JPH0258280B2

JPH0258280B2 -

Info

Publication number: JPH0258280B2
Application number: JP59100441A
Authority: JP
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Takaaki Aoyanagi; Masa Hamada; Keiji Ogawa; Hironobu Iinuma
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1984-05-21
Publication date: 1990-12-07
Also published as: HUT38971A; ES8605584A1; ZA853779B; PT80496A; PT80496B; JPS60246399A; ES543289A0; DK223385D0; GR851217B; EP0162422A2; DK223385A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアンジオテンシン変換酵素に対して
酵素阻害活性を示す新規生理活性物質ホルオキシ
ミチン（Foroxymithine）、その製造法およびそ
れを有効成分とする降圧剤に関するものである。本発明者らは、微生物化学研究所の構内の土壌
より分離された放射菌であつてMG329−CF56株
と名付けた菌を培養し、得られる培養液中にアン
ジオテンシン変換酵素阻害活性を有する物質が
存在することを見出した。その酵素阻害物質の採
用方法について検討し、その物質の単離に成功し
かつ本物質が新規物質であることを確認して本発
明を完成した。本発明者らは、さらに医薬としてのホルオキシ
ミチンの有用性について検討し、本物質が降圧作
用を有することを見出した。アンジオテンシン変換酵素によるヒプリル−
Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンの分解を阻止する
本物質の効力について調べた結果、後述の試験例
に示されるごとく、本物質は抗アンジオテンシン
変換酵素活性を有することが確認された。したがつて、第一の本発明の要旨とするところ
は、次の式で表わされる抗アンジオテンシン変換酵素活性
を有する新生理活性物質ホルオキシミチン又はそ
の薬学的に許容できる塩にある。ホルオキシミチ
ンは後記の実施例を示すごとく、ホルオキシミチ
ン生産菌の培養液を、活性炭、DEAE−セフア
デツクスＡ−25のクロマトグラフイー等で分画
することにより白色粉末として採取できる。ホルオキシミチンの物性はつぎのとおりであ
る。すなわち、ホルオキシミチン・２水和物は融
点105〜130℃（分解）、質量分析法で得られ分子
量は575である。元素分析値はC43.46％、H6.31
％、N16.2％であり、C₂₂H₃₇N₇O₁₁・2H₂Oの分
子式を得る。また比旋光度は〔α〕²² _D−44.5゜（ｃ＝
１、H₂O）である。ホルオキシミチンの赤外部
吸収スペクトル（臭化カリウム錠）は添付図面に
示すとおりであり、3400、3250、2940、1660、
1540、1460、1380、1340、1240、1060、880（cm
^-1）に特異吸収帯を示す。ホルオキシミチンのプロトン核磁気共鳴スペク
トル（重水中、100MHz）は2.0〜2.4（CH₂×６）、
2.5（CH₃×１）、3.9〜4.25（CH₂×３）、4.25〜4.4
（CH₂×１）、4.5〜4.75（CH×２）、4.75〜4.9（CH
×１）、5.46〜5.65（OH×１）、8.42 （＝Ｃ｜−Ｈ×1.5）、8.78（＝Ｃ｜−Ｈ×0.5） ppmに吸収を示す。また第二の本発明の要旨は、ストレプトミセス
属に属するホルオキシミチン生産菌を培養して本
物質を培養物中に生産、蓄積させ、これを採取す
ることを特徴とする新規生理活性物質ホルオキシ
ミチンの製造法にある。本発明の方法において、ホルオキシミチン生産
菌とは、ホルオキシミチンを生産する菌株を意味
する。本発明のホルオキシミチンの生産に使用さ
れる生産菌の例には本発明者らによつて微生物化
学研究所の構内で採取された土壌より分離された
ストレプトミセス・ニトロスポレウス
（Streptomyces nitrosporeus）MG329−CF56株
と本発明者らによつて京都市左京区鞍馬山の土壌
より分離されたストレプトミセス・ザオミセテイ
カス（Streptomyces zaomyceticus）MG325−
CF7株がある。これらの菌株は工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請し、昭和58年９月16日付でそれぞれ
微工研菌寄第7244号（FERM Ｐ−7244）及び微
工研菌寄第7243号（FERM Ｐ−7243）として受
託された。以下にこれらの菌株を菌学的性状につ
いて記述する。 (イ) MG329−CF56株の菌学的性状１形態 MG329−CF56株は顕微鏡下で、分枝した
基中菌糸より比較的長い、真直ぐな
（Rectifl−exibiles）気菌糸を形成し、螺旋
形成及び輪生枝は認められない。成熟した胞
子鎖は10個以上の胞子の連鎖を認め、胞子の
大きさは0.4〜0.6×0.8〜1.4ミクロン位で、
その表面は平滑である。２各種培地における生育状態色の記載について〔〕内に示す標準はコ
ンテイナー・コーポレーシヨン・オブ・アメ
リカのカラー・ハーモニイ・マニユアル
（Container Corporation of Americaの
Color Harmony Maniual）を用いた。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培
養）無色の発育上に、茶灰の気菌糸をうつす
らと着生し、溶解性色素は認められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（27
℃培養）発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性
色素も認められない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地
（ISP−培地５、27℃培養）うす黄〔１ 1/2ie、Lt.Olive〕の発育上
に白〜明るい茶灰〔2fe、Covert Gray〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに
黄味をおびる程度である。 (4) スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培地
４、27℃培養）うす黄〔１ 1/2ea、Lt、Yellow〕の発
育に、白〜明るい茶灰〔2dc、Natural
String〕の気菌糸を着生し、溶解性色素は
わずかに黄味をおびる程度である。 (5) チロシン寒天培地（ISP−培地７、27℃
培養）うす黄茶の発育上に、白〜明るい灰
〔2fe、Covert Gray〕の気菌糸を着生し、
かすかに茶色の溶解性色素を生産する。 (6) 栄養寒天培地（27℃培養）オリーブ灰〔1ig、Olive Gray〕の発育
上に、茶白〔3ba、Pearl Shell Tint〜
3dc、Natural〕の気菌糸を着生し、溶解
性色素は茶色をおびる。 (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地
２、27℃培養）うす黄茶の発育上に、白〜明るい茶灰
〔2fe、Covert Gray〜3fe、Silver Gray〕
の気菌糸を着生し、溶解性発色は認められ
ない。 (8) オートミル寒天培地（ISP−培地３、27
℃培養）うす黄茶の発育上に、白〜明るい茶灰
〔3fe、Silver Gray〕の気菌糸を着生し、
溶解性色素は認められない。 (9) グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培
養）うす黄茶〔１ 1/2ea、Lt、Lellow〕の
発育上に、白〜明るい茶灰〔2de、
Natural String〕の気菌糸を着生し、溶
解性色素は黄味をおびる。 (10) スターチ寒天培地（27℃培養）うす黄茶の発育上に、茶白〜明るい茶灰
〔2fe、Covert Gray〜3fe、Silver Gray〕
の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められ
ない。 (11) リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養）うす黄茶〔1ca、Pale Yellow〕の発育
上に、白〜明るい灰の気菌糸を着生し、溶
解性色素は認められない。 (12) セルロース（27℃培養） 21日間培養したが、発育は認められなか
つた。 (13) ゼラチン穿刺培養単純ゼラチン培地（20℃培養）では、う
す黄の発育上に、明るい灰〜明るい茶灰の
気菌糸を着生し、うす茶色の溶解性色素を
生産する。グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン培地（27℃培養）では、うす茶の発育上
に白の気菌糸を着生し、茶色の溶解性色素
を生産する。 (14) 脱脂牛乳（37℃培養）発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性
色素も認められない。３生理的性質 (1) 生育温度範囲イースト・スターチ寒天（可溶性殿粉１
％、酵母エキス（大五栄養化学製）0.2％、
紐寒天2.0％、PH7.0を用い、20℃、24℃、
27℃、30℃、37℃、50℃の各温度で試験の
結果、50℃を除いていずれの温度でも生育
するが、最適温度は27℃〜30付近と思われ
る。 (2) ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン、20
℃培養及びグルコース・ペプトン・ゼラチ
ン、27℃培養）いずれの培地においても培養後５日目頃
から液化が始まり、その作用は中等度〜強
い方である。 (3) スターチの加水分解（スターチ・無機塩
寒天培地及びスターチ寒天培地、いずれも
27℃培養）培養後３日目頃から水解性が認められ、
その作用は強い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛
乳、37℃培養）培養後４日目頃から凝固が始まり、ただ
ちに凝固完了後ペプトン化が観察され、14
日〜21日目でほぼ完了した。その作用は中
等度〜強い方である。 (5) メラニン様色素の生成（トリプトン・イ
ースト・ブロス、ISP−培地１；ペプト
ン・イースト・鉄寒天、ISP−培地６；チ
ロシン寒天、ISP−培地７、いずれも27℃
培養）いずれの培地でもメラニン様色素の生成
は認められない。 (6) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリー
ブ寒天培地、ISP−培地９、27℃培養）グルコース、Ｌ−アラビノースを利用し
て発育し、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノー
スはおそらく利用していると判定される。
Ｄ−フルクトースはおそらく利用していな
いと判定され、シユクロース、イノシトー
ル、ラフイノース、Ｄ−マンニトールは利
用しない。 (7) リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒
天、27℃培養）培養後５日目頃から発育周辺のリンゴ酸
石灰を溶解し、その作用は中等度である。 (8) 硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリ含有
ブイヨン、ISP−培地８、27℃培養）陽性である。以上の性状を要約すると、MG329−CF56株は
その形態上から、輪生枝及び螺旋形状を認めず、
胞子の表面は平滑である種々の培地で無色〜うす黄、あるいはうす黄茶
の発育上に白〜明るいい茶灰の気菌糸を着生し、
溶解色素は黄色〜茶色味を呈する。メラニン様色
素は陰性であり、蛋白分解力は中等度〜強い方、
スターチの水解性も強い方である。なお、この菌
株の細胞壁に含まれる２，６−ジアミノピメリン
酸はLL−型であり、ストレプトミセス
（Streptomyces）属に属することは明らかであ
る。これらの性状よりMG329−CF56株に近縁の既
知菌種を検索すると、ストレプトミセス・ニトロ
スポレウス（S.nitrosporeus、文献
International Journal of Syetematic
Bacteriology、18巻、152頁、1968；文献
Jounal of Antibiotics、Series Ａ、５巻、477
頁、1952；文献ワツクスマン著The
Actinomycetes、２巻、248頁、1961）及びスト
レプトミセス・グリゼオルス（S.griseolus、文
献International Journal of Systematic
Bacteriology、18巻、122頁、1968；文献ワツ
クスマン著The Actinomycetes、２巻、222頁、
1961）があげられる。ストレプトミセス・グリゼ
オルスはゼラチンの液化がゆるやかであり、ミル
クの凝固がおそく、スターチの水解性も弱い。
又、Ｄ−フルクトースを炭素源として利用するこ
と等からMG329−CF56株とは明らかに区別され
る。ストレプトミセス・ニトロスポレウスとの性状
の比較を表にして示した。

【表】

【表】ストレプトミセス・ニトロスポレウスの＊
は文献の成績、その他は文献の記
載。
MG329−CF56株とストレプトミセス・ニトロ
スポレウスの最も大きな相異点はセルロースの分
解である。その他わずかな違いはみられるが、両
者は極めて近縁な性質を示し、電子顕微鏡写真で
の胞子の形態も酷似している。これらの点から、MG329−CF56株をストレプ
トミセス・ニトロスポレウス（Steptomyces
nitrosporeus）MG329−CF56と同定した。 (ロ) MG329−CF7株の菌学的性状１形態 MG329−CF7株は、顕微鏡下で分岐した
基中菌糸より比較的長いまつすぐな気菌糸あ
るいはかぎ状の気菌糸（hooks）を形成し、
らせん形状および輪生枝は認められない。成
熟した胞子鎖は10個以上の胞子の連鎖を認
め、胞子の大きさは0.4〜0.8×0.8〜1.0ミク
ロン位でその表面は平滑である。２各種培地における生育状態色の記載について〔〕内に示す標準は、
コンテイナー・コーポレーシヨン・オブ・ア
メリカのカラー・ハーモニイ・マニユアル
（Container Corporation of Americaの
Color Harmony Manual）を用いた。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培
養）うす黄〔2ca.Lt.Ivory〜2le、Mustard〕
の発育上に白色の気菌糸をうつすらと着生
し、溶解性色素は認められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（27
℃培養）うす黄〔１ 1/2ea、Lt.Yellow〕の発育
上に、白〜灰白色〔ｃ、Lt.Gray〕の気菌
糸をわずかに着生し、溶解性色素も認めら
れない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地
（ISP−培地５、27℃培養）うす黄〜うす黄茶の発育上に白〜灰白色
の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められ
ない。 (4) スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培地
４、27℃培養）うす黄〔2gc、Bamboo〕の発育上に白
〜黄味灰〔2ea、Lt.Wheat〕あるいは明る
い〔3fe、Silver Gray〕の気菌糸を豊富に
着生し、溶解性色素は黄色味をおびる (5) チロシン寒天培地（ISP−培地７、27℃
培養）うす茶〔3ng、Yellow Maple〕〜灰味
黄茶〔3pl、Deep Brown〕の発育上に灰
味白〜茶白〔3ca、Pearl Pink〕の気菌糸
を豊富に着生し、溶解性色素は茶色味をお
びる。 (6) 栄養寒天培地（27℃培養）明るい茶灰〔3le、Cinnamon〕の発育上
に灰味白〜明るい灰の気菌糸を着生し、茶
の溶解性色素を産生する。 (7) イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地
２、27℃培養）うす黄〔2ne、Mustard Gold〕の発育
上に白〜灰味白、黄味灰の気菌糸を着生
し、溶解性色素は認められない。 (8) オートミール寒天培地（ISP−培地３、
27℃培養）うす黄茶〔1fb、Pastel Yellow〕の発
育上に白〜明るい灰の気菌糸を着生し、黄
色の溶解性色素を産生する。 (9) グリセリン・硝酸塩寒天培地（27℃培
養）うす黄〔2ea、Lt、Wheat〕の発育上に
白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認め
られない。 (10) スターチ寒天培地（27℃培養）発育は無色〜うす黄〔１ 1/2ea、Lt.
Yellow〕、気菌糸は着生せず、溶解性色素
も認められない。 (11) リンゴ酸石灰寒天培地（27℃培養）無色〜うす黄の発育上に白色の気菌糸を
わずかに着生し、溶解性色素は認められな
い。 (12) セルロース（紙片添加合成液、27℃培
養） 21日間培養したが、発育は認められなか
つた。 (13) ゼラチン穿刺培養単純ゼラチン培地（20℃培養）では無色
〜うす黄の発育上に白色の気菌糸をわずか
に着生し、茶の溶解性色素を産生する。グ
ルコース・ペプトン・ゼラチン培地（27℃
培養）では発育は無色〜うす黄、気菌糸は
着生せず、溶解性色素は暗い茶色を呈す
る。 (14) 脱脂牛乳（37℃培養）発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性
色素は茶色味をおびる。３生理的性質 (1) 生育温度範囲スターチ・イースト寒天（可溶性殿粉
1.0％イーストエキス（大五栄養化学製）0.2
％、紐寒天3.0％、PH7.0）を用いて、20
℃、24℃、27℃、30℃、37℃、50℃の各温
度で試験の結果、20℃、24℃、27℃、30℃
で良く発育し、37℃ではわずかに発育、50
℃では発育は認められなかつた。最適温度
は27℃〜30℃付近と思われる。 (2) ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン、20
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン、27℃培養）単純ゼラチン、グルコース・ペプトン・
ゼラチンとも、培養後７日目頃から液化が
始まつたが、その作用は中等度〜弱い方で
ある。 (3) スターチの加水分解（スターチ・無機塩
寒天培地及びスターチ寒天培地、何れも27
℃培養）スターチ・無機塩寒天培地では培養後３
日目頃から、またスターチ寒天培地では培
養後５日目頃からともに水解性が認めら
れ、その作用は中等度〜強い方である。 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛
乳、37℃培養）培養後７日目頃から凝固が始まり、直ち
に完了後、ペプトン化が始まる。その作用
は中等度である。 (5) メラニン色素の生成（トリプトン・イー
スト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・
イースト・鉄寒天、ISP−培地６；チロシ
ン寒天、ISP−培地７、いずれも27℃培
養）いずれの培地でも認められるが、チロシ
ン寒天の場合は弱い方である。 (6) 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリー
ブ寒天培地、ISP−培地９、27℃培養）グルコース、Ｄ−キシロースを利用して
発育し、シユクロース、イノシツト、Ｌ−
ラムノース、ラフイノース、Ｄ−マンニツ
トは利用しない。Ｌ−アラビノース、Ｄ−
フラクトースはおそらく利用していないと
思われる。 (7) リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒
天、27℃培養）培養後10日目頃から発育周辺のリンゴ酸
石灰を溶解が認められ、その作用は中等度
である。 (8) 硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリ含有
ペプトン水、ISP−培地８、27℃培養）陽性である。以上の性状を要約すると、MG329−CF7株は
その形態上から胞子のうを認めず、気菌糸にらせ
ん形成及び輪生枝を形成しない。また胞子の表面
は平滑である。種々の培地で無色〜うす黄あるいは黄茶の発育
上に白〜明るい灰あるいは黄味灰の気菌糸を着生
し、溶解性色素は黄色または茶色味をおびる。メ
ラニン様色素は陽性、蛋白質の分解力は中等度、
スターチの水解性は中等度〜強い方である。な
お、この菌株の細胞壁に含まれる２，６−ジアミ
ノピメリン酸はLL−型であり、ストレプトミセ
ス（Streptomyces）属に属することは明らかで
ある。これらの性状より既知菌種を検索すると、スト
レプトミセス・ザオミセテイカス
（Streptomyces zaomyceticus、文献
⁽¹⁾International Journal of Systematic
Bacteriology、22巻、374頁、1972、文献⁽²⁾The
Journal of Antibiotics Series A7巻、134頁、
1954）が最も近縁の種としてあげられる。 MG329−CF7株とストレプトミセス・ザオミ
セテイカスIMC Ｓ−0663（ISP5196）株とを実際
に比較検討し、その成績の大要を次表に示す。

【表】

【表】註：炭素源の利用で±はおそらく利用していることを
示す。
＊は文献2)、°は文献1)の記載。
表にみられるように、MG325−CF7株とスト
レプトミセス・ザオミセテイカスはＬ−アラビノ
ースの利用を除いて、ほぼ一致した性状を示し、
両者は極めて近縁の種と考えられる。よつて、
MG325−CF7株をストレプトミセス・ザオミセ
テイカス（Streptomyces zaomyceticus）
MG325−CF7株と同定した。次に、本発明のホルオキシミチンの製造法を具
体的に説明する。本発明の方法を実施するに当つ
て、ホルオキシミチン生産菌を培養するのに用い
る栄養源としては、通常の微生物が利用し得る公
知の栄養源を適宜使用できる。例えば、市販され
ているグリセリン、グルコース、ラクトース、デ
ンプン、糖蜜などの炭水化物、油脂類などを炭素
源として、市販されているペプトン、肉エキス、
コーン・ステイープ、リカー、綿実粉、落花生
粉、大豆粉、コーン・グルテンミール、魚粉、酵
母エキス、Ｎ−Ｚアミン、カゼイン、硝酸ナトリ
ウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなど
を窒素源として、食塩、リン酸塩、炭酸カルシウ
ム、硫酸マグネシウムなどの無機の栄養源とし
て、それぞれ使用できる。特に好ましい培地成分
としては、炭素源としてグリセリンなど、窒素源
として綿実粉などがある。グリセリン1.5％、綿
実粉1.5％、食塩0.3％、Ｌ−アスパラギン・１水
和物0.2％を含む培地などを用いるのが好ましい。ホルオキシミチンの大量生産には、液体培養が
好ましい。培養温度としては、ホルオキシミチン
生産菌が発育し、ホルオキシミチンを生産する範
囲の任意の温度を適用し得るが、特に好ましい温
度は25〜35℃である。培養は通常本物質が培養物
中に生産され、充分に蓄積するまで継続される。
例えば、ホルオキシミチン生産菌ストレプトミセ
スニトロスポレウスMG329−CF56株の場合に
は、500mlの坂口フラスコにグリセリン1.5％、綿
実粉1.5％、食塩0.3％、Ｌ−アスパラギン・１水
和物0.2％を含む培地（PH7.4に調整）120mlを入
れ、滅菌した後、これにホルオキシミチン生産菌
ストレプトミセスニトロスポレウスMG329−
CF56株の斜面培養物の一白金耳量を接種し、27
℃で好気的に振とう培養を行なつたところ、培養
後48時間〜192時間の間にホルオキシミチンの蓄
積が認められた。ホルオキシミチンはジヤー培養
法でも振とう培養と同様によく生産される。例え
ば、30の醗酵槽に15の培地を入れて滅菌し、
らかじめ培養した種培養液を0.5接種し、27℃
で毎分15の無菌空気を通気し、毎分200回転で
撹拌した。この条件下で本物質の生産は68時間で
最高に達した。ホルオキシミチンの培養工程なら
びに精製工程中での追跡は、次の方法による抗ア
ンジオテンシン変換酵素活性測定に基づいて行
なつた、抗アンジオテンシン変換酵素活性の測
定は、M.HAYAKARIら、Analytical
Biochemistry84巻、361〜369頁（1978年）記載
のアンジオテンシン変換酵素活性測定測定法を
改良して行なつた。すなわち、食塩0.3Mを含む
トリス−塩酸緩衝液（0.5M、PH8.0）に基質ヒプ
リル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンを５mg／ml
の濃度で溶解し、この溶液0.05mlに検出を含む溶
液0.40mlを加えた混合溶液を37℃、３分間加温し
た後、牛肺臓より部分精製したアンジオテンシン
変換酵素溶液を0.05ml加えて、37℃、30分間反
応させた。1N苛性ソーダを0.03ml加えて反応を
停止し、15分後に0.06Mリン酸ナトリウム緩衝液
（PH7.2）を２ml加え、次いで１％塩化シアヌルの
メチルセロソルブ溶液を２ml加えて発色させ、室
温に15分間放置後、382nｍにおける吸光度(a)を
測定した。同時に検体を含まない混合溶液を同様
に調製し、同様に反応させた対照の吸光度(b)を測
定し、アンジオテンシン変換酵素阻害率を式：
〔（ｂ−ａ）／ｂ〕×100により計算した。この定量
法で純粋なホルオキシミチン・２水和物は7μ
ｇ／mlで濃度でアンジオテンシン変換酵素を50
％阻害した。（IC₅₀＝7μｇ／ml）ホルオキシミチン生産菌の培養液中および菌
体中に存在するホルオキシミチンを培養物から採
取するに当つては、培養液から吸着剤に吸着お
よび脱離させる方法で好収率で採取できる。吸着
剤としては、活性炭、イオン交換樹脂などが使用
できる。例えば、ホルオキシミチンは活性炭に吸
着され、50％アセトン水で溶出される。培養液
にこれの２重量％の活性炭を入れて撹拌し、水洗
後培養液の1/4量の50％アセトン水で溶出する
と活性分画が得られる。これを減圧下に濃縮する
ことによりホルオキシミチンの粗濃縮液が得られ
る。これを水でうすめ、培養液に換算して1/60
の体積のDEAE−セフアデツクスＡ−25（OH^-
型）のカラムに吸着させ、水洗後の0.1Mの食塩
水で溶出できる。これを塩酸で中和した後、減圧
下に濃縮することにより粗粉末を得ることができ
る。また逆相高速液体クロマトグラフイーも精製
に用いられる。特にヌクレオシル（Nucleosil）
5C18（Macherey−Nagel社製）のクロマトグラ
フイーが有効であり、メタノール：0.4％酢酸＝
10：90の溶出液でホルオキシミチンを精製するこ
とができる。本発明のホルオキシミチンの生物活性について
その薬理作用を検討した。その結果、本物質が降
圧作用を有していることが見出された。本発明の
ホルオキシミチンの降圧作用について試験例を挙
げて説明する。試験例本例は、自然発症高血圧ラツト（SHラツト）
におけるホルオキシミチンの血圧に及ぼす効果を
示す。体重320〜358ｇのSSH−ラツトにホルオキシ
ミチン・２水和物を12.5mg／Kg、25mg／Kg、50
mg／Kgの投与量で、水溶液として経口投与した。
投与後、経時的に血圧測定を行ない、ホルオキシ
ミチン投与群と蒸溜水のみを経口投与した対照動
物の血圧変化を比較した。試験結果を第１表に示す。

【表】以上の結果より、ホルオキシミチンは自然発症
高血圧ラツト（SH−ラツト）の血圧を降下させ
る物質であると認められた。したがつて、本発明
によつて得られたホルオキシミチンは降圧剤とし
て有用である。マウスに対する急性毒性試験では、ホルオキシ
ミチン・２水和物の800mg／Kgの投与量でマウス
に静脈内投与しても死亡例は認められない。した
がつてホルオキシミチンは毒性の低い物質である
と認められる。したがつて第三の本発明によれば、次式で表わされる新生理活性物質ホルオキシミチン又
はこれの薬学的に許容できる塩を有効成分とする
降圧剤が提供される。本発明に従う降圧剤としては、ホルオキシミチ
ンまたはその薬学的に許容される塩を常用の担体
と配合して製剤でき、さらには各種の化学療法剤
を配合することもできる。ホルオキシミチンの塩の例としては、ホルオキ
シミチンのヒドロキサム基における、薬学的に許
容できる陽イオン、例えばアルカリ金属イオン、
アルカリ土類金属イオン、その他の適当な金属イ
オンの塩がある。本発明の化合物ないし薬剤の投与形態は、経
口、注射、直腸坐剤のいずれでもよい。注射剤を
調製する場合は、上記有効成分化合物にPH調整
剤、緩衝剤、安定化剤、賦形剤等を添加し、常法
により凍結乾燥を行ない、凍結乾燥注射剤を作る
ことができ、また有効成分化合物に、PH調整剤、
緩衝剤、安定化剤、等張剤、局麻剤等を添加し、
常法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤を作るこ
ともできる。経口用固形製剤を調製する場合、有
効成分化合物に、賦形剤、更に必要に応じて結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等
を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤等を作ることができる。経
口液状製剤を調製する場合には、有効成分化合物
に、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加え
て、常法によりシロツプ剤およびドライシロツプ
剤を作ることができる。直腸坐薬製剤を調製する
場合には、有効成分化合物に、賦形剤、更に必要
に応じて界面活性剤を加えた後、常法により坐剤
とすることができる。ホルオキシミチンの投与量は症状により異なる
が、成人ではホルオキシミチンとして１回0.02〜
2000mgを１日３回投与するのがよい。次に本発明のホルオキシミチンの製造法に関し
て実施例を示すが、本物質の理化学的性状ならび
に生産方法、その精製法が本発明者らによつて明
らかにされたので、本明細書に示された方法を修
飾することは容易であり、本発明は以下に記載す
る実施例のみに限定されるものではない。実施例１ホルオキシミチン生産菌ストレプトミセス・ニ
トロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）
MG329−CF56株（微工研菌寄7244号）の斜面培
養物から−白金耳量を、あらかじめ120℃、20分
間滅菌した培地（500mlの坂口フラスコに120mlず
つ分注したグリセリン1.5％、綿実粉1.5％、食塩
0.3％、Ｌアスパラギン・１水和物0.2％を含
み、PH7.4に調製し滅菌した培地）に接種した。
27℃、毎分130往復で好気的に培養し、経時的に
ホルオキシミチン生産量を検討した。その結果、
アンジオテンシン変換酵素阻害活性より定量し
たホルオキシミチンの濃度は培養３日後に最高に
達し、培養12日後まで安定に維持された。実施例２実施例１に示した培養条件で、ホルオキシミチ
ン生産菌ストレプトミセス・ニトロスポレウス
MG329−CF56株を72時間培養した種培養液を実
施例１と同様の培地に５ml接種し、同様に72時間
培養した。得られた培養液５を珪藻土を過助
剤に用いて過し、水洗し5.5の液を得た。
この液のアンジオテンシン変換酵素阻害活性
（IC₅₀）は10μ／mlであつた。得られた培養液
5.5に、クロマト用活性炭（和光純薬製）100ｇ
を加えて撹拌し、ホルオキシミチンを吸着させ
た。過して活性炭を集め、水２で洗滌後、こ
の活性炭を2.4の５％アセトン水中で30分間撹
拌し、ホルオキシミチンを溶離した。これを過
し、液を減圧下に濃縮乾固して、粗粉末15.8ｇ
を得た（IC₅₀＝416μｇ／ml）。得られた粗紛末を
500mlの脱イオン水に溶解し、DEAE−セフアデ
ツクスＡ−25（OH^-型）250mlのカラムに吸着さ
せ、脱イオン水で洗滌後、0.1Mの食塩水１で
溶出した。溶出液を塩酸で中和し、減圧下に濃縮
乾固して11.2ｇの粗粉末を得た（IC₅₀＝32μｇ／
ml）。この粗粉末を脱イオン水100mlに溶解し、逆
相シリカゲル（Kieselgel60、silanized、メルク
社製）を600mlつめたカラムに吸着させ、脱イオ
ン水で展開した。活性分画を集め、減圧下に濃縮
乾固して3.29ｇの粗粉末を得た（IC₅₀＝12.4μｇ／
ml）。これを99.5％エタノール200mlと25％アンモ
ニア水50mlの混液に溶解し、これをあらかじめ
99.5％エタノール：25％アンモニア水＝４：１の
混液で平衡化したシリカゲルカラム（250ml）に
吸着させ、同溶媒混液で展開した。活性分画を集めて減圧下に濃縮乾固し、1.96ｇ
の粗粉末を得た。（IC₅₀＝11μｇ／ml）。この粗粉
末を0.4％酢酸水30mlに溶解し、これを10mlずつ
３回に分けて、あらかじめメタノール：0.4％酢
酸水＝10：90の混液で平衡化した分取用高速液体
クロマトカラム：ヌクレオシル5C18、20mm（直
径）×300mm（長さ）（Macherey Nagel社製）に
吸着させ、同混液で毎分６mlの流速で溶出した。
６mlずつ分画し、活性分画を集めて濃縮乾固し、
それを100mlの蒸溜水に溶解して凍結乾燥するこ
とにより白色粉末1.23ｇを得た。こうして得られ
たホルオキシミチン・２水和物のアンジオテンシ
ン変換酵素阻害活性（IC₅₀）は7μｇ／mlであつ
た。実施例３ホルオキシミチン生産菌ストレプトミセス・ザ
オミテイカス（Streptomyces zaomyticus）
MG325−CF7株（微工研寄7243号）の斜面培養
物から１白金耳量を、あらかじめ120℃、20分間
滅菌した培地（500mlの坂口フラスコに120mlずつ
分注したグリセリン1.5％、綿実粉1.5％、食塩0.3
％、Ｌ−グルタミン酸・１ナトリウム塩0.5％を
含む滅菌前にPH7.4に調製した培地）に接種した。
27℃で毎分130往復で好気的に振とう培養し、培
養３日後の培養液を上記の滅菌した培地15を含
む30のジヤー培養槽４基に、それぞれ0.5ず
つ接種し、27℃で毎分15の無菌空気を通気し、
毎分250回転で撹拌、培養した。培養３日後、得
られた培養液を過し、水洗液を合せて61の
液を得た。これに活性炭１Kgを加えて撹拌し、ホ
ルオキシミチンを吸着させた。過して活性炭を
集め、水で充分洗滌後、この活性炭を15の50％
アセトン水中で撹拌することにより、ホルオキシ
ミチンを溶離した。これを過し、液を減圧下
に濃縮して、76の濃縮液を得た。この濃縮液
7.6をDEAE−セフアデツクスＡ−25（OH^-型）
1.15のカラムに吸着着させ、脱イオン水で洗滌
後、0.1N食塩水４で溶出した。6N HClでPH
7.0に中和後溶出液を減圧下に濃縮乾固して61.5
ｇの粗粉末を得た。この粗粉末を脱イオン水300
mlに溶解し、6N塩酸でPH3.0とし、あらかじめ0.4
％酢酸水で平衡化した逆相シリカゲル
（Kieselgel60、silanized、メルク社製）1.5の
カラムに吸着させ0.4％酢酸水で展開した。活性
分画を集め、470mlの粗分画を得た。この活性画
470mlのうちの100mlを減圧下に20mlに濃縮した。
これをあらかじめ１％酢酸水で平衡化した大量分
取用逆相HPLCカラム（Prep PAK−500／C₁₈）
にウオーターズ社製Prep LC／System500を用い
て吸着させ、同HPLCシステムにより１％酢酸水
で毎分50mlの流速で展開した。活性分画を集め、
減圧下に濃縮乾固することにより6.35ｇの粗粉末
を得た。この粗粉末を0.4％酢酸水に溶解し、10
回に分けて、あらかじめメタノール：0.4％酢酸
水＝10：90の混液で平衡化した分取用HPLCカラ
ム：ヌクレオシル5C₁₈（前出）に吸着させ、同混
液で毎分６mlの流速で溶出した。６mlずつ分画
し、それぞれの活性分画を集めて濃縮し水を加え
て凍結乾燥することにより白色粉末3.66ｇを得た
（IC₅₀＝7μｇ／ml）。こうして得られた物質は理化
学的性状がストレプトミセス・ニトロスポレウス
MG325−CF56株の生産するホルオキシミチン・
２水和物の理化学的性状と完全に一致した。スト
レプトミセス・ザオミテイカスMG325−CF7株
の場合は収量は、培養液12.8よりホルオキシ
ミチン・２水和物が3.66ｇ得られたことになる。
これよりストレプトミセス属にはニトロスポレウ
スに限らずザオミセテイカスにもホルオキシミチ
ンを生産する株が存在することが明らかとなつ
た。

【図面の簡単な説明】

図面は臭化カリウム錠で測定したホルオキシミ
チン・２水和物の赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１次式で表わされる抗アンジオテンシン変換酵素活性
を有する生理活性物質ホルオキシミチン、または
その薬学的に許容できる塩。２ストレプトミセス属に属するホルオキシミチ
ン生産菌を培養して、次式で表わされる生理活性物質ホルオキシミチンを培
養液中に生産、蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする生理活性物質ホルオキシミチンの製
造法。３次式で表わされる生理活性物質ホルオキシミチン又は
これの薬学的に許容できる塩を有効成分として含
有する降圧剤。