JPH02501985A - 免疫複合体の選択的除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫複合体の選択的除去 発明の背景 本発明は血清からの免疫複合体の選択的除去に有用な新しい組成物に関するもの である。更に詳しくは、本発明は遊離の循環免疫グロブリンよりも大きい親和性 で免疫複合体に結合するように設計された、複数のポリペプチド領域からなる免 疫吸着物質に関するものである。

免疫複合体は、多くのヒトの疾病状態の病理学に関係している。実際、自己免疫 疾患、腫瘍性疾患、後天性免疫不全症候群、及びいくつかの感染性疾病の多くの 個体の血清には、高レベルの循環免疫複合体を含むことを示すことができる。こ のような複合体は、多種の免疫エフェクター機能を媒介すると推測されている。

循環面からの複合体の除去は治療上利点があることが期待される。

アメリカ合衆国特許第４６１４５１３号は少な（とも“プロティンＡの構成物゛ を含む、血中からの“免疫反応性物質゛の除去の方法及び装置を記載している。

プロティンＡは多くの免疫グロブリン種のＦＣ領域と特異的結合能を持つ、多く のスタフィロコッカス・オーレウスこの天然蛋白質は約１５０アミノ識残基かう なる、疎水性Ｎ−末端領域を介して部分的に細胞壁に埋め込まれている。この分 子の残りの部分はＥ、Ｄ、Ａ、ＢそしてＣと命名さｎた、５つの相同性の高い領 域からなり、それらは各々約７０００ダルトンの分子量を持って、ポリペプチド 鎖に沿って連続的に配置されている。それぞれの領域は、見かけ上等しいアフィ ニティーで、免疫グロブリンの１つのＦｃ領域に独立に結合する能力を持ってい る。この結合相互作用は、約５　Ｘ　１０’　Ｍ−”の会合、または結合定数（ Ｋａ　）を持ち、その値は、緩衝液のｐＨ，免疫グロブリンの種、クラス、サブ クラスによって若干変化する。しかしながら、プロティンＡは恐ら（立体的な制 約のため、一度に２つの免疫グロブリン分子にしか結合できない。

プロティンＡは免疫グロブリンのＦｃ領域へ結合しても、免疫グロブリンの（対 応する）抗原に対する親和性に対して有意な影響は与えない。天然或は組換え体 由来のプロティンＡは、それゆえ、多くの診断及び基礎研究の適用のための免疫 吸着剤として有用である。ヨーロッパ特許第８３３０６５００．６号１国際特許 出願ＰＣＴ／ＳＥ／８３１００２９７号およびＰＣＴ／５Ｅ８３１００２９８号 参照のこと。これらの出願は実質１同等の１プロティン人様の結合１または増加 した“ＩｇＧ−結合活性”を持つ“プロティン人様の１分子を開示している。

アメリカ合衆国特許第４６１４５１３号の開示で認識されていないのはプロティ ンＡが遊離、及び結合免疫グロブリンの双方に結合する、というその開示中の手 法における制約である。故に、プロティンＡは、非複合状態の、可溶性の免疫グ ロブリンの存在下で、選択的に免疫複合体を除去するための実際的な治療薬とし ては使用され得ない。

本発明の目的は、血液あるいは血清からの選択的な免疫複合体の除去に有用な、 新しい免疫吸着物質を提供することである。他の目的はこの免疫吸着性のポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列を提供し、遊離の、循環免疫グロブリン存在下で の免疫複合体除去法を提供することである。

本発明の上記及びその他の目的、及び態様は、以下の記載、図面、請求の範囲に よって明確になるであろう。

発明の概要 免疫複合体即ち、免疫グロブリン分子の凝集体の血清からの選択的除去のための 手法が、本発明により開発された。好ましい観点として、この手法はスタフィロ コッカスのプロティンＡ及びその個々の結合領域の免疫グロブリンの（対応する ）抗原に対する親和性を変えることなく、そのＦｃ部分に結合するといった天然 の能力を利用する。また、この手法は天然プロティンＡ結合領域の構造を変え、 それが、遊離の可溶性免疫グロブリン（以下５ｏｌ−Ａｂと略す）よりも、架橋 された、複合された、或は凝集した免疫グロブリン（複合体）と大きい親和性で 結合する能力を持つようにするために、既知の組換えＤＮＡ操作技術を用℃・る 。

本発明によれば、プロティンＡと比較してｓｏ　１−Ａｂにて好ましくは１０５ Ｍ−１以下；であるプロティンＡ結合部位アナログの複数コピーからなる物質は 、免疫複合体に対する選択性を示すことが発見された。この物質は、その複数の 結合領域と免疫複合体中の異なる免疫グロブリンの複数のＦｃとの間で複数の相 互作用を奏することによって特徴づけられる。一つの分子に充分な間隔、すなわ ち複数箇所の結合が可能となるように、少（とも約５２オングストロームの間隔 で複数コピーの結合領域を持たせた場合、免疫複合体の複数点での結合が生成す る。

別の方法として、結合領域と（免疫）複合体との複数点での結合を可能にするよ うに、個々の結合領域を閾値濃度で固体支持体の表面に間隔を置いて固定する。

一つの結合領域と一つのＦＣ間の結合に特命的なＫａは非常に低いが、本発明の 物質をｆＦ依づげる、複合相互作用の存在は、有効結合定数を個々の結合領域の 個々の（結合）定数の総和に近づけるので、分子会合に有意な安定性を付与する 。

本発明の基礎になる仮定に対する裏付けは、文献中に見られる。例えば、Ｊ、　 Ｊ、　Ｌａｎｇｏｎｅ及び他の研究者１７１−１７８．１９８４）は、弱くプロ ティンＡと結合する種（例；ネズミ及びヤギ）由来の可溶性のＩｇＧは、免疫グ ロブリンが複合体を作るように凝集した場合、より強い親和性でプロティンＡと 相互作用することを示している。同様に補体カスケードの第一成分であるＣ１ｑ は、ＩｇＧのＦＣ部分に対する低い親和性を持ち、可溶性のＩｇＧ分子には有意 に結合しないことが知られている。

Ｃｌｑ分子は、それぞれＦｃに対する同等の親和性を持つ６つの結合領域から成 るため、１分子のＣ１ｑと３つ或いはそれ以上のＦｃ　（免疫複合体中に会合し たもの）との結合が非常に安定な構造を作る原因となっていると考えられる（　 Ｈｕｇｈｅｓ−Ｊｏｎｅｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　３２　：　１９１−１９８ 、　１９７７　；　Ｈｕｇｈｅｓ−ＪｏｎｅｓおよびＧａｒｄｎｅｒ。

Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１６　：　６９７−７０１　、　１９７　ｃり 。

ｓｏ　Ｉ−Ａｂよりも複合体との結合を増すような濃度で、多数の結合力低下ア ナログが支持基盤に共有結合される。

この結合は、基盤上に共有結合された、異種三機能性でそれ自身は免疫グロブリ ン結合能のない架橋試薬と反応可能な適当なアミノ酸を用いることによって実施 可能である。

本発明によれば、血液を血漿と細胞成分に分離し、血漿を免疫吸着物質に晒し、 処理後の血漿を細胞成分と再び混合することにより、遊離の免疫グロブリン存在 下で、複合免疫グロブリンを血漿から選択的に除去することが可能である。

本発明の上記、及び他の特色は以下の記載、図面、請求の範囲の内容によって明 確にされる。

図面の簡単な説明 第１Ａ図は、天然プロティンＡのＦＢ結合領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（ −文字及び三文字記号で表記）である。下線を施した残基はアルファらせんの領 域を示し、星印の残基は結合時にヒ）ＩｇＧのＦｃ領域の残基に最も近くなる残 基を示す。

第１Ｂ図は天然ＦＢ（ＦＢｓｓ）、及び可溶性ＩｇＧに対する低下した結合活性 を持つ、本発明のＦＢアナログのアミノ酸配列（−文字記号で表記）を開示して おり、後者には短縮アナログのＦＢ？）”　＋　ＦＢ３６＋　ＦＥ２９＋　ＦＥ ４ｏｎ及びＦＢ４７が含まれる。

第２図は、本発明において有用な、典型的なプロティンＡ結合領域（ＦＥ２９） の低結合アナログをコードする、本発明の組換えＤＮＡ（配列）、及びＮ−末端 のメチオニン残基（開始）ならびに結合領域を固定支持体に結合するために用い られた、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ、　Ｃｙｓ、　Ａｌａ。

Ａｌａｌミスペーサ−を含む、（上記組換えＤＮＡの）アミノ酸配列を示す。

そして第３図は複合体及びｓｏ　１−Ａｂに対する、天然ＦＢ及び２つの代表的 なＦＢブナログの相対、的な結−合親和性を示すグラフである。

記載 プロティンＡの結合領域と、ＩｇＧのＦｃ領域との相互作用における分子間力は 、Ｘ−線結晶解析のデータ及びコンピュータで計算された結合エネルギーによっ て研究された。プロティンＡ結合領域（ＦＢ）と、ヒ）ＩｇＧのＦｃ領域から成 る複合体は結晶化され、その三次元構造が決定された（　Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅ ｒら、１９７８．　Ｈｏｐｐｅ−２３６１−２３７８）。更に、ＦＢとＦｃの相 互作用における結合エネルギーのコンピュータ予測が成された。

これらのデータ及び情報の結果、ＦＢ及びＦＣのそれぞれの残基について、相補 する分子内の原子が４オングストロ一ム以内の距離にあることを示す作業モデル （或いは結合点の大まかな地図）の構築が可能になった。コンピュータグラフィ ックスによる、結合界面上の極性、及び荷電残基の位置の考察の結果、二分子の 境界（即ち、小さい誘電率の環境）に、多くの陽電荷及び陰電荷が埋めこまれる ことが明らかになり、それらの静電相互作用が結合エネルギーに有意に寄与する であろうと仮定された。更なる解析によって分子間の相補面に明らかな逆の荷電 の組は存在しないことが示され、結合のメカニズムは単に逆電荷の相互の中和に よるものではないことが示唆された。

天然プロティンＡのＦＢ領領域アミノ酸配列が第１Ａ図に示されている。この分 子は下線部に２つのアルファらせん領域を持つ。結晶解析の研究から、これらの らせん構造は結合する時ＫＩｇＧのＦｃ領域と緊密に会合することが明らかにな った。第１Ａ図中に示されている星印のアミノ酸は結合に最も直接関与する、即 ち、Ｆｃ−ＦＢ複合体中でＦＣの残基から約４オ／ゲストローム以内にあると決 定された残基である。

前述の情報から、プロティンＡ分子のＦＥ領領域アミノ酸配列でのどのような変 化がＩｇＧに対する親和性を低下させるかが予想され、この予想を検証するため にＦＢ領領域アナログが設計された。いくつかのアナログのアミノ酸配列が、第 １Ｂ図に示されている。これらのアナログは、ＫａでｌＸｌ０Ｍ　から５Ｘ１０ Ｍ　間の、可溶性ＩｇＧに対する親和性を持つことが示された。

上記のようなアナログを設計するために使われた手法は第１Ｂ図を再度参照する ことにより、良く理解される。

ＦＢｓｓと書かれた蛋白質は、天然の、或いは野生型のＦＢ配列である。Ｆ　Ｅ Ｔ、はＬｙｓ７−　Ｇｌｕ”結合を切断するトリプシンによって、天然型の蛋白 質を切断することによって生成する。ＦＢ、ｓのＦＣに対するＫａは約５　Ｘ　 １０’Ｍ−”　；　ＦＢＴ、のＦＣに対するＫａは約５−Ｘ　１０’　Ｍ−”で ある。

残りのアナログは適切なりＮＡの発現によって作られる。

全てが天然断片の短縮アナログよりなる。これらのアナログのＦＣに対する概算 の親和性は、リットル１モルで表すと、それぞれＦＢｚ６．　Ｋａ　＝　２　ｘ 　１０３；　Ｆｌｈｓ、４　Ｘ１０”（Ｋａ＜２　ｘ　１０３；ＦＢ４０１６　 ｘ　１０３＜Ｋａ＜２　ｘｌｏ　；　ＦＢ４７．　Ｋａ　＝２　Ｘ　１０　であ る。本発明の種々のアナログとしてのオリゴマーは、複合体に対して高い親和性 、例えば１０７　Ｍ−１以上、そシテ好ましく　ハ１０８Ｍ−”以上；を持ち、 ＦＣに対して低い親和性、例えば１０’Ｍ−１する。多点結合にはオリゴマーの 結合領域間で少くとも５２オングストローム（中心から中心まで）の間隔が必要 である。複合体との多点相互作用は、また、複合体中の２個或いはそれ以上のＦ Ｃが同時に反応できるような濃度で、上記のようなアナログが（支持体の）表面 に固定さｎた時にも起こる。

この分野の技術に熟練した人たちには理解さｎるだろうが、ＦＣのＦＢ断片に対 する親和性は、第１図に示されたものと厳密に同じアミノ酸配列およびそれをコ ードするＤＮＡ配列のみには依存しない。同じアミノ酸配列をコードする他のＤ ＮＡが使用され得る。完全なアミノ酸配列より短かい第１図のＦＢ断片にもある 程度の結合活性が残存している。また、有意な結合活性を保持しながら配列中の アミノ酸のいくつかが置換され得ることも考慮される。プロティンＡのＡ、Ｃ， Ｄ、又はＥ結合領域のアナログ及びストレプトコッカス種由来の蛋白質Ｇの断片 のような機能的に類似のバクテリア蛋白質のアナログを含めて、他の修飾アミノ 酸配列も本発明の範囲内である。少くとも５　Ｘ　１０２Ｍ−’の結合親和性を 持つものが利用可能である。

ＦＣ領域を構成するＩｇＧの重鎖には、それぞれ１つだけプロティンＡに認識さ れる結合領域が存在する。一方、複合体は近接してたくさんの結合領域を提示す る。この構造上の相違を利用して、複合体結合部分の選択性を上昇させるには、 個々ではＦｃに対して比較的低い親和性を持つ、プロティンＡの結合領域のアナ ログの繰り返し或いはオリゴマーを設計したり、同じく個々では低親和性の近接 した結合領域を含む構造を設計する。このようなオリゴマーは、遊離のＩｇＧの よ５に一つの結合領域しか持たない種に対しては低い親和性を持つが、複合体の ようた複数の結合領域を持つ種には高い親和性を持つ。このようなオリゴマーの 親和性定数は、もし結合がそれぞれの部位で独立に起こるとすれば、繰り返し単 位の個々の親和性ＫＯの積になる；ここでＫＯとは反応物質のモル濃度を用いて 定義される固有の結合定数である。故に、例えばＦｃＫ対する親和性がＩ　Ｘ　 １０３Ｍ”のアナログを使用して、遊離の免疫グロブリン分子に対しては同じｌ Ｘ１０”Ｍ−”の親和性を持つが、複合体に対する親和性がＩ　Ｘ　１０’Ｍ− ’の三量体を作ることができる。もし、一つのアナログ−Ｆｃ結合の組が、他の 結合の生成を阻害するとすれば、観察されるＫａは（Ｋａ）”より小さくなるが 、しかしＫａよりは依然高い。

プロティンＡ自身も複数結合領域を線状に配置していると見なされ得るというこ とにも注意すべきである。しかしながら、恐らくは立体障害のために、最適の条 件下で同時ＶＣ１つのプロティンＡ分子上の２つの部位しか結合できず、そして プロティンＡは有意に選択的に複合体に結合できない。

プロティンＡ結合領域アナログをコードする遺伝子は、ロチインＡ、プロティン Ｇの他の知られた配列、或いは他の結合領域に基づ℃・て設計され、合成オリゴ ヌクレオチドの結合、又は本質的に知られた他の手法による従来の組換えＤＮＡ 技術を用いて調製され得る。典型的なＦＢアナログのＤＮＡ及びアミノ酸配列が 第２図に示されている。これは第１Ｂ図に示されたＦＢ２９の構造と対応してお り、開始部位（Ｍｅｔ）　；Ｐｒｏ、Ｐｒｏ、　ｃｙｓｓＡｌａ、　Ａｌａ配列 （固定支持体との結合にこのＣｙｓ残基が使われた）：そして次に２つのらせん 領域にまたがり、結合に最も重要と考えられている９つの残基のうち７つの残基 を含む、天然ＦＢの２９残基；からなる。

一般に、第１Ｂ図に示されるようなアナログは、Ｅ。

て第２図で例示されるような、リーダーペプチドの遊離のためのブロムシアン切 断部位となるメチオニン残基、そしてアナログのアミン末端もしくはその近（に 位置し、固体支持体への低親和性化アナログの意図した結合を可能にするための システィン残基を含む、融合蛋白質として発現される。もちろん、熟練した分子 生物学者には、他の多くの産生技術も明白であろう。このような構築物は、セフ ァロースビーズ（架橋したデキストラン）のような、不活性で比較的表面積の大 きい粒子、又は他の生物学的に同等の物質からなる（支持）基盤を含む、免疫る かぎり、結合領域の表面密度は免疫複合体の多点結合を可能にする。別の言い方 なすれば、アナログの間陽が、複合体の結合領域間の距離を上回るような低密度 で基盤上に配置されない限りは、この種の物質は遊離の免疫グロブリンより選択 的に複合体と結合する。これは、最も良い条件でも経験的に（（ＩｇＧ）４（プ ロティンＡ）２〕の構造式を持つ巨大分子凝集体しか生成しない天然の完全なプ ロティンＡとは対照的である。最適に作用するアナログの濃度は経験的に決めら れる必要があり、それは支持体物質の表面積、架橋の様式、使用されるアナログ の具体的性質、そして免疫複合体の大きさ等の因子に依存する。

別の方法として、結合力低下アナログは、多数の結合ペアを作る目的で挿入され たアミノ酸スペーサー配列によって、充分間隔を置かれた多数の結合力低下領域 を含む、プロティンＡ様分子（オリゴマー）として発現させることも可能である 。この点については、２つの活性な結合領域の中心間の最少距離は約５２オング ストロームである必要がある。そしてこれらは望ましい選択性を持った、免疫吸 着物質を生成するために固定化することができる。

機能的に“免疫複合体゛とは複数の１−のＦｃを含む分子凝集体と表現される； この凝集体または複合体は、抗原−抗体結合、熱凝集、又は化学的架橋が原因で ある。

抗原−抗体凝集体及び熱凝集体の潜在的な不安定性のため、共有結合的に架橋さ れたヒ）　ＩｇＧの凝集体が、本発明の効果の検討のため天然複合体のモデルと して用いられた。ヒトエ（はカルボジイミドで架橋され、異なる大きさの凝集体 がゲル濾過クロマトグラフィーによって回収された。ここで報告されている実験 において使用された凝集体は、約６０ＱＯＯＯダルトンの分子量を持ち、これは Ｉｇの４量体と同等である。使用前にこの凝集体は低レベルの内因性循環免疫複 合体しか含まないヒト血清によって希釈された。

この発明は、説明のためのものであって発明の範囲を限定することを意図しない 、以下の非限定的実施例から更に理解される。

プロティンＡのＦＢ２．アナログをコードする遺伝子の構築に関与する分子生物 学及び微生物学は、遺伝子構築に関する分子生物学及び微生物学の例として提供 されている。

ＦＢ２．　アナログをコードする遺伝子は、ＦＢｓｓ親遺伝子のＮ−末端及びＣ −末端双方において短縮及び／或いは置換をすることによって構築された。ＦＢ 、、遺伝子は以前にオリゴヌクレオチドの結合によって合成された。

ＦＢ５ｍ　（第１図）をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを、そのＮ−末 端で遺伝子を改変する準備のため、ＥｃＯＲｌ及びＭｌｕ　Ｉ制限酵素によって 消化した。二重切断プラスミド調製物は単切断及び非切断分子からポリアクリル アミドゲル電気泳動によって分離された。電気泳動的溶出、エタノール沈殿及び 再懇濁に引き続いて、ＥｃｏＲＩ／Ｍｌｕｌ消化プラスミドは、目的の蛋白質配 列をコードするように設計された、目的ＤＮＡ配列を持つ合成されたいくつかの オリゴヌクレオチドと結合された。

配列のそれぞれの末端は、上記制限酵素によってプラスミド中に作られたＥｃｏ ＲＩ及びＭｌｕ　Ｔサイトと相補的であるように設計された。ライゲーションの 混合物は、標準的な微生物学的手法によってコンピテント！螢連■細胞に導入さ れた。これによって得られるコロニーは、制限酵素分析によって変化したＮ−末 端の存在を指標にスクリーニングされた。目的配列の確認はＤＮＡ配列決定（サ ンガーのダイデオキシ法）によってなされた。

同様にして、プラスミドをＨｉｎｄｍ及びＰｓｔｌで消化することにより、この 改変遺伝子のＣ−末端を短縮した。

目的の配列（ＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＰｓｔ　１サイトへの結合のため、相補性のあ る末端に設計しである）を持つオリゴヌクレオチドを、二重切断プラスミドに結 合した。結合、形質転換、スクリーニング、配列決定の後、Ｎ−末端にプロモー ター及び適切なリーダーペプチドが挿入された最終的な遺伝子配列（第２図）が 発現のために用意された。

ットルのバッフル付振とうフラスコ中、１０り／ｌトリ１−／ｌテトラサイクリ ンストック（９５％エタノール中１０４／ｍ／）を含む、５９−のルリアプロス （Ｌｕｒｉａｂｒｏｔｈ　）に接種した。この培養液は回転台で２０゜ｒｐｍ、 １７時間、３７℃で培養された。培養装置は、全体が２００ｄで接種された。

Ｅ、　ｃｏｌｔの培養 上記対数増殖期培養物は、１１　ｆ／Ｌ　Ｎａ２　ＨＰＯい１５　ｆ／ｌ　Ｄ− グルコース、５　ｆ／を酸加水分解物、３ｆ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ２、１り／１ＮＨ ４ｃ１．０．５り／１ＮａＣ１，５ｍｌ／を微量鉱物混合液（１３，３−濃　） ＩＣＩ、５．４　ｆ／１ＦｅＣ１３’　６　Ｈｚ０．１．４４　タ／ｌ　Ｚｎ　 Ｓ　０４　・７　Ｈｚ　０　、　１．０り／Ｌ　Ｍｎ　Ｃ１ｚ　・　４　Ｈ２０ 、０，２５ｆ／ｌ　Ｃｕ　Ｓ　０４　・　５　Ｈｚ０゜及び０．０６２　ｆ／ｌ 　Ｈ，ＢＯ，）、　０．５　ｍｌ／ｌ　Ｉ　Ｍ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、１，４ 脱イオン水から成る培地１０リツトルに接種され、細胞は１１，３００Ｘｆで１ ０分間の遠心分離によシ沈澱させられる。上滑を傾瀉したのち、細胞塊は適当か 容器に移され、−７０℃で保存される。

封入体の調製 凍結細胞塊１００りを１リツトルの脱イオン水に再懸濁する。細胞は５０００　 ｐｓｉで稼働しているホモゾナイザーで溶菌される。部分的に溶解された細胞は １５分間氷上で放置され、同じ条件下で再度ホモゾナイザーにかけられる。封入 体及び細胞の破片は３５００Ｘｆで３０分間、４℃で遠心分離することによって 沈殿される。

アナログの精製 融合蛋白質は、４０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び８Ｍ尿素、 ｐＨｓ、ｏからなる緩衝液中で封入体から可溶化される。１グラムの封入体につ き、２５ゴの体積の緩衝液が加えられ；可溶化は攪拌及びホモゲナイザー処理に よって促進される。融合蛋白質が溶液中に移ったならば、ｄＨ２０中、１ｍＭＥ ＤＴＡ、ｐＨ８，０に対し、−晩、４℃で透析することによって尿素を除去する 。透析された物質は濃酸の添加により、０．１１１ｍＨＣｌ　に調、整され、プ ロティンＡアナログをリーダーペプチドから切断するためにブロムシアン（０， ２５ｆ／ｆ細胞塊）が加えられる。反応は攪拌下、４〜６時間、遮光して室温で 行われる。未反応のブロムシアン及び揮発性の副産物は凍結乾燥によって除去さ れる。残留物は脱イオン水に再懸濁され、溶液のｐＨはｌＮＮａＯＨの添加によ り、８．０に調整される。このｐＨを保持しながら、室温で２時間攪拌した後、 消化物は２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　、１ｍＭＥＤＴＡ％ｐＩ（８，０に 対して、−晩透析される。消化物は、イオン交換クロマトグラフィーに先立ち、 １ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加によシ、環元される。

消化物は２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、及び１ｍＭ　ＤＴ Ｔ、ｐＨ８，０（カラム緩衝液）によって平衡化されたワットマフ　（Ｗｈａｔ ｍａｎ　）　ＤＥ　−５２セルロースの陰イオン交換カラム上でクロマトグラフ ィーにかけられる。標品はカラム緩衝液中に溶かしてからカラムに添加される。

カラムから溶出する蛋白質Ｈ２８０ｎｍで検知され、２０ゴづつの分画に回収さ れる。結合した蛋白質はカラム緩衝液中のＮａＣ１の０−５００ｎ＋Ｍ＠度勾配 全用いて溶出される。個々の分画は分析用Ｃ−１８逆相高性能液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酵ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動（ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び／又はニワトリ抗−プロチインＡ抗体（後述）を用いた 放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を用いて、目的のアナログの存在について検査され る。適切な分画が集められ、濃縮され、脱イオン水中の１ｍＭＥＤＴＡに対して 透析される。得られた標品は再び１ｍＭＤＴＴによって環元され、トリフルオロ 酢酵によってｐＨｚＯに調整されたｃｌ）（、Ｏ中２５チアセトニトリルで平衡 化された分取用Ｃ１８カラムにのせられる。結合した物質はア七ト二トリルの２ ５−４５％濃度勾配を用いて溶出される。アナログの同定は、以前に分析された 組換えアナログとの、分析用Ｃ１８カラムからの同時溶出、及び／又はアミノ醒 分析及び配列決定によって確認される。アナログの純度は分析用逆相クロマトグ ラフィーで確認される。目的の純度を持つ分画が集められ、凍結乾燥させニワト リ抗−ＦＢを用いた′サンドイッチ′放射線免疫検定法（ＲＩＡ）が、精製中に 得られた標品中の結合力低下アナログの同定及び定量に用いられた。簡潔に述べ ると、ｐＨ８，０のホウ醒塩緩衝液（ＢＳＢ）中、２−５μ９／ゴの濃度に希釈 された、ニワトリ抗−ＦＢは、湿潤空気中、３７℃で１時間のインキュベーショ ンによって、ポリ塩化ビニルのマイクロタイタープレートのウェルに結合される 。非結合蛋白質は除去され、余った蛋白質結合領域は、ＢＳＢ中の１％脱脂粉乳 を加え、１時間、３７℃で保温することによシ、封鎖された。濃度既知のプロテ ィンＡアナログ及び未知標品の様々な希釈液は、４〜１８時間、室温下でウェル に注入される。結合時間の終了後、各ウェルをＢＳＢで洗浄することによって、 非結合蛋白質は除去される。濃度２５μｙ／ｌｎｔ及び比活性２５００　ｃｐｍ ／　ｎｇを持つ、１２５Ｘ−標識二’７トリ抗−ＦＢは、結合アナログを検出す るために各ウェルに添加される。プレートは一晩室温で放置され、洗浄後、放射 活性が測定される。標準曲線は、アナログの濃度に対し、ウェル結合ｃｐｍをグ ラフ化することによって、描かれるっ未知標品中のアナログ濃度は、曲線の直線 部分から決定される。この検出法の感度は、天然ＦＢ分子についてｉｄ５−１０ ０　ｎｇ／ｍｇ、そして結合力低下アナログについては５−１００μり／−でお る。

ＢＳＢ中２０μｆ／―の濃度に希釈されたヒトＩｇＧをポリ塩化ビニル製マイク ロタイタープレートのウェルに接着させる。ＢＳＢ中の１％脱脂乳を添加するこ とによシ、残留の蛋白質結合部が封鎖される。余分の蛋白質溶液は除去され、既 知蛋白質濃度のＦＢ、又はそのアナログの希釈がウェルに加えられる。３０分放 置した後、０．０５μｆ／ゴに希釈された１２５ニー標識ＦＢの一定量が下にイ ンキュよ一ジョンされる。非結合放射活性を除去するためにプレートを洗い、風 乾し、各ウェルは切シ離すレ、カンマシンチレーションスＲクトロメーターで計 数される５％阻害の値は各アナログ濃度において、以下の式を用いて計算される ： ここで、ｃ　ｐｍ、。。とは阻害剤なしでウェルに結合した放射活性を表わし、 ｃｐｍ試験　とは既知量のＦＢまたはそのアナログを含むウェルに結合した放射 活性を表すう阻害剤濃度に対する％阻害をグラフ化することによって、ＦＢ及び そのアナログについての結合曲線力；描かれる；結合の５０％阻害に必要な各ア ナログの量はグラフから決定される。結合力低下アナログの結合定数は以下のよ うに計算される： ここでＫ（ＦＢｘ）　とはアナログＦＢｘの結合定数であり、Ｋ（ＦＢ）　とは 天然断片３分子（５Ｘ１０’Ｍ−１と推定される；　Ｌａｎｇｏｎｅ、　１９８ ２　）の結合定数でｈＤ、セして［：ＦＢＸ）及び（ＦＢ）　とは結合の５０％ 阻害に必要なＦＢｘ及びＦＢのモル濃度でろる。

単量体のプロティンＡアナログを用いた免疫複合体の選択的結合 ＦＢｓｓ（天然ＦＢ）　又は結合力低下アナログは、０．１マイクロタイタープ レートに、２時間、３７℃で接着される。アナログ濃度ヲ１．５から１００μり ／―迄変化させても、それに続（＋２１１−標識可溶性ＩｇＧ或いは熱凝集Ｉｇ Ｇの結合に殆んど或は全く影響しない。残留した蛋白質結合領域は、１％脱脂乳 で１時間処理することによシ封会される。封鎖溶液の除去後、１チ脱脂乳中に希 釈された可溶性ＩｇＧが、室温で２時間、免疫グロブリン結合領域を飽和させる ため添加される。過剰のＩｇＧはウェルのＢＳＢによる洗浄で除去され；様々な 濃度のｌｕニー標識可溶性ＩｇＧ又は凝集ＩｇＧ　（同じ比活性に調整しである ）が各ウェルに加えられ、引続き一晩インキユベーションされる。選択的結合を 知るために、Ｆ　１３ｓｓ或いはアナログによって覆われたウェルに結合した二 種の標識物の放射活性の絶対カウント数を比較に用いた。

ＦＢｓｓ　、ＦＢ２９及びＦＢ４０（第１図参照）の１２６Ｉ−ＩｇＧ及び１２ ６　ニー凝集ＩｇＧに対する結合力を比較した代表的な実験が纂３図に示されて いる。ＦＢ５．で覆われたウェルでは、リガンド濃度５及び４０μ２／ゴの間で 、そして可溶性ＩｇＧの飽和濃度である１　ｔｑ／−で、双方のリガンドについ て同様の、そして有意な量が結合する。結合した放射活性の絶対量は減少したも のの、可溶性ＩｇＧの飽和濃度ｔ５Ｗｉ／−に上げることによる１２６　ニー　 ＩｇＧのＦ　Ｂ５８への結合阻害の試みは（可溶性ＩｇＧの平衡濃度付近での仕 事のため）成功しなかった。ＦＢ２．及び両リガンドの放射活性の絶対量は低下 するものの、有意に多い量の１２ｓＩ−凝集ＩｇＧか１！Ｓ　Ｉ−可溶性ＩｇＧ 　と比較して結合する。この試験条件ではＦＢ、、よりもＦＢ、。

を含むウェルに多くの放射活性が結合する。可溶性ＩｇＧの飽和濃度を１から５ ■／−まで上昇すると、アナログによって覆われたウェル中での選択的結合が促 進した。

固定化単量体プロティンＡアナログを用いた免疫複合体セファロースＣＬ−４８ （ファルマシア）は以下のようにして活性化された。ゲルは無水再結晶４−ジメ チルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）添加に先立ち、順に水、ジオキサン／水混合物 及び無水ジオキサンで洗浄される。

次に無水ジオキサン中の塩化トシル溶液が加えられ、混合物は室温で１５分間混 合される。混合物は、未反応ＤＭＡＰ及び塩化トシルを除去するために、無水ジ オキサンで濾過される。無水ジオキサン中の０．５Ｍジアミノジプロビルアミン （ＤＡＤＰＡ）溶液が次に加えられ、混合物は一晩、窒素下、４℃で振とうされ る。ゲル１４Ｆ遇され、順に無水ジオキサン、ジオキサン／　１　ｍＭ　ＨＣＩ 混合物、そして最後に水で洗浄される。更に、１０　ｍＭＥＤＴＡを含む、０． １Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，７で洗浄後、異種二機能性架橋剤でちる 、ｍ−マレイミドベンゾイル・スルホスクシンイミド（スルホ−ＭＢＳ）が加え られ、ゲルは２時間、室温そ攪拌される。ゲル（は再び０．１Ｍリン酸ナトリウ ム緩衝液、１０ｒｎＭＥＤＴＡ、ｐＩ（６，７そして次に０．１Ｍ酢酸ナトリウ ム、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＩ（５，０で洗浄される。この結合スルホ−ＭＢＳに よって活性化されたゲルは適量づつに分けて、そして様々な濃度のプロティンＡ アナログを含む溶液と混合される。混合物は室温で９０分間混和され、酢酸ナト リウム−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐ）（５，０で洗浄される。未反応のスルホ−ＭＢＳ は９０分間、同緩衝液に０．１Ｍ２−メルカプトエタノールを添加することによ シ封鎖される。封鎖の後、ゲルは酢酸ナトリウム−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ５，０ 、そして次に１０ｍＭリン液ナトリウム、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、ｐＨ７，３で洗浄される。ゲルは使用まで４℃でリン醒ナトリウム緩衝 液、０．０２％アジ化ナトリウム中で保存される。

免疫複合体アッセイ 複合体はサイトチック（Ｃｙｔｏｔｅｃｈ　）社から販売されている。酵素結合 免疫検査キットを用い、使用説明書に従って定量される。標準曲線の作成のため に、三種の熱凝集ＩｇＧの標準検体がキットに含まれている。標準曲線から未知 標品の値が調べられる；４μり等量（Ｅｑ　）　／ｉ以下を含む血清は正常と見 なされ、一方それ以上のレベルを持つものは上昇している、と見なされる。

可溶性ヒト　ＩｇＧ　ＲＩＡ 可溶性ＩｇＧのレベルはＲＩＡで定量される。簡潔に述べれば、濃度５μｆ／ゴ に希釈された、特異的精製ヤギ抗−ヒトーＩｇＧ　が、ポリ塩化ビニル製マイク ロタイタープレートのウェルに吸着される。１％脱脂粉乳で非特異的蛋白質結合 雪域を封鎖した後、ＩｇＧ　の標準標品、又は未知標品がウェルに加えられ、プ レートは室温で４時間インキュベーションさせられる。非結合物質の除去のため 更に洗浄した後、一定量の１２５Ｉ−標識ヤギ抗−ＩｇＧ反応の終了後、プレー トは洗浄、乾燥、切断、そして計数される。標準曲線は、７．５及び６４０　ｎ ｇ／−の間の既知濃度の可溶性ＩｇＧ標品を用いて描かれた。未知標品は４つの 異なる希釈で各３ウエルずつ検査された。未知標品中のＩｇＧ１１度は標準曲線 から計算される；曲線の直線部分にらたる希釈（標品）Ｆｉ希釈について補正さ れ、平均され、報告されたＩｇＣ濃度を得る。この検査法では複合体はμｙ／ｒ ｒｔ　表記即ち、やや低い効率で検出されるものの、５ｏｌ−Ａｂ　に加えて複 合体のＩｇＧが検出される。

セファロース−ＦＢアナログ調製液がエッＲンドルフ遠心分離管に入れられる。

ゲルは２回洗浄され、上清は捨てられる。正常ヒト血清中に希釈された、化学的 に凝集させたＩｇＧ　（ＣＡＧ／ＮＨ３）、又は同様に緩衝液中で希釈された正 常ヒト血清（Ｎ：［（Ｓ）の１００　ｐｔがゲルに加えられ、攪拌され、そして 様々な時間、３７℃でインキュベーションされた。吸着の時間を５から１２０分 の間で変えた場合及び温度を３７℃又は２５℃で保持した場合も同様の結果が得 られる。上清は別々の試験管に移され、ゲル標品は１００μｔの緩衝液を加えて 洗浄される。洗浄物は最初の上清と合わせて保存される。対照となる標品はプロ ティンＡアナログの結合していないされ、サイトチックＥＩＡキット及びＩｇＧ ＲＩＡを用い、複合体と５ｏｌ−Ａｂ　量がそれぞれ決定される。

以下に示す第１ｆｉは、免疫複合体の選択的除去における、固定化アナログ濃度 の影響を決定した実験の結果を示す。

第１表 ＦＢｓ＠４１１Ｆ／＋ｄ　ＣＡＧ／ＮＨＳ　８．０　（５６）”）０．９０　（ ７６）Ｆ　Ｂｓｓ　３ｑ／１ｎｔＣＡＧ／ＮＢＳ　７．０　（６２）　０．９９ 　（７３）ＦＢｓｓ　２ｒＩ９／ｄ　ＣＡＧ／ＮＨＳ　９．１（５０）　１．４ ９（６０）Ｆ　Ｂｓｓ　１　ｗｌ／ｍｌ　Ｃ，＾、Ｇ／ＷＳ　１０．２（４３） 　２１１（４３ンＦＢｚｅ　４”９／ｌＣＡ咋Ｓ　７．０（６２）　３．５５（ ４）ＦＢ２１　ＳＩＰ／ｄ　ＣＡＧ／ＩＩＪＨ８８，０（５６）　３．７２（− １）Ｆ　Ｂ２９　２”９／ｎｔＣＡＧ／１’ＪＨＳ　１０．３　（４４）　３． ０４　（１８）Ｆ　Ｂ２９　１Ｍ／＋ｄ　ＣＡ９離Ｓ　ＩＺ７　（３１）　３． ７３　（−８）なし　ＮＨ８２，２３，８２ 対照　ＮＨ８１，６３，１０［１９） ＦＢｓｓ　２＋１９／ｍｇ　Ｎ）Ｉｓ　ＮＤ　１．０７（６５）ＦＢｓｓ　１シ ／ｄ　ＮＨＳ　ＮＤ　１．９７　（３６）ＦＢ２１１　４’９７ｍ１　ＮＨ８Ｏ ，８３，３９（−９）ＦＢ２．　３■／ｄ　ＮＨＳ　ＮＤ　３．２６（−５）Ｆ Ｂ２９　２■／ｄ　Ｎ１（Ｓ　ＮＤ　３．４６（−１３）Ｆ　Ｂｚｓ　ＩＷ／１ ｎｔＮＨ８ＮＤ　２．７８　（１０）１）角括弧内の数字は、同様に取シ扱われ 六未吸着標品と比較したチ減少を示す。

２）丸括弧内の数字は、対照セファロースに吸着された標品と比較したチ減少を 示す。

３）未決定 セファロースＰＢ５．又はＦＢ２．調製物によるＣＡＧ／ＮＨ８の吸着は、複合 体濃度を有意に、対照標品の１８．３μｆ　Ｅｑ／−から７ないし約１３μｙ　 Ｅｑ／−の間まで減少させる。アナログ濃度３及び４■／−のゲルは、よシ低い アナログ濃度と比較して多量の複合体の除去が可能である。ＦＢ５ｓ？：有する ゲルによるＮＨＳの吸着の後、ヒ）ｓｏｌ−Ａｂ値は、対照値の３６−７０％に 減少する。

これに対してＦＢ２．を有するゲルに↓るＮＨ３標品の吸着は、殆んど或いは全 （ｓｏｌ−Ａｂ値を減少しなかった（−１３％から１０％の減少）。

以下の実験は、複合体値が固定化プロティンＡの量を増加した際の吸着で用量依 存的に減少するかを調べたものである。結合セファロースの膨潤ゲルを２５から ２００μｔの体積で試験管に分注した。この実験におけるＦ　Ｂ、。

及びＦＢ２．アナログのゲルに対する割合は双方とも４ｑ／−ゲルでらった。Ｃ ＡＧ／ＮＨＳの１００マイクロリツトルが各試験管に加えられ、攪拌され、室温 で１０分間反応させられた。上清を除き、ゲル標品を洗浄し、そして上記のよう に処理された。この実験の結果は、以下に示す第道表に示されており、ここでＣ ＩＣとは循環免疫複合体を、そしてＨｕ　ＩｇＧとはヒト免疫グロブリンを指す 。

第■表 ２５μｔ　２９．６８２）　４．２５”）　２１．５２　２．．６５　２０．４ ０　４．６８（２７）　’）　＜３８）　（３１）　（−１０）５０μｔ　３０ ．９２　４．４３　１９．６０　１．７５　１１４０　３．７３１００μｔ　２ ８．６８　３．５７　１３．２０　０．７７　１０．１２　４．１９１５０μｔ 　２３．６８　３．６４　５．６０　０．４６　５．９２　３．５６２００μｔ 　２６．４０　１９９　２．７２　０，３４　４，９２　３．０１１）これらの 実験で用いられたアナログのゲルに対する濃度は４　ｔｔｑ／−である。

２）ＣＩＣ値はμｆ　Ｅｑ／一単位で示しである。

３）ＨｕＩｇＧ値はＭｐｙ／一単位で示しである。

４）丸括弧内の値は同体積の対照セファロースと比較した／ミーセント低下値で ある。

ＦＢｓ、−又はＦ’Ｂ２９−セファロース量の増加に伴なうＣＡＧ／ＮＨＳの吸 着は、ＣＩＣ値の、対照値に対する２７から９０％の低下という濃度依存性を示 した。

５ｏｌ−Ａｂ値も同様にセファロース−ＦＥＢ、吸着後；３８ないし８９％の間 の低下を示した。これに対し、セファロース−ＦＢ２．に吸着された標品の可溶 性１ｇＧ値は殆んど、或いは全く低下を示さなかった（対照値の−１７から１６ ％間）。

本発明は以上の説明とは別の態様で実施することもでき、そのような別の態様も 請求の範囲に含まれる。

ＦＢ−２９ε０ＯＦＪＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＯＲＮＧＦＩＯ５ＬＫＤ’ ＦＢ　−４０ＥＯＯＮＡＦＹＥ　ＴＬ　）−１Ｌ　ＰＮＬＮＥＥＯＲＮＧＦ　Ｉ 　Ｏ５ＬＫＤＤＰ　ＳＯ５ＡＮＬＬＡＥＪ６ｏｂｒ：　ラメ’１ｖ４５９　（） ｔｇ／ｍｌ）国際調査報告 ｍｍｌ　Ａ＠ｅｉｗｓ″“？Ｃτ／υＳ　εε１０３５ｍユ国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．遊離の免疫グロブリンの存在下て、液体中の複数の会合ヒト免疫グロブリン 分子からなる免疫複合体を除去するための、生物学的に合成された複数のポリペ プチド領域からなる免疫吸着物質であつて、前記ポリペプチド領域は、単独では ヒトＦＣの領域と第一の結合定数で結合し、そして 前記ポリペプチド領域の集合体は、免疫複合体■として会合した複数のヒト免疫 グロブリンの複数の対応する領域と全体の結合定数としては第一の結合定数より 大きい値て結合する、 ことを特徴とする免疫吸気物質。
2. ２．第一の結合定数が１×１０７Ｍ−１以下である請求項１記載の免疫吸着物質 。
3. ３．第一の結合定数が１×１０５Ｍ−１以下である請求項１記載の免疫吸着物質 。
4. ４．少なくとも１つの領域が、スタフイロコツカスのプロテインＡの一部と相同 なポリペプチドからたる請求項１記載の免疫吸着物質。
5. ５．複合体■として会合したヒト免疫グロブリンが支持体に結合可能になる濃度 で、各ポリペプチド領域が支持体に結合されている請求項１記載の免疫吸着物質 。
6. ６．各ポリペプチド領域が、支持体の反応性部位に共有結合したアミノ酸によつ て支持体に結合されている請求項５記載の免疫吸着物質。
7. ７．結合したアミノ酸がポリペプチド領域のアミノ末端近くに位置するシステイ ン残基である請求項６記載の免疫吸着物質。
8. ８．各ポリペプチド領域が、支持体に該支持体の反応部位に共有結合したスペー サーアームによつて結合しており、該スペーサーアームがペプチド結合した少く とも２つのアミノ酸から成る請求項５記載の免疫吸着物質。
9. ９．複数のポリペプチド領域が複数のオリゴマーを形成し、そして各オリゴマー はペプチド結合によつてつながれた少くとも２つの上記領域を含む、請求項１記 載の免疫吸着物質。
10. １０．各オリゴマーが支持体に結合されている請求項９記載の免疫吸着物質。
11. １１．請求項１記載の免疫吸着物質のポリペプチド領域をコードするＤＮＡ配列 。
12. １２．請求項４記載の免疫吸着物質のポリペプチド領域をコードするＤＮＡ配列 。
13. １３．請求項６記載の免疫吸着物質のポリペプチド領域及び共有結合アミノ酸を コードするＤＮＡ配列。
14. １４．請求項８記載の免疫吸着物質のポリペプチド領域、及びスペーサーアーム をコードするＤＮＡ配列。
15. １５．遊離の免疫グロブリンに比べて免疫複合体が請求項１記載の免疫吸着物質 に選択的に結合するために充分な温度及び時間の条件で全血を前記免疫吸着物質 と接触させ、その後全血を前記の免疫吸着物質から分離する；工程からなる、遊 離の免疫グロブリンの存在下で免疫複合体を全血から除去する方法。
16. １６．遊離の免疫グロブリンに比べて免疫複合体が請求項１記載の免疫吸着物質 に選択的に結合するために充分な温度及び時間の条件で血漿を免疫吸着物質と接 触させ、その後、血漿を前記の免疫吸着物質から分擁する；工程からなる、遊離 の免疫グロブリンの存在下で免疫複合体を血漿から除去する方法。