JPH02504643A - 部位特異的標識化のための放射性ハロゲン化化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 部位特異的標識化のための放射性 ハロゲン化化合物 １．１里生丘！ 本発明は、糖タンパク質組成物の部位特異的標識化のために使用される、放射性 ハロゲン化された化合物に関する。より詳細には、本発明は、モノクローナル及 びポリクローナル抗体及びそれらの断片を含む、放射性糖タンパク質共役体（ｏ ｎｊｕｇａｔｅｓ）を製造するだめの中間体として使用され、その際、放射能標 識は糖タンパク質の酸化された炭水化物残基に部位特異的に結合されたものであ る、放射性ハロゲン化された化合物に向けられる。また、形成された糖タンパク 賞共役体、及び、この共役体の使用方法を包含する。

２、主里坐ＬＬ ヨウ素、臭素、フッ素及びアスクチンの放射性同位元素のような放射性ハロゲン は、種々の診断及び治療上の適用にとって有用である。インビボ又はエヱ旦上旦 で、診断上又は治療上有効な放射性ハロゲンを希望の標的部位に移送するのを高 めるために、放射性ハロゲンは、しばしばタンパク質、殊に、希望の標的部位に 対して特異的な親和性を有する抗体又は抗体断片のような糖タンパク質にカップ リングされる。残念ながら、今日までに開発された放射性ハロゲン化共役体に関 しては、インビボで、標的部位に特異的に局在させ、かつ、非標的部位に移送さ れるのを防止するという抗体の能力を効果的に維持しつつ、同時に、特に甲状腺 を含む非標的部位に、遊離の放射性ハロゲンが望ましくない存在を生ずるという 共役体の脱ハロゲン化を防止するための有効な方法がなかった。

直接放射性ハロゲン化のために必要な酸化反応の条件は有害であり、抗体分子の 免疫特異性を破壊しがちであるので、糖タンパク質、特に、抗体又は抗体断片の 直接放射性・ハロゲン化は不満足なものであった。実際、ある種の抗体は、抗体 の抗原結合力を実質的に破壊することなくしては、直接ハロゲン化することは不 可能である（Ｐｏｗｅ、　１９８６＋　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　１（Ｓｕｐｐｌ、 　　１）：５３９−５４２）　、加えて、例え、抗体活性すなわち抗原を結合す る能力がかなりの程度に維持されるとしても、直接ハロゲン化のなされた抗体は インビボでの通用には不適当である、なぜなら、ハロゲン化は抗体のタンパク基 のチロシン残基で一次的に生ずるからである。

千ロジン等の甲状腺ホルモンを分解するデアイオディナーゼ酵素（ｄｅｉｏｄｉ ｎａｓｅ　ｅｎｚｙｓｅｓ）のような、■に存在する脱ハロゲン化酵素に対して 、かかる構造は感受性を有するため、放射性ハロゲン化チロシン残基は、特に不 適当である。（一般には、Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎら〜１９８０、　　ｉｎ　　 ｔｈｅ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｇｌａｎｄ、　　Ｍ、Ｄｅｖｉｓｓｃｈｅｒ、ｅｄ、 、　　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ８１を参照、）。−抗 体分子の直接放射性ハロゲン化に関連する問題を避けるために、ポルトン−フン チル試薬（Ｂｏｌ　ｔｏｎ＝、Ｈｕｎｔｅｒ）のＮ−スクシニル−３−（４−ヒ ドロキシフェニル−プロピオネート、及びウッド試Ｎ　（Ｗｏｏｄ）のメチル− ４−ヒドロキシベンズイミデートのような小さい分子が放射性ヨード化され、そ して、次に、比較的穏やかなカップリング条件下において抗体分子に結合された 。しかしながら、これらの分子は芳香環の水酸基に対して“オルト”位に放射性 ヨード基を有しており（ここでは、“オルトハロゲン２と呼ばれている）、その 結果、直接に放射性ヨード化された抗体の放射性ヨード化チロシン残基にインビ ボのデアイオディナーゼ酵素が作用するのと同様な影響を受ける。

１９８６年１２月３日に公開されたヨーロッパ特許出願第８６３０３７５７、　 ８号明細書は、水酸基をもたず、かつ、パラ又はメタ位が置換されている芳香環 を使用する、抗体分子の放射性ハロゲン化方法を述べている。この方法は、次の 工程を必要とする。：　　（１）　５ｕ（ｎ−Ｂｕ）ｓ及びＳｎＭｅ３から選ば れる有機金属基によるハロアリール化合物のメタル化；　（２）　ＨｇＸｔ、　 Ｈｇ（ＯＡｃ）ｚ、　ＢＸ３又はＢＺ３（ここで、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素で あり、そして、Ｚはアルキル又はアルコキシである。）から選ばれる基による、 生成したアリールスズ化合物の部位特異的な反応における金属転移；（３）次い で、脱メタル化反応によるメタル化化合物の放射性ハロゲン化；及び（４）好ま しくは放射性ハロゲン化の前における、蛋白に結合するための官能基の付加（Ｗ ｉｌｂｕｒら、　１９８６．　Ｊ。

Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌｓ　ＸＸＩＩＩ（１０−１２）　：　１３０４−０６も参照）。

ヨーロッパ特許出願第８６３０３７５７．８号の方法及び組成物と異なり、本発 明の組成物は、商業的に容易に入手しうる出発物質を使用して短時間に容易な方 法により形成される、水酸基、アルコキシ又はヒドロキシアルコキシ基により活 性化された芳香環からなる放射性ハロゲン化された芳香族化合物を含む。加えて 、本発明は芳香基のわずられしいメタル化を避ける。かように、本発明の方法は 、化合物が土佐に投与されたときに、問題を生ずる水銀のような未反応金属やあ らゆる残留物を除去するための精製工程を必要としない。水酸基、アルコキシ又 はヒドロキシアルコキシ基は、本発明の放射性ハロゲン中間体の水溶性を高めろ る。この組成物は、さらに、抗体分子の抗原結合領域の一部でなく、又、それに 関係もしない、抗体の酸化された炭水化物基に、部位特異的に結合するための反 応性アミン基を有する。こうして、本発明の組成物と方法は、治療上又は診断上 効果のある放射性ハロゲン基の不ヱ胚での標的への移送にとって、特に好都合で ある。

本発明の方法と組成物は、簡単で効果的な方法、及び、インビボにて標的部位に 選択的に存在し雷非標的部位には存在せず：そして、生体に投与されたときに、 放射性ハロゲンを容易に遊離しない、放射性ハロゲン化化合物の組成物という長 く望まれていた必要性のために意図され、そして、これを満足するであろう。

３．２里■！ｈ 本発明は、水酸基、アルコキシ又はヒドロキシアルコキシ基により活性化された 芳香環で、この活性基のパラ位が放射性ハロゲンで置換されている、放射性ハロ ゲン化された芳香化合物を提供する。本発明の放射性ハロゲン化化合物の由来す る芳香化合物は、アルキル、ヒドロキシアルキル、エステル、アルキルエステル 、又は、塩素、臭素、トシレート等の脱離基により置換されたアルキル基、又は 、第１級ないしは第２級アミノ基で置換されたアルキル基等の封鎖基を活性基に 対してオルトに有し、この結果、放射性ハロゲン基が置換しても、これは“オル ト”位には存在しない。

本発明の化合物は、さらに、治療上有用な部位特異的に結合した放射性ハロゲン 化抗体共役体を形成するために、抗体又は抗体断片の酸化された炭水化物との反 応に利用される、反応性アミンを含む。

本発明の放射性ハロゲン化化合物は次式の化合物である： 式中、ＲＩ＝水素、アルキル、ヒドロキシアルキル；Ｒ２＝　酸ヒドラジド、ア ルキル酸ヒドラジド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルフェニルヒド ラジン、アルキルアミン又はアルコキシアミン； Ｒ３−水素、アルキル又はＲ２。

Ｒ４＝アルキル、ヒドロキシアルキル又はＲ２：及び ミニヨウ素、臭素、フッ素又はアスタチンの放射性同位元素。

本発明の放射性ハロゲン化化合物は、放射性ハロゲンが糖タンパク質分子の酸化 された炭水化物基に共有結合を介して部位特異的に結合しているモノクローナル 及びポリクローナル抗体の共役体を含む、放射性糖タンパク質共役体を製造する ための中間体として有用である。

本発明は、さらに、抗体共役体を含む放射性ハロゲン化組成物、及び、本発明の 放射性ハロゲン化合物を使用する共役体の製造方法を提供する。共役体は、非共 役の抗体又は抗体断片と実質的に同一の免疫特異性を保持する。これらの方法及 び組成物は、インビボで標的部位に選択的に存在し；非標的部位には存在せず； インビボに投与されたとき、簡単には遊離の放射性ハロゲンを放出しない、放射 性ハロゲン化抗体共役体のための、簡単で効果的な方法及び組成物を提供する。

本発明は、さらに、抗体共役体の製造方法、及び、インビボにおける多くの治療 的及び診断的な適用に関する共役体の使用方法を提供する。本発明の放射性ハロ ゲン化糖タンパク質共役体は、また、研究目的のために使用される。

図面の簡単な説明 本発明の詳細な説明、実験例、及び、これに付された図を参照することにより、 一層完全に理解することができる。

第１図は、腫瘍発生動物又は非腫瘍発生動物に投与した後の、放射性ヨード化抗 体共役体の生物学的半減期（日）を表わす２１群と５群は、ＣＹＴ−０３０３− ８７２，３共役体を受けた；２群と４群は、ｐＨ６，０でＮａＣＮＢＨａにより 処理されたＣＹＴ−０３０３−８７２，３；　３群と６群は、ｐＨ４，７５でＮ ａＣＮＢ）１ａで処理されたＣＹＴ−０３０３−Ｂ７２．３　、及び４群と８群 はヨードビーズ（商標）を使用して直接放射性ヨード化された８７２．３抗体を 受けた。実験の詳細については、本文を参照。

第２図は、腫瘍発生動物に投与した後における、放射性ヨード化共役体の、器官 ／血液比として示される、生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を表わ す。１〜４群は、第１図に示されのと同一のＩｌｌ瘍発生動物である。

第３図は、グラム当たりの注射された用量のパーセント　（％ＩＤ／ｇ）として 表わされた、放射性ヨード化共役体の生体分布を表わす。１〜４群は、第１図及 び第２図に示されたと同一の腫瘍発生動物である。

第４図は、（Ａ）腫瘍発生動物及び（Ｂ）非腫瘍発生動物に投与した後の、器官 ／血液比として示される、放射性ヨード化共役体の生体分布を表わす。１群はＣ ＹＴ−０３０３−Ｒ７２，３共役体（非還元）；２群はＰＨ＝６．０で還元され たＣＹＴ−０３０３−Ｒ７２，３共役体；３群はＣＹＴ−０３２５−８７２，３ 共役体；及び４群はＣＹＴ−０３２４−Ｒ７２，３共役体を受けた。

実験の詳細については本文を参照。

５．発明の詳細な説明 本発明は、放射能標識が糖タンパク質分子の酸化された炭水化物基に部位特異的 に結合している、放射性槽タンパク質共役体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を製造する ための中間体として有用である新規な放射性ハロゲン化化合物に向けられる。糖 タンパク質が抗体又は抗体断片であるときは、酸化された炭水化物基は、分子の 抗原結合部位の一部分ではなく、また、直接にこれに関連するものではない。本 発明の放射性ハロゲン化化合物を使用して製造される放射性抗体共役物は、共役 していない抗体分子と実質的に同一の免疫特異性を保持する。

本発明の放射性ハロゲン化化合物は、放射性ハロゲンに対して環の°パラ”位に 存在する水酸基、アルコキシ又はヒドロキシアルコキシ基の存在により゛活性化 ”された芳香環である、芳香族化合物誘導体から成る０本明細書を通じて使用さ れるとき、“活性化された芳香族化合物°なる語句は、水酸基、アルコキシ又は ヒドロキシアルコキシ置換基を有する芳香族化合物を含むことを意味する。活性 化された芳香族化合物が放射性ハロゲン化されるとき、この放射性ハロゲン基が “パラ”位に付加し、°オルビ位に付加しないようにするために、放射性ハロゲ ン化化合物が由来する活性化された芳香族化合物は、活性基の“オルト位に存在 する、例えば、アルキル、ヒドロキシアルキル、エステル、アルキルエステル、 又は塩素、臭素、トシレート等の脱離基により置換されたアルキル基、又は第１ 級ないし第２級のアミンにより置換されたアルキル基等の封鎖基を有する。かよ うにして、本発明の放射性ハロゲン化化合物は、“オルト”位に放射性ハロゲン が置換することに関連するあらゆる固有の代謝性の不安定性を回避し、そして、 ■に投与されたとき、本発明の放射性ハロゲン化化合物は脱ハロゲン化酵素によ る脱ハロゲンに抵抗する。

５．１．　　　・　ハロ°ン　　ム 本発明の放射性ハロゲン化化合物は、次式で表わされる： 式中、Ｒ’寥水素、アルキル、又はヒドロキシアルキル；Ｒ２−酸ヒドラシト、 アルキル酸ヒドラジン、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルフェニルヒ ドラジン、アルキルアミン、又はアルコキシアミン； Ｒ３−水素、アルキル又はＲ２； Ｒ４１＝＝アルキル、ヒドロキシアルキル又はＲｚ　。

及び ミニヨード、臭素、フッ素及びアスクチンからなる群より選ばれるハロゲンの放 射性同位体。

本明細書において使用されるとき、“アルキル“なる語は炭素数１〜４の直鎖又 は分枝鎖をもつアルキルを含むことを意味する。

本発明の放射性ハロゲン化化合物は、さらに、臨床上有用な部位特異的に結合し た放射性ハロゲン化抗体共役体を形成するために、抗体又は抗体の断片の酸化さ れた炭水化物基との反応のために使用される反応性のアミン基を含む。

本明細書において使用されるとき、“反応性アミン。

なる語は、アルデヒド基と反応し、水を排除して、Ｃ＝Ｎ結合を形成する、アミ ン含有基を含むことが意図される。かようにして、“反応性アミン２は、限定さ れるものではないが、ヒドラジノ、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、アルキル ヒドラジン、アルコキシアミン基等を含む。

本発明の例示しうる放射性ハロゲン化合物は、これに限定されるものではないが 、２−ヒドロキシ−３−）ｆルー５−”ハロベンゾイルヒドラジド：２−ヒ）’ ワキシー３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−”ハロベンゾイルヒドラ ジド；２−（２，３−ジヒドロキシ）プロポキシ−３−メチル−５−＊ハロベン ゾイルヒドラジド；２′−ヒドロキシ−３′−メチル−５′−”ハロヒドロシン ナモイルヒドラジド；２−ヒドロキシ−３−メチル−５−１ハローα−アミノト ルエン；等を含む（ここで、°ハロは放射性ハロゲン基を表わす）。

例示される放射性ヨード化化合物は、限定されるものではないが、２−ヒドロキ シ−３−メチル−５−”ヨードベンゾイルヒドラジド；２−ヒドロキシ−３−（ ２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−”ヨードベンゾイルヒドラジド；２−（ ２，３−ジヒドロキシ）プロホキシー３−メチル−５−″ヨードベンゾイルヒド ラジド；２′−ヒドロキシ−３′−メチル−５′−１ヨードヒドロキシシンナモ イルヒドラジド；２−ヒドロキシ−３−メチル−５−″ヨードーα−アミノトル エン等を含む（ここで、“ヨードはｌ−１２３、ｌ−１２５、Ｉ　−１３１等の 放射性ヨード基を表わす）。

本発明で使用される放射性ハロゲン基は、ｌ−１２３，１−１２５，１−１３１ 等のヨウ素；　Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｂｒ−７７等の臭素；　　Ｆ−１８等 のフッ素；及びＡｔ−２１１等のアスタチンの放射性同位体のすべてを含む。特 定の放射性ハロゲンは、所望の放射性共役体の意図される用途により選ばれる。

ガンマカメラを使用する、■における画像診断の適用のためには、ｌ−１２３及 びｌ−１３１が好ましい、陽電子断層撮影画像を使用する生体における診断画像 処理のためには、Ｆ−１８、Ｂｒ−７５及びＢｒ−７６が好ましい。一方、特別 のラジオイムノアッセイを含む４７ビトロでの適用にとっては、ｌ−１２５及び Ｉ　−１３１が好ましい。インビボでの治療上の適用にとっては、好ましい放射 性ハロゲンはｌ−１３１、Ｂｒ−７７及びＡｔ−２１１を含む。

５．２．　　　・　ハローン　　Ａ　のり゛古本発明の放射性ハロゲン化化合物 は、次の反応の概要にしたがって製造される： アルキル、ヒドロキシアルキル、エステル、アルキルエステル、又は塩素、臭素 、トシレート等の脱離基により置換されたアルキル基、及び、第１級又は第２級 アミノ基からなる群より選ばれ、そして、“活性基２に対してオルト位に存在す るこれらの封鎖基を有する°活性化された”芳香族化合物は、放射性ハロゲン化 されて、中間体を形成し、次に、下記反応概要１．２又は３により反応性アミン 基が結合して、本発明の放射性ハロゲン化化合物を形成する。

放射性ハロゲンが、例えば、ヨウ素又は臭素の放射性同位体のようにイオン形で 存在する場合には、放射性ハロゲン化は、活性化された芳香族化合物を、クロラ ミン−Ｔ；ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ商標：　ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）；ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ商標：　Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）等の酸化剤の存在下に、適当な溶媒中、ハ ロゲンの放射性及び非放射性の塩の混合物と反応させることにより達成される。

放射性ハロゲンがフッ素又はアスクチンの放射性同位体のように分子状で存在す る場合は、酸化剤は必要ではなく、そして、放射性ハロゲン化は、単に、活性化 された芳香族化合物を適当な溶媒中において、放射性及び放射性ハロゲンの非放 射性の同位体の混合物と反応させることにより達成される。

本発明の−の態様に従って、反応性アミン基は次の概要による置換反応を使用し て、放射性ハロゲン化された中間体に結合する。

、入土：躯」− ここで、ＯＲはメチルエステル、エチルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステル等のエステｎはＯ，Ｌ　２，３又は４である。

この態様において、放射性ハロゲン化芳香族エステルは適当な溶媒に溶解し、そ して、少なくとも１当量のヒドラジン分解剤、例えば、無水ヒドラジンと反応さ せる。この反応のためエステルが溶解するが、エステル又はヒドラジン分解剤と は反応しない、いかなる溶媒も有用である。混合物は、出発物質が実質的に反応 する迄室温で撹拌され、そして、所望の目的物は、例えば、溶媒の除去により分 離される。形成された放射性ハロゲン化化合物の、抗体分子の酸化された炭水化 物基に部位特異的に結合させるために利用される反応性アミン基は、酸ヒドラジ ド又はアルキル酸ヒドラジドである。

本発明の他の態様は従って、次の概要によ・リジアゾ化反応を使用して、反応性 をアミン基は放射性ハロゲン化中間体に結合される： ここで、ｎは０，１，２．３又は４を示す。

この態様において、酸性水溶液中の第１級アミンを含有する放射性ハロゲン化中 間体を、少なくとも等量のニトロソ化剤、例えば亜硝酸等と反応させる。次に、 生成した水溶液を、塩化スズ等の還元剤と反応させる。

所望の放射性ハロゲン化化合物は、常法により、例えば、酸性化して所望のヒド ラジンを形成させる、沈澱、又は、溶媒の除去等により、水溶液から分離される 。

抗体分子の酸化された炭水化物基に部位特異的に結合させるために使用される、 生成した放射性ハロゲン化化合物の反応性アミン基は、ヒドラジン、アルキルヒ ドラジン又はアルキルフェニルヒドラジンである。

本発明のさらに他の態様に従って、次式による置換反応により、反応性アミン基 が放射性ハロゲン化中間体に結合される。

ここで、Ｙは非放射性ハロゲン基、例えば、Ｃ】、Ｂｒ等、又はトシレート基等 の脱離基であり；２はＮＨ，又はＮＲ（Ｒはアルキル、水酸基又はｎは０．１． ２．３．又は４を表わす。

このＢ欅において、非放射性のハロゲン、トシレート基のような脱離しうる基を 有する放射性ハロゲン化中間体は、相応の溶媒に溶解され、そして、ヒドラジン 分解剤又はヒドロキシルアミンと反応させられる。

反応混合物は室温で攪拌され、又は、反応が実質的に完了する迄、加熱される。

所望の生成物は、例えば、溶媒の除去により分離される。抗体分子の酸化された 炭水化物基に部位特異的に結合させるため、生成した放射性ハロゲン化化合物の 反応性アミン基は、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルフェニルヒドラ ジン又はアルコキシアミンである。

実際には、概要Ｉに従う本発明の方法は、２−ヒドロキシ−３−メチル−５−′ ″ヨードベンゾイルヒドラジド次のように形成される例により示すことができる ： 十分量のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中のヨー化ナトリウムとナトリウム１２ ５−ヨーシトの約１．１等量の混合物に、メチル−２−ヒドロキシ−３−メチル ベンゾエートが加えられ、均一な溶液を得る。約１．１等量のクロラミン−Ｔが 導入され、そして、レドランジ（ｒｅｄｏｒａｎｇｅ）反応混合物が室温で２時 間放置される。

少なくとも１．５当量の飽和千オ硫酸ナトリウムと１０倍量の水が反応ガラス瓶 に加えられる。生成した白色のスラリーがクロマトグラフィーのカラムに注がれ 、無機不純物は水（約１０ｄ）で洗浄することにより溶出される。所望の生成物 は１０Ｉｄのメタノールで溶出され、そして、４当量の無水ヒドラジンがメタノ ール分画に加えられる。この反応溶液は約１８時間還流され、そして、次に、溶 媒が蒸発されて、所望の生成物を得る。

放射性ハロゲン化化合物の生成は、１層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又は高性 能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニターすることができ、そして 、所望の化合物はＨＰＬＣ又はカラムクロマトグラフィーにより精製することが できる。

５．３．　　　　　・に　ム　た丑″ 本発明に従って、放射性ハロゲン化化合物は、有利には、部位特異的に結合する 放射性抗体、共役体を製造するために使用される。放射性の抗体共役体は、ロッ ドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）らに発行された米国特許第４．６７１．９５８号明 細書に記載された方法により製造される（又、１９８６年３月２６日に公開され たヨーロッパ特許第８５４０１７７６、１号を参照）。

要約すると、抗体の抗原結合領域の一部ではなく、又、それに関連しないか、又 はその外側に存在する、抗体又は抗体の断片の炭水化物側鎖は、選択的に酸化さ れ、又、酵素的に修飾されて、アルデヒド基を形成する。生成したアルデヒドは 、アミン基（例えば、アンモニア誘導体ヒドラジノ基、酸ヒドラジド、フェニル ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アルコキシアミン等）と反応し、ヒドラゾン 、フェニルヒドラゾン、オキシム又はそれらの置換誘導体及びそれらの還元形を 形成する。

５．３．１．皿止坐化至負去五 抗体分子の炭水化物の部分又はその基の酸化は、アルデヒド基の生成を導く。過 ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、ナトリウムメタペリオデート及びカリウムメタペリ オデート等の種々の酸化剤が使用できる。これらの中で、酸素酸及びその塩が好 ましい、というのは、二次又は不所望の副反応がより少ないからである。一般的 な議論については、Ｊａｃｋｓｏｒ＋＋　１９４４．Ｉｎ　　ＯｒｇａｎｉｃＲ ｅａｃｔｉｏｎｓ　２＋　ｐ３４１　：　Ｂｕｎｔｏｎ＋　１９６５＋　０ｘｉ ｄａｔｉｏｎ　ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、（Ｗｉｂｅ ｒｔ　ｅｄ、）、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ３ ６７を参照されたい。

これらの酸化剤による抗体の酸化は、既知の方法で実施できる。この酸化におい て、抗体は水溶液の形態で、一般には、１００■／ｄ以下、好ましくは１〜２０ ■／−の濃度で使用される。酸化剤として、酸素酸又はその塩が使用されるとき は、−ｉには水溶液の形態で使用され、そして、濃度は一般には０．００１〜１ ０ｍＭ、好ましくは１．０〜１０ａＭである。酸素酸又はその塩の量は抗体の種 類に依存するが、−ｉには例えば、酸化しうる炭水化物の量の２〜１０倍の過剰 で使用される。しかしながら、最適の量はルーチンの実験により決定することが できる。

抗体を酵素酸又はそれらの塩で酸化する工程における、最適の範囲は、ｐＨが約 ４〜８、温度が０〜３７℃、及び、反応時間が約１５分から１２時間である。

抗体の酸素酸又はそれらの塩による酸化の間、光は、好ましくは、糖タンパク賞 の過剰の酸化を防止するために遮断される。

５．３．２．鼠囮坐鼠素桓方抜 抗体分子の炭水化物部位の酸化は、また、酵素ガラクトースオキシダーゼで行う ことができる（Ｃｏｏｐｅｒら。

１９５９、　Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ＋、　２３４　：　４４５−４４８）、抗 体は、水溶液で使用され、濃度は一般には０．５〜１０■／−である。

酵素は、一般には、約５．５〜８．０のｐ）ｌの範囲で、溶液ＩＩｄ当たり約５ 〜１００単位で使用される。酵素反応に及ぼすｐＨ，基質濃度、緩衝剤及び緩衝 剤の濃度の影響は、クーパーら（１掲）により報告されている。

炭水化物の部位と、反応性アミン、例えば、ヒドラジノ、ヒドラジド、フェニル ヒドラジン、アルキルヒドラジン、アルコキシアミン等を有する放射性ハロゲン 化化合物を反応させて製造される。即時に生成する化合物は、最初の付加物から 水分子を脱離させて得られる炭素−窒素二重結合を有する： アルデヒドとヒドラジドの反応の一般的な議論については、１９７８年３月のＩ ｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏ ｎｓ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　ＭｃＧｒａｗ　 ＨｉｌｌＣｏ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ８２４−８２５を参照。

約０．５〜２０■／−の濃度の酸化された抗体の溶液が放射性ハロゲン化化合物 と混合され（抗体のアルデヒドに対する反応性アミン基のモル比の範囲は約１〜 １０．０００である）、そして、溶液は約１〜２４時間インキエベートされる。

適当な温度は０〜３７°Ｃで、ｐＩ（は約６〜８である。

抗体共役体が形成された後、これらは、適宜、ナトリウムシアノボロヒドリラド 又は水素化ホウ素ナトリウムのような適当な還元剤で安定化される。還元剤は、 約４．０〜６．５のｐＨで、利用しろるアルデヒドに対して約１０〜５００倍の モル過剰で加えられる。一般的な議論については、Ｊｅｎｔｏｆｔ　ａｎｄ　Ｄ ｅａｒｂｏｒｎ＋　１９７９．Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５４　：　４３５９を参照されたい。

驚くべきことに、抗体共役体の生物学的半減期は、放射性ハロゲン化化合物の反 応性アミン基と抗体の酸化された炭水化物のアルデヒド基の間で形成される共有 結合の還元の程度を変えることにより、コントロールすることができることが見 い出された。　（正第７を参照）。例えば、ｐＨが約４．０〜４．７５で結合を 還元すると、ｐＨが６．０で還元したもの、又は、全く還元しないものに比べて 、生物学的半減期を増大する。インビ±での通用に依存して、抗体共役体は有利 には修飾して、所望の生物学的半減期をもつ共役体を得る。

５．４．五−一生 いかなる抗原又はハプテンの決定基に対する抗体をも、本発明において使用して もよい。通常のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方とも適当であ るが、モノクローナル抗体は幾つかの利点を提供する。各モノクローナル抗体は 、１つの抗原決定基に対して特異的である。加えて、この分野の当業者にとり既 知の手法を使用すれば、大量の実質的に均一なモノクローナル抗体を効率的に、 かつ、経済的に製造しうる。

本願を通じて使用されるように、°抗体”なる語は、抗体分子の抗原決定領域の 一部でなく、また、これに直接関連しない炭水化物基を含有する、いかなる抗体 断片及び全抗体分子をも含むことを意図する。抗体断片は、これに限定されない が、半抗体分子（ｈａｌｆ　ａｎ−ｔｉｂｏｄｙ　ａ＋ｏｌｅｃｕｌｅ）　（単 純型（ｓｉｎｇｌｅ　ｈｅａｖｙ）　：軽鎖対）、Ｆａｂ、　Ｆａｂ″又は（Ｆ ａｂ’）ｚ断片を含むものが、抗体共役体を製造するために使用することができ る。

本発明の一〇ＢｔｌＡにおいて、放射性ハロゲン化抗体の断片共役体は、本発明 の可溶性の放射性ハロゲン化共役体を活性化したチオールプロテアーゼ酵素と反 応させ、ここに参考文献として言及する米国特許出願第１５２、２０９号に記載 のようにして、抗体（Ｆａｂ”）２放射性ハロゲン化化合物共役体を形成させる ことにより、製造することができる。

本発明の他の態様において、部位特異的な共有結合のために利用しうる増大され た数のマンノース基を有する抗体を、反応概要に従って使用することができる。

この°高マンノース°抗体を使用して形成される共役体は、放射性ハロゲン化化 合物の共有結合のために利用しうる多数の部位のために、より高い特異的放射能 を有しうる。°高マンノース”抗体は、継続中の米国特許出願第１５３．１７５ 号に記載されており、これは、ここに参考までに記載する。

ＩｇＧ、　Ｉｇｌｌ及びＩｇＡを含むクラスの抗体が、本発明の方法で使用され る。

上述のように、いかなる抗原又はハブテンのいかなる決定基に対する抗体も、こ こに述べた反応概要において使用することができる。かかる決定基は、これに限 定されないが、次のものの決定基を含む：腫瘍及び悪性腫瘍細胞、細菌の、カビ の、ウィルスの、寄生虫の、マイコプラズマの、組織適合性、分化（ｄｉｆｆｅ ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）及び他のｍ脂膜抗原、病原体表面抗原、毒素、酵素、ア レルゲン、薬物、あらゆる生物学的に活性な分子等。例えば、異なる抗原決定基 に対して反応性のモノクローナル抗体の組みあわせも使用できる。

５．５．息−一部 本発明の放射性ハロゲン化抗体共役体は、インビトロでの診断上の利用のみなら ず、インビボでの種々の治療上、診断上の利用のための好適に使用される。

本発明の−のＬ！様に従って、抗体共役体がインビボでの応用のために使用され る。

この態様において、放射性ハロゲン化抗体共役体は、それらがインビボでの投与 に適するように水溶性を有する。細胞の障害に対して免疫特異的であり、これに 関連する特別の抗原又は抗原決定基に免疫反応性であるという抗体基の特性は、 組成物を特異的な細胞、組織、又は器官、又は、抗原基を存するインビボの他の すべての部位に、治療剤又は診断剤を移送するのに理想的に適合するものとする 。生体Ｃ弓おける脱ハロゲン化酵素（ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ　ｅｎｚｙ ｍｅｓ）による脱ハロゲン化に抵抗するという本発明の抗体共役体の放射性ハロ ゲン化化合物基の特性は、組成物を、非標的組織、特に甲状腺へ遊離した放射性 ハロゲンが好ましくない蓄積を起こすことなく、インビボで使用するために理想 的に適合するものとされる。かようにして、常法により製造された放射性ハロゲ ン化抗体共役物に比べて、意図した標的部位に存在し、特に肝臓及び肺臓を含む 非標的部位及び甲状腺には分布しないという　（後記、第７章参照）、よりすぐ れた生体分布は、本発明の組成物を、標的部位における剤の持続性が望まれると きのインビボでの治療的又は診断的な放射性同位体の移送にとって特に適したも のとする。

加えて、前述の５．３で説明したように、本発明の抗体共役体は適当な還元剤で の処理により安定化することができる。生成した共役体の生物学的半減期は、還 元条件のｐｎを選択することによって、抗体の酸化された炭水化物基と放射性ハ ロゲン化化合物の反応性アミン基との間の共有結合の還元の度合をコントロール することにより、コントロールすることができるという知見が得られた。（後記 ７を参照）、こうして、驚くべきことに、本発明の共役体を使用すると、インビ ボに投与される治療上又は診断上の共役体の生物学的半減期をコントロールする ための手段を提供しろる。意図された応用に依存して、かかるコントロールは特 に重要である。例えば、血栓症又は血液の塊りの部位を撮影する際には、血液の 滞留のより迅速なりリアランスを達成することが望まれ、そして、それゆえ、よ り短かい生物学的半減期が好ましい。これは、放射性ハロゲン化化合物と抗体残 基の間の共有結合を還元しないことにより達成される。他方、治療上の応用にと っては、より迅速な、又はよりゆるやかなりリアランスが、線量の処方、放射性 同位体の物理的半減期等を含む多くの変数に基づいて望まれるであろう、生物学 的半減期又はクリアランスの調節は、本発明の抗体共役体中の共有結合の還元の 度合（又は非度合）を変えることにより達成することができる。

インビボの投与は、ヒト血清アルブミン等の他のタンパク質を有するか、又は、 有しない、血清又は生理食塩水を含む、あらゆる適当な担体中に水溶性の放射性 ハロゲン化抗体共役体を含む、治療上有効な組成物又は診断用組成物の使用を含 むことができる。抗体共役体の線量は、当業者により容易に決定することができ 、結合した放射性ハロゲン化化合物及び共役体の意図した目的の性質によって、 異なるであろう。

投与経路は、一般には腹腔内であるが、一般的に好ましいのは静脈経路による投 与である。

この出願において使用されるとき、“細胞障害１という語は、すべてのＩＩ瘍、 例えば、ガン、アデノーマ、過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｓ）等；対宿主性 移植片病（例えば、骨髄移植）を含むある種の免疫障害；免疫抑制障害（例えば 、後天性免疫不全症（エイズ）、腎又は骨髄移植後）：アテローム動脈硬化症プ ラークの形成に関連するような心血管症等；ウィルス、バクテリア、カビ、マイ コプラズマ又は寄生性の剤等により引き起こされた感染等。

治療上の適用は、一般に、放射性ハロゲンが治療剤である、放射性ハロゲン化抗 体共役体の有効量を投与することによる細胞障害の治療を含む、好ましい治療上 有効な放射性ハロゲンは、ｌ−１３１、Ｂｒ−７７及びＡｔ−２１１を含む。

診断上の通用は、一般に、一定の時間的枠内における標的組織での共役体の検出 又は局在化を可能とするために、有効量の水溶性の抗体放射性ハロゲン化共役体 を投与することによる、特定の組織又は細胞障害の撮像を含む。診断目的のため に、抗体に結合した放射性ハロゲン化化合物は、影像装置を使用して検出するこ とのできる、放射性同位体を含む。種々の放射性ハロゲン化された基が、撮像目 的のための共役体を製造するのに適する。　　ｌ−１２３やｌ−１３１のような 放射性同位体は、検出のためにガンマカメラを使用する映像にとって好ましい。

Ｆ−１８、Ｂｒ−７４及びＢｒ−７６のような陽電子を放出する放射性ハロゲン は、陽電子断層撮影画像を使用する映像にとって好ましい。

造影できる組織及び細胞障害は（あらゆる固体腫瘍、リンパ腺、上皮小体、肺臓 ならびに腎臓のようなある種の器官、炎症又は感染部位（例えば、かかる部位の マクロファージ）、心筋梗塞又は血栓症、（ネオアンチゲン決定基又はフィブリ ン、血小板）等を含む。

本発明の他の態様に従って、抗体共役体はインビト二での適用のために使用され る。二のａ様において、放射性ハロゲン化抗体共役体は水溶液中に溶解してもよ く、また、代わりに、プレート、ビーズのような固体の不溶性の支持体に結合さ せて固定してもよい、放射性ハロゲン化抗体共役体は、有利には、種々の工ｌビ トロでのアッセイにおいて、ＵＳ及び悪性腫瘍の細胞、細菌の、カビの、ウィル スの、寄生性の、マイコプラズマの組織適合性、鑑別、及び、他の細胞膜抗原、 病原菌表面抗原、毒素、酵素、アルレゲン、薬物、あらゆる生物学的に活性な分 子等の抗原又は抗原決定基を検出するために使用される。４ｙＥ上旦での適用に とって、ｌ−１２５及びｌ−１３１のような放射性ハロゲンが好ましい。

次の非制限的な例は発明を一層明らかにする゛ために役立つものであり、決して 、これを制限することを意図するものではない。

（本頁以下余白） ６．２−ヒ゛ロキシー３−メチル−−１ヨードベン゛イルヒト−シト（ＣＹＴ− ０３０３の制゛告（式中、”Ｉはｌ−１２５を示す。）は、次のようにして、本 発明に従って製造された： 活性化された芳香族エステルメチル−２−ヒドロキシ−３−メチルベンゾニー） 　（ＣＹＴ−０２２９，１）が、放射性ヨード化されて、中間体メチル−２−ヒ ドロキシ−５−ヨード−３−メチルベンゾエート　（ＣＹＴ−０３００，３）を 形成し、これは、続いてヒドラジン分解されてＣＹＴ−０３０３を与える。反応 の概要は次に表わされる。

実際には、１０ｄの丸底フラスコに、化合物１を１２．０■、Ｎ、Ｎ−ジメチル ホルムアミド（Ｄ肝）０．５成、Ｎａ−ｌ−１２５溶液１４．２＋ａＣｉ　（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｔｓ。

ＩＬ）及びクロラミン−７２０，２ｍｇ（Ａｌｄｒｉｃｈ、　！’Ｉｉ１ｗａｕ ｋｅｅ。

罰、化合物２）を詰める。反応混合物を、室温で攪拌しながら約１５分インキュ ベートした。次に、ＮａＩ　１０．８ｇ　（０，０７２ミリモル）を加え、そし て、混合物を室温で約１．７５時間インキュベートした。過剰のヨード分子は飽 和の千オ硫酸ナトリウム水溶液２．０−を加えてクエンチされ、そして、生成し た白色スラリーをＲＰ−１８抽出カートリツジ（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ）上に注いだ。無機不 純物は水１０．０−によりカートリッジからフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）され、そ して、所望の中間体Ｃ買−０３００（３）がメタノール１５．０ｄを使用して溶 出された。次いで、無水ヒドラジン（ＮＨｚＮ）ｌｘ）　０．４−をメタノール 分画に加え、そして、透明で無色の反応混合物は約６０°Ｃで１８時間還流され た。溶媒が７発され、白色残渣を得た。残渣は、１．　Ｏ−ずつ３回計３．０− の水で洗浄され、約１６４μＣｉ／μｍｏｌｅの比放射活性を有するＣＹＴ−０ ３０３（３）　９．７８ｍＣ１を得た。ＴＬＣ１５０％エチルアセテート／ヘキ サン、Ｋ、ｆシリカゲル、短波Ｕν視覚化において：Ｒｆ、０．２゜ ７、ＣＹＴ−−丑′ル　　の　　゛れた次の実験は、抗体分子の酸化された炭水 化物基に部位特異的結合された、本発明の放射性ヨード化化合物を使用して製造 された放射性ヨード化抗体共役体は、（ａ）“オルト”のヨード基をもち、同様 に部位特異的に結合された放射性ヨード化化合物を使用する、又は、（ｂ）非特 異的又はランダムに抗体分子に結合する放射性ヨード化化合物を使用する、いず れかにより製造される類似の共役体に比較して、実験動物にインビボで投与され たとき、すぐれた生体分布を示したことを説２個の放射性ヨード化化合物、即ち 、抗体の酸化された炭水化物基に部位特異的な共有結合するのに適したアミン基 及び°オルト°ヨード基を有する３、５−ショートグリシル−し−チロシン（Ｃ ＹＴ−０３２５）　；及び、抗体のアミン基に非特異的又はランダムに結合する 反応性のカルボキシル基をもつ、５−ヨード−３−メチルサリチル酸、Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル（ＣＹＴ−０３２４）は、次のようにして製造さ れた。

（本頁以下余白） ７．１．１．　３５−　”ショートゲージルーし一チロシンｃｙ丁−０の卸Ｐ告 次の反応スキームに従って、製造された。

実際には、１０ｊｄの丸底フラスコに、グリシル−し−チロシン水和物０．０１ ｇ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ’、Ｌｏｕｉｓ＋間、、　４ ）　、ＰＢＳ緩衝液ｐ）ｌ−７，４１，０ｍ、ヨー化ナトリウム０．０１５ｇ及 びＮａｌ−１２５５，１３ｍＣ１（Ａｎ＋ｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）を詰めた 。反応混合物は、透明で均一な混合物が得られる迄、室温で２、速に攪拌した。

次に、２　（Ａｌｄｒｉｃｈ。

Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　ＷＩ）の０．０２２ｇを一部ずつ加えた。生成した橙赤 色の混合物を室温で１．５時間、攪拌しながらインキュベートした０次に、飽和 のチオ硫酸ナトリウム水溶液（０，５ａｆ）を加え、減圧時溶媒を留去すると、 白色のワックス状の残渣を得る０次に、このワックス状の残渣を、ＲＰ−１８ク ロマトグラフイーカートリツジを通して　（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏｗｐａｎｙ＋　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ。

ＮＪ）　、水ＩＱ、Ｑａｆ、次いで、メタノール１０．ＯＪｄを使用して、溶出 した。メタノール性分画から溶媒を蒸発させると、白色のワックス状の固体とし てＣＹＴ−０３２５を得た。

収量：　０．０２０ｇ（１２４ｕ　Ｃ３／　ｕ　１Ｉｌｏｌｅの比放射性活性を もつ５、１　ｍｃｉ）。

７．１．２．　　−”ヨー゛−−メ　ルサ１チル″″　Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステル（ＣＹＴ−０３２ｍ激 ３−メチルサリチル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＹＴ−０３ ２３）の放射性ヨード化により製造された。

次の反応スキームに従って、製造された。

実際には、２００ｊｄの丸底フラスコに、３−メチルサリチル酸（Ａｌｄｒｉｃ ｈ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ、　Ｍｉ１ｗａｕｋｅｅ＋　ＷＬ　５）、２２．６７ｇ 、エチレングリコールジメチルエーテル５０．０ｄｌ。

及び、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６）　１７．１５ｇを詰め、そして、混 合物を約Ｏ″Ｃに冷却した。ついで、５０．０ｍのエチレングリコールジメチル エーテルに溶解された１、３−ジシクロへキシルカルボジイミド（７）３０．７ ５ｇを冷反応混合物に加えた。反応混合物を冷却浴からとり出し、内部の温度を 徐々に、約２０〜２５°Ｃに上昇させた。生成した白色スラリーは室温で約７２ 時間攪拌した；そして、次いで、濾過して、生じた沈澱物を除去した。減圧下濾 液を蒸発させると、黄白色の固体残渣を得る。黄白色残渣を１５０．０Ｏｄの熱 イソプロピルアルコール中に溶解し、この溶液を約２０〜２５℃に冷却し、そし て、約１８時間室温に放置した。沈澱したＣＹＴ−０３２３は、濾過により白色 固体として得られ、そして、４０°Ｃ１３０■Ｈｇ圧で濾過ケーキを乾燥した。

収量：３３．３９ｇ　　（９０％）。ＴＬＣで２５０％エチルアセテート／ヘキ サン、Ｋ、ｆシＩＪカゲル、短波ＵＶ視覚化：　Ｒｆ　Ｏ，６゜造された： 実際には、１０Ｉｌｉの丸底フラスコに、ＣＹＴ−０３２３を１０．０■、ＰＢ Ｓ緩衝液ｐＨ−７，４を１．０Ｊ１１１！、アセトニトリル（ＣＢＩＣＮ）　２ ．０ｄ及びヨー化ナトリウム８．０■及びＮａ−ｌ−１２５（Ａ＋ｍｅｒｓｈａ ＋ｅ　Ｃｏｒｐ、、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｔｓ＋　ＩＬ）　３．３５＋ａＣｉ を詰めた。均一な溶液が得られたら、クロラミン−Ｔ１１．４■を加えた０反応 混合物は、適宜攪拌しながら、約１．５時間室温で放置させた。次に、未反応の ヨード分子を、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液１．０−を加えて、クエンチした 。所望のＣＹＴ−０３２４化合物は、抽出カートリッジから、メタノール１０Ｊ ｄで溶出した。溶媒をメタノール分画から混合すると、約８２．７μＣ３／μｏ ＋ｏｌｅの比放射活性をもつＣ買−０３２４を約５．ｈｇ（１，１ｍｃｉ）得た 。

ＴＬＣで２５０％エチルアセテート／ヘキサン、Ｅｍ−６０シリカゲル（ＥＭ　 ５ｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｅｒｒｙ旧１１．Ｒａｈｗａｙ、　ＮＪ）　、短波ＵＶ視 覚化：　Ｒｆ、　０．５６゜ ７．２．筑迷共役生ｄ盈 この実験で使用される抗体は、Ｓｃｈｌｏｍらに発行された米国特許第４．５２ ２．９１８号明細書に記載されたハイブリドーマセルラインＡＴＣＣ随Ｂ７２． ３（以下、”８７２．３抗体”）から得られたヒトの胸部及び結腸の癌と反応す るネズミ（ｍａｒｉｎｓ）モノクローナル抗体であった（Ｎｕｔｉら、　１９８ ２．　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　５３９−４５を参照）、二 〇Ｂ７２．３抗体は、ＬＳＩ７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）ヒト結腸アデノカルチノー マ細胞を含む多くの腫瘍性の細胞に見い出される抗原と反応性である。

７．２．１．　　　　　　ＣＹＴ−０３Ｏｆ”ＣＹＴ−０３０３がＢ７２．３抗 体の酸化された炭水化物基に部位特異的に結合した、多くのＣＹＴ−０３０３− ８７２，３共役体が製造された。８７２．３抗体の炭水化物残基は、最初に、抗 体のアリコツト（ａｌｉｑｕｏｔ）を、１５００〜５０００倍モル過剰の過ヨウ 素ナトリウム（ＮａｌＯ−）　１０ミリモルと、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ＝６．０中、 暗室で１時間反応させることにより酸化された。酸化された抗体は、次いで、リ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、ＮＡＰ−２５カラムにて、脱塩した。２ ０倍のモル過剰のＣＹＴ−０３０３を十分量のＤ？ｌＦ　（約１０〜２０％）を 含有するアセテート緩衝水溶液ｐＨ＝５．０中で抗体と均一な溶液が得られる迄 反応させることによって、ＣＹＴ−０３０３を抗体の酸化された炭水化物基に結 合させた。共役反応は、室温で約５〜８時間道行させた。すべての共役体は、性 成したあらゆる凝集物を除去するために、ＰＢＳ　ｐＨ＝　７．４で溶出された 、ＴＳＫ−３０００高性能液体クロマトグラフィーカラムを使用して、精製され た。

ある場合においては、共役体中のＣＹＴ−０３０３と抗体の酸化された炭水化物 基の間の部位特異的結合を形成するヒドラゾン結合は、ナトリウムシアノボロヒ ドリド（ＮａＣＮＢＬ）と反応させて還元した。ＮａＣＮＢＨｚは、アセテート 緩衝水溶液中の酸化した８７２．３抗体とＣＹＴ−０３０３に、ｐＨ４，５〜６ ．０で、約４０００モル過剰にして加えられ、そして、反応混合物は４°Ｃに１ 晩インキユベートした。

次に、還元された共役体は、生成した凝集物を除くために、ｐＨ＝７．４で、Ｐ ＢＳで溶出されるＴＳＫ−３０００）ｉＰＬｃカラムを使用して、精製された。

７．２．２．　　　亡　　・ＣＹＴ−０３２ｆ””上記７．２．１で記載したよ うに、Ｂ７２．３抗体の酸化された炭水化物に部位特異的にＣＹＴ−０３２５が 結合した、ＣＹＴ−０３２５−８７２，３共役体が製造された。これらの共役体 は、ヨード置換基がＣＹＴ−０３２５のフェノール性領域の水酸基に対して“オ ルビに存在する点で、７．２．１で記載したものとは明らかに相違する。

ＣＹＴ−０３２５は、抗体を約２０００モル当量のＮａＣＮＢＨ３を含有するＰ ＢＳ緩衝液中で、ｐＨ＝６．０にて、約１０００から１モル過剰にしてＣＹＴ− ０３２５と（ＮＡＰ−２５カラムでの脱塩の後に）反応させることにより、８７ ２．３抗体の酸化された炭水化物基にカップリングされた。４　’Ｃで１晩イン キユベートを進行させ、そして、得られた共役体は、凝集物を除くために、ｐＨ ＝１．４でｐＢｓ緩衝液を使用して、ＴＳＭ−３０００ＨＰＬＣカラムを通して の溶出により、精製された。

７　−２．３．　　　　　　　　亡　　　　　　・ＣＹＴ−０３２４丑″ＣＹＴ −０３２４のＮＨＳエステル基のカルボキシル基が、次のように、抗体分子のア ミンにランダムに、又は、非部位特異的に結合した、ＣＹＴ−０３２４−Ｂ７２ ．３共役体が製造された： ＣＹＴ−０３２４（３ｍｇ、　　８．４　μｍｏｌｅ）を、０．４蔵のＤＭＦと ０．６雌のＰＢＳ　（ｐＨ＝７．４）に懸濁した。８７２．３抗体（６５０μｆ 　ＰＢＳ、　ｐ）］＝７．４中の３．４■）を、５５μｌのＣＹＴ−０３２４／ ＤＭＦ懸濁液（約０．１６５ｍｇ　ＣＹＴ−０３２４）に加え、抗体に対し約２ ０倍のモル過剰のＣＹＴ−０３２４を含む反応混合物を形成させた。反応混合物 は、４°Ｃで１時間インキュベートした；次に、約４０モル過剰のグリシンを加 え、未反応のＣＹＴ−０３２４を消費した。非部位特異的に結合したＣＹＴ−０ ３２４−８７２，３共役体は、生成した凝集体を除去するために、ＰＢＳ緩衝液 ｐＨ＝７．４を使用して、ＮＡＰ−１０カラムを通じて、溶出することにより精 製した。

７．３．−生２？、Ｊニ目１生血 ８７２、３抗体が特異的に作用する標的抗原を存する腫瘍移植片を生ずる動物に 投与することにより、本発明のＣＹＴ−０３０３共役体の生体分布を、類憤のＣ ＹＴ−０３２４共役体、ＣＹＴ−０３２５共役体、並びに、ヨードビーズ登録商 標で直接に放射性ヨード化された８７２．３抗体の生体分布と比較するために、 一連のインビボの実験を行った。

実験の各系列において、一群の非Ｉ！Ｉ瘍の“正常”の動物をコントロールとし て使用した。すべての動物は、無制限の濾過した水とプリナラボラトリーローデ ニトチョウ＃５０１０で飼われた。

インビボの実験は、次のようにして実施された。

簡単に述べると、腫瘍発生動物は、ｎｕ／ｎｕスイスマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ　 Ｆａｒ＋ａｓ、　Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、　ＮＹ）　（６退会から６　ケ月令： 　１Ｂ　　３０ｇ）　ニ１０’　ノＬＳ１７１４　ヒ）　結ＢＩＡ７　テ／　カ ルチノーマ細胞（０，２ｍｅ）を皮下注射することにより得られた。すべての注 射は、左背部のわき腹にされた。

腫瘍が触知できたとき、すなわち、約１０−１５ミリ×１５−２０ミリの大きさ のとき、実験動物は４匹ずつの相応の群にわけられた。コントロールの“正常” スイス、又は、Ｂａ１ｂ　ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ、　Ｇｅｒｍ ａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）も、３匹ずつ、同等の群にわけられた。すべての実験的、 及び°コントロール”の動物には、次に、測したアリコツトの相応のｌ−１２５ −放射性ヨード化−Ｂ７２．３共役体が与えられた（０日目）。動物の放射能は 、注射後直ちに、かつ、３日間毎日、線量測定器を使用して測定された。３日目 に動物を殺し、重量を測定し、そして、器官は種々の組織における放射能レベル を測定するために、切開した。切開の直前に、血液試料が採取された。すべての 組織試料の放射能が線量測定器を使用して測定された。

１のインビボ実験において、次の放射性ヨード化８７２．３共役体の生物学的半 減期が直接に比較された：（１）ヒドラゾン結合が還元されていないＣＹＴ−０ ３０３−Ｂ７２．３　；　（２）ヒドラゾン結合がｐＨ−６，０でＮａＣＮＢＨ ４を使用して還元した、即ち、部分的に還元されたＣＹＴ−０３０３−８７２， ３；　（３）　　ヒドラゾン結合がｐ）Ｉ＝４．７５でＮａＣＮＢＨ，を使用し て、即ち、実質的に還元されたＣＹＴ−０３０３−８７２，３；及び（４）ヨー ドゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ登録商標）に代えてヨードビーズ（Ｔｏｄｏｂｅａｄｓ 登録商標：　Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａＩ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆ ｏｒｄ、　ＩＬ）を使用した、Ｃｏ１ｃｈｅｒらの方法に従って（１９８４，Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４：５７４４−５１）、ヨードビーズを使用して直接 に放射性ヨード化された８７２．３抗体。得られた結果は、第１〜３図に示され ている。

第１図に示したように、非還元ＣＹＴ−０３０３−Ｂブ２．３共役体の生物学的 半減期は、腫瘍発生（第１群対第４群）又は非腫瘍発生（第５群対第８群）の動 物のいずれに投与した場合においても、直接に放射性ヨード化された８７２．３ 抗体のそれよりも有意に小さかった。一方、それぞれｐＨ＝６．０（第２群）及 びｐＨ＝４．’？ｓ　（第３群）で、ＣＹＴ−０３０３−８７２，３共役体のヒ ドラゾン結合を還元すると、生物学的半減期を約１日から約３日と約７日に明ら かに増大させ、即ち、腫瘍発生動物に投与したとき、直接に放射性ヨード化され たＢ７２．３抗体のそれとは有意には変わらなかった（第４群と比較）。このよ うに、放射性ハロゲン化化合物のアミン基と抗体の酸化された炭水化物基との間 で形成される共有結合の還元の度合をコントロールすると、インビボに投与され たときの共役体の生物学的半減期を調節しうることは明らかである。

加えて、同じ実験において、試験した４個すべての共役体の腫瘍／血液比は実質 的に同一であったのにかかわらず、直接に放射性ヨード化された８７２．３抗体 の甲状腺／血液比は、ｐｎ＝ｓ、ｏ又はｐＨ＝４．７５のいずれかで還元された ＣＹＴ−０３０３−８７２，３共役体のそれの約７倍であった（第２図）、さら に、第３図に示したように、直接に放射性ヨード化された８７２．３抗体の腫瘍 のグラム当たりの注射された線量のパーセントはＣＹＴ’−’０３０３−Ｂ７２ ．３共役体（ｐＨ＝４．７５で還元された）のそれの約２倍であったが、ＣＹＴ −０３０３−８７２，３共役体を受けた動物の甲状腺における放射性ヨードのパ ーセントは、通常の放射性ヨード化抗体を受けた動物で観察されたそれのわずか 約１７１６であった。

このように、本発明の部位特異的に結合したＣＹＴ−０３０３共役体は、通常の 直接放射性ヨード化された標的特異的抗体に比較すると、非標的の甲状腺部位へ の放射性ヨードの損失を実質的に少なくしつつ、腫瘍部位へ明らかに有利に移送 することを示していることは明らかである。■に投与されたとき、本発明の放射 性ハロゲン化共役体を使用すると、脱ハロゲン化はより少なく生ずるようにみえ る。

他の実験において、次の放射性ヨード化抗体共役体の生体分布を上述のようにし て比較した：　（１）　ＣＹＴ−０３０３−８７２，３（非還元）；（２）　ｐ Ｈ−６，０でＮａＣＮＢＨａで還元されたＣＹＴ−０３２５−８７２，３；　（ ３）　ＣＹＴ−０３２５−８７２，３；及び（４）ＣＹＴ−０３２４−８７２， ３゜結果は、第４図（Ａ及びＢ）において、それぞれ腫瘍発生及び非腫瘍発生動 物に対して与えられている。

第４図（Ａ及びＢ）において明らかに示されているように、本発明に従って部位 特異的に結合した共役体を受けた動物（第１群及び第２群）、及び、“オルト” のヨード基をもつ部位特異的に結合したＣＹＴ−０３２５共役体（第３群）及び 非部位特異的に結合したＣＹＴ−０３２４共役体（第４群）の動物において、放 射性標識化された抗体共役体の器官／血液比は実質的に同一であったが、標的の 腫瘍細胞及び非標的の組織、殊に、第１群から３群の動物の肝臓及び肺臓への放 射性標識の生体分布において、第４群の動物に比較して有意の差があった。

第４Ａ図に示されるように、腫瘍発生動物において、腫瘍における器官／血液の 比は、部位特異的に結合する共役体を受けた動物においては（第１〜３群）、非 特異的に結合する共役体受けた動物（第４群）に比べて、約２倍大きかった。

一方、第４　（Ａ及びＢ）図は、腫瘍発生及び非腫瘍発生動物において、非標的 の肺臓の器官／血液比は、非特異的に結合する共役体を受けた動物においては、 部位特異的に結合する共役体を受けたものに比べて（第１〜３群）、約５倍以上 大きかったことを示している。同様に、第４　（Ａ及びＢ）図は、本発明の部位 特異的な共役体を受けたものに比べて（第１及び２群）、非部位特異的に結合す る共役体（第４群）を受けた動物においては、望ましくない非標的肝臓への放射 能標識の移送が約５倍大きかったことを示している。部位特異的に結合した共役 体を受けた動物について、本発明の共役体とは異なって、“オルト”のヨード基 をもつ第３群のみが、肝臓への放射性標識の実質的な移送を示した。これは、脱 ハロゲン化され、もはや、抗体共役体に結合していない放射能標識を表わすかも しれない、実際、ＣＹＴ−０３２５共役体、及び、ＣＹＴ−０３２４共役体の肝 １ｔｉ／血液比はＣＹＴ−０３０３共役体（非還元及び還元の両方）のそれより も、それぞれ、約４倍及び５．５倍大きかった。加えて、ＣＹＴ−０３２５共役 体の肺臓／血液の比は、ＣＹＴ−０３０３共役体のそれの約３倍であった。

要約すると、インビボで投与されたとき、本発明の部位特異的に結合した共役体 は、通常の放射性ヨード化された共役体と同様、又は、一層良好に、意図した標 的部位に移送され、そして、肝臓や肺臓といった非標的部位には移送されないこ とが明らかである。加えて、有意に脱ハロゲン化される直接放射性ヨード化され た抗体に対比して、“オルト”ヨード基をもたない本発明の放射性ヨード化され た抗体共役体は、インビ、ホ、で投与されたとき、有意には脱ハロゲン化されな い。

それゆえ、インビボでの実験は、本発明の共役体はインビボの標的への移送にと って、すぐれた化合物であることを示している。

ここに記載され、請求された発明は、ここに開示された特別のｙｆ！ｉ、ｔ−！ Ｊによる範囲に限定されるべきではない、というのは、これらの態様は本発明の いくつかの局面を示すものとして意図される。いかなる同等の態様も、この発明 の範囲内にあると意図される。実際、ここで示され、かつ、記載されたものに加 えて、本発明の種々の変更が、上記の記載より、本分野の当業者にとって明らか であろう。かかる変更も、この出願の請求の範囲内にあることが意図される。

ＢＯ半減期（日） 器管／血管 ■Ｄ／グラム 器管／血液 器管／血液 国際調査報告 自ｌＩｕ＋ａａ勧ＢＲａ嗜＾零ＩＩ１．（・１ゆ？Ｍ、ｐＱ〒／１ｊｓ９Ｑ／ｌ ’ｌ）−ａｇ１フＩＮ？ＥＲＮＡＴ工０ＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ 、　ＰＣＴ１０５８９１０２４６７Ｉ工工、　　　ＣｌａＬｍｓ　　１０−１１ 　　ｄｒａｗｎ　　ｔ？　ａ　　ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　ｔｒｅａｔｍｅｎ ｔ　　ｏｆ　　＝@　ｅｅ工１ｕｌａｒ ｃｌｉｓｏｒｄｅｒ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｘｎ　Ｃ１ａｓｓ　４２４５ｕｂ ｅｌａｓｓ　８５．９Ｌ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼の化合物。 ［式中、 Ｒ１＝水素、アルキル又はヒドロキシアルキル；Ｒ２＝酸ヒドラジド、アルキル 酸ヒドラジド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルフェニルヒドラジン 、アルキルアミン又はアルコキシアミン； Ｒ３＝水素、アルキル又はＲ２； Ｒ４＝アルキル、ヒドロキシアルキル又はＲ２；及び ＊Ｘ＝ヨウ素、臭素、フッ素又はアスタチンの放射性同位体。〕
2. ２．＊Ｘがヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、臭素−７５、臭 素−７６、臭素−７７、フッ素−１８及びアスタチン−２１１よりなる群から選 ばれるものである、請求の範囲第１項記載の化合物。
3. ３．２−ヒドロキシ−３−メチル−５−＊ヨードベンゾイルヒドラジド；２−ヒ ドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−＊ヨードベンゾイルヒ ドラジド；２−（２，３−ジヒドロキシプロポキシ−３−メチル−５−＊ヨード ベンゾイルヒドラジド；２′−ヒドロキシ−３′−メチル−５′−＊ヨードヒド ロシンナモイルヒドラジド；及び２−ヒドロキシ−３−メチル−５−＊ヨード− α−アミノトルエン（ここで、＊は放射性ヨード置換基である）よりなる群から 選択される、請求の範囲第１項記載の化合物。
4. ４．２−ヒドロキシ−３−メチル−５−ヨードベンゾイルヒドラジド（ここで、 ＊は放射性ヨード置換基である）。
5. ５．放射性ハロゲン化化合物のアミンと抗体又は抗体断片の酸化された炭水化物 基との間で共有結合を介して結合した式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ１＝水素、アルキル又はヒドロキシアルキル；Ｒ２＝酸ヒドラジド、アルキル 酸ヒドラジド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルアミン又はアルコキ シアミン； Ｒ３＝水素、アルキル又はＲ２； Ｒ４＝アルキル、ヒドロキシアルキル又はＲ２；及び ＊Ｘ＝ヨウ素、臭素、フッ素又はアスタチンの放射性同位体 である。］ のアミン含有放射性ハロゲン化化合物を含む放射性ハロゲン化抗体共役体であっ て、上記酸化された炭水化物基は抗体又は抗体断片の抗原結合領域の一部ではな く、また、これに直接関連するものではなく、そして、共役体のアミンはヒドラ ジノ、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アルキルヒドラ ジン及びアルコキシアミンから選ばれた放射性ハロゲン化化合物の反応性アミン に由来するものであり、そして、この共役体は、（ａ）非共役抗体又は抗体共役 体と実質的に同一の免疫特異性、及び、（ｂ）インビボ投与に適するような水溶 性、により特徴づけられるものである、上記の放射性ハロゲン化抗体共役体。
6. ６．アミン含有放射性ハロゲン化化合物が、２−ヒドロキシ−３−メチル−５− ＊ヨードベンゾイルヒドラジド；２−ヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ プロピル）−５−＊ヨードベンゾイルヒドラジド；２−（２，３−ジヒドロキシ プロポキシ−３−メチル−５−＊ヨードベンゾイルヒドラジド；２′−ヒドロキ シ−３′−メチル−５′−＊ヨードヒドロシンナモイルヒドラジド；及び２−ヒ ドロキシ−３−メチル−５−＊ヨード−α−アミノトルエン（ここで、＊は放射 性ヨード置換基を表す）から成る群より選ばれる、請求の範囲第５項記載の共役 体。
7. ７．放射性ハロゲン化化合物が２−ヒドロキシ−３−メチル−５−＊ヨードベン ゾイルヒドラジド（ここで、＊は放射性ヨード置換基である。）である、請求の 範囲第５項記載の共役体。
8. ８．抗体又は抗体断片がモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片である 、請求の範囲第５項記載の共役体。
9. ９．抗体断片が、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ′）２断片、（Ｆａｂ′）断片及び半抗 体分子よりなる群から選ばれる、請求の範囲第５項記載の共役体。
10. １０．放射性ハロゲン化化合物のアミンと抗体又は抗体断片の酸化された炭水化 物基との間で共有結合を介して結合した式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ１＝水素、アルキル又はヒドロキシアルキル；Ｒ２＝酸ヒドラジド、アルキル 酸ヒドラジド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルフェニルヒドラジン 、アルキルアミン又はアルコキシアミン； Ｒ３＝水素、アルキル又はＲ２； Ｒ４＝アルキル、ヒドロキシアルキル又はＲ２；及び ＊Ｘ＝ヨウ素、臭素、フッ素又はアスタチンの放射性同位体 である。〕 で表わされるアミン含有放射性ハロゲン化化合物を含む、放射性ハロゲン化抗体 共役体であって、上記酸化された炭水化物基は抗体又は抗体断片の抗原結合領域 の一部ではなく、また、これに直接関連するものではなく、そして、共役体のア ミンはヒドラジノ、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、ア ルキルヒドラジン及びアルコキシアミンから成る群より選ばれた放射性ハロゲン 化化合物の反応性アミンに由来するものであり、そして、この共役体は、（ａ） 非共役抗体又は抗体共役体と実質的に同一の免疫特異性、及び、（ｂ）インビボ の投与に適するような水溶性によって特徴づけられるものである、上記の放射性 ハロゲン化抗体共役体の治療上有効な量を、動物又はヒトに投与することを特徴 とする、細胞障害の治療方法。
11. １１．＊Ｘがヨート−１３１、臭素−７７又はアスタチン−２１１である、請求 の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．（ａ）（ｉ）放射性ハロゲン化化合物のアミンと抗体又は抗体断片の酸化 された炭水化物基との間の共有結合を介して結合された式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ１＝Ｈ、アルキル又はヒドロキシアルキル；Ｒ２＝酸ヒドラジド、アルキル酸 ヒドラジド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジン、アルキルフェニルヒドラジン、 アルキルアミン又はアルコキシアミン； Ｒ３＝水素、アルキル又はＲ２； Ｒ４＝アルキル、ヒドロキシアルキル又はＲ２；そして ＊Ｘ＝ヨード、臭素、フッ素又はアスタチンの放射性同位体 である。］ のアミン含有放射性ハロゲン化化合物を含む放射性ハロゲン化抗体共役体であっ て、上記酸化された炭水化物基は抗体又は抗体断片の抗原結合領域の一部ではな く、また、これに直接関連するものではなく、そして、この共役体のアミンはヒ ドラジノ、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、フェニルヒドラジド、アルキルヒ ドラジン及びアルコキシアミンから成る群より選ばれた放射性ハロゲン化化合物 の反応性アミンに由来し、そして、この共役体は、（１）非共役抗体又は抗体共 役体と実質的に同一の免疫特異性、及び、（２）インビボ投与に適するような水 溶性によって特徴づけられるものであり、そして、（ｉｉ）特定の組織の抗原決 定基とは免疫反応性、かつ、免疫特異的であり、また、非特異的組織にとっては 実質的に非免疫反応性で、かつ非免疫特異的であり、そして、抗原決定基は非特 異的組織には十分量では見い出せないものである、上記の放射性ハロゲン化抗体 共役体の有効量を動物又はヒトに投与すること；及び （ｂ）この放射性ハロゲン化抗体共役体が特定の組織に存在するかどうかを検出 すること、を含んで成るインビボで特定の組織を造影するための方法。
13. １３．＊Ｘがヨード−１２３又はヨード−１３１である、請求の範囲第１２項記 載の方法。
14. １４．＊Ｘが臭素−７５、臭素−７６又はフッ素−１８である、請求の範囲第１ ２項記載の方法。