JPH0257670B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫分析法、ことに感度の高い免疫
分析を迅速適宜に行う方法に関する。

臨床上の分析法では、問題の抗原種のこん跡を
含む血清の希釈試料をとくに排他的にこん跡の抗
原と反応するように調整した或る比率の抗体と混
合する。この抗体を通常、自然に生ずる試料のう
ち最も異常なものの中に存在すると考えられる最
高量の抗源に中程度の化学量論的過剰量にして加
える。

これ等の２種の分子間の反応は二分子反応であ
り、その速度はこれ等の分子の濃度の相乗積に比
例する。抗原の濃度が10^-12ｇ／ml程度に低いと
き（一般に多くの自然生成のホルモンの場合のよ
うに）は、反応の終る時間は24hrより長い。この
場合分析手順が不当に長くなる。

さらにこのような低い濃度では反応の検出が著
しく困難になる。

種種の有名な同位元素希釈法がこのような分析
のために使われている。その最も簡単なもので
は、加えられる抗体の化学量論的当量をわずかに
越える量で放射性同位体トレーサー的
（isotopicallylabelled）抗原（以下ラベル抗原と
言う）の試料を混合物に加える。このラベル抗原
は、抗体に対する非ラベル抗原と拮抗しラベル抗
原の非ラベル抗原に対する比率に比例して結合す
る。反応の終つた後、反応した抗原−抗体錯化合
物を反応していない抗原から分離する（多数の方
法のうちの任意の１つにより）。そしてこれ等の
互いに分離した部分のどちらか一方又は両方の部
分の放射能を使い血清試料中の抗原の初めの濃度
を定めることができる。

その他のラベル抗原（たとえばけい光ラベル、
化学発光ラベル、スピンラベル等の抗原）が同様
な種類の分析に使うことができるのは明らかであ
る。一般に放射性ラベル法に対し別の方法で感度
が匹敵できるかどうかは、けい光ラベル、化学発
光ラベル等による分析手順の感度に依存する。放
射性とは異なつてこれ等の他のラベルを検出する
方法の多くのものの感度は濃度に極めて依存す
る。

非同位体法の感度が放射性同位元素希釈法に匹
敵し又はこの希釈法より高い場合には、このよう
な非同位体法が好適なことが多い。実験室員が放
射性物質にさらされることに伴う健康の阻害は非
放射性ラベルを使うことによりなくなる。さらに
非同位体トレーサーでは、放射性の免疫分析試薬
が有限の短い半減期を持つので、試薬寿命が一層
長くなる。又非放射性試薬の費用が一層安くまた
これ等の試薬を検出する器具の法が一層簡単で一
層安価であるから、非放射性ラベルの方が望まし
い。

従つて非放射性ラベリングを使い抗原及び抗体
を300倍又はそれ以上に自動的に濃縮する（従つ
て反応速度を90000倍又はそれ以上に高める）免
疫分析法は、極めて時間のかかる既存の方法たと
えば、米国セント・ルイス市のスイー・ブイ・モ
スビー・カムパニ（C.V.Mosby Co.）から1978
年に刊行されソレル（Thorell）及びラースン
（Larson）を著者とする論文『放射性免疫分析及
び関連技術の方法論及び臨床的応用』の第144、
186、198及び200頁に記載の方法より著しく有利
である。

予備濃縮を望ましい認めてはいても、従来この
成績を得るのに便宜の手段が得られていない。反
応成分は遠心法により予備濃縮することができる
が、この方法では十分には満足ができない。第１
の例では予備濃縮した反応成分は、これ等を反応
のために遠心機から取出すときに部分的に再希釈
しなければはらないことが多い。第２にこの方法
では通常高価な設備を必要とする。第３にこの方
法は異常に時間がかかる。このことはとくに低分
子量の種たとえばアンジオテンシン
（angiotensin）及びハプテン（hapten）のような
小さな抗原の場合にいえる。

本発明では、反応が行われる媒質自体内で両反
応成分について予備濃縮を行う。この場合再希釈
による前記した障害がなくなる。さらに本発明で
は各反応成分を、免疫分析に適用する従来の方法
で一般に行われているよりも多数倍も高度に濃縮
する。さらに本発明ではこれ等の目的をすべて安
価にかつ迅速に達成することができる。

従来の方法では免疫反応成分すなわち抗原（又
はハプテン）及び抗体がゲル媒質の局部的区域内
で反応する。試験物質は電気泳動によりゲルを経
て移動させ不動化した反応成分に反応しながら接
触させる。平衡状態になつた後、反応してない又
は結合してない物質はさらに電気泳動により不動
化反応成分から分離する。前記したような方式は
米国特許第3966897号明細書に記載してある。し
かしこの特許明細書にはゲル媒質内で各反応分を
予備濃縮することは記載してない。

本発明は一般に従来の免疫分析に比べて、反応
の各成分をこれ等の成分が内部で反応する同じ媒
質内で濃縮することが異なつている。従来は極め
て急速な反応速度の得られる最終電位は決して十
分には生じない。その理由は各反応成分が濃縮さ
れた状態にならないからである。

本発明による分析法は、免疫反応成分を同じ媒
質内で円板状に濃縮し集める電気泳動法を使う。
本方法では各反応成分を精密に制御して媒質を経
て移動させる。媒質中の反応成分の移動の制御
は、これ等の反応成分の反応を伴う相互の接触を
生ずる次の移行に先だつてこれ等の反応成分を濃
縮するのに使う。

本発明分析法は、(a)免疫反応成分を媒質中で移
行させこの媒質中で濃縮し、(b)濃縮した各成分を
前記媒質内でさらに相対的に移させ相互に反応を
伴つて接触させ、(c)濃縮した各成分を前記媒質内
で反応させることから成つている。

本発明によるデイスク（disc）電気泳動分析方
法は次の利点がある。

１ 24hrの免疫反応は1sec以下に短縮される（た
とえば24hr×90000sec／hr÷90000＝1sec） ２ 反応し又反応してないラベル抗原の自動分離 ３ 非放射性ラベルによる高い感度 ４ 簡単な装置及び取扱い ５ 安価なこと 本発明の目的は、初めに希釈した各反応成分に
よる迅速な反応を生じさせる方法を提供しようと
するにある。

本発明の他の目的は、免疫反応成分を同じ媒質
内で予備濃縮して反応させようとするにある。

なお本発明の他の目的は、免疫分析を行う安価
迅速な方法を提供しようとするにある。

さらに本発明の目的は、一層感度の高い分析を
行う方法を提供しようとするにある。

以下本発明によるデイスク電気泳動分析法の実
施例を添付図面について詳細に説明する。

第１図にはデイスク電気泳動装置を竪断面で示
してある。

米国特許第3384564号明細書によるデイスク電
気泳動法では孔の大きいポリアクリルアミドゲル
１をガラス管２内に用意する。ゲル１は、対流を
妨げる媒体として作用するが、これがないと印加
した電界内のイオンの運動をわずかしか妨げな
い。ゲル１はかなりの濃度（たとえば0.06M）の
弱塩基性の塩［たとえばトリスオキシメチルアミ
ノメタン（TRIS）］と塩酸とを6.7に近いPHで調
合し、TRIS−HCl緩衝液を生成する。この場合
イオン種（ionic species）はTRIS⁺及びCl^-であ
る。ガラス管２はその上端部３が溜め４の上部緩
衝液５内に突出し、下端部６が溜め８の下部緩衝
液５内に浸るように配置してある。上下の溜め
４，８は、0.5Mの程度の濃度のTRIS及びグリシ
ンの溶液から成る緩衝液５，７を入れてある。上
部溜め４は陰極９を備え、そして下部溜め８は陽
極１０を備えている。各電極９，１０は、それぞ
れ、各電極９，１０を横切つて約200Vの電位で
数ｍＡを送出することのできる給電源１２の陰極
（−）及び陽極（＋）に、スイツチ１１を経て位
置Ａを介して接続される。

抗原Ag、抗体Ab及びラベル抗原Ag^*を含む血
清の混合物を、さらに蔗糖の40％水溶液と混合す
れば［緩衝液５の濃度より著しく高い濃度を持つ
溶液を作るために］、この混合物は緩衝液５の下
方のゲル１の頂部上で極めて容易にピペツトで取
ることができる。

スイツチ１１を位置Ａに閉じると、電界はゲル
１の長手に沿つて印加される。正味の負の電荷を
持つ試料分子（通常多くの血清たんぱく質及び抗
原を含む）はガラス管２内のゲル１を経て下方に
溜め８に向つて移向し始める。

米国特許第3384564号明細書とニユーヨーク科
学協会年報第121号（1964年刊）第321ないし349
頁のオーンステイン・エルの論文とに記載してあ
るように、これ等の負に帯電したイオン種は、若
干の互いに近接した円板形の各区域（図示してな
い）に集中する。塩素イオンCl^-より低い最高の
移動度を持つイオン種はCl^-のすぐ後方の前部区
域にある。他のすべての陰イオンは後部区域に位
置し、これ等の陰イオンは電気泳動の移動度が後
部に向い逐次低くなり、最後の区域は約PH8.9で
グリシネ−トイオンに最も近い移動度を持つ最も
遅い陰イオンが占める。この最後の区域にグリシ
ネ−トイオンが後続する。各区域の陰イオンは、
この区域の導電率の増加により、陰イオンの速度
を第１の区域の前方でゲル１内のCl^-の速度に正
確に等しい値に減らすのに十分なだけ電位こう配
に局部的低下を生ずるまで濃縮される。次いで給
電源１２からの一定の電流により、次次の区域は
元のままの一定の速度で移行し、各区域の厚み
は、一定のままに保持され、出発試料内の各成分
の濃度に正比例する。この現象は定常状態の重な
りと称する。各区域の最終濃度は、出発濃度に無
関係であり、出発条件により定まるゲル１内Cl^-
の濃度だけによる。このことは、初めに約６×
10^-6Mの濃度で存在する各血清成分が、約10000
倍（0.06÷６×10^-6）の濃度であることを意味す
る。初めに２×10^-4Mで存在するこれ等の成分
は、約300倍等の濃度になる［ニユーヨーク科学
協会年報第121号（1964年刊）の第321ないし349
頁のオーステイン・エルの論文参照］。

しかし定常状態の重なり区域生成法では、濃縮
に伴つて分離するから、第１図に例示した装置
は、修正しないままにしておけば、抗原（Ag及
びAg^*）及び抗体（Ab）を集めて反応させない。

本発明は、後述のように前記の説明及び引用文
献で述べた方法によつて実施される。

本発明の１実施例によれば、第１図の装置を、
上下の溜め５，７の緩衝組成物が初めに互いに異
なるようにする。たとえば上部溜め５に前記のよ
うにグリシネートのような遅い陰イオンを入れ、
下部溜め７にはこの場合グルカミンのような遅い
陽イオンを入れる。ゲル１は酢酸アンモニウムの
ように早い陽イオン及び早い陰イオンの塩を含
む。このゲル溶液のPHは（1964年刊行のニユーヨ
ーク科学協会年報第121号第341頁のオーンテイ
ン・エルの論文に記載してあるように）、試験中
に一方の免疫反応種（たとえば抗体Ab）が陽イ
オンであり、他方の免疫反応種が陰イオンになる
ようにする。

陰イオン種（これは試料抗原Ag及びラベル抗
原A^*とする）は前記のように蔗糖溶液中に入れ
ると、前記したように層状に重なり濃縮する。

試料が層状に重なつた後、スイツチ１１をオフ
位置にする。上下の溜め４，８を別の各溜め（図
示してない）にあける。ゲルガラス管２を上部溜
め４から取出し、逆さにして上側を下にしてふた
たび溜め８に挿入する。前回に下部溜め８からの
緩衝液７はこの場合上部溜め４に注入する。又前
回に上部溜め４からの緩衝液５は下部溜め８に注
入する。

陽イオン種（これを抗体とする）を蔗糖溶液内
のゲル１の頂部３［前回には底部６］に装入す
る。この場合スイツチ１１を位置Ｂに投入する。
陽イオン種は、前部のNH₄ ⁺イオンと、後続のグ
ルカミン陽イオンとの間にこの場合下方に移動す
る高度に濃縮した層状に重なる。前回に重なつた
陰イオン抗原（Ag＋Ag^*）は動き続ける（ただ
しこの場合上向きに）。やがてこれ等の互いに反
対の向きに移動する２つの免疫反応種の層は互い
に出会つて反応する（図示してない）。反応した
層又は反応してない層或はこれ等の両方の層内の
ラベル抗原Ag⁺の量を測定し、試料内の抗原Ag
の量を定める。

第２図にはとくに前記した本発明方法による免
疫分析を行うための自動装置を例示してある。

免疫反応を支え反応に先だつて免疫種を移動さ
せ濃縮するゲル３１は、たわみ性のプラスチツク
製支持テープ３３又は幅状体に支えてある。ゲル
３１は、貯蔵リール（図示してない）から巻きほ
ぐし引続いて巻取りリール（図示してない）にふ
たたび巻取るテープ３３又は幅状体上に生成す
る。

ゲル３１は、それぞれ単一の反応を生ずる各別
の区間３２に配置される。各区間３２は、それぞ
れ矢印で示した後述する１連の場所５０，６０，
７０，８０を過ぎて割出しされる。各区間３２に
は、それぞれ１対のくぼみ３４，３５が形成され
ている。分与場所５０でくぼみ３４は、上方の分
与器３７から抗原（Ag＋Ag^*）を受け、そして
くぼみ３５は、分与器３９から抗体３８（Ab）
を受ける。

特定の区間３２が免疫反応物すなわち抗原３６
及び抗体３８を受けた後、区間３２は、テープ３
０の両端間に電界を印加するように場所６０に割
出しされる。それぞれくぼみ３４，３５内に入れ
た免疫反応剤は、電界の影響のもとにゲル３１の
上面４０の下方に移動する。ゲル３１は、受入れ
くぼみ３４，３５を介しゲル上面４０の下方への
反応物の移動を支え表面効果及びこぼれをなく
す。

場所６０には、それぞれ前記したようなグリシ
ネート（遅い陰イオン）及びグルカミン（遅い陽
イオン）の緩衝液４３，４４を入れる２個の容器
４１，４２を設けてある。各緩衝液４３，４４の
イオンは、ゲル３１の各側部４７，４８に接触す
る湿り心材４５，４６を介してゲル３１に送られ
る。

イオンの移動は、それぞれ緩衝液４３，４４内
に配置した電極５１，５２を介して生ずる。

前記のようにゲル３１は適正なPHにおける酢酸
アンモニウムのような早い陽イオン及び早い陰イ
オンの塩を含む。

ゲル３１の区間３２を場所６０に割出しする
と、抗原３６及び抗体３８はゲル３１を横切つて
矢印５５により示すように相互に近づく向きに移
動し始める。免疫反応物すなわち抗原３６及び抗
体３８はゲル３１の中央部分５６で集中し相互に
出会つて反応する。電力源５３からの電流は、各
免疫反応剤間の反応中に切られ又は弱められる。

次に区間３２は、図示のように反応した成分及
び反応してない成分を分離するために、ゲル３１
を横切つてさらに電位を印加するように場所６０
と同じ部品を持つ第２の場所７０に割出しされ
る。

区間３２は次いで走査検出場所８０に割出しさ
れる。場所８０は結合した部分６０′又は結合し
てない部分６１或は両部分６０′，６１内でラベ
ル抗原Ag^*を測定し、試料抗原Agを定める。

この自動装置は、ゲル３１を平らな水平位置に
位置させることにより重力の影響をなくしてある
から、前記したようにゲル３１を逆さにする必要
がない。

当業者には明らかなように各場所５０，６０．
７０，８０の全部ではなくても幾つかを組合わせ
てもよい。しかしこの実施例のような各別の場所
により、複数の試験が１度に処理できるから作用
能力が高くなる。又抗原Ag^*及び抗体Abは、使
用の直前にふたたび湿らせる乾燥したゲル内に含
ませてもよい。

本発明の前記の実施例はすべて制限した又は対
流を生じない媒体を通る電気泳動移行の処理中に
各反応成分の１種類又は複数種類の濃縮を行う。
濃縮した各成分は濃縮に使つた同じ媒質内で反応
を伴つて接触するようになり再希釈及び転送の必
要がなくなる。反応はすべて同じ媒質内で監視さ
れ便利である。

本発明により考えられる反応ではすべて、成分
及び免疫種は自然の電離性のものであるか、又は
結合や誘導のような適正な化学処理と溶液のPHの
選択とにより電離性にすることができる。

反応は、多くの種類の標準のけい光計、光度
計、比色計又は同位体による方法によつてゲル材
料内で監視することができる。

ゲルのような非対流性媒体は物質の移行を制御
する装置に好適である。本発明に使うことのでき
るゲルはセフアデツクス（Sephadex）、寒天、ポ
リアクリルアミド等のような標準の原料から選
ぶ。定常状態の重なり移行は、所要の極めて高い
濃度が得られるようにコールラウシユ調整作用に
より精密に制御する。これ等のゲルは又半透明又
は透明にして反応がゲル内で光学的に監視できる
ようにするのがよい。

以上本発明をその実施例について詳細に説明し
たが本発明はなおその精神を逸脱しないで種種の
変化変型を行うことができるのはもちろんであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はデイスク電気泳動濃縮を行う電気泳動
装置の１例の竪断面図、第２図は本発明方法を自
動的に実施するためのデイスク電気泳動分析装置
の斜視図である。 ３１……ゲル、３３……テープ、３６……抗
体、３７，３９……分与器、５０……場所（導入
装置）、５１，５２……電極、５３……電力源、
６０，７０……場所（電界印加装置）、８０……
場所（測定装置）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (1) 試料中のイオン電荷をもつ免疫反応成分
   をデイスク電気泳動分析法により定量分析する
   にあたり、 (イ) 該試料及び該試料中の該免疫反応成分の後
   述する予め定めた量のラベル等価物を多孔性
   の媒質中にその一端部から導入し、 (ロ) 該媒質の両端部間に電界を印加してデイス
   ク電気泳動により該免疫反応成分及びそのラ
   ベル等価物を該媒質中で移動させ定常状態の
   重なりとして濃縮し、 (ハ) 他方、該免疫反応成分及びそのラベル等価
   物と特異的に反応するそしてこれらと逆のイ
   オン電荷をもつ免疫反応体を該媒質の他端部
   から導入しそしてこれらと逆方向にデイスク
   電気泳動させて同様に濃縮し、 (ニ) こうして互いに近寄る方向に移動する濃縮
   された該免疫反応成分及びそのラベル等価物
   と該免疫反応体とを該媒質中で出会わせて反
   応させ、この反応において前者が後者よりも
   過剰量になるように該ラベル等価物の導入量
   を予め定めてあり、 (ホ) 未反応の該免疫反応成分及びそのラベル等
   価物を該媒質中でさらに移動させて反応生成
   物から分離し、そして (ヘ) 未反応の該ラベル等価物の量又は反応生成
   物中の該ラベル等価物の量又はこれら両方を
   測定することによつて該試料中の該免疫反応
   成分の量を定める、 ことを特徴とする、定量分析法。 (2) 免疫反応成分として陰イオン抗原を、ラベル
   等価物としてそのラベル抗原を、そしてこれら
   と特異的に反応する免疫反応体として陽イオン
   抗体を、それぞれ使う前項(1)に記載の定量分析
   法。