JPH0336516B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0336516B2 JPH0336516B2 JP60233371A JP23337185A JPH0336516B2 JP H0336516 B2 JPH0336516 B2 JP H0336516B2 JP 60233371 A JP60233371 A JP 60233371A JP 23337185 A JP23337185 A JP 23337185A JP H0336516 B2 JPH0336516 B2 JP H0336516B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- ecor
- plasmid
- site
- bamh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は複合プラスミドに関する。より詳しく
は、酵母インベルターゼ遺伝子を利用した複合プ
ラスミドに関する。
は、酵母インベルターゼ遺伝子を利用した複合プ
ラスミドに関する。
（発明の構成）
酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を
備え、また食品、医薬品、飼料等の原料として、
人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用な微
生物であり、遺伝子工学に於ける宿主としての開
発が期待されている。
備え、また食品、医薬品、飼料等の原料として、
人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用な微
生物であり、遺伝子工学に於ける宿主としての開
発が期待されている。
しかしながら、酵母の細胞表層は細胞膜と外側
に強固な細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術
によつて生産された有用物質（異種蛋白質）の精
製が困難な場合が多く、精製を簡略化するため
に、生産物を菌体外に分泌させる系の開発が望ま
れている。
に強固な細胞壁を有するため、遺伝子組換え技術
によつて生産された有用物質（異種蛋白質）の精
製が困難な場合が多く、精製を簡略化するため
に、生産物を菌体外に分泌させる系の開発が望ま
れている。
本発明者等は、酵母を宿主とする遺伝子組換え
技術において、菌体内で生産された有用物質を効
率よく分泌させることのできるプラスミド・ベク
ターを探索した結果、本発明を達成したもので、
その要旨は、 サツカロマイセス・セレビシエのインベルタ
ーゼ遺伝子（SUC2）中の、インベルターゼの
翻訳開始コドンより約900bp上流にあるEcoR
部位から、成熟インベルターゼのＮ末端Ser
より下流12番目のアミノ酸であるValをコード
するGTCの位置にあるAva部位までのDNA
と、 サツカロマイセス・セレビシエのインベルタ
ーゼ遺伝子（SUC2）中の、インベルターゼの
終止コドンより約70bp上流にあるSau3A部
位から、その約500bp下流にあるAlu部位ま
でのDNAを、のAva部位とのSau3A
部位との間でリンカーを介して直結したDNA
を含有することを特徴とする複合プラスミド。
技術において、菌体内で生産された有用物質を効
率よく分泌させることのできるプラスミド・ベク
ターを探索した結果、本発明を達成したもので、
その要旨は、 サツカロマイセス・セレビシエのインベルタ
ーゼ遺伝子（SUC2）中の、インベルターゼの
翻訳開始コドンより約900bp上流にあるEcoR
部位から、成熟インベルターゼのＮ末端Ser
より下流12番目のアミノ酸であるValをコード
するGTCの位置にあるAva部位までのDNA
と、 サツカロマイセス・セレビシエのインベルタ
ーゼ遺伝子（SUC2）中の、インベルターゼの
終止コドンより約70bp上流にあるSau3A部
位から、その約500bp下流にあるAlu部位ま
でのDNAを、のAva部位とのSau3A
部位との間でリンカーを介して直結したDNA
を含有することを特徴とする複合プラスミド。
に存する。
本発明を以下詳細に説明するに、インベルター
ゼは、酵母サツカロマイセス・セレビシエの代表
的な分泌酵素として知られているが、本酵素は細
胞膜と細胞壁との間に局在し、ごく一部が菌体外
に漏出するに過ぎない。これは、本酵素の分子量
が大きいため細胞壁を通過できないと考えられて
いる。
ゼは、酵母サツカロマイセス・セレビシエの代表
的な分泌酵素として知られているが、本酵素は細
胞膜と細胞壁との間に局在し、ごく一部が菌体外
に漏出するに過ぎない。これは、本酵素の分子量
が大きいため細胞壁を通過できないと考えられて
いる。
本発明は、上記インベルターゼ遺伝子の特定の
領域を利用することによつて、菌体内で生産され
た有用物質を分泌させることのできる複合プラス
ミドを提供するものである。
領域を利用することによつて、菌体内で生産され
た有用物質を分泌させることのできる複合プラス
ミドを提供するものである。
サツカロマイセス・セレビシエのインベルター
ゼ遺伝子としては、SUC2遺伝子が知られ、その
ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が解
明されている［Nucleic Acids research、11巻、
６号、1943〜1953頁、特にその1948〜1949頁を参
照］。
ゼ遺伝子としては、SUC2遺伝子が知られ、その
ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が解
明されている［Nucleic Acids research、11巻、
６号、1943〜1953頁、特にその1948〜1949頁を参
照］。
本発明の複合プラスミドにおける、インベルタ
ーゼ遺伝子の利用領域としては、インベルターゼ
遺伝子のプロモーター配列とシグナル配列（19ア
ミノ酸残基からなる）とを含むEcoR〜Ava
領域、即ち上記SUC2遺伝子中、インベルターゼ
の翻訳開始コドンより約900bp上流にあるEcoR
部位から、成熟インベルターゼのＮ末端Ser
（TCA）より下流12番目のVal（GTC）の位置に
あるAva部位までの塩基配列が使用される。ま
た、ターミネーター配列を含む領域として、上記
SUC遺伝子中、インベルターゼの終止コドンよ
り約70bp上流にあるSau3A部位から約500bp下
流にあるAlu部位までのSau3A〜Alu領域
が使用される。
ーゼ遺伝子の利用領域としては、インベルターゼ
遺伝子のプロモーター配列とシグナル配列（19ア
ミノ酸残基からなる）とを含むEcoR〜Ava
領域、即ち上記SUC2遺伝子中、インベルターゼ
の翻訳開始コドンより約900bp上流にあるEcoR
部位から、成熟インベルターゼのＮ末端Ser
（TCA）より下流12番目のVal（GTC）の位置に
あるAva部位までの塩基配列が使用される。ま
た、ターミネーター配列を含む領域として、上記
SUC遺伝子中、インベルターゼの終止コドンよ
り約70bp上流にあるSau3A部位から約500bp下
流にあるAlu部位までのSau3A〜Alu領域
が使用される。
そして、本発明の複合プラスミドは、上記の
EcoR〜Ava領域におけるAva部位と、
Sau3A〜Alu領域におけるSau3A部位との
間でリンカーを介して直結した塩基配列を含んで
いる。
EcoR〜Ava領域におけるAva部位と、
Sau3A〜Alu領域におけるSau3A部位との
間でリンカーを介して直結した塩基配列を含んで
いる。
なお、プラスミド2μｍ DNA及びpBR322等
の複製起点が使用され、また、TRP1、Apr等の
選択マーカーが使用される。
の複製起点が使用され、また、TRP1、Apr等の
選択マーカーが使用される。
以下に、本発明の複合プラスミドの調製法と、
このプラスミドにマウスアミラーゼ遺伝子を挿入
し、酵母を形質転換した場合の有用性について説
明する。
このプラスミドにマウスアミラーゼ遺伝子を挿入
し、酵母を形質転換した場合の有用性について説
明する。
１ ［プラスミドpSMF2、３、４（3.8kb）の調
製］ インベルターゼ遺伝子SUC2を含むプラスミ
ドpRB58［Cell、28巻、145〜154頁（1982年）］
をXho及びBamHで切断して、SUC2のプ
ロモター配列及びシグナルペプチド配列を含む
Xho〜BamH断片（約2.9kb）を単離し、
更にAvaで切断して約1.3kbのDNA断片を得
る。この両端を充填した後BamHリンカー
（8mer、10mer、12mer）を連結する。
製］ インベルターゼ遺伝子SUC2を含むプラスミ
ドpRB58［Cell、28巻、145〜154頁（1982年）］
をXho及びBamHで切断して、SUC2のプ
ロモター配列及びシグナルペプチド配列を含む
Xho〜BamH断片（約2.9kb）を単離し、
更にAvaで切断して約1.3kbのDNA断片を得
る。この両端を充填した後BamHリンカー
（8mer、10mer、12mer）を連結する。
得られた３種のDNA断片をEcoR及び
BamHで切断して、SUC2のプロモーター配
列及びシグナルペプチド配列を含む約1kbの
EcoR〜BamH断片を得る。
BamHで切断して、SUC2のプロモーター配
列及びシグナルペプチド配列を含む約1kbの
EcoR〜BamH断片を得る。
次いで、これをプラスミドpUC38［Bethesda
Research Laboratories、lnc.発行のBRLカタ
ログ（August1、1983）、Cat／No.5359 SA記
載］のEcoR〜BamH部位に挿入して、
夫々プラスミドpSMF2、３、４を得る。（第１
図参照） ２ ［プラスミドpSMF6（3.3kb）の調製］ 前記プラスミドpRB58をXba及びEcoR
で切断してインベルターゼ遺伝子のターミネー
ター配列を含むXba〜EcoR断片を単離し、
次いでこれをSau3A及びDdeで切断して
Sau3A〜Dde断片を得、この両端を充填後、
BamHリンカー（10mer）を連結し、BamH
及びAluで切断し、得られたDNA断片
（約0.55kb）を、プラスミドpUC8のBamH
〜Hinc部位に挿入してプラスミドpSMF6を
得る。（第１図参照） ３ ［pSMF12、15、18（3.9kb）の調製］ (1) プラスミドpBR322をPvuで切断し、
Hindリンカーを連結してPvu部位を
Hind部位に変えた後、EcoR及びHind
で切断して、大腸菌のARS及びアンピシ
リン耐性遺伝子を含むEcoR〜Hind断を
作製し、 (2) 前記プラスミドpSMF2、３、４をEcoR
及びBamHで切断してEcoR〜BamH
断片を作製し、 (3) 前記プラスミドpSMF6をBamH及び
Hindで切断してBamH〜Hind断片を
作製し、 上記(1)、(2)及び(3)の３種のDNA断片を、
T4DNAリガーゼを用いて連結してpSMF12、
15、18を作製する。（第１図参照） ４ ［pSMF32T、35T、38T（6.6kb）の調製］ (1) 酵母プラスミド2μｍ DNAをEcoR及
びPstで切断してARSを含むEcoR〜Pst
断片を得る。
Research Laboratories、lnc.発行のBRLカタ
ログ（August1、1983）、Cat／No.5359 SA記
載］のEcoR〜BamH部位に挿入して、
夫々プラスミドpSMF2、３、４を得る。（第１
図参照） ２ ［プラスミドpSMF6（3.3kb）の調製］ 前記プラスミドpRB58をXba及びEcoR
で切断してインベルターゼ遺伝子のターミネー
ター配列を含むXba〜EcoR断片を単離し、
次いでこれをSau3A及びDdeで切断して
Sau3A〜Dde断片を得、この両端を充填後、
BamHリンカー（10mer）を連結し、BamH
及びAluで切断し、得られたDNA断片
（約0.55kb）を、プラスミドpUC8のBamH
〜Hinc部位に挿入してプラスミドpSMF6を
得る。（第１図参照） ３ ［pSMF12、15、18（3.9kb）の調製］ (1) プラスミドpBR322をPvuで切断し、
Hindリンカーを連結してPvu部位を
Hind部位に変えた後、EcoR及びHind
で切断して、大腸菌のARS及びアンピシ
リン耐性遺伝子を含むEcoR〜Hind断を
作製し、 (2) 前記プラスミドpSMF2、３、４をEcoR
及びBamHで切断してEcoR〜BamH
断片を作製し、 (3) 前記プラスミドpSMF6をBamH及び
Hindで切断してBamH〜Hind断片を
作製し、 上記(1)、(2)及び(3)の３種のDNA断片を、
T4DNAリガーゼを用いて連結してpSMF12、
15、18を作製する。（第１図参照） ４ ［pSMF32T、35T、38T（6.6kb）の調製］ (1) 酵母プラスミド2μｍ DNAをEcoR及
びPstで切断してARSを含むEcoR〜Pst
断片を得る。
(2) 一方、プラスミドYRp7［Nature、282巻、
39〜43頁（1979）］のTRP1とARS1を含む
EcoR〜EcoR断片をPstで切断して、
TRP1のみを含むEcoR〜Pst断片を調製
する。
39〜43頁（1979）］のTRP1とARS1を含む
EcoR〜EcoR断片をPstで切断して、
TRP1のみを含むEcoR〜Pst断片を調製
する。
(1)及び(2)の断片を結合させることにより得ら
れた、2μｍDNAの復製起点とYRp7のTRP1と
を含むEcoR〜EcoR断片を、pSMF12、
15、18のEcoR部位に挿入してpSMF32T、
35T、38Tを得る。（第１図参照） 上記で得られたpSMF32T、35T、38Tは、
サツカロマイセス・セレビシエ インベルター
ゼ遺伝子のプロモーター配列、シグナル配列及
びターミネター配列を有し、2μｍDNA及び
pBR322由来の複製起点を有するシヤトルベク
ターであり、TRR1、Apr等の選択マーカーを
持つている。
れた、2μｍDNAの復製起点とYRp7のTRP1と
を含むEcoR〜EcoR断片を、pSMF12、
15、18のEcoR部位に挿入してpSMF32T、
35T、38Tを得る。（第１図参照） 上記で得られたpSMF32T、35T、38Tは、
サツカロマイセス・セレビシエ インベルター
ゼ遺伝子のプロモーター配列、シグナル配列及
びターミネター配列を有し、2μｍDNA及び
pBR322由来の複製起点を有するシヤトルベク
ターであり、TRR1、Apr等の選択マーカーを
持つている。
このため、例えば、このBamHサイトに、
前述のマウスアミラーゼ遺伝子を挿入し、酵母
を形質転換すれば、アミラーゼを培地中に分泌
させることができる。
前述のマウスアミラーゼ遺伝子を挿入し、酵母
を形質転換すれば、アミラーゼを培地中に分泌
させることができる。
なお、上に述べたpSMF32T、35T、38Tの
代わりに、下記５及び６のプラスミドを使用し
ても同様の結果が得られる。
代わりに、下記５及び６のプラスミドを使用し
ても同様の結果が得られる。
５ ［pSMF32、35、38（5.4kb）の調製］
前記４におけるYRp7をEcoRで切断して、
TRP1遺伝子とARS1とを含むEcoR〜EcoR
断片を単離し、前記pSMF12、15、18におけ
るEcoR部位に挿入してpSMF32、35、38を
得る。
TRP1遺伝子とARS1とを含むEcoR〜EcoR
断片を単離し、前記pSMF12、15、18におけ
るEcoR部位に挿入してpSMF32、35、38を
得る。
６ ［pSMF32S、35S、38S（5.8kb）の調製］
(1) プラスミド2μｍDNAをAvaで切断して、
Ava〜Ava断片を採取し、充填した後
EcoRで切断して、REP3遺伝子を含む
850bpの平滑DNA断片を得る。
Ava〜Ava断片を採取し、充填した後
EcoRで切断して、REP3遺伝子を含む
850bpの平滑DNA断片を得る。
(2) 一方、YRp7をEcoR及びRsaで切断し
てTRP1及びARS1を含むEcoR〜Rsa断
片を調製する。
てTRP1及びARS1を含むEcoR〜Rsa断
片を調製する。
(1)及び(2)の断片を結合させることにより
TRP1、ARS1及びREP3を含むEcoR〜
EcoR断片を調製し、これを前記pSMF12、
15、18のEcoR部位に挿入してpSMF32S、
35S、38Sを得る。
TRP1、ARS1及びREP3を含むEcoR〜
EcoR断片を調製し、これを前記pSMF12、
15、18のEcoR部位に挿入してpSMF32S、
35S、38Sを得る。
７ ［分泌ベクターの構築］
(1) マウスアミラーゼ遺伝子の導入
(イ) マウスすい臓由来のアミラーゼ遺伝子を
含有するプラスミドpMSa104［Cell、179
巻、21頁（1980年）］をPstで切断し、得
られた Pst〜Pst断片をプラスミド
pUC13［Pharmacia社カタログ、Ｐ−
LBiochemicals、27頁、27−4973記載］の
Pst部位に挿入して、マウスアミラーゼ
遺伝子を含むプラスミドpRE1075（4.3kb）
を作製する。
含有するプラスミドpMSa104［Cell、179
巻、21頁（1980年）］をPstで切断し、得
られた Pst〜Pst断片をプラスミド
pUC13［Pharmacia社カタログ、Ｐ−
LBiochemicals、27頁、27−4973記載］の
Pst部位に挿入して、マウスアミラーゼ
遺伝子を含むプラスミドpRE1075（4.3kb）
を作製する。
pRE1075をApaで切断し、得られた
Apa〜Apa断片をS1ヌクレアーゼ処理
して平滑端とし、次いでDraで切断し
て、アミラーゼ前駆体の最初の15個のアミ
ノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白質をコードす
るApa〜Dra断片を採取する。（この
遺伝子はアミラーゼの分泌シグナルを欠失
している）。これにBamHリンカー（例
えば12mer）を結合し、BamHで切断し
て両端にBamH部位を持つDNA断片を
得る。
Apa〜Apa断片をS1ヌクレアーゼ処理
して平滑端とし、次いでDraで切断し
て、アミラーゼ前駆体の最初の15個のアミ
ノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白質をコードす
るApa〜Dra断片を採取する。（この
遺伝子はアミラーゼの分泌シグナルを欠失
している）。これにBamHリンカー（例
えば12mer）を結合し、BamHで切断し
て両端にBamH部位を持つDNA断片を
得る。
(ロ) 一方、pSMF32T、35T、38T
（pSMF32、35、38又はpSMF32S、35S、
38Sでもよい）をBamHで切断後、仔牛
小腸由来のアルカリ性ホスフアターゼ
（ClAP）処理してリン酸基を除去する。
（pSMF32、35、38又はpSMF32S、35S、
38Sでもよい）をBamHで切断後、仔牛
小腸由来のアルカリ性ホスフアターゼ
（ClAP）処理してリン酸基を除去する。
(イ)及び(ロ)で得たDNA断片を結合してマウス
アミラーゼ遺伝子を含むプラスミド pRE1100
（8.1 kb）を得る。（第２図参照） （発明の効果） 上記により構築された複合プラスミドpREl100
を、例えば酢酸リチウムを用いた形質転換法によ
り酵母サツカロマイセス・セレビシエに導入し、
形質転換株を培養すると、後記実施例に示すよう
にアミラーゼを培地中に分泌させることができ
る。
アミラーゼ遺伝子を含むプラスミド pRE1100
（8.1 kb）を得る。（第２図参照） （発明の効果） 上記により構築された複合プラスミドpREl100
を、例えば酢酸リチウムを用いた形質転換法によ
り酵母サツカロマイセス・セレビシエに導入し、
形質転換株を培養すると、後記実施例に示すよう
にアミラーゼを培地中に分泌させることができ
る。
（実施例）
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
なお、以下に実施例における操作は、特に記載
する場合を除き、次の〜の方法によつた。
する場合を除き、次の〜の方法によつた。
［制限酵素によるDNAの切断と回収］
制限酵素による切断用緩衝液は、下記３種類
を用い(1)〜(3)の使い分けは、Advanced
Bacterial Genetics（1981）（Cold spring
Hirbor、New York）に従つた。また切断条
件は、２単位／μｇDNAの制限酵素を用い、
37℃または65℃、30分間処理する。
を用い(1)〜(3)の使い分けは、Advanced
Bacterial Genetics（1981）（Cold spring
Hirbor、New York）に従つた。また切断条
件は、２単位／μｇDNAの制限酵素を用い、
37℃または65℃、30分間処理する。
次いで、TE緩衝液（10ｍＭのトリス塩酸PH
8.0及び１ｍＭのEDTAからなる）で飽和した
フエノールで１回抽出し、エーテルでフエノー
ルを除き、２倍容のエタノールを加えて−20℃
で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回
収する。
8.0及び１ｍＭのEDTAからなる）で飽和した
フエノールで１回抽出し、エーテルでフエノー
ルを除き、２倍容のエタノールを加えて−20℃
で30分間放置した後、遠心分離してDNAを回
収する。
(1) 低塩濃度緩衝液
10ｍＭのトリス塩酸（PH7.4）、10ｍＭの硫
酸マグネシウム及び１ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。
酸マグネシウム及び１ｍＭのジチオスレイト
ールからなる。
(2) 中塩濃度緩衝液
50ｍＭのNaCl、10ｍＭのトリス塩酸（PH
7.4）10ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。
7.4）10ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭ
のジチオスレイトールからなる。
(3) 高塩濃度緩衝液
100ｍＭのNaCl、50ｍＭのトリス塩酸（PH
7.4）及び10ｍＭの硫酸マグネシウムからな
る。
7.4）及び10ｍＭの硫酸マグネシウムからな
る。
［大腸菌（E.coli）からのプラスミドDNA
の調製］ (1) ミニ調製法（mini prep法）［Nucleic
Acids Res.7巻、1513〜1523頁（1979）］ プラスミドDNAを含む大腸菌を、500μ
のＬ−ブロス（10ｇのペプトン、５ｇの酵母
エキス、１ｇのグルコース、５ｇのNaCl／
１からなるPH7.2）を用いて一夜間培養し、
遠心分離して集菌した菌体を、100μの溶
液Ａ［50ｍＭのグリコース、10ｍＭの
EDTA、25ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）及び
リゾチーム２mg／mlからなる］に懸濁し、氷
水中で30分間放置する。
の調製］ (1) ミニ調製法（mini prep法）［Nucleic
Acids Res.7巻、1513〜1523頁（1979）］ プラスミドDNAを含む大腸菌を、500μ
のＬ−ブロス（10ｇのペプトン、５ｇの酵母
エキス、１ｇのグルコース、５ｇのNaCl／
１からなるPH7.2）を用いて一夜間培養し、
遠心分離して集菌した菌体を、100μの溶
液Ａ［50ｍＭのグリコース、10ｍＭの
EDTA、25ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）及び
リゾチーム２mg／mlからなる］に懸濁し、氷
水中で30分間放置する。
次いで氷水中で200μの溶液Ｂ［１％の
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.2N
のNaOH］を加え振盪して同時にDNAの変
性を行う。
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.2N
のNaOH］を加え振盪して同時にDNAの変
性を行う。
150μの3M酢酸ソーダ溶液（PH4.8）を加
え氷冷後遠心分離し、上清に冷エタノールを
加え、−70℃に冷却して遠心分離し沈澱を集
める。沈澱を、400μの溶液Ｃ［50ｍＭのト
リス塩酸（PH8.0）及び0.1Mの酢酸ソーダか
らなる］に溶解し、不溶物を除去後、冷エタ
ノールを加え、沈澱するDNAを洗浄し、減
圧下乾燥し−20℃で保存する。
え氷冷後遠心分離し、上清に冷エタノールを
加え、−70℃に冷却して遠心分離し沈澱を集
める。沈澱を、400μの溶液Ｃ［50ｍＭのト
リス塩酸（PH8.0）及び0.1Mの酢酸ソーダか
らなる］に溶解し、不溶物を除去後、冷エタ
ノールを加え、沈澱するDNAを洗浄し、減
圧下乾燥し−20℃で保存する。
(2) 大量調製法
プラスミドDNAを含む大腸菌を、100mlの
Ｌ−ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬
剤を含む）を用いて培養し、集菌、洗浄後、
３mlの溶液Ａ（50ｍＭのグルコース、10ｍＭ
のEDTA、25ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）及
びリゾチーム２mg／mlからなる）に懸濁し、
氷水中で30分間放置する。
Ｌ−ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は薬
剤を含む）を用いて培養し、集菌、洗浄後、
３mlの溶液Ａ（50ｍＭのグルコース、10ｍＭ
のEDTA、25ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）及
びリゾチーム２mg／mlからなる）に懸濁し、
氷水中で30分間放置する。
次いで氷水中で４mlの溶液Ｂ［１％のSDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.2Nの
NaOH］を加え振盪して、同時にDNAの変
性を行う。
（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む0.2Nの
NaOH］を加え振盪して、同時にDNAの変
性を行う。
３mlの3M酢酸ソーダ溶液（PH4.8）を加え
氷冷後、遠心分離し、上清に0.6容のイソプ
ロパノールを加え、−20℃で20分間放置する。
氷冷後、遠心分離し、上清に0.6容のイソプ
ロパノールを加え、−20℃で20分間放置する。
遠心分離して沈澱を集め、エタノールで洗
浄後２mlのTE（PH7.5）緩衝液に懸濁する。
次いで、10μのRNase Ａ（10mg／ml）を加
え、37℃で30分間放置後フエノール抽出を行
う。水層に0.2容の5M NaClと1/3容の30％
ポリエチレングリコール6000を加えて−20℃
で40分間、次いで４℃で40分間放置する。遠
心分離して沈澱を集め、400mlの水に溶解し、
DNAをエタノールで沈澱させ、洗浄後100μ
のTE緩衝液に溶解する。
浄後２mlのTE（PH7.5）緩衝液に懸濁する。
次いで、10μのRNase Ａ（10mg／ml）を加
え、37℃で30分間放置後フエノール抽出を行
う。水層に0.2容の5M NaClと1/3容の30％
ポリエチレングリコール6000を加えて−20℃
で40分間、次いで４℃で40分間放置する。遠
心分離して沈澱を集め、400mlの水に溶解し、
DNAをエタノールで沈澱させ、洗浄後100μ
のTE緩衝液に溶解する。
［T4 DNAリガーゼによる連結］
連結する２個のDNA断片は、1μｇ／10μ
になるように、連結用緩衝液［66ｍＭのトリス
塩酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、
10ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解
し65℃で10分間処理した後、４℃で66μMの
ATP（アデノシントリフオスフエート）を加
え、更にT4リガーゼを粘着末端の場合は0.1単
位／μｇ DNA、また平滑末端の場合は１単
位／μｇ DNAになるように加えて４℃で18
時間反応させた後、65℃で10分間処理する。
になるように、連結用緩衝液［66ｍＭのトリス
塩酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、
10ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解
し65℃で10分間処理した後、４℃で66μMの
ATP（アデノシントリフオスフエート）を加
え、更にT4リガーゼを粘着末端の場合は0.1単
位／μｇ DNA、また平滑末端の場合は１単
位／μｇ DNAになるように加えて４℃で18
時間反応させた後、65℃で10分間処理する。
［大腸菌の形質転換］［Advanced Bacterial
Genetics（1981）（Cold Spring Havor、New
York）］ ５mlのレーブロスに大腸菌を植菌し、一夜間
培養する。この0.2mlを20mlのＬ−ブロスに植
え、37℃でクレツトユニツトが60に達するまで
振盪培養する。菌体を集め氷冷した50ｍＭの塩
化カルシウムと10ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）
とからなる緩衝液10mlに懸濁し、30分間氷冷す
る。遠心分離した菌体を１mlの塩化カルシウム
溶液に懸濁し、この0.1mlを10μのDNA溶液
と混合し０℃で30分間、42℃で２分間インキユ
ベートした後、1.5mlのＬ−ブロスを加え37℃
で30分間培養し、この0.1mlを寒天培地に植え
る。
Genetics（1981）（Cold Spring Havor、New
York）］ ５mlのレーブロスに大腸菌を植菌し、一夜間
培養する。この0.2mlを20mlのＬ−ブロスに植
え、37℃でクレツトユニツトが60に達するまで
振盪培養する。菌体を集め氷冷した50ｍＭの塩
化カルシウムと10ｍＭのトリス塩酸（PH8.0）
とからなる緩衝液10mlに懸濁し、30分間氷冷す
る。遠心分離した菌体を１mlの塩化カルシウム
溶液に懸濁し、この0.1mlを10μのDNA溶液
と混合し０℃で30分間、42℃で２分間インキユ
ベートした後、1.5mlのＬ−ブロスを加え37℃
で30分間培養し、この0.1mlを寒天培地に植え
る。
［S1ヌクレアーゼによる DNA粘着末端の
除去］ 粘着末端を持つDNAを、200μの高塩濃度
緩衝液［30ｍＭの酢酸ソーダ（PH4.25）、0.3M
のNaCl及び４ｍＭの硫酸亜鉛からなる］に溶
解し、Ｓ１ヌクレアーゼを20単位／μｇDNA
加え、22℃で40分間処理し、TE緩衝液で飽和
したフエノールで抽出処理した後、エーテルで
フエノールを除き、冷エタノールを加え、−20
℃に冷却し、遠心分離により、沈澱した
DNAを回収する。
除去］ 粘着末端を持つDNAを、200μの高塩濃度
緩衝液［30ｍＭの酢酸ソーダ（PH4.25）、0.3M
のNaCl及び４ｍＭの硫酸亜鉛からなる］に溶
解し、Ｓ１ヌクレアーゼを20単位／μｇDNA
加え、22℃で40分間処理し、TE緩衝液で飽和
したフエノールで抽出処理した後、エーテルで
フエノールを除き、冷エタノールを加え、−20
℃に冷却し、遠心分離により、沈澱した
DNAを回収する。
［粘着末端の充填］
1μｇのDNAを、30μの50ｍＭトリス塩酸
（PH7.2）、10ｍＭの硫酸マグネシウム、0.1ｍＭ
のジチオスレイトール、50μｇ／mlの牛血清ア
ルブミン（BSA）及び0.2ｍＭのdNTPに溶か
し、1.25単位のklenow断片（大腸菌のDNAポ
リメラーゼの大きな断片）を加え室温で30分
間反応させる。次いで、1μの0.5M EDTA
（PH8.0）を加えて反応を停止させ、フエノール
及びエーテルで逐次抽出し、フエノールを除去
し、DNAをエタノール沈澱により回収する。
（PH7.2）、10ｍＭの硫酸マグネシウム、0.1ｍＭ
のジチオスレイトール、50μｇ／mlの牛血清ア
ルブミン（BSA）及び0.2ｍＭのdNTPに溶か
し、1.25単位のklenow断片（大腸菌のDNAポ
リメラーゼの大きな断片）を加え室温で30分
間反応させる。次いで、1μの0.5M EDTA
（PH8.0）を加えて反応を停止させ、フエノール
及びエーテルで逐次抽出し、フエノールを除去
し、DNAをエタノール沈澱により回収する。
［Bam Ｈリンカーのリン酸化］
Bam Ｈリンカー（B.R.L社製）
8mer：5′CGGATCCG 3′、10mer：
5′CCGGATCCGG 3′ 12mer：5′CCCGGATCCGGG 3′ （二重鎖のうち一本鎖のみを示した） は、末端にリン酸基が付いていないので、T4
キナーゼでリン酸化を行なつた。
5′CCGGATCCGG 3′ 12mer：5′CCCGGATCCGGG 3′ （二重鎖のうち一本鎖のみを示した） は、末端にリン酸基が付いていないので、T4
キナーゼでリン酸化を行なつた。
3n molのBamH リンカーを、41μの80
ｍＭトリス塩酸（PH7.5）及び12ｍＭの塩化マ
グネシウムに溶解し、60℃で10分間インキユベ
ートした後、37℃で10ｍＭの２−メルカプトエ
タノールと、20ｍＭのATPを加え、更に10単
位のT4キナーゼを添加して37℃で30分間処理
した後、−20℃で保存する。
ｍＭトリス塩酸（PH7.5）及び12ｍＭの塩化マ
グネシウムに溶解し、60℃で10分間インキユベ
ートした後、37℃で10ｍＭの２−メルカプトエ
タノールと、20ｍＭのATPを加え、更に10単
位のT4キナーゼを添加して37℃で30分間処理
した後、−20℃で保存する。
［Bam Ｈリンカーの平滑末端への連結］
平滑末端のDNA断片（1.2p mol末端）と上
記でリン酸化したBam Ｈリンカー（100p
mol末端）を連結用緩衝液［66ｍＭのトリス塩
酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、10
ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解
し、１単位のT4リガーゼを加え、４℃で18時
間反応後、BamHで処理して余分のBamH
リンカーを除き、TE緩衝液で飽和したフエ
ノールでDNAを抽出し、エーテルでフエノー
ルを除去後エタノール沈澱でDNAを回収する。
記でリン酸化したBam Ｈリンカー（100p
mol末端）を連結用緩衝液［66ｍＭのトリス塩
酸（PH7.5）、6.6ｍＭの塩化マグネシウム、10
ｍＭのジチオスレイトールからなる］に溶解
し、１単位のT4リガーゼを加え、４℃で18時
間反応後、BamHで処理して余分のBamH
リンカーを除き、TE緩衝液で飽和したフエ
ノールでDNAを抽出し、エーテルでフエノー
ルを除去後エタノール沈澱でDNAを回収する。
［DNA断片の仔牛小腸アルカリンフオスフ
アターゼ（ClAP）による処理］ リガーゼ反応によるプラスミド DNAの自
己連結を阻止するために、リガーゼ反応に先だ
つて、プラスミド DNAの制限酵素による切
断断片をClAPで処理する。
アターゼ（ClAP）による処理］ リガーゼ反応によるプラスミド DNAの自
己連結を阻止するために、リガーゼ反応に先だ
つて、プラスミド DNAの制限酵素による切
断断片をClAPで処理する。
制限酵素で切断したプラスミドDNA（10p
mol5′末端）を50μのClAP緩衝液［50ｍＭの
トリス塩酸（PH9.0）、１ｍＭの塩化マグネシウ
ム、0.1ｍＭの塩化亜鉛及び１ｍＭのスペルミ
ジンからなる］に溶解し、1p mol末端当り、
0.01単位のClAPを加え37℃で30分間反応後、
10μの0.1Mトリス塩酸（PH8.0）、1M Nacl、
10ｍＭ EDTA、5μの10％SDS、40μの水
を加え、65℃で15分間保持する。冷却後TE緩
衝液で飽和したフエノールで抽出処理し、エー
テルでフエノールを除去し、エタノール沈澱に
よりプラスミドDNAを回収する。
mol5′末端）を50μのClAP緩衝液［50ｍＭの
トリス塩酸（PH9.0）、１ｍＭの塩化マグネシウ
ム、0.1ｍＭの塩化亜鉛及び１ｍＭのスペルミ
ジンからなる］に溶解し、1p mol末端当り、
0.01単位のClAPを加え37℃で30分間反応後、
10μの0.1Mトリス塩酸（PH8.0）、1M Nacl、
10ｍＭ EDTA、5μの10％SDS、40μの水
を加え、65℃で15分間保持する。冷却後TE緩
衝液で飽和したフエノールで抽出処理し、エー
テルでフエノールを除去し、エタノール沈澱に
よりプラスミドDNAを回収する。
［酵母の形質転換（KU法）
酵母サツカロマイセス・セレビシエを10mlの
YEPD培地中で30℃で一夜間培養し、集菌して
一回TE緩衝液で洗浄した後、同緩衝液に懸濁
し、細胞数が２×108cells／mlとなるようにす
る。
YEPD培地中で30℃で一夜間培養し、集菌して
一回TE緩衝液で洗浄した後、同緩衝液に懸濁
し、細胞数が２×108cells／mlとなるようにす
る。
この懸濁液500μに同量の0.2M酢酸リチウ
ム（PH7.5）を加え、30℃１時間保持した後、
100μ宛試験管に分注し、０℃でこれにDNA
を添加し、０℃で30分間混合する。100μの
70％ポリエチレングリコール4000を含むTE緩
衝液を加え、よく混合した後30℃で１時間、次
いで42℃で５分間保持し、遠心分離して集菌
し、滅菌水で洗浄する。
ム（PH7.5）を加え、30℃１時間保持した後、
100μ宛試験管に分注し、０℃でこれにDNA
を添加し、０℃で30分間混合する。100μの
70％ポリエチレングリコール4000を含むTE緩
衝液を加え、よく混合した後30℃で１時間、次
いで42℃で５分間保持し、遠心分離して集菌
し、滅菌水で洗浄する。
これを500μの滅菌水に懸濁し、100μ宛
を選択培地上に植菌し、30℃で３〜４日間培養
して形質転換株を得る。
を選択培地上に植菌し、30℃で３〜４日間培養
して形質転換株を得る。
実施例
１ ［プラスミドpSMF4（3.8kb）の調製］
インベルターゼ遺伝子 SUC2を含むプラス
ミドpRB58をXho及びBamHで切断して
SUC2のプロモター配列及びシグナルペプチド
配列を含むXho〜BamH断片（約2.9kb）
を単離し、更にAvaで断片して約1.3kbの
DNA断片を得、この両端を充填した後BamH
リンカー（12mer）を連結した。
ミドpRB58をXho及びBamHで切断して
SUC2のプロモター配列及びシグナルペプチド
配列を含むXho〜BamH断片（約2.9kb）
を単離し、更にAvaで断片して約1.3kbの
DNA断片を得、この両端を充填した後BamH
リンカー（12mer）を連結した。
得られたDNA断片をEcoR及びBamH
で切断して、SUC2のプロモーター配列及びシ
グナルペプチド配列を含む約1kbのEcoR〜
BamH断片を得た。
で切断して、SUC2のプロモーター配列及びシ
グナルペプチド配列を含む約1kbのEcoR〜
BamH断片を得た。
次いで、これをプラスミドpUC8のEcoR
〜BamH部位に挿入して、プラスミド
pSMF4を得た。
〜BamH部位に挿入して、プラスミド
pSMF4を得た。
２ ［プラスミドpSMF6（3.6kb）の調製］
前記プラスミドpRB58をXba及びEcoR
で切断してインベルターゼ遺伝子のターミネー
ター配列を含むXba〜EcoR断片を単離し、
次いでこれをSau3A及びDdeで切断して
Sau3A〜Dde断片を得、この両端を充填後、
BamHリンカー（10mer）を連結し、BamH
及びAluで切断し、得られたDNA断片
（約0.55kb）を、プラスミドpUC8のBamH
〜Hinc部位に挿入してプラスミドpSMF6を
得た。
で切断してインベルターゼ遺伝子のターミネー
ター配列を含むXba〜EcoR断片を単離し、
次いでこれをSau3A及びDdeで切断して
Sau3A〜Dde断片を得、この両端を充填後、
BamHリンカー（10mer）を連結し、BamH
及びAluで切断し、得られたDNA断片
（約0.55kb）を、プラスミドpUC8のBamH
〜Hinc部位に挿入してプラスミドpSMF6を
得た。
３ ［pSMF18（3.9kb）の調製］
(1) プラスミドpBR322をPvuで切断し、
Hindリンカーを連結してPvu部位を
Hind部位に変えた後、EcoR及びHind
で切断して、大腸菌のARS及びアンピシ
リン耐性遺伝子を含むEcoR〜Hind断片
を作製し、 (2) 前記プラスミドpSMF4をEcoR及び
BamHで切断してEcoR〜BamH断片
を作製し、 (3) 前記プラスミドpSMF6をBamH及び
Hindで切断してBamH〜Hind断片を
作製し、 上記(1)、(2)及び(3)の３種のDNA断片を、
T4DNAリガーゼを用いて連結してpSMF18を
作製した。
Hindリンカーを連結してPvu部位を
Hind部位に変えた後、EcoR及びHind
で切断して、大腸菌のARS及びアンピシ
リン耐性遺伝子を含むEcoR〜Hind断片
を作製し、 (2) 前記プラスミドpSMF4をEcoR及び
BamHで切断してEcoR〜BamH断片
を作製し、 (3) 前記プラスミドpSMF6をBamH及び
Hindで切断してBamH〜Hind断片を
作製し、 上記(1)、(2)及び(3)の３種のDNA断片を、
T4DNAリガーゼを用いて連結してpSMF18を
作製した。
４ ［pSMF38T（6.6kb）の調製］
(1) 酵母プラスミド2μｍ DNAをEcoR及
びPstで切断してARSを含むEcoR〜Pst
断片を得た。
びPstで切断してARSを含むEcoR〜Pst
断片を得た。
(2) プラスミドYRp7のTRP1とARS1を含む
EcoR〜EcoR断片をPstで切断し
TRP1のみを含むEcoR〜Pst断片を調製
した。
EcoR〜EcoR断片をPstで切断し
TRP1のみを含むEcoR〜Pst断片を調製
した。
(1)及び(2)の断片を結合させることにより得ら
れた、2μｍ DNAの複製起点とYRp7のTRP1
とを含むEcoR〜EcoR断片を、pSMF18の
EcoR部位に挿入してpSMF38Tを得た。
れた、2μｍ DNAの複製起点とYRp7のTRP1
とを含むEcoR〜EcoR断片を、pSMF18の
EcoR部位に挿入してpSMF38Tを得た。
上記で得られたpSMF38Tは、サツカロマイ
セス・セレビシエ インベルターゼ遺伝子のプ
ロモーター配列、シグナルペプチド配列及びタ
ーミネター配列を有し、2μｍ DNA及び
pBR322由来の複製起点を有するシヤトルベク
ターであり、TRR1、Apr等の選択マーカーを
有する。
セス・セレビシエ インベルターゼ遺伝子のプ
ロモーター配列、シグナルペプチド配列及びタ
ーミネター配列を有し、2μｍ DNA及び
pBR322由来の複製起点を有するシヤトルベク
ターであり、TRR1、Apr等の選択マーカーを
有する。
７ ［分泌ベクターの構築］
(1) マウスアミラーゼ遺伝子の導入
(イ) マウスすい臓由来のアミラーゼ遺伝子を
含有するプラスミドpMSa104をPstで切
断し、得られた Pst〜Pst断片をプラ
スミド pUC13のPst部位に挿入して、
マウスアミラーゼ遺伝子を含むプラスミド
pRE1075（4.3kb）を作製した。
含有するプラスミドpMSa104をPstで切
断し、得られた Pst〜Pst断片をプラ
スミド pUC13のPst部位に挿入して、
マウスアミラーゼ遺伝子を含むプラスミド
pRE1075（4.3kb）を作製した。
pRE1075をApaで切断し、得られた
Apa〜Apa断片をS1ヌクレアーゼ処理
して平滑端とし、次いで Draで切断し
て、アミラーゼ前駆体の最初の15個のアミ
ノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白質（この遺伝
子はアミラーゼの分泌シグナルを欠失して
いる）した。をコードする Apa〜Dra
断片を採取。これにBamHリンカー
（12mer）を結合し、BamHで切断して
両端にBamH部位を持つDNA断片を得
た。
Apa〜Apa断片をS1ヌクレアーゼ処理
して平滑端とし、次いで Draで切断し
て、アミラーゼ前駆体の最初の15個のアミ
ノ酸を欠いたアミラーゼ蛋白質（この遺伝
子はアミラーゼの分泌シグナルを欠失して
いる）した。をコードする Apa〜Dra
断片を採取。これにBamHリンカー
（12mer）を結合し、BamHで切断して
両端にBamH部位を持つDNA断片を得
た。
(ロ) 一方、pSMF38TをBamHで切断後、
仔牛小腸由来のアルカリ性ホスフアターゼ
（ClAP）処理してリン酸基を除去した。
仔牛小腸由来のアルカリ性ホスフアターゼ
（ClAP）処理してリン酸基を除去した。
(イ)及び(ロ)で得たDNA断片を結合してマウス
アミラーゼ遺伝子を含むプラスミド pREl100
（8.1 kb）を得た。
アミラーゼ遺伝子を含むプラスミド pREl100
（8.1 kb）を得た。
８ アミラーゼ活性（分泌）の確認
上記方法により構築したプラスミドpREl100
を用いて酵母サツカロマイセス・セレビシエ
YNN27株をKU法により形質転換した。
を用いて酵母サツカロマイセス・セレビシエ
YNN27株をKU法により形質転換した。
得られた形質転換株を１％澱粉を炭素源とす
るYEP寒天培地上に接種し、30℃で３日間培
養した結果、アミラーゼの分泌生産による顕著
なハロー（halo）の形成が観察された。
るYEP寒天培地上に接種し、30℃で３日間培
養した結果、アミラーゼの分泌生産による顕著
なハロー（halo）の形成が観察された。
なお、アミラーゼ遺伝子を含まない前記プラ
スミドpSMF38Tを用いて上記と同様に
YNN27株を形質転換し、形質転換株を１％澱
粉を炭素源とするYEP寒天培地上に接種し、
30℃で３日間培養した場合には、ハローの形成
は観察されなかつた。
スミドpSMF38Tを用いて上記と同様に
YNN27株を形質転換し、形質転換株を１％澱
粉を炭素源とするYEP寒天培地上に接種し、
30℃で３日間培養した場合には、ハローの形成
は観察されなかつた。
第１図及び第２図は、本発明の複合プラスミド
の構成ルートを示す模式図であつて、図中の記号
Ａ，Ap，Au，Ｂ，Ｄ，Dr，Ｅ，Ｈ，Hc，Ｐ，
Pv，Ｓ，Ｘ，Xh等は夫々下記の制限酵素を示
す。 Ａ：Ava、Ap：Apa、Au：Alu、Ｂ：
BamH、Ｄ：Dde、Dr：Dra、Ｅ：EcoR
、Ｈ：Hind、Hc：Hinc、Ｐ：Pst、
Pv：Pvu、Ｓ：Sau3A、Ｘ：Xba、Xh：
Xho。
の構成ルートを示す模式図であつて、図中の記号
Ａ，Ap，Au，Ｂ，Ｄ，Dr，Ｅ，Ｈ，Hc，Ｐ，
Pv，Ｓ，Ｘ，Xh等は夫々下記の制限酵素を示
す。 Ａ：Ava、Ap：Apa、Au：Alu、Ｂ：
BamH、Ｄ：Dde、Dr：Dra、Ｅ：EcoR
、Ｈ：Hind、Hc：Hinc、Ｐ：Pst、
Pv：Pvu、Ｓ：Sau3A、Ｘ：Xba、Xh：
Xho。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サツカロマイセス・セレビシエのインベ
ルターゼ遺伝子（SUC2）中の、インベルター
ゼの翻訳開始コドンより約900bp上流にある
EcoR部位から、成熟インベルターゼのＮ末
端Serより下流12番目のアミノ酸であるValを
コードするGTCの位置にあるAva部位まで
のDNAと、 サツカロマイセス・セレビシエのインベルタ
ーゼ遺伝子（SUC2）中の、インベルターゼの
終止コドンより約70bp上流にあるSau3A部
位から、その約500bp下流にあるAlu部位ま
でのDNAを、のAva部位とのSau3A
部位との間でリンカーを介して直結したDNA
を含有することを特徴とする複合プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60233371A JPS6296086A (ja) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | 複合プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60233371A JPS6296086A (ja) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | 複合プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6296086A JPS6296086A (ja) | 1987-05-02 |
| JPH0336516B2 true JPH0336516B2 (ja) | 1991-05-31 |
Family
ID=16954072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60233371A Granted JPS6296086A (ja) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | 複合プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6296086A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003060071A2 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| WO2009058322A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2090589A1 (en) | 2002-02-07 | 2009-08-19 | Dyax Corp. | Albumin-fused Kunitz domain peptides |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02156881A (ja) * | 1988-12-12 | 1990-06-15 | Agency Of Ind Science & Technol | サッカロマイセスセレビシエｐｏｐ２ |
| JPH02156880A (ja) * | 1988-12-12 | 1990-06-15 | Agency Of Ind Science & Technol | サッカロマイセスセレビシエｐｏｐ１ |
| US5629167A (en) | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| CA2671261A1 (en) | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Neisserial antigens |
| EP1047784B2 (en) | 1998-01-14 | 2015-03-18 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neissera meningitidis antigens |
| GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
| EP2261338A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-04 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| WO2000066741A2 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Chiron S.P.A. | Conserved neisserial antigens |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| JP2004508801A (ja) | 1999-10-29 | 2004-03-25 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | ナイセリア抗原性ペプチド |
| PT2289545T (pt) | 2000-01-17 | 2016-09-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacina de omv suplementada contra meningococos |
| EP2213743A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-08-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2881568C (en) | 2000-10-27 | 2019-09-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| RU2331435C2 (ru) | 2001-12-12 | 2008-08-20 | Чирон Срл. | Иммунизация против chlamydia trachomatis |
| EP1562982B1 (en) | 2002-11-15 | 2010-05-05 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis |
| PT2054431E (pt) | 2006-06-09 | 2011-11-03 | Novartis Ag | Confórmeros de adesinas bacterianas |
| US9505823B2 (en) | 2006-08-07 | 2016-11-29 | TEV A Biopharmaceuticals USA, Inc. | Albumin-insulin fusion proteins |
| AU2012222833B2 (en) | 2011-03-03 | 2017-03-16 | Zymeworks Inc. | Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs |
| WO2014012082A2 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Zymeworks Inc. | Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs |
| CA2874083C (en) | 2014-12-05 | 2024-01-02 | Universite Laval | Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases |
| CN107400636B (zh) * | 2017-08-10 | 2020-10-09 | 安徽大学 | 一种蔗糖酶基因及其表达与应用 |
-
1985
- 1985-10-21 JP JP60233371A patent/JPS6296086A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003060071A2 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2090589A1 (en) | 2002-02-07 | 2009-08-19 | Dyax Corp. | Albumin-fused Kunitz domain peptides |
| WO2009058322A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6296086A (ja) | 1987-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0336516B2 (ja) | ||
| Gunkel et al. | Proteinase K from Tritirachium album Limber: characterization of the chromosomal gene and expression of the cDNA in Escherichia coli | |
| KR960011919B1 (ko) | IgA 단백질 분해효소를 이용한 재조합 단백질의 효소적 절단방법 | |
| CA1340173C (en) | Production and purification of a protein fused to a binding protein | |
| IE831185L (en) | Cloning system for kluyveromyces species | |
| JPH0513630B2 (ja) | ||
| JP2000135092A (ja) | オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド | |
| JPH05268970A (ja) | 部分的合成遺伝子を用いる成長ホルモンの発現 | |
| JP2733602B2 (ja) | ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母 | |
| JPH07110233B2 (ja) | リプレツシブルイ−ストプロモ−タ− | |
| JPS62500074A (ja) | バチルス スリンギエンシス 結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント | |
| JPS61158793A (ja) | ヒト・リゾチ−ムの合成遺伝子 | |
| JPH0576375A (ja) | 改良された酵母ベクター | |
| US5643791A (en) | Characterization and structure of an endodglucanase gene of Cellulomonas fimi | |
| JPH01501996A (ja) | 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター | |
| JP2507874B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコ−ドするｄｎａ配列 | |
| JP2560214B2 (ja) | 分泌シグナルペプチドをコードするｄｎａ配列 | |
| RU2120475C1 (ru) | Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты) | |
| JPH0256076B2 (ja) | ||
| JPS6398389A (ja) | 酵母における改良遺伝子発現 | |
| JPH0588110B2 (ja) | ||
| JP2500312B2 (ja) | ヒト成長ホルモンの生産法 | |
| JP2538200B2 (ja) | ポリペプチド分泌発現ベクタ―及び形質転換微生物 | |
| JPH035797B2 (ja) | ||
| JPH035798B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |