JPH02502014A - フィブリン結合性蛋白質を用いる血餅の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 鼓ｊυ辷賢 本発明は生体内のフィブリン沈着物を検出する方法に関する。結合された検出可 能な物質、例えば放射性核種を有するフィブリン結合性タンパク質が血餅の如き フィブリイン沈着物を診断し、かつ治療中にその溶解を監視するのに提供されフ ィブリンは或種の血管タンパク質の生成及び活性化を伴なう連鎖反応により創傷 部位で生成される不溶性タンパク質である。フィブリンの繊維状ネットワークが 創傷部位で生成し、血小板と結合し、かくして創傷からの血液の流れを停止する フィブリン−血小板血餅を生成する。かくして、フィブリン−血小板血餅形成は 人間その他の動物の生存に必須である。しかしながら、生体内のどこか他の所（ 即ち、創傷部位以外の場所）に於けるフィブリン−血小板血餅形成は、危険で潜 在的に寿命に脅威な血流の制限を生じる。血栓としても知られている血餅は形成 されたもとの位置に留まることがあり、あるいはその場所を離れて血流中を通っ て新しい部位に移動することがあり、その部位で血餅が血流の急激な遮断を生じ る。異常なフィブリン−血小板血餅によりひき起された医学的な問題の例は、静 脈及び動脈の血栓症、心臓血管中の血栓によりひき起される心臓発作並びに肺動 脈及び脳動脈の血栓塞栓症を含む、その他に、フィブリン−血小板血餅は梗塞及 び腫瘍の部位で生じると報告されており、それらの部位でフィブリインは損傷さ れた組織または腫瘍を包囲し、かくして患者の症状を更に悪化することがある（ 米国特許第４．４１８．０５２号を参照のこと）、異常なフィブリン−血小板血 餅と関連する医学上の問題の高い発生率に鑑みて、このような症状を診断するた めの技術の開発に多くの努力がなされていた。不運にも、これらの技術の多くは 、特異性または信頼性に欠けるという問題があり、一方その他の技術は試験を完 結するのに許容し得ない程長い時間を要する。更に別の方法は血栓を形成過程中 に検出するように設計されるが、既存の血餅を検出しない。

試みられた診断方法の中に酵素の如き放射標識されたタンパク質の使用があり、 これらは血餅に結合するか、あるいは血餅中に混入され、その結果生体内の放射 性同位元素の検出のための技術を用いて血餅が像映し得る。このようなタンパク 質はストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、フ ィブロキナーゼ、ストレプトキナーゼ−活性化ヒトプラスミン、フィブリン及び それらの或種のフラグメントを含む（例えば、米国特許第４．４２７．６４６号 、同第４．４１６，８６５号、同第４．４１８．０５２号及び同第４，６６３． １４６号明細書を参照のこと）、シかしながら、血餅に対する放射標識されたタ ンパク質の低い特異性または親和性、放射標識操作中のタンパク質の変性、及び タンパク質に対する放射性同位元素の不安定な結合の如き問題は或種のこれらの 提案された診断技術と関連した。かくして、生体内の異常なフィブリン−血小板 血餅の早期検出のための正確で便利な方法に対する要望が依然としである。

主皿Ω亙亡 本発明は、 （ａ）血栓溶解性タンパク質の血餅溶解活性が減少または排除されておりそして 標識がフィブリン結合性領域以外の血栓溶解性タンパク質の部分に選択的に結合 される標識された血栓溶解性タンパク質をフィブリン−血小板血餅を有すると思 われる患者に投与し、ついで （ｂ）患者中の標識された血栓溶解性タンパク質の生体内分布のパターンを検出 する段階を含んでなる、生体内のフィブリン沈着物を検出する方法を提供する。

血栓溶解性タンパク質は、プラスミンの如きタンパク質、並びにストレプトキナ ーゼ、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼの如き、プラスミノーゲン活性化因 子を含む、投与される血栓溶解性タンパク質は、減少されたプラスミノーゲン活 性化活性を有する組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡと称する）であ って、それに結合された検出可能な物質がキレートの形態の９９′″Ｔｃの如き 放射性同位元素であるｔ−ＰＡであることが好ましい。

本発明の一態様に於いて、検出可能な物質は、血餅溶解活性を担当する血栓溶解 性タンパク質の部分または血栓溶解性タンパク質のこのようなその他の部分に結 合して血栓溶解活性を減少または排除し得るリンカ−を介して血栓溶解性タンパ ク質に結合される。活性の減少は生体内のフィブリン沈着物の場所に於けるタン パク質の局在化を延長し、かっ血餅溶解活性を有するタンパク質の投与に関連す る副作用を最小にすることを助ける。

また、本発明は検出可能な物質をリンカ−を介して血栓溶解性タンパク質に結合 することを含み、リンカ−の結合がフィブリン結合性領域以外の血栓溶解性タン パク質の部分に対してなされる、標識された血栓溶解性タンパク質の製造方法を 提供する。

’Ｘ’ｔｒ＝一本発明により、結合された検出可能な物質を有するフィブリン結 合性タンパク質であって、検出可能な物質がフィブリン結合性領域以外のタンパ ク質の部分に特異的に結合されるフィブリン結合性タンパク質が提供される。詳 しくは、プラスミノーゲン活性化に応答性のｔ−ＰＡタンパク質の部分に特異的 に結合するリンカ−を介して結合された放射性同位元素を有するｔ−ＰＡが提供 される。本発明のこのｔ−ＰＡタンパク質は、（リンカ−がどれだけ多くそれに 結合されるかに応じて）プラスミノーゲン活性化活性及び無傷のフィブリン結合 性領域を減少し、または実質的に排除した。

本発明のタンパク質は血餅の如きフィブリン沈着物の生体内診断のため、及び治 療中のフィブリン沈着物の溶解を監視するため投与される。また、本発明の放射 標識されたフィブリン結合性タンパク質の調製に有用なキットが本明細書中に開 示される。

皿皿二呈垂星説亙 第１図は、動物中の血餅を像映するために放射標識されたｔ−ＰＡの注入に続い て示された時点で撮られたウサギのγカメラの像を示す。

第２図は、Ｄ−フェニルアラニン−プロリン−アルギニン−ＣＨ２１リンカ−の 合成経路を示す。

第３図は、キレート化化合物とＤ−フェニルアラニン−プロリン−アルギニン− ＣＨ２Ｃｊ２Ｈ２Ｃ−との反応を示す。

第４図は、リンカ−として有用である二つの異なるトリペプチドクロロメチルケ トン誘導体の合成を示す。

第５図は、ｔ−ＰＡに結合され得る二つの放射性ヨウ素化されたリンカ−を示す 。

第６図は、標識された血栓溶解性タンパク質を用いる頚静脈フィブリン−血小板 血餅の像を示す。

のＩ　、なＵ 本発明は、生体内のフィブリン−血小板血餅を診断し、かつ治療措置中のこのよ うな血餅の溶解を監視するための方法を提供する。その方法は、血栓溶解性タン パク質の血餅溶解性が投与前に減少され、または実質的に排除された、標識され た血栓溶解性タンパク質の投与を含む、タンパク質のフィブリン結合性は検出可 能な物質をフィブリン結合性領域以外のタンパク質の部分に選択的に結合するこ とにより保たれる。

生体内の検出可能な物質の分布を検出するための操作が使用されて心筋梗塞また は腫瘍と関連するフィブリン血小板血餅の如きフィブリン血小板血餅を局在する 。血餅溶解活性の減少または排除は、結合されたタンパク質が血餅溶解過程中に フィブリン血小板血餅から遊離される前に検出工程の完結を可能にすることに役 立つ、加えて、診断用薬として減少または排除された血餅溶解活性を有する血栓 溶解性タンパク質の使用は、医師がフィブリン血小板血餅に悩んでいないかもし れない患者に血餅溶解性酵素を投与することに関連する不必要に誘発する副作用 を避けることを可能にする。血餅の診断に続いて、血餅の完全溶解を確実にする ために、治療中の本発明の標識された血栓溶解性タンパク質の周期的な投与が用 いられて種々の治療措置を監視し得る０本発明の最も広範な用途は人間の医学的 治療に於けるものであるが、本発明は家畜の処置に同様に適用し得る。

また、本発明は検出可能な物質を血栓溶解性タンパク質の非フィブリン結合性部 分に特異的に結合し、その結果血栓溶解性タンパク質のフィブリン結合性が検出 可能な物質による標識付けにより減少されないような方法を提供する。標識され た血栓溶解性タンパク質のフィブリン結合性の減少は、血餅滞留時間が短縮され ることから、血餅像映剤としてのその有効性を減少することがある。加えて、像 上の一層大きい“バックグラウンド”は、血栓部位に局在化されない、投与され た標識タンパク質の増大された部分に帰因することがある。検出可能な物質は、 下記のリンカ−を用いてタンパク質のフィブリン結合性の領域の外部で選択的に 結合され得る。

本発明に従って投与される血栓溶解性タンパク質は、生体内のフィブリンを結合 する血栓溶解性タンパク質である。血栓溶解性タンパク質は天然産のものであっ てもよく、あるいは例えば遺伝子工学技術によりフィブリン結合性領域を含むよ うに操作されていてもよい、有利には、血栓溶解性タンパク質は、それを投与し ようとする患者中で自然に産出して、逆作用の免疫学的応答の機会を減少する。

既知の天然産フィブリン結合性タンパク質はウロキナーゼ（ＵＫＳと称する）及 び組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡと称する）の如きプラスミノー ゲン活性化因子を含むが、これらに限定されない。プラスミノーゲン活性化因子 は不活性な前駆体プラスミノーゲンのプラスミンへの転化を触媒作用する酵素で あり、プラスミンはまたフィブリンを結合しフィブリン溶解活性を有する０組織 プラスミノーゲン活性化因子はウロキナーゼよりも極めて大きいフィブリンに対 する親和性を有するものとして認識されたセワンタンパク質分解酵素であり、こ こでｔ−ＰＡの酵素活性はフィブリン沈着物の部位に局在化され、かくしてｔ− ＰＡは本発明に使用するのに一般に好ましい。或種の細胞系（例えば、ボウズ（ Ｂｏｗｅｓ　）メラノーマ細胞）からｔ−ＰＡを分離する方法が記載されており 、また組換えＤＮＡ技術によりｔ−ＦＡを生成する方法が知られている（英国特 許出願第２、１１９．８０４号明細書を参照のこと）。

タンパク質は、そのフィブリン結合性を維持しつつその血餅溶解活性を減少する ために処理される０本明細書で使用される“血餅溶解活性”という用語は、フィ ブリンの分解を直接または間接に生じ、それ故フィブリンー血小板血餅の溶解を 生じるタンパク質の生物活性を云う、　ｔ−ＰＡ酵素は血餅を直接溶解しないが 、プラスミノーゲンから血餅溶解性タンパク質プラスミンの生成を触媒作用する 。それ故、ｔ−ＰＡに関して、そのプラスミノーゲン活性化生物活性は本明細書 中に使用される“血餅溶解活性”であると考えられる。

タンパク質の血餅溶解（即ち、フィブリン分解）活性は、血栓熔解性タンパク質 が血餅部位から遊離される前に検出工程の完結を可能にするのに充分な程度に減 少される。フィブリン沈着物の部位に於ける血栓溶解性タンパク質の局在化を延 長することの他に、血餅溶解活性の減少はまたこのような活性を有するタンパク 質の投与に関連する副作用を最小にするのに役立つ。生体内のフィブリン血小板 血餅の位置を正確に検出するために、血餅溶解活性の減少が有利であることが発 見された。以下に詳述されるように、血餅溶解性タンパク質（その固有の減少さ れていない血餅溶解活性を有する）が生体内の血餅に結合する時に、フィブリン の局在化分解が始まり、これは、特にタンパク質が主として血餅の外表面に結合 される時に、もとのフィブリン血小板血餅部位からの血栓溶解性タンパク質の遊 離をもたらす、従って、タンパク質及びそれに結合された検出可能な物質の生体 内分布は漸進的に一層拡散するようになる０分散が始まる前に強い局在化信号も しくは像を与えるのに充分な量の検出可能な物質がフィブリン−血小板血餅の位 置で蓄積した時間は、はんの短間間にすぎない。それ故、医師はフィブリン−血 小板血餅がなかったと結論することがあり、また患者を更の試験に不必要にもか けることがある０本発明の方法に使用される場合、ｔ−ＰＡの酵素活性の減少ま たは排除は、ｔ−ＰＡの活性がフィブリンの存在下に激増することが知られてい ることがら、特に重要である。

血栓溶解性タンパク質の血餅溶解活性は、フィブリイン結合性が維持される限り 、如何なる好適な手段によっても減少し得る０組換えＤＮＡ技術による生成の場 合、タンパク質を暗号化するクローン化遺伝子は、例えば遺伝子中で挿入、欠失 及びその他の突然変異を生じる既知の方法により血餅溶解活性を減少するように 変性し得る０例えば、分離された遺伝子は、制限酵素消化単独に、または或種の ヌクレアーゼによる消化の如きその他の酵素処理と組合せた制限酵素消化にかけ て、血餅溶解活性に応答性のタンパク質の部分を暗号化する遺伝子断片の一部ま たは全部を切除し得る０部位特異的な突然変異誘発の如き、その他の既知の操作 が血餅溶解活性を失活するのに使用し得る（オールド（Ｏｌｄ）及びブリムロー ズ（Ｐｒｉｓｒｏｓｅ）著、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉ ｐｕｌａｔｉｏｎ　、第２編、カリフォルニア大学発行、ロスアンゼルス１６４ 頁を参照のこと）、また、タンパク質それ自体は断片化されてもよく、そのフィ ブリン結合性部分がアフィニティ・クロマトグラフィーの如き既知の技術により 精製し得る。フィブリイン結合性を維持しつつ、タンパク質の血餅溶解活性を減 少するためのタンパク質の化学処理は、また別の選択である。以下に更に詳細に 記載される本発明の一つの態様は、タンパク質を、フィブリン−血小板血餅溶解 活性に応答性のタンパク質の部分に選択的に結合する化学化合物と反応させるこ とを伴ない、ここでタンパク質のこの部分への化学化合物の結合は上記の活性を 減少する。化学化合物はタンパク質に可逆的に、または不可逆的に結合してもよ く、あるいは自己不活化抑制剤であってもよい、タンパク質を生体内に投与しよ うとする場合には、不可逆的な抑制剤（即ち、タンパク質に共有結合されるもの ）が使用されることが好ましい。

血栓溶解性タンパク質に結合される検出可能な物質は、タンパク質のフィブリン 結合性を有意に減少しないでタンパク質に安定に結合でき、患者に安全に投与で き、かつ好適な既知の手段で検出できる如何なる物質であってもよい。検出可能 な物質はタンパク質に直接結合されてもよく、あるいは後述されるような或種の 親和性リガンドを含む種々のリンカ−もしくはアダプター分子を介してタンパク 質に結合されてもよい、好適な検出可能な物質の中に、核磁気共鳴造影剤、Ｘ線 造影剤、並びにヨウ素放射性同位元素（例えばＩ３１■またはＩ！３ｊ）、イン ジウム放射性同位元素側えばｌ　Ｉ　ｌ　１ｎ）、臭素放射性同位元素（例えば ？ＳＢｒまたは？６Ｂ、）、またはフッ素放射性同位元素（例えばＩＩＩＦ）を 含むがこれらに限定されない放射性同位元素がある。これらの診断剤は外部の（ 非観血的）手段により検出可能である０本発明に使用するのに好ましい放射性同 位元素は放射性核種９軸テクネチウム（””Ｔｃ）である。９９ｍ７ｃの６時間 の半減期並びにＴカメラ走査装置とのその適合性及び殆どの病院や診療所に於け るその有用性は、９９′″Ｔｃを診断操作用に有利な放射性核種にする。

種々の放射性同位元素を用いてタンパク質を放射標識する方法は公知である。こ れらの操作はタンパク質への放射性同位元素の直接的な結合またはタンパク質の 種々の官能基と反応して放射性同位元素をタンパク質に結合する種々のキレート 化剤及びその他のリンキング化合物による結合を含む（例えば、米国特許第４． ６５２．４４０号、同第４，６５９，８３９号及び同第４．４７２．５０９号及 び英国特許出願第２．１０９，４０７号明細書を参考のこと）、シかしながら、 フィブリン結合性タンパク質への放射標識化合物の非特異的な結合は、放射性同 位元素の一部がフィブリン結合性領域に結合されることから、タンパク質のフィ ブリンに結合する能力の低下をもたらすことがある。

本発明に従って、検出可能な物質（例えば放射性同位元素）はタンパク質のフィ ブリン結合性領域の外部に選択的に結合されることが好ましい。

本発明の標識された血栓溶解性タンパク質は診断用薬剤として有用であり、かつ 治療中にフィブリン−血小板血餅の溶解を監視するのに有用である。当業者に知 られているように、特別な患者に注入される量は、フィブリンに対する特別なタ ンパク質の親和性、タンパク質に結合された検出可能な物質の性質、及び、その 物質が放射性同位元素である場合には調製物の特異的な活性の如き因子に依存す る。注入量は、患者への投与後に適当な検出装置により生体内口の物質の生体内 分布のパターンの検出に充分な量である。標識された血栓溶解性タンパク質は、 好適な生理的に許容し得る担体中で注入されてもよい、好適な担体はタンパク質 を変性しないか、もしくはさもなければ変質しないか、あるいはタンパク質を溶 液から沈殿させないものであり、かつ患者に非毒性である。

好適な担体は塩化ナトリウムまたはその他の塩、グルコース、デキストロースも しくは注入用の水を含む水性溶液、好ましくは等張水性溶液を含むが、これらに 限定されない。

本発明の標識された血栓溶解性タンパク質を患者に注入した後、検出操作は存在 し得るフィブリン−血小板血餅の部位で標識された血栓溶解性タンパク質の結合 を可能にするのにプリンに対する血栓溶解性タンパク質の特異性または親和性の 程度、検出可能な物質の性！（例えば特別な放射性同位元素の半減期）、フィブ リン−血小板血餅に結合されなくなる注入された標識血栓溶解性タンパク質が生 体から取り除かれる効率、注入部位及びタンパク質が血餅に達するまで移動しな ければならない経路等の如き、因子に依存する。一般に、血流からタンパク質の 未結合部分の実質的な取り除きを可能にするのに充分な時間が経過される０本発 明の或種の血栓溶解性タンパク質は特別な器官（例えば肝臓）により患者から取 り除かれ、生体からの除去経路は血栓溶解性タンパク質の性質により変化し得る 。生体内分布のパターンが検出される時、このような器官はフィブリン沈着物部 位として解されない。

フィブリン−血小板血餅の存在が一旦診断されると、好適な薬剤またはそれらの 混合物による治療が開始される。既知の治療薬は酵素ストレプトキナーゼ、ウロ キナーゼ、及びｔ−ＰＡ、並びにヘパリンの如き抗凝血剤を含む、これらの薬剤 は、未標識形態で、通常の操作に従って投与される。措置中に血餅の溶解を監視 するための現行法の多くは血流の部分回復と完全回復とを区別する能力に欠ける という問題がある。

本発明のタンパク質は、治療薬剤の投与と併わせて投与され、血餅が有効に溶解 された時（即ち、フィブリン沈着物が本発明の方法により最早検出されない時） を測定することができ、ついで治療が終了され得る。この様な措置操作の監視は 、従来問題であった措置の早すぎる終了の発生率を減少する。

また本発明は、血栓溶解性タンパク質のフィブリン結合の活性を保ちつつ、血栓 溶解性タンパク質を標識する方法であって、検出可能な物質をリンカ−により血 栓溶解性タンパク質に結合することを含み、リンカ−の結合がフィブリン結合性 領域以外の血栓溶解性タンパク質の部分に対してなされることを特徴とする標識 方法を提供する。この方法は、血餅溶解性領域への検出可能な物質の結合により 失活される（またはその生物活性の低下を受け易い）血餅溶解性領域を含む血栓 溶解性タンパク質に特に有利である。

結合された検出可能な物質を有する血栓溶解性タンパク質であって、その物質が 血餅溶解性領域の外部で結合され、これが別の活性、例えばフィブリン結合性に 影響せずに血餅溶解活性を減少または排除するような血栓溶解性タンパク質が、 本発明に含まれる。そのタンパク質は酵素活性及びフィブリン結合性領域の両方 を含む血栓溶解性酵素であってもよく、フィブリン結合性領域の生物活性の持続 が所望される。酵素活性に応答性である酵素の部分に特異的に結合するリンカ− が使用される。か（して、リンカ−による血栓溶解性タンパク質への検出可能な 物質の結合後に、その他の官能性領域（例えば、基質結合性領域）の活性が保た れる。

酵素活性を与える酵素の部分に結合する幾つかの化合物が知られており、本発明 に従ってリンカ−として使用でき、あるいは使用のために修飾し得る。このよう な化合物は親和性標識試薬を含むが、これらに限定されない、これらの試薬は酵 素の同定及び性格づけ並びに試験管内分析に於ける或種の酵素の失活のような目 的に使用される。一群の親和性標識試薬は、オリゴペプチドクロロメチルケトン 化合物を含み、これらは一般に２個〜約４個のアミノ酸残基を含み、しばしば特 別な酵素の基質から誘薄される。これらの化合物は酵素の活性部位に共有結合的 に（不可逆的に）結合し、それにより酵素を失活する。或種の酵素（例えばセリ ンタンパク質分解酵素、特にトリプシン状のセリンタンパク質分解酵素）を失活 するオリゴペプチドクロロメチルケトン化合物が知られている。カリクレイン、 プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ及びその他のタンパク質分解酵素のオリ ゴペプチドクロロメチルケトン失活剤が、Ｐｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ ｓｏｌｏｇｙ＋　８０巻、８２６〜８４２頁（１９８１年）及びＢｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ＋　１７巻、４７７８〜４７８４頁（１９７８年）に於いてケトナー （Ｋｅｔｔｎｅｒ）及びシャク（Ｓｈａｗ）により記載されている。これらの失 活剤及びそれらのリンカ−としての使用が、以下に更に記載される。

本発明の一態様に於いて、検出可能な物質を、フィブリン結合性領域以外の血栓 溶解性タンパク質の部分に特異的に結合するリンカ−によりタンパク質に結合す ることにより、検出可能な物質がタンパク質のフィブリン結合性を減少せずにフ ィブリン結合性領域を有する血栓溶解性タンパク質に特異的に結合される。フィ ブリン結合性ドメインは、フィブリンに結合する能力をタンパク質に与えるタン パク質の部分である。リンカ−は、一方で検出可能な物質を結合し、かつフィブ リン結合性領域から離れた部位でタンパク質に結合する如何なる好適な化合物で あってもよい。好適なリンカ−はフィブリン結合性部分以外のタンパク質の部分 と特異的に結合する種々の親和性リガンドを含むが、これらに限定されない。

例えば、検出可能な物質は血餅溶解活性に応答性のタンパク質の部分に結合され てもよく、この結合は上記の活性の低下を生じ、一方フイブリン結合に応答性の タンパク質の部分は影響を受けないまま残る。

この特異的な結合を行なう一つの方法は、オリゴペプチド誘導体リンカ−分子に より検出可能な物質をタンパク質に結合することを伴ない、ここでリンカ−は血 餅溶解活性に応答性のタンパク質の部分に特異的に結合し、それにより上記の活 性を減少する。同様に、タンパク質の全ての部分（フィブリン結合性に応答性の 部分を含む）への検出可能な物質の非特異的な結合により生じ得るフィブリン結 合性の低下は、この方法により最小にされる。このようなオリゴペプチド誘導体 リンカ−の例は、特別な酵素が自然に相互作用する特別なポリペプチド基質の部 分を模擬することにより特別な酵素を失活すると思われるものである。このよう なリンカ−の例は、“クロロメチルケトン”トリペプチド自己不活化酵素抑制剤 である。抑制剤分子のクロロメチルケトン基は、酵素の活性部位中のヒスチジン 残基をアルキル化することにより酵素を失活する。幾つかのこのような抑制剤の 一つはトリペプチド誘導体グルタミン酸−グリシン−アルギニン−クロロメチル ケトンであり、これはカルバイオケム・バイオケミカルズ（Ｃａｌｂｊｏｃｈｅ ｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、サンジエゴ市からウロキナーゼ抑制剤とし て市販されている。別のものはＤ−フェニルアラニン−Ｌ−プロリン−Ｌ−アル ギニン−クロロメチルケトンであり、これは以下に”Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−ＣＨ２Ｃｉ、”と略記され、カルバイオケムによりトロンビン抑制剤として “ブラック（ＰＲＡＣＫ）”の商品名で販売されている。このトロンビン抑制剤 は、ケトナー（Ｋｅｔｔｎｅｒ）及びシャク（Ｓｈａｗ）により記載されていた （Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　１４巻、９６９〜９７３頁を参照の こと）、また、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣＩｌはｔ−ＰＡを抑制す ることが知られていた（Ｍ、モーラ−（Ｍｏｈｌｅｒ）著、Ｔｈｒｏａ＋ｂ、　 ａｎｄ　Ｈａｅｓ。

５２巻、２号、１６０−１６４頁（１９８６年）を参照のこと）、酵素活性に応 答性のｔ−ＰＡの部分に結合する別のトリペプチド誘導体はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ａ ｒｇ−ＣＨ２−Ｃ１２である。

本発明の一態様に従って、化合物Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃ１２ま たはＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣＩｌは、プラスミンへのプラスミノーゲ ンの転化を触媒作用するのに応答性のｔ−ＰＡタンパク質の部分に放射標識され た分子（例えば、放射性核種金属を含むキレート）を特異的に結合するためのリ ンカ−として使用される。

このトリペプチドリンカ−によるｔ−ＰＡへの放射性核種キレートの結合は、タ ンパク質への放射性核種の安定な共有結合及び酵素のプラスミノーゲン活性化活 性の低下の両方をもたらし、その間フィブリン結合性が保持される。かくして、 −ｍの化学反応は二つの目標、即ちタンパク質の特異的な放射標識化及び同時の 酵素活性の低下を達成する。

本発明は、次式の化合物を提供する。

（式中、ｍは０または１であり、Ｑは放射標識された分子を表わす、） ｍがＯである場合には、トリペプチドクロロメチルケトンリンカ−はＤ−Ｐｈｅ −Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨｔＣＩｔである０ｍが１である場合には、リン カ−はＴｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＢ、Ｃ１２である。これらの化合物 が含み得る多くの放射標識された分子の中に、下記の放射性核種金属キレート及 び放射性ハロゲン化分子がある。

また、本発明により、ｔ−ＰＡに結合する上記のトリペプチド−ｃＨｔｃｌリン カ−の一つにより結合された放射標識分子を有するタンパク質ｔ−ＰＡが提供さ れる。

種々の構造の多くのキレート化化合物が知られている。ブラックまたはＴｙｒ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｔＣｌリンカ−に結合されるキレート化化合物は、リンカ −のアミノ末端と反応して結合を形成することができ、かつ放射性核種と結合を 形成して放射性核種の安定なキレートを生成し得るドナー原子を含む如何なる化 合物であってもよい、キレート化化合物は、リンカ−のフェニルアラニンもしく はチロシン残基の遊離アミノ基と反応性の一つの官能基及びキレート化化合物の 基と反応性の第二の官能基を含む三官能アダプター分子によりトリペプチドリン カ−に結合されてもよい、多（のこのようなアダプターが知られており、アダプ ターの必要性及びその選択はキレート化化合物の化学構造に依存する。

Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣ１またはその他のトリペプチドリンカ− に結合され得る多くのキレート化化合物の一つは、次式を有するキレート化化合 物である。

硫黄保護基（Ｔ）を含む（太守、“巳″１７坩性エステル蕃り表＝ｈＶ）ａＩＴ ’＋ 欧州特許出願公告第１８８．２５６号明細書に記載された、この”Ｎｚ５ｚ”キ レート化化合物はトリペプチドリンカ−の遊離アミンと反応してアミド結合を形 成する活性エステル基を含む。

以下の実施例２に記載されるように、トリペプチドリンカ−が合成され、リンカ −のＡｒｇ−Ｃ８２０１部分が結合される前に、Ｎ、Ｓ、キレート化化合物がＤ −Ｐｈｅ−Ｐｒｏジペプチドに結合されてもよい、キレート化化合物が無傷のト リペプチドと反応させられる場合には、成る比率のキレート化化合物はフェニル アラニン残基の末端ＮＨ１基と反応するよりもむしろアルギニン残基の遊離アミ ノ基と反応する（これは得られるトリペプチド誘導体のｔ−ＰＡとの相互作用を 妨害する）ことがわかった。

しかしながら、反応混合物のｐＨを（例えば約５〜７に）調節してキレート化化 合物のエステルとフェニルアラニン（アルギニンよりむしろ）残基のアミンとの 選択的な反応を促進し得る。かくして、キレート化化合物は無傷のトリペプチド と反応させ得る。

欧州特許出願第１８８．２５６号明細書及び後記の実施例に記載されるように、 キレート化化合物は、９９′″Ｔｃの如き金属放射性核種と反応させられて相当 するキレートを生成することができ、このキレート中で放射性核種金属は二つの 窒素ドナー原子及び二つの硫黄ドナー原子に対する４個の別々の共有結合により 保持される０、ついで、結合されたキレートを有するトリペプチドリンカ−がｔ −ＰＡと反応させられ、ここでリンカ−は上記のようにプラスミノーゲンの活性 化に応答性のｔ−ＰＡ酵素の部分に結合されるようになる。得られた放射標識さ れたｔ−ＰＡタンパク質は、フィブリン沈着物を診断するため、または治療措置 の進行を監視するため投与される。

幾つかのその他の放射標識された分子が、フィブリン結合性領域の外部で結合す るリンカ−によりフィブリン結合性タンパク質に結合されてもよい、硫黄ドナー 原子、窒素ドナー原子、酸素ドナー原子及びリンドナー原子の種々の組合せを含 むキレート化化合物が使用し得る。多くのこのようなキレート化化合物並びにそ れらを合成し放射標識化して金属放射性核種キレートを生成する方法が知られて いる０本発明の一態様に於いて、キレート化化合物は窒素原子及び硫黄原子から 選ばれた合計４個のドナー原子を含む。放射標識操作中に、ドナー原子と放射性 核種金属との間で結合が形成する。上記のＮ、Ｓ、キレート化化合物の他に、３ 個の窒素ドナー原子及び１個の硫黄ドナー原子を含む化合物が使用し得る。この ような“Ｎ、Ｓ”化合物の例は、次式の化合物を含む。

（式中、Ｔはそれが結合される硫黄ドナー原子と一緒になってチオアセクール基 またはへミチオアセタール基を形成する基の如き硫黄保護基であり、 各Ｒは独立にＨｔまたは＝０を表わし、各Ｒ′は独立に水素、システィン以外の アミノ酸の非アルキル側鎖、アルキル、一対のジアルキル、及び（ＣＨ，）、− Ｚからなる群から選ばれた置換基を表わし、 Ｚは−ＣＯＯＨまたはリンカ−と反応してキレート化化合物をリンカ−に結合す る官能基を表わし、 ｍは、せいぜい一つのｍが１を表わすことを条件として０または１を表わし、 ｎは１〜約４の整数であり、かつ ＲＩＩは水素、−（Ｃ１１，）　、、−Ｚ、または置換された１個以上の極性基 を有するアルキル基である） 上記の化合物は少なくとも１個の−（ＣＨ，）、、−Ｚ置換基を含む。

本発明のこのＮ、Ｓキレート化化合物の放射標識化は、次式の放射性核種金属キ レートを生成する。

（式中、Ｍは放射性核種金属またはその酸化物を表わし、かつその他の記号は上 記のとおりである）種々のＮ３Ｓキレート化化合物を合成する方法は知られてい る０例えば、欧州特許出願公告第１７３．４２４号を参照のこと。

その他のキレート化化合物は、ドナー原子の異なる組合せをもち得る。このよう な化合物は、中でもＮ、Ｓ、キレート化化合物、Ｎ、Ｓ、キレート化化合物、及 びＮ、Ｓ、キレート化化合物を含む、その他、上記のＮ、Ｓｔ化合物及びＮ、Ｓ 化合物は種々の数本発明に従ってフィブリン結合性タンパク質に結合され得る放 射標識分子のその他の例は放射性ハロゲン化分子を含む。

診断像映に有用な放射性ハロゲンは患者をＴ−カメラで走査することによる像映 のための１２３７及び陽電子断層撮影像映のためのｘ＊Ｆ、　ｆｆ５Ｂｒまたは ”７　ｂＢｒを含むが、これらに限定されない。

フェニル環のメタ位またはパラ位で放射性ハロゲンを結合する分子の例が、欧州 特許出願公告第２０３．７６４号に記載されている。これらの化合物は次式によ り表わし得る。

”Ｘ−Ａｒ−Ｒ （式中、Ｘはヨウ素、臭素、フッ素またはアスクチンの放射性同位元素であり、 Ａｒは芳香族環またはへテロ芳香族環であり、Ｒは環のヒドロキシ置換またはア ミノ置換により生成されるような親電子性置換に対してＡｒを活性化しない１〜 １２個の直鎖の炭素原子を含む置換基である） 結合または置換基は、リンカ−と反応して放射性ハロゲン化分子を結合するのに 適した官能基である接合基をそれらに結合した。′Ｉ−パラーヨードフェニル化 合物（′″Ｉはヨウ素の放射性同位元素を表わす）は、欧州特許第２０３．７６ ４号に記載された操作を用いて調製されてもよく、これらの操作は一般にハロ芳 香族化合物に有機金属基５ｎ（ｎ−Ｂｕ）ｓまたはＳｒＭｅｓを置換することを 伴なう。ついでハロゲンの放射性同位元素がハロ脱金属化（ｈａｌｏｄｅｍｅｔ ａｌｉｚａｔｉｏｎ）により有機金属基に代えて置換される。このような操作を 用いて調製し得る放射性ハロゲン化分子の例は次式により表わされる。

（式中、ｎは０〜３の整数を表わし、Ｚは接合基を表わし、かつ１Ｘはハロゲン の放射性同位元素を表わす）本発明の一態様に於いて、接合基はフィブリン結合 性タンパク質のフィブリン結合性領域の外部で結合するリンカ−１例えばｔ−Ｐ Ａに結合する（そしてｔ−ＰＡを抑制する）トリペプチドクロロメチルケトンリ ンカ−と反応する基である。接合基はリンカ−の−級アミンと反応してアミド結 合を形成する活性エステルであってもよい、多（の好適なエステルの中に２゜３ ．５．６−チトラフルオロフエニルエステル、チオフェニルエステル及びＮ−ヒ ドロキシスクシンイミジルエステルがある。かくして、上記の放射性ハロゲン化 分子は、上記のトリペプチド誘導体リンカ−によりフィブリン結合性領域の外部 でｔ−ＰＡに結合され得る。

また、フィブリン結合性タンパク質はポルトン−フンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕ ｎｔｅｒ）試薬、即ちＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル） プロピオネートまたはその水溶性誘導体を用いて放射性ヨウ素化されてもよい、 これらの試薬を放射性ヨウ素化する方法（ここで放射性同位元素は芳香族環のヒ ドロキシルに対してオルト位で置換される）が知られている０例えばポルトン及 びフンター著、Ｂｉｏｃｈｅａ、Ｊ、　１３３巻、５２９〜５３９頁（１９７３ 年）並びにｔｈｅ　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｃａｌＣｏａ＋ｐａｎｙ　１９ ８８　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃａｔａｌｏｇ　２９５頁 を参照のこと、得られる放射性ヨウ素化分子は次式により表わされる。

Ｎ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート スルホスクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（水 溶性） （式中、１１はヨウ素の放射性同位元素を表わし、ｍは０または１（少なくとも 一つのｍは１である）である）付加的なメチレン基が芳香族環とエステル基との 間に挿入されてもよい。

本発明の−Ｂ様に従って、放射性ヨウ素化ポルトン−フンター試薬のスクシンイ ミジルエステル基が、フィブリン結合性タンパク質のフィブリン結合性領域の外 部で結合するリンカ−の遊離アミン基と反応させられる。放射性ヨウ素化試薬は 、例えば上記のトリペプチドクロロメチルケトンリンカ−の一つによりｔ−ＰＡ に結合されてもよい。

本発明の別の態様に於いて、放射性ハロゲンがトリペプチドリンカ−に直接結合 されてもよい、放射性ハロゲンは、トリペプチドリンカ−中のフェニルアラニン 残基またはチロシン残基の芳香族環に置換されてもよい、このような放射性ハロ ゲン化リンカ−を生成する操作は、後記の実施例４及び５に示された操作を含む 。

特別なタンパク質の血餅溶解活性が減少される程度は、タンパク質に結合される 特異的なリンカ−化合物（例えば、トリペプチドリンカ−）に関係する。酵素活 性を更に減少することが所望される場合には、付加的な標識された（例えば放射 性同位元素で標識されたリンカ−化合物または未標識リンカ−化合物がタンベク 質と反応させられてもよい。

成る場合には、ｔ−ＰＡタンパク質のプラスミノーゲン活性化活性の全てを完全 に破壊することを避けることが望ましいことがある。低レベルの残留の酵素活性 は、血餅の外表面のみと対照的に血餅の内部で放射標識されたｔ−ｐ＾の結合を 可能にするのに充分に血餅を“オーブン・アップ（ｏｐｅｎ　ｕｐ）″するのに 役立つことがある。改良された像が生じ得る。

本発明の−Ｍ、様に於いて、本発明の放射標識されたフィブリン結合性タンパク 質を調製するのに使用するためのキットが提供される。このようなキットの例は ｔ−陥を含む第一バイアルを含むキットである。第二バイアルは、下記の三つの 試薬を含む凍結乾燥製剤を含む。

（ａ　）　ＮｚＳ、−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣｚ　（前記のＤ− Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ，Ｃ／！リンカ−に結合されたＮｚ５ｚキレ一ト 化化合物を含む分子。そのリンカ−は後記の実施例２に記載されたようにして合 成される。） （ｂ）ペルテクネテート（”’Ｔｃ０ａ−、これは＋７の酸化水準にある）を中 性〜酸性のｐＨで一層低い酸化状態に還元するのに有効な還元剤（その結果テク ネチウム交換錯体が生成され得る）。多くの好適な還元剤が知られており、第一 スズイオン（例えば、塩化第一スズまたはフン化第−スズの如き第一スズ塩の形 態の第一スズイオン）、金属スズ、ホルムアミジンスルフィン酸、塩化第一鉄、 硫酸第一鉄、アスコルビン酸第−鉄及びホウ水素化物のアルカリ塩を含むがこれ らに限定されない、好ましい還元剤は第一スズ塩である。

（Ｃ）還元された９９′″Ｔｃが交換錯体を生成し、かくして９９・Ｔｃｔ加水 分解から保護する交換剤、この錯体から９９′″Ｔｃの有効な移動または交換を 得るために、交換剤はキレート化剤よりも一層弱く放射性核種を結合することが 有利である。使用し得る交換剤は、グルコン酸、グルコヘプトン酸、メチレンジ ホスホネート、グリセリン酸、グリコール酸、マンニトール、修酸、マロン酸、 コハク酸、ビシン、Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン 、クエン酸、アスコルビン酸、及びゲンチシン酸を含むがこれらに限定されない 。

交換剤としてグルコン酸またはグルコヘプトン酸を用いて良好な結果が得られる 。

ペルテクネテートは水性溶液中で第二バイアルの内容物と合せられる。ペルテク ネテートは還元され、交換剤により結合され、ついでＮ、Ｓ、キレート化剤に移 されて安定なキレートを生成する。得られる”　”ＴｃＮｚＳｔ−Ｄ−Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｔＣｊ！は、生理的に許容し得る条件（即ち、ｔ−ＰＡを 変性しない反応条件）下でｔ−ＰＡと反応させられて本発明の放射標識されたｔ −ＰＡを生成する。

塩化第一スズ還元剤がグルコン酸交換剤と合わされてグルコン酸第−スズ錯体を 生成してもよ（、この錯体はそれ故成分（ｂ）及び（Ｃ）として作用する。一般 に下記の実施例２に記載されるようなキットを用いて９９＠７ｃで放射標識され たｔ−ＰＡが調製される。

キットは、必要により種々の緩衝剤、放射標識化操作中に使用される付加的な試 験、安定剤またはその他のこのような化合物を含む付加的なバイアルを含んでも よい、キットを用いて放射ｍｓされたタンパク質を調製する操作は、無菌条件下 で行なわれる。

以下の実施例は本発明の或種の態様を説明するために示されるものであり、特許 請求の範囲を限定することを意図したものではない。

亥１」１− Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　−ＣＩ　Ｃ１’ンカー　し、また　しない、９９　 ＠　７ｃ　Ｎｓキレート−ｔ−ＰＡ　人　の量凍結乾燥ｔ−ＰＡのバイアルを、 無菌水を用いて再形成して約５■／ｄとした。緩衝剤をゲル濾過により０．２５ ＭのＮａＰｉ　ｒｏ、３Ｍのグアニジン、ｐＨ７，５に交換した。グアニジンを 添加してｔ−ＰＡを溶液中に保つ０次式を有する２、３．５．６−チトラフルオ ロフエニル活性エステルを含む予備生成されたＮ！Ｓ！キレートを用いて標識化 を行なった。

反応混合物は、 １　）　Ｔｃ−９９ｍキレートをバイアル中に乾燥し、２）　ｔ−ＰＡ　（３ｍ ｇ）　１．５ｄを添加し、３）ＩＭのグアニジン０．４５ｗ１（ｐＨ７）を添加 し、４）０．５ＭのＮａＰｉ　１．　Ｏｒｎｉ　（ｐＨ１０）を添加することに よりつ（られた。

３７°Ｃで３０分後、反応物を適当な緩衝剤中で平衡にされたセファデックス（ Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５カラムにかけた。精製された標１ｔ−ＰＡを含む 両分（フロー−スルー（ｆ　１ｏｅｖ−ｔｈｒｏｕｇｈ）　）を集め、ＴＬＣで 特性決定した。

この反応混合物中の或種の変化並びに対照の調製及び得られた結果は、以下のと おりであった。

調製＃１ ３■ｔ−ＰＡ ２６．７ｍＣ１キレート ｐＨ１ｏ、３７°Ｃ１３０分 反応ＴＬＣ５４，５％ 生成物：　１０．７■Ｃｉ、　２．６７ｍＣ１／　ｔｎｇ、　ＴＬＣ−９９，４ ％収　率：放射性化合物（未修正）４０％、タンパク質１００％ フィブリン結合性：１■／ｄのフィブリノーゲンで３７．９％調製＃２ １．５■の抗体のＦａｂフラグメント ４．２２躊Ｃｉ　キレート ｐＨ１ｏ、３７°Ｃ１１０分 反応ＴＬＣ５３，４％ 生成物：　２．５９＋ｗＣｉ、　１．５７ｍＣ１／■、　ＴＬＣ−９９，４％収 　率：放射性化合物（未修正）　５９．７％、タンパク質９３％ 調製＃３ ｔ−ＰＡに結合されたブラック（ＰＲＡＣＫ）　０．９■１１．８ｍＣ１キレー ト ｐＨ０，３７°Ｃ，１５分 反応ＴＬＣ行なわず 生成物：　３．２５ｍＣ１，２−８２−８ｌ／■、　ＴＬＣ−９９，２％収　率 ：放射性化合物（未修正）　２７．５％、タンパク質６６．５％ フィブリン結合性：１．０■／ｄのフィブリノーゲンで５６．２％ 調製＃４ ４．０■ｔ−ＰＡ ４０ｓＣｉ　キレート ｐＨｌ０１３７℃、３０分 反応ＴＬＣ行なわず 生成物：　１４．６３ｓ＋Ｃｉ、　３．３１腸Ｃｉ／■、　ＴＬＣ−９９，１％ 収　率：放射性化合物（未修正）　３６．５％、タンパク質９８％ フィブリン結合性：１．０■／ｄのフィブリノーゲンで４５．０％ 調製＃５ １．２■ｔ−ＰＡ １７．８＋ｓＣｉキレート ｐＨ９、室温、１５分、リシンによる処理反応ＴＬＣ５０，５％ 生成物：　３．５＋ａＣｉ、　２．２２ｍＣ１／ｍｇ、　ＴＬＣ−９８，４％収 　率：放射性化合物（未修正）　１９．７％タンパク質１００％ フィブリン結合性：１．０■／−のフィブリノーゲンで６６．８％ 調製＃６ ｔ−ＰＡに結合されたブラック０．２■２１．８ｍＣ１キレート ｐＨ９、室温、２５分、リジンによる処理反応ＴＬＣ４７％ 生成物：　１．３４ｓＣｉ、　６．２８ｍＣ１／■、　ＴＬＣ−９８，０％収　 率：放射性化合物（未修正）６％ タンパク質９３％ フィブリン結合性：１．０■／ｄのフィブリノーゲンで６５．５％ 調製＃７ ｔ−ＰＡに結合されたブラック１．０■４１ｍＣ１キレート ｐＨ９、室温、３０分、リシンによる処理反応ＴＬＣ行なわず 生成物：　９．９６ｍＣ１，８，１５ｍＣ１／■、　ＴＬＣ−９８，７％収　率 ：放射性化合物（未修正）２４％、タンパク質４９％ フィブリン結合性：１．０■／ｄのフィブリノーゲンで６５．２％ 得られた製剤を、頚静脈中に人工誘発された血餅を有するウサギに投与した。製 剤を血餅に近い耳静脈に注射した。特にことわらない限り、全ての製剤を生理的 に許容し得る溶液中に希釈し合計容ｔ８ｍｌとし、ウサギに１０分で注入した。

ウサギＢ１注入１ 調製＃３．２．７ｍＣ１、０，９７■ブラックｔ−ＰＡウサギＢ、注入２ 調製＃　１．３．７２ｍＣ１、１，８■ｔ−ＰＡウサギＣ１注入１ 調製＃４．４．３　ｍｃｉ　、　１−３１１１ｇ　ｔ−ｐａウサギＣ１注入２ 調製＃４．４．０ｍＣ１、１，３■ｔ−ＰＡウサギＤ、注入１ 調製＃５．２．１２ｍＣ１、０，９■ｔ−ＰＡウサギＤ２注入２ 調製＃６．０．９５＋ｅＣｉ　、　０．１５■ブラックｔ−ＰＡウサギＤ、注入 ３ 調製＃５．０．８２ｍＣ１、０，４５■ｔ−ＰＡ経路は反対の耳である。

ウサギＦ、注入１ 冷ｔ−ＰＡ　１■ ウサギＦ、注入２ 調製＃７．１．６１望Ｃｉ　、　０．２６■ブラックｔ−ＰＡ。

注射後の様々な時点においてガンマカメラを用いてウサギをスキャンし血餅を像 化した。第１図は、＃１注射後指示された時点でウサギＣに行われた４つのスキ ャンを示す：注射直後並びに注射の５．１０および１５分後。注射の部位は細い 矢印で示され、゛そして血餅部位は太い矢印で示されている。理解できるように 、血餅の像は５分および１０分の時点で最も暗く、そしてわずか注射１５分後に はずっと薄くなった。この動物に調製物＃４を注射した。この調製物においては Ｎ、Ｓ、キレートを、該キレート上のエステル基とｔ−ＰＡタンパク質のりジン 残基上の遊離アミノ基との反応により、直接ｔ−ＰＡタンパク質に結合した（す なわちＰＰＡＣＫリンカ−なし）。ｔ−ＰＡが酵素活性を維持しているので、血 餅の溶解の間に金塊表面から放射能ラベル化ｔ−ＰＡが遊離されるため、像はか なり速く薄くなると思われる。

像化を行い得る間の時間の長さを延長する試みにおいて、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−ＣＨｚＣｉ！　（ＰＰＡＣＫ）リンカ−をｔ−ＰＡに結合させてそれの 酵素活性を不活性化した。得られたＰＰＡＣＫ−ｔ−ＰＡを””ＴｃＮ１５ｚキ レートと反応させ、ＰＰＡＣＫリンカ−を含む放射能ラベル化タンパク質接合体 を形成せしめた。この接合体を前に示したようにウサギＢ（注射＃１）、Ｄ　（ 注射＃２）およびＦ（注射＃３）に注射した。ＤおよびＦについてのスキャンは 、延長された時間の間局在化された血餅の像を示した（分単位よりもむしろ時間 単位で測定）が、一方Ｂについてのスキャンはあまり良い像を与えなかった。理 論上では結合することを期待しないが、注射＃１としての活性ｔ−ＰＡ（Ｆにつ いては非ラベル化ｔ−ＰＡそしてＩについては９９′″ＴＣＮｚＳｔ　７ベル化 ｔ−ＰＡ）の投与は、血餅の外面上だけに該診断薬の結合を限定するよりもむし ろ、金塊をわずかに“切開”し、””ＴｃＮｚ５．−ＰＰＡＣＫ−ｔ−ＰＡ診断 薬に更なる結合部位を提供すると思われる。

像化のための延長された時間の長さは、ＰＰＡＣＫをｔ−ＰＡに結合し、その酵 素活性を阻害することにより達せられたが、全ての調製物において減少されたフ ィブリン結合に問題が残った。これは、フィブリン結合部分を含む該タンパク質 の各部分における遊離アミノ基へのＮ、Ｓ、キレートの共有結合に起因すると思 われる。従って、幾つかの調製物においてｔ−ＰＡ上にＰＰＡＣＫが存在したと しても、ｔ−ＰＡと該キレートの結合は非特異的で、即ち、ＰＰＡＣＫリンカ− を介した結合に限定されない。

ｔ−ＰＡの非−フィブリン結合部位への放射性核種の特異的結合を達成させよう として、その酵素活性を減少させたまま、ｔ−ＰＡへの結合前にＰＰＡＣＫリン カ−とＮｚ５ｚキレートを連結する方法を開発した。これらの方法を例２に記載 する。

肛 ””ＴｃＮ　Ｓ　−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　−ＣＨＣＩ！、−ｔ−ＰＡ　” 　の骨。制の゛わ亙■方抜 次のようにしてＮｚＳｔ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｔＣｌ　ｚ分子を 化学的に合成し、そして９９６Ｔｃで放射能ラベル化し、次いでｔ−ＰＡと接合 される。

１：じ（ト先ン躊フヒ１ヨ四：ＪヒニＺ正士Ｊご乙ｉ三７−１と二１０１ンーメ チルエスール　３　の量。

１ｇ（６ミリモル）のし−プロリン−メチルエステルＨＣｆ（Ａｌｄｒｉｃｈ） を１５ｄのＣＨ，Ｃｆ、に添加した０次に８６６Ｊｌ！（１当量）のトリエチル アミン（ＴＥＡ　）を添加し、続いて１．６ｇ（１当量）のｔ　−Ｂｏｃ　−Ｄ −フェニルアラニン（Ｂａｃｈｅｍ）および１．６ｇ（１，３当量）のジシクロ へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ。

Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。反応液を室温で３．５時間撹拌した。

ＴＬＣ（ＣＨｓＣＮ：ＨｚＯ：Ａｃ０Ｈ１９４：　５　：　１、ニンヒドリン染 色）は少量の出発物質およびＲｆｏ、９５に主たる新しい生成物を示した。

ジシクロウレア（ＤＣＵ　）を濾過により除去し、そしてｃｏ、ｃｚ□で洗浄し た。有機性濾液を０．　ＩＮ　ＨＣｌ１．５％ＮａＨＣＯｓおよびｎｔｏでそれ ぞれ洗浄した。ｃｎ、ｃｚ、層をＭｇ５Ｏａ上で乾燥し、濾過し、そして減圧下 で蒸発させるとオイルを得る。このオイルをシリカゲルカラム（３５ＣＩＩ　Ｘ 　２　ｃｔａ　）に適用し、そしてＥｔＯＡｃ　：　Ｈｅｘ（４：　６　）で溶 出させた。同一溶媒およびＫＭｎＯ４染色を使ったＴＬＣによりフラクションを モニターした。最初のフラクション（Ｒｆｏ、９）は非極性の不純物を含んでい た０次のフラクションは所望の化合物（ＲｆＯ，４）を含み、これを集め、そし て蒸発させると１．５４ｇ　（７０％）の透明な粘着性オイルを得た。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｆｓ）　７．２（ｓ、５Ｂ、Ｃ，Ｈｓ）、　３．７（ｓ、３ Ｈ，０Ｃｔｈ）、　１．９（ｍ＋４Ｂ＋（ＣＢｚ）ｚ）、１．４（ｓ、９Ｈ，ｃ （ＣＢりｚ）。

Ｄ−フェニルアラニン−プロリン−メチルエステル　４９」１１ １．５４ｇ（４ミリモル）のｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅ　（３ ）に３５ｄのトリフルオロ酢酸を添加した。浴を室温まで序々に上げながら、こ の溶液を０℃（）１．０／氷）にて１時間撹拌した。

ＫＭｎ（Ｌ染色を使ったＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、４　：　６）は、出発物 質の完全な消失を示した。　Ｔ　Ｌ　Ｃ（ＣＨ３ＣＮ　：　ＨｚＯ：　ＡｃＯＨ ，９４：５：１、ニンヒドリン染色）は１つの生成物（Ｒｆｏ、７）を示した。

ＴＥＡ′４！：減圧下で除去した。残渣をジエチルエーテルで粉砕しそして濾過 し、１．３ｇの白色結晶固体を得た（収率８１％）。

’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｊ！ｓ）　８．２（ｂｒ、ＩＨ，ＮＨｚ）、　７．２（Ｓ、 ５Ｈ，Ｃ＆ｌｌ５）、　３．７（Ｓ。

３Ｈ，０ＣＲ３）、１．７（Ｉｔ、４Ｂ、　（ＣＨｚ）ｚ）−スクシンイミジル −４，５−ビス−Ｓ−１−エトキシエチルメルカプト　アセトアミドペン　フェ ート　５　の與製り 化合物ｉは、（ｌ−エトキシ）エチル硫黄保護基およびスクシンイミジルエステ ル基を含んで成るＮｔＳｚキレート化合物である。そのようなキレート化合物の 合成、および相当するキレートを形成させるための９９＋＋＋７ｃによるそれの 放射能ラベル化は、欧州特許出願公開第１８８．２５６号、並びに共に１９８７ 年６月１９日に出願された同時係属出＠Ｕ、Ｓ、第０６５．０１１および０６５ 、０１７号中に記載されている。

１　ｇ　（２，３６ミリモル）の４．５−ビス（ｓ−（Ｓ−１−エトキシ）エチ ルメルカプト〕アセトアミドペンタン酸（ビスーＥＯＥ−カルボン酸）を１０． ０ｄの無水ＴＨＦに溶解した。

０．２９８ｇ　（２−５９ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドを添加 し、次に０．５８４ｇ　（２，８３ミリモル）のジシクロへキシルカルボジイミ ドを添加した０反応液を室温で一晩撹拌した。

Ｔ　Ｌ　Ｃ（９６：　４　、　ＥｔＯＡｃ　：　ＨＯＡｃ、　ｐ−アニスアルデ ヒド染色）分析は、ビスーＥＯＥ−カルボン酸（Ｒｆ＝０．５）の消失および新 しい生成物（Ｒｆ　＝０．６５）の生成を示した。

ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ　）を濾過により除去し、そして塩化メチレンで 洗浄した。溶媒を真空中で濾液から除去してオイルを残した。この粗生成物をＥ ｔＯＡｃ　：　ＨＯＡｃ　（９６：　４　）におけるフラッシュクロマトグラフ ィー（ＳｉＯ□＋　２ｃｍＸ４５（＠）により精製した。　０．６５のＲｆを有 する生成物を含有するフラクションを合わせ、そして蒸発させた。ジエチルエー テル粉砕および濾過により収率７９％で吸温性の白色固体を得た。

’ｔｌ　Ｎ？ＩＲ（ＤＣ（／！３）　：δ７．２５（蒙、２Ｈ，ＮＢＸ　２）、 　４．７５（ｇ、２ｔ１．ＳＣ■×２　）　３．３　（ｓ、４Ｈ，ｓｃＨｇＸ　 ２）、　２．８５（ｓ、４Ｈ，ＮＨＳ（ＣＬ）ｚ）、　１．５５（ｄ。

６Ｈ，ＣＨ３ＣＨＸ　２）、１．２（ｔ、６）１．ＣＨｓＣＢｚＸ　２　）。

４．５−ビス−Ｓ−１−エトキシ　エチルメルカプトアセトアミドペン　ノイル −Ｄ−フェニルアーニルーＬ−プロリルーメチルエスール　６　の舌。制８４９ ■（２，１８ミリモル）のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅ　（４）に５１ｄの無水Ｄ ＭＦを添加した。３１４ｉ！１のトリエチルアミン（１当量）を添加し、続いて １．１３ｇ（１当量）のビス−エトキシ−カルボン酸ＮＨＳエステル（５）を添 加した０反応液を一晩撹拌した。

Ｔ　Ｌ　Ｃ（ＥｔＯＡｃ　：　ＡｃＯＨ、９６：　４、ｐ−アニスアルデヒド） は、前記ＮＨＳエステル（Ｒｆｏ、９）の消失および新しい生成物（ＲｆＯ，８ ）の出現を示した。ＤＭＦを減圧下で除去し、そして残渣をＥｔＯＡｃ中に取り 出した。　ＥｔＯＡｃをＯ，ＩＮ　ＦＩＣｊｌ！　。

５％Ｎａ１ｔｌＣＯｓで１回、およびＨ，０で２回洗浄した。有機相をＭｇ５Ｏ ａ上で乾燥し、濾過し、次いで蒸発させて１．１ｇ（６３％）のオイルを得た。

シリカゲルカラム（４５Ｃ１１Ｘ２Ｃ１１）を使ったフラッシュクロマドグラフ ィーにより、このオイルを精製した。　ＥｔＯＡｃ　：　Ａｃ０）１（９６：４ 、ｐ−アニスアルデヒド染色）を使って所望の化合物を溶出させた。生成物を含 むフラクションをあっめ、６００■（３５％）の透明オイルを得た。

’ＨＮＭＲ（ＤＣＣｌ　３）　３００ＭＨｚ　６７．１５（ｍ、５Ｈ１Ｃａｎｓ ）（ｓ、３Ｈ，０ＣＲｓ）１．５（ＩＩ、６Ｈ，１ｓｃＨＸ　２）　１．１８（ ｍ、６Ｈ，ＣＨｚＣ１’ｌｔ）　−４５−ビス−Ｓ−１−エトキシ　エチルメル カプトアセトアミドベン　ノイル−Ｄ−フェニルアーニルーし一プロ３ン　７　 のテ ロ００■（０，７５ミリモル）のビス−エトキシ−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−Ｍｅ（ ６）に５ｄのＭｅＯＨを添加した。０．７５ｄ　（１当量）のｌＮＮａＯＨを添 加すると溶液が濁った。１時間後、Ｔ　Ｌ　Ｃ（ＣＨｚＣＮ　：　ＨｚＯ：Ａｃ ＯＨ，９４：　５　：　１）により多量の出発物質と共にＲｆｏ、２の所に新し い生成物が現れた。反応を一晩続けた。ＴＬＣは同じ出発物質がまだ存在するこ とを示した。　３５０ｉ１１（０，５当量）のｌＮＮａＯＨを添加した。２時間 後、新しい生成物がＴＬＣによる主要スポットとみなされた。

溶媒を除去し白色の残渣を残した。この残渣をＥｔＯＡｃ中に取り出し、そして １　）’ｌ　ＡｃＯＨで２回およびＬｏで２回洗浄した。

次いで有機相をＭｇ５Ｏ，上で乾燥し、濾過し、そして蒸発すると４８４■（８ ２％）の粘着性白色固体が残った。

この化合物を、シリカゲル（２５ＣＩＩ　Ｘ　１．５　ＣＩ　）および溶出溶媒 として使ったフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物がカ ラムから出はじめたらすぐに、溶媒の比を９２：６：２に変更し、そしてＴＬＣ により溶出液中にわずかな化合物しかなくなるまで溶出を続けた。全溶媒を除去 し、そして高真空下で最終生成物を乾燥した。収量：４６０■Ｘ２）、１．６（ ｄ、６１．ＣＨ２Ｃｌ）、１．２（ｔ、６Ｈ，Ｃｆｉ、Ｃｌり　。

ビス−エトキシ−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　（７）　（０，１ｇ　、　０．２６ミリモ ル）を１．２ｄのＴＨＦ中でＮ−メチルモルホリン（０，０２８ｍ、０．２６ミ リモル）と−２０℃で１０分間反応させた。イソブチルクロロホルメート（０， ０３５ｄ、０．２６ミリモル）を含む冷ＴＨＦ　（５ｄ）を混合無水調製物に添 加し、そしてその混合物を、１．２ｍの冷ＤＭＦ中に溶解されたＢ−Ａｒｇ（Ｎ Ｏ，）ＣＨｚＣ１−ＩＣｌ　（８）　（０，０７３ｇ、０．２６ミリモル）に添 加した［ｅｔｔｎｅｒおよびＳｈａｗ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１７（２２）　：　４７８０（１９７８）　）　、反応液を一２０℃にて１時間 および室温にて２時間撹拌し、次いで濾過した。濾液を薫発乾固し、そして残渣 をＩｄのメタノールに溶解した。この溶液を酢酸エチルで２４ｄに希釈し、次い でＯ，ＩＮ　ＨＣｆ　、　５％ＮａＨＣＯａおよび飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し た。有機相を無水Ｎａ、ＳＯ，上で乾燥し減圧：ａ縮して（９）を得た。

ニトロ−アルギニン？ｒ”４体（９）をＡｃＯＨ中に取り出し、そしてＦｒｅｉ ｄｉｎｇｅｒら、Ｊ、Ｏｒ　、Ｃｈｅｍ、　４３　：　４８００（１９７８）に 記載のようにして、２０％水性ＴｉＣ１１，３および４Ｍ水性酢酸アンモニウム から作成した新しく調製したＴｉＣｊ！＊の緩衝化溶液によりＮｚ下で処理した 。　Ｃ１ｅｒｔｃｉら、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、　２８　：　１５４７（１９８７） により記載されたように、クロロメチルケトン基がＴ１Ｃｆ！ｓの存在下で還元 される性質のため、酢酸アンモニウムのｐＨをＡｃＯＨを使って下げ、ニトロ基 の還元を最大にしそしてクロロメチルケトンの還元を最少にする。

生じたＮｚＳｚ−Ｄ−Ｐｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＣＢｚＣｊ！　）分子（即ち化 合物Ｕ）を次のようにして９”Ｔｃで放射能ラベル化し、相当する９９′″Ｔｃ Ｎ２５．キレートを含んで成る次の式の化合物を形成せしめる。

ＣＨ，ＣＯＯ” ■ ｌ−の注射用無菌水を、グルコン酸第−スズ錯体（５０■のグルコン酸ナトリウ ムと１．２■の塩化第一スズ、乾燥固体形においてＭｅｒｃｋ　Ｆｒｏｓｓｔ＋ 　Ｃａｎａｄａから入手可能）を含む無菌バイアルに添加し、そして内容物が溶 解するまでバイアルを穏やかに撹拌した。無菌のインスリン注射器を使って、得 られたグルコン酸第−スズ溶液０．１　ｄを空の無菌バイアルに注入した。過テ クネチウム酸ナトリウム（０，７５ａｅ、　７５−７５−１Ｏ０゜ＤｕＰｏｎｔ 、　Ｍｅｄｉｐｈｙｓｉｃｓ、　ＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔからまたはＥ、Ｒ， ５ｑｕｉｂｂから購入した”Ｍｏ／　”Ｔｃ発生器から溶出）を添加し、そして そのバイアルを穏やかに撹拌して内容物を混合し、次いで室温で１０分間インキ ュベートし、９９′″Ｔｃ−グルコネート錯体を形成せしめた。この錯体は、Ｎ ｚ５ｚキレ一ト化合物に交換するまで９９ｓ７ｃ放射性核種が一時的に結合して いる、中間体または“交換錯体”である。

前に調製した乾燥固体形態の化合初刊を含むバイアルに０．８７−の１００％イ ソプロピルアルコールを添加した。このバイアルを穏やかに振とうし、該化合物 を熔解した０次に、この溶液０．５８〆を、０．１６ｄの氷酢酸１０．１Ｎ　Ｈ Ｃｊｌ！　（２：１４）を含むバイアルに移し、そしてバイアルを穏やかに撹拌 した。この酸性にされた溶液のうち０．５−を、前に調製した？？＋５７ｃｍク ルコネート錯体を含むバイアルに移した。穏やかに撹拌して混合した後、このバ イアルを７５℃±２°Ｃの湯浴中で１５分間インキュベートし、次いですぐに０ ℃の水浴に２分間移して反応を止めた。こうして（１１）を形成せしめた。

９９′″ＴｃＮ２ＳｚＴｃＮ２５ｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　Ｉｌ化合物（ 旦）を緩衝化溶液中ｔ−ＰＡと一緒にし、次のようにして放射能ラベル化ｔ−Ｐ Ａ複合体を生成させた。

５ＩｄのＨｚＯを５０ｄｇバイアルのＡｃｔｉｖａｓｅに添加し、そして室温で ２０分間放置しておいた。このタンパク質溶液を、０．２Ｍアルギニン、０．０ １Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ７，２）を含む緩衝液にゲル濾過カラムを用いて交換した 。９′″ＴＣ−Ｎ！Ｓｔ−ラベル化用混合物に１．０　Ｍ　）リス塩基を添加し 、混合物のｐＨを７．７に調整した。このラベル化用混合物およびｔ−ＰＡ温溶 液１＝１のモル比で合わせ、そして３７°Ｃで１０分間インキュベートした。（ この最終混合物のｐＨは７．２より低くなく且つ８．２より高くなくすべきであ る。）残りのｔ−ＰＡ活性を、数倍モル過剰のＰＰＡＣＫの添加により除去した 。次いで該タンパク質を、取り込まれなかった””ＴＣＩ　ＰＰＡＣＫおよび” ”Ｔｃ−Ｎｚ５ｚＰＰＡＣＫをも除去するゲル濾過カラム上で脱塩した。二〇カ ラムを０．２Ｍアルギニン、１０＋ａＭリン酸Ｎａ（ｐＨ７，２）で平衡化した ０次いで該タンパウサギの耳の縁の静脈への２０分間の点滴静注により化合物■ を投与した。ここで予め形成された血栓が頚静脈中にあり、その血栓を点滴の間 像化した。点滴の終了の６０分後でもまだ像は明確であった（第６図）。

貫主 Ｄ−Ｔｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　−ＣＦＩ　Ｃｌリンカ−の人　びＮ２Ｓキレート　 人ｌ二■主ｑｋ金 この合成スキームは第２図に示される。リンカ−は、トリペプチド誘導体の合成 についての）［ｅｔｔｎｅｒ及びＳｈａｗ（Ｂｉｏｃｈｅｉ−ハ±ｒ２．１７　 （：１９７Ｂ）　４７８０頁）により記載された方法の変法を用いて合成できる 。

止金１１Ω育底 Ｃｂｚ−Ｄ−Ｐｈｅ及びＰｒｏ−ＭｅをＣＨｚＣｌ、ｚに付加する。１当量のジ シクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ　”） を加え、そして−夜反応を行う。ＫＭ、０４により可視化された、ＥｔＯＡｃ　 ：　ヘキサン（１：　１）におけるＴＬＣはＲｆ−〇、６に生成物を示す、ジシ クロヘキシル尿素（ＤＣＵ　）を濾去し、そして有機層をそれぞれＯ，ＩＮ　Ｈ ｌ　、５％ＮａＨＣＯｚ　、及び塩水で洗浄する。ＣＨ，Ｃｌ２．を？！ｇｓＯ ｉで乾燥し、濾過し、そして蒸発せしめて化合物３を得る。過剰のＤＣｌＪを濾 過によりＣ）ｌｆｆｃＮから除去することができる。

立論Ｊ１旨針鉦吸 化合物３を１．４当量のＩ　Ｎ　ＮａＯＨを含有するメタノール中で一夜撹拌す る。生成物をＴ　Ｌ　Ｃ（ＥｔＯＡｃ　：　ＡｃＯＨ９６：　４　）上でＦＡＡ による可視化によってＲｆ＝０．５において見ることができる。反応が完了した 後、溶剤を除去し、そして残渣をＥｔＯＡｃ中に入れる。溶液を０．ＩＮ）Ｉｉ 及びＨ，Ｏにより洗浄する。有機層をＦ’ＩｇＳＯａで乾燥し、濾過し、そして 蒸発せしめる。生成物をシリカゲルカラム上で１００％ＣＨｓＣＮを用いて精製 する。

入　５，６　び７の４ 化合物５，６、及び７をＫｅｔｔｎｅｒ及びＳｈａ＋＋　（前掲）により刊行物 に記載されているようにして、そして第２図に示すようにして合成した。混合無 水物生成物（６）を１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲルカラム上で精製した ０次に、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣ１，（すなわち、ＰＰＡＣＫ） である化合物７をキレート化化合物に結合せしめる。

化金立工■金威 第３図に示すように、ＰＰＡＣＫリンカ−を、エトキシエチル（ＥＯＥ　）硫黄 保護基及びＮ−ヒドロキシサクシンイミジルエステルを含有するｒＮ２ＳｚＪキ レート化化合物に結合せしめる。

このエステルはリンカ−上の第一アミン基と反応してキレート化化合物をそれに 連結せしめる０反応は次の通りである。

ＰＰＡＣＫをＨｚＯ及び１当量のＮａＨＣＯ＊に入れるｐ［ＩはＨａ）ＩＣＯ， の添加前が４であり、そして添加後が６である。このｐＨは、アルギニンのグア ニジノ基に対してＰｈｅアミノ基における反応のために特異的である。１当量の キレート化化合物をジメトキシエタン（ＤＭＥ）中に入れ、そして３０分間にわ たって水溶液に加える。ｎＢｕＯＨ：　Ａｃ０）１　：　ＨｚＯ（４：　１　： 　１　）におけるＴＩ、Ｃは２種類の出発物質の間のＲｆ＝０．５に新たなスポ ットを示し、これはパラ−アニスアルデヒド及びニンヒドリンの両者において染 色する。２時間後、溶剤を除去する。化合物８を不活性化したシリカゲルを用い るシリカゲルカラム上で直接精製しそしてＣＨｚＣｊ！　ｚ　：　Ｍｅａｎ　： 　ＡｃＯＨ（８５：　１３　：　２　）により溶出する。

・　−゛　びｔ−ＰＡへの　人 化合物８を放射能標識して、ＰＰＡＣＫリンカ−に連結された””ＴＣ−ＮｚＳ ｘ放射性核種金属キレートを生成せしめる。放射能標識法は例２に前記した通り である。生ずる９９′″ＴＣ−Ｎ、Ｓ！−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚ ＣＩ！化合物をｔ−ＰＡと緩衝液中で結合せしめ、次に放射性核種金属キレート をリンカ−を介して右ｊ　−ＰＡに結合せしめる。

■Ωユｌ左二 上記の方法においてフェニルアラニンの代りにアミノ酸リジンを用いてリンカ− Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣ１２を製造することができる。放射性核種金 属キレートを、ＮｔＳｚキレート及びＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ，Ｃ１ ２リンカ−について前記したようにして、このリンカ−を介してｔ−ＰＡに結合 せしめることができる。

肛 ヨード　Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　−ＣＤ　Ｃ１’　ンカーの１！す告　びｔ −ハ仝■丈ｑ持金 合成方法は一般的に第４図及び第５図に示される。

Ｎ　−ＣＢＺ　−）’　−ｎ−ブチル　フェニルアラニン　２Ω金底 無水ＴＨＦ中Ｎ−〇ＢｚＰ−クロロフェニルアラニン１（１当量）の溶液に、１ ００℃にてｎ−ブチルリチウム（３，３当量）を添加する。１時間後、ＢｕｓＳ ｎＣｘ　（過剰）の溶液を加える。

Ｂｕ３ＳｎＣｐの代りに他のトリーアルキル−３ｎ化合物を使用することができ る。溶液をＯ′Ｃに加温し、そして飽和Ｎ）］、Ｃｆｆ１の添加により停止する 。ジエチルエーテルへの抽出処理が目的生成物をもたらす。

Ｎ　−ＣＢＺ　−）　’　−ｎ−ブチル　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−／　ｆ）Ｌｔｌ　 Ｘ　−及」主１ｕ合底 無水ＴＩ（Ｆ中Ｎ−ＣＢＺｐ−）ジ−ｎ−ブチル錫Ｐｈｅ（２）（１当量）の溶 液に、０°Ｃにてジシクロへキシルカルボジイミド（１，２当量）、及び次にＮ −ヒドロキシサクシンイミド（１，２当量）を加える。生ずる溶液を一夜撹拌す る。混合物を濾過し、濾液を濃縮し、そして粗残渣をクロマトグラフ処理する。

ＴＨＦ中精製ＮＨ３の溶液にプロリンメチルエステルのＴＨＦ溶液を加える。生 ずる溶液を一夜撹拌する。混合物を濾過し、濾液を濃縮し、そして粗残渣をクロ マトグラフィー処理してＮ−ＣＢＺｐ−）ツーｎ−ブチル錫Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ− メチルエステル（３Ｌ）を得る。

Ｎ−ＣＢＺ　−）ソーｎ−ブチル　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＯ，Ａｒ　（ＣＭＫ−← Ｄ」λ含炭 ９５％エタノール中Ｎ−ＣＢＺｐ−）ツーｎ−ブチル錫Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ−メチ ルエステル（３Ｌ）の溶液にＫＯＨ（５〜１０当量）を加える。生ずる溶液を数 時間わずかに加温する。この溶液を０℃に冷却し、そして冷水性ＨＣｆにより酸 性化する。抽出処理が目的のカルボン酸をもたらす。Ｔ）（Ｆ中このカルボン酸 の溶液に、クロロ蟻酸イソブチル（１当量）をＮ−メチルモルホリン（１当量） の存在下で加え、そしてこの混合物を一２０℃にて１時間反応せしめる。冷トリ エチルアミン（１当量）を添加し、そして生ずる混合物をすぐに、冷ＤＦＭ中ニ トロアルギニンクロロメチルケトン−ＨＣｆｆｌ（１当量）の溶液′　に加える 。２０°Ｃにて１時間及び室温にて２時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、そ して濃縮乾固する。酢酸エチルへの抽出処理が目的生成物（土）をもたらす。

−ト１−ｎ−ブチル　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　（ＣＭＫ）　５　の人酢酸／エタ ノール溶液中Ｎ−ＣＢＺ−ｐ−トリーニーブチル錫Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＮＯｚＡｒ ｇ（ＣＭＫ）　（４）の溶液に、活性炭上パラジウムを加える。生ずる混合物を ３０ｐｓ　ｉにて数時間水素化する。

セライトにより触媒を濾去する。濾液を水で稀釈しそしてエーテルで洗浄する。

次に、水層を凍結乾燥して生成物（５）を得る。

一ト１−ｎ−ブチル　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ　（ＣＭＫ）　５　の性旦ニヱ化 ０、　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ中Ｎａ　ｌ　２１１を含有するバイアル（１０ｍｃｉ以 下）にＰＢＳ　（リン酸緩衝液）中ｐ−トリーｎ−ブチル錫Ｐｈｅ　−Ｐｒ。

−Ａｒｇ（ＣＭＫ）（５）（５０ｇ　、　７．　Ｉ　Ｘｌ０−”μｍｏｌ）を加 える。この溶液に、水中クロラミン−Ｔの溶液（水１６０Ｉ！！中１６０尾、　 ０．７１μｍｏ１）を加える。３〜５分間の後、Ｎａ２Ｓ、０３を加える（水中 Ｎａｚｓｚｏｓの１．０■／ＩＩｌ溶液７０ｍ）、生ずる放射性ヨード化ＰＰＡ ＣＫリンカ−を第５図に示す　Ｉ’ｌｌ放射性核種はリンカ−のフェニルアラニ ン残基の芳香族環上に直接置換される。

放射性ヨード化化合物をｔ−ＰＡと緩衝液中で結合せしめ、次にそれをｔ−ＰＡ に結合せしめる。

、１ 数■ユヨード　Ｔ　ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ　−ＣＨＣ１’　ンカーの１１゛告　びｔ −ＰＡへのそ全益金 合成方法が一般的に第４図及び第５図に示される。

Ｔ　ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ　（ＣＭＫ　９　の人Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＣＭＭ） 　（９）の合成は、Ｐ−）ツーｎ−ブチル錫Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＣＭＫ） 　（５）について記載したようにして、Ｎ−ＣＢＺ−ｐ−）ツーｎ−ブチル錫Ｐ ｈｅ（２）を０−ベンジル−Ｎ−ＣＢＺチロシン（−β−）で置き換えることに より達成される。この０−ベンジル−Ｎ−ＣＢＺチロシン（ｉ）をプロリンメチ ルエステルと連結し、生ずるジペプチドを酸に加水分解し、そして次にＮＯ□ア ルギニンＣＭＫに連結せしめる。水素化がＮＯｘ　、ベンジル及びＣＢＺ保護基 を除去し、目的化合物（９）を与える。

Ｔ　ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ　（ＣＭＫ）　９　の　ヨードＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ ＣＭＫ）　（９）の放射性ヨード化はＰ−）ツーｎ−ブチル錫Ｐｂｅ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ（ＣＭＫ）　（５）について記載したようにして達成される。生ずる放射 性ヨード化された化合物を緩衝液中でｔ−ＰＡと反応せしめ、次にこの化合物を ｔ−ＰＡと結合せしめる。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、２ Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（ｊ（２ＣＩ　ＣＰＰＡＣに）の合成浄書（内容に変 更なし） ＦＩＧ、３ Ｎｚ　Ｓ２リガンドＮＨＳエステルへのＰＰＡＣＫの直接連結Ｈ２０中１当量の Ｎ、ＨＣＯ２ ジメトキシエタン 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成１年５月２５日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８Ｂ１０３３１Ｂ ２　発明の名称 フィブリン結合性蛋白質を用いる血餅の診断方法３　特許出願人 ４代理人 住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル〒１０５　１１話（ ５０４）０７２１ ５　補正書の提出年月日 １９８９年４月１２日（＆亀α） ６　添付書類の目録 補正書の翻訳文　１通 浄書（内容に変更なし） 請求の範囲 １、血栓溶解性蛋白質を標識するための方法であって、検出可能な物質を該血栓 溶解性蛋白質にリンカ−を介して結合せしめることを含んで成り、ここで、該リ ンカ−が、該血栓溶解性蛋白質のフィブリン結合ドメイン以外の部分に結合する 、前記方法。

λ　前記リンカ−がオリゴペプチドクロロメチルケトンである、請求項１０方法 。

１　前記血栓溶解酵素がｔ−ＰＡであり、そして前記リンカ−がｔ−ＰＡのプロ テアーゼ部分に特異的に結合する、請求項１又は２の方法。

４、　前記リンカ−がＤ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣ１及びＴ ｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ，Ｃ１２から選択される、請求項３の方法 。

５、前記検出可能な物質が放射性同位元素である、請求項４に記載の方法。

６、前記放射性同位元素がキレートの形の放射性核種金属である、請求項５の方 法。

７、　生体内フィブリン−血小板血餅イメージング用キットであって、血栓溶解 性蛋白質、及びキレート化化合物に結合したリンカ−を含んで成り、ここで該該 リンカ−が該血栓溶解性蛋白質のフィブリン結合ドメイン以外の部分に結合して いる、前記キット。

ａ　ｔ−ＰＡである前記血栓溶解性蛋白質を含む第一バイアル、（ａ　）　Ｎｚ Ｓｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨｚＣｆ又はＮｚ５ｚ−Ｔｙｒ −Ｌ−Ｐｒ。

−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＢｚＣｚ　（ここで、Ｎｚ５ｚはＮｚ５ｔキレ一ト化化合物を 表わす） （ｂ）ベルテクネレートを交換錯体が生成する酸化状態にまで還元するのに有効 な還元剤、及び （ｃ）還元された＊９ｗａＴｃが交換剤と共に前記交換錯体を形成するであろう その交換剤、を含んで成る凍結乾燥された調製物を含む第二バイアル、を含んで 成る請求項７のキット。

９、前記還元剤が第一錫イオンであり、そして前記交換剤がグルコン酸である、 請求項８のキット。

１０、次の式： （式中、ｍは０又はｌであり、そしてＱは放射性標識された分子である） の化合物。

１１、、Ｑが放射性核種金属キレートを含んで成る、請求項１０の化合物。

１２、前記放射性核種金属キレートが窒素及び硫黄原子から選択された合計４個 のドナー原子のを含んで成る、請求項１１の化合物。

１３、前記放射性核種金属キレートが１個の硫黄及び３個の窒素原子を含んで成 る、請求項１２の化合物。

１４、前記放射性核種金属キレートが２個の硫黄及び２個の窒素ドナー原子を含 んで成り、そして該化合物が次の式：（式中、ｍはＯ又は１であり、そしてＭは 放射性核種又はその酸化物を表わす） を有する、請求項１２の化合物。

１５、次の式： Ｃ式中、ｎは０〜３であり、そして０Ｘはハロゲンの放射性同位元素を表わす） の１つで表わされる、請求項１ｏの化合物。

１６、前記化合物が次の式： （式中、１■はヨウ素の放射性同位元素を表わし、そしてｍはＯ又はＩであり、 少なくとも１つのｍは１である）で表わされる、請求項１ｏの化合物。

１７８次の式： Ｃ式中、′Ｘは放射性ハロゲンを表わす）の化合物。

１８、次の式： （式中、′Ｘは放射性ハロゲンを表わす）の化合物。

１９、　ｔ−ＰＡに結合した、請求項１０　、１３　、１４　、１５　、１６　 、１７又は１８の化合物を含んで成る放射性標識されたｔ−ＰＡ蛋白質。

２０、検出可能な物質が結合している血栓溶解性蛋白質であって、該検出可能な 物質が該蛋白質に、該蛋白質のフィブリン結合ドメイン以外の部分に特異的に結 合するリンカ−を介して結合している、前記蛋白質。

２１、前記蛋白質が酵素であり、そして前記リンカ−が、酵素活性を提供する蛋 白質の部分に特異的且つ非可逆的に結合し、これによって該蛋白質の酵素活性が 低下又は除去されている、請求項２０の蛋白質。

２２、前記リンカ−がオリゴペプチドクロロメチルケトンである、請求項２１の 蛋白質。

２３、前記蛋白質がｔ−ＰＡであり、そして前記リンカ−が、プラスミノーゲン の活性化を担当するｔ−ＰＡの部分に特異的に結合する、請求項２１又は２２の 蛋白質。

２４、前記検出可能な物質が、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃ ｌ及びＴｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ，ＣＩｌから選択されたリンカ− を介してｔ−ＰＡ結合している、請求項２３の蛋白質。

２５、前記検出可能な物質が放射性同位元素である、請求項２４の蛋白質。

２６、前記放射性同位元素がキレート形の９９′″Ｔｃである、請求項２５の蛋 白質。

手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３３１８ ２、発明の名称 フィブリン結合性蛋白質を用いる血餅の診断方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ジェネンテック、インコーボレイティド（外１名） ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号靜光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 ハ ６、補正の対象 （１）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の代表者の 欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）　図面の翻訳文 （４）委任状 ７、補正の内容 （１１（４１別紙の通り （支））　明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （３）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１１訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）　明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）図面の翻訳文　１通 （４）　委任状及びその翻訳文　各２通手続補正書く方式） 平成２年４月１３日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３３１８ ２、発明の名称 フィブリン結合性蛋白質を用いる血餅の診断方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ジェネンテック、インコーボレイティド（外１名） ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ、門−下目８番１０号靜光虎ノ門ビル　電話５０ ４−０７２１５、補正命令の日付 平成２年１月３０日（発送日） ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の７第１項の規定による書面の「補正書の提出年月日」 の欄 （２）補正書の翻訳文 ７、補正の内容 （１）別紙の通り （２）補正書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の７ 第１項の規定による書面　１通 （２）補正書の翻訳文　１通 （３）上　申　書　１通 国際調査報告 □＋　Ａ＃’１１に＊、　ＰＣＴ／’ｕｓ羽１０３３１８□、ｌ　Ａ、ａ＋ゆ１ １　ＰＩＮＴ／ＵＳ８Ｂ１０３３１１１国際調査報告 Ｔｈ１１−一〜−−−１→−−−川１１ｈｅ　ｇｗｅｍ−−ｒｉ＋＋４　ｗ　ｌ ＆＋　−−ｉ＋＋ｄ−一一一。

糧−ｅｍ　ｍｙ　ｍ　ｔｗｍ−ｍ　ｎｅ　ｒｗ−１’ｍ−１勤ｒ＋ＩＦｒｍ　＃ 　１２１０１／ｆ１９’Ｍｙ　ｊｇ−−Ｐｍ＋ｗ　ＣＭ’ｌｉ＋ｖ　ＩＩ　＝　 Ｍ　＋＊ｙ　ｈｅｈｋ−ｒ−！−１噛納１１ｗ＊　ｗｅ　−卵１−軸−１ｈｅ　 ｐ{ｐ＋ｗ　ｊ　−−１−−−ユ

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．生体内でフィプリン−血小板血餅を検出する方法であって、 （ａ）フィプリン−血小板血餅を有することが疑われる患者に標識された血栓溶 解性蛋白質を投与し、ここで血栓溶解性蛋白質の血餅分解活性が低下又は除去さ れ、そして該標識が血栓溶解性蛋白質のフィプリン結合ドメイン以外の部分に選 択的に結合し；そして （ｂ）患者中の標識された血栓溶解性蛋白質の生体分布のパターンを検出する； ことを含んで成る方法。
2. ２．前記標識された血栓溶解性蛋白質が注射により患者の血流中に投与される、 請求項１の方法。
3. ３．前記標識された血栓溶解性蛋白質がｔ−ＰＡである、請求項１の方法。
4. ４．前記検出可能な物質が放射性同位元素である、請求項１又は３の方法。
5. ５．前記放射性同位元素がキレートの形の放射性核種金属である、請求項４の方 法。
6. ６．前記放射性核種金属９９ｍＴｃであり、そして該９９ｍＴｃの生体分布の検 出をガンマーカメラによる患者の走査により行う、請求項５の方法。
7. ７．前記検出可能な物質が、前記血栓溶解性蛋白質の血餅溶解部分に特異的に結 合するリンカーを介して該血栓溶解性蛋白質に結合している、請求項１の方法。
8. ８．前記血栓溶解性蛋白質がフィプリン結合性セリンプロテアーゼであり、そし て前記リンカーが、該セリンプロテアーゼの血餅溶解部分に結合するオリゴペプ チドクロロメチルケトンである、請求項７の方法。
9. ９．前記血栓溶解性蛋白質がｔ−ＰＡであり、そして前記リンカーがＤ−Ｐｈｅ −Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ又はＴｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ− ＣＨ２Ｃｌから選択される、請求項８の方法。
10. １０．前記検出可能な物質が放射性同位元素である、請求項７，８又は９の方法 。
11. １１．前記放射性同位元素がキレートの形の放射性核種金属である、請求項１０ の方法。
12. １２．前記血栓溶解活性が実質的に除去されている、請求項１の方法。
13. １３．血栓溶解性蛋白質を標識するための方法であって、検出可能な物質を該血 栓溶解性蛋白質にリンカーを介して結合せしめることを含んで成り、ここで、該 リンカーの結合が、該血栓溶解性蛋白質のフィプリン結合ドメイン以外の部分に 対してである、方法。
14. １４．前記リンカーがオリゴぺププチドクロロメチルケトンである、請求項１３ の方法。
15. １５．前記血栓溶解酵素がｔ−ＰＡであり、そして前記リンカーがｔ−ＰＡのプ ロテアーゼ部分に特異的に結合する、請求項１３の方法。
16. １６．前記リンカーがＤ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ及びＴ ｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌから選択される、請求項１５の方法 。
17. １７．前記検出可能な物質が放射性同位元素である、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記放射性同位元素がキレートの形の放射性核種金属である、請求項１７ の方法。
19. １９．生体内フィプリン−血小板血餅イメージング用キットであって、血栓溶解 性蛋白質、リンカー及び検出可能な物質を含んで成り、ここで該検出可能な物質 が該リンカーを介して該血栓溶解性蛋白質に結合されており、この結合が該血栓 溶解性蛋白質のフィプリン結合ドメイン以外の部分に対してである、前記キット 。
20. ２０．前記血栓溶解性蛋白質がｔ−ＰＡである第一バイアル、並びに （ａ）Ｎ２Ｓ２−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ又はＮ２Ｓ ２−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ−ＣＨ２Ｃｌ、 （ｂ）ぺルテクネレートを交換錯体が生成する酸化状態にまで還元するのに有効 な還元剤、及び （ｃ）還元された９９ｍＴｃが交換剤と共に前記交換錯体を形成するであろうそ の交換剤、を含んで成る凍結乾燥された調製物を含む第二バイアル、を含んで成 る請求項３１のキット。
21. ２１．前記還元剤が第一錫イオンであり、そして前記交換剤がグルコン酸である 、請求項２０のキット。
22. ２２．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｍは０又は１であり、そしてＱは放射性標識された分子である） の化合物。
23. ２３．Ｑが放射性核種金属キレートを含んで成る、請求項２２の化合物。
24. ２４．前記放射性核種金属キレートが窒素及び硫黄原子から選択された合計４個 のドナー原子の全部を含んで成る、請求項２３の化合物。
25. ２５．前記放射性核種金属キレートが１個の硫黄及び３個の窒素原子を含んで成 る、請求項２４の化合物。
26. ２６．前記放射性核種金属キレートが２個の硫黄及び２個の窒素ドナー原子を含 んで成り、そして該化合物が次の式：▲数式、化学式、表等があります▼Ｈ （式中、ｍは０又は１であり、そしてＭは放射性核種又はその酸化物を表わす） を有する、請求項２４の化合物。
27. ２７．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼がミリ（式中、ｎは０〜３であり、そして＊ Ｘはハロゲンの放射性同位元素を表わす） の１つで表わされる、請求項２２の化合物。
28. ２８．前記化合物が次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼（式中、＊Ｉはヨウ素の放射性同位元素を表 わし、そしてｍは０又は１であり、少なくとも１つのｍは１である）で表わされ る、請求項２２の化合物。
29. ２９．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、＊Ｘは放射性ハロゲンを表わす）の化合物。
30. ３０．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、＊Ｘは放射性ハロゲンを表わす）の化合物。
31. ３１．ｔ−ＰＡに結合した、請求項２２，２５，２６，２７，２８，２９又は３ ０の化合物を含んで成る放射性標識されたｔ−ＰＡ蛋白質。