelle ligiert und zur Transformation von E. coli benutzt. Das daraus hervorgehende Plasmid pRW 775 wurde für einen in vitro Rekombinationstest benutzt. In einem Immunoscreen-Verfahren positive Nachkommenplaques wurden ausgewählt und plaque-gereinigt. Die daraus hervorgehende Rekombinante wurde als vCP-16 und der Insertions-Locus als C3 bezeichnet. 



   Das in der vorstehenden Konstruktion benutzte Plasmid pRW 764.2 enthielt ausserdem eine singuläre Bgl II-Stelle etwa 2,4 Kbp von der Eco RI-Stelle entfernt. Unter Benutzung der gleichen Clonierungsstrategie wurde das H6/Tollwut G Gen mit dem Plasmid pRW 764.2 an dieser Stelle ligiert und führte zu pRW 774. Dieses Plasmid wurde zur Konstruktion der Rekombinante vCP-17 mit dem als C4 bezeichneten Insertionslocus benutzt. 



  Das Plasmid pRW 764.5 enthält ein 850 bp Pvu II-Fragment von Kanarienpocken-DNA mit einer singulären Bgl II-Stelle, die asymmetrisch in dem Fragment 400 bp von einem Ende liegt. Unter Benutzung der wie vorher beschriebenen Clonierungsstrategie wurde das mit dem H6-Promotor verbundene Tollwut G-Gen an dieser Stelle inseriert und ergab das Plasmid pRW 777. Das damit hergestellte stabile rekombinante Virus wurde als vCP-19 und der Insertionslocus als C5 bezeichnet. 



  Plasmid pRW 764.7 enthält ein 1,2 Kbp Pvu II-Fragment mit einer singulären Bgl II-Stelle 300 Basen von einem Ende. Dieses Plasmid wurde mit Bgl II verdaut und mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I an den Enden glattgemacht. Das an den Enden glattgemachte lac Z-Gen mit dem 11K-Promotor wurde eingefügt und führte zu Plasmid pRW 778. Das unter Benutzung dieses Plasmids hergestellte stabile rekombinante Virus wurde als VCP-20 und der Insertionslocus als C6 bezeichnet. 


 Beispiel 14 
 


 Konstruktion eines das Fusionsprotein von Newcastle Disease Virus exprimierenden rekombinanten 
 Geflügelpockenvirus vFP-29 
 



  Plasmid pNDV 108, der cDNA-Clon des Fusionsgens von NDV-Stamm Texas, besteht aus einem Hpa I cDNA-Fragment von etwa 3,3 Kbp, das sowohl die codierende Sequenz für das Fusionsprotein als auch zusätzliche, in die Sca I-Stelle von pBR 322 clonierte, codierende NDV-Sequenzen enthält. Schritte zur Herstellung des Insertionsplasmids sind nachstehend beschrieben. 


 (1) Herstellung von Plasmid pCE 11 
 



  Ein FPV-Insertionsvektor, pCE 11, wurde durch Einfügen von Polylinkern an der Hinc II-Stelle von pRW 731.13 hergestellt (bezeichnet als Locus f7). pRW 731.13 enthält ein 5,5 Kbp  Pvu II-Fragment von FP-1-DNA. Ein nicht-essentieller Locus wurde vorstehend definiert an der Hinc II-Stelle durch Konstruktion der in Beispiel 6 beschriebenen stabilen Rekombinante vFP-6. Die an der Hinc II-Stelle eingefügten Polylinker enthalten die folgenden Restriktionsenzym-Schnittstellen: Nru I, Eco RI, Sac I, Kpn I, Sma I, Bam HI, Xba I, Hinc II, Sal I, Acc I, Pst I, Sph I, Hind III und Hpa I. 


 (2) Herstellung von Plasmid pCE 19 
 



  Dieses Plasmid ist eine weitere Modifikation von pCE 11, in das das Vacciniavirus-Transkriptionstoppsignal ATTTTTNT (L. Yuen und B. Moss, J. Virology, Bd. 60 [1986], Seiten 320-323) (in diesem Fall ist N ein A) zwischen die Sac I- und Eco RI-Stellen von pCE 11 mit Verlust der Eco RI-Stelle eingefügt worden ist. 


 (3) Einfügung von codierenden NDV-Sequenzen 
 



  Ein über ein Gel gereinigtes 1,8 Kbp Bam HI-Fragment, das mit Ausnahme von 22 Nucleotiden vom 5 min -Ende des Fusionsproteingens alle Nucleotide enthielt, wurde in die Bam HI-Stelle von pUC 18 eingefügt und bildete pCE 13. Dieses Plasmid wurde mit Sal I verdaut, das in dem Vektor 12 Basen oberhalb des 5 min -Endes der codierenden Sequenz spaltet. Die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I aufgefüllt und das Plasmid anschliessend mit Hind III verdaut, das 18 Basen oberhalb der Sal I-Stelle spaltet. Ein über ein Gel gereinigtes 146 bp Sma I - Hind III-Fragment, das den in den bevorzugten Ausführungsformen beschriebenen Vacciniavirus-H6-Promotor sowie auch Polylinkersequenzen an jedem Ende enthielt, wurde mit dem Vektor ligiert und in E. coli Zellen transformiert. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pCE 16 bezeichnet. 



  Um das ATG Startcodon des NDV-Fusionproteingens mit dem 3 min -Ende des H6-Promotors in Ablesephase zu bringen und die in  pCE 16 vom NDV 5 min -Ende fehlenden 22 Nucleotide zu ersetzen, wurde ein komplementäres synthetisches Oligonucleotid mit Eco RV-und Kpn I-Stellen an den Enden entwickelt. Die Oligonucleotidsequenz war:
 
 5 min -ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-
 AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C 3 min .
 



  Die Konstruktion pCE 16 wurde anschliessend mit Eco RV und  Kpn I verdaut. Die Eco RV-Stelle liegt in dem H6 Promotor 24 Basen oberhalb des Initiations-ATG. Die Kpn I-Stelle liegt in der codierenden NDV Sequenz 29 Basen unterhalb des ATG. 



  Die Oligonucleotide wurden miteinander hybridisiert, phosphoryliert und mit dem linearisierten Plasmid verbunden. Die daraus hervorgehende DNA wurde zur Transformation von E. coli Zellen benutzt. Dieses Plasmid wurde als pCE 18 bezeichnet. 



  Zur Insertion codierender NDV-Sequenzen in einen FPV Insertionsvektor wurde ein über ein Gel gereinigtes 1,9 Kbp Sma I-Hind III-Fragment von pCE 18 (wobei in der Polylinkerregion gespalten wird) mit einem 7,8 Kbp Sma I-Hind III-Fragment von pCE 19 (wie vorstehend beschrieben) ligiert. Das Transkriptionsstartsignal liegt 16 Basen unterhalb der Sma I-Stelle. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pCE 20 bezeichnet. 



  Das Plasmid pCE 20 wurde in einem in vitro Rekombinationstest eingesetzt, wobei Geflügelpockenvirus FP-1 als auffangendes Virus benutzt wurde. Die daraus hervorgehende Nachkommenschaft wurde auf CEF-Monolayers plattiert und die Plaques wurden einem  beta -Galactosidase-Protein-A Immuntest unter Verwendung eines polyclonalen Hühner-anti-NDV-serums unterworfen. In der Färbung positive Plaques wurden ausgewählt und 4 Runden einer Plaquereinigung unterzogen, um eine homo gene Population zu erhalten. Die Rekombinante wurde vFP-29 genannt. 


 Beispiel 15 
 


 Konstruktion von Katzenleukämievirus-(FeLV) Hüll-(ENV)-Glykoprotein 
 exprimierenden Avipoxvirusrekombinanten 
 



  Das FeLV-env-Gen enthält die Sequenzen, welche das p70 + p15E Polyprotein codieren. Dieses Gen wurde zunächst in das Plasmid pSD467vC mit dem dem FeLV-env-Gen vorangestellten Vaccinia H6-Promotor eingefügt. Zuvor wurde das Plasmid pSD467vC durch die Einfügung eines 1802 bp Sal I/Hind III-Fragments, das das Vaccinia-Hämagglutinin (HA)-Gen enthält, in einen pUC 18 Vektor erhalten. Die Lage des HA-Gens wurde zuvor bestimmt (Shida, Virology, Bd. 150 [1988], Seiten 451-462). Die Mehrheit des das HA-Genprodukt codierenden offenen Leserahmens wurde deletiert (Nucleotid 443 bis Nucleotid 1311) und eine mutiple Clonierungsstelle, die Bgl II-, Sma I-, Pst I- und Eag I-Restriktionsendonucleasestellen enthielt, eingefügt.

   Das resultierende Plasmid pSD467vC enthält flankierende Arme aus Vaccinia von 442 bp aufwärts 5 min seitig von der mutiplen Clonierungsstelle und 491 bp 3 min seitig von diesen Restriktions-Schnittstellen. Diese flankierenden Arme ermöglichen es, dass in die multiple Clonierungsregion eingefügtes Material in die HA-Region des Kopenhagen-Stamms von Vaccinavirus rekombiniert werden kann. Die daraus hervorgehende rekombinante Nachkommenschaft ist HA-negativ. 



  Der H6-Promotor war synthetisiert worden durch das Aneinanderhängen von vier überlappenden Oligonucleotiden, die zusammen die vorstehend in den bevorzugten Ausführungsformen beschriebene vollständige Sequenz umfassten. Das daraus hervorgehende 132 bp-Fragment enthielt eine Bgl II-Restriktions-Schnittstelle am 5 min -Ende und eine Sma I-Stelle am 3 min -Ende. Dieses wurde in pSD467vC über die Bgl II-und Sma I-Restriktions-Schnittstellen eingefügt. Das daraus hervorge hende Plasmid wurde als pPT15 bezeichnet. Das FeLV-env-Gen wurde in die unmittelbar 3 min seitig von dem H6-Promotor liegende singuläre Pst I-Stelle von pPT15 inseriert. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pFeLV1A bezeichnet. 



  Zur Konstruktion der FP-1 Rekombinante wurde die 2,4 Kbp H6/FeLV-env-Sequenz aus pFeLV1A durch Spaltung mit Bgl II und partielle Spaltung mit Pst I ausgeschnitten. Die Bgl II-Stelle liegt an der 5 min -Grenze der H6-Promotorsequenz. Die Pst I Stelle liegt 420 bp nach dem Terminationssignal der Translation für den offenen Leserahmen des Hüll-Glykoproteins. 



  Die 2,4 Kbp H6/FeLV-env-Sequenz wurde in mit Bam HI und Pst 15 I gespaltenen pCE 11 eingefügt. Der FP-1-Insertionsvektor, pCE 11, leitet sich ab von pRW 731.13 durch Einfügung einer multiplen Clonierungsstelle in die nicht-essentielle Hinc II-Stelle. Dieser Insertionsvektor gestattet die Herstellung von FP-1-Rekombinanten, die fremde Gene im Locus f7 des FP-1  Genoms enthalten. Das rekombinante FP-1/FeLV-Insertionsplasmid wurde als pFeLVFI bezeichnet. Diese Konstruktion bietet kein vollständiges ATG zur ATG-Substitution. 



  Um eine vollständige ATG:ATG-Konstruktion zu erreichen, wurde ein Nru I/Sst II-Fragment von etwa 1,4 Kbp aus dem Vacciniavirusinsertionsvektor pFeLV1C abgeleitet. Die Nru I-Stelle liegt innerhalb des H6-Promotors in einer Position von 24 bp oberhalb von dem ATG. Die Sst II-Stelle liegt 1,4 Kbp 3 min seitig des ATG und 1 Kbp 5 min seitig von dem Terminationssignal der Translation. Dieses Nru I/Sst II-Fragment wurde mit einem 9,9 Kbp-Fragment ligiert, das durch Verdau mit Sst II und partiellen Verdau mit Nru I erzeugt war. Dieses 9,9 Kbp-Fragment enthält die 5,5 Kbp der FP-1 flankierenden Arme, die pUC Vektorsequenzen, 1,4 Kbp an den dem 3 min -Ende des env-Gens entsprechenden Abschnitten der FeLV-Sequenz und die Sequenz ganz am 5 min -Ende des H6-Promotors (ca. 100 bp). Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pFeFLVF2  bezeichnet.

  Die ATG:ATG-Konstruktion wurde durch Nucleotidsequenzanalyse bestätigt. 



  Ein weiterer FP-1 Insertionsvektor, pFeLVF3, wurde aus pFeLVF2 durch Entfernen der dem wahrscheinlichen Immunsuppressionsbereich entsprechenden FeLV-env-Sequenzen abgeleitet (Cianciolo et al., Science, Bd. 230 [1985], Seiten 453-455) (Nucleotid 1548 bis 1628 der codierenden Sequenz). Dieses wurde erreicht durch Isolierung eines Sst II/Pst I-Fragments (Stellen sind oben beschrieben) von etwa 1 Kbp aus dem Vacciniavirus-Insertionsvektor pFeLV1D. Das Plasmid pFeLV1D ist ähnlich dem Plasmid pFeLV1C mit der Ausnahme, dass die dem Immunsuppressionsbereich entsprechenden env-Sequenzen (Nucleotid 1548 bis 1628) durch Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 [1987], Seiten 7177-7181) entfernt worden waren.

  Das 1 Kbp Sst II/Pst I-Fragment ohne die Nucleotide 1548 bis 1628 wurde in ein 10,4 Kbp Sst II/Pst I-Fragment eingefügt, das das übrige aus pFeLVF2 abgeleitete H6:FeLV-env-Gen enthält. 



  Die Insertionsplasmide, pFeLVF2 und pFeLVF3, wurden für in vitro Rekombinationstests mit FP-1 als dem auffangenden Virus benutzt. Nachkommenschaft der Rekombination wurde auf CEF Monolayer plattiert und rekombinante Viren wurden durch Plaque-Hybridisierung auf CEF Monolayern ausgewählt. Mittels Hybridisierungsanalyse identifizierte rekombinante Nachkommenschaft wurde ausgewählt und 4 Runden einer Plaquereinigung unterworfen, um eine homogene Population zu erhalten. Eine FP-1-Rekombinante, die das vollständige FeLV-env-Gen enthielt, wurde als vFP-25 und eine FP-1-Rekombinante, die das vollständige Gen mit Ausnahme des Immunsuppressionsbereichs enthielt, als vFP-32 bezeichnet. Für beide Rekombinanten wurde durch Immunpräzipitation unter Benutzung eines polyclonalen Rinder-anti-FeLV polyclonalen Serums (Antibodies, Inc., Davis, Ca) gezeigt, dass sie das richtige Genprodukt exprimieren.

  Es ist von Bedeutung, dass diese FP- 1-Rekombinanten das fremde FeLV-env-Gen in der von Katzen stammenden CRFK-Zellinie (ATCC Nr. CCL94) exprimieren. 



  Zur Konstruktion von Kanarienpocken-(CP)-Rekombinanten, wurde ein H6:FeLV-env-Sequenzen enthaltendes 2,2 Kbp-Fragment aus pFeLVF2 durch Spaltung mit Sma I und Hpa I ausgeschnitten. Die Sma I-Stelle liegt an der 5 min -Grenze der H6-Promotorsequenz. Die Hpa I-Stelle liegt 180 bp 3 min seitig von dem Terminationssignal der Translation für den offenen Leserahmen des Hüll-Glykoproteins. 



  Die 2,2 Kbp H6:FeLV-env-Sequenz wurde in die nicht-essentielle Eco RI-Stelle des Insertionsplasmids pRW 764.2 eingesetzt, nachdem die Enden der Eco RI-Stelle glattgemacht waren. Dieser Insertionsvektor gestattet die Erzeugung von CP-Rekombinanten, die fremde Gene im Locus C4 des CP-Genoms enthalten. Das rekombinante CP-Insertionsplasmid wurde als pFeLVCP2 bezeichnet. Diese Konstruktion bietet eine perfekte ATG:ATG-Substitution. 



  Das Insertionsplasmid, pFeLVCP2, wurde in einem in vitro Rekombinationstest mit CP als dem auffangenden Virus eingesetzt. Nachkommenschaft der Rekombinante wurde auf CEF Monolayer plattiert und rekombinantes Virus mittels eines mit Protein-A-verbundenen  beta -Galactosidaseimmuntests unter Verwendung eines kommerziellen polyclonalen Rinder-anti-FeLV Serums (Antibodies, Inc., Davis, CA.) ausgewählt. In der Färbung positive Plaques wurden ausgewählt und 4 Runden einer Plaque-Reinigung unterzogen, um eine homogene Population zu erhalten. Eine Rekombinante, die das gesamte FeLV-env-Gen exprimiert, wurde als vCP-36 bezeichnet. 


 Beispiel 16 
 


 Konstruktion von Rous-assoziiertem Virus Typ 1-(RAV-1)-Hüll-(env)-Gen 
 exprimierendem rekombinantem Geflügelpockenvirus vFP-22 
 



   en  spezifische Präzipitation einer kleinen Menge von Vorläuferprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 180 kD und von Spaltprodukten von 90 kD. 


 Beispiel 20 
 


 Konstruktion der Herpes simplex gD exprimierenden Geflügelpockenvirus-FP-1-Rekombinante vFP-30 
 



  Das Herpes simplex Virus (HSV) Typ 1 Glykoprotein D-Gen (gD) vom Stamm KOS wurde in die Bam HI-Stelle von pUC 9 als ein am 5 min -Bam HI-Ende mit Hpa II-NruI-Fragment, das mit dem am 3 min -Bam HI-Ende verknüpft wurde, cloniert; das 5 min -Ende liegt unmittelbar neben der Pst I-Stelle von pUC 9. Die 5 min -Sequenz von HSV gD, die mit dem Initiationscodon (ATG) der Translation beginnt, enthält die folgende unterstrichene Nco I Stelle:
 
 ATGGGGGGGGCTGCCGCCAGGTTGGGGGCCGTGATTTTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGG.
 



  Der vorstehend beschriebene Vaccinia H6-Promotor wurde an das HSV gD-Gen über ein synthetisches Oligonucleotid verknüpft. Das synthetische Oligonucleotid enthält den 3 min -Abschnitt des H6-Promotors von der Nru I-Stelle zum ATG und weiter zur codierenden Sequenz von gD bis zur Nco I-Stelle. Das Oligonucleotid wurde mit einem Pst I-kompatiblen Ende auf der 5 min -Seite synthetisiert. Der gD Clon in pUC 9 wurde mit Pst I und Nco I gespalten und die HSV-Sequenz am 5 min -Ende zum Austausch mit dem synthetischen Oligonucleotid entfernt, was zu pRW 787 führte. Die Sequenz des doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotids ist:
 
 GTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGGTGCCGACGTCAGCGCTATAGGCAATTC-AAACATAGCATTACCCTCCACGGCCAGCTAGATTAGGTGCTGTTATTTTATTTGTAGTTA TAGTA-GGACTCGTCGATCTAATCCACGACAATAAAATAAACATCAATATCATCCTGAGGTAC
 



  Verdau von pRW 787 mit Nru I und Bam HI erzeugt ein Fragment von etwa 1,3 Kbp, das die 3 min -Seite des H6-Promotors von der  Nru I-Stelle durch die codierende Sequenz von HSV gD hindurch bis zur Bam HI-Stelle enthält. Der mit Nru I und Bam HI gespaltene Vektor pRW 760 wurde in Beispiel 11 beschrieben. Die Insertion eines 1,3 Kbp Fragments in den Vektor pRW 760 führte zu pRW 791. Der Vektor pRW 791 enthält das vollständige HSV gD Gen unter dem Vaccinia H6-Promotor in der nicht-essentiellen Hinc II-Stelle in FP-l in pRW 731.13 (Locus f7). 



  Rekombination des Spenderplasmids pRW 791 mit FP-1 führte zu vFP-30. Oberflächenexpression des Glykoproteins wurde in rekombinanten Plaques nachgewiesen unter Verwendung von mit  beta -Galactosidase verknüpftem Protein A und für HSV-1 spezifischen Seren. 


 Beispiel 21 
 


 Verwendunq von Entomopockenpromotoren zur Regulation der Expression von Fremdgenen 
 in Pockenvirenvektoren 
 


 (a) Hintergrund 
 



  Pockenviren von Insekten (Entomopocken) werden gegenwärtig in der Unterfamilie Entomopoxvirinae eingeordnet, die weiter unterteilt wird in drei Gattungen (A, B und C), die Entomopockenviren entsprechen, die aus den Insektenordnungen Coleoptera, Lepidoptera bzw. Orthoptera isoliert wurden. Entomopockenviren haben in der Natur einen engen Wirtsbereich, und es ist nicht bekannt, dass sie in irgendeiner Vertebratenart replizieren. 



  Das in den vorliegenden Untersuchungen benutzte Virus wurde ursprünglich aus infizierten Larven von Amsacta moorei (Lepidoptera: arctildae) aus Indien isoliert; vgl. Roberts und Granados, J. Invertebr. Pathol. Bd. 12, (1968), Seiten 141-143. Das Virus, bezeichnet als AmEPV, ist die Leitart für Genus B. 



  Wildtyp AmEPV wurde von Dr. R. Granados (Boyce Thomson Institute, Cornell University) als infektiöse Hämolymphe von infizierten Estigmene acrea-Larven erhalten. Es wurde gefunden, dass das Virus in der Invertebraten-Zellinie IPLB-LD652Y repliziert, die aus Ovariumgeweben von Lymantria dispar (Schwammspinner) (beschrieben bei Goodwin et al., In Vitro Bd. 14 [1978] Seiten 485-494) gewonnen wurde. Diese Zellen wurden bei 28 DEG C in IPL-528-Medium gezogen, das mit 4% fötalem Kälber- und 4% Hühnerserum supplementiert war. 



  Das Wildtyp-Virus wurde auf Plaques auf LD652Y-Zellen geprüft und ein Plaque, als V1 bezeichnet, wurde für weitere Experimente ausgewählt. Dieses Isolat ruft zahlreiche Einschlusskörperchen (OBs) im Cytoplasma der infizierten Zellen gegen Ende des Infektionszyklus hervor. 


 (b) Promotorindentifizierung 
 



  Die Identifizierung und Kartierung eines AmEPV-Promotors wurde wie folgt erreicht. Gesamt-RNA aus infizierten LD652Y-Zellen (48 Stunden nach der Infektion; späte Phase) wurde isoliert und benutzt, um mit 32P-markierte erste Strang-cDNA zu erzeugen. Die cDNA wurde dann benutzt, um "Blots" zu prüfen, die Restriktionsverdaus von AmEPV-Genom enthielten. Dieser Southern Blot führte zur Aufdeckung eines starken Signals auf einem 2,6 kb Cla I-Fragment, was anzeigte, dass dieses Fragment ein stark exprimiertes Gen codierte. Das Fragment wurde in einen Plasmidvektor cloniert und seine DNA-Sequenz bestimmt. 



  Analyse der Sequenzdaten ergab einen offenen Leserahmen, der in der Lage war, ein 42 kD Polypeptid zu codieren. In vitro Translation der Gesamt-RNA zum Zeitpunkt 48 Stunden nach der Infektion und Auftrennung der Produkte über SDS-PAGE führte zu einem Polypeptid von ca. 42 kD. 


 (c) Konstruktion eines rekombinanten Vacciniavirus mit der Expression eines Fremdgens unter der Kontrolle des Entomopockenvirus-Promotors. 
 



  Um zu bestimmen, ob ein Entomopockenvirus-Promotor in einem Vertebraten-Pockenvirussystem funktionieren würde, wurde das folgende Plasmid konstruiert: ein Oligonucleotid wurde chemisch synthetisiert, das 107 Basen von der 5 min -Seite des Translationsstartsignals des 42K Gens (nachfolgend als AmEPV 42K-Promotor bezeichnet) enthielt und von einer Bgl II-Stelle am 5 min -Ende und am 3 min -Ende von den ersten 14 Basen der codierenden, an einer Eco RI-Stelle aufhörenden Region von Hepatitis B-Virus pre-S2 flankiert ist. Die AmEPV 42K-Promotorsequenz ist im folgenden beschrieben:
 
 TCAAAAAAATATAAATGATTCACCATC
 TGATAGAAAAAAAATTTATTGGGAAGA
 ATATGATAATATTTTGGGATTTCAAA
 ATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATG
 



  Der AmEPV 42K-Promotor wurde mit dem Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAG) wie folgt ligiert. Ein das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen und den codierenden Bereich von pre-S2 (Typ ayw wie beschrieben bei Galibert et al., Nature Bd. 281 [1979], Seiten 646-650) enthaltendes pUC-Plasmid wurde erzeugt, das von den Vacciniavirusarmen in der nichtessentiellen Region des Vacciniavirusgenoms, das das Hämagglutinin-(HA)-Molekül codiert (HA-Arme beschrieben in Beispiel 15; HA-Region beschrieben von Shida, Virology Bd. 150 [1986], Seiten 451-462) flankiert war. Das vorstehend beschriebene Oligonucleotid wurde in dieses Plasmid eingefügt, indem die singuläre Eco RI-Stelle in den HBVsAg codierenden Bereich und die singuläre Bgl II-Stelle in dem HA-Vacciniaarm benutzt wurde. Das daraus hervorgehende rekombinante Vacciniavirus wurde als vP 547 bezeichnet. 



   Die Expression der codierenden HBVsAg-Sequenz unter der Kontrolle des Entomopocken 42K-Promotors wurde mit einem Immu noassay nachgewiesen. Entsprechende Kulturen der Säugetierzellinie BSC-40 wurden mit Ausgangsvacciniavirus oder der Rekombinante vP 547 infiziert. 24 Stunden nach Infektion wurden die Zellen lysiert und das Lysat in Reihenverdünnungen auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht. Die Membran wurde zuerst mit einem Ziegen-anti-HBV-Serum und anschliessend mit <1><2><5>J-Protein A inkubiert. Nach dem Waschen wurde ein Röntgenfilm mit der Membran belichtet. Positive Signale wurden in mit vP 547 infizierten Kulturen, jedoch nicht in mit Elternvirus infizierten Kulturen gefunden, was eine Erkennung des AmEPV 42K-Promotors durch Vacciniavirus in Säugetierzellen andeutet. 



  Die vorstehenden Ergebnisse wurden bestätigt durch Verwendung eines Ausria-Assays (vgl. Beispiel 1 für Details), um HBVsAg in infizierten Säugetierzellen nachzuweisen. Vacciniavirusrekombinanten, die entweder das HBVsAg-Gen an AmEPV42K oder an den Vacciniavirus H6-Promotor gekoppelt hatten, wurden verwendet, um BSC-40 Zellen zu infizieren; das Ausmass der Expression von sAg wurde in einem Ausria-Test ermittelt.

  Wie in Tabelle XII dargestellt, zeigen die Daten, dass die Menge an Expression von HBVsAg bei Verwendung des 42K-Promotors signifikant war. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle XII
Expression von HBVsAg in rekombinantem Vacciniavirus 
<tb>Head Col 01 AL=L: Rekombinantes Virus 
<tb>Head Col 02 AL=L: Promotor 
<tb>Head Col 03 AL=L: Ausria P/N-Verhältnis 
<tb> <SEP>vP-410 <SEP>Kontrolle <SEP>1,0 
<tb> <SEP>vP-481 <SEP>H6 <SEP>24,3 
<tb> <SEP>vP-547 <SEP>42K <SEP>44,9 
<tb></TABLE> 



  Weitere Experimente wurden durchgeführt, um die zeitabhängige Natur der Regulation des AmEPV 42K Promotors in einem Vertebraten-Pockenvirussystem zu bestätigen. Gleichartige Kulturen von BSC-40 Zellen wurden mit vP 547 in Gegenwart  oder Abwesenheit von 40  mu g/ml Cytosin Arabinosid, einem deshalb die späte virale Transkription blockierenden Inhibitor der DNA-Replikation infiziert. Die Mengen der Expression wurden in einem Ausria-Test 24 Stunden nach Infektion überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass der 42K Promotor als ein früher Promotor in einem Vacciniavirus-Replikationssystem erkannt wurde. 



  Die Verwendung des AmEPV 42K-Promotors zur Expression von Fremdgenen in einem Säugetiersystem ist ersichtlich verschieden von der Verwendung des Autographa californica NPV Polyhedrin-Promotors zur Genexpression in Invertebraten-Systemen (Luckow und Summers, Biotechnology, Bd. 6 [1988], Seiten 47-55). Der Polyhedrinpromotor wird nicht durch den Transkriptionsapparat in Säugetierzellen erkannt (Tjla et al., Virology, Bd. 125 [1983], Seiten 107-117). Die Verwendung des AmEPV 42K-Promotors in Säugetierzellen zeigt erstmals, dass ein Insektenviruspromotor zur Expression von fremden Genen in einem nicht-insektenviralen Vektor in Nicht-Invertebratenzellen benutzt worden ist. 



  Um festzustellen, ob Avipoxviren ebenfalls den 42K-Entomopockenpromotor erkennen würden, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Identische Kulturen von CEF-Zellen wurde mit 10 pfu pro Zelle entweder von Geflügelpockenvirus, Kanarienpockenvirus oder Vacciniavirus geimpft und gleichzeitig mit 25  mu g eines der folgenden Plasmide transfiziert: 1) Plasmid 42K.17, das die HBV pre-S2 + sAg codierende Sequenz mit dem 42K-Promotor verknüpft enthielt oder 2) Plasmid pMP15.spsP, das die identische HBVsAg codierende Sequenz mit dem Vacciniavirus H6-Promotor verknüpft enthält. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gefroren und lysiert und die Lysate unter Verwendung eines Ausria-Tests (siehe Beispiel 1) auf die Gegenwart von HBVsAg überprüft. 



  Die in Tabelle XIII gezeigten Ergebnisse sollten in einem qualitativen Sinn betrachtet werden. Sie deuten an, dass der  Transkriptionsapparat sowohl von Geflügelpockenvirus als auch von Kanarienpockenvirus in der Lage ist, den 42K-Promotor zu erkennen und die Transkription der damit verbundenen codierenden HBVsAg-Sequenz gestattet.

  Obwohl die Mengen an Expression niedriger sind als die mit dem Vacciniavirus H6-Promotor, liegen die Mengen deutlich über den Hintergrundmengen, die man mit den negativen Kontrollen erhält. 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle XIII
Erkennung des 42K Entomopockenviruspromotors durch Avipoxviren 
<tb>Head Col 01 AL=L: Virus 
<tb>Head Col 02 AL=L: Promotor 
<tb>Head Col 03 AL=L: Verhältnis P/N 
<tb> <SEP>Geflügelpocken <SEP>42K <SEP>39,1 
<tb> <SEP>H6 <SEP>356,8 
<tb> <SEP>Kanarienpocken <SEP>42K <SEP>90,2 
<tb> <SEP>H6 <SEP>222,2 
<tb> <SEP>Vaccinia <SEP>42K <SEP>369,4 
<tb> <SEP>H6 <SEP>366,9 
<tb> <SEP>Kein <SEP>42K <SEP>7,8 
<tb> <SEP>Kein <SEP>H6 <SEP>7,2 
<tb> <SEP>Vaccinia <SEP>- <SEP>7,2 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 22 
 


 Immunisierung mit VCP-16 zum Schutz von Mäusen gegen eine Belastungsinfektion 
 mit lebendem Tollwutvirus 
 



  Gruppen von 20 vier bis sechs Wochen alten Mäusen wurden in der Pfotenfläche mit 50 bis 100  mu l einer Reihe von Verdünnungen von einer der beiden folgenden Rekombinanten beimpft: (a) vFP-6 - der in Beispiel 6 beschriebenen Geflügelpocken-Tollwutrekombinante - und (b) vCP-16 - der in Beispiel 13 beschriebenen - Kanarienpocken-Tollwut-Rekombinante. 



  Nach 14 Tagen wurden 10 Mäuse aus jeder Gruppe geopfert und das Serum gesammelt. Der anti-Tollwuttiter in dem Serum wurde mit dem in Beispiel 7 beschriebenen RFFI-Test berechnet. Die verbleibenden 10 Mäuse aus jeder Gruppe wurden einer Belastungsinfektion durch intrazerebrale Impfung mit dem CVS-Stamm von Tollwutvirus, das in Beispiel 7 benutzt wurde, ausgesetzt. Jede Maus erhielt 30  mu l, was 16 Maus-LD50 entsprach. Nach 28 Tagen wurde die Zahl der überlebenden Mäuse bestimmt und die schützende Dosis 50 (PD50) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIV zusammengefasst. 



  Der bei mit vFP-6 geimpften Mäusen gefundene Schutzgrad bestätigte das in Beispiel 7 diskutierte Ergebnis der Impfung mit rekombinanten Geflügelpockenviren vFP-3. Der mit der Impfung mit vCP-16 erreichte Schutzgrad ist beträchtlich höher. Auf der Basis des berechneten PD50 ist die Kanarienpocken-Tollwut-Rekombinante 100mal wirksamer beim Schutz gegen eine Belastungsinfektion mit Tollwut als die Geflügelpocken-Tollwut-Rekombinante. 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Title: Tabelle XIV
Die durch zwei Avipox-Tollwut-Rekombinanten erzielte schützende Immunität gegen eine Belastungsinfektion mit Tollwutvirus 
<tb>Head Col 01 to 03 AL=L: Geflügelpocken vFP-6 
<tb>Head Col 04 to 06 AL=L:

   Kanarienpocken vCP-16 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Impfdosis: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>RFFI-Titer: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Überlebensrate: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Impfdosis: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>RFFI-Titer: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Überlebensrate: 
<tb> <SEP>7.5<a> <SEP>2.3<b> <SEP>7/10 <SEP>6.5 <SEP>2.5 <SEP>10/10 
<tb> <SEP>5.5 <SEP>1.8 <SEP>5/10 <SEP>4.5 <SEP>1.9 <SEP>8/10 
<tb> <SEP>3.5 <SEP>0.7 <SEP>0/10 <SEP>2.5 <SEP>1.1 <SEP>1/10 
<tb> <SEP>1.5 <SEP>0.6 <SEP>0/10 <SEP>0.5 <SEP>0.4 <SEP>0/10 
<tb> <SEP>1 PD50 = 6.17 <SEP>1 PD50 = 4.18 
<tb> 
 a  Virus-Titer, ausgedrückt als log10 TCID50
b RFFI-Titer, ausgedrückt als log10 der höchsten Serumverdünnung,

   die eine Reduktion um mehr als 50% in der Anzahl der fluoreszierenden Vertiefungen in einem RFFI-Test ergibt.
  
<tb></TABLE> 


 Beispiel 23 
 


 Verwendung von Geflügelpockenpromotorelementen zur Expression von Fremdgenen 
 


 I. Identifizierung des ein 25.8 Kilodalton (kD) Genprodukt codierenden Geflügelpockengens 
 



  Sichtbarmachen von in mit Geflügelpocken (FP-1) infizierten CEF-Lysaten vorhandenen Proteintypen mittels Coomassie Brilliantblau-Anfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen zeigte einen  reichlich vorhandenen Typ mit einem offenbaren Molekulargewicht von 25,8 kD. Dieses Protein fehlte in nicht-infizierten Zellysaten. Puls-Experimente unter Verwendung von <3><5>S-Methionin zur Radiomarkierung synthetisierter Proteine zu bestimmten Zeiten nach der Infektion zeigten wiederum die grosse Menge an FP-1-induziertem Protein und zeigten, dass es 6 bis 54 Stunden nach Infektion synthetisiert wird. An seinem Spitzenwert macht dieses FP-1 25,8 kD Protein ca. 5 bis 10% des in dem Zellysat vorhandenen Gesamtproteins aus. 



  Die grosse Menge an durch FP-1 induziertem 25,8 kD Protein legte nahe, dass das dieses Genprodukt codierende Gen von einem starken FP-1 Promotorelement reguliert wird. Um dieses Promotorelement zur nachfolgenden Verwendung bei der Expression von Fremdgenen in Pockenvirenrekombinanten zu lokalisieren, wurde eine Polysomen-Präparation aus mit FP-1 infizierten CEF-Zellen 54 Stunden nach Infektion gewonnen. RNA aus dieser Polysomenpräparation wurde isoliert und führte dann, wenn man sie zur Programmierung eines Kaninchenreticulocyten-in vitro-Translationssystem benutzte, vorwiegend zur Bildung von 25,8.8 kD FP-1 Protein. 



  Die Polysomen-RNA wurde ausserdem als Matrize zur cDNA-Synthese des ersten Strangs unter Verwendung eines Oligo(dT)12-18 als Primer benutzt. Der erste Strang der cDNA wurde als eine Hybridisierungssonde in einer Southern-Blot-Analyse mit genomischen Verdaus von FP-1 benutzt. Ergebnisse aus diesen Hybridisierungsanalysen legten nahe, dass das für das 25,8 kD Protein codierende Gen in einem 10.5 Kbp Hind III-Fragment enthalten war. Dieses genomische Hind III-Fragment wurde anschliessend isoliert und mit einem kommerziellen Vektor, pBS (Stratagene, La Jolla, CA.), cloniert und der Clon als pFP23k-1 bezeichnet. Weitere Hybridisierungsanalysen unter Verwendung des ersten Strangs der cDNA als Sonde gegen Verdaus von pFP23k-1 führten zur Lokalisierung des 25.8 kD Gens auf einem 3.2 Kbp Eco RV-Sub-Fragment. 



  Dieses Fragment wurde in pBS subcloniert und als pFP23k-2 bezeichnet. 



  Etwa 2.4 Kbp dieses FP-1 Eco RV-Fragments wurden mit der Sanger-Didesoxy-Kettenabbruchsmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 [1977], Seiten 5463-5467) sequenziert. Die Analyse der Sequenz ergibt einen offenen Leserahmen (ORF), der ein Genprodukt mit einem Molekulargewicht von 25.8 kD codiert. In vitro run-off-Transkription dieses ORF durch Polymerase des Bakteriophagen T7 (Stratagene, La Jolla, CA.) in einem pBS Vektor erzeugt eine RNA-Art, die bei Benutzung zur Programmierung eines Kaninchenreticulocyten in vitro-Translationssystems (Promega Biotec, Madison, WI) eine Polypeptidart mit einem offenbaren Molekulargewicht von 25.8 kD ergibt. Dieses Polypeptid wandert auf einem SDS-Polyacrylamidgel gemeinsam mit dem reich vorhandenen 25.8 kD Protein, das in mit FP-1 infizierten CEFs beobachtet wird.

  Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich um das codierende Gen für das durch FP-1 induzierte, reich vorhandene 25.8 kD Genprodukt handelt. 


 II. Verwendung von Upstream-Promotorelementen des FP-1 25.8 kD Gens zur Expression des 
 Katzenleukämievirus (FeLV) env-Gens in FP-1 und Vacciniarekombinanten. 
 



  Ein den regulatorischen Bereich des FP-1 25.8 kD Gens enthaltendes 270 bp Eco RV/Eco RI-Fragment (FP25.8K Promotor) und 21 bp der codierenden Sequenz des 25.8 kD Gens wurden aus pFP23k-2 isoliert. Nachstehend wird die Nucleotidsequenz der FP 25.8K Promotorregion vorgestellt, die benutzt wurde, um pFeLV25.8F1 und pFeLV25.81A zu erzeugen. Diese 270 Nucleotide lange Sequenz stellt 249 Nucleotide des 5 min -Bereichs vor dem Initiationscodon (ATG) für das 25.8 kD Genprodukt und die ersten 21 bp der codierenden Sequenz zur Verfügung.
 
 5 min -GATATCCCCATCTCTCCAGAACAGCAGCATAGTGTTAGGACAATCATCTAATGCAATATCATA
 TATGAATCTCACTCCGATAGGATACTTACCACAGCTATTATACCTTAATGTATGTTCTATATATTTAAAAACAGAAACAAACGGCTATAAGTTTATATGATGTCTATATTATAGTGAGTATATTATAAGTAT GCGGGAATATCTTTGATTTAACAGCGTACGATTCGTGATAAGTAAATATAGGCAATGGATAGCATAAATGAATTC-3 min 
 



  Dieses Fragment wurde an den Enden glattgemacht und dann in einen mit Sma I verdauten, FeLV env-Sequenzen enthaltenden FP-1 Insertionsvektor (pFeLVF1; siehe Beispiel 15) eingefügt. Dieser Insertionsvektor ermöglichte Rekombination mit dem f7 Locus des FP-1 Genom. Die Einfügung der FP25.8K Promotor upstream-Sequenzen auf der 5 min -Seite des FeLV env-Gens und die richtige Orientierung wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Diese Insertion stellt kein perfektes ATG für die ATG-Substitution zur Verfügung, da das von dem 25.8 kD Gen bereitgestellte ATG sich nicht im Leseraster des FeLV env ATG befindet und daher kein Fusionsprotein gebildet wird. Das FP-1 Insertionsplasmid, das den FP25.8 kD Promotor oberhalb des FeLV env Gens enthielt, wurde als pFeLV25.8F1 bezeichnet. 



  Eine ähnliche Konstruktion wurde hergestellt unter Verwendung des das FeLV Gen enthaltenden Vacciniavirus-Insertionsvektors pFeLV1A (siehe Beispiel 15). Der H6-Promotor wurde aus pFeLV1A ausgeschnitten durch Verdau mit Bgl II und Sma I. Nachdem die Bgl II-Restriktionsstelle am Ende glattgemacht war, wurde das den FP25.8K Promotor enthaltende, am Ende glattgemachte 270 bp Eco RV/Eco RI-Fragment neben dem 5 min -Ende des FeLV env-Gens bestätigt. Diese Konstruktion wurde durch Sequenzanalyse überprüft. Auch in dieser Rekombinante gibt es kein perfektes ATG für ATG Substitution, da das ATG und das 25.8 kD Gen nicht im Leseraster mit dem ATG des FeLV-Gens ist.

   Der die 25.8KD Gen upstream-Region neben dem 5 min -Ende des FeLV-Gens enthaltende Vaccinia-Insertionsvektor (Kopenhagen-Stamm) wurde als pFeLV25.81A bezeichnet.  Die Insertionsplasmide pFeLV25.8F1 und pFeLV25.81A wurden zur in vitro Rekombination mit FP-1 (pFeLV25.8F1) und dem Kopenhagen-Stamm des Vacciniavirus (pFeLV25.81A) als den auffangenden Viren benutzt. Die Nachkommenschaft der Rekombination wurde auf passende Zellmonolayer plattiert und rekombinante Viren wurden nach einen Immuntest mit mit  beta -Galactosidase verbundenem Protein A und einem Rinder-anti-FeLV-Serum (Antibodies, Inc., Davis, CA.) ausgewählt. Vorläufige Ergebnisse legen nahe, dass der FP25.8K Promotor die Expression von Fremdgenen in Pockenviren-Rekombinanten steuern kann. 


 Beispiel 24 
 


 Sicherheit und Wirksamkeit von vFP-6 und vCP-16 bei Geflügel 
 



  Mit den beiden Avipoxrekombinanten vFP-6 und vCP-16 (beschrieben in den Beispielen 6 und 13) wurden 18 Tage alte Hühnerembryonen, Eintagsküken und 28 Tage alte Küken beimpft und die Reaktion der Vögel nach drei Kriterien ausgewertet: 1) Effekt der Impfung auf das Ausschlüpfen, Impfreaktionen und Sterblichkeit 2) die von dem Tollwutglykoprotein hervorgerufene Immunantwort und 3) die von den Geflügelpockenantigenen hervorgerufene Immunantwort. Die Experimente wurden wie folgt durchgeführt. 


 A. Sicherheitstests. 
 



  Gruppen von zwanzig 18 Tage alten Embryonen wurden in die Allantoishöhle mit 3,0 oder 4,0 log10 TCI500 entweder von vFP-6 oder vCP-16 beimpft. Nach dem Ausschlüpfen wurden die Küken 14 Tage beobachtet, danach wurde ihnen einzeln Blut entnommen und die Seren gesammelt. Die beiden Rekombinanten, mit denen die Hühnerembryonen beimpft wurden, hatten keinen Effekt auf die Ausschlüpfrate der Eier und die Küken blieben gesund während der 14tägigen Beobachtungsphase. 



  Gruppen von zehn SPF-Eintagsküken wurden mit 3,0 log10TCID50 einer jeden der Rekombinanten intramuskulär geimpft. Die Küken wurden 28 Tage lang beobachtet und Serumproben 14 und 28 Tage nach der Impfung gesammelt. Mit keiner der beiden Rekombinanten wurde eine Impfreaktion an der Impfstelle beobachtet und die Küken blieben gesund während der 28 Tage der Beobachtungsphase. 



  Gruppen von zehn 28 Tage alten Küken wurden mit einem der  beiden rekombinanten Viren beimpft, wobei sie entweder 3,0 log10 TCID50 intramuskulär oder 3,0 log10TCID50 über die Hautroute (Geflügelnetzwerk) erhielten. Die Küken wurden 28 Tage lang beobachtet und Serumproben 14 und 28 Tage nach der Impfung gesammelt. Bei keiner der beiden Rekombinanten wurde eine Reaktion auf die intramuskuläre Impfung beobachtet. Impfung in die Haut führte zu einer sehr kleinen Impfreaktion auf Geflügelpocken mit Läsionen, die in der Grösse heterogen waren. Kanarienpockenimpfung führte zur Ausbildung einer normalen Läsion auf der Haut an der Impfstelle. Alle Läsionen waren bis zum Ende des Experiments zurückgegangen. 


 B. Immunantwort. 
 



  Der in Beispiel 7 beschriebene RFFI-Test wurde benutzt, um die Mengen an Antikörper gegen das Tollwutglykoprotein festzustellen. Für jede Gruppe wurden die Ergebnisse als der geometrisch gemittelte Titer der individuellen Seren ausgedrückt, die auf Internationale Einheiten (IU) entsprechend einem Standardserum umgerechnet wurden, das 23,4 IU enthielt. Der kleinste positive Wert wurde als ein IU festgelegt und benutzt, um die Prozentzahl positiver Vögel zu bestimmen. Antikörper gegen Avipoxviren wurden mit einer ELISA-Methode unter Verwendung eines Geflügelpockenvirusstamms als Antigen getestet. Jede Serumprobe wurde 1/20 und 1/80 verdünnt. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung der positiven und negativen Seren aufgestellt. Der kleinste positive Wert wurde berechnet, indem das Mittel der verschie denen Werte der negativen Seren mit zweifacher Standardabweichung hinzugefügt wurde. 



  Die Ergebnisse der serologischen Beobachtungen werden in Tabelle XV für vFP-6 und Tabelle XVI für vCP-16 gezeigt. 



  Eine begrenzte Antikörperbildung sowohl auf Tollwut wie auf Geflügelpockenantigene wurde beobachtet bei Embryonen, die entweder mit vFP-6 oder vCP-16 beimpft waren. Der Geflügelpockenvektor rief eine Antikörperbildung auf beide Antigene in einer grösseren Anzahl von Vögeln hervor als der Kanarienpockenvektor, doch die Antwort war immer noch heterogen. 



  Mit vFP-6 beimpfte Eintagsküken zeigten eine gute Antikörperbildung, wobei alle Küken auf Tollwut und Geflügelpockenantigene seropositiv 28 Tage nach der Impfung waren. Die Antwort auf die Impfung mit vCP-16 war sehr viel niedriger, wobei 40% der Küken seropositiv für Tollwutglykoprotein nach 28 Tagen und 10% seropositiv für Avipoxantigene waren. 



  Mit vFP-6 intramuskulär geimpfte, 28 Tage alte Küken zeigten 100% Serokonversion auf beide Antigene 14 Tage nach der Impfung. Obwohl die Mehrzahl der Küken ebenso Serokonversion nach Impfung in die Haut zeigte, waren die erreichten Titer sowohl für Tollwut- wie für Avipoxantigene viel niedriger. Wie zuvor zeigten mit vCP-16 sowohl über den intramuskulären als auch den kutanen Weg geimpfte Küken eine uneinheitliche Antwort mit einem Maximalwert von 70% Serokonversion auf Tollwut über intramuskuläre Beimpfung. Der niedrige Wert einer Serokonversion für Avipoxantigene nach Impfung mit Kanarienpocken könnte den Grad der serologischen Verwandtschaft zwischen den Viren widerspiegeln. 



  Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl vFP-6 wie vCP-16 sicher für die Impfung von Hühnern in einem weiten Altersbereich sind. Der Geflügelpockenvektor vFP-6 scheint effizienter bei der Auslösung einer Immunantwort in Hühnern zu sein. Für die  beiden rekombinanten Avipoxviren Geflügelpocken und Kanarienpocken wurde aber signifikant gezeigt, dass sie für eine Impfung in ovum nützlich sind. 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle XV
Immunantwort gegen Geflügelpocken/Tollwut-Glykoprotein (vFP-6) bei Hühnern verschiedenen Alters 
<tb>Head Col 01 AL=L: Positive Gruppen 
<tb>Head Col 02 AL=L: Dosis
(TCID50) 
<tb>Head Col 03 AL=L: Zeit nach Impfung
(Tage) 
<tb>Head Col 04 to 07 AL=L: Antikörper 
<tb>SubHead Col 04 to 05 AL=L: Tollwut Glykoprotein 
<tb>SubHead Col 06 to 07 AL=L:

   Geflügelpocken 
<tb>SubHead Col 04 AL=L> DIAMETER  IU Titer: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>% Vögel/1IU: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L> DIAMETER: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>Elisa OD %: 
<tb> <SEP>Embryonen <SEP>10<3> <SEP>3 + 14 <SEP>0.28 <SEP>15 <SEP>0.125 <SEP>54 
<tb> <SEP>18 Tage alt <SEP>10<4> <SEP>3 + 14 <SEP>0.87 <SEP>30 <SEP>0.129 <SEP>46 
<tb> <SEP>Eintagsküken, i.m. <SEP>10<3> <SEP>14
28 <SEP>1.8
4.2 <SEP>90
100 <SEP>0.109
0.234 <SEP>70
100 
<tb> <SEP>28 Tage alte Küken, i.m.

  <SEP>10<3> <SEP>14
28 <SEP>3.7
2.7 <SEP>100
100 <SEP>0.317
0.378 <SEP>100
100 
<tb> <SEP>28 Tage alte Küken,
Durchstechung <SEP>10<3> <SEP>14
28 <SEP>1.6
0.54 <SEP>100
90 <SEP>0.191
0.161 <SEP>100
80 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=7 
<tb>Title: Tabelle XVI
Immunantwort gegen Kanarienvogelpocken/Tollwut-Glykoprotein (vCP-16) von Hühnern bei verschiedenem Alter 
<tb>Head Col 01 AL=L: Positive Gruppen 
<tb>Head Col 02 AL=L: Dosis
(TCID50) 
<tb>Head Col 03 AL=L: Zeit nach Impfung
(Tage) 
<tb>Head Col 04 to 07 AL=L: Antikörper 
<tb>SubHead Col 04 to 05 AL=L: Tollwut Glykoprotein 
<tb>SubHead Col 06 to 07 AL=L:

  Kanarienpocken 
<tb>SubHead Col 04 AL=L> DIAMETER  IU Titer: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>% Vögel/1IU: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L> DIAMETER: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>Elisa OD%: 
<tb> <SEP>Embryonen <SEP>10<3> <SEP>3 + 14 <SEP>0.14 <SEP>0 <SEP>0.068 <SEP>25 
<tb> <SEP>18 Tage alt <SEP>10<4> <SEP>3 + 14 <SEP>0.19 <SEP>8 <SEP>0.059 <SEP>25 
<tb> <SEP>Eintagsküken, i.m. <SEP>10<3> <SEP>14
28 <SEP>0.18
0.21 <SEP>10
40 <SEP>0.027
0.059 <SEP>0
10 
<tb> <SEP>28 Tage alte Küken, i.m. <SEP>10<3> <SEP>14
28 <SEP>0.61
0.24 <SEP>70
30 <SEP>0.093
0.087 <SEP>60
30 
<tb> <SEP>28 Tage alte Küken,
Durchstechung <SEP>10<3> <SEP>14
28 <SEP>0.34
0.11 <SEP>40
10 <SEP>0.071
0.061 <SEP>30
10 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 25 
 


 Sicherheit und immunogene Wirkung einer Impfung von Ferkeln mit vFP-6 
 



  Zwei Gruppen von drei Ferkeln wurden mit der Rekombinante vFP-6 beimpft über einen der beiden Wege: 
 
   a) drei Tiere erhielten 8,1 log10TCID50 durch eine intramuskuläre Impfung; und 
   b) drei Tiere erhielten die gleiche Dosis durch orale Impfung. 
 



  Allen Tieren wurde in wöchentlichen Abständen Blut entnommen und alle Tiere erhielten eine Auffrischimpfung der gleichen Dosis über den gleichen Weg am Tag 35. Die Ferkel wurden täglich auf klinische Symptome beobachtet. Die Seren wurden auf anti-Geflügelpocken-Antikörper mit einem ELISA-Test und einen Serumneutralisationstest geprüft. Tollwutantikörper wurden in einem RFFI-Test bestimmt. 



  Alle Ferkel blieben bei guter Gesundheit und keine Läsionen wurden nach der Impfung beobachtet. Die Temperaturkurven waren normal, wobei kein Unterschied zwischen geimpften und nicht geimpften Tieren zutage trat. Sowohl die über den intramuskulären als auch oralen Weg geimpften Ferkel entwickelten eine Antikörperbildung auf Geflügelpockenantigene, wie durch ELISA- und Serumneutralisation bestimmt wurde. Eine zweite Antwort war offenkundig nach der Auffrischimpfung. (Ergebnisse nicht gezeigt). Alle Ferkel entwickelten ausserdem eine Immunantwort auf Tollwutglykoprotein, wie in einem RFFI-Test bestimmt, und ein Auffrischeffekt war bei beiden Wegen offenkundig. Diese Ergebnisse sind in Tabelle XVII zusammengefasst. 



  Die Ergebnisse zeigen an, dass die Impfung mit Geflügelpocken/Tollwutrekombinanten unschädlich für Ferkel ist und dass die Rekombinante in der Lage ist, eine signifikante Im munantwort auf das Tollwutglykoprotein nach oraler oder intramuskulärer Impfung hervorzurufen. 
<tb><TABLE> Columns=8 
<tb>Title: Tabelle XVII
Gegen Tollwutglykoprotein erzeugte Antikörper in mit vFP-6 geimpften Ferkeln 
<tb>Head Col 01 AL=L: Impfweg 
<tb>Head Col 02 AL=L: Tier Nr. 
<tb>Head Col 03 to 06 AL=L: Tollwut-Antikörper nach Tagen 
<tb>Head Col 07 to 08 AL=L: (RFFI-Titer) 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>14: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>21: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>28: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>35<b>: 
<tb>SubHead Col 07 AL=L>42: 
<tb>SubHead Col 08 AL=L>49: 
<tb> <SEP>I.M.

   <SEP>984 <SEP>2.4<a> <SEP>2.2 <SEP>2.1 <SEP>2.2 <SEP>3 <SEP>3 
<tb> <SEP>985 <SEP>2.5 <SEP>2.7 <SEP>2.6 <SEP>2.4 <SEP>3 <SEP>3 
<tb> <SEP>986 <SEP>2.2 <SEP>2.0 <SEP>2.1 <SEP>2.3 <SEP>3 <SEP>3 
<tb> <SEP>Oral <SEP>987 <SEP>3 <SEP>2 <SEP>2.1 <SEP>2 <SEP>3 <SEP>3 
<tb> <SEP>988 <SEP>2.9 <SEP>2.4 <SEP>2.2 <SEP>2.4 <SEP>2.7 <SEP>2.5 
<tb> <SEP>989 <SEP>2.8 <SEP>2 <SEP>1.7 <SEP>1.8 <SEP>2.4 <SEP>2.5 
<tb> 
 a Titer ausgedrückt als log10 der höchsten Serumverdünnung, die eine Reduktion um mehr als 50% in der Anzahl der fluoreszierenden Näpfchen in einem RFFI-Test ergibt.
b Tiere erhielten eine zweite Impfung am Tag 35.
  
<tb></TABLE> 

Claims (31)

1. Rekombinantes Virus zur Expression eines Genprodukts in einem Vertebraten, welches Virus eine DNA enthält, die das Genprodukt ohne replikative Vermehrung des Virus in dem Vertebraten codiert und exprimiert.

2. Virus nach Anspruch 1, welches ein Pockenvirus ist.

3. Virus nach Anspruch 2, welches ein Avipoxvirus ist.

4. Virus nach Anspruch 3, welches ein Geflügelpockenvirus oder ein Kanarienvogelpockenvirus ist.

5. Virus nach Anspruch 1, bei dem das Genprodukt ein Antigen ist.

6. Virus nach Anspruch 5, bei dem das Antigen eine Immunantwort bei einem Vertebraten auslöst.

7. Virus nach Anspruch 5 oder 6, welches ein Pockenvirus ist.

8. Virus nach Anspruch 7, welches ein Avipoxvirus ist.

9. Virus nach Anspruch 8, welches ein Geflügelpockenvirus oder ein Kanarienvogelpockenvirus ist.

10.

Virus nach Anspruch 6, bei dem das Antigen eine Immunantwort auf ein Vertebratenpathogen bei einem Vertebraten auslöst.

11. Virus nach Anspruch 10, welches ein Pockenvirus ist.

12. Virus nach Anspruch 11, welches ein Avipoxvirus ist.

13. Virus nach Anspruch 12, welches ein Geflügelpockenvirus oder ein Kanarienvogelpockenvirus ist.

14. Virus nach Anspruch 10, bei dem der Vertebrat ein Säugetier und das Vertebratenpathogen ein Säugetierpathogen ist.

15. Virus nach Anspruch 14, bei dem das Antigen ein Tollwut G-Antigen, gp51,30-Hüllantigen des Rinderleukämievirus, FeLV-Hüllantigen des Katzenleukämievirus oder Glykoprotein D-Antigen des Herpes simplex Virus ist.

16. Virus nach Anspruch 14 oder 15, bei dem die Säugetiere Hunde, Katzen, Mäuse, Kaninchen, Rinder, Schafe oder Schweine sind.

17.

Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein rekombinantes Avipoxvirus ist, das eine DNA aus einer Nicht-Avipox-Quelle in einem nicht-essentiellen Bereich des Genoms des Avipoxvirus enthält.

18. Virus nach Anspruch 17, das ausserdem einen Nicht-Avipoxpromotor zur Expression der DNA enthält.

19. Virus nach Anspruch 18, bei dem der Nicht-Avipoxpromotor ein Vacciniapromotor ist.

20. Virus nach Anspruch 19, bei dem der Vacciniapromotor der HH-, 11K- oder Pi-Promotor ist.

21. Virus nach Anspruch 18, bei dem der Nicht-Avipoxpromotor ein Entomopoxpromotor ist.

22. Virus nach Anspruch 17, das ausserdem einen Avipoxpromotor zur Expression der DNA enthält.

23. Virus nach Anspruch 17, bei dem die DNA ein Antigen ei nes Säugerpathogens codiert.

24.

Virus nach Anspruch 23, bei dem das Antigen ein Tollwutantigen, Tollwut G-Antigen, gp51,30-Hüllantigen des Rinderleukämievirus, FeLV-Hüllantigen des Katzenleukämievirus oder Glykoprotein D-Antigen des Herpes simplex Virus ist.

25. Virus nach Anspruch 17, bei dem die DNA ein Antigen eines Vogelpathogens codiert.

26. Virus nach Anspruch 25, bei dem das Antigen ein Vogelinfluenza-Hemagglutininantigen, Fusionsproteinantigen von Newcastle Disease Virus, RAV-1-Hüllantigen des Rous assoziierten Virus, Nucleoproteinantigen des Vogelinfluenzavirus, Matrixantigen des infektiösen Bronchitisvirus oder Peplomerantigen des infektiösen Bronchitisvirus ist.

27. Virus nach Anspruch 17, welches ein Geflügelpockenvirus ist.

28. Virus nach Anspruch 17, welches ein Kanarienvogelpockenvirus ist.

29.

Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein rekombinantes Pockenvirus ist, das eine DNA aus einer beliebigen Quelle und einen Entomopoxpromotor zur Expression der DNA enthält.

30. Virus nach Anspruch 29, welches ein Avipoxvirus ist.

31. Virus nach Anspruch 29, welches ein Vacciniavirus ist.