JPH0253408B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、人間の血漿からコーン（Chon）法
に従つてエタノールで沈澱させることによつて免
疫グロブリン含有分別物を得そしてこの分別物を
多数回沈澱処理によつておよび沈澱剤としてのポ
リエチレングリコールの使用下に更に精製し、次
いで免疫グロブリンを水溶性重合体によつて沈澱
させそして薬学的製剤に仕上げる、静脈内投与で
きる抗体含有免疫グロブリンを製造する方法に関
する。 人間の生体は、感染を克服した後に、一般に同
じ病原体による２度目の感染に対して保護されて
いる。かかる保護は接種によつても達成され得
る。即ち、これは細胞的および体液的免疫性の形
成に基づいている。細胞的免疫性がリンパ細胞に
よつてもたらされるのに対して、体液的免疫性に
関しては種々の特別な抗体が責任を果している。
抗体は、血液中に現われるグロブリン特性を有す
る高分子蛋白質である。体液的免疫性の充分な形
成には初めの20生存年が必要とされ、特に６生存
月と24生存月との間の期間内には最も僅かしか形
成されない。久しい以前から〔1952、ブルトン
（Bruton）〕抗体が特定の患者の場合不足してお
り（抗体欠乏症候群）、この場合殆んど家族的集
団での発病が問題となることが知られている。か
かる患者は、時々生命を脅かす程と成る度々繰返
される種々の感染に悩む。同様な抗体欠乏状態は
遺伝学的にも生じ得るだけでなく、後天的にも生
じ得そして殆んど選択的または部分的抗体欠乏症
候群（AMS）として生じる。 かかる患者はその欠乏した抗体を形成できない
ので、該抗体を感染の治療またはその阻止の為に
充分な程度に投与しなければならない。かかる代
用品の効能は時間的に限界があり、有効期間は投
与された抗体の生物学的半減期に依存している。
生体中に形成される抗体は３〜４週間の生物学的
半減期を有している。 抗体含有免疫グロブリンが殊にいわゆるコーン
（Cohn）法に従つて人間の血漿を分別することに
よつて〔J.L.オンクレイ（Oncley）、M.メリン
（Melin），D.A.リチヤート（Richert），J.W.カメ
ロン（Cameron）およびP.M.グロス（Gross）・
ジユニアの“人間の血漿の細分別物に、抗体、イ
ゾアグリチン、プロトロンビン、プララスミノゲ
ンおよびβ−リポプロテインを分離すること
（The Separation of the Antibodies，
Isoagglutinins，Prothrombin，Plasmingen
and β−Lipoprotein into Subfractions of
Human Plasma）”、ジヤーナル・オブ・ザ・ア
メリカン・ケミカル・ソシエテイ、第71巻、第
541頁（1949）〕そしてアルコール沈澱処理するこ
とによつて製造できることは公知である。かかる
製剤は確に筋肉的適用には適しているが、静脈内
的適用には適していない。何故ならば、その製造
方法の間に、有害な性質を有する副生成物が生ず
るからである。このものを静脈内注射した場合に
は、度々既に注射の間に、例えば血圧降下の如き
生命を脅かす状態を惹きおこすところの確かに短
時間しか継続しないが非常に強い非相容的反応が
生ずる。静脈内注射できる相容的免疫グロブリン
を得るために、従来には免疫グロブリンを酵素的
に分解するかまたは化学的に変えてきた。これに
よつて免疫グロブリン製剤の治療的効能あるいは
生物学的性質は勿論不利な影響を受けた。免疫グ
ロブリン分子が酵素的処理によつて小さくされそ
してそれによつて抗体の品質が低下されるだけで
なく、その際に生ずる分解生成物が得ようとする
抗原／抗体反応および／またはFc−摂取体の抗
原／抗体−コンプレツクスの形成をも競合的に阻
害する。かかる変質された免疫グロブリンの他の
欠点は、生物学的半減期が短縮されていることで
ある。 化学的に変えられた免疫グロブリンの別の欠点
は、繰返し投与した場合に多分追加的な非相容的
反応をもたらし得る新しい抗原的特異性が現われ
ることである。 静脈内注射に適するガンマーグロブリンの製造
を達成しようとした、従来技術に属する他の方法
（ドイツ特許出願公開第2606118号明細書）では、
血漿−蛋白質懸濁物のポリエチレン−グリコール
での段階的精製およびポリエチレン−グリコール
での沈澱処理を行なつている。ポリエチレン−グ
リコールでの精製段階は出来るだけ低いイオン濃
度のもとで実施する。このことは蛋白質の変質を
避ける為に重要であると見なされている。しかし
ながら極めて低いイオン濃度のもとで分別を実施
することは、確認されている如く、多大の費用を
要し且つ製造された生成物が非相容的徴候を失な
つていない。 更に、静脈内適用の為に特定のガンマーグロブ
リン製剤を、ポリエチレン−グリコール（PEG）
での抗補体的ガンマーグロブリン成分の沈澱処理
後に血漿分別物からヒドロキシ−エチル−澱粉の
存在下に得る方法（AT−PS344883）も従来技術
に属する。この方法でも同様に、完成製剤を副作
用なしに静脈内適用できる為には、かかる精製で
は尚充分でないということが判る。 本発明は、上述の欠点を避けることを目的と
し、酵素的に分解せず化学的に変質させずそして
多量の投与量でも副作用なしに静脈内適用できる
静脈内投与可能な免疫グロブリン製剤を造ること
を課題としている。 この課題は、最初に記した種類の方法におい
て、免疫グロブリン含有分別物を更に精製する際
に多価無機酸の塩、特に硫酸アンモニウム、の水
溶液で少なくとも一回の沈澱処理およびモノ−ま
たはジ−サツカリドの存在下でのポリエチレング
リコールでの少なくとも一回の沈澱処理を行うこ
とによつて本発明に従い解決される。 免疫グロブリン含有分別物は、人間の血漿から
公知のコーン法あるいは変更コーン法によつてエ
タノールでの沈澱処理によつて得そして該分別物
中に含まれるエタノールを、殊に透析によつて、
除くのが好ましい。 本発明の方法の有利な実施形態によれば３つの
精製段階が使用され、詳細には、免疫グロブリン
含有分別物を最初の精製段階において145〜
208g／の硫酸アンモニウム含有量の溶液（25
〜35％の硫酸アンモニウム飽和度）にて5.9〜6.5
のPH値のもとで処理し、沈澱物を分離して廃棄
し、次の沈澱段階に、残つた溶液から268〜
289g／の硫酸アンモニウム含有量の溶液（44
〜47％の硫酸アンモニウム飽和度）にて8.0のPH
値のもとで処理することによつて免疫グロブリン
含有沈澱物を沈澱析出させ、沈澱物を得、水に溶
解しそしてその溶液から殊に透析によつて硫酸ア
ンモニウムを除き、次で残つた免疫グロブリン含
有溶液を第２番目の精製段階においてモノ−また
はジ−サツカリドの存在下に少なくとも0.15のイ
オン濃度で且つ5.8〜6.4のPH値のもとでポリエチ
レン−グリコールでの処理に委ね、生じた沈澱物
を分離して廃棄し、そして残つた溶液を、第３番
目の精製段階においてポリエチレン−グリコール
でのもう一度の処理に6.4〜7.0のPH値のもとで委
ね、その上で新たに生じた沈澱物を分離して廃棄
しそして残つた溶液中のもはや有害汚染物質を含
まない免疫グロブリンをPH値7.0〜7.5のもとで重
合体沈澱剤によつて沈澱させそして薬学的製剤に
仕上げる。 処理のかかる組合せに於ては、第２番目の精製
段階に於て分子量2000〜6000のポリエチレン−グ
リコールを60〜90g／の量で０〜40℃の温度の
もとで沈澱剤として使用することができる。第３
番目の精製段階に於ても2000〜6000の分子量のポ
リエチレングリコールを沈澱剤として有利には70
〜100g／の量で同様に０〜40℃の温度のもと
で使用することができる。 モノ−およびジ−サツカリドは特にグリコー
ゼ、フルクトーゼ、マンノーゼ、ガラクトーゼの
如きモノ−サツカリドまたはサツカローゼ、ラク
トーゼ、マルトーゼの如きジ−サツカリドを、し
かも溶液に対して１〜35重量％、殊に５〜20重量
％の量で使用するのが適している。免疫グロブリ
ンの精製を上記の様に行なうと直ちに、該免疫グ
ロブリンが溶液から、しかも水溶性重合体での沈
澱処理によつて得ることができる。かかる水溶性
重合体としては、エチレンオキサイドとポリオキ
シプロピレンとの共重合体〔バスフ（BASF）社
の市販品“PLURONIC（登録商標）”〕、更にデキ
ストラン、ポリビニル・アルコール、ポリビニ
ル・ピロリドン等が実証されている。ポリエチレ
ン・グリコールも、残留溶液中ポリエチレン・グ
リコールの濃度を高めることによつてしかも
150g／以上に高めることによつて純粋な免疫
グロブリンの沈澱剤として使用することができ
る。次で、沈澱した免疫グロブリンを薬学的製剤
に仕上げる。その際公知の手段を用いることがで
きる。 精製した免疫グロブリンの薬学的製剤への仕上
は、発熱物質不含の水に溶解し、更に透析し、限
外過またはゲル過し、５〜200g／、殊に
50〜160g／に免疫グロブリン濃度を調節しそ
してNaClによつて0.005〜0.3、殊に0.1〜0.2にイ
オン濃度を調整することによつて行なうのが有利
である。 最終生成物中に含まれる血漿蛋白は、少なくと
も80％が、沈澱係数Ｓ＝７でそして21〜28日の生
物学的半減期を有する天然の免疫グロブリンより
成つている。この生成物の抗補体活性は、C′H₅₀
単位を中和する為に少なくとも35mgの蛋白質を必
要とする様な値に相当する。更に、本発明に従つ
て製造される製剤は、160000より多い分子量を有
する蛋白成分を５％より少ない量でしか含有して
いない事を特徴としている。 本発明に従う方法を以下の実施例によつて更に
詳細に説明する。 実施例 １ 人間の血漿をPH値7.0〜7.2に調整しそして−２
℃の温度に維持する。該溶液に８重量％のエタノ
ールを添加し、その際に本質的には綿維素原を含
有している沈澱物が生ずる。この沈澱物を分離除
去した後にエタノール濃度を25重量％に高めそし
て温度を−６℃に下げる。沈澱した、実質的に粗
免疫グロブリンより成る沈澱物をホスフエート・
アセテート緩衝剤中で抽出しそして12重量％のエ
タノールとPH値5.3で２℃のもとで混合する。沈
澱物（アルフアーおよびベーターグロブリンを含
有している）を廃棄しそして上澄みのエタノール
濃度をPH値7.2温度−10℃のもとで25重量％に高
め、それによつて免疫グロブリンを沈澱させる。
こうして製造され集められたペースト状免疫グロ
ブリン分別物を本発明に従つて以下の様に再び処
理する： １Kgの免疫グロブリン−ペーストを２の0.9
％NaCl溶液に撹拌下に溶解しそして透析する。
その後に蛋白質濃度を20g／に並びにイオン濃
度を0.15に調節し、そして6.25のPH値のもとで
176g／の硫酸アンモニウムを添加し（最初の
精製段階）、次で生じた不所望の汚染物含有沈澱
物を廃棄しそして上澄みに別の硫酸アンモニウム
を275g／の濃度に達するまで添加しそして7.2
のPH値に調整する。沈澱する免疫グロブリン含有
沈澱物を水に溶解しそして水道の水に対する透析
に委ねる。次でその溶液に80g／のポリエチレ
ン−グリコールを150g／のグルコーゼの存在
下に6.0のPH値および0.15のイオン濃度のもとで
導入する（第２精製段階）。沈澱物を廃棄しそし
て6.5〜6.6のPH値のもとでポリエチレン−グリコ
ール濃度を98g／に高める。新たに生じた沈澱
物を廃棄する（第３精製段階）。 今度は溶液のポリエチレン−グリコール含有量
を7.2のPH値のもとで180／に高め、それによ
つて汚染物不含の免疫グロブリンが沈澱する。こ
の生成物を遠心分離し、そして五回の洗浄によつ
て尚存在するポリエチレン−グリコールを除く。 実施例 ２ １Kgの免疫グロブリン・ペーストを、実施例１
に記載されているのと同様に、製出しそして処理
する。但し第２精製段階に於てグリコーゼの代り
にフルクトーゼを150g／の量で使用する。 実施例 ３ １Kgの免疫グロブリン・ペーストを、実施例１
に記載されているのと同様に、製出しそして処理
する。但し、第２精製段階に於てグルコーゼの代
りにサツカローゼを150g／の量で使用する。 実施例 ４ 実施例１に記載されているのと同様に人間の血
漿から製出される0.5Kgの免疫グロブリン・ペー
ストを、６の0.9％NaCl溶液中に撹拌下に溶解
しそして限外過によつて該溶液からエタノール
を除く。残つた溶液の蛋白質濃度を20g／にそ
してイオン濃度を0.15に調整し、次で6.7のPH値
のもとで119.5g／の第二リン酸ナトリウムを添
加する（精製段階）。生じる沈澱物を廃棄しそし
て上澄みを水酸化ナトリウムによつて7.2のPH値
に調節し、その際に再び廃棄される新たに沈澱物
が生ずる（精製段階）。その後に275g／の硫酸
アンモニウム溶液を添加する。生じる免疫グロブ
リン含有沈澱物を水に溶解しそして無機塩を除く
為に透析を行なう。その溶液に87.5g／のポリ
エチレングリコールおよび150g／のグリコー
ゼを添加しそしてPH値を6.0に調節する。沈澱物
を廃棄し（精製段階）、残つた溶液のPH値を6.6に
高めそしてポリエチレン−グリコールを更に添加
することによつて溶液のポリエチレン−グリコー
ル濃度を95g／に高める。新たに生じる沈澱物
を廃棄する（精製段階）。今度は、溶液のポリエ
チレン−グリコール含有量を7.2のPH値のもとで
150g／に高める。これによつて汚染物質不含
の免疫グロブリンが沈澱する。この生成物を実施
例１に於ける如く遠心分離しそして洗浄すること
によつて尚存在するポリエチレン・グリコールを
除く。 実施例 ５ １Kgの免疫グロブリンを実施例１に記載されて
いるのと同様に製出しそして処理する。但し、汚
染物質不含の免疫グロブリンを沈澱させる最後の
沈澱処理を、38g／のプルロニツク（Pluronic
（登録商標））F68−このものはエチレンオキサイ
ドとポリオキシ・プロピレンとの共重合体である
−を添加することによつて行ない、その際に同様
に7.2のPH値を維持する。 以下の表に、実施例１〜５に従つて製造された
免疫グロブリンの抗補体活性を掲載する。但し、
その値はE.A.カバツト（Kabat）およびM.M.マ
イヤー（Mayer）の“実験免疫化学
（EXperimental Imm unochemistry）”、トーマ
ス（Thomas）、スプリングフイールド社
（Springfield）、（1961）あるいはパブリツク・ヒ
ールス・モノグラフ（Public Health
Monograph）No.74、“Standerized diagnostic
complemment fixation method and
adaptation to microtest”、ワシントン、（1965）
に従つて測定した。 第１表 以下の実施例に従つて 抗捕体活性 製造された免疫グロブリン 実施例１ 96mg 実施例２ 95mg 実施例３ 101mg 実施例４ 35mg 実施例５ 104mg 実施例１〜５に従つて製造された製品は、第
表に挙げた7S−成分を80％以上の割合で含有し
ている。その測定は、“ヨーロペイシエン・アル
ツナイブツク（Europa¨ischen Arzneibuch）”、
第巻、ドイチエル・アポテケル（Deutscher
Apotheker）出版、シトツトガルト（1975）に従
つて分析的限外遠心分離機で行なつた。その際、
ホスフエートー緩衝溶液の状態でPH6.0〜8.0そし
てイオン濃度が少なくとも0.2である１％溶液
（容積％）を測定に委ねた。 第表 以下の実施例に従つて 7S成分 製造された免疫グロブリン 実施例１ 95.5％ 実施例２ 95.5％ 実施例３ 98.4％ 実施例４ 88.0％ 実施例５ 98.2％ 実施例１〜５に従つて得られた免疫グロブリン
をナトリウム・ドデシル−サルフエート−ポリア
クリルアミド−ゲル−電気泳動〔SDS−PAGE，
Ｋ・ウエバー（Weber）およびＭ・オスボルン
（OSborn）、ジアーナル・オブ・ビオロジカル・
ケミストリー（J.Biol Chem ），244，4406
（1969）〕に従つて別の測定を試みた。その際、得
られた蛋白質の区分判断はその分子量をもとにし
て行われる。実施例１〜５に従つて得られる本発
に従う免疫グロブリン（試料１〜５）の場合、添
付したグラフから判る様に150000の分子量の所に
広帯域が生ずる。 これに対して試料６は、ペブシンで酵素的に分
解された製剤をそして試料７はプラスミン酵素的
に分解された製剤であり、これらの場合には
105000あるいは50000の低い分子量の所に広帯域
が在る。試料８は化学的に変えられた製剤中の分
子量分布を示しており、この場合160000以上の著
しく高分子量の成分が存在しており且つ約50000
の低分子量の成分も存在している。 本発明に従つて製造された製剤を、その血圧を
左右する作用に関して、コーン法に従つて製造さ
れた製剤と比較した。比較試験は麻酔をかけた犬
について行なつた。犬の外頚静脈を下顎の下の辺
縁の所で分割しそして両方の静脈分支にカテーテ
ルを入れて縫つける。更に、頚動脈を自由分割し
そしてカテーテルを入れて縫つける。血圧は動脈
のカテーテルを介して電気的気圧計で測定され
る。麻酔剤および比較すべき免疫グロブリン製剤
はその注入量を一定に維持しながら他の両方のカ
テーテルを介して導入される。血圧値は試験物質
の投与後60分間の間に調整される。その際それぞ
れ縮期血圧値および拡張期血圧値が測定されそし
て平均値が記録される。投与される量はそれぞれ
150mg／Kgである。結果を以下の表に示す。 【表】

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明に従う各実施例の製剤（１〜
５）並びに比較用製剤（６〜８）についてのナト
リウム・ドデシル・サルフエート・ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動をグラフ化したものであ
る。縦軸の数字は分子量を、横軸の数字は製剤番
号を意味する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 人間の血漿からコーン（Chon）法に従つて
   エタノールで沈澱処理して免疫グロブリン含有分
   別物を得そしてこの分別物を多数回沈澱処理によ
   つて且つ沈澱剤としてのポリエチレングリコール
   の使用下に更に精製し、次いで免疫グロブリンを
   水溶性重合体によつて沈澱させそして薬学的製剤
   に仕上げる、静脈内投与できる抗体含有免疫グロ
   ブリンの製造方法であつて、免疫グロブリン含有
   分別物を更に精製する際に多価無機酸の塩での少
   なくとも一回の沈澱処理およびモノ−またはジ−
   サツカリドの存在下でのポリエチレングリコール
   での少なくとも一回の沈澱処理を行う、上記方法
   で製造されそして少なくとも80％が、７の沈澱係
   数Ｓおよび21〜28日の生物学的半減期を有する天
   然の免疫グロブリンでありそして、C′H₅₀単位を
   中和するために少なくとも35mgの蛋白質を必要と
   するのに相当する抗補体活性を有していることを
   特徴とする、上記静脈内投与できる抗体含有免疫
   グロブリン製剤。 ２ 160000より多い分子量の蛋白質成分を５％よ
   り少ない量でしか含有していない特許請求の範囲
   第１項記載の免疫グロブリン製剤。 ３ 人間の血漿からコーン（Chon）法に従つて
   エタノールで沈澱処理して免疫グロブリン含有分
   別物を得そしてこの分別物を多数回沈澱処理によ
   つて且つ沈澱剤としてのポリエチレングリコール
   の使用下に更に精製し、次いで免疫グロブリンを
   水溶性重合体によつて沈澱させそして薬学的製剤
   に仕上げる、静脈内投与できる抗体含有免疫グロ
   ブリンの製造するに当たつて、免疫グロブリン含
   有分別物を更に精製する際に多価無機酸の塩での
   少なくとも一回の沈澱処理およびモノ−またはジ
   −サツカリドの存在下でのポリエチレングリコー
   ルでの少なくとも一回の沈澱処理行うことを特徴
   とする、上記抗体含有免疫グロブリンの方法。 ４ 多価無機酸の塩として硫酸アンモニウムを使
   用する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 免疫グロブリン含有分別物を最初の精製段階
   において145〜208g／の硫酸アンモニウム含有
   量の溶液にて5.9〜6.5のPH−値のもとで処理し、
   沈澱物を分離して廃棄しそして次の沈澱段階にお
   いて、残つた溶液から268〜289g／の硫酸アン
   モニウム含有量の溶液にて8.0のPH−値のもとで
   処理することにより免疫グロブリン含有沈澱物を
   沈澱させて該沈澱物を得、水に溶解しそしてその
   溶液から硫酸アンモニウムを殊に透析によつて除
   き、次いで残つた免疫グロブリン含有溶液を第２
   番目の精製段階においてモノ−サツカリドまたは
   ジ−サツカリドの存在下に少なくとも0.15のイオ
   ン濃度のもとでポリエチレン−グリコールでの処
   理に5.8〜6.4のPH−値のもとで委ね、生じた沈澱
   物を分離して廃棄し、そして残つた溶液を、第３
   番目の精製段階においてポリエチレン−グリコー
   ルでのもう一度の処理に6.4〜7.0のPH−値のもと
   で委ね、その上で新たに生じた沈澱物を分離して
   廃棄しそして残つた溶液中にもはや有害不純物を
   含まない免疫グロブリンをPH−値7.0〜7.5のもと
   で重合沈澱剤によつて沈澱させそして薬学的製剤
   に仕上げる、特許請求の範囲第３項または第４項
   記載の方法。 ６ 第２番目の精製段階においてポリエチレング
   リコール（分子量；2000〜6000）を０〜40℃の温
   度のもとで60〜90g／の量で使用する特許請求
   の範囲５項記載の方法。 ７ 第３番目の精製段階においてポリエチレン−
   グリコール（分子量；2000〜6000）を０〜40℃の
   温度のもとで70〜100g／の量で使用する特許
   請求の範囲第５項記載の方法。 ８ サツカリドとして、グリコーゼ、フルクトー
   ゼ、マンノーゼ、ガラクトーゼの如きモノ−サツ
   カリドまたはサツカローゼ、ラクトーゼ、マルト
   ーゼの如きジサツカリドを１〜35重量％、殊に５
   〜20重量％の量で使用する特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ９ 蛋白質不純物が除かれた免疫グロブリンをデ
   キストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニル
   ピロリドンまたはポリエチレン−グリコール等の
   添加によつて沈澱させる特許請求の範囲第３〜５
   項の何れか一つに記載の方法。 １０ 精製された免疫グロブリンの薬学的製剤へ
   の仕上げを、発熱物質不含の水に溶解し、更に透
   析し、限外濾過またはゲル濾過し、５〜200g／
   、殊に50〜160g／に免疫グロブリン濃度を
   調節しそしてNaClによつて0.005〜0.3、殊に0.1
   〜0.2にイオン濃度を調整することによつて行う
   特許請求の範囲第３〜９項の何れか一つに記載の
   方法。