JPH02503266A - ウイルスの保存 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルスの保存 本発明は、生きたウィルスの保存に関し、特に、生きたウィルスの免疫その他の 有用な活性を維持したまま、再生可能な安定形態に乾燥することに関する。

生きたウィルスは、数々の重要な用途を有する。中でも、ウィルスをそのままあ るいは弱毒化して用いる免疫性ワクチンとしての用途は、最も重要である。２つ の良い例として、ポリオウィルス及びはしかウィルスが挙げられる。しかしなが ら、生きたウィルスワクチンは、保管状態で維持するのが非常に困難である。こ れらは、現時点においては、その免疫効果を失わずに乾燥、再生することができ ない。同様の理由でこれらは、凍結することもできない。従って、ウィルスワク チンを冷滅菌状態、例えば冷蔵庫内で水溶液培地中で保持することが要求されて いる。上述した疾患の１つであるはしかは、とくに第三世界において、伝染病学 的に大変重要である。アフリカだけで、毎年数百万人の子供がはしかで死亡して いる。これは、組織上または財政上の理由で冷蔵利用の視点を持たない大多数の 国々に、治療に必要なワクチンを配給できないことに大きく起因する。

従って、冷蔵その他の水分調整を行わずに、使用直前に水を用いて簡単に再生で きるような、ウィルスをそのままの免疫活性のある形状で保存する簡単な方法が 世界的に強く必要とされている。

その他のウィルスもそれぞれのフィールドでかなり重要性がある。

例えば、エプスタイン−パールウィルス（ＥＢＶ）は；モノクロナル抗体の作成 及びヒト分子遺伝学の研究のためのヒトＢ細胞系の作成に非常に重要である。Ｅ ＢＶは現在の所は、冷蔵下の水溶液培地に保管されている。

同様に大腸菌から誘導されたラムダファージ等のバクテリオファージは、ＤＮＡ の合成やいわゆる遺伝子工学での遺伝子ライブラリーの作成に非常に重要である 。現在の所、本ウィルスは冷蔵条件下で水溶液中に保管されなければならない。

不安定な生物学的生成物は、安定剤を当該生成物に添加して室温または凍結状態 （凍結乾燥）で乾燥する方法が良く知られているが、生きたウィルスの安定化に 成功した報告は、我々の知る限りにおいては、まだ無い。

例えば、英国特許出願第２００９２９１１１Ａ号は、スクロースやラフィノース 、グルコース及びトレハロースを含有する種々の糖質を結合させることによる、 メニンゴコツカル（ａｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）多糖類の凍結乾燥下での安定 化について記載している。本例においては、もちろん抗原性化合物は生きたウィ ルスではない。同様に、英国特許出願第２１２６５８８Ａ号は、ある糖質及び糖 酸の存在下での腫瘍壊死因子の安定化について記載している。

欧州特許出願第１４０４８９Ａ１号では、風疹ウィルス抗原をある糖質内に浸漬 することによって安定化している。しかしながら、本例もウィルスそのものの安 定化の可能性については言及していない。

我々の先の英国特許出願第２１８７１９１Ａ号（１００８７７００１９６号）は 、種々のタンパク質その他の高分子をトレハロース存在下で室温乾燥する保存法 を記載し、請求している。ここでは、死んだウィルスのワクチンについて言及さ れているが、本方法によって、免疫その他の機能を持った生きたウィルスが、保 存できるかどうかについては示唆していない。

我々は、現在、凍結及び室内温度でウィルス培地を乾燥する際にトレハロースが 存在すると、生きたウィルスを保存でき、続いて、その免疫性その他生浮力を含 む有用な特性を総て十分に保持したまま再生できることを見いだした。こうして 、初めて、安定な乾燥状態のポリオやインフルエンザウィルス等のワクチンを提 供できた。

本発明によれば、ウィルスを含有する水溶液システムをトレハロースの存在下で 凍結状態あるいは室温で乾燥させる、生きたウィルスの保存方法が提供される。

一般には、実験の有効性がトレハロースを１乃至２０ｖｔ％、典型的には５乃至 １０ｖｔ％含有する水溶液システムを用いると有益な実験結果が得られるが、添 加するトレハロースはより多い方が良い。本来、添加されるトレハロースの量は 、システム中に存在するウィルスの量に部分的に依存するが、ウィルスに対する トレハロースの正確な比率は特に重要ではない。

標準的な手法を用いて、水によって再生できる室温で保管可能な乾燥材料を得る ために、ウィルスを完全に凍結できると同時に、実際に、免疫その他の活性を喪 失せずに室温で水溶液システムを乾燥することが可能である。例えば、バクテリ オファージラムダＧＴＩＯ及び１０ｗｔ％のトレハロースを含有し、室温（およ そ２０℃）で乾燥した水溶液標本は、続いて、水溶液培地中の大腸菌懸濁液を添 加することにより、再生された。

以下の実施例は、本発明の特徴を示すものであるニー実施例１ エプスタインパールウィルスを乾燥状態で室温保存する際のトレハロース効果の 評価 材料及び方法 １、ウィルス生成 り９５．８産生細胞系（エプスタインパールウィルス、Ｅｄ、エプスタイン及び エイコン（Ａｃｈｏｎｇ）、ベルリン、スプリンガー　フエアシーグ（Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ）、１９７９）をＤＭＥＭ／１０ＳＦＣＳ中で培養し、 ３０ｎｇ／ｍｌの１２−０−テトラゾコニルーフオルポル−１３−アセテート（ ＴＰＡ）を添加し、カルチャーを３３℃で１０日間維持した。その後、上清を集 上清を元のカルチャーの４０倍に濃縮した。

２、乾燥及び保管 濃縮したウィルス標本に等量の保存剤（２％、２０％または４０％トレハロース （シグマ）水溶液）を添加し、各溶液の半量を４℃で保管した。残りの半量はガ ラスアンプル中で凍結乾燥し、室温で保管した。１週間後、凍結乾燥した材料を 滅菌水で再生し、ＤＭＤＭ／１０％ＦＣＳを用いて最終的なウィルス量を元のカ ルチャー上清の３分の１に希釈して、各標本の希釈液を作成した。

３、３Ｈチミジンを用いた増殖試験 最終ウィルス希釈液にヒト扁桃腺Ｂ細胞を１０’／ａｌ添加し、ウィルス感染が 起こるように、穏やかに撹拌しながら９０分間インキュベートした。次に遠心機 によって細胞を集め、５ｘｌＯ’／ｍｌで再懸濁し、０゜２ｍｌの標本（１０５ 細胞）を９６ウエルの平らな組繊カルチャープレート上に、各条件について３ウ エルずつ蒔いた。３７℃で５日間インキュベートした後、１ウエルにつきｌμＣ ｉの３Ｈチミジンを添加し、６時間インキュベート後　ｓＨチミジンを取り込ん だウェルをベータ線カウンターでカウントした。

結果 ４℃保管ＥＢＶ　　　　　　　６４５２ｇ　＋　９７０２　　　（１００）凍結 乾燥ＥＢＶ　　　　　　　５６４１　＋　　５６０　　　　９ＥＢＶ　＋　１＄ ト１／ハロ−ス１１８６０±１４６６　　　　１８ＥＢＶ　、　１０％トレハロ ー２　３７７５７　＋　５６６３　　　　５８．５ＥＢＶ　＋２０％トレハａ− ス４１７９３　　　　　　　　６５加えて、標本を陰性染色した電子顕微鏡像に よれば、１０％のトレハロース存在下では乾燥ＥＢＶの微細構造が保存されてい るのに対し、トレハロースを含有しないものは、その微細構造は完全に破壊され ていた。

実施例２−大腸菌バクテリオファージ（ラムダ）ＧＴ１０背景： バクテリオファージラムダは、大腸菌を感染し、溶菌あるいは溶原経路のいずれ かによって菌内に侵入する。溶菌経路では、ファージは宿主内で複製し、ついに は宿主を溶菌して全ファージを放出する。溶原経路では、ファージＤＮＡは、複 製しバクテリア宿主を溶菌する代わりに宿主ゲノム内に侵入し、ゲノムと共に複 製を行う。

溶原あるいは溶菌経路での侵入調節遺伝子は、ファージ抑制遺伝子（Ｃ１）であ る。挿入部を有するラムダファージを寒天プレート上に蒔くと、バクテリア増殖 面にファージ複製及び増殖によって溶菌されたバクテリア細胞を示す透明な領域 （プラーク）が生じる。

実験１： 単一のプラークを寒天プレートから取り、ｌｅｌの３Ｍバッファー（５，５ｇ　 ＮａＣ］、　２ｇ　Ｍｇ５Ｏａ　・７ＨｔＯ１５＋＊］の１Ｍトリス／ＨＣＩ　 ｐＨ７，５及び５ｍｌの２％ゼラチンを１リツトルに調整したもの）中で４℃で 保管した。

この保管液を３Ｍバッファーで１０００分の１に希釈した。１μｍあるいは１０ μｌの標本を、同量の蒸留水に溶かした２０％トレハロースと共に、ポリプロピ レンのエッペンドルフチューブに取った。これを室温で乾燥させた。小容量の方 の標本は板状のフローフード内で一晩乾燥させ、大容量の方の標本は脱気用の経 路がついたデシケータ内で乾燥させた。標本の乾燥状態を２４乃至４８時間維持 した。プラーク試験のため、大腸菌（ＮＭ　５１４株でおよそ８Ｘ１０’）を］ ＯｍＭのＭｇＳＯ４に懸濁させた溶液１００μｌを各乾燥ファージ標本に加え、 ３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、］Ｏ＋ｅｌのラ ムダトップ寒天（＋Ｓバクトドリプトン、０．５％バクトーイースト抽出液、０ ．５％ＮａＣ］、０．２ＦＶＭｇＳＯ，及び＋１パクトー寒天を４２℃で調整） を予めＬ−寒天プレート上に蒔いておいた各標本に添加した。これらを放置冷却 し、反転し、３７℃でおよそ１６時間インキュベートした後、プラーク数をカウ ントした。

結果 ファージ処理　　　希釈保管液　　プラーク数／プレートＳ１４バッファー中で 　　１／１０００希釈を１μ］　　　　　　４７４℃保管 ＳＭバッファー中で　　１／１０００希釈を１μｍ０乾燥 Ｘ狡−ム 長期保管 前述の実験により、挿入部を有するバクテリオファージラムダをトレハロース中 で、再水和の機能を保持しながら乾燥する方法の詳細を説明した。ｑれらの実験 に用いたバクテリオファージは乾燥後２４乃至４８時間後に再水和され、吸着能 力を示し、大腸菌宿主バクテリア内に侵入し、複製、成熟し、ついには宿主を溶 菌して大量の新しいバクテリオファージを放出する能力を示した。

以下の実験は、再水和でき、機能を維持するようなバクテリオファージを、トレ ハロースが長期間逆境下で保存する能力を試験するものである。全標本の１０％ をバクテリオファージラムダの保管液から取り、同量の２０％グルコースあるい は３Ｍバッファー、または２０％のトレハロースあるいはルリアブイヨンと共に エッペンドルフチューブ内で混合した。使用したバクテリオファージ保管液は、 寒天プレートカルチャーから単一プラークをｌｅｌの３Ｍバッファーに溶かして 作成した。標本を脱気経路のついたデシケータ内で少なくとも１６時間以上乾燥 し、その後、上部をエッペンドルフにねじ込んだ。再水和するまでの間、このエ ッペンドルフ内に標本を様々な条件下で保管した。これを通常の室温で時間及び 季節を変化させながらベンチ内に放置した。また、暗室内及び直射日光内で保管 した。保管温度は４℃であった。１０か月後、これらをｌｏａ＋ＭのＭｇＳＯ４ に懸濁した大腸菌（およそ８Ｘ１０’）溶液１００μｌ中で再水和させ、混合し た後３７℃で約３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各標本に ４２℃のラムダトップ寒天を４ｍｌ添加し、予め作成しておいたし一寒天プレー ト上に蒔いた。これを放置冷却した後、３７℃でおよそ１６時間インキュベート した。プラーク数をカウントした。

乾燥ファージの溶液　　　プラーク数／プレートＩＨグルコース　　　　　　　 無し ５Ｍバッファー　　　　　　　無し ルリアブイヨン　　　　　　無し １０％トレハロース　　　　　　　１１８この結果より、保管液ｌｅｌ当たり！ ２１］０’プラーク形成単位という値が得られる。同じ保管液について１０か月 前に試験した際の比較値は、４７ｘｌＯ”プラーク形成単位であり、乾燥後すぐ にトレハロ−スノくツファーで再水和させたものは、１９ｘｌＯ”プラーク形成 単位であった。

実施例３ ポリオウィルス３型 ５０μｍのウィルス保管液＋５０μｌの２０ｚトレノーロースを３７℃で乾燥し 、この温度で２４時間乾燥し、トレハロース無しで乾燥したウィルス及び乾燥し ないウィルスとの比較試験を行った。

数字は、細胞変成の低下を対数（常用対数）表示した力価である。

２４時間　７日間 トレハロース有り　　　　　３や４３．７トレハロース無し　　　　　５．９　 　　６．０乾燥せず　　　　　　　　　０．５　　０．８即ち、トレハロースは 、とくに３７℃での保管に対して著名な保護効果を示す。

実施例４ インフルエンザウィルスＸ７９株（＾／Ｐｈ１ｌ／２／８２　ｘ　ＰＲ／８　Ｈ ３Ｎ２）　Ｉ’：Ｒ３４０５０μｍのウィルス＋５０μｍの２０％トレハロース を室温で乾燥し、この温度で４８時間保管した後、ダルベコのＭＥＭ組織カルチ ャー培地で再生し、標本の１０μｍをＭＤＣＫ細胞（ＰＨ１０）に移し、４８時 間インキュベートした。その後、血球凝集反応力価を調べた。

左医 トレハロース有り　　　　　　７，０ トレハロース無し　　　　　　４．５ 乾燥せず　　　　　　　　　７．０ 即ち、トレハロースはこの温度でウィルスを完全に保護する。他の乾燥方法及び ポリオとインフルエンザの両方との保管に対しては、より少ない保護効果を示す かまたは全く保護効果を示さなかった。

実施例５ トレハロース−乾燥ミンク腸炎ウィルスの免疫性実験は、アメリカ合衆国ライス コンシン州マジソンのハーランスプレイグ　ダウレイ　インコーホレイテッド（ ）ＩＡＲＬＡＮ　５ＰＲＡＧＵＥ　Ｄ＾ＷＬＥＹ　ＩＮＣ，）のユナイテッドワ クチンズ部門と共に行った。

ユナイテッドワクチンズのＢ　Ｉ　ＯＣＯＭＰ−ＤＰはミンクジステンパー−腸 炎ウィルスワクチンとＣ型ボツリヌス菌をバクテリントキソイドとしての緑膿菌 と共に混合した混合ワクチンである。本特許関連のデータは、不活化したミンク 腸炎ウィルス（ＭＥＶ）で免疫したミンクに、生きた有毒腸炎ウィルスを再度投 与した時の効果についての１データのみである。この混合ワクチンの成分は、他 のワクチン成分中のウィルス粒子の懸濁液として、凍結乾燥した形態で販売され ているものを注射直前に再懸濁している。

ＭＥＶ溶液は１０％のトレハロース添加及び添加無しで凍結乾燥し、ウィスコン シン州マジソンのユナイテッドワクチンズに輸送し、そこで乾燥成分中に通常の 生理食塩水を混合して再生し、生きたミンク腸炎ウィルスの投与に対するこのワ クチンでの免疫ミンクの抗致死能を試験した。

生存／投与数 トレハロース有り　　　　　　５１５ トレハロース無し　　　　　　１１５ 即ち、この、乾燥に対して非常に感受性の高いウィルスの免疫性はトレハロース によって保存される。

国際調査報告

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．ウイルスを含有する水溶液システムをトレハロース存在下で凍結状態もしく は室温で乾燥する、生きたウイルスの保存方法。
2. ２．上記水溶液システムが１乃至２０ｗｔ％のトレハロースを含有する請求項第 １項に記載の方法。
3. ３．前記水溶液システムが５乃至２０ｗｔ％のトレハロースを含有する請求項第 １項に記載の方法。