JPH0257189A - アキカラマツの気相培養によるベルベリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アキカラマツン（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　　
ｍ１ｎｕｓＬ、ｖａｒ　ｈｙｐｏｌｅｕｃｕｍ　Ｍｉｑ
、）の組織培養細胞を気相培養することによるベルベリ
ンの製造方法に関する。

（従来の技術） アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　　ｍ１ｎｕｓ　
Ｌ、ｖａｒ　ｈｙｐ。

ｌｅｕｃｕｍ旧ｑ、）はキンポウゲ科の植物であり、ア
ルカロイドであるベルベリンを含有することが知られて
いる。このベルベリンは１例えば、整腸剤。

細菌性腸疾患治療剤などの医薬品として、または染料と
して広く利用されている。

アキカラマツからベルベリンを採取するには。

天然の植物体から直接に採取する方法、およびアキカラ
マツの培養細胞（カルス）から採取する方法が知られて
いる。これらの方法のうち、天然のアキカラマツ植物体
からベルベリンを直接に採取する方法には、該植物体の
ベルベリン含有量が極めて少ない；アキカラマツの生育
が天候などの自然環境に左右されやすい；アキカラマツ
の採集に時間と手間がかかる；などの欠点があり、有利
なベルベリンの採取方法とはいえない。これに対して、
培養細胞（カルス）を用いる方法においては。

ベルベリン高生産性のカルスを選択し、天候などの自然
環境の影響を受けずにベルベリンを生産することが可能
であると考えられる。例えば、ファイトケミストリー（
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　２１巻、　１４１
９〜１４２１頁（１９Ｂ２）には、植物ホルモンとして
２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）および
カイネチンを含有するＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋ
ｏｏｇ）固体培地を用いてアキカラマツの組繊細胞を培
養する方法が記載されている。しかし、この方法におい
ては、培養培地と培養細胞からなる培養混合物から培養
細胞を分離するのが難しい。そのため、ベルベリンを得
るには、培養混合物をホモジナイズし、カルスを破砕し
てから抽出を行う必要があり、カルスを新たな培地に移
して培地からベルベリンを採取する連続生産が困難であ
った。上記培養混合物からの培養細胞の分離を良好に行
う方法として、アキカラマツの培養細胞を担体に包括さ
せて得られる固定化培養細胞を培養する方法が提案され
た（特開昭６０−２２７６９１号）。しかし、この方法
においては、培養細胞をアルギン酸ナトリウムなどの担
体に包括する操作が煩雑であり、操作を無菌的に行うの
に多大な労力を必要とした。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものでありその目的
とするところは、アキカラマツの培養細胞を連続操作の
可能な方法で培養することによりベルベリンを効果的に
大量生産する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 発明者らは、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　　
ｍ１ｎｕｓＬ、ｖａｒ　ｈｙｐｏｌｅｕｃｕｍ　Ｍｉｑ
、）の組織培養細胞を用いたベルベリンの製造方法であ
って、かつ培養液からベルベリンを効果的に採取するこ
とが可能な方法について研究を行い１本発明を完成する
に至った。

本発明のベルベリンの製造方法は、アキカラマツの組織
培養細胞を気相中に保持し、該細胞に液体培地を噴霧し
、かつ空気または酸素を供給して気相培養する工程；お
よび該培養により得られる培養物からベルベリンを採取
する工程；を包含し。

そのことにより上記目的が達成される。

本発明方法で組成培養細胞の培養に用いられる培地とし
ては、無機成分および炭素源を必須成分とし、これに必
要に応じて植物ホルモン、ビタミン類、アミノ酸などを
添加した培地が用いられる。

無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム
、カルシウム、マグネシウム、イオウ。

鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素。

ヨウ素、コバルトなどを含む無機塩が挙げられる。

それには、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム。

塩化カルシウム、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫
酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン
、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、二酸化モリブデン
、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルトな
どがある。

炭素源としては、ショ糖などの炭水化物およびその誘導
体、脂肪酸などの有機酸、およびエタノールなどのアル
コールが挙げられる。

植物ホルモンとしては、オーキシン類およびサイトカイ
ニン類が用いられる。オーキシン類としては、２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）　。

ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、　２．４．５−　）ジク
ロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、インドール酢
酸（ＩＢＡ）などが挙げられる。サイトカイニン類とし
ては、ゼアチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）　、カイネ
チン、リボシルゼアチン、イソペンテニルアデニンなど
が挙げられる。ベルベリンの生産量を高クシ、かつベル
ベリンを細胞外へ放出しうるカルスを得るためには、　
ＮＡＡおよびＢＡを合わせて使用することが好ましい。

ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ＶＢ＋）。

ピリドキシン（ＶＢ＆）　、ピリドキサール、ピリドキ
サミン、パントテン酸カルシウム、アスコルビン酸（Ｖ
Ｃ）　、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸アミド
、リボフラビン（ＶＢｚ）などが挙げられる。

このような培地としては、植物の組成の培養に一般に使
用される培地に、上記炭素源、さらに必要に応じて上記
植物ホルモン、ビタミン類などを添加した培地が用いら
れる。上記植物の組成培養に一般に使用される培地とし
ては、　ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇ）培地、
　ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−３ｋｏｏｇの）培地、ホ
ワイト（Ｗｈｉｔｅ）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏ
ｒｇ）のＢ−５培地などの液体培地があり、　ＭＳ培地
またはＬＳ培地が好適に用いられる。

本発明方法によりベルベリンを製造するには。

まず、アキカラマツの植物体組織から培養細胞を調製す
る。培養細胞としては２例えば、アキカラマツの根、茎
９葉、花芽または種子から採取した組織片から誘導され
るカルスが好適である。カルスの誘導は通常のカルス誘
導法により行われる。

例えば、上記の組織片を滅菌処理した後、植物ホルモン
を含有する上記培地（固体培地を用いる）に置床し、無
菌的に培養することにより行われる。

このようにして得られたカルスは、適当な液体培地を用
いて継代培養がなされる。この継代培養において、ベル
ベリンの生産性が高く、生育速度の速い安定した性質の
カルスが選択される。このようにして継代培養されたカ
ルスをシードとして用い、気相培養が行われる。

本発明方法による気相培養は１例えば、第１図に示す気
相培養装置を用いて行われる。この培養装置は、培養槽
１を有し、該槽１は外部に加熱滅菌および温度調節手段
１１を備えている。槽１の上方部にはカルス投入用の植
込口１００および通気口１０１が設けられ、下方部には
培養液収容部１２が設けられている。この収容部１２の
上方気相中には多孔板１３が配置されている。多孔板１
３は、アキカラマツのカルスを保持するものであり、ス
テンレス製金網などの網状構造物を含む。孔の大きさは
カルスが培養液収容部１２へ落下しない程度の大きさに
設定される。多孔板１３上のカルス１４の上方にノズル
１５が開口している。このノズル１５は、これと上記培
養液収容部１２とを接続する送液管１６を介して循環ポ
ンプ１７により、収容部１２の培養液（培地液およびカ
ルスの生産物を含有する）を植物組織１４に供給するた
めに設けられる。多孔板１３は、培養槽１中に間隔をあ
けて平行に複数枚設置されていてもよい。複数枚の多孔
板１３が設置される場合には、各多孔板１３上のカルス
１４の上方にそれぞれノズル１５が開口し、カルス１４
に必要最小量の培養液が均等に供給されることが好まし
い。

アキカラマツのカルスの気相培養を行うには。

まず、上記装置の植込口１００からカルスを培養槽１内
に入れ、多孔板１３上に該カルスをほぼ均一の厚みとな
るように載置する。上記成分を有する培地液はポンプ１
７により送液管１６を通り、ノズル１５からカルス１４
上へ噴霧される。一方の通気口１０１からは空気もしく
は酸素が供給され、他方の通気口１０１からこれが排出
される。上記培養においては光は必須ではなく、照射し
てもしなくてもよいが、暗所での培養が好ましい。

カルス１４は、多孔板１３上で培地液および空気の供給
により生育してベルベリンを生成する。このベルベリン
は、主にカルス細胞外に放出され、培養液中に蓄積され
る。この培養液を採取し、硝酸イオンまたは塩素イオン
を含む溶液または該イオンを形成しうる塩を添加するこ
とにより、ベルベリンが硝酸塩または塩化物として析出
する。例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化
アンモニウムまたはその溶液が用いられる。

上記装置を用いた本発明方法において、得られる培養液
（ベルベリンを含有する）の半量を培養槽から回収し、
同量の新たな滅菌培地液を加え。

さらに培養を行うことにより連続的に培養液を回収する
ことができ、ベルベリンの製造が効果的に行われる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施■土 アキカラマツの幼芽部組織を採取し、常法に従って滅菌
し、１μＨの２．４−Ｄを含有するＬＳ固体培地に置床
した。これを２５°Ｃの暗所に静置してカルスを誘導し
、継代培養を行った。次いで、このカルスをＬＳ液体培
地（植物ホルモンとして１００μＨのＮＡＡおよび１０
μｈのＢＡ、および炭素原として３０ｇ／　１のシュク
ロースを含有する）に移植し、２５°Ｃで振盪しながら
（１００ストロークス／分）継代培養した。

この際、濃い黄色を示しくベルベリン生産性が高い）、
生育の良好なカルスを駒込ピペットで選択し、これを新
たなＬＳ液体培地に植え継ぐことにより継代培養を行っ
た。得られたカルスを気相培養用シードとした。

上記のようにして得られたカルス培養物を第１図に示す
気相培養装置の植入口１００から多孔板１３上に接種し
た。培地液としては、上記カルスの液体培養に用いたの
と同様の培地を使用した。植込口１００を密閉した後、
ポンプ１７を駆動させて培養液収容部１２の培地液を送
液管１６を介してノズル１５からシード組織に連続的に
噴霧供給した。培地液または培養液の供給量は１００Ｉ
Ｒ１７分であり、該培地液または培養液に対する空気量
は１／１０〜１／３０ＶＶＭの範囲とした。培養槽１の
内圧は９通気口１０１を介して設置した調圧バルブによ
り０．１〜０．７ｋｇ／ｃｍ”Ｇに調節した。培地液ま
たは培養液はカルス１４に供給され、残余は多孔板１３
から培養液収容部１２へ流下した。流下した培養液は再
びポンプ１７により送液管１６を通ってノズル１５から
植物組織に供給された。培養液はこのようなサイクルを
繰り返して循環した。植物組織は、このようにして２５
℃にて１６日間培養された。

培養槽１から培養液ＩＩ！、を回収した。この培養液中
には、ベルベリンが蓄積されていた。この培養液に硝酸
カリウムを添加することにより、ベルベリンを硝酸塩と
して析出させて回収した。このようにして回収されたベ
ルベリンの量は。

培養液１１当り８５０■であった。

１隻ｍ 実施例１と同様の工程により１６日間培養を行った後に
培養液の半量を回収した。培養液収容部１２に残った培
養液の半量に新たなＬＳ液体培地（実施例１と同じ組成
）を同量加え、気相培養を継続した。５日間培養後、再
び培養槽１から培養液を回収し、ベルベリンを硝酸塩と
して回収した。このようにして回収されたベルベリンの
量は、培養液１１当り８５０■であった。上記新たな培
地を加えたときの培養液にはベルベリンが１！当り４２
５ｍｇ含有されていたため、この５日間の培養によりベ
ルベリンが培養液１２当り４２５■生産されたことにな
る。

このように、適当な期間培養した後に培養液を新たなも
のに取り替えて気相培養を行うことにより、同一の培養
細胞を繰り返し用いて、効率良（ベルベリンが生産され
る。

（発明の効果） 本発明によれば、アキカラマツ植物体の組織培養細胞（
カルス）を気相培養することにより、ベルベリンが効果
的かつ安定的に大量生産される。

上記気相培養により９組織培養細胞を担体に保持させる
などの処理をせず直接培養することができるので、煩雑
な操作を必要とせず、無菌的操作が簡便に行われる。こ
のようにして得られるベルベリンは、各種医薬品や染料
として利用される。

４、　′　　の　　　な−゛ 第１図は２本発明で用いる気相培養装置の正面断面図で
ある。

１・・・培養槽、１１・・・加熱滅菌および温度調節手
段。

１２・・・培養液収容部、１３・・・多孔板、１４・・
・アキカラマツのカルス、１５・・・ノズル、１６・・
・送液管、１７・・・循環ポンプ、　　１００・・・植
込０．１０１・・・通気口。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アキカラマツ（￥Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ￥￥ｍｉｎ
   ｕｓ￥Ｌ．ｖａｒｈｙｐｏｌｅｕｃｕｍ　Ｍｉｑ．）の
   組織培養細胞を気相中に保持し、該細胞に液体培地を噴
   霧し、かつ空気または酸素を供給して気相培養する工程
   ；および 該培養により得られる培養物からベルベリンを採取する
   工程； を包含するアキカラマツの気相培養によるベルベリンの
   製造方法。