JPH0256076B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0256076B2 JPH0256076B2 JP60112287A JP11228785A JPH0256076B2 JP H0256076 B2 JPH0256076 B2 JP H0256076B2 JP 60112287 A JP60112287 A JP 60112287A JP 11228785 A JP11228785 A JP 11228785A JP H0256076 B2 JPH0256076 B2 JP H0256076B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- ecor
- gene
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はプラスミドに関するものである。特に
分秘ベクターとして有用なプラスミドに関するも
のである。
分秘ベクターとして有用なプラスミドに関するも
のである。
（発明の構成）
酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を
備え、また、食品、医薬品、飼料等の原料とし
て、人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用
な微生物であり、遺伝子工学に於ける宿主として
の開発が期待されている。
備え、また、食品、医薬品、飼料等の原料とし
て、人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用
な微生物であり、遺伝子工学に於ける宿主として
の開発が期待されている。
しかし、酵母の細胞表層は、細胞膜の外側に強
固な細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術によ
つて生産された有用物質（異種蛋白質）の精製が
困難な場合が多く、精製を簡略化するために、生
産物を菌体外に分泌させる系の開発が望まれてい
る。また、分必生産は連続培養が可能となり、大
幅な生産量の増加が期待され、更に菌体内プロテ
アーゼによる生産物の分解が防止される等そのメ
リツトは大きい。
固な細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術によ
つて生産された有用物質（異種蛋白質）の精製が
困難な場合が多く、精製を簡略化するために、生
産物を菌体外に分泌させる系の開発が望まれてい
る。また、分必生産は連続培養が可能となり、大
幅な生産量の増加が期待され、更に菌体内プロテ
アーゼによる生産物の分解が防止される等そのメ
リツトは大きい。
従来酵母サツカロマイセス・セレビシエのα因
子遺伝子が検討され、その配列が解明されている
［Cell、30巻、933−943頁（1982）］。また酵母α
因子遺伝子のリーダー配列を利用して蛋白質を分
泌させる検討がなされている（特開昭59−132892
号公報、特開昭59−196093号公報）。
子遺伝子が検討され、その配列が解明されている
［Cell、30巻、933−943頁（1982）］。また酵母α
因子遺伝子のリーダー配列を利用して蛋白質を分
泌させる検討がなされている（特開昭59−132892
号公報、特開昭59−196093号公報）。
本発明者等は、酵母を宿主とする遺伝子組換え
技術において、菌体内で生産された有用物質を効
率よく分泌させることのできるシグナルペプチド
を探索した結果、酵母α因子遺伝子のリーダー配
列中の、22残基のアミノ酸配列からなる特定のペ
プチドが蛋白質の分泌活性を示し、このペプチド
をコードするポリヌクレオチドを、所望の蛋白質
をコードする外来遺伝子（構造遺伝子）の上流に
連結したプラスミドを調製して適当な宿主中で発
現させた場合に、目的とする蛋白質を効果的に分
泌させることができることを見出し本発明を達成
した。
技術において、菌体内で生産された有用物質を効
率よく分泌させることのできるシグナルペプチド
を探索した結果、酵母α因子遺伝子のリーダー配
列中の、22残基のアミノ酸配列からなる特定のペ
プチドが蛋白質の分泌活性を示し、このペプチド
をコードするポリヌクレオチドを、所望の蛋白質
をコードする外来遺伝子（構造遺伝子）の上流に
連結したプラスミドを調製して適当な宿主中で発
現させた場合に、目的とする蛋白質を効果的に分
泌させることができることを見出し本発明を達成
した。
即ち本発明の要旨は、構造遺伝子の上流にサツ
カロマイセス・セレビシエα因子遺伝子のプロモ
ーター配列と下記のアミノ酸配列からなるペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを連結し、構造
遺伝子の下流にサツカロマイセス・セレビシエα
因子遺伝子のターミネーター配列を連結し、かつ
プラスミドpBR322のアンピシリン耐性遺伝子
（Apr）及び複製開始点（ori）を含む領域、2μｍ
プラスミドの複製開始点（ori）を含む領域並び
にサツカロマイセス・セレビシエのトリプトフア
ン合成酵素遺伝子（TRP1）を含む領域を含有し
てなるプラスミド。
カロマイセス・セレビシエα因子遺伝子のプロモ
ーター配列と下記のアミノ酸配列からなるペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを連結し、構造
遺伝子の下流にサツカロマイセス・セレビシエα
因子遺伝子のターミネーター配列を連結し、かつ
プラスミドpBR322のアンピシリン耐性遺伝子
（Apr）及び複製開始点（ori）を含む領域、2μｍ
プラスミドの複製開始点（ori）を含む領域並び
にサツカロマイセス・セレビシエのトリプトフア
ン合成酵素遺伝子（TRP1）を含む領域を含有し
てなるプラスミド。
Met Arg Phe Pro Ser lle Phe Thr Ala
Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala
Ala Pro Val に存する。
Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala
Ala Pro Val に存する。
本発明を詳細に説明するに、本発明のプラスミ
ドの特異とする点は、構造遺伝子の上流にサツカ
ロマイセス・セレビシエα因子遺伝子のプロモー
ター配列と上記のアミノ酸配列からなるペプチド
をコードするポリヌクレオチドを連結してなるこ
とである。
ドの特異とする点は、構造遺伝子の上流にサツカ
ロマイセス・セレビシエα因子遺伝子のプロモー
ター配列と上記のアミノ酸配列からなるペプチド
をコードするポリヌクレオチドを連結してなるこ
とである。
上記のアミノ酸配列からなるペプチドをコード
するポリヌクレオチド（以下DNAと記す）は、
第１図に示される22個のアミノ酸配列からなるペ
プチドをコードする66塩基対（bp）の塩基配列
で表されるDNAからなる。このDNAは合成する
こともできるし、また例えば酵母の染色体DNA
のα因子遺伝子から単離することができる。
するポリヌクレオチド（以下DNAと記す）は、
第１図に示される22個のアミノ酸配列からなるペ
プチドをコードする66塩基対（bp）の塩基配列
で表されるDNAからなる。このDNAは合成する
こともできるし、また例えば酵母の染色体DNA
のα因子遺伝子から単離することができる。
本発明のプラスミドは後述する方法によつて容
易に調製され、構造遺伝子として所望の蛋白質を
コードする外来遺伝子を選択し、適当な宿主中に
導入して発現させることにより、目的とする蛋白
質をを効果的に分泌させることができる。
易に調製され、構造遺伝子として所望の蛋白質を
コードする外来遺伝子を選択し、適当な宿主中に
導入して発現させることにより、目的とする蛋白
質をを効果的に分泌させることができる。
以下に、ヒトのβ−エンドルフインの遺伝子
（β Ｅ DNA）を構造遺伝子（マーカー）とし
て、本発明のプラスミドの分泌ベクターとしての
有用性について詳細に説明する。
（β Ｅ DNA）を構造遺伝子（マーカー）とし
て、本発明のプラスミドの分泌ベクターとしての
有用性について詳細に説明する。
［分泌ベクターの構築］
(1) サツカロマイセス・セレビシエのα因子
DNAを含むプラスミドpLS01（4.4kb）の調製 詳細は後記実施例に記載するが、サツカロマ
イセス・セレビシエの染色体DNAをEcoRで
切断し2kb前後のDNA断片をプラスミド
pUC13（Pharmacia社カタログ、Ｐ−Ｌ
Biochemicals、27頁、27−4973記載）のEcoR
部位に挿入して、大腸菌を形質転換し、挿入
DNAを含む白色のコロニーを集め、上記酵母
のα因子DNAMFα1及びMFα2と相同な下記
の16塩基のヌクレオチド 5′GGCCAACCAATGTACT3′ （α因子のＣ末端側の−Gly−Gln−Pro−Met
−Tyrに相当する） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼー
シヨンを行ない、陽性のコロニーを選択する。
次いでプラスミドDNAを分離し、酵母のα因
子DNAを含むプラスミドpLS01（4.4kb）を選
択採取する。
DNAを含むプラスミドpLS01（4.4kb）の調製 詳細は後記実施例に記載するが、サツカロマ
イセス・セレビシエの染色体DNAをEcoRで
切断し2kb前後のDNA断片をプラスミド
pUC13（Pharmacia社カタログ、Ｐ−Ｌ
Biochemicals、27頁、27−4973記載）のEcoR
部位に挿入して、大腸菌を形質転換し、挿入
DNAを含む白色のコロニーを集め、上記酵母
のα因子DNAMFα1及びMFα2と相同な下記
の16塩基のヌクレオチド 5′GGCCAACCAATGTACT3′ （α因子のＣ末端側の−Gly−Gln−Pro−Met
−Tyrに相当する） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼー
シヨンを行ない、陽性のコロニーを選択する。
次いでプラスミドDNAを分離し、酵母のα因
子DNAを含むプラスミドpLS01（4.4kb）を選
択採取する。
(2) プラスミドpREl032（5.8kb）の調製
プラスミドYPp7（5.7kb）［サツカロマイセ
ス・セレビシエのTRP1を含むDNA断片と
pBR322を結合したプラスミド、Na−ture、
282巻、39〜43頁（1979）記載］をEcoRで部
分切断し粘着末端を充填した後、連結して
YRp7の一方のEcoRサイトが除去された
pREl032（5.8kb）を調製する。
ス・セレビシエのTRP1を含むDNA断片と
pBR322を結合したプラスミド、Na−ture、
282巻、39〜43頁（1979）記載］をEcoRで部
分切断し粘着末端を充填した後、連結して
YRp7の一方のEcoRサイトが除去された
pREl032（5.8kb）を調製する。
(3) プラスミドpUC8−βE（2.9kb）の調製
プラスミドpYT3−24（特開昭58−92696号公
報、２頁記載）をHaeで切断して、ヒトのβ
−エンドルフイン遺伝子（93bp、以下β Ｅ
DNAという）を含む160bpのHae〜Hae
断片を採取する。
報、２頁記載）をHaeで切断して、ヒトのβ
−エンドルフイン遺伝子（93bp、以下β Ｅ
DNAという）を含む160bpのHae〜Hae
断片を採取する。
一方、フアージM13mp7（Nucleic Acids
Research ９巻、309〜321頁記載）のRF
DNA（二本鎖 DNA）をHincで切断し、エ
タノールに溶解するHinc−Hinc断片
5′GACCTGCAGGTC3′を除いたHinc部位
に、上記β Ｅ DNAを含む160bpのDNA断
片を連結し大腸菌を形質転換した。形質転換株
からRF DNAを調製し、これをBamHで
切断して得られた172bpのBamH〜BamH
断片を、プラスミドpCU8［Bethesda
Research Laboratories、InC.発行のBRLカタ
ログ（August １、1983）、Cat／No.5359SA記
載］のBamHサイトに挿入してpUC8−β
Ｅ（2.9kb）を得る。
Research ９巻、309〜321頁記載）のRF
DNA（二本鎖 DNA）をHincで切断し、エ
タノールに溶解するHinc−Hinc断片
5′GACCTGCAGGTC3′を除いたHinc部位
に、上記β Ｅ DNAを含む160bpのDNA断
片を連結し大腸菌を形質転換した。形質転換株
からRF DNAを調製し、これをBamHで
切断して得られた172bpのBamH〜BamH
断片を、プラスミドpCU8［Bethesda
Research Laboratories、InC.発行のBRLカタ
ログ（August １、1983）、Cat／No.5359SA記
載］のBamHサイトに挿入してpUC8−β
Ｅ（2.9kb）を得る。
(4) プラスミドpREl046（0.4kb）の調製
pLS01（4.4kb）の、プロモーター配列及びリ
ーダー配列（第１図に示す本発明の塩基配列を
含む）を含むEcoR〜Hind断片（1.4kb）
とpUC8−βE（2.9kb）のHind〜EcoR断片
（0.2kb、βE DNAを含む）とを、pREl032
（5.8kb）のEcoR切断部位に、連結して
pREl046（7.4kb）を得る。（第２図参照） (5) プラスミドpREl052（5.2kb）の調製 pREl032（5.8kb）のTRP1を含むEcoR〜
Pst断片（0.8kb）と、2μｍプラスミドの複製
開始点を含むPst〜EcoR断片（2kb）と、
pBR322のPvu〜EcoR断片（2.3kb）とを、
連結してpREl051（5.1kb）を作製した後EcoR
で部分切断し、粘着末端を充填後連結して、
pREl051の一方のEcoR切断部位を欠いた
pREl052（5.2kb）を得た。（第３図参照） (6) プラスミドpREl059（6.8kb）の調製 前記(4)で得たpREl046のプロモーター配列、
リーダー配列及びβ Ｅ DNA配列を含む
EcoR〜Sma断片（1.6kb）と、pLS01
（4.4kb）の、ターミネーター配列を含むHinc
〜EcoR断片（0.3kb）とを採取する。
ーダー配列（第１図に示す本発明の塩基配列を
含む）を含むEcoR〜Hind断片（1.4kb）
とpUC8−βE（2.9kb）のHind〜EcoR断片
（0.2kb、βE DNAを含む）とを、pREl032
（5.8kb）のEcoR切断部位に、連結して
pREl046（7.4kb）を得る。（第２図参照） (5) プラスミドpREl052（5.2kb）の調製 pREl032（5.8kb）のTRP1を含むEcoR〜
Pst断片（0.8kb）と、2μｍプラスミドの複製
開始点を含むPst〜EcoR断片（2kb）と、
pBR322のPvu〜EcoR断片（2.3kb）とを、
連結してpREl051（5.1kb）を作製した後EcoR
で部分切断し、粘着末端を充填後連結して、
pREl051の一方のEcoR切断部位を欠いた
pREl052（5.2kb）を得た。（第３図参照） (6) プラスミドpREl059（6.8kb）の調製 前記(4)で得たpREl046のプロモーター配列、
リーダー配列及びβ Ｅ DNA配列を含む
EcoR〜Sma断片（1.6kb）と、pLS01
（4.4kb）の、ターミネーター配列を含むHinc
〜EcoR断片（0.3kb）とを採取する。
一方、pREl052（5.2kb）をEcoRで切断し、
次いでバクテリアルアルカリンフオスフアター
ゼ（Bacterial alkaline phosphatase、BAP）
を加えて末端のリン酸基を外した後、これを、
上記二つのDNA断片と連結してプラスミド
pREl059（6.8kb）を得る。（第４図参照） (7) プラスミドpREl066（6.6kb）の調製 pREl059をHinc、Ban及びEcoRで切
断して、Ban〜Hinc断片（1.5kb）、Hinc
〜EcoR断片（0.5kb）及びBam〜EcoR
断片（4.6kb）を調製し、これらを連結して
pREl059のHinc〜Hinc部位が欠失してい
るプラスミドPREl066（6.6kb）を得る。（第５
図参照） （発明の効果） プラスミドpREl066は、β Ｅ DNA配列の
上流に第１図に示す、本発明の僅か66塩基からな
る短いシグナル配列を有するのみであるが、この
プラスミドを、例えば、酵母サツカロマイセス・
セレビシエ YNN27株に導入し、形質転換株を
培養すると、後記実施例に示すように、高い効率
でβ−エンドルフインを培養液中に分泌させるこ
とができる。
次いでバクテリアルアルカリンフオスフアター
ゼ（Bacterial alkaline phosphatase、BAP）
を加えて末端のリン酸基を外した後、これを、
上記二つのDNA断片と連結してプラスミド
pREl059（6.8kb）を得る。（第４図参照） (7) プラスミドpREl066（6.6kb）の調製 pREl059をHinc、Ban及びEcoRで切
断して、Ban〜Hinc断片（1.5kb）、Hinc
〜EcoR断片（0.5kb）及びBam〜EcoR
断片（4.6kb）を調製し、これらを連結して
pREl059のHinc〜Hinc部位が欠失してい
るプラスミドPREl066（6.6kb）を得る。（第５
図参照） （発明の効果） プラスミドpREl066は、β Ｅ DNA配列の
上流に第１図に示す、本発明の僅か66塩基からな
る短いシグナル配列を有するのみであるが、この
プラスミドを、例えば、酵母サツカロマイセス・
セレビシエ YNN27株に導入し、形質転換株を
培養すると、後記実施例に示すように、高い効率
でβ−エンドルフインを培養液中に分泌させるこ
とができる。
（実施例）
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
なお、以下の実施例における操作は、特に記載
する場合を除き、次の〜の方法によつた。
する場合を除き、次の〜の方法によつた。
［制限酵素によるDNAの切断と回収］
制限酵素による切断用緩衝液は、下記４種類
を用い(1)〜(3)の使い分けは、Advanced
Bacterial Genetics（1981）（Cold spring
Harbor、New York）に従つた。また切断条
件は、２単位／μgDNAの制限酵素を用い、37
℃または65℃、30分間処理する。
を用い(1)〜(3)の使い分けは、Advanced
Bacterial Genetics（1981）（Cold spring
Harbor、New York）に従つた。また切断条
件は、２単位／μgDNAの制限酵素を用い、37
℃または65℃、30分間処理する。
次いで、TE緩衝液（10ｍＭのトリス塩酸PH
8.0及び１ｍＭのEDTAからなる）で飽和した
フエノールで１回抽出し、エーテルでフエノー
ルを除き、２倍容のエタノールを加えて−20℃
で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回
収する。
8.0及び１ｍＭのEDTAからなる）で飽和した
フエノールで１回抽出し、エーテルでフエノー
ルを除き、２倍容のエタノールを加えて−20℃
で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回
収する。
(1) 低塩濃度緩衝液
10ｍＭのトリス塩酸（PH7.4）、10ｍＭの硫
酸マグネシウム及び１ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。
酸マグネシウム及び１ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。
(2) 中塩濃度緩衝液
50ｍＭのNaCl、10ｍＭのトリス塩酸（PH
7.4）10ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。
7.4）10ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。
(3) 高塩濃度緩衝液
100ｍＭのNaCl、50ｍＭのトリス塩酸（PH
7.4）及び10ｍＭの硫酸マグネシウムからな
る。
7.4）及び10ｍＭの硫酸マグネシウムからな
る。
(4) 制限酵素Sma用緩衝液
20ｍＭのKCl、10ｍＭのトリス塩酸（PH
8.0）、10ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。
8.0）、10ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。
［大腸菌（E.coli）HB101からのプラスミド
DNAの調製］ (1) ミニ調製法（mini prep法）Nucleic
Acids Res.7巻、1513〜1523頁（1979）］ 大腸菌HB101を宿主とし、0.5mlのＬ−ブ
ロス（10ｇのペプトン、５ｇのイースト・エ
キス、１ｇのグルコース、５ｇのNaCl／１
からなるPH7.2）を用いて一夜間培養し、遠
心分離して集菌した菌体を、100μの溶液
Ａ（50ｍＭのグルコース、10ｍＭのEDTA、
25ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）及びリゾチー
ム２mg／mlからなる）に懸濁し室温で30分間
放置する。
DNAの調製］ (1) ミニ調製法（mini prep法）Nucleic
Acids Res.7巻、1513〜1523頁（1979）］ 大腸菌HB101を宿主とし、0.5mlのＬ−ブ
ロス（10ｇのペプトン、５ｇのイースト・エ
キス、１ｇのグルコース、５ｇのNaCl／１
からなるPH7.2）を用いて一夜間培養し、遠
心分離して集菌した菌体を、100μの溶液
Ａ（50ｍＭのグルコース、10ｍＭのEDTA、
25ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）及びリゾチー
ム２mg／mlからなる）に懸濁し室温で30分間
放置する。
次いで氷水中で200μの溶液Ｂ［１％の
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.2N
のNaOH］を加えて振盪してし、同時に
DNAの変性を行う。150μの3M酢酸ソー
ダ溶液を加え氷冷後、遠心分離し、上清に冷
エタノールを加え、−20℃に冷却して遠心分
離し、沈澱を集める。
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.2N
のNaOH］を加えて振盪してし、同時に
DNAの変性を行う。150μの3M酢酸ソー
ダ溶液を加え氷冷後、遠心分離し、上清に冷
エタノールを加え、−20℃に冷却して遠心分
離し、沈澱を集める。
沈澱を、溶液Ｃ（50ｍＭのトリス塩酸及び
0.1Mの酢酸ソーダからなる）に溶解し、不
溶物を除去後、冷エタノールを加え、沈澱す
るDNAを洗浄し、減圧下乾燥し−20℃で保
存する。
0.1Mの酢酸ソーダからなる）に溶解し、不
溶物を除去後、冷エタノールを加え、沈澱す
るDNAを洗浄し、減圧下乾燥し−20℃で保
存する。
(2) 大量調整法
200mlのＬ−ブロス（薬剤耐性プラスミド
の場合は薬剤を含む）に大腸菌HB101を植
菌し、一夜間培養し、集菌後、15mlのSTES
緩衝液［TES緩衝液（10ｍＭのトリス塩酸
（PH7.4）、１ｍＭのEDTA及び50ｍＭのNaCl
からなる）に25％のサツカロースを添加した
もの］に懸濁し、EDTA、リゾチーム及び
リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を夫々30
ｍＭ、600μｇ／ml及び50μｇ／ml加え、更に
氷水中でプロナーゼＥを500μｇ／ml添加す
る。次いで、SDSを１％となるように加え、
37℃で振盪し、氷水中に戻し、NaClを終濃
度1Mとなるように添加した後、遠心分離し、
上清に、２倍容の冷エタノールを加え、−20
℃に保持し遠心分離してDNAを沈澱として
回収し、減圧下乾燥し、−20℃で保存する。
の場合は薬剤を含む）に大腸菌HB101を植
菌し、一夜間培養し、集菌後、15mlのSTES
緩衝液［TES緩衝液（10ｍＭのトリス塩酸
（PH7.4）、１ｍＭのEDTA及び50ｍＭのNaCl
からなる）に25％のサツカロースを添加した
もの］に懸濁し、EDTA、リゾチーム及び
リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を夫々30
ｍＭ、600μｇ／ml及び50μｇ／ml加え、更に
氷水中でプロナーゼＥを500μｇ／ml添加す
る。次いで、SDSを１％となるように加え、
37℃で振盪し、氷水中に戻し、NaClを終濃
度1Mとなるように添加した後、遠心分離し、
上清に、２倍容の冷エタノールを加え、−20
℃に保持し遠心分離してDNAを沈澱として
回収し、減圧下乾燥し、−20℃で保存する。
［T4 DNAリガーゼによる連結］
連結する２個のDNA片は、1μｇ／10μに
なるように、連結用緩衝液［66ｍＭのトリス塩
酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、
10mMのジチオスレイトールからなる］に溶解
し65℃で10分間処理した後、４℃で66μMの
ATP（アデノシントリフオスフエート）を加
え、更にT4リガーゼを粘着末端の場合は0.1単
位／μｇDNA、また平滑末端の場合は１単
位／μｇDNAとなるように加えて４℃で18時
間反応させた後、65℃で10分間処理する。
なるように、連結用緩衝液［66ｍＭのトリス塩
酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、
10mMのジチオスレイトールからなる］に溶解
し65℃で10分間処理した後、４℃で66μMの
ATP（アデノシントリフオスフエート）を加
え、更にT4リガーゼを粘着末端の場合は0.1単
位／μｇDNA、また平滑末端の場合は１単
位／μｇDNAとなるように加えて４℃で18時
間反応させた後、65℃で10分間処理する。
［大腸菌の形質転換（Advanced Bacterial
Genetics（1981）（Cold Spring Havor、New、
York）］ ５mlのＬ−ブロスに、大腸菌HB101を植菌
し、一夜間培養する。この0.2mlを20mlのＬ−
ブロスに植え、37℃でクレツトユニツトが60に
達するまで振盪培養する。菌体を集め氷冷した
50ｍＭの塩化カルシウムと10ｍＭのトリス塩酸
（PH8.0）とからなる緩衝液10mlに懸濁し、30分
間氷冷する。遠心分離した菌体を１mlの塩化カ
ルシウム溶液に懸濁し、この0.1mlを10μの
DNA溶液と混合し０℃で30分間、42℃で２分
間インキユベートした後、1.5mlのＬ−ブロス
を加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天
培地に植える。
Genetics（1981）（Cold Spring Havor、New、
York）］ ５mlのＬ−ブロスに、大腸菌HB101を植菌
し、一夜間培養する。この0.2mlを20mlのＬ−
ブロスに植え、37℃でクレツトユニツトが60に
達するまで振盪培養する。菌体を集め氷冷した
50ｍＭの塩化カルシウムと10ｍＭのトリス塩酸
（PH8.0）とからなる緩衝液10mlに懸濁し、30分
間氷冷する。遠心分離した菌体を１mlの塩化カ
ルシウム溶液に懸濁し、この0.1mlを10μの
DNA溶液と混合し０℃で30分間、42℃で２分
間インキユベートした後、1.5mlのＬ−ブロス
を加え37℃で30分間培養し、この0.1mlを寒天
培地に植える。
Ｖ ［S1ヌクレアーゼによるDNA粘着末端の除
去］ 粘着末端を持つDNAを、200μの高塩濃度
緩衝液［30mMの酢酸ソーダ（PH4.25）、0.3M
のNaCl及び4mMの硫酸亜鉛からなる］に溶解
し、S1ヌクレアーゼを20単位／μｇDNAを加
え、22℃で40分間処理し、TE緩衝液で飽和し
たフエノールで抽出処理した後、エーテルでフ
エノールを除き、エタノールを加え、−20℃に
冷却し、遠心分離により、沈澱したDNAを回
収する。
去］ 粘着末端を持つDNAを、200μの高塩濃度
緩衝液［30mMの酢酸ソーダ（PH4.25）、0.3M
のNaCl及び4mMの硫酸亜鉛からなる］に溶解
し、S1ヌクレアーゼを20単位／μｇDNAを加
え、22℃で40分間処理し、TE緩衝液で飽和し
たフエノールで抽出処理した後、エーテルでフ
エノールを除き、エタノールを加え、−20℃に
冷却し、遠心分離により、沈澱したDNAを回
収する。
［Bam Ｈリンカーのリン酸化］
Bam Ｈリンカー（B.R.L社製）
5′CCGGATCCGG3′
GGCCTAGGCC
は、末端にリン酸基が付いていないので、T4
キナーゼでリン酸化を行なつた。
キナーゼでリン酸化を行なつた。
3nmolのBamH リンカーを、41μの80
ｍＭトリス塩酸（PH7.5）及び12ｍＭの塩化マ
グネシウムに溶解し、60℃で10分間インキユベ
ートした後、37℃で10ｍＭの２−メルカプトエ
タノールと、20ｍＭのATPを加え、更に10単
位のT4キナーゼを添加して37℃で30分間処理
した後、−20℃で保存する。
ｍＭトリス塩酸（PH7.5）及び12ｍＭの塩化マ
グネシウムに溶解し、60℃で10分間インキユベ
ートした後、37℃で10ｍＭの２−メルカプトエ
タノールと、20ｍＭのATPを加え、更に10単
位のT4キナーゼを添加して37℃で30分間処理
した後、−20℃で保存する。
［Bam Ｈリンカーの平滑末端への連結］
平滑末端のDNA断片（1.2p mol末端）と上
記でリン酸化したBam Ｈリンカー（100p
mol末端）を連結用緩衝液［66ｍＭのトリス塩
酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、10
ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解
し、１単位のT4リガーゼを加え４℃で18時間
反応後、BamH で処理して余分のBamH
リンカーを除き、TE緩衝液で飽和したフエ
ノールでDNAを抽出し、エーテルでフエノー
ルを除去後エタノール沈澱でDNAを回収する。
記でリン酸化したBam Ｈリンカー（100p
mol末端）を連結用緩衝液［66ｍＭのトリス塩
酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、10
ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解
し、１単位のT4リガーゼを加え４℃で18時間
反応後、BamH で処理して余分のBamH
リンカーを除き、TE緩衝液で飽和したフエ
ノールでDNAを抽出し、エーテルでフエノー
ルを除去後エタノール沈澱でDNAを回収する。
［プラスミド DNAのバクテリアルアルカ
リンフオスフアターゼ（BAP）処理］ プラスミドDNAの自己連結を阻止するため、
プラスミドDNAの制限酵素部位とDNA断片と
の連結に先だつて、プラスミドDNAを予め
BAPで処理する。
リンフオスフアターゼ（BAP）処理］ プラスミドDNAの自己連結を阻止するため、
プラスミドDNAの制限酵素部位とDNA断片と
の連結に先だつて、プラスミドDNAを予め
BAPで処理する。
制限酵素で切断したプラスミドDNA（10p
mol 5′末端）を200μのBAP緩衝液［10ｍＭ
のトリス塩酸（PH8.0）及び0.1ｍＭのEDTAか
らなる］に溶解し、100単位のBAPを加え、65
℃で１時間反応後、TE緩衝液で飽和したフエ
ノールで抽出処理し、エーテルでフエノールを
除去し、エタノール沈澱によりプラスミド
DNAを回収する。
mol 5′末端）を200μのBAP緩衝液［10ｍＭ
のトリス塩酸（PH8.0）及び0.1ｍＭのEDTAか
らなる］に溶解し、100単位のBAPを加え、65
℃で１時間反応後、TE緩衝液で飽和したフエ
ノールで抽出処理し、エーテルでフエノールを
除去し、エタノール沈澱によりプラスミド
DNAを回収する。
実施例
(1) プラスミドpLS01（4.4kb）の調製
酵母サツカロミセス・セレビシエ（S.
cerevisiae）IFO 1136の染色体DNA 500μｇを
500μの緩衝液［100ｍＭのトリス塩酸（PH
7.5）、50ｍＭのNaCl、10ｍＭの塩化マグネシ
ウム及び１ｍＭのジチオスレイトールからな
る］中で15単位のEcoRで37℃、１夜間処理
して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾配遠心にか
け、2kb前後のDNA断片を集めた。これをプ
ラスミドpUC13をEcoRを用いて切断した断
片1μｇとT4リガーゼ２単位を用いて連結し、
得られたプラスミドで大腸菌JM83株を形質転
換し、アンピシリン（Apr）耐性株を選択し
た。
cerevisiae）IFO 1136の染色体DNA 500μｇを
500μの緩衝液［100ｍＭのトリス塩酸（PH
7.5）、50ｍＭのNaCl、10ｍＭの塩化マグネシ
ウム及び１ｍＭのジチオスレイトールからな
る］中で15単位のEcoRで37℃、１夜間処理
して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾配遠心にか
け、2kb前後のDNA断片を集めた。これをプ
ラスミドpUC13をEcoRを用いて切断した断
片1μｇとT4リガーゼ２単位を用いて連結し、
得られたプラスミドで大腸菌JM83株を形質転
換し、アンピシリン（Apr）耐性株を選択し
た。
合成オリゴヌクレオチド
5′GGCCAACCAATGTACT3′
をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンを行ない、陽性のコロニーを選択し、プラ
スミドDNAを分離し、制限酵素による解析と
塩基配列の決定により、Cell、30巻、937頁
（1982）の記載と一致する塩基配列を有する酵
母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01
（4.4kb）を選択採取した。
ヨンを行ない、陽性のコロニーを選択し、プラ
スミドDNAを分離し、制限酵素による解析と
塩基配列の決定により、Cell、30巻、937頁
（1982）の記載と一致する塩基配列を有する酵
母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01
（4.4kb）を選択採取した。
(2) プラスミドpREl032（5.8kb）の調製
プラスミドYRp7（5.7kb）をEcoRで部分
切断し、粘着末端を充填した後、T4リガーゼ
で連結してYRp7の一方のEcoRサイトが除
去されたpREl032（5.8kb）を調製した。
切断し、粘着末端を充填した後、T4リガーゼ
で連結してYRp7の一方のEcoRサイトが除
去されたpREl032（5.8kb）を調製した。
(3) プラスミドpUS8−βE（2.9kb）の調製
プラスミドpYT3−24をHaeで切断して、
β Ｅ DNA（93bp）を含む160bpのHae〜
Hae断片を採取した。
β Ｅ DNA（93bp）を含む160bpのHae〜
Hae断片を採取した。
一方、フアージM13mp7のRF DNAを
Hincで切断し、エタノールを添加してエタ
ノールに溶解する断片
5′GACCTGCAGGTC3′（Hinc〜Hinc）を
除去した後、Hinc部位に、上記β Ｅ
DNAを含む160bpのHae〜Hae断片をT4
リガーゼで連結した。これを大腸菌HB101株
に導入した。得られた形質転換株からDNAを
調製しこれをBamHで切断し、得られた
BamH〜BamH断片を、プラスミドpUC8
のBamHサイトに挿入してpUC8−βE
（2.9kb）を得た。
Hincで切断し、エタノールを添加してエタ
ノールに溶解する断片
5′GACCTGCAGGTC3′（Hinc〜Hinc）を
除去した後、Hinc部位に、上記β Ｅ
DNAを含む160bpのHae〜Hae断片をT4
リガーゼで連結した。これを大腸菌HB101株
に導入した。得られた形質転換株からDNAを
調製しこれをBamHで切断し、得られた
BamH〜BamH断片を、プラスミドpUC8
のBamHサイトに挿入してpUC8−βE
（2.9kb）を得た。
(4) プラスミドpREl046（7.4kb）の調製
(イ) pLS01（4.4kb）をEcoR及びHindで切
断してプロモーター配列及びリーダー配列を
含むEcoR−Hind断片1.4kb）を得た。
断してプロモーター配列及びリーダー配列を
含むEcoR−Hind断片1.4kb）を得た。
(ロ) pUC8−βE（2.9kb）をHind及びEcoR
で切断してHind〜EcoR断片（0.2kb）
を得た。
で切断してHind〜EcoR断片（0.2kb）
を得た。
(ハ) pREl032（5.8kb）をEcoRで切断し、こ
れを上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガ
ーゼを用いて連結してpREl046（7.4kb）を得
た。
れを上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガ
ーゼを用いて連結してpREl046（7.4kb）を得
た。
(5) プラスミドpREl052（5.2kb）の調製
(イ) pREl032（5.8kb）をEcoR及びPstで切
断してTRP1を含むEcoR〜Pst断片
（0.8kb）を得た。
断してTRP1を含むEcoR〜Pst断片
（0.8kb）を得た。
(ロ) 2μｍプラスミドをEcoRで切断し、その
粘着末端を充填して平滑末端とした後、Pst
で切断して複製開始点を含むPst〜EcoR
断片（2kb）を得た。
粘着末端を充填して平滑末端とした後、Pst
で切断して複製開始点を含むPst〜EcoR
断片（2kb）を得た。
(ハ) 上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片を、
pBR322をEcoR及びPvuで切断したPvu
〜EcoR断片（2.3kb）と共にT4 DNA
リガーゼにより連結してpREl051（5.1kb）を
作製しEcoRで部分切断した後、粘着末端
を充填して平滑末端としてT4リガーゼで連
結し、一方のEcoR断片部位を欠失した
pREl052（5.2kb）を得た。
pBR322をEcoR及びPvuで切断したPvu
〜EcoR断片（2.3kb）と共にT4 DNA
リガーゼにより連結してpREl051（5.1kb）を
作製しEcoRで部分切断した後、粘着末端
を充填して平滑末端としてT4リガーゼで連
結し、一方のEcoR断片部位を欠失した
pREl052（5.2kb）を得た。
(6) プラスミドpREl059（6.8kb）の調製
(イ) pREl046（7.4kb）をEcoR及びSmaで
切断し、得られたプロモーター配列、リーダ
ー配列及びβ Ｅ DNA配列を含むEcoR
〜Sma断片（1.6kb）を採取した。
切断し、得られたプロモーター配列、リーダ
ー配列及びβ Ｅ DNA配列を含むEcoR
〜Sma断片（1.6kb）を採取した。
(ロ) pLS01（4.4kb）をHinc及びEcoRで切
断しターミネーター配列を含むHinc〜
EcoR断片（0.3kb）を採取した。
断しターミネーター配列を含むHinc〜
EcoR断片（0.3kb）を採取した。
(ハ) pREl052（5.2kb）をEcoRで切断し、
BAPを加えて末端のリン酸基を外した後、
上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガーゼ
を用いて連結してプラスミドpREl059
（6.8kb）を得た。
BAPを加えて末端のリン酸基を外した後、
上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガーゼ
を用いて連結してプラスミドpREl059
（6.8kb）を得た。
(7) プラスミドpREl066（6.6kb）の調製
(イ) pREl059（6.8kb）をHinc、Ban及び
EcoRで夫々切断して、Ban〜Hinc断
片（1.5kb、このうちHinc部位から上流の
66塩基が第１図に示すシグナルペプチドの配
列である）、Hinc〜EcoR断片（0.5kb）
断片及びBan〜EcoR（4.6kb）断片を調
製し、これらをT4リガーゼで連結して
pREl059のHinc〜Hinc部位が欠失した
プラスミドPREl066（6.6kb）を得た。
EcoRで夫々切断して、Ban〜Hinc断
片（1.5kb、このうちHinc部位から上流の
66塩基が第１図に示すシグナルペプチドの配
列である）、Hinc〜EcoR断片（0.5kb）
断片及びBan〜EcoR（4.6kb）断片を調
製し、これらをT4リガーゼで連結して
pREl059のHinc〜Hinc部位が欠失した
プラスミドPREl066（6.6kb）を得た。
(8) プラスミドpREl066の塩基配列の確認
pREl066DNAをBamHIで切断し、５末端の
リン酸をBAP処理により除去し、γ−Ｐ−
ATPとポリヌクレチオドキナーゼにより５末
端を32Pで標識した。これをAvaで切断して
得られた約320bpの断片をポリアクリルアミド
ゲルから溶出し、マキサム−ギルバード法によ
り塩基配列を決定し、予期した通りの継ぎ方で
あることを確認した。
リン酸をBAP処理により除去し、γ−Ｐ−
ATPとポリヌクレチオドキナーゼにより５末
端を32Pで標識した。これをAvaで切断して
得られた約320bpの断片をポリアクリルアミド
ゲルから溶出し、マキサム−ギルバード法によ
り塩基配列を決定し、予期した通りの継ぎ方で
あることを確認した。
(9) プラスミドpREl066による酵母サツカロマイ
セス・セレビシエYNN27株の形質転換 酵母サツカロミセス・セレビシエ（S.
cerevisiae）YNN27株を、YPD培地（１％の
酵母エキス、２％のペプトン及び２％のグルコ
ースからなる）で一夜間培養した培養液0.5ml
を20mlのYPD培地に植え、30℃でクレツトユ
ニツト60まで振盪培養する。この10mlを遠心分
離して得た菌体を10mlのTE緩衝液で洗浄し、
１mlのTE緩衝液に懸濁する。この0.5mlに0.5
mlの0.2M酢酸リチウム、10ｍＭのトリス塩酸
（PH7.5）及び１ｍＭのEDTAを加え、30℃で１
時間保持した後、氷水中で冷却する。
セス・セレビシエYNN27株の形質転換 酵母サツカロミセス・セレビシエ（S.
cerevisiae）YNN27株を、YPD培地（１％の
酵母エキス、２％のペプトン及び２％のグルコ
ースからなる）で一夜間培養した培養液0.5ml
を20mlのYPD培地に植え、30℃でクレツトユ
ニツト60まで振盪培養する。この10mlを遠心分
離して得た菌体を10mlのTE緩衝液で洗浄し、
１mlのTE緩衝液に懸濁する。この0.5mlに0.5
mlの0.2M酢酸リチウム、10ｍＭのトリス塩酸
（PH7.5）及び１ｍＭのEDTAを加え、30℃で１
時間保持した後、氷水中で冷却する。
得られた菌体懸濁液100μにDNA溶液10μ
を加え、０℃で30分間保持した後、200μ
の70％ポリエチレングリコール4000溶液を加
え、30℃で１時間、次いで42℃で５分間保持し
た後、集菌し、0.5mlの水で洗浄後0.3mlの水に
懸濁し、プレート１枚に0.1ml植える。
を加え、０℃で30分間保持した後、200μ
の70％ポリエチレングリコール4000溶液を加
え、30℃で１時間、次いで42℃で５分間保持し
た後、集菌し、0.5mlの水で洗浄後0.3mlの水に
懸濁し、プレート１枚に0.1ml植える。
(10) β−エンドルフインの分泌量
上記(9)で得たプラスミドpREl066を含む酵母
を２日間培養した後、遠心分離し、上清につい
て、β−エンドルフイン［RIA］キツトNew
England Nuclear社、カタログ番号NEK−
003）を使用し、カタログ記載の方法に従つて
ラジオイムノアツセイを行なつた結果、上清中
のβ−エンドルフイン量は、73.7ng／mlであつ
た。
を２日間培養した後、遠心分離し、上清につい
て、β−エンドルフイン［RIA］キツトNew
England Nuclear社、カタログ番号NEK−
003）を使用し、カタログ記載の方法に従つて
ラジオイムノアツセイを行なつた結果、上清中
のβ−エンドルフイン量は、73.7ng／mlであつ
た。
なお前記のプラスミドpREl046及びpREl052
により、同様にサツカロマイセス・セレビシエ
YNN27株を形質転換し、培養後、遠心分離し
た上清について、上記と同一方法により測定し
たβ−エンドルフイン量は、夫々18.3ng／ml及
び0.2ng／mlであつた。
により、同様にサツカロマイセス・セレビシエ
YNN27株を形質転換し、培養後、遠心分離し
た上清について、上記と同一方法により測定し
たβ−エンドルフイン量は、夫々18.3ng／ml及
び0.2ng／mlであつた。
第１図は本発明のポリヌクレオチドのアミノ酸
配列及び該アミノ酸をコードするDNAの塩基配
列を示し、第２〜第５図は本発明におけるプラス
ミドの構成ルートを示す模式図であつて、図中、
ＥはEcoRを、ＨはHindを、ＳはSalを、
ＰはPstを、ＢはBamHを、PvはPvuを、
SmはSmaを、HcはHincを、BnはBanを、
ｘはXbaを夫々示す。
配列及び該アミノ酸をコードするDNAの塩基配
列を示し、第２〜第５図は本発明におけるプラス
ミドの構成ルートを示す模式図であつて、図中、
ＥはEcoRを、ＨはHindを、ＳはSalを、
ＰはPstを、ＢはBamHを、PvはPvuを、
SmはSmaを、HcはHincを、BnはBanを、
ｘはXbaを夫々示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 構造遺伝子の上流にサツカロマイセス・セレ
ビシエα因子遺伝子のプロモーター配列と、下記
のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを連結し、構造遺伝子の下流にサ
ツカロマイセス・セレビシエα因子遺伝子のター
ミネーター配列を連結し、かつプラスミド
pBR322のアンピシリン耐性遺伝子及び複製開始
点を含む領域、2μｍプラスミドの複製開始点を
含む領域並びにサツカロマイセス・セレビシエの
トリプトフアン合成酵素遺伝子を含む領域を含有
してなるプラスミド。 Met Arg Phe Pro Ser lle Phe Thr Ala
Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala
Ala Pro Val
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60112287A JPS61271988A (ja) | 1985-05-27 | 1985-05-27 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60112287A JPS61271988A (ja) | 1985-05-27 | 1985-05-27 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61271988A JPS61271988A (ja) | 1986-12-02 |
| JPH0256076B2 true JPH0256076B2 (ja) | 1990-11-29 |
Family
ID=14582913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60112287A Granted JPS61271988A (ja) | 1985-05-27 | 1985-05-27 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61271988A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2061482T3 (es) * | 1986-05-02 | 1994-12-16 | Gist Brocades Nv | Metodo para la identificacion de secuencias de señal secretora para sintesis de proteina extracelular en bacillus. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0116201B1 (en) * | 1983-01-12 | 1992-04-22 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| DK172738B1 (da) * | 1983-04-07 | 1999-06-21 | Chiron Corp | Fremgangsmåde til at udtrykke modent insulin og DNA-struktur til anvendelse ved fremgangsmåden |
-
1985
- 1985-05-27 JP JP60112287A patent/JPS61271988A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61271988A (ja) | 1986-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0336516B2 (ja) | ||
| JP3250968B2 (ja) | オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド | |
| FI94426B (fi) | Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille | |
| CN1160462C (zh) | 利用革兰氏阳性菌表达重组蛋白质 | |
| US4359535A (en) | Autonomously replicating DNA containing inserted DNA sequences | |
| US20040106118A1 (en) | Method for exposing peptides and polypeptides on the cell surface of bacteria | |
| JPH07170978A (ja) | レンニンの製造方法 | |
| JPH0513630B2 (ja) | ||
| JP2733602B2 (ja) | ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母 | |
| JPH07110233B2 (ja) | リプレツシブルイ−ストプロモ−タ− | |
| JPS62500074A (ja) | バチルス スリンギエンシス 結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント | |
| Stephens et al. | A promoter whose utilization is temporally regulated during sporulation in Bacillus subtilis | |
| JP2504723B2 (ja) | 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌 | |
| JPH0256076B2 (ja) | ||
| JPS63501053A (ja) | 異種タンパク質の生産方法 | |
| Allen et al. | Nucleotide sequence of the Erwinia chrysanthemi gene encoding 2-keto-3-deoxygluconate permease | |
| JP2507874B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコ−ドするｄｎａ配列 | |
| JPH035797B2 (ja) | ||
| JPH035798B2 (ja) | ||
| EP0261534A2 (en) | Improved gene expression in yeast | |
| JP2560214B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコードするｄｎａ配列 | |
| JPH066060B2 (ja) | 新規なプロモ−タ− | |
| JP2538200B2 (ja) | ポリペプチド分泌発現ベクタ―及び形質転換微生物 | |
| JPH0588110B2 (ja) | ||
| CN120866397A (zh) | 一种在绿色杜氏藻中表达外源基因的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |