JPS6035263A - 不溶性担体に固定化された免疫活性物質の安定化法及び該物質を構成単位として含む生理活性物質測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担体上に固定保持された免疫活性物質の安定化
法並びに該方法により安定化された免疫活性物質を構成
単位として含む生理活性物質測定用試薬に関するもので
ある。

抗原抗体反応は特異性と感度が非常に高いことから過去
において種々の生理活性物質の測定や検定に応用されて
きた。中でもラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ　＋以下ＲＩＡと略す）は特に高感度
の測定が可能なことから生体試料（血清、尿２組織液等
）など被検試料中の微量物質（例えばインスリン、グル
カゴン、サイロキシン等のホルモンやＩｇＥ、α−フェ
トプロティン。

ＣＥＡ等の高分子生理活性物質）の測定に応用されてき
た。しかしながら、ＲＩＡは試薬が高価で安定性が悪く
、結果の読みとりに複雑な装置を要し、また試薬の取扱
いや廃棄に特別の安全基準を設けなければならない、な
どアイソト−プを使用することに伴なう種々の制約から
その普及も一部に限られていたが、１９７１年にＲＩ　
Ａに代る酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ　、以下ＥＩＡと略す）が考案されるに至っ
た。ＥＩＡはアイソトープの代りに酵素を標識物質とし
て用いているが、酵素標識試薬は安価で長期間にわたっ
て安定であり、ＲＩＡと同等の測定感度を有し、その結
果は肉眼又は簡単な装置で測定できるといった利点を有
している為、その普及が近年急速に進んている。ＲＩＡ
とＥＩＡとはこのように標識物質が異なるたけで、その
測定原理は同一のものである。

更にその測定システムについても各種各様のものが報告
されるに至っているがその種類はＢ　／　Ｆ分離法〔抗
原抗体反応の結果、抗原と抗体が結合して生じた結合型
の部分（１３ｏｕｎｄ型、Ｂ）と結合していない遊離型
の部分（’、’Ｆｒｅｅ型、Ｆ）　とを物理的に分離し
て測定する方法〕全採用するヘテロジニアス（１−Ｉｅ
ｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　）測定系とその必袂性のない
ポモジニアス（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　）測定系の２
種に大別される。ホモシニアス測定系は免疫成分の１つ
（主として抗体）により酵素活性が相応して抑制あるい
は活性化される酵素−ハブテン複合体が僅かに発見され
ているのみなので非常に限られた範囲で応用可能でおる
にすぎない。従って、現在において採用されているＲＩ
Ａ及びＥＩＡの大部分がへテロジニアス測定系である。

かかるヘテロジニアス測定系においてぞのＢ／Ｆ分離法
は抗原あるいは抗体を水不溶性の担体上に固定保持せし
めた固相法が最もよく利用されている方法である。更に
水不溶性の担体として従来、セルロースセファロース、
アガロース、デキストラン等の天然島分子化合物葡用い
る方法が採用されていたが、これらは洗浄操作に時間を
要し、遠心分離操作全必要とすることが測定直の１＜ラ
ツキ葡生む大きな原因となっていた。このため最近では
カラス等の無機物質やポリスチレン、ポ１１プロピレン
、Σｙ　ＩＪ塩化ビニール等の合成高分子化合物をチュ
ー７゜ピース、ディスク片、微粒子（ラテ・ノクス粒子
）。

マイクロプレー　ト等の形態にして担体としテ用イられ
るようになり、前述の問題点ケ克服している。

則ち、これら全担体として使用すれば遠心分離操作が不
要となり、洗浄操作も極めて前便化され測定（直の再現
性についても良好な紹来が得られ、自動化システムも可
能となり一部実用化も行なわれている。かかる理由によ
り、固相法によるヘテロジニアス測定系において有用な
測定システムを確立する１こめには担体の性能がその成
否を握る。即ち、担体の好ましい条件としては、（１）
免疫活性物質ケ結合せしめた際にその免疫活性を保持し
つるものであること、（２）試料検体中に含有する成分
による非特異的吸着がないこと、（３）免疫活性物質を
強固に結合しうる性質を有していること、（４）充分量
の免疫活性物質ケ結合しうる表面構造等の性質？有する
こと、（５）　Ｂ　／　Ｆ分離操作に伴なう洗浄操作な
ど取扱いが簡便であること、などが挙げられる。

上記の諸条件を満たすような免疫活性物質の固定保持さ
れた担体を得るためには担体の種類の選択のみならず免
疫活性物質の結合方法や保存方法なども開発の課題とな
っている。固相法ｒ採用したＲ　Ｉ　ＡやＥ　Ｉ　Ａで
は、従来、ガラスピースやポリスチレンビーズ等に免疫
活性物質を共有結合あるいは物理的な吸着法で担体上に
固定保持した後、血清アルブミン等を含有する緩衝液中
に浸漬して保存している。

しかし、これには（１）使用時にｐ紙等を用いて緩衝液
の水切りが必要であり、手間がかかるうえ測装置のバラ
ツキを生む原因となる、（２）乾燥させると免疫活性物
質の免疫活性が低下し固相の劣化がか生じる、（３）自
動化システムを指向するうえで技術的な課題を残す、な
ど問題点が多い。

本発明者らは、かかる技術的な背景をもとに、前述の問
題点に鑑み、担体上に固定保持された免疫活性物質を安
定化させる方法について鋭意研究の結果、担体上に固定
保持された免疫活性物質を糖類溶液、蛋白質溶液並びに
低級多価アルコール浴１仮の単独若しくは共存下ｉこ浸
漬処理ぜしめることによって所期の目的が達成されるこ
とを見出し、本発明全完成するに到った。

本発明は、担体上に固定保持された免疫活性物質を糖類
溶液、蛋白質溶液並びに低級多価アルコール溶液の単独
若しくは共存下に浸漬処理ぜしめることｔ特徴とする固
定化免疫活性物質の安定化方法並びに該方法により安定
化された免疫活性物質全含有してなる生理活性物質の測
定用１試薬である。

本発明において用いられる担体は通常のＲＩ　Ａ及びＥ
ＩＡで用いられる不溶性担体は例外なく用いられるが、
中でも遠心分離２行４つなくても固液分離が容易な不溶
性担体、例えば、ポリスチレン。

ポリプロピレン、ポリ塩化ヒニール、ポリエチレン、ポ
リクロロカーボネート、シリコーン樹脂。

シリコーンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス
、スリカラス１アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸
化物等の無機物質が特に好ましいが、これらに限定され
るものではなく、又その形態もチューブ、ビーズ、ディ
スク片、微粒子（ラテックス粒子）、マイクロプレート
等多種多様の形態のものが用いられ得る。

免疫活性物質を担体に固定保持させる方法としては通常
共有結合法あるいは物理的吸着法が挙げられる。共有結
合法は水不溶性の担体と免疫活性物質を共有結合によっ
て結合させて固定化する方法であって、担体結合法の中
では最も多くの報告が見られる。この方法によって免疫
活性物質を担体に結合さぜる際に関与する官能基はα−
またはε−アミ７基、α−２β−１またはγ−カルボキ
シル基、スルフヒドリル基、水酸基、イミダゾール基、
フェノール基などである。これらの官能基はジアゾニウ
ム基、酸アシド、イソシアナート。

あるいは活性型のハロゲン化アルキルなどと反応する。

従ってこのような反応性に富んだ官能基を利用すること
によって、免疫活性物質と水不溶性の４１．１体とを共
有結合させることが可能となる。

（代謝、第８巻、６９６頁、１９７１年）。更に担体が
カラス等の無機物の場合には反応性に富んだ官能基を入
れるためにγ−アミノプロビルトＩＩエトキシシランの
ような官能基をもったトリアルコキシシラン誘導体で処
理する。得られたアミ７基含有アルキル化カラスはアミ
ノ基含有免疫活性物質と同様に処理して免疫活性物質を
共有結合させることができ、る。一般にはグルタルアル
デヒドで処理して反応性に富んだアルデヒド基全導入し
て免疫活性物質と結合させる方法が用いられる（　Ｊ　
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　７８８０巻、８９５頁、１
９７６年）。この他、免疫活性物質の種類によって種々
の架橋試薬が用いられる。例えば、アミン基とアミン基
とを結合するものとして前述のグルグルアルデヒドの他
、サクシンアルテヒド、マロンアルテヒＦなど、アミノ
基とスルフヒドリル基とｔ結合するものとしてｍ−マレ
イミドベンノイル−Ｎ　−ヒドロサクシンイミドエステ
ル、４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシル−ＩＮ　−ヒトロサクシンイミドエステルな
ど、スルフヒト“リル基とスルフヒドリル基との結合に
は０−フェニレンビスマレイミドなどが挙げられる。

物理的吸着法は水不溶性の担体に免疫活性物質を物理的
に吸着させて固定保持させる方法であって、活性炭、多
孔性カラス、カラスビーズ、アルミナ、金属駿化物、シ
リカゲル、ヒドロキシアバタイ１−のような無機物質の
他、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニール、
ポリプロピレン。

ボリクｌコロカーボネイ１−のような合成高分子化合物
の担体の場合に用いられる。中でも、カラス。

ポリスチレン、ポリ塩化ビニールをチコーブ、ピース、
ティスフ片、微粒子（ラテックス粒子）。

マイクロプレート等の形態にして用いられた場合ｉと好
ましく採用される固定化方法である。

本発明において担体上に固定保持される免疫活性物質と
しては抗原、抗体およびハプテン（薬物等）が挙げられ
る。抗原としてはインスリン、グルカゴン、成長ホルモ
ン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、副腎皮質ホルモン、甲
状腺刺激ホルモン等のホルモン、　ＩｇＧ、　ＩｇＭ　
、　ＩｇＡ、　ＩｇＥ　、　ＩｇＤ　。

α−フェトプロティン、フェリチン、β２−ミクログロ
ブリン、ＣＥＡなどの蛋白質、およびＨＢＳ抗原、風疹
ウィルス抗原などのウィルス抗原が挙げられる。抗体と
しては、周知の方法でウサギ。

モルモット、マウス、ヤギ、ヒツジ等の咄乳動物やニワ
トリ、アヒル等の鳥類に抗原や次に述べるハプテン等を
免疫して得られる抗体（抗インスリン抗体、抗グル、カ
ゴン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗α−フェトプロティン抗体
、抗β２−ミクログロブリン抗体等）が挙げられる。ハ
プテンとしてはステロイドホルモン、カテコールアミン
、ビタミン等が挙げられる。

本発明における糖類溶液としては、例えばリポース、グ
ルコース、フラクト−ス、マンノース。

カラクトース、マルトース、乳糖、ショ糖等の単糖類や
少糖類、更にデキスＩ・ラン、デキストリン等の多糖類
全精製水あるいは緩衝液に溶解した糖類溶液が挙げられ
、中でも乳糖、シヨ糖、デキスト１１ンが好ましく用い
られる。また、本発明における蛋白質溶液としては、例
えばウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ
血清アルブミン等の血清アルブミンの他、水溶性ゼラチ
ンを精製水あるいは緩衝液に溶解した蛋白質浴液が挙げ
られ、好ましくはウシ血清アルブミンや水溶−性ゼラチ
ンが用いられる。更に低級多価アルコール溶液としては
例えばグリセロール、エリトリトール。

アドニトール等が挙げられ、特にグリセロールを精製水
あるいは緩衝液に溶解した溶液が好ましく用いられる。

更に上記の糖類浴液、蛋白質溶液並びに低級多価アルコ
ールをそれぞれ単独に用いてもよいが例えば上記糖類を
蛋白質溶液に含有させて共存溶液として用いるなど、こ
れら全併用した場合には更に優れた効果が期待できる。

本発明の糖類溶液あるいは蛋白質浴液において、糖類の
含有量は通常、該水性物中の濃度がＣ）、１〜１０Ｗ／
Ｖ愛とな一′る・量、好ましくは２．５〜５Ｗ／Ｖチで
ある。蛋白質の含有量は通常、該水性物中の濃度が０．
１〜２Ｗ／Ｖ％となる量、好ましくは０．５〜１．５Ｗ
／Ｖ％である。また、糖類と蛋白質が共存する場合には
、糖類及び蛋白質の含有量は通常、該水性物中の濃度が
それぞれ０．１〜１０　Ｗ／Ｖ　％　。

０．１〜２Ｗ／Ｖチとなる量、好ましくは２．５〜５Ｗ
／Ｖ　％　、　０．５−１．５　Ｗ／Ｖ　％である。更
に、低級多価アルコールとしてグリセロールを用いた場
合にはその含有量は通常、該水性物中の濃度が２５〜１
００　Ｖ／Ｖチとなる址、好ましくは５０〜１００Ｖ／
Ｖである。

糖類、蛋白質及び低級多価アルコールを溶解せしめる溶
媒としては精製水あるいは緩衝液が挙げられ、特に緩衝
液については、中性イ」近に緩衝作用を有するもの、例
えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グツド緩衝液等が用
いられるがリン酸緩衝液が特に好ましく、そのモル濃度
は０．０１〜０．２Ｍで、好ましくは０．０２〜０．０
５　Ｍである。また、１）　Ｈは６．８〜７．２が好ま
しい。

該水性組成物を調製する場合、各物質の添加順序につい
ては特に限定されるものではない。

担体上に固定保持された免疫活性物質奮糖類あるいは蛋
白質溶液に浸漬処理し、乾燥化せしめる方法は、例えば
担体全室温下にて２０〜４０分間、該水性物中に浸漬し
た後、担体全敗り出し、Ｆ紙等の上に静置し自然乾燥す
れば良く、そのまま試薬として有用であるが、更に好ま
しくは窒素ガスシールあるいは減圧密栓して保存する。

このように担体を糖類あるいは蛋白質溶液中に浸漬処理
することによって担体の自然乾燥操作中に生じる免疫活
性物質の抗原活性や抗体活性の低下を防ぐことが可能と
なる。

一方、担体上に固定保持された免疫活性物質を低級多価
アルコール溶液に浸漬処理し、保湿化せしめる方法は、
例えば担体を室温下にて２０〜４０分間、該水性物中に
浸漬した後、担体を取り出し、ｐ紙等の上に静置し軽く
水を切るだけで良く、担体を長らく保湿化せしめること
が可能となり、そのまま試薬として有用である。

このようにして得られた担体上に固定保持された免疫活
性物質はＲＩＡあるいはＥＩＡによる生理活性物質の測
定試薬として有用である。ＲＩＡ及びＥＩＡの代表的な
測定システムには競合法とサンドイツチ法があり、以下
にその測定原理について説明する。

競合法とは未知量の測定対象物を含有する被検液とアイ
ソト−プあるいは酵素で標識した一定量の免疫活性物質
（測定対象物と同一物質）とを１該測定対象物に対する
抗体を担体に固定保持せしめたものに対して競合的に反
応させ、抗体に結合もしくは非結合の放射能あるいは酵
素活性を測定し、未知量の測定対象物を測定する方法で
ある。

サンドイツチ法とは未知量の測定対象物ｔ、該測定対象
物に対する抗体を担体に固定保持ぜしめたものとを結合
させ、さらにこれにアイソト−プあるいは酵素で標識し
た免疫活性物質（該測定対象物に対する抗体）全結合反
応ざぜ、担体に結合した免疫活性物質の放射能あるいは
酵素活性を測定し、未知量の測定対象物全測定する方法
である。

以上、ＲＩＡあるいはＥＩＡにおける代表的な測定シス
テムを挙げ担体上に固定保持した免疫活性物質の使用法
？例示したが、本発明はこれらの例示に限定されるもの
ではなく種々の変法に対しても適用されるものであるこ
とは云うまでもない。

以下に、参考例、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。

征考１列　１ （１）抗インスリン抗体結合ガラスピーズの調製市販ガ
ラスピーズ（直径６〜７ｍｍ）５００個を精製水にて洗
浄後、更にアセトンを加えて洗浄した。次に２チγ−ア
ミノトリニドキシンラン−アセトン溶液に浸漬し、室温
下で３時間反応させた。

反応終了後、ガラスピーズ全アセトン引き続いて精製水
にて洗浄した。このようにして調製されたアミノ基含有
ガラスピーズ會２５φグルタルアルデヒド水溶液に室温
下にて２時間浸漬処理し活性化した。次いで精製水にて
ガラスピーズを充分に洗浄した後、３１１１９のモルモ
ット抗インスリン抗体を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液１
）Ｈ７，３、１００ｍ１に浸漬し４℃にて１６時間反応
し抗インスリン抗体ｔガラスピーズに結合させた。反応
終了後、０．０２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，３に
てビーズ全洗浄し史にｏ、１ｓ　Ｍ　ＮａＣ６、１％ワ
シ血清アルブミン。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）。

０．０５　％　ＮａＮａ含有リン酸緩衝液ｐＨ７，３に
浸漬し用時まで冷所保存した。

（２）抗β２−ミクログロブリン抗体結合ポリスチレン
ビーズの調製 市販ポリスチレン製ヒーズ（直径６．５ｓｍ）５００個
ｋ　０．０２　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５にて洗浄後、
３　ｎｙのウサギ抗β２−ミクログロブリン抗体を含む
０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５、１００ｍｌに浸漬
し、４℃にて１６時間反応し抗β２−ミクログロブリン
抗体全ポリスチレンビーズに結合さぜた。

反応終了後、０．０２．Ｍ　ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，３
にてビーズ全洗浄し、更に０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１％
ワシ血清アルブミン、　１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、
　０．０５　％Ｎａ　Ｎ３含有０．０２Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７，３浸漬し、用時まで冷所保存した。

（３）抗Ｃ−反応性蛋白（Ｃ−ＲＰ　）抗体結合ポリ塩
化ビニールプレートの調製 市販ポリ塩化ビニール製マイクロプレート（Ｕ宰型、９
６ウエル）の各ウェルに５μｇのマウス抗Ｃ−ＲＰ抗体
を含む０．０５　Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９，６、０，１ｍｌ
ｋ加え４℃にて２１時間静置し抗Ｃ酸緩衝液ｐ　Ｅ（７
，４にて各ウェルを洗浄し、次Ｇ）で１％ウシ血清アル
ブミン含有０．ＯＩＭ’Ｊン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，４ｋ　
０．２　ｍｌ’ｃ加え、４°Ｃ，１９時間静置、用時ま
で冷所保存した。

参考例　２ 〔１〕抗インスリン抗体結合ガラスピーズ全用し）だＦ
ＪＩＡ法によるインスリンの測定 インスリンのＥＩＡによる測定 試薬 （１）参考例１で得られた抗インス１】ン抗体結合フッ
゛ラスビーズ。

（２）　０−３２０　ｐＵ／ｍｌの標準インスｌ］ン。

（３）ペルオキシダーゼ標識抗インス１ｊン抗体。

（４）上記（２＞　、’　（３）の試薬の希釈に用しＡ
る、Ｏ，ｘ５ＭＮａＣｌ、　１％ウシ血清アルフ゛ミン
、　１　ｍＭｌ＞ＤＴＡ　、　０．１　％”ｊ−リチル
酸ナトＩＩワム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，９
゜ （５）　６０　ｍｇ　・０−フェニレンジアミン（６）
　１．７　Ｖ／Ｖチ過酸化水素水（７）　（５）、（６
）の酵素基質の溶解に用いる、０．０５Ｍクエン酸−リ
ン酸緩衝ｉ　ｐ　Ｈ４，８゜試薬（４）で希釈した試薬
（３）　５００μｌに標準インスリン５０μｌを添加し
、次いて試薬（１）を加えた後、３７“Ｃで６００分間
反応せる。反応後、（）、９％ＮａＣｌにてピースを洗
浄し、次いで試薬（？）←５００μｌ！ヲ加えて酵素反
応全開始する。３７℃で１５分間反応させた後、試薬（
８）　３．０　ｍｌ　ｆ添加して反応を停止させ反応液
の４９２　ｎ、ｍにおける吸光度を測定する。

〔２〕抗β２−ミクログロブリン抗体結合ポリスチレン
ピース音用いたＥＩＡ法によるβ２−ミクログロブリン
の測定 β２−ミクログロブリンのＢＩＡによる測定試薬 （１）参考例１で得られた抗β２−ミクロクーロフ゛１
」ン抗体結合ポリスチレンビーズ。

（２）０〜２００μｇ／ｌの標準β２−ミクロク゛ロフ
゛ＩＪン。

（３）ペルオキシダーゼ標識抗β２−ミクロク゛ロア゛
１）ン抗体。

（４）上記（２）　ｊ　（３）の試薬の希釈に用し）る
、０．１５ＭＮａＣ１、１％ウシ血清アルブミン、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．ｔ％サリチル酸ナト１ｊウム含有０．
０２　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，９゜（５）　６０　ｍｆ
Ｊ　’０−フェニレンジアミン。

（６）　ｌ　、　７　Ｖ／　Ｖ％過酸化水素水。

（７）　（５）、（６）の酵素基質の溶解に用いる０、
０５１Ｖｆクエン酸−〇、１ｉＶＩリン酸緩衝液ｐ　Ｈ
４，８゜試薬（４）で希釈した試薬（３）　１　ｍｌに
標準β２−ミクログ〔Ｊプリン２０μｌを添加し、次い
で試薬（１）を力０えた後、３７°Ｃで６００分間反応
せる。反応後、０．９％ＮａＣｄにてビーズを洗浄し、
次いて試薬（？）斡５００μｌ’Ｌ加えて酵素反応全開
始する。３７℃で１５分間反応させた後、試薬（８）　
３．０　ｍｌ　２添加して反応を停止させ、反応液の４
９２　ｎｍにおける吸光度ケ測定する。

〔３〕抗Ｃ−ＲＰ抗体結合ポリ塩化ビニールプレートを
用いたＥＩＡ法によるＣ　−ｒ＜　Ｐの測定 Ｃ−ＲＰＱＥＩＡによる測定 試薬 （１）参考例１て得られた抗Ｃ−ＲＰ抗体結合ポリ塩化
ビニールプレート。

（２）　Ｏ−１０００ｎｇ／ｍｌの標準Ｃ−ＲＰ。

（３）ベルオキシターゼ標識抗Ｃ−ＲＰ抗体。

（４）上記（２）　、’　（３）の試薬の希釈、および
プレートの洗浄に用いる、１％ウシ血清アルフミン。

０．５チノニボール３００（ポリオキンエチレンノニル
フェニルエーテル、三洋化成工業（山開品名）　、　０
．９　ｌｘ　ＮａＱ？含有０．０２　Ｍ　’＋　７　酸
緩衝液ｐＨ７−３゜ （５）　６０　ｙｎｆ／　ｔｏ−フェニレンジアミン。

（６）　■、７　Ｖ／Ｖチ過酸化水素水。

（７）　（５）、（６）　ノ酵素基質の溶解に用いる、
０．０５Ｍクエン酸−０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ４，８
゜試薬（４）で希釈した標準Ｃ−１（Ｐ１００μｌ’に
各ウェルに添加し、３７°Ｃで１２０分間反応させる。

次いで反応液？吸引除去し、試薬（４）で各ウェルを充
分に洗浄し、更に試薬（３）ｉｘｏｏμｌ添加し、３７
℃で１２０分間反応させた。反応後、ウェルを試薬（４
）で洗浄し、試薬（力→１００μｉ加えて酵素反応を開
始する。室温下に−（１５分間反応させた後、試薬（８
）　５０μｌを添加して反応を停止させ、反応液の４９
０　ｎｍにおける吸光度をマイクロプレート用の比色計
で測定した。

実施例　］ 抗インスリン抗体結合ガラスピースの安定化参考例１で
調製した抗インスリン抗体結合ガラスピーズを精製水で
洗浄後、下記の処理液（ａ）〜（ｆ）に室温下、３０〜
４０分間、浸漬処理した。

（ａ）　５　Ｗ／　’Ｖ　％シヨ糖及び１％ウシ血清ア
ルブミンを含む０．０２ＭＩＩン酸緩衝液ｐＨ６，９゜
（ｂ）　５　Ｗ／Ｖチンヨ糖を含む０．０２Ｍリン酸緩
衝液ｐ　Ｈ６，９。

（ｃ）　１％ウシ血清アルブミンを含む０．０２Ｍリン
酸緩衝液ｐ　Ｈ６，９゜ （ｄ）１％水溶性ゼラチンを含む０．０２　Ｍ　ＩＩン
酸緩衝液ｐＩ（６，ｇ。

（ｅ）　５０　Ｖ／Ω饅グリセロール溶液。

（ｆ）　０．０２　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，９゜処理後
、室温下にてピースを自然乾燥した。

この様にして調製したヒースを４０°Ｃの恒温室に保存
し苛酷試験２行なった。抗体結合ヒースの安定性の評価
については一定量（３２０μ［Ｊ／ｍｌ）のインスリン
を含む試料全参考例２に占己載したＥＩＡ法で測定し、
対照ビーズ（参考例１で調製した、ビーズ全１チウシ血
清アルブミン等ケ含む０．０２Ｍリン酸緩衝１ｐＬ−（
７，３に浸漬した状態で４°Ｃに保存したもの）を用い
て測定した場合に対する百分比全活性保持率（％）とし
て第１表に示し第　１　表 実施例　２ 抗ρ２−ミクログロブリン抗体結合ポリスチレンビーズ
の安定化 参考例１で調製した抗β２−ミクログロブリン抗体結合
ポリスチレグビーズを精製水に浸し、濾紙等を用いて軽
く水を切った後下記の処理液（ａ）〜（ｆ）に室温下、
３０〜４０分間、浸漬処理した。

（ａ）　５　Ｗ／　Ｖ　％シヨ糖及び１％ワシ血清アｌ
レフミンを含むリン酸緩衝液ｐＨ６・９０ （ｂ）　５　Ｗ／Ｖチショ糖を含む０．０２　Ｍ　ＩＩ
ン酸緩衝液ｐＨ６，９゜ （Ｃ）１％ワシ血清アルブミン？含む０．０２　Ｍ　Ｉ
Ｉン酸緩衝液ｐＨ６，９゜ （ｄ）　１　％水溶性ゼラチンを含む０．０２　Ｍ　’
Ｉン醒緩衝ｌＰＨ６，９゜ （ｅ）　５０　Ｖ／Ｖ％グリセロールｍ液。

（ｆ）　０．０２　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，９０処理後
、ピースを取り出しＦ紙等全用いて水全切り室温下にて
自然乾燥した。このようにして得られたビーズ？実施例
１と同様、４０°Ｃの恒温室に保存し苛酷試験を行なっ
た。抗体結合ヒ゛−スの安定性の評価は一定量（２００
μｇ／ｌ　）σ）β２−ミクログロブリン？含む試料を
参考例２に記成したＥＩＡ法で測定し、対照ビーズ（参
考例１で調製した、ビーズに１％ワシ血清アル）゛ミン
等を含む０．０２　Ｍリン酸緩衝ｉ　ｐ　Ｈ７，３に浸
漬した状態で４°Ｃに保存したもの）を用いて測定した
場合に対明細書の浄書（内容に変更なし） する百分比を活性保持率（＠とじて第２表に示した。

第　２　表 実施例　３ 抗Ｃ−ＲＰ抗体結合ポリ塩化ビニールプレートの安定化 参考例１で調製した抗Ｃ−ＲＰ抗体結合ポリ塩化ビニー
ルプレートを下記の処理液と方法により処理した。

明細書の浄書（内容に変更なし） （ａ）各ウェルの内面をグリセロール溶液に浸漬処理後
乾燥する。

（ｂ）各ウニルミ１％ウシ血清アルブミン含有０．０１
Ｍ　ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，４に浸漬しまたまま保存す
るっ （ｃ）各ウェルを自然乾燥する。

処理後、各プレートを２５°Ｃにて７週間保存し、その
安定性を試験した。抗体結合マイクロプレートの安定性
の評価は一定量（１０００ｎｔ／＝ｔ　）のＣ−ＲＰを
含む試別を参考例２に記載したＥＩＡ法で測定し、対罷
マイクロプレート（参考例１に記載した方法により用時
調製したもの）を用いて測定した場合に対する百分比を
活性保持率（Φとして第３表に示した。

第３表 手続補正書動却 昭和５８年１２月１９日 昭；１１１５８年特許願第１４４２０１号２　発明の名
称 不溶性相体に固定化された免疫活性物質の安定化法及び
該物質を構成単位として含む生理活性物質測定用試薬 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
４　補正命令の日付 昭和５８年１１月２９日（発送日） ５　補正の対象 明細書（２５頁、２７頁及び２８頁）。

６　補正の内容 明細１（２５頁、２７頁及び２８頁）の浄書（内容に変
更なし）。

別紙の通り。

以上 手続補正書 昭和５？年／／月　７日 特許庁長官　殿 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件どの関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。

６、補正の内容 （１）明細書１９頁８行目に記載の「冷所保存した。、
−１の後に改行して次の文章を加入する。

［（４）抗ＣＥＡ（がん胎児性抗原）抗体結合ポリ塩化
ビニールプレートの調製 市販ガラスピーズ（直径６〜７　ｍｍ　）５００個を精
製水にて洗浄後、更にアセトンを加えて洗浄した。次に
２％γ−アミノトリエトキシシラン−アセトン溶液に浸
漬し、室温下で３時間反応させた。

反応終了後、ガラスピーズをアセトン引キ続いて精製水
にて洗浄した。このようにして調製されたアミノ基含有
ガラスピーズを２．５％グルタルアルデヒド水溶液に室
温下にて２面間浸漬処理し活性化した。次いで精製水に
てガラスピーズを充分に洗浄した後、３ダのウサギ抗Ｃ
ＥＡ抗体を含む０、０２　Ｍリン酸緩衝ｍｐＨ７，３，
１００ｍ１ｊＣ浸漬し、４℃にて１６時間反応し抗ＣＥ
Ａ抗体をガラスピーズに結合させた。反応終了後、０．
０２ＭＩＩン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，３にてビーズを洗浄し
、更に０、１５　Ｍ　ＮａＣＡ！、１　％　’７シ血清
アルブミン、１ｍＭ　ＥＤ　Ｔ　Ａ−０，Ｑ　５　％　
ＮａＮ、含有りｙｉ緩衝液ｐ　Ｈ７，３に浸漬し用時ま
で冷所保存した。」（２）明細書２３頁１５行目に記載
の「比色計で測定した。」の後に改行して次の文章を加
入する。

［（４）抗ＣＥＡ抗体結合ガラスピーズを用１ｎｆｃＥ
ＩＡ法によるＣＥＡの測定 試薬 （１）参考例１で得られた抗ＣＥＡ抗体結合ガラスピー
ズ。

（２）　６０μｇ／ゴの標準ＣＥＡ。

（３）ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体。

（４）上記（２）、　（３）の試薬の希釈に用いる。０
．１５ＭＮａＣＡ、１係ウシ血清アルブミン、１ｍＭＥ
　Ｄ　Ｔ　Ａ、　Ｏｉ！［％サリチル酸す）　ＩＩＯム
含有０、０２　Ｍ　ＩＩン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，０゜（５
）６０ｍ９　、Ｑ−・フェニレンジ（６）ｌ、　７　Ｖ
／Ｖ係過酸化水素水（７）上記（５）、（６）の酵素基
質の溶解に用いる、０．０５Ｍクエン酸−０，１Ｍリン
酸緩衝液ｐ　Ｈ４，８゜（８）　１．５　Ｎ　Ｈ２Ｓ　
Ｏ。

（９）上記（５）及び（６）を（７）に溶解した・０−
フェニレンジアミン６０■、１．７％過酸化水素水２０
０μｌをへ含む発色試液２０ｍ１０ 操作法 試薬（４）で希釈した試薬（３）　５００μｌ　に標準
ＣＥＡ溶液５０μｌを添加し１次いで試薬（１）を加え
た後。

３７℃で１８時間反応させる。反応後、０．９％ＮａＣ
１にてビーズを洗浄し、次いで試薬（９）　５　［１０
μｌを加えて酵素反応を開始する。３７℃で３０分間反
応させた後、試薬（８）　３．０　ｍｌを添加して反応
を停止させ反応液の４９２　ｎｍにおける吸光度を測定
する。」 （３）明細書２８頁１行目から同頁６竹目にかけて記載
の「（ａ）各ウェルの内面をグリセロール溶液に・・・
・・・・・・（Ｃ）各ウェルを自然乾燥する。」を次の
と右シ補正する。

「（ａ）各ウェルを４Ｗ／Ｖ％ラクトース溶液に浸漬処
理後乾燥する。

（ｂ）　各ウェルを１係ウシ血清アルブミン含有０．０
２Ｍヘベス緩衝液ｐ　Ｈ７，０に浸漬処理後乾燥する。

（ｅ）各ウェルを１憾ウシ血清アルブミン含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，４に浸漬したまま保存する。

（ｄ）各ウェルを自然乾燥する。」 （４）明細書２８頁に記載の第３表を次のとおシ補正す
る。

「　第３表 」 （５）明細書２７頁１５行目から２８頁にかけて記載の
実施例　３の後に実施例　４を次のとおシ追加する。

［実施例　４ 抗ＣＥＡ抗体結合ガラスピーズの安定化参考例１で調製
した抗ＣＥＡ抗体結合ガラスピーズを精製水で洗浄後、
下記の処理液（ａ）〜（ｈ）に室温下、３０〜４０分間
、浸漬処理した。

（ａ）　５　Ｗ　／　Ｖ　％シヨ糖及び１チウシ血清ア
ルブミンを含む０．０２　Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，０
゜（ｂ）　５ｗ　／　Ｖ　％乳糖を含む０．０２Ｍリン
酸緩（ｔｉｓ液ｐ　Ｈ７，０゜ （ｃ）　５　Ｗ　／　Ｖ％ラマンース及び１．５係水溶
性ゼラチンを含む０．０２Ｍ）リス−塩酸緩衝液ｐ　Ｈ
７，２゜（ｄ）　４　％デキストリンを含む０．０２　
Ｍ　）　＋１スー塩酸緩衝液ｐ　Ｈ７，２゜ （ｅ）　５　Ｗ　／　Ｖ　％　ショ糖を含むＯ，（１２
Ｍ　ヘペス緩衝液ｐ　Ｈ７，２゜ （ｆ）　０．０２　Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，０゜（ｇ
）０．０２Ｍ１リス−塩酸緩衝液ｐ　）Ｉ　７．２゜（
ｂ）　０．０２　Ｍヘベス緩衝液ｐ　Ｈ７，２゜処理後
、室温下にてビーズを自然乾燥した。

この様にして調製したビーズを４０℃の恒温室に保存し
苛酷試験を行なった。抗体結合ビーズの安定性の評価ｌ
こつｂては一定量（６０Ｍｇ／　ｍｌ　）のＣＥＡを含
む試料を参考例２に記載したＥＩＡ法で測定し、対照ビ
ーズ（参考例１で調製した。

ビーズを１係ウシ血清アルブミン等を含ｂＯ，０２Ｍ　
ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，３に浸漬した状態で４℃に保存
したもの）を用すて測定した場合に対する百分比を活性
保持率（俤）として第４表に示した。

第４表 手続補正書 昭和ら９年／７月　２日 １、事件の表示 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件どの関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　％許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５　補正の対象 切器１１、発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄。

及び発明の詳細な説明の欄。

６　補正の内容 （１、発明の名称の欄に記載の「不溶性担体に固安化さ
イ′また免疫活性物質の安定化法及び該物質を構成単位
として含む生理活性物質測定用試薬」を「不溶性担体に
固定化された免疫活性物質の安定化法及び該物質を構成
単位として含む生理活性物質重１１定用試薬」と補正す
る。

（２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。

（３）明細書８頁２行目から同頁３行目にかけて記載の
「糖類溶液、蛋白質溶液並びに低級多価アルコール溶液
の単独若しくは共存下に」を「糖類溶液、若しくは糖類
と蛋白質の共存溶液に」と補正する。

（４）明細書８頁７行目から同頁８行目にかけて記載の
「糖類浴液、蛋白質溶液並びに低級多価アルコール溶液
の単独若しくは共存下に」を「糖類溶液若しくは糖類と
蛋白質の共存浴液に」と補正する。

（５）明細書１２頁１９行目から同頁２００行目かけて
記載の１本発明における蛋白質溶液としては、−１を「
本発明において糖類と共存させる蛋白質としては、」と
補正する。

（６）明細書１３頁２行目から同頁４行目にかけて記載
の１水溶性ゼラチンを精製水あるいは緩衝液に溶解した
蛋白質溶液が挙げられ、」を「水溶性ゼラチン等が挙げ
られ、」と補正する。

（７）明ｉ１ａ：％ｉ：１３頁５行目から同頁９行目に
かけて記載の「更に低級多価アルコール溶液としては・
・・・・・溶解した溶液が好ましく用いられる。」を削
除する。

（８）明細書１３頁９行目から同頁］３３行目かけて記
載の１更に上記の糖類溶液、・・・・・・・・これらを
併用した場合には更に優れた効果が期待できるー」を［
上記の糖類溶液は単独で用いてもよいが、糖類を蛋白質
溶液（蛋白質を精製水ある論は緩衝液に溶解したもの）
に含有させて糖類と蛋白質の共存溶液として用する場合
には更に優れた効果が期待できる。」と補正する。

（９）明細：ｉｌ：１３頁１４行目から１４頁７行目に
かけて記載の「本発明の糖類溶液あるいは蛋白質溶液に
おいて、・・・・・・好ましくは５０〜１００Ｖ／Ｖで
ある。」を［本発明の糖類溶液における糖類のまた糖類
と蛋白質の共存溶液における糖類及び蛋白質の含有量は
通常、該水性物中の浸度がそれぞれ０．１〜１０Ｗ／Ｖ
％　、０．１−２Ｗ／Ｖ％とｆｌる量、好ましくは２．
５−５　Ｗ／Ｖ　％　、　０．５−１．５　Ｗ／Ｖ　％
である。」と補正する。

α０明訓書１４頁８行目に記載の「糖類、蛋白質及び低
級多価アルコール」を「糖類及び蛋白質」と補正する。

（１υ明訓−」、１４頁１８行目から同頁１９９行目力
１けて記載の１−糖類あるいは蛋白質溶液に」を「糖類
溶ｈｖ、又は糖類及び蛋白質の共存溶液に」と補正する
。

αり明細書１５頁５行目に記載の「糖類あるいは蛋白質
溶液中に」を「糖類溶液、又は糖類及び蛋白質の共存溶
液中に」と補正する。

０３明細書１５頁９行目から同頁１５５行目かけて記載
の「一方、組木上に固定保持された・・・・・・・その
まま試薬として有用である。」を削除する。

（１４１明細書２３頁１９行目に記載の［処理液（ａ）
〜（ｆ）」を［処理液（ａ）〜（ｅ）　Ｊ：と補正する
。

θυ明明細１櫨４ グリセロ轡シル溶液」を削除する。

αＱ明明細１ヰ４ リン酸緩衝液ｐ　Ｈ　６．　９　Ｊをｒ（ｅ）　０．　
０　２　Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ　６．　９。」と補正す
る。

０乃明細書２５頁に記載の第１表を次のとおり補正する
。

「　第　１　表 」 α椴明細書２５頁１９行目に記載の「処理液（ａ）〜（
ｆ）」を「処理液（ａ）〜（ｅ）」と補正する。

翰明細書２６頁９行目に記載の「（ｅ）　５０　Ｖ／Ｖ
％グリセロール溶液。」を削除する。

翰明細誉２６頁１０行目に記載のｒ（ｆｌ　０．０２　
Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ６，９゜」をｒ　（ｅ）　０．０
２　Ｍリン酸緩衝液ｐ　Ｈ６，９゜」と補正する。

Ｑ］）明細書２７頁に記載の第２表を次のとお〕補正す
る。

「　第　２　表 」 以上 別紙 ２、特許請求の範囲 （１）担体上に固定保持された免疫活性物質を糖に浸、
潰せ、しめ７ゐことを特徴とする固定化免疫活性物質の
安定化法。

（２）　担体がガラス、シリカゲル、金属酸化物等の無
機物質である特許請求の範囲ｍ１項記載の固定化免役活
性物質の安定化法。

（３）担体がポリスチレン、ポリ塩化ビニール。

ポリプロピレン、ポリエチレン等の合成高分子化合物で
ある特許請求の範囲第１項記載の固定化免疫活性物質の
安定化法。

（４）免疫活性物質が抗原である特許請求の範囲第１項
〜第３項のいずれかに記載の固定化免疫活性物質の安定
化法。

（５）免疫活性物質が抗体である特許請求の範囲第１項
〜第３項のいずれかに記載の固定化免疫活性物質の安定
化法。

た溶液中に浸漬せしめることにより安定化し、た、１゜ 担体上に固定保持された免疫活性物質を構成単位として
含む生理活性物質測定用試薬。

（７）担体がガラス、シリカゲル、金属酸化物等の無機
物質である特許請求の範囲第６項記載の生理活性物質測
定用試薬。

（８）、、担体がポリスチレン９．ポリ塩化ビニール、
ポリプロピレン、ポリエチレン等の合成高分子化合物で
ある特許請求の範囲第６項記載の生理活性物質測定用試
薬。

（９）免疫活性物質が抗原である特許請求の範囲第６項
〜第８項の−ずれかに記載の生理活性物質測定用試薬。

αＱ　免疫活性物質が抗体である特許請求の範囲第６項
〜第８項のいずれかに記載の生理活性物質測定用試薬。

０υ　生理活性物質の測定に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）
を用いる特許請求の範囲第６項〜第１　（１項のめずれ
かに記載の生理活性物質測定用試薬。

αリ　生理活性物質の測定にラジオイムノアノセィ（Ｒ
Ｉ　Ａ　）を用いる特許請求の範囲第６項〜第１０項の
ｂずれかに記載の生理活性物質測定用試薬。

以上

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体上に固定保持された免疫活性物質を糖類、蛋
   白質及び低級多価アルコールから成る群より選ばれた一
   種又は二種以上の浴液中に浸漬せしめることを特徴とす
   る固定化免疫活性物質の安定化法。
2. （２）担体がガラス、シリカゲル、金属酸化物等の無機
   物質である特許請求の範囲第１項記載の固定化免疫活性
   物質の安定化タム。
3. （３）　４１１がポリスチレン、ポリ塩化ビニール。 ポリプロピレン、ポリエチレン等の合成高分子化合物で
   ある特許請求の範囲第１項記載の固定化免疫活性物質の
   安定化弘。
4. （４）免疫活性物質が抗原である特許請求の範囲第１項
   〜第３項のいずれかに記載の固定化免疫活性物質の安定
   化法。
5. （５）　免疫活性物質が抗体である特許請求の範囲第１
   項〜第３項のいずれかに記載の固定化免疫活性物質の安
   定化３ム。
6. （６）糖類、蛋白質及び低級多価アルコールから成る群
   より選ばれた一種又は二種以上の＠液中に浸漬せしめる
   ことにより安定化した、担体上に固定保持された免疫活
   性物質を構成単位として含む生理活性物質測定用試薬。
7. （７）担体がカラス、シリカゲル、金属酸化物等の無機
   物質である特許請求の範囲第６項記載の生理活性物質測
   定用試薬。
8. （８）担体がポリスチレン、ポリ塩化ビニール。 ポリプロピレン、ポリエチレン等の合成高分子化合物で
   おる特許請求の範囲第６項記載の生理活性物質測定用試
   薬。
9. （９）免疫活性物質が抗原である特許請求の範囲第６項
   〜第８項のいずれかに記載の生理活性物質測定用試薬。 αＯ免疫活性物質が抗体である特許請求の範囲第６項〜
   第８項のいずれかに記載の生理活性物質測定用試薬。 剣η　生理活性物質の測定に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）
   ｆｆｉ用いる特許請求の範囲第６項〜第１０項のいずれ
   かに記載の生理活性物質測定用試薬。 ０オ　生理活性物質の測定にラジオイムノアッセイ（Ｒ
   Ｉ　Ａ　）を用いる特許請求の範囲第６項〜第１０項の
   いずれかに記載の生理活性物質測定用試薬。