JPH025867A - ヒト腺がん抗原の発現ためのｄｎａ化合物、該化合物を含有するベクター、およびそれを発現させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、モノクローナル抗体ＫＳＩ／４に認識される
ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞の〜４０，０００ダルトン細胞表面
糖タンパク質抗原をコードする新規なりＮＡ化合物およ
び組換えＤＮＡクローニングベクターに関するものであ
る。本発明のベクターによれば、真核性または原核性の
宿主細胞内で新規なりＮＡ化合物を発現させることがで
きる。

本発明はまた、これらの新規なりローニングベクターで
形質転換された宿主細胞に関するものである。形質転換
された宿主細胞は、ＫＳＩ／４抗原、またはその前駆体
、誘導体、またはその小断片（サブフラグメント）を発
現する。本発明のＤＮＡ化合物の多（が天然並びに実験
室のいずれにおいてもこれまで産生されたことのないＫ
ＳＩ／４・抗原誘導体の製造に有用であり、これらのユ
ニークなタンパク質も本発明に包含される。

［従来技術と発明が解決すべき課題］ がん死の主要な原因である肺がんは組織学的に、未分化
の大細胞（１５％）、小細胞（２０％）、類表皮または
鱗状（３０％）、および腺がん（３５％）の４つの主要
な型に分類される。最も有効な治療形式は、放射線照射
および外科治療であるが、全切除の可能な腫瘍と診断さ
れる患者は全肺がん患者の３０％以下に過ぎない。不幸
にも、５年以上生存する患者は腫瘍を完全に除去したと
思われる患者の内、１／３以下である。したがって、該
疾患の早期診断方法と、より効果的な治療法の開発が重
要である。

近年、肺がん患者の免疫応答を操作するために免疫学的
技術が用いられている。これらの技術により診断、予防
および治療において従来法に代わる方法が得られた。肺
がん細胞の表面抗原に対して惹起された特異抗体、すな
わち、そのような細胞表面構造に対する抗体はより特異
的に標的を認識することができるので、免疫学的診断及
び治療に有用である。そのような抗原に対して惹起され
たモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）による特定患部の
治療法の臨床面での評価が世界的に集中して行われてい
る。タンパク質操作、および特異的モノクローナル抗体
の生産の促進にとっては標的抗原の詳細なアミノ酸構造
の解明が有益である。即ち、ＫＳＩ／４反応性抗原をク
ローニングすれば、新規な抗体の設計に必要な基礎的な
情報が得られる。

ＫＳＩ／４抗原（Ｋ　Ｓ　Ａ）は、今日までに検査され
た、事実上あらゆるヒト腺がん（肺がん、前立腺がん、
乳がん、および結腸がん）、並びにある種の対応するヒ
ト上皮組織中に高いエピトープ濃度で見いだされる約４
０，０００ダルトンの細胞表面糖タンパク質抗原である
。この抗原は、ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞内で発現され、バル
キら（Ｖａｒｋｔ＋１９８４、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、　　４４：６８Ｌ−６８７）が示したよう
に、モノクローナル抗体ＫＳ１／４によって特異的に認
識される。ＫＳＡは、３１４アミノ酸残基の３４，９２
２ダルトンのプレプロタンパク質として合成される。こ
のプレプロタンパク質は、次いで、プロセッシングされ
て２３３アミノ酸残基の、２６，３４０ダルトンの細胞
表面タンパク質となる。この数字と〜４０゜０００ダル
トンという実測値との差は、発生期のタンパク質が翻訳
後の修飾（グリコジル化）を受けたことによると考えら
れる。細胞表面ＫＳＡの成熟化には約２１アミノ酸残基
のシグナルペプチド鎖（プレプロＫＳＡの残基１−２１
）の開裂、次いでプロペプチドの約６０アミノ酸残基（
プレプロＫＳＡの残基２２−８１）の除去が含まれる。

ＫＳＡは、システィン豊富領域、Ｎ−グリコジル化部位
、疎水性の膜透過領域、並びに高電荷の細胞質内アンカ
レッジ（アンカー）領域からなる、膜タンパク質に共通
の構造特性を有する。細胞質アンカレッジ領域は発生期
タンパク質のカルボキシ末端（プレプロＫＳＡの残基２
８９−３１４）に見いだされる約２６アミノ酸残基を含
み、膜透過領域は、細胞質アンカレッジ領域のすぐ上流
の約２３アミノ酸残基（プレプロＫＳＡの残基２６６−
２８８）を含むと思われる。残余のアミノ酸残基は細胞
外のＫＳＡそのものを構成し、その部分は、ある種の細
胞内で発現された場合、グリコジル化され、モノクロー
ナル抗体ＫＳ　ｌ／４によって認識されるコンホメーシ
ョンに折り畳まれる。

原核生物は、通常、組換え遺伝子から発現されたタンパ
ク質をグリフシル化せず、あるいは適切に折り畳まない
ので、通常のＫＳＡのような翻訳後修飾を受けていない
ＫＳＡ誘導体を初めて合成したという点で本発明は有意
義である。これらの独特なタンパク質は以下に十分に議
論を尽くすように、研究および臨床上、極めて大きい価
値を有する。

［課題を解決するための手段］ 本発明の目的に応じ、本明細書中に用いられる語句を以
下に定義する。

へｇ：抗原。

ＡＰＲ：アンピシリン耐性表現型またはそれを付与する
遺伝子。

ｄｈｆｒニジヒドロ葉酸還元酵素またはそれを付与する
遺伝子。

Ｅｎｈ：ＢＫウィルスから得られるエンハンサ−配列。

Ｇ４１８Ｒ：　Ｇ４１８ｉ性表現型またはそれを付与す
る遺伝子。ＫｍＲともいう。

Ｈｍｎ：ハイグロマイシン耐性表現型またはそれを付与
する遺伝子。

ＩＶＳ：イントロンをコードしているＤＮＡ。

介在配列ともいう。

ＫＳＡ　：クローニングされた、ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞の
〜４０，０００ダルトンの細胞表面タンパク質抗原であ
って、モノクローナル抗体ＫＳｌ／４によって認識され
る抗原、またはＫＳＩ／４によって認識されるか否かに
拘わらず、その抗原性断片を指す。

ＬＰ：アデノウィルスの後期プロモーターのプロモータ
ー活性を有するＤＮＡセグメント。

ＭｏＡＢ：モノクローナル抗体。

発生期タンパク質：ｍＲＮＡ転写物が翻訳されて生産さ
れるタンパク質であって、いかなる翻訳後修飾をも受け
ていないもの。

ｐＡ：ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。

ｐＬ：バクテリオファージλの左側プロモーターのプロ
モーター活性を含有するＤＮＡセグメント。

プレブローＫＳＡニアミノ末端にプレプロペプチドが付
加されているＫＳＡｏ プローＫＳＡニアミノ末端にプロペプチドが付加されて
いるＫＳＡｏ プロモーター：　ＤＮＡのＲＮＡへの転写を指令するＤ
ＮＡ配列。

組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
の余分のＤＮＡセグメントを付加することができる、ま
たは既に付加されているＤＮＡ分子からなる自律的に複
製可能な物質であって、プラスミドおよびファージを含
むが、それらに限定されない。

組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが導入されて
いる組換えＤＮＡクローニングベクターレプリコン：プ
ラスミドまたは他のベクターの自律的な複製を制御する
、または複製させるＤＮＡ配列。

制限断片：ｌまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ
酵素の作用によって生成される線状ＤＮＡ配列。

感受性宿主細胞：特定のＤＮＡセグメントまたは毒性化
合物に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントの・存在
なしには、これらの存在下で増殖し得ない宿主細胞。

構造遺伝子：機能的ポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａ配列であって、翻訳開始シグナルおよび終止シグナル
を含む。

Ｔ　ｃＲ：テトラサイタリン耐性表現型またはそれを付
与する遺伝子。

形質転換；受容細胞の遺伝型を変化させるＤＮＡを受容
細胞に導入すること。

形質転換体：形質転換された受容宿主細胞。

翻訳活性化配列＋ｍＲＮＡ転写物をペプチドまたはポリ
ペプチドに翻訳するＤＮＡ配列であって、リポソーム結
合部位をコードする配列および例えば、５°−ＡＴＣ−
３’のような翻訳開始コドンを含む。

以下に図面について説明する。

第１図ニブラスミドｐＫＣ２８３（１〜９．１ｋｂ）の
制限部位および機能地図。本発明の目的において、該地
図は正確な縮尺に基いて描かれていない。

第２図ニブラスミドｐＫＣ２８３ＰＸ（〜６．１ｋｂ）
の制限部位および機能地図。

第３図ニブラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　（〜５．９ｋｂ
）の制限部位および機能地図。

第４図ニブラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ（〜５゜９　ｋ
ｂ）の制限部位および機能地図。

第５図ニブラスミドＰＫＣ２８３ＰＲ３（〜４゜０ｋｂ
）の制限部位および機能地図。

第８図ニブラスミド１２０３２　（〜３．９ｋｂ）の制
限部位および機能地図。

第７図ニブラスミドルＮＭ７８９の制限部位および機能
地図。

第８図ニブラスミド１２０の構築模式図、並びにその制
限部位および機能地図。

第９図ニブラスミドｐＬ４７（〜４　、５　ｋｂ）の制
限部位および機能地図。

第１Ｏ図ニブラスミドｐＰＲ１２（〜５．１ｋｂ）の制
限部位および機能地図。

第１１図：ｐＰＲ１２ＡＲ１（〜５．１ｋｂ）の制限部
位および機能地図。

第１２図ニブラスミドｐＬ１１０（〜６　、６　ｋｂ）
の制限部位および機能地図。

第１３図ニブラスミドｐＬ１１０ｃの構築模式図、およ
びその制限部位および機能地図。

第１４図ニブラスミドｐＡＧ９３２（〜３　、８　ｋｂ
）の制限部位および機能地図。

第１５図ニブラスミドｐＡＧ１３３８（〜６．３ｋｂ）
の制限部位および機能地図。

第１６図ニブラスミドルＧ　Ｅ　ＭＴＭ（２８７０ｂｐ
）の制限部位および機能地図。

第１７図ニブラスミドｐＧＡＧ１３１７（４１６３ｂｐ
）の制限部位および機能地図。

第１８図ニブラスミドｐＬＫＳＡ−８（〜６　ｋｂ）の
制限部位および機能地図。

第１９図ニブラスミドｐＬＫｓＡ（〜６．２ｋｂ）の制
限部位および機能地図。

第２０図ニブ５ｘミＦｐＬＰＣｈｄ（〜１０．２３ｋｂ
）の制限部位および機能地図。

第２１図ニブラスミドｐＡＬＰＫＳＡの制限部位および
機能地図。

本発明は、式： ％式％ ）［ ： ： ■υＡＳＰ　ＰＲＯＧＬＹ　Ｇｕ　Ｔ）１１　ＬＥＵ　
ＩＴ、Ｅ　ＴＹＲＴＹＲＶＡＬ　ＡＳＰ　ＧＬｔｌ　Ｌ
ＹＳ　ＡＬＡ　ＰＲＯＧＬＵ　Ｐ）［Ｅ　ＳＥＲＭＥＴ
　ＧＬＮ　ＧＴ、Ｙ　ＬＥｔｌ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＧＬ
Ｙ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＩＩＩ　ＶＡＬ
ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　Ｖ
ＡＬ　ＡＬＡ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＩＪ
：ＬＴ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　５ＥＲＡＲＧ　ＬＹＳＬＹＳ
ＡＲＧ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　ＴＹＲＧＬＩＪ　Ｌ
ＹＳ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＬＥ　ＬＹ！３　ＧＬＵ　Ｍ
ＥＴＧＬＹ　ＧＬＵ　ＭＥＴ　ＨＩＳ　ＡＲＧ　ＧＬＵ
　ＬＥＵ　ＡＳＷ　ＡＬＡ−Ｃｏｏｌ（式中、ＡＬＡは
アラニン残基、ＡＲＧはアルギニン残基、ＡＳＮはアス
パラギン残基、ＡＳＰはアスパラギン酸残基、ＣＹＳは
システィン残基、ＧＬＮはグルタミン残基、ＧＬＵはグ
ルタミン酸残基、ＧＬＹグリシン残基、ＨＩＳはヒスチ
ジン残基、ＩＬＥはイソロイシン残基、ＬＥＵはロイシ
ン残基、ＬＹＳはリシン残基、ＭＥＴはメチオニン残基
、ＰＨＥはフェニルアラニン残基、ＰＲＯはプロリン残
基、ＳＥＲはセリン残基、ＴＨＲはスレオニン残基、Ｔ
ＲＰはトリプトファン残基、ＴＹＲはチロシン残基、Ｖ
ＡＬはバリン残基を表す） で示されるアミノ酸残基配列を有するタンパク質をコー
ドしているＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物に関す
るものである。

本発明の化合物は組換えＫＳＡ、および従来知られてい
なかった発生期のＫＳＡのアミノ酸配列およびヌクレオ
チド配列に係るものである。ＫＳＡのヌクレオチド配列
は、式二 ５’　−ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　Ｇ
ＣＣＣＴＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＡＴ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　Ｃ
Ｔｒ　ＴＡＴ　ＧＡＴＣＣＴ　ＧＡＣＴＧＣＧＡＴ　Ｇ
ＡＧ　ＡＧＣＧＧＧ　ＣＴＣＴｒｒ　ＡＡＧ　ＧＣＣＡ
ＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＧ
　ＴＧＣＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＣ
Ｔ　ＧＧＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＡＧＡＡＣＡ　ＧＡＣＡＡ
Ｇ　ＧＡＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＡＣＣＴＧＣＴＣ
Ｔ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＣＣＴＡＣＴ
ＧＧ　ＡＴＣＡＴＣＡＴＴ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　
ＣＡＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＣ
ＴＴＡτＧＡＴ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＴＴＧ　Ｃ
ＧＧ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ｃＡｃ　ＡＡＧ　ＧＡ
ｃ　ＡＴＣＡＣＡＡＣＧ　ＣＧＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ｃ
ＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＴｒＴ　ＡＴＣＡＣＧ
　ＡＧＴ　ＡＴｒ　ＴＴＧ　ＴＡＴＧＡＧ　ＡＡＴ　Ａ
ＡＴ　ＧＴｒＡＴＣＡＣＴ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　
ＧＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＡＡＭ
　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＡ
ＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＴＡ
Ｔ　ＴｒＴＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　
ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＴｒＧ　ＴｒＴ　ＣＡＴ　ＴＣ
Ｔ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＧＧＡＣＣＴＧ　ＡＣＡ　Ｇ
ＴＡ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＧＡ
Ｔ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡＡＣＴ　
ＴＴＡ　ＡＴｒ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＧＴｒ　ＧＡＴ　Ｇ
ＡＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＴｒＣＴＣＡ
　ＡＴＧＣＡＧ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　Ｇ
ＧＴ　ＧＴＴ　ＡＴｒ　ＧＣＴ　ＧＴｒ　ＡＴＴ　ＧＴ
Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧＡＴＧ　ＧＣＡ　ＧＴｒ　
ＧＴｒ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴｒ　ＧＴＴ　ＧＴＧ　Ｃ
ＴＧ　ＧＴｒ　ＡＴｒ　ＴＣＣＡＧＡ　ＡＡＧＡＡＧ　
ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　Ａ
ＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴ
Ｇ　ＧＧＴＧＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　
ＣＴＣＡＡＴ　ＧＣＡ−３’（式中、Ａはデオキシアデ
ニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデオキシシチジル、
Ｔはチミジルを表す） で示される。

また、本発明は、式： ％式％ （式中、各記号は上記の定義に従う） で示されるアミノ酸残基配列を有するタンパク質をコー
ドしているＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物を包含
するものである。

この化合物はアミノ末端にプロペプチドが付加した組換
えＫＳＡ、およびこれまで知られていない発生期のプロ
ＫＳＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表すも
のである。プロＫＳＡのヌクレオチド配列の内、暗号鎖
のみを便宜上示すと、下記の式： ％式％ ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　Ｇ
ＡＣＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ
　ＴＡＴ　ＴＴＴＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴｒ　Ａ
ＡＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＣＣＴＴＧ　ＴｒＴ　ＣＡＴ
　ＴＣＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＧＧＡＣＣＴＧ　ＡＣ
Ａ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ
　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ’ＣＡＡＡ
ＣＴ　ＴｒＡ　ＡＴｒ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＧＴＴ　ＧＡ
Ｔ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＴｒＣ
ＴＣＡ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＧＣ
Ｔ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＡＴｒ　ＧＣＴ　ＧＴｒ　ＡＴｒ
　ＧＴＧ　ＧＴｒ　ＧＴＧ　ＧＴＧＡＴＧ　ＧＣＡ　Ｇ
ＴＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴｒ　ＧＴＴ　ＧＴ
Ｇ　ＣｒＧ　ＧＴＴ　ＡＴｒ　ＴＣＣＡＧＡ　ＡＡＧＭ
Ｇ　　ＡＧＡ　　ＡＴＧ　　ＧＣＡ　　ＭＧ　　ＴＡＴ
　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＡ　
　ＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＧＴＧＡＧ　ＡＴ
Ｇ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＣＴＣＡＡＴ　ＧＣＡ−
３’（式中、各記号は上記の定義に従う） で示される。

また、本発明は、式： ％式％ ）［ ： （式中、各記号は上記の定義に従う） で示されるアミノ酸残基配列を有するタンｌ＜）７質を
コードしているＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物を
包含するものである。

この化合物はアミノ末端にプレプロペプチドが付加した
組換えＫＳＡ、およびこれまで知られていない発生期の
プレプロＫＳＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
を表すものである。プレプロＫＳＡのヌクレオチド配列
の内、暗号酸のみを便宜上示すと、下記の式： ％式％ （式中、各記号は上記の定義に従う） で示される。

本発明のＤＮＡ化合物は、ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞由来のｍ
ＲＮＡから調製されるｃＤＮＡから導かれる。これらの
ｃＤＮＡクローンの内２つを処理し、発生期のプレプロ
ーＫＳＡおよび暗号領域の５′および３°末端の未翻訳
ｍＲＮＡをコードしているＤＮＡ部分の両者を含有する
ＤＮＡ分子を構築した。これら２つのｃＤＮＡを含有す
るプラスミドをｐＡＧ９３２およびｐＡＧ１３３８と命
名した。

プラスミドｐＡＧ９３２を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび５
ｓｔＩ［で消化し、生じた〜２０５塩基対断片を単離し
た。プラスミドｐＡＧ１３３８を制限酵素５ｓｔＩ［お
よびＢｇｌＩ［で消化し、生じた〜ｔ　ｉｏ。

塩基対断片を単離した。これらの２断片を、次いで、予
め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化しておい
たプラスミドｐｃ　Ｅ　Ｍ”−４にライゲート（結合）
させた。このライゲーションによってプラスミドｐＧＡ
Ｇ１３１７が得られた。プラスミドｐＧＡＧ１３１７の
詳細な構築方法は実施例１１に記載されている。プラス
ミドｐＧＡＧ１３１７の制限部位および機能地図を第１
７図に示す。

プラスミドｐＡＧ９３２はノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　
（Ｎ　ＲＲＬ）　（Ｐｅ。

ｒｉａ、　　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ）に１９８７年１０月
２０日に寄託され、そのパーマネント・ストック・カル
チャー・コレクションの１部となっている菌株、大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２　　ＤＨ５／ｐＡＧ９３２から
単離すると好都合である。大腸菌Ｋ１２　　ＤＨ５／ｐ
ＡＧ９３２の培養物は、ＮＲＲＬから、受託番号ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１８２６６の下で得ることができる。プラス
ミドｐＡＧ９３２の制限部位および機能地図を第１４図
に示す。同様に、プラスミドｐＡＧ１３３８は、ＮＲＲ
Ｌに１９８７年１０月２０日に寄託され、そのパーマネ
ント・ストック・カルチャー・コレクションの１部とな
っている菌株、大腸菌に１２　ＤＨ５／ｐＡＧ１３３８
から単離すると好都合である。大腸菌Ｋ　１２　　ＤＨ
５／ｐＡＧ　ｌ　３３８の培養物は、ＮＲＲＬから、受
託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２６５の下で得ることがで
きる。プラスミドｐＡＧ１３３８の制限部位および機能
地図を第１５図に示す。プラスミドｐｃ　Ｅ　ＭＴＭ−
４は何人も入手可能であって、プロメガ・バイオチク（
Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ　１ｏｔｅｃｈ、＋　　２８００　
５ｏｕｔｈ　Ｆ　ｉｓｈ　Ｈａｔｃｈｅｒｙ　Ｒｏａｄ
、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗ　Ｉ　、　５３７１１）から
購入することができる。プラスミドｐＧＥＭＴＭ　　４
の制限部位および機能地図を第１６図に示す。

プラスミドｐＧＡＧ１３１７はプレプロＫＳＡの暗号配
列、並びにプレプロＫＳＡの５°および３′非翻訳領域
を含有する付加的な配列の両者を含有している。これら
の付加的な配列は発生期のプレプロ−ＫＳＡの暗号路の
５°末端および３゛末端に存在する式； ％式％ および式： ５’−ＴＡＡ　ＣＴＡ　ＴＡＴ ＣＭ　ＡＴＧ　ＣＡＣ ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＴ ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ ＣＭ　ＧＴＧ　ＴＣＴ ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＭＧ　ＡＴＴ　ＡＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡ
Ａ　ＧＧＧ　ＡＭＡＣＡ　ＡＡＴ　ＴＡＣＡＡＡ　ＴＧ
Ｔ　ＧＴＧ　ＴＧＣＧＴＧ　ＧＧＡＴＧＡ　ＡＧＧ　Ｔ
ＣＡ　ＴＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＴτＡＧ　ＴＴＴ　ＡＡＣ
ＴＭ　ＴＡＧ　ＴＧＡ　ＭＣＣＴＧ　ＴＡＣＴＣＡ　Ａ
ＡＡ　ＴＡＴＡＣＴ　ＧＧＣＴＩ”Ｉ”　ＡＣＣＡＡＴ
　ＣＴＴ　ＧＭ　ＡＴＴ　ＴＧＡＴＡＴ　　ＡＴＡ　　
ＴＧＣＡ−３菅 ＡＧ ＧＡ ＡＴＧ ＭＧ ＣＡ （式中、各記号は上記の定義に従う） で示される配列である。ＤＮＡの塩基対形成における相
補性に基づき、２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖の配列を決
定すればもう一方の鎖の配列を決定するのに十分である
。

ＫＳＡをコードしているＤＮＡを含有する様々な組換え
ＤＮＡ発現ベクターを構築した。本発明のベクターは２
つのタイプからなる：すなわち、真核性生物、とりわけ
哺乳類宿主細胞を形質転換するために構築されたものと
、大腸菌を形質転換するために構築されたものである。

本明細書に例示する真核性または哺乳類ベクターを大腸
菌に導入することはできるが、これらのプラスミド中に
存在する、ＫＳＡをコードするＤＮＡの一云写のための
真核性プロモーターは大腸菌内では無効である。

発生期のＫＳＡをコードする本発明のＤＮＡ化合物は、
ＫＳＡを哺乳類および他の真核性細胞内で発現させるの
に特に好適である。多くの哺乳類宿主細胞は、ＫＳＡの
アミノ末端に存在するシグナル（プレ）ペプチドを認識
し、適切にプロセッシングするのに必要な細菌内機槽を
有する。また、幾つかの宿主細胞は腺がん細胞の細胞表
面に存在するＫＳＡに見られるような、翻訳後の修飾、
例えばグリコジル化を行うことができる。真核性宿主細
胞の形質転換のための、広範囲におよぶ様々なベクター
類があり、以下に例示する特定のベクター類はいかなる
意味からも、本発明の範囲を制限するものではない。

本発明のＢＫエンハンサ−型ベクターは、ＢＫエンハン
サー−アデノウィルス後期プロモーター力・ノセトと、
ハイグロマイシン耐性付与遺伝子およびネズミのジヒド
ロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有している。Ｂ
Ｋウィルスエンハンサ−とアデノウィルス後期プロモー
ターとを一緒に用いると、真核性宿主細胞内での組換え
遺伝子の転写が著しく増大する。ハイグロマイシン耐性
付与遺伝子は、真核性宿主細胞内で有用な選択マーカー
として含有されている。ネズミのジヒドロ葉酸還元酵素
は適切な条件下、宿主染色体内で増幅される。

この増幅は、該ｄｈｆｒ遺伝子と極めて近接したＤＮＡ
配列をも巻き込み得ることがシムケの総論に記載されて
いる（Ｓｃｈｉｍｋｅ、　　１９８４．　　Ｃｅ１ｌ　
３７：７０５−７１３）。ｄｈｆｒ遺伝子は、ｄｈｆｒ
陰性細胞内では選択マーカーであり、宿主細胞を漸増量
のメトトレキセートに暴露することによってＤＮＡセグ
メ／トのコピー数を増大するのに用いることができる。

プラスミドｐＬＰＣｈｄは、本発明の新規なＫＳＡ構造
遺伝子を発現する真核性発現ベクターの構築に使用する
ことができる。プラスミドｐＬＰＣｈｄはｄｈｆｒ遺伝
子、２型アデノウイルス（Ａｄ２）プロモーターおよび
ＢＫウィルスエンハンサ−を含有している。ＢＫウィル
スエンハンサ−を含有するＢＫウィルスは購入するか、
実施例１３記載のごとくにして容易に、大量に単離する
ことができる。ＢＫウィルスはまた、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ
ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＳＡＴ
ＣＣ）から受託番号ＡＴＣＣＶＲ−８３７の下で入手す
ることもできる。

ＢＫウィルスのゲノムをプラスミドｐｄＢＰＶ−Ｍ　Ｍ
　Ｔ　ｎｅｏの一部と結合させてプラスミドｐＢＫｎｅ
ｏ　ｌおよびｐＢＫｎｅｏ２を構築する。プラスミドｐ
ｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴｎｅｏはＡＴＣＣから受託番号Ａ
ＴＣＣ３７２２４の下で入手することができ、約１５ｋ
ｂの大きさであって、プラスミドｐＢＲ３２２由来のレ
プリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシン
耐性付与酵素をコードする構造遺伝子を発現させる位置
にあるマウスのメタロチオナインプロモーター、並びに
約８ｋｂのウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ＤＮＡを含有
している。プラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴｎｅｏを
制限酵素−ＢａｍＨＩで消化すると、２つの断片：ＢＰ
Ｖ　ＤＮＡを含有する〜８ｋｂ断片と上記の他の配列を
含有する〜７ｋｂ断片が生成される。ＢＫウィルスは唯
一のＢａｍＨＩ制限部位を有するので、プラスミドｐｄ
ＢＰＶ　−ＭＭ　Ｔ　ｎｅｏの〜７ｋｂ　ＢａｍＨＩ制
限断片を、ＢａｍＨＩで線状化したＢＫウィルスＤＮＡ
にライゲートさせることにより、プラスミドｐＢＫｎｅ
ｏｌ及びｐＢＫｎｅｏ２が構築された。ＢＫウィルスＤ
ＮＡの方向性によってのみ異なるプラスミドｐＢＫｎｅ
。

１およびｐＢＫｎｅｏ２の構築は実施例１４に記載され
ている。ｐＢＫｎｅｏｌは〜２．１ｋｂの５ａｉｌ　−
Ｈ１ｎｄｌｌ制限断片を含有しており、プラスミドｐＢ
Ｋｎｅｏ２は〜１．Ｏｋｂ制限断片を含有している。

プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２は、い
ずれもエンハンサ−配列をも含めて、ＢＫウィルスの全
ゲノムを含有しているので、本発明の発現ベクターの構
築に有用な出発物質である。発現ベクター、プラスミド
ｐＢＬｃａｔは、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ酵素（ＣＡＴ）を発現させる位置にある２
型ヒトアデノウィルス後期プロモーターと直列（タンデ
ム）にＢＫエンハンサ−配列を含有している。プラスミ
ドＰＳＶ２ＣａｔはＣＡＴ遺伝子の便利な供給源であり
、受託番号ＡＴＣＣ３７１５５の下、ＡＴＣＣから入手
可能である。２型ヒトアデノウイルスＤＮＡは購入可能
であり、また、ＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣＶＲ−２
の下、入手可能である。

例示のプラスミドｐＢＬｃａｔは、２型ヒトアデノウイ
ルスＤＮＡの０．３２ｋｂの後期プロモーター含有Ａｃ
ｃｌ−Ｐｖｕ■制限断片を、該ＡｃｃＩ　−Ｐｖｕ■制
限断片のＰｖｕ■末端とのみ結合する平滑末端化Ｂｅ１
ｌリンカ−とライゲートさせるごとにより構築された。

次いで、得られた断片をプラスミドｐｓＶ２ｃａｔの〜
４．　ｌｋｂ　Ａｃｃｌ−Ｓｔｕｌ制限断片とライゲー
トさせると中間体プラスミドｐＬＰｃａｔが得られる。

所望のプラスミドｐＢＬｃａｔは、プラスミドｐＬＰｃ
ａｔの〜４．８１ｋｂ　Ａｃｃｌ　−３ｔｕＩ制限断片
にＢＫウィルスＤＮＡの、複製起源およびエンハンサ−
を含む〜１．２８ｋｂ　Ａｃｃｌ　−Ｐｖｕ■制限断片
をライゲートすることにより、構築された。プラスミド
ｐＢＬｃａｔの構築は実施例１５に詳しく記載されてい
る。

次いでプラスミドｐＬ１３３をプラスミドｐＨＣ７、ｐ
Ｓ　Ｖ　２　ｇｐＬ、およびｐＳ　ｖ　２−β−グロヒ
ンから構築した。プラスミドｐＨＣ７はヒトプロティン
ＣをコードするＤＮＡ配列を含有している。

プラスミドｐＨＣ７は、ＮＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５９２６（寄託日、１９８５年１月２９日）の
下、人手可能な大腸菌Ｋ１２　　ＲＲＩ／ｐＨＣ７から
単離することができる。プラスミドｐＨＣ７を制限酵素
Ｂａｎ１で消化し、〜１．２５ｋｂの制限断片を単離し
た。リンカ−を付加した後、断片を制限断片Ａｐａｌお
よびＨｉｎｄＩＩ［で切断し、所望の〜１．２３ｋｂ制
限断片を単離した。次いでプラスミドｐＨＣ７を制限酵
素ＰｓＬＩで切断し、〜０．８８ｋｂ制限断片を単離し
、リンカ−を付加した後、断片を制限酵素Ａｐａｌおよ
びＢｇｌｌｌで再切断して〜０．　ｌ　９　ｋｂ　Ａｐ
ａ　ｆ　−Ｂｇｌ　Ｕ制限断片を単離した。プラスミド
ｐＳＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１４５）を制限酵素Ｈｆ
ｎｄｌｌｌおよび旦耐■で消化し、〜５．１ｋｂ断片を
単離した。次いで、〜１．２３ｋｂ垣剰■−人匹■制限
断片、〜０．Ｉｅｋｂ人凹Ｉ−隻〔■断片および〜５．
Ｉｋｂ比暉可■−乱ｇｉｎ断片をライゲートさせて中間
体プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８を構築した。プラスミ
ドｐｓｖ２−ＨＰ　ＣＢの詳しい構築は実施例１６に記
載されている。

次いで、プラスミドｐＳＶ２−ＲＰＣ３を制限酵素旦±
ｎｄｌｌＩおよび５ａｉｌで切断し、〜０．２９ｋｂ制
限断片を単離した。同様に、プラスミドｐＳＶ２−ＨＰ
ＣＢを制限酵素旦ｇｌＩＩおよび５ａｉｌで切断し、〜
１．１５ｋｂ制限断片を単離した。プラスミドｐＳｖ２
−β−グｏビア（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５９２８，１９８
５年１月２９日寄託）を制限酵素Ｂｇｌｌｌおよび旦±
−■で切断し、〜４．２ｋｂ制限断片を単離した。これ
らの３断片をライゲートしてプラスミドｐＬ　１３３を
構築した。プラスミドｐＬ１３３の詳しい構築は実施例
１６に記載されている。

プラスミドｐＬ１３３を制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化
し、アルカリホスファターゼで処理した。プラスミドｐ
ＢＬｃａｔを同様に制限酵素ＨｉｎｄｌｌＴで切断し、
〜０．８７ｋｂ制限断片を単離した。この断片を、Ｈｉ
ｎｄｎｌ切断、ホスファターゼ処理プラスミドｐＬ１３
３ベクターにライゲートすることにより、プラスミドｐ
ｒ、ｐｃを構築した。プラスミドｐＢＬｃａＬのＨｉｎ
ｄＩＩｌ断片はプラスミドｐｉ、　１３３に２方向性で
挿入され得るので、ｐｔ、ｐｃは〜１．０ｋｂＮｄｅｌ
−３ｔｕｌ断片を適切な方向性で含有するものであるこ
とに留意すべきである。プラスミドｐＬｐｃは、プラス
ミドｐＬ１３３と同様、５Ｖ４Ｑのエンハンサ−１早期
および後期プロモーターＴ抗原−結合部位、および？！
製起源を含有している。プラスミドｐｔ、ｐｃの詳しい
構築は実施例１７に記載されている。

プラスミドｐＬＰＣ上の５Ｖ４Ｑ要素は緊密な位置にあ
り、その輪郭を描（ことは困難である。

５Ｖ４Ｑの複製に必要なＴ抗原のＴ−抗原結合部位への
結合はＶ４０後期プロモーターからの転写を促進するこ
とが分かっているが、驚（べきことに、ＢＫ後期プロモ
ーターについても同様の効果がある。通常、５Ｖ４Ｑの
複製起源を含有するプラスミドのＴ抗原誘導による高レ
ベルの′ｆｔｔ製は宿主細胞にとって致死的であるため
に、プラスミドｐＬＰＣおよびプラスミドｐＬ　１３３
のいずれも、５Ｖ４０Ｔ抗原の存在下ではエビソーム性
（染色体外）要素として安定に維持されず、これらの２
つのプラスミドが安定に維持されるためには宿主細胞の
染色体ＤＮＡに組み込まれる必要がある。

ＢＫエンハンサ−１複製起源、早期および後期プロモー
ターおよびＢＫのＴ抗原結合部位類似体はすべて緊密に
位置していることから、ＢＫウィルスＤＮＡ上の輪郭を
描くことが困難であり、従って、Ｉ３にエンハンサ−領
域の全体構造は５Ｖ４Ｑのそれと極めて類似している。

しかしながら、ＢＫＴ抗原の存在下で増殖させると、Ｂ
ＫＦｆｆ製起源およびＴ抗原結合部位を含有するプラス
ミドは、致死的な程度には複製されず、染色体外成分と
して宿主細胞内で安定に維持される。さらに、Ｔ抗原誘
導性の複製を利用し、ＢＫ複製起源を含有するヘクター
のコピー数を増大させ、選択圧を与えてより多くのプラ
スミドのコピーを宿主細胞の染免停ＤＮＡに組み込ませ
るようにすることができる。明らかにＢＫのＴ抗原と５
Ｖ４ＱのＴ抗原とは構造−機能相関関係およびそれらの
結合部位において同様であることから、ＳＶ４０　Ｔ抗
原はＢＫ複製をも刺激する。

組換えＤＮＡ発現ベクターのエピソーム性の維持が、常
に宿主細胞の染色体への組み込みよりも有利であるとは
限らない。しかしながら、真核性細胞内で機能的な選択
マーカーがないことから、プラスミドｐＬＰＣを、選択
マーカーを含有する他のプラスミドと一緒に同時導入（
形質転換）しない限り、プラスミドｐｔ、ｐｃによる安
定な真核性形質転換体を同定することはできない。そこ
で、プラスミドｐＬＰＣを改良し、真核性宿主細胞内で
選択可能な誘導体プラスミドを製造した。

これは、プラスミドｐＬＰＣを、ハイグロマイシン耐性
付与遺伝子を含有するプラスミドｐＳＶ２　ｈｙｇの一
部とライゲートさせることによって行われた。プラスミ
ドｐＳｖ２ｈｙｇは、ＮＲＲＬから、受託番号ＮＲＲＬ
　　Ｂ−１８０３９（寄託日、１９８６年２月１１日）
の下、入手可能である。プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇを制
限酵素ＢａｍＨＩで消化し、全ハイグロマイシン耐性付
与遺伝子を含有する〜２、５ｋｂ　ＢａＩＩＩＨ１制限
断片を単離し、フレノウ酵素（大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ１をサブスチリン開裂に付して得られる大きい断片）
で処理した後、フレノウ処理した、プラスミドｐＬＰＣ
の〜５．８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ−３ｔｕ［制限断片とライ
ゲートさせてプラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌおよびｐｌ、
ＰＣｈｙｇ２を得た。プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌおよ
びｐＬＰＣｈｙｇ２はハイグロマイシン耐性付与遺伝子
の方向性のみが異なる。プラスミドｐＬＰｃｈＹｇｌは
〜５．０ｋｂｌｌｉｎｄｌ［［断片を含有しているが、
プラスミドｐＬＰｃｈｙｇ２は〜１．０断片を含有して
いる。プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌおよびｐＬＰｃｔ＋
ｙｇ２の詳しい構築は実施例１８に記載されている。

ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有
するプラスミドｐＢＷ３２の構築を以下に示す。

プラスミドｐＴＰＡ１０２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８３
４，１９８４年８月ＩＯ日寄託）を制限酵素Ｕｈｌｌｌ
ｌで切断し、〜４．４ｋｂ制限断片を単離した。

この断片をフレノウ処理し、リンカ−を付加した後、断
片を制限酵素ＨｉｎｄＩ［［およびＢａｍＨＩで切断し
、〜２．Ｏｋｂ制限断片を得た。次いで、ｐＴＰＡ１０
２の〜２８８ｂｐ　Ｃ１ａｌ　−ＥｃｏＲＩ制限断片を
Ｃ１ａｌ　−ＥｃｏＲＩ切断ベクターｐＫＣ７にライゲ
ートすることにより、プラスミドｐＲＣを構築した。プ
ラスミドｐＫＣ７はＡＴＣＣから、受託番号ＡＴＣＣ３
７０８４の下で人手可能である。

プラスミドｐＲＣを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ
■で消化し、上で形成したプラスミドｐＴＰＡ１０２の
〜２．Ｏｋｂ制限断片にライゲートすることによりプラ
スミドｐＴＰＡ１０３を得た。プラスミドｐＴＰＡ１０
３の構築は実施例１９Ａに記載されている。

プラスミドｐＴＰＡ１０３を制限酵素Ｂｇｌｌｌで切断
し、フレノウ処理し、Ｎｄｅｌリンカ−を付加した。こ
の混合物をライゲートさせ、プラスミドｐＴＰＡ１０３
ｄｅｒ　Ｎｄｅ［を形成した。プラスミ消化し、〜１．
４ｋｂ断片を単離した。次いで、この断片をフレノウ処
理し、Ｈｐａｌルミｌリンカ加した後、制限酵素旦ｃｏ
Ｒｒで切断した。ｔｒｐＰ。

とＴＰＡのアミノ末端を含有する〜７７０ｂｐ断片をＥ
ｃｏＲＩ−３ｍａ［消化ベクターｐＵｃ１９とライゲー
トさせ、ｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥを構築した。

プラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥを制限酵素ｂ■で部分
消化した後、制限酵素ＢａｍＨＩで全消化した。次いで
、得られた〜３．４２ｋｂ　０ｐａｌ　−ＢａｍＨｒ制
限断片をプラスミドｐＴＰＡ１０３由来の〜１．０１５
ｋｂ　５ｅａｌ　−ＢａｍＨＩ断片とライゲートさせ、
プラスミドｐＢＷ２５を構築した。プラスミドｐＢＷ２
５の構築は実施例１９Ｂに記載されている。

プラスミドｐＢＷ２５を制限酵素ＨｉｎｄＩｕおよびＥ
ｃｏＲＩで切断し、得られた〜８１０ｂｐ断片をＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ　−Ｅ　ｃｏＲＩ切断ファージＭ１３ｍｐ８（
ＮｅｗＥ　ｎｇＬａｎｄ　Ｂ　ｔｏｌａｂｓ）にライゲ
ートしてファージｐＭ８ＢＷ２６を構築した。次いで、
ファージｐＭ８ＢＷ２６を用いてインビトロの突然変異
誘発反応（アミノ酸残基をコードするＤＮＡの欠失）を
行い、ファージｐＭ８ＢＷ２７を構築した。ファージｐ
Ｍ８ＢＷ２７を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅｌで切
断し、〜５６０ｂｐ制限断片を単離した。〜４８ｂｐの
合成Ｎｄｅｌ−Ｘｂａｌリンカ−を合成した。

プラスミドｐＴＰＡ１０３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩで切断し、〜６８９ｂｐ断片を単離した。プ
ラスミドｐＬ１１０（実施例９で構築）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで部分消化し、次いで、Ｘｂａ［で完全に切断し
て〜６．Ｏｋｂ断片を単離した。この〜６．Ｏｋｂベク
ター断片、プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜６８９ｂｐ断
片、ファージＩ）Ｍ８ＢＷ２７の〜５６０　ｂｐ断片、
および〜４８ｂｐリンカーを全部−緒にライゲートさせ
、プラスミドｐＢＷ２８を得た。このプラスミドｐＢＷ
２８の構築プロトコールは実施例１９Ｃに記載されてい
る。

次いで、プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２．０ｋｂＨｉ
四■−旦１■断片をプラスミドｐｓｖ２−βグロビンの
〜４．２ｋｂ　Ｈｉｎｄ［［−ＢｇｌＩ［断片とライゲ
ートさせてプラスミドｐＴＰＡ３０１を構築した。プラ
スミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）を制
限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。ＢａｍＨ１リンカ−を付
加した後、〜１．９ｋｂのｄｈｆｒ遺伝子断片を、Ｂａ
ｍＨ［切断し、ホスファターゼ処理したプラスミドｐＴ
ＰＡ３０１にライゲートさせることによりプラスミドｐ
’ｒ　Ｐ　Ａ　３０３を得た。

プラスミドｐＴＰＡ３０１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＢｇｌＩｌで切断し、〜２．７ｋｂ断片を得た。プラス
ミドｐＴ　Ｐ　Ａ　３０３を制限酵素Ｈｉｎｄｌｎおよ
びＥｃｏＲ［で切断し、ｄｈｒｒ遺伝子を含有する〜２
３４０ｂｐ断片を得た。プラスミドｐＴＰ　Ａ　３０３
を制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌおよび５ｓｔｌで切断し、〜
１．７ｋｂ断片を得た。プラスミドｐＢＷ２８を制限酵
素Ｘｈｏｌｌおよび５ｓｔｌて切断し、〜６８０ｂｐ断
片を？”Ｊだ、プラスミドｐＴＰＡ３０１の〜２，７ｋ
ｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片、プラスミドｐＴＰＡ３
０３の〜２３４０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断
片、プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜１．７ｋｂ　Ｈｉｎ
ｄＩ［ｌ−３ｓｔｌ断片およびプラスミドｐＢＷ２８の
〜６８　ｏｂｐ　Ｘｈ。

［［−Ｓ　ｓｔ　Ｉ断片を全部−緒にライゲートし、プ
ラスミドｐＢＷ３２を構築した。プラスミドｐＢＷ３２
の構築プロトコールは実施例１９Ｄに記載されている。

プラスミドｐＢＷ３８のｄｈｆｒ遺伝子含有〜１．９ｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ制限断片を単離し、フレノウ酵素で処理
し、ＥｃｏＲ１部分消化したプラスミドｐＬＰＣｈｙｇ
　ｌに挿入し、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰ
Ｃｈｄ２を構築した。プラスミドｐＬＰＣｈｙｇ１は２
個のＥｃｏＲｒ制限酵素認識部位を有し、その１つはハ
イグロマイシン耐性付与遺伝子中に、もう１個はプラス
ミドｐＢ　Ｒ３２２から導かれた配列中に存在する。ｄ
ｈｒｒ遺伝子を含有する断片をプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃ
ｈｙｇ　ｌのｐＢＲ３２２誘導Ｅｃ。

Ｒ１部位に挿入し、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌ及びｐＬ
ＰＣｈｄ２を得た。本発明の目的から、プラスミドｐＬ
ＰｃｈｄｌをプラスミドｐＬＰＣｈｄと呼称する。

プラスミドｐＬＰＣｈｄの制限部位および機能地図を第
２０図に示す。ｄｈｆｒ遺伝子含有ＤＮＡセグメントの
方向性のみが異なるプラスミドｐＬＰＣｈｄｌおよびｐ
ＬＰｃｈｄ２の構築を実施例２０に示した。

プラスミドｐΔＬＰＫＳＡはプラスミドｐＧＡＧ１３１
７およびプラスミドｐＬＰＣｈｄから誘導された本発明
のベクターである。プラスミドｐＧＡＧ１３１７の〜１
２００塩基対のＢｓ５Ｈ１］−Ｈｌｎｃ［Ｉ断片をフレ
ノウ処理して５゛突出末端を充填した。この断片は全Ｋ
ＳＡ暗号領域を表す。次いで、この断片をＢａ１ｌ消化
し、精製したベクターｐＬＰＣｈｄとライゲートさせた
。これにより、プラスミドｐｌ、ＰＣｈ＜Ｉのプロティ
ンＣ構造遺伝子カフラスミドｐＧＡＧ１３１７のＫＳＡ
構造遺伝子で置き換えられ、好ましい発現ベクターであ
るｐＡＬＰＫＳＡが構築された。プラスミドｐＡＬＰＫ
ＳＡの詳細な横築方法を実施例２■に記載した。プラス
ミドｐＡ　Ｌ　Ｐ　Ｋ　ＳΔの制限部位および機能地図
を第２１図に示す。

本発明は、本明細書で例示した特定の真核性プロモータ
ーの使用に限定されるものではない。ＳＶ４０後期プロ
モーターまたは真核性遺伝子由来のプロモーター、例え
ばニストロケンで誘導可能なニワトリオバルミン遺伝子
、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイドで誘導
可能なチロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、チミ
ジンンキナーゼ遺伝子、主要な早期アデノウィルス遺伝
子由来のプロモーター、および５Ｖ４Ｑ早期プロモータ
ーを単離し、真核性宿主細胞にＫＳＡを産生させるため
に設計された組換えＤＮＡ発現ベクターに用いるように
修飾することも容易である。

真核性プロモーターを、ＫＳＡを発現させるためにタン
デム（直列）に用いることができる。さらに、広範な真
核性宿主細胞に影響を及ぼす多数のレトロウィルスが知
られている。レトロウィルスＤＮＡのロングターミナル
リピートはしばしばプロモーター活性をコードしており
、ＫＳＡを発現させるために、上記のＢＫエンハンサー
−アデノウィルス後期プロモーターの代わりに用いるこ
とができる。

ベクターｐＡＬＰＫＳＡは、様々な真核性宿主細胞、特
に哺乳類宿主細胞に導入し、発現させることができる。

通常、大腸菌内でのプラスミドＤＮＡの調製は他の宿主
細胞内のそれよりも有効なので、プラスミドｐΔ１、Ｐ
ＫＳＡは大腸菌内での複製を可能にする配列をも含有し
ている。発生期のＫＳＡ構造遺伝子を伴った特定のプロ
モーターが機能する宿主細胞内でＫＳＡが発現される。

当業者ならば、その宿主細胞が大ＤＮＡウィルスの前明
朗（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子産物を発
現する限り、種々の真核性宿主細胞を用いてＢＫエンハ
ンサー−アデノウィルス後期プロモーターを用い、ＫＳ
Ａを発現させることができるということを理解し得るで
あろう。前初期遺伝子産物は、例えばプラスミドまたは
他のベクターによる形質転換のごとく様々な方法で宿主
細胞内に導入され得るので、実質上、あらゆる真核性細
胞を本発明方法に用いることができる。ヒト細胞は天然
状態でのＢＫウィルスの宿主であり、ＢＫエンハンサ−
の刺激活性を持つ細胞因子を含有していると思われるの
で、ヒト細胞は本発明方法における好ましい宿主細胞で
ある。ヒト腎細胞はとりわけ好ましい宿主細胞であるが
、ＥＩＡ遺伝子産物を発現するアゾ／ウィルス５で形質
転換された胚セルライン２９３は最も好ましく、ＡＴＣ
Ｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から、
受託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５７５３の下で入手可能
である。

本発明のＤＮＡ化合物は、例えば、大腸菌、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔ　
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等の原核性宿主細胞内でも発現
される。通常、原核性宿主細胞は、組換えＤＮＡ遺伝子
から形成される哺乳類タンパク質のグリコジル化を行わ
ず、また、しばしば適切にホールディング（折り畳み）
しないので、本発明のＫＳＡコード化ＤＮＡを原核性宿
主細胞内で発現させると、様々な新規ＫＳＡ誘導体が得
られる。原核性宿主細胞によって発現される新規なＫＳ
Ａ誘導体はモノクローナル抗体ＫＳＩ／４と種々のレベ
ルの反応性を示すので、特異的な抗体／抗原相互作用に
必要なホールディングおよび翻訳後修飾を決定するのに
用いることができる。また、新規なＫＳＡ誘導体は、こ
れまで知られていない、ＫＳＡの特殊な部分とのみ反応
する新規な抗体の創造に有用である。当業者ならば、競
合法で診断または治療を行う際には、恒原のある部分を
認識する能力を有する抗体が、不可欠であるということ
を容易に理解するであろう。

本発明のＫＳＡコード化ＤＮＡ化合物の原核性宿主細胞
内での発現に先立ち、真核性シグナルペプチド（プレペ
プチド）をコードしているＤＮＡと真核性プロペプチド
とを除去した。本発明はいかなる理論または実施方法に
も限定されず、または左右されないが、発生期のプレプ
ロＫＳΔの２１アミノ酸残基は、シグナルペプチド（プ
レペプチド）として働（と考えられる。本発明は、真核
性宿主細胞内でＫＳＡを発現させるための、特定の真核
性シグナルペプチドの使用に限定されるものではない。

さらに、発生期のプレプロＫＳＡのアミノ末端にある次
の６０アミノ酸残基はプロペプチドとして働く。プレプ
ロペプチドを除去すると、Ｕ　ＣＬ　Ａ　−Ｉ）　３細
胞の細胞表面に見いだされる発生期のＫＳＡの鎖と実質
上同様の発生期の鎖を有する分子が形成される。−膜内
な原則として、原核性生物は有効に真核性シグナルペプ
チドをプロセッシングしないので、発生期ＫＳＡ構造遺
伝子のシグナルペプチドをコードする部分を原核性生物
内で発現させることは非能率的といえる。本明細書には
具体的に例示しなかったが、本発明は、原核性生物内で
ＫＳＡを発現し、分泌する、原核性のシグナルペプチド
をコードするＤＮＡと、本発明のＫＳＡをコードするＤ
ＮＡとの融合物をも包含するものである。

上記の修飾に加え、分子の原核性生物内での発現に先立
ってＫＳＡをコードしているＤＮＡの他の領域を除去し
た。具体的には、発生期ＫＳＡのカルボキシ末端の４９
アミノ酸残基をコードしているＤＮＡを除去した。この
ことは、発生期ＫＳＡの全細胞質領域と膜透過領域とが
除去されたことを意味する。従って、この分子のＤＮＡ
が発現されると、ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞の表面に認められ
る発生期のＫＳＡ鎖と実質上同じアミノ酸構造を含有す
るＫＳＡ誘導体が導かれる。

上記のように、ＫＳＡの一部の細胞外分泌のための「シ
グナル」（プレペプチド）をフードしていると思われる
発生期ＫＳＡの１−２１アミノ酸残基は、腺がん細胞の
表面に見いだされる発生期ＫＳＡには存在しない。ＫＳ
Ａのプロペプチドを含有する発生期ＫＳＡの残基２２−
８１もタンパク質のプロセッシングの過程で除去され、
それは、分子の正しいホールディングおよび修飾に関与
しているとされている。発生期ＫＳＡの残基８２−２６
５は以下に例示する原核性発現ベクターに含有されてい
るが、残基２６６−３１４は含有されていない。これら
の残基は細胞質領域と膜透過領域を含有している。

しかしながら、本発明は特定のＫＳＡ誘導体の発現に限
定されるものではない。本発明のＤＮＡ化合物はＫＳＡ
の様々なアミノ酸残基をコードする、ある部分を欠失さ
せて修飾することができる。

当業者ならば、本発明のＤＮＡ化合物を、制限酵素消化
や部位特異的突然変異誘発に付すことよって、ＫＳＡ誘
導体をコードしている化合物群を殆ど無制限に得ること
ができることを認識し得るであろう。そのような操作も
本発明の範囲内であって、本明細書で開示した詳細な配
列によって可能である。

本発明のプラスミドｐＬＫＳＡは大腸菌内でＫＳＡのア
ミノ酸残基８２−２６５を発現させるように設計されて
いる。プラスミドｐＬ　Ｋ　Ｓ　ＡはプラスミドｐＧＡ
Ｇ１３１７およびプラスミドｐＬ１１０Ｃから構築され
た。プラスミドｐＧＡＧ１３１７については既に述べた
。プラスミドｐＬ　１１０Ｃの構築については、以下に
簡単に記載すると共に、その詳細を実施例１−１０に示
す。プラスミドｐＬ１１０ｃの制限部位および機能地図
を第１３図に示す。

大腸菌Ｋ１２　　ＢＥ１２０１／ｐＫｃ２８３（寄託臼
：　１９８４年８月３日）からプラスミドｐＫＣ２８３
を得た。この培養物はＮＲＲＬから、受託番号ＮＲＲＬ
　Ｂ−１５８３０の下、人手可能である。プラスミドｐ
ＫＣ２８３はバクテリオファージλのハイブリソソｔｐ
ｐ−ｐＬプロモーターを含有している。大腸菌に１２　
　ＢＥ１２０１は細胞ＤＮＡに組み込まれた温度感受性
ｃｌリプレッサーを含有しているので、この細胞中でプ
ラスミドｐＫＣ２８３が得られた。プラスミドｐＫＣ２
８３単離の詳細を実施例１に示す。プラスミドＰＫＣ２
８３の制限部位および機能地図を第１図に示す。

プラスミド１）ＫＣ２８３をまず制限酵素ＰｖｕｌＩで
消化することにより、不要な１ａｃＺ部分をプラスミド
ｐＫＣ２８３から除去した。次いで、消化ＤＮＡに特殊
なりＮＡリンカ−を付加してＰｖｕＩ［部位を一個のＸ
ｈｏ１部位に変換し、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを創
造した。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの単離に関する詳
細を実施例２に記載した。プラスミドＰＫＣ２８３ＰＸ
の制限部位および機能地図を第２図に示す。実施例３に
記載したように、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを大腸菌
に１２Ｍｏ（λ゛）に導入した。大腸菌に１２Ｍ０（λ
゛）はＮＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９９３
（寄託臼：　１９８５年８月１４日）の下、入手可能で
ある。

プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを制限酵素Ｂｇｌｌｌｌお
よびＸｈｏ［で消化した。ベクターを精製した後、Ｂｇ
ｌｌｌおよびＸｈｏｌ末端を有するＤＮＡリンカ−をベ
クターにライゲートさせ、プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ
を形成した。旦ｇｌｌＩ−Ｘα１リンカ−はＸｂａ１部
位をも含有している。プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの詳
しい構築方法を実施例４に示す。

プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限部位および機能地図
を第３図に示す。

プラスミドｐＫＣ２８３−ＬのＸ　ｈｏ　１部位をＢａ
ｍＨ１部位に変換した。プラスミドｐＫ　Ｃ２８３Ｌを
制限酵素Ｘｈｏｌで完全消化した後、フレノウ処理し、
ＢａｍＨＩリンカ−を付加してプラスミドｐＫＣ２８３
−ＬＢを構築した。プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの詳
細な構築を実施例５に示す。プラスミドｐＫＣ２８３−
ＬＢの制限部位および機能地図を第４図に示す。

次いで、プラスミドＰＫＣ２８３ＰＸを制限酵素５ａｉ
ｌで消化した後、得られた〜４．Ｏｋｂのベクターをフ
レノウ処理し、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加することによ
り、余分の大腸菌ＤＮＡを該プラスミドから除去した。

ライゲーションによって再環化するとプラスミドｐＫＣ
２８３ＰＲ８が得られた。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ
３の構築方法の詳細を実施例５に示す。プラスミドｐＫ
、Ｃ２３ＰＲ８の制限部位および機能地図を第５図に示
す。

次いで、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３を制限酵素Ｐｓ
ｔｌおよびＳ　ｐｈ　Ｉで消化し、〜０．８５ｋｂのＰ
ｓｔｌ−３ｐｈｌ制限断制限中離した。同様の方法で、
プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢをＰｓｔｌおよびＳ　ｐ
ｈ　Ｉで消化し、〜３．Ｏｋｂの断片を単離した。次い
で、ｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂＰｓｔｌ−３
ｐｈｌ断片をｐＫＣ２８３−ＬＢの〜３゜Ｏｋｂ　Ｐｓ
ｔｌ−ｓｐ旧ベクター断片にライゲートしてプラスミド
ＰＬ３２を構築した。プラスミドｐＬ３２の詳細な構築
を実施例６に示す。プラスミドｐＬ３２の制限部位およ
び機能地図を第６図に示す。

プラスミドｐＮＭ７８９はＮＲＲＬから受託番号ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１８２１６の下で得られる大腸菌に１２　Ｒ
Ｖ３０８／ｐＮＭ７８９から単離される。プラスミドｐ
ＮＭ７８９の制限部位および機能地図を第７図に示す。

プラスミドｐＮＭ７８９を制限酵素ＰｖｕＩＩによる部
分消化、制限酵素ＢａｍＨＩによる完全消化に付した後
、アルカリホスファターゼ処理した。次いで、消化し、
アルカリホスファターゼ処理したベクターｐＮＭ７８９
に新しいＰｖｕｌｌ　−ＢａｍＨＩリンカ−をライゲー
トすることにより、プラスミド１２０を得た。プラスミ
ドｐ１２０の詳細な構築方法を実施例７に示す。プラス
ミド１２０の制限部位および機能地図を第８図に示す。

次いで、プラスミド１２０を制限酵素ＸｂａｌおよびＢ
ａｍＨＩで完全消化し、ＥＫ−ＢＧＨコード化〜０．６
ｋｂ　Ｘｂａ［−ＢａｍＨＩ制限断片を単離した。プラ
スミドｐＬ３２を制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで
消化し、〜３．９ｋｂのベクター断片を単離した。次い
で、プラスミド１２０由来の〜０゜６ｋｂ　ＸｂａＩ　
−ＢａｍＨＩ断片をプラスミド１２０由来の〜３．９ｋ
ｂベクター断片にライゲートさせてプラスミドｐＬ４７
を得た。プラスミドｐＬ４７の詳細な構築方法を実施例
７に示す。プラスミドｐＬ４７の制限部位および機能地
図を第９図に示す。

プラスミドｐＰＲ１２は温度感受性ｐＬリプレッサー遺
伝子ｃｌとプラスミドｐＢ　Ｒ３２２由来のテトラサイ
クリン耐性付与遺伝子を含有している。

プラスミドｐＰＲ１２は米国特許節４，４３６，８１５
（１９８４年３月１３日公告）に開示されている。プラ
スミドｐＰＲ１２の制限部位および機能地図を第１Ｏ図
に示す。プラスミドｐＰＲ１２をまず制限部位ＥｃｏＲ
Ｉで完全消化し、フレノウ処理することにより、該プラ
スミドからＥｃｏＲ１部位を除去した。次いで、ベクタ
ーをライゲートして再環化することにより、プラスミド
ｐＰＲ１２△Ｒ１を構築した。次いで、プラスミドｐＰ
Ｒ１２△Ｒ１を制限酵素Ａｖａｌで消化し、フレノウ処
理した。Ａｖａｌ消化し、フレ／つ消化したｐＰＲ１２
△Ｒ１を、ＥｃｏＲ［リンカ−とライゲートし、制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断して再環化することによリプラスミ
ドＰＰＲ１２ＡＲ１を構築した。プラスミドｐＰＲｌ　
２ＡＲｌの詳細な構築方法を実施例８に示す。プラスミ
ドｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能地図を第１１
図に示す。

プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１をまず制限酵素Ｐｓｔｌお
よびＥｃｏＲＩで消化してプラスミドＰＰＲＩ２ＡＲ１
の〜２．９　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ制限断片
を単離した。プラスミドｐＬ４７を制限酵素ＰｓｔＩお
よびＢａｍＨＩで消化して〜２．７ｋｂのＰｓローＢａ
ｍＨＩ制限断片を単離した。別に、プラスミドｐＬ４７
を制限酵素ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ［で消化し、〜１
．０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を単離し
た。プラスミドｐＬ４７の〜２．７ｋｂＰｓｔ　［−Ｂ
ａｍＨＩ制限断片と〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−Ｂａ
ｍｆ（［制限断片とをプラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩの〜
２．９　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ制限断片とラ
イゲートしてプラスミドｐＬｌｌｏを構築した。

プラスミドｐＬ１１０の詳細な構築方法を実施例９に示
す。プラスミドｐＬ１１０の制限部位および機能地図を
第１２図に示す。

プラスミドｐＬ１１０を制限酵素ＮｄｅＩ消化、フレノ
ウ処理に付し、再環化することにより、プラスミドｐＬ
ｌｌＯＡを構築した。また、プラスミドｐＬ１１０を制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、テト
ラサイクリン耐性付与断片を単離した。この断片をファ
ージｍ１３ｎ＋ｐ１８の〜７．２５ｋｂ　Ｈ４ｎｄＩ［
Ｉ−ＥｃｏＲＩ制限断片とライゲートさせてファージＭ
１３Ｔｃ３を得た。ファージｍ１３ｍｐ１８は、ニュー
・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入し得る。次いで、−本積の
ファージＭ１３Ｔｃ３を単離し、テトラサイクリン遺伝
子内のＢａｍＨ１部位中、部位−オチドＣをＡに変換す
るためにインビトロの部位特異的突然変異誘発反応を行
った。これにより、テトラサイクリン耐性付与タンパク
質のアミノ酸成分を変えずにＢａｍＨ１部位を消滅させ
た。新規な、突然変異したプラスミドで形質転換し、Ｂ
ａｍＨ１部位を欠失した複製型を選択してプラスミドｐ
Ｌ１１０Ｂと命名した。

プラスミドｐＬ１１０Ｂを制限酵素Ｎｈｅ［および５ｓ
ｌｌで消化し、テトラサイクリン耐性付与断片を単離し
た。同様にプラスミドｐＬ１１０Ａを制限酵素Ｎｈｅ［
および５ｓｌｌで切断し、大きいベクター断片を単離し
た。プラスミドＰＬＩＩＯＢのテトラサイクリン耐性付
与断片をｐＬｌｌｏＡのＮｈｅｌ−３ｓｌｌ切断ベクタ
一断片とライゲートさせ、プラスミドｐＬ１１０ｃを構
築した。プラスミドｐＬ１１０ｃの詳細な構築方法を実
施例１０に示す。プラスミドｐＬ１１０ｃの制限部位お
よび機能地図を第１３図に示す。

プラスミドｐＧＡＧ１３１７を制限酵素Ａｐａｌせ切断
し、アルカリホスファターゼで処理した。

Ｋ　Ｓ　Ａの最明の６アミノ酸残基および付加的なメチ
オニン残基をコードしているＤＮＡを含有するリンカ−
類を分子にライゲートさせた。これらのリンカ−はまた
、その５″末端にＸｈｏｌ制限部位を有する。次いで、
ＤＮＡをＸｂａＴおよびＥｃｏＲＩで消化し、〜５００
ｋｂ　Ｘｂａ［−Ｅ′ｃｏＲＩ制限断片を単離した。プ
ラスミドｐＬ１１０ＣをＥｃ。

Ｒ１およびＸｂａｌで消化し、大きいベクター断片を単
離した。ｐｃΔＧ１３１７の〜５００ｋｂＥｃ。

ＲＩ−Ｘｂａｌ断片をｐＬｌｌｏｃのＥｃｏＲＩ　−Ｘ
ｂａＩベクター断片とライゲートさせ、プラスミドｐＬ
ＫＳＡ−Ｂを構築した。プラスミドｐＬＫＳＡＢの詳細
な構築方法を実施例１２に示す。プラスミドｐＬＫＳＡ
−Ｂの制限部位および機能地図を第１８図に示す。

プラスミドｐＬＫＳＡ−Ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
した後、アルカリホスファターゼで脱りん酸化した。次
いで、ＥｃｏＲＩ切断分子にＥｃｏＲＩＢａｍＨ［リン
カ−をライゲートさせた。これらのリンカ−もＫＳＡの
ＥｃｏＲ１部位から膜透過領域までの８アミノ酸残基を
コードするＤＮＡと転写終止コドンとを含有している。

次いで、このプラスミドを制限酵素Ｘｂａｌで切断し、
ＫＳＡコード化Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ断片を単離した
。次いで、ｐＬｌｌｏｃを制限酵素ＸｂａｌおよびＢａ
ｍＨＩで切断し、大きいベクター断片を単離した。ｐＬ
ＫＳＡ−ＢのＫＳΔコード化Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ制
限断片をプラスミドｐＬ１１０ｃのＸｂａｌ　−Ｂａｍ
Ｈ１ベクタ一断片にライゲートしてプラスミドｐＬＫＳ
Ａを構築した。プラスミドｐｔ、　Ｋ　Ｓ　Ａの詳細な
構築方法を実施例１２に示す。プラスミドｐＬＫＳＡの
制限部位および機能地図を第１９図に示す。

プラスミドｐｔ、　Ｋ　Ｓ　Ａはテトラサイクリン耐性
付与遺伝子、温度感受性Ｃｌ８５７１Ｊプレツサー遺伝
子、ハイブリッドｐＬ／ｌｐｐプロモーター系および発
生期プレプロＫＳＡのアミノ酸残基８２−２６５を含有
している。発生期プレプロＫＳＡのアミノ酸残基８２−
２６５はＵＣＬＡ−Ｐ３のごとき腺がんの細胞表面に見
いだされる発生期のアミノ酸抗原構造を含有している。

特定のプロモーターの選択は本発明の実用性にとって重
要な事ではなく、従って、大腸菌内でのＫＳＡ発現は特
定のプロモーターの使用に限定されるものではない。

既述の例示プロモーターｐｔ、に代えて用い得るプロモ
ーターとしては、例えば、大腸菌のラクトース（旦、他
ハリ、旦、並旦抑、バクテリオファージλＰＬＯＬ、お
よびバクテリオファージλＰｉｔＯｎプロモーターを挙
げることができるがこれらに限定されない。また、■ま
たはそれ以上のプロモーター、例えば卿およびｌａｃプ
ロモーターをタンデムに配して用い、あるいは、ｔａｃ
プロモーターのようなハイブリッドプロモーターを用い
てＫＳＡ構造遺伝子を発現させることもできる。上記の
プロモーターはすべて、既に特性化されており、当業者
に周知であって、合成または既知のプラスミドから構築
することができる。

当業者ならば本発明が、ＫＳＡを大腸菌内で発現させる
ために特定のレプリコン含有プラスミドの使用に限定さ
れないことを理解するであろう。

ｐＢＲ３２２、ｐＩ３　Ｒ３２８、ｐＡｃＹｃｌ、８４
等に由来する多くのレプリコンが知られており、それら
が本発明のＫＳＡをコードしているＤＮＡ化合物を発現
させるように企画された組換えＤＮＡクローニングおよ
び発現ベクターの構築に好適である。本発明はまた、本
明細書中の例示プラスミドに示されている実際の選択マ
ーカーに限定されるものではない。本発明のＤＮＡ化合
物（または配列）を含有する組換えＤＮＡクローニング
および発現ベクターに用いるのに適した、真核性および
原核性の両宿主細胞用の広範な選択マーカーが種々存在
している。

本発明の代表的なりＮＡ配列およびプラスミドには多く
の改変、並びに変異が存在し得る。例えば、遺伝暗号の
縮重によって、ポリペプチド暗号領域を通じてヌクレオ
チドの置換、並びに翻訳終、ＴＡＧ　　　　ＴＧＡ　　
　ＴＡＡ 止シグナル、　　　または　　　での　　　終止ＡＴＣ
ＡＣＴ　　　ＡＴ′ｒ シグナルの置換を具体的に挙げることができる。

そのような配列は、今や既知となったＫＳＡのアミノ酸
またはＤＮＡ配列から推測し、以下に示す通常の合成法
に従って構築することができる。そのような合成は、実
質上、イタクラ（Ｉ　ｔａｋｕｒａ）ら（１９７７，５
ｃｉｅｎｃｅ　１９８　：　１０５６）およびフレア（
Ｃｒｅａ）ら（１９７８，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　ＳΔ　７５：５７６５）の方法に従っ
て行うことができる。また、合成遺伝子およびリンカ−
は、シスチック（Ｓｙｓｔｅｃ）　ｌ　４５０　Ａ　Ｄ
ＮＡシンセサイザー（Ｓｙｓｔｅｃ、　　Ｉｎｃ、、　
　３８１６　Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｍｉｎ
ｎｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ）またはＡＢＳ３３ＱＡ　Ｄ
ＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、　　Ｉｎｃ、、　　８５０　　ＬｉｎｃｏＩｎ
　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ　９４４０４）のいず
れかを用いて合成し得る。当業者にはその他の多くのＤ
ＮＡ合成装置が知られており、合成りＮＡ断片の作成に
用いることができる。したがって、本発明は、本明細書
に例示した特定のＤＮＡ配列やプラスミドに限定される
ものではない。

本発明の原核性発現ベクターは、広範囲におよぶ多くの
宿主生物に適用され、とりわけ、大腸菌のようなダラム
陰性菌、例えばＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２、等に適用し
得る。本発明の全態様が有用であるが、ある種のベクタ
ーおよび形質転換体が好ましい。

好ましい形質転換体はＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＲＶ
３０８／ｐＬＫＳＡである。

当業者ならば、本発明の発現ベクターを用いて真核性ま
たは原核性宿主細胞を形質転換し、発生期のＫＳＡ構造
を持ったポリペプチドを宿主細胞内で発現させることを
理解するであろう。宿主細胞内で機能し、発生期のＫＳ
Ａ構造遺伝子を発現させるプロモーターを有するベクタ
ーで宿主細胞が形質転換され、また、宿主細胞がシグナ
ルペプチドのプロセッシングにかかる細胞機構を有する
ならば、成熟ＫＳＡがその細胞表面に見いだされるであ
ろう。他の発現条件下、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉＲＶ３０
８中にプラスミドｐＬＫＳＡが存在する場合等では、宿
主細胞からＫＳＡを単離しなければならない。

前記のごとく、組換え法で産生されたＫＳＡは上皮起源
のがんの診断、予防、治療および研究に深（関与し得る
。さらに、ＫＳＡは正常なヒト上皮細胞の亜集団によっ
ても発現されるので、本発明で開示したアミノ酸および
ヌクレオチド配列はそのような細胞表面抗原が正常な組
織の分化、発達および非−悪性腫瘍性の疾患状態に果す
役割を研究する上で有用である。ＫＳＡ遺伝子（または
そのサブフラグメント）は、他の近縁遺伝子またはその
変異体を見いだすために広範な細胞型から導かれたＤＮ
Ａライブラリーのプローブとして用い得る。次いで、こ
れらの新らしい抗原遺伝子を用い、さらにがんと闘うた
めの新規な抗体を構築することができる。

モノクローナル抗体ＫＳＩ／４は、ブモル（Ｂｕｍｏｌ
）により、がんの診断、予防およりび治療に有効な物質
であることが示された［ライスフェルト（Ｒｃｉｓｒａ
ｌｄ、　ＲΔ、）およセル（Ｓｅｌｌ、Ｓ、　）編、Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　
Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
：　Ａｌａｎ　ＲＬｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　　１９８５＋
　　２５７−２５９］。スペアマン（Ｓ　ｐｅａｒｍａ
ｎ）ら（１９８７、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　ａｎｄ
　Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２４１　：　６９
５−７０３）は、腫瘍の位置決定と治療にモノクローナ
ル抗体−ビンカアルカロイド抱合体を用いることを開示
した。このＫＳＩ／４ＤＡＶＬＢ（４−デスアセチルビ
ンブラスチン）抱合体は、Ｂ　ｕｍｏｌらが述べたよう
に、腫瘍の増殖抑制にも関与している［セリアニ（Ｃｅ
ｒｉａｎｉ、　Ｒ、Ｌ　。

）編、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ
ｈｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｄ　ｊａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ
　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｒＢｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ、
　ＮｅｗＹｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｐｌｅｎ
ｕｍ　Ｐｒｅｓｓ；　ｌ　９８７＋２０５−２１５］。

これらの文献の教示に照らして、組換えＫＳＡは、ＫＳ
Ｉ／４の親和性を改変するのに宵用であるらしい。ＫＳ
Ｉ／４の細胞表面のＫＳＡ可溶性部分との結合の後、Ｘ
線結晶解析に付すことにより、抗原のどのアミノ酸残基
がＫＳＩ／４のとのアミノ酸残基に極めて接近している
かが分かるであろう。次いで、タンパク質設計（工作）
を利用することにより、抗原の陽性残基の近くに陰性残
基を配するよう、ＫＳＩ／４を改変することができる。

そのような「工作された」抗体は、がん患者の細胞表面
ＫＳＡにより大きい親和性を示すであろう。類似の方法
で、これらのタンパク質工作法を用いて低親和性のＫＳ
Ｉ／４誘導体を削造することもできる。

当業者ならば、本発明の配列を用いてのみ作成可能なそ
れら「高親和性」抗体は正常なＫＳＩ／４に比較して有
効性が増大していることが分かるであろう。新しく工作
された抗体はより緊密にＫＳＡと結合するので、患者に
投与すべき分子の量を少なくできる。このことは、患者
の循環系に循環される抗体の全量を減少し、その結果、
それら抗体が正常な結腸細胞のような低エピトープ細胞
と結合する可能性を減少することになる。他方、抗原の
高エピトープ濃度を示す腺がん細胞は新規抗体によって
より認識され易くなるであろう。

さらに、組換えＫＳＡおよびその誘導体は、当業者既知
の可溶化法を用いて発現された細胞から単離することが
できる。カーノ（Ｋ　ａｈａｎ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏ
ｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｖｏｌ、　ＩＸ、
　　Ｂｕｓｃｈ、編、ｐ、　２８３−３３８．　　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ、１９７３）は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）（Ｎｅ
ｗ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉ
ｃｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂ　！ｏｌｏｇｙ。

ｖｏｌ、　２．　　Ｐ　ａｉｎ等編、ＰＰ、　１　４２
＋　Ｗｉｌｅｙ、　　Ｌｏｎｄｏｎ１９７５）のように
、多くの抽出方法を記載した。次いで、抗原含有画分を
用い、ケラ−（Ｋ６ｈｌｅｒ）およびマイルスタイン（
１’Ｊｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ　２
５６：４９５−４９７）またはゴールデンバーグ（Ｇ　
ｏ　ｌｄｅｎｂｅｒｇ）　（米国特許第４，４４４．７
４４号）の教示に従い、新規な抗体を作成する。その組
換えＫＳＡまたはＵＣＬＡ−Ｐ３に対する特異反応性に
基づいて単離され得るこれらのＫＳＩ／４“姉妹”も疾
患状態の診断および治療に有用である。

組換えＫＳＡおよびその誘導体はまた、腫瘍細胞と反応
するポリクローナル抗体を惹起するのにも用い得る。時
には、そのようなポリクローナル抗体は、腫瘍表面マー
カーとの反応性の増大を示す場合もある。ポリクローナ
ル抗体の惹起は、当業者周知の方法で行われる。動物を
抗原またはそのサブユニットでチャレンジし、次いで、
動物の免疫系によって抗原に対する抗体が産生されるの
に適当な期間、動物を飼育する。次いで、抗体を、周知
の方法、例えばハーバ−マン（Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ）等
編（夏　ｍｍｕｎｏｄｉｏｇｎｏｓｉｓ　　ｏ　ｆ　Ｃ
ａｎｃｅｒ、　　Ｍａｒｃｅｌ　　Ｄｅｋｋｅｒ、　　
Ｉ　ｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｂａ５ｅｌ、
　　１９７９）およびセル（Ｓｅｌｌ）ｉ（Ｔｕｍｏｒ
　Ｍａｒｋｅｒｓ、　ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、　　Ｃ
１１ｆｔｏｎ、Ｎ、Ｊ、、　　１９８０）によって開示
された方法で単離する。次いで、これらの抗体をイムノ
ロジカルアッセイ（免疫学的検定）に用いて組織中の腺
がん細胞の存在を調べる。

組換えＫＳＡおよびその誘導体はまた、分析学的方法論
の標準化のために大量の規定された抗原を提供するため
に調製される。例えば、ＫＳ　ｌ／４抗体または新たに
開発されたその誘導体の発酵および生産の監視（モニタ
ー）用の機能的なイムノアッセイを開発することもでき
る。組換えＫＳＡを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによってモノクローナル抗体ＫＳＩ／４の精製は
大いに単純化されるであろう。組換えＫＳＡまたはその
誘導体はまた、様々なモノクローナル抗体に基く生産物
の精製、製剤化分析および安定性研究に有用である。組
換えＫＳＡは強力な抗原がんワクチンの開発に用い得る
。

以下の実施例により、本明細書で開示した発明をさらに
詳しく説明する。実施例は本発明を構築する方法を記載
し、さらに適切な箇所で方法を説明した。なお、以下の
実施例では、プラスミド名がイタリック体であることを
表す下線を省略した。

実施例１　プラスミドｐＫＣ２８３の単離大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌＤＫ　１２　　Ｂ　Ｅ　ｌ　２０１／ｐＫＣ２８
３の凍結乾燥品をノーザン・リージョナル・リサーチ・
ラボラトリ−（Ｎ　ＲＲＬ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇ
ｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、Ｐｅｏｒｉａ、　　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓ６１６０４）
から、受託番号Ｎ、ＲＲＬＢ−１５８３０（寄託日＋　
１９８４年８月３日）の下、入手した。この凍結乾燥品
を、ＬＢ培地（１０ａ中にＢａｃｔｏ−トリプトン１０
ｇ、Ｂａｃｔｏ−イースｌ−ｘキス５ｇおよびＮａＣ１
１０ｇを含有、ｐＨ７，５）１０ｄを含有するチューブ
に傾瀉して入れ、３２℃で２時間インキュベートし、ア
ンピシリンを５０μ９７ｍ（ｌとなるように加え、３２
℃で一夜インキユベートした。大腸菌に１２　　ＢＥ１
２０１／ｐＫＣ２８３は、細胞に組み込まれた温度感受
性のｃｌリプレッサー遺伝子を含有しているので、３２
°Ｃでインキュベートした。以後の実施例に示すように
、野生型ラムダｐＬリプレッサー遺伝子を含有するか、
ラムダルｌ−プロモーターを含有していない細胞をこの
ラスミドの単離法に用いる場合には、インキュベーショ
ン温度は３７°Ｃとする。

少ｆｆｉの一夜培養物をアンピシリン５０μ９／献を含
有するＬＢ−寒天プレート（Ｂ　ａｃｔｏ−アガー１５
ｇ／σを含有するＬＢ培地）により、大腸菌に１２　　
ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３の単一コロニー単離体が得
られるような方法で平板培養した。得られた単一コロニ
ーをアンピシリン５０μ９／ｍ１２を含有するＬＢ−培
地１０＋＋＋１２に接種し、激しく撹拌しながら３２°
Ｃで一夜インキュベートシた。−夜培養物１０ｍｇをア
ンピシリン５０μ９７ｍ（ｌを含有するＬＢ−培地５０
０　ｍｆ２に接種し、激しく撹拌しながら培養物が定常
期に達するまでインキュベートシた。　以下の工程には
、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２，Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎｇ、　　ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の
方法を適用した。

細胞を遠心して収穫しく４０００ｇ、１０分間、４°Ｃ
）、上清を捨てた。細胞ペレットを水冷したＳＴＥバッ
フｙ−（０，ＩＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ、　ｐ［（７，８および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）１００
ｄで洗浄した。洗浄後、細胞ペレットをリゾチーム５　
ｎ＋ｇ／　ｍｌｌを含有する溶液１（５０ｍＭグルコー
ス、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，Ｑおよび１
０ｍＭ　ＥＤＴＡ）１０ｍｆｆ中に再懸濁し、室温で１
０分間放置した。溶液２（０，２Ｎ　ＮａＯＨおよび１
％ＳＤＳ）２０ｍｇをリゾチーム処理細胞に加え、倒置
して溶液を静かに混合した。水上で混合物を１０分間イ
ンキュベートした。

水冷した５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４，８（１５ｍｇ）を
溶解した細胞混合物に加え、溶液を倒置して混合した。

溶液を水上で１０分間インキュベートした。５Ｍ酢酸カ
リウム溶液は氷酢酸１１．５ｍ＆を水２８．５ｄと５Ｍ
酢酸カリウム６０ｍ＆に加えて調製した。得られたｍ１
ｌＪｔは、カリウムに関して３Ｍであり、酢酸に関して
５Ｍである。

溶解した細胞混合物をＢ　ｅｃｋｍａｎ　Ｓ　Ｗ　２７
　（またはその同等装置）を用いて遠心した（２０．Ｏ
ＯＯｒｐｍ、２０分間、４°Ｃ）。細胞ＤＮＡおよび破
片はチューブの底にペレットを形成した。上浦約３６ｄ
を回収し、０．６容量のインプロパツールを加え、混合
し、得られた溶液を室温で１５分間放置した。室温で１
５分間、１２，０Ｏ０９で遠心することにより、プラス
ミドＤＮＡを収穫した。上清を捨て、ＤＮＡペレットを
室温で、７０％エタノールによって洗浄した。エタノー
ル洗浄液をデカント（傾瀉）シ、ペレットを真空デシケ
ータ−内で乾燥した。次いで、ペレットをＴＥバッファ
ー（ＩＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−トＩｃＩ、ｐＨ８，０、およ
び１ｍＭＥＤＴＡ）８ｍ１２に再懸濁した。

ＤＮＡ溶液にＣｓＣ１（８９）を加えた。臭化エチジウ
ムのｌ　Ｏｍｇ／　ｍ１水溶液約０．８ｍ＆をＣｓＣ１
−ＤＮＡ／８液各１０ｍ１２に加えた。溶液の最終密度
は約１．５５９／ｍＩｌであり、臭化エチジウム濃度は
約６００μｇ／ｒｎ１であった。溶液をＢ　ｅｃｋｍａ
ｎ５０型遠心管に移し、パラフィン油を口部まで満たし
てシールし、遠心した（４５．００　Ｏｒｐｍ、　２４
時間、２０分間）。遠心後、ＤＮＡの２本のバンドを可
視光線の下で観察した。チューブからキャップを除去し
た後、遠心管の側方から＃２１の皮下注射用の針を付け
た注射器を用いて下方のＤＮＡバンドを採取した。

水を飽和した１−ブタノールを用いて数回抽出すること
により、臭化エチジウムを除去した。ＴＥバッファーに
対して透析することにより、ＣｓＣ１を除去した。緩衝
化ファノール、次いでクロロホルムで抽出した後、ＤＮ
Ａを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。

プラスミドｐＫＣ２８３約１ｍ′９を得、ＴＥバッファ
ー中、４°Ｃにおいて濃度約１μ９／μσで保存した。

プラスミドｐＫＣ２８３の制限部位および機能地図を第
１図に示す。

実施例２　プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの構築実施例１
で調製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ約１０μＱを
ＩＯＸ中塩中限制限バッファー００ｍＭ　ＮａＣＬ　　
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７゜５、ｌ　ＯＯ
ｍＭ　ＭｇＣｌｚ、およびｌｏｍＭＤＴＴ）２０ｕＱ、
Ｉｍｇ／ｍＮＢｓＡ２０μ１２．制限酵素Ｐｖｕ■　５
μＱ（〜５０単位、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、ＢＲＬ）の定義に従う、本明細書記載の
全制限酵素はＢＲＬから入手した）および水１４５μＱ
と混合し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。本明細書記載の制限酵素反応は、フェノ
ール、次いでクロロホルム抽出の常套手段によって終了
した後、ＤＮＡを析出させ、エタノールで洗浄し、さら
にＤＮＡをＴＥバッファーに再懸濁した。上記のごとく
にしてＰｖｕＩ［消化を終了させた後、Ｐ　ｖｕ　ＩＩ
消化プラスミドｐＫｃ２８３ＤＮＡを沈澱させ、ＴＥバ
ッファー５μジに再懸濁した。

Ｘｈｏｌリンカ−（５°−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３′）約
６００ピコモル（ｐＭ）を、５Ｘキナーゼバツフアー（
３００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，８，５０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣ１ｔ、および２５ｍＭ　　ＤＴＴ）　１０
１ｔ（１゜５ｍＭ　　ＡＴ　Ｐ　５１１Ｑ、　ＨｔＯ２
４１ｔＱ−Ｔ　４ポリヌクレオチドキナーゼＱ　、　５
　μ（（Ｐ　Ｌ　−Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓの定義
によると約２．５単位）、１１１９／次ＱＢ　Ｓ　Ａ５
μＱおよび１０ｍＭスペルミジン５μｇを含有する混合
物中、３７℃で３０分間インキュベートすることにより
キナーゼ処理した。

キナーゼ処理したＸｈｏＩリンカ−約１２．５μＱをＰ
ｖｕｌＩ消化プラスミドｐＫＣ２８３５μｇに加え、次
いで、ｌＯＸリガーゼバッファー（３００ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，６，１００ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　
ｔ、および５０ｍＭ　ＤＴＴ）２．５μＮ、　１ｍ９／
１ｘＱＢｓＡ２．５μ（２，５ｍＭ　ＡＴＰ７μｍ２．
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２．５　ｕＱ（Ｐ　−Ｌ　　Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓの定義によす約２．５単位）、ス
ペルミジン２．５μｅおよび水３μａをＤＮＡに加えた
。得られたライゲーション混合物を４°Ｃで一夜インキ
ユベートした。ライゲーション反応の後、反応混合物を
高塩バッファー組成に調整した（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、
０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１０、０ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ　ｔおよび１ｍＭ　ＤＴＴ）。制限酵素Ｘ
ｈｏｌ約１０μ＋２（１００単位）を反応混合物に加え
、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベー
トした。

反応を終了させ、Ｘｈｏｌ−消化ＤＮＡを沈澱させ、再
懸濁し、Ｘｈｏｆリンカ−をライゲーション反応混合物
に加えないことを除き、上記方法と同様にしてライゲー
トさせた。ライゲートしたＤＮＡは、所望のプラスミド
Ｉ）ＫＣ２８３ＰＸを構成していた。プラスミドｐＫＣ
２８３ＰＸの制限部位および機能地図を第２図に示す。

実施例３　大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ＋）／ｐＫＣ２３３Ｐ
Ｘの構築 大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ＋）は、受託番号ＮＲＲＬＢ−１
５９９３（寄託日、１９８５年８月１４日）の下、Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉＢＢから凍結乾燥品として得ることができ
る。

大腸菌Ｋ　１２　ＭＯ（λ”　）ｌ；！野性型−Ｆ、Ｉ
ＡダｐＬｃＩブレッサー遺伝子を含有しているので、本
発明のハイブリッドｐＬ−１ｐｐプロモーターからの転
写は、大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ＋）細胞内では起こらない
。凍結乾燥品を解凍し、ＭＯ（λ″）の単一コロニーを
単離し、インキュベーション温度が３７℃であって、増
殖培地にアンピシリンを加えないことを除き、実質上、
実施例１の方法に従ってＭＯ（λ′″）細胞の一夜培養
物１０酎を調製した。

この−夜培養物５０μＱを、１０　ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ４
および１０ｍＭ　ＭｇＣＩｔを含有するＬＢ培地５１１
Ｑ。

に接種した。この培養物を激しく撹拌しながら３７℃チ
ー夜インキュベートした。翌朝、１０ｍＭＭｇ５Ｏ，お
よびｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＬを含有するＬＢ培養２０Ｍで
希釈した。希釈した培養物を細胞密度約ｌＸｌ０”細胞
／酎を示す、５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ、ｓｏ）が
約０．５に達するまで激しく撹拌しながら３７℃でイン
キスペードした。培養物を水浴中で１０分間冷却した後
、遠心（４０００ｇ、１０分間、４℃）して細胞を収穫
した。細胞ベレットを冷１０　ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ４１０
０屑σに再懸濁した後、即座に遠心してペレット化した
。この細胞ベレットを３０ｍＭ　ＣａＣＩｔ　１００ｊ
！１２に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした
。

遠心して細胞を再度、採取し、３０　ｍＭ　ＣａＣ（ｂ
再懸濁した。この細胞０．５村を実施例２で調製した、
ライゲートしたＤＮＡ製品に加えた（このＤＮＡは３０
　ｍＭ　ＣａＣ１＊中に調製されている）。

この細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベート
し、４２℃で９０秒間熱シヨツクかけた後、氷上で約２
分間冷却した。この細胞−ＤＮＡ混合物を１２５ｍｆｆ
のフラスコ中でＬＢ培地１０Ｊ１１２中に希釈シ、３７
℃で１時間インキュベートした。アンピシリン含有ＬＢ
−寒天プレート上にｌＯＯμＱづつ接種し、３７℃でコ
ロニーが発現するまでインキュベートした。

コロ＝−をａ別にインキュベートシ、各コロニーのプラ
スミドＤＮＡを制限酵素分析およびゲル電気泳動によっ
て検査した。プラスミドＤＮＡを単離し、所望の大腸菌
Ｋ１２Ｍ０（λ＋）／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転換体が同
定されるまでＣｓＣｌグラディエント工程を行わないこ
とを除き、実施例１記戦の方法に従って小規模で処理し
た。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能
地図を第２図に示す。

実施例４　大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３−
Ｌの構築 プ５スミＦｐＫＣ２８３ＰＸＩＯμ９を実質上、実施例
１記載の方法で調製し、ＩＯＸ高塩バッファアー２０μ
（１、Ｌｍ９／ｍ１Ｂ　Ｓ　Ａ　２０　μＱ、制限酵素
Ｂｇｌｌ１５μＱ（〜５０単位）、制限酵素Ｘｈｏ１５
μＱ（５０単位）および水１５０μＱに溶解し、得られ
た反応混合物を３７°Ｃて２時間インキュベートした。

反応を止め、Ｂｇｌｌｌ−Ｘｈｏｌ消化ＤＮＡを沈澱さ
せた後、ＤＮＡをＴＥバ、ファー５μＱに再懸濁した。

ＢｇｌＩ［およびＸｈｏ［制限酵素開裂末端を有するこ
とを特徴とする一本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡリンカ
−を合成し、キナーゼ処理した。実質上、実施例２の方
法に従って、キナーゼ処理した。このＤＮＡリンカ−は
、式 で示される配列を有する。上記のリンカ−は、本積デオ
キンオリコヌクレオチドから、当業者既知の方法で合成
された。−本漬デオキシオリゴヌクレオチドは、ホスホ
ラミダイトの化学を利用した、アプライド・バイオシス
テム社（８５０Ｌ　ｉｎｃ。

Ｉｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、　　Ｆｏｓｔｅｒ　
ｃｌｔｙ、　ＣＡ、　　９４４０４）供給の３８０Ａ　
ＤＮＡ合成装置等の市販の装置を用いて合成される。そ
の他のＤＮＡ合成法も当業者に既知である。−本漬ＤＮ
Ａの便利な合成法である改良ホスホトリエステル法が、
イタクラら（前掲）およびフレアら（前掲）によって示
された。その他、特に好ましいＤＮＡ合成法は、シンク
ら（Ｈｓｉｕｎｇ、　　１９８３　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１１　：　３２２７）、
およびナラング（Ｎ　ａｒａｎｇ１９８０、　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＩｏｇｙ　６８　：　９０
）によって開示された。

リンカ−とＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌ消化プラスミドｐＫＣ
２８３ＰＸを実質上、実施例２記載の方法に従ってライ
ゲートした。ライゲートしたＤＮＡはプラスミドｐＫＣ
２８３−Ｌを構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３−
Ｌを用いて大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）を形質転換し、得
られた大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３−Ｌを
、実質上、実施例３の方法に従って同定した。

実施例５　大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫ　Ｃ２８３
−ＬＢの構築 プラスミドＩ）ＫＣ２８３−ＬＤＮＡ約１０μ９を実質
上、実施例１記載の方法で調製し、ＩＯＸ高塩バッファ
アー２０μＱ、　　ｌ　ｍ９／ｍｌＢ　Ｓ　Ａ　２０μ
ｇ、制限酵素Ｘｈｏ１５μｅ（５０単位）および水１５
５μｇに溶解し、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時
間インキュベートした。３容量の９５％エタノールとＯ
Ｎ容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、ドライアイス−エ
タノール浴中で５分間インキュベートし、遠心すること
により、反応混合物からＸ　ｈｏ　Ｉ　ｌ白化プラスミ
ドｐＫＣ２８３−ＬのＤＮＡを沈澱させた。得られたＤ
ＮＡペレｙトを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１
０Ｘニツクトランスレーシヨンバツフｙ−（０，５Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７，２、Ｏ，ｌ　Ｍ　ＭｇＳ　Ｏ
４、および１ｍＭＤＴＴ）２μＱ１各２ｍＭのデオキシ
ヌクレオチド・トリホスフェート溶液１μａ、水１５μ
Ｑ、フレノウ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断
片）ｌμＱ（Ｐ　−Ｌ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
の規定による〜６単位）および１ｍｇ／ｍ（２ＢＳＡ　
　１μＱに再懸濁した。得られた反応混合物を２５℃で
３００分間インキュベートた。溶液を７０℃で５分間イ
ンキュベートして反応を止めた。

ＢａｍＨＩリンカ−（５°−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−３
゛）をキナーゼ処理し、ｘｈｏＩ消化し、フレノウ処理
したプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ　　ＤＮＡと、実質上
、実施例２記載の方法に従ってライゲートした。ライゲ
ーションの後、ＤＮＡを、高塩バッファー中、ＢａｍＨ
Ｉ約１００単位で３７°Ｃにおいておよそ２時間、消化
した。ＢａｍＨＩ消化の後、実質上、実施例２記載の方
法に従って、ライゲーション用のＤＮＡを調製した。

実質上、実施例２および３記載の方法に従って、〜５．
９ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片をライゲーションして再環
化し、大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）に導入した。大腸菌に
１２Ｍ０（λａ／ｐＫＣ２８３−ＬＢ形質転換体を、実
質上、実施例３の方法に従って同定した後、プラスミド
ｐＫＣ２８３−ＬＢ　　ＤＮＡを調製した。プラスミド
ｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図を第４図
に示す。

実施例６　大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ３２の構築 出発プラスミド、制限酵素およびリンカ−が異なる外は
、実質上、実施例５記載の方法に従い、プラスミドｐＫ
Ｃ２８３ＰＸ約１０μ９を高塩バッファアー中で制限酵
素５ａｌｌで消化し、フレノウ処理し、ＥｃｏＲＩリン
カ−（５°−ＧＡＧＧΔＡＴＴＣＣＴＣ−３’）とライ
ゲートした。制限酵素ＥｃｏＲＩ消化により〜２．ｌｋ
ｂ　ＤＮＡを切除した後、〜４．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲｌ制
限断片をライゲーションによって環化し、プラスミドｐ
ＫＣ２８３ＰＲ３を得た。実質上、実施例３の方法に従
い、ライゲートしたＤＮＡを用いて大腸菌Ｋ１２Ｍ０（
λ゛）を形質転換シタ。大腸菌Ｋ　１２　ＭＯ（λ’）
／ｐＫ　Ｃ２８３ＰＲ３形質転換体を同定した後、実質
上、実施例１記載の方法に従い、プラスミドｐＫＣ２８
３ＰＲ３ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＫＣ２８３Ｐ
Ｒ３の制限部位および機能地図を第５図に示す。

プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３ｔ／ＩＪＩＯμ９を高塩
バッファアー２００μｇ中で制限酵素ＰｓｔｌおよびＳ
　ｐｈ　ｌで消化した。反応混合物を３７°Ｃで約２時
間インキュベートした後、０．６％低ゲル化温度のアガ
ロース（ＦＭＣコーポレーション、Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ
１１ｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　　Ｒｏｃｋｌａｎ
ｄ、　Ｍａｉｎｅ０４８４１）のゲルに適用し、〜１３
０Ｖ、〜７５ｍＡにおいて、Ｔｒｉｓ−酢酸バッファー
中で電気泳動を行った。

ゲルを臭化エチジウムの希薄溶液で染色し、長波長のＵ
Ｖ光照射下に観察して〜０．８５ｋｂのＰｓｔｌ−３ｐ
ｈ［制限断片を構成するＤＮＡバンドを小さいセグメン
トとしてゲルから切除した。このセグメントの容量を該
セグメントのｆｆ１ｆｆｔと密度から求め、等容量のＴ
ｒｉｓ−［ＩＣ１，ｐＨ７，６をセグメントの入った試
験管に加えた。次いで、７２°Ｃでインキュベートして
セグメントを融解させた。

プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂのＰＳ
ローＳ　ｐｈ　Ｉ制限断片約ｌｕｙを容量約１００μρ
中に得た。同様の方法でプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ
を制限酵素ＰｓｔｌおよびＳ　ｐｈ　Ｉで消化し、生成
した〜３．Ｏｋｂ制限断片をアガロースゲル電気泳動に
よって単離し、ライゲーションに備えた。

実質上、実施例２の方法に従って、プラスミドｐＫＣ２
８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂ　Ｐｓｔｌ　−３ｐｈ（制
限断片とプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの〜３゜Ｏｋｂ
　Ｐｓｔｌ−３ｐｈｌ制限断片とをライゲートした。ラ
イゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ３２を構成
していた。プラスミドｐＬ３２の制限部位および機能地
図を第６図に示す。実質上、実施例３の方法に従い、プ
ラスミドｐＬ３２を用いて大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ°）を
形質転換した。実質上、実施例１の方法に従い、大腸菌
に１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ３２形質転換体からプラスミ
ドｐＬ３２ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＬ３２ＤＮ
Ａの分析の結果、１以上のＥｃｏＲＩ’Ｊンカーが、プ
ラスミドｐＫＣ２８３ＰＸのフレノウ処理した５ａｌｌ
末端に付加されていることが分かった。１以上のＥｃｏ
ＲＩリンカ−が存在することは、プラスミドｐＬ３２ま
たはその誘導体の利用可能性に影響を及ぼさずものでは
な（、そのことは、２個のＥｃｏＲＩリンカ−が−緒に
ライゲートした時には常に生成されるＸｈｏｌ制限部位
の存在によって検出することができる。別法として、プ
ラスミドｐＬ　３２は、プラスミドｐＫＣ２８３−ｔ、
Ｂに対して、この実施例の第１節で述べた５ａｌｌ　−
ＥｃｏＲ■切除およびライゲーションを行うことによっ
て構築することもできる。

実施例７　大腸菌に１２Ｍ０（λ＋）ｐＬ４７の構築 大腸菌に１２ＲＶ３０８／ｐＮＭ７８９．（１９８７年
５月４日寄託）は、／−ザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリ−から、受託番号ＮＲＲＬＢ−１８２１６
の下、凍結乾燥品として入手し得る。ｐＮＭ７８９の制
限部位および機能地図を第７図に示す。インキュベーシ
ョン温度が３７℃であることを除き、実質上、実施例１
の方法に従って培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する
。ｐＮＭ７８９　１０μｙをＰｖｕＩＩバッフｙ−（５
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６０ｍＭＮａＣ
１および５ｍＭ　ＭｇＣ１＊）２００μ１２に懸濁する
。Ｐｖｕｌｌｌ単位を加え、反応混合物を３７℃で５分
間インキュベートする。６５°Ｃで１０分間、加熱して
酵素を不活化する。ｌＯＸ１０ＸＢａバッフｙ−（２０
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０，１ＭＮａｃｌ
および７０ｍＭ　ＭｇＣｌ２＋）３０　ｔｔＱ、水７（
ｂｚ＋２およびＢａｍＨＩ　ｌ　Ｏ単位を加え、反応混
合物を３７°Ｃで１時間インキュベートする。アルカリ
ホスファクラーゼ５単位を加え、６５°Ｃで１時間イン
キユベートスる。１％アガロースゲル上でＤＮＡ断片を
分離し、１箇所切断に相当する断片を精製する（第８図
）。

実質上、実施例４の教示に従い、平滑末端とＢａｍ１（
［末端を有するＤＮＡリンカ−を合成する。

このリンカ−は、式： で示される構造を有する（第８図、１１８を参照）。

このリンカ−をキナーゼ処理し、実質上、実施例２の教
示に従い、ＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩ消化プラスミドｐ
ＮＭ７８９にライゲートする。このライゲーション混合
物で大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１
５６２４、寄託日、１９８３年９月２８日）を形質転換
し、実質上、実施例３の方法に従い、これら形質転換体
からプラスミドを単離する。適当なサイズのＰｖｕｌＩ
断片（４９４ｂ［））およびＸｂａｌ　−Ｂａｍ１−１
１断片（６２８ｂｐ）を含有する数個のプラスミドを選
択する。少なくとも２個のプラスミドについて、Ｂａｍ
８１部位から単一のＳ　ｍａ　１部位に向けての配列決
定を行い、所望の配列を有する１つのクローンを選択す
る。この中間体プラスミドを、プラスミド１２０と命名
する。この工程の概略模式図およびプラスミド１２０の
制限部位および機能地図を第８図に示す。

Ｅ　Ｋ　−Ｂ　Ｇ　ＨをコードするＤＮＡを単離するた
めに、プラスミド１２０約１０１１ｇを約５０単位づつ
の制限酵素ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩを含有する高塩バ
ッファー２００μσ中で消化した。消化産物をアガロー
スゲル電気泳動で分離し、ＥＫ−ＢＧＨをコードしてい
る〜０．６ｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ制限断片を単
離し、実質上、実施例６記載の方法に従ってライゲーシ
ョン用に調製した。

プラスミドｐＬ３２をも同様に制限酵素Ｘｂａｌおよび
ＢａｍＨｌで消化し、プラスミドｐＬ３２の〜３．９ｋ
ｂ制限断片を単離し、ライゲーション用に調製した。実
質上、実施例２の方法に従ってプラスミドＰＬ３２の〜
３．９ｋｂ　Ｘｂａｌ　−ＢａｍＨＩ制限断片をプラス
ミド１２０の〜０．６ｋｂ　ＸｂａｌＢａｍＨＩ制限断
片とライゲートし、プラスミドｐＬ４７を得た。プラス
ミドｐＬ４７の制限部位および機能地図を第９図に示す
。

実質上、実施例３記載の方法に従い、プラスミドｐＬ４
７で大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ゛）を形質転換し、大腸菌に
１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ　４７形質転換体を同定した。

実質上、実施例１記載の方法に従い、プラスミドｐＬ４
７ＤＮＡを形質転換体から調製した。

実施例８　大腸菌Ｋ　１２　　ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２
ＡＲｌの構築 プラスミドｐＰＲ１２は温度感受性のｐＬリプレッサー
遺伝子ｃ１８５７とプラスミドｐＢＲ３２２テトラサイ
クリン耐性付与遺伝子とを含有する。プラスミドｐＰＲ
１２は米国特許第４，４３６，８１５号（１９８４年３
月１３日出願）に開示され、特許請求されている。プラ
スミドｐＰＲ１２の制限部位および機能地図を第１０図
に示す。

プラスミドｐＰＲ１２約ｌＯμ９を高塩バッファアー２
００μσ中で制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単位により、３
７°Ｃで２時間消化した。実質上、実施例５記載の方法
に従ってＥｃｏＲ［消化プラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを
沈澱させ、フレノウ処理した。

フレノウ反応の後、ＥｃｏＲＩ消化し、フレノウ処理し
たプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを実質上、実施例２記載
の方法に従ってライゲーションによって再環化した。所
望のプラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１を構成するライゲート
したＤＮＡを用い、アンピシリン耐性ではな（テトラサ
イタリン（５μ９７ｍ１）耐性に基づいて選択する以外
は実質上、実施例３記載の方法に従って大腸菌に１２　
　ＲＶ３０８を形質転換した。大腸ｆ’ｉ！Ｋ１２ＲＶ
３０８は、ＮＲＲＬから、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１
５６２４の下、入手可能である。大腸菌に１２　　ＲＶ
３０８／ｐＰＲ１２△Ｒ１形質転換体を同定した後、実
質上、実施例１記載の方法に従ってプラスミドｐＰＲ１
２△Ｒ１を形質転換体から調製した。

プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１約ｌＯμ９を生塩バッファ
アー２００μａ中で制限酵素Ａｖａｌ約５０単位により
、３７℃で２時間消化した。実質上、実施例５記載の方
法に従ってＡｖａｌ消化プラスミドｐＰＲ１２ΔＲＩ　
ＤＮＡを沈澱させ、フレノウ処理した。フレノウ反応の
後、Ａｖａｌ消化し、フレノウ処理したプラスミドｐＰ
Ｒ１２△ＲＩＤＮＡを実質上、実施例２記載の方法に従
ってＥｃｏＲＩリンカ−（５′−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣ
ＴＣ−３°）とライゲートした。リンカ−ライゲーショ
ンの後、ＤＮＡを沈澱させ、制限酵素ＥｃｏＲＴ約５０
単位を含有する高塩バッファー約２００μｅに再懸濁し
た。得られた反応混合物を３７℃で約２時間インキュベ
ートした。得られた反応混合物を３７℃で約２時間イン
キュベートした。ＥｃｏＲＩ消化の後、反応混合物をア
ガロースゲルに適用し、実質上、実施例６記載の方法に
従い、〜５．　ｌ　ｋｂ　ＥｃｏＲ１制限部片を精製し
た。実質上、実施例２の方法に従い、〜５．　Ｌ　ｋｂ
　ＥｃｏＲＩ制限部片をライゲーションによって再環化
した。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＰＲ
１２人Ｒ１を構成していた。アンピシリン耐性ではなく
テトラサイクリン耐性に基づいて選択する以外は実質上
、実施例３記載の方法に従い、プラスミドｐＰＲ１２Ａ
Ｒ１を用いて大腸菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８を形質転換し
た。大腸菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２ＡＲ１形
質転換体を同定した後、実質上、実施例１記戦の方法に
従ってプラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１を調製した。プラス
ミドｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能地図を第１
１図に示す。

実施例９　大腸菌Ｋ　ｌ　２　　ＲＶ３０８／ＰＬ　ｌ
　ｌＯの構築 プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩ　　ＤＮＡ約ｌＯμ２を制
限酵素ＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩ各５０単位を含有する
高塩バッファアー約２００μｑに懸濁し、得られた消化
反応混合物を３７°Ｃで約２時間インキュベートした。

次いで、実質上、実施例６記載の方法に従って反応混合
物をアガロースゲルに適用し、〜２．９　ｋｂ　Ｐｓｔ
ｌ　−ＥｃｏＲＩ制限部片を単離してライゲーション用
に調製した。

プラスミドｐＬ４７　約ｌＯμ９を高塩バッファー２０
０μ１２中で制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによ
り、３７℃において２時間消化した。ＰｓｔＩ　　Ｅｃ
ｏＲＩ消化ＤＮＡをアガロースゲルに適用し、実質上、
実施例６記載の方法に従い、複製起源とアンピシリン耐
性付与遺伝子の一部とを含有する〜２．７　ｋｂ　ｒ’
ｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ制限部片を単離し、ライゲーシ
ョン用に調製した。別の反応混合物中で、プラスミドＰ
Ｌ４７ＤＮＡ約″ｌＯμ９を、高塩バッファー２００μ
σ中、制限酵素ＥｃｏＲ（ｔ６よびＢａｍＨＩにより、
３７℃で２時間消化し、新規な転写活性化および翻訳活
性化配列、並びにＥＫ−ＢＧＭをコードするＤＮＡを含
有する〜ｌ。

０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を単離し、
実質上、実施例６記載の方法に従い、ライゲーション用
に調製した。得られた〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩＢａ
ｍＨ１制限断片〜制限断片用２μ９ラスミドｐＬ１１Ｏ
を構築した。

プラスミドｐＬ４７の〜２．７　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　−
ＢａｍＨｌ制限断片と〜１．０３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−
ＢａｍＨＩ制限部片とをプラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の
〜２゜９　ｋｂ　Ｐｓｔ　ｒ　−ＥｃｏＲＩ制限部片に
ライゲートしてプラスミドｐＬ　１１０を構築し、ライ
ゲートしたＤＮＡを用い、アンピシリン耐性ではなくテ
トラサイクリン耐性に基づいて形質転換体を選択する以
外は実質上、実施例２および３記載の方法に従って大腸
菌Ｋ１２　　ＲＶ３０８を形質転換した。

２つのＰｓｔｌ制限酵素認識部位がＥＫ−ＢＧＭ暗号化
領域中に存在しているが、それらは添付図面には記載さ
れていない。プラスミドｐＬ１１０の制限部位および機
能地図を添付の第１２図に示す。

実施例ＩＯ大腸菌Ｋ　１２　　ＲＶ３０８／ｐＬ　１１
０Ｃの構築 Ａ、大腸菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐＬＩ　ｌ０Ａ（７
）構築 プラスミドｐＬ１１０ＤＮＡ約１μ９を、１０Ｘ高塩バ
ッファー（１，０Ｍ　ＮａＣ１，０，５０ＭＴｒｉｓ−
ＨＣＬ　ｐＨ７，５，０、１０Ｍ　ＭｇＣｌ　２および
１０ｍＭジチオスレイトール）２μＱとＮｄｅｌ酵素３
単位とを含有する全ｆｆ１２０μａ中で制限酵素Ｎｄｅ
Ｉにより、３７°Ｃで１時間消化した。反応混合物をフ
ェノール／クロロホルム抽出に付し、ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させた。Ｎｄｅ［消化プラスミドｐＬ１１０Ｄ
ＮＡをＩＸＸフレノウバッファ４０ｍＭ　ＫＰＯ，、ｐ
！（７，５，６、６ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、１．０ｍＭ　２
−メルカプトエタノール、３３ｔｔＶＩ　ｄＡ′ＦＰ、
３３μＭ　ｄＣＴＰ、３３μＭｄＧＴＰおよび３３μＭ
ＴＴＰ）５０μＱに溶かした。このＤＮＡに、大腸［４
ＤＮＡポリメラーゼＩの大きいフラグメント（フレ／つ
）２μρ（〜１０ＬＩ；泣、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）を加えて混合し、得られた反応混合物を
１６°Ｃで１時間インキュベートした。フェノール抽出
によって反応を止め、常法通り、Ｄ　Ｎ、　Ａを精製し
た。Ｎｄｅｌ消化し、フレノウ処理したＤＮＡを、次に
、Ｔ’４．、ＤＮＡリガーゼと、４°Ｃにおいて１６時
間ライゲートさせた。

得られたＤＮＡで大腸菌に１２株ＲＶ３０８（ＮＲＲＬ
　　Ｂ−１５６２４）を常法通り形質転換した。

アンピシリン１００μ９／順を含んだし一寒天培地上で
形質転換体を選択し、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
）をドーリ−（Ｄｏｌｙ）の示した方法に従い、高速ア
ルカリ抽出法で耐性コロニーからプラスミドを単離した
。Ｎｄｅ１部位を欠（プラスミド（ｐＬ　１１０Ａ、第
３図）を選択した。

Ｂ１部位特異的突然変異誘発によるファージｐＬ１１０
Ｂの構築 部位特異的突然変異誘発による、テトラサイタリフ耐性
付与遺伝子中のＢａｍＨ１部位の除去は第１３図の右側
に図示されている。

Ｂ（１）　ファージＭ１３Ｔｃ３の構築テトラサイクリ
ン耐性付与遺伝子供給源としてプラスミドｐＬ１１０を
用いた。ＴＥバッファー５０μρ中、プラスミドｐＬ１
１０約５０μｇを１ＱｘＨｉｎｄＩＩ［バッフｙ−２５
，ｃｌおよび水１７０μＣに加えた。制限酵素Ｈｉｎｄ
Ｉ［Ｉ約５μρ（〜５０単位）をプラスミドｐＬ１１０
ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ
）１７．４　約１３μＱと制限酵素ＥｃｏＲｌ　５　μ
（２（〜５０単位）をＨｉｎｄ■消化プラスミドｐＬ１
１０に加え、反応混合物を３７°Ｃでさらに２時間イン
キュベートした。反応混合物をＴＥ飽相フェノールで抽
出して反応を止め、クロロホルム抽出してフェノールを
除去した。次いで、Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ消
化プラスミドルＬ　Ｉ　１０を沈澱させ、遠心して収集
し、１％アガロースゲルに適用して大きい〜４．３ｋｂ
　ＥｃｏＲＩＨｉｎｄＩＩｒ制限断片を単離、精製した
。

ファージｍ　ｌ　３　ｍｐ　ｌ　８　（Ｎｅｗ　Ｅ　ｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂ　１ｏｌａｂｓ）をＴＥバッファー５０
μσに溶解し、次いで、上記のごとく、ＥｃｏＲｒおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。

Ｅ　ｃｏＲＩ　　Ｈ１ｎｄＩ［［切断ファージｍ１３ｍ
ｐ１８ＤＮＡを、〜７．２５ｋｂ制限断片を単制限部製
することを除いて、ｐＬｌｌｏについて記載したと同様
にして精製した。

プラスミドｐＬ１１０の〜４．３ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ
−ＥｃｏＲｒ断片約１１００ｎを、ファージｍｌ　３ｍ
ｐｌ　８の〜７．２５　ｋｂ　Ｈｉｎｄ［−ＥｃｏＲ［
断片約１１００ｎ、１０ｘリガーゼバッフｙ−２１１（
１，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（〜１００単位）および
水１４μＱと混合した。このライゲーション反応混合物
を１５°Ｃで１．５時間インキュベートした。ライゲー
トしたＤＮＡは所望のファージｍ１３Ｔｃ３ＤＮＡを構
成していた。ファージｍ１３Ｔｃ３の制限部位および機
能地図を第１３図に示す。

大腸菌Ｋ　１２　　ＪＭ１０９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂｉ。

１ａｂｓから入手可能）の代わりに大腸菌に１２　　Ｊ
Ｍｌｏｌを用いることができる）の−夜培養物１ｍｆ２
をＬブロス５Ｑ＋ｍ１２に接種し、得られた培養物を、
通気下、Ｏ９Ｄ、、、、〜０．３〜０．４の値になるま
で３７℃でインキュベートした。細胞を１０ｍＭＮａＣ
１２５ｍ＆に再懸濁し、水上で１０分間インキュベート
したのち、遠心して採集した。細胞を７５ｍＭ　ＭｇＣ
ｌｚ　１　、２５　ｍ（ｌに再懸濁し、細胞各２００μ
Ｑをとり、上で調製した。ライゲートしたＤＮＡｌ０μ
Ｑに加え、水上で約４０分間インキュベートシた。次い
で、細胞−ＤＮＡ混合物を４２°Ｃで２分間インキュベ
ートし、種々の量（１，１０およびｌ　００　ｐＱ＞を
とり、２％Ｘ−Ｇａ１５０ｕ＆。

１００ｍＭ　　Ｉ　ＰＴＧ５０μρ、および対数増殖期
の大腸菌に１２　　ＪＭ１０９（２００μ１２）を含有
するｔｏｐ　ａｇａｒ（４５℃で融解状態に維持した０
、５％ａｇａｒを含有するＬブロス）３ｍｌに加えた。

細胞−ｔｏｐａｇａｒ混合物を４０μ９／ｍ１のＸ　−
Ｇ　ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−チオガラクトジッド）および０８１ｍＭのｒ　
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトジッド）
を含有するＬ−ａｇａ？プレートに接種し、３７°Ｃで
一夜インキユベートした。

翌朝、青色に対して、幾つかの透明なプラークの各々を
用い、Ｌブロス２−に接種し、得られた培養物を通気下
、３７°Ｃで２時間インキュベートした。青色が消滅し
ていることは、所望の挿入が起こったことを意味する。

次いで、培養物を遠心し、得られた上清２００μｇを、
通気下、３７℃で増殖している大腸菌に１２　　ＪＭ１
０９の培養物（０，Ｄ、５ｓｏ＝０．５）１０ｍｆに加
えた。これらの培養物を３７°Ｃでさらに３０分間イン
キュベートし、次いで、遠心して細胞をペレット化し、
それらが含有する複製型組換えファージを調製するため
に用いた。実施例１記載の方法の規模を縮小し、細胞か
ら二本鎖の複製型ファージＤＮＡを単離した。そのファ
ージＤＮＡの制限酵素分析により、ファージｍ１３Ｔｃ
３ＤＮＡを含有する形質転換体を単離した。

Ｂ　（ｉｉ　）　　−本鎖ファージｍ１３′ｌ”ｃ３Ｄ
ＮＡの調製大腸菌に１２　　ＪＭ１０９／ｍ１３Ｔｃ３
の一夜培養物１．５−を遠心し、ファージｍ１３Ｔｃ３
含有上清１００ｕσをＯ，Ｄ、、、ｏか約０．４〜．０
．５の大腸菌に１２　　ＪＭ１０９の培養物２５−に接
種した。通気下、培養物を３７°Ｃで６時間インキュベ
ートし、培養物を遠心して得られた上清、約２０ｄを新
しいチューブにいれた。２０％ポリエチレンングリコー
ル（ＰＦＧ６０００）２ｍｌと１４゜６％ＮａＣ１を含
有する溶液２ｍｌを上清に加えた後、水上で２０分間イ
ンキュベートした。

上清を７００　Ｏｒｐｍで２５分間遠心し、得られた一
本鎖ｍ１３Ｔｃ３ＤＮＡを含有するペレットをＴＥバッ
ファー５００μｅに再懸濁した。このＤＮＡ溶液をＴＥ
−飽和フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した
。次いで、−本鎖ＤＮＡをＮａ０Ａｃとエタノールで沈
澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した後、水６
０μｅに溶解した。

Ｂ　（ｉｉｉ　）　　突然変異誘発 突然変異誘発に用いる一本鎖ＤＮＡ断片を、自動ＤＮＡ
合成装置により、合成した。該断片は、式： ％式％ で示される配列を有し、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２中の
テトラサイクリン耐性付与遺伝子のＢａｍＨ１部位（５
°−Ｇ　Ｇ　Ａ　′ＦＣＣ−３′）の周辺領域の配列と
ホモローガスである。ただし、５°末端から２番目のＡ
残基（または３°末端から３番目のＡ残基）がプラスミ
ドｐＢ　Ｒ３２２中ではＣである。この変化により、テ
トラサイクリン耐性付与遺伝子タンパク質のアミノ酸成
分が変わることはないが、ＢａｍＨ１部位は消滅する。

突然変異誘発ブライマーおよびＭ１３重層的（ユニバー
サル）プライマー［ベセスダリサーチラボラトリー（Ｂ
　ＲＬ）Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ　６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ、　ＭＤ　２０７６０］各々約１０ピコモルを
ＩＸ牛ナーゼバッフｙ−（６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ
ｐＨ７，８，１５ｍＭメルカプトエタノール、１０ｍＭ
　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｔおよび０．４１μＭ、ＡＴＰ）２０
μｇ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位（Ｂ　
ＲＬ）ニヨリ、３７°Ｃで３０分間処理した。キナーゼ
処理したＤＮＡを以下の突然変異誘発法に用いた。

アニーリング反応は、−本鎖ファージｍ１３Ｔｃ３の３
００ｎｇ（１，２μの、普遍プライ７−７−１ｐピコモ
ル、２μＱ）、突然変異誘発プライマー１ｐＭ（２μｅ
）、ＩＯＸアニーリングバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡおよび５０
０ｍＭ　ＮａＣり２　ｕＱ、および水１２゜８μＱを混
合することにより行われた。反応混合物を８０°Ｃで２
分間、５０°Ｃで５分間インキュベートし、次いで、室
温まで冷却した。

伸長反応は、ＩＯＸ伸長（ｅｘｔｅｎｓ　１ｏｎ）バッ
ファー（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，１ｍ
ＭＥＤＴ　Ａ、　　ｌ　２０ｍＭ　ＭｇＣ＋ｔ）５　ｕ
Ｑ−２ｍＭ　ｄＡＴ　Ｐ５μｇ、各６ｍＭのｄＧＴＰ、
ＴＴＰおよびｄＣＴＰを含んだ溶１ｆｆｌ　１μＱ、フ
レノウ酵素１μｇ（約２単位、ファルマシアＰ−Ｌバイ
オケミカルス、８０　Ｑ　　ＣｅｎｔｅｎｎｉａｌΔｖ
ｅｎｕｅＳＰ　ｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ　Ｊ０８８５
４）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼｌμｌ！（ｔｏ。

単位）および水１７μＱをアニーリングしたＤＮＡに加
えることにより行われた。伸長反応混合物を室温で１時
間、次いで、３７°Ｃで２５時間、４°Ｃで一夜インキ
ユベートした。

ＴＥ飽和フェノールで２回抽出して反応を止めた後、Ｃ
ＨＣｌ３で２回抽出した。エタノールおよびＮａ０Ａｃ
でＤＮＡを沈澱させた。遠心してＤＮＡを集め、水５０
μσ中に再懸濁し、このＤＮＡ溶液にｌ０ＸＳ　１バツ
フアー６μａを加えた。

ＤＮＡ溶液を等しく３本の管に入れた。２本の管には、
Ｓ１ヌクレアーゼ（マイルスラボラトリーズ）約２００
単位を入れた。一方の８１反応混合物は、室温で５分間
、他は１０分間、インキュベートした。反応混合物をＴ
Ｅ飽和フェノールで抽出（２回）することにより、反応
を止めた。フェノール抽出の後、クロロホルムで２回抽
出し、次いで、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールによって反
応混合物からＤＮＡを析出させた。ＤＮＡの未処理試料
を負対照とした。Ｓ１処理試料は、以後の工程を通して
別々に離しておいたが、同様の結果を得た。

ＤＮＡベレットを水２０μＱに再懸濁し、得られた溶液
１０μＱを用いて大腸菌に１２　　ＪＭＩＯ９（大腸菌
に１２　　ＪＭＩＯＩを用いてもよい）を、Ｉ　ＰＴＧ
またはＸ−Ｇａ１をプレートに加えないことを除き、フ
ァージｍ１３Ｔｃ３の構築工程と同様にして形質転換し
た。

約４８プラークから得た二本鎖複製型ＤＮＡを前記の如
くにして単離し、ＢａｍＨＩ制限部位の存在に関してス
クリーニングした。ＢａｍＨ１部位を含有しない単離体
を、上記のごとく、−本漬ＤＮＡを調製してざらにスク
リーニングした。ジデオキシ配列決定法（Ｊ、Ｈ，Ｓｍ
１ｔｈ、１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｇｍｏｌｏ
ｇｙ　６５　：　５６０　５８０）を用いて一本鎖ＤＮ
Ａの配列を決定した。所望の単離体をｐＬｌｌｏＢと命
名した（第１３図）。

Ｃ，プラスミドｐＬ１１０ｃの構築 ファージｐＬ１１０ＢＤＮＡの複製盟約５０μ９をＮｈ
ｅｌ制限酵素約５０単位を含んだ１ＸＮｈｅＩバツフ　
７−（５０ｍＭ５ＮａＣ１，６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ
Ｌｐ）Ｔ７．５．６　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２および６
ｍＭ　βメルカプトエタノール）２５０μ＆中で、３７
℃において２時間消化した。次いで、Ｎｈｅｌ消化ファ
ージｐＬ１１０Ｂ　　ＤＮＡに５Ｍ　ＮａＣｌ　　５μ
ｆ２゜さらに、Ｓａｌ［制限酵素５μＱ（〜５０５０単
を加えた。３７°Ｃで２時間消化を継続した。テトラサ
イクリン耐性付与遺伝子の突然変異した領域を含んだ所
望の〜４２２ｂｐ　Ｎｈｅｌ　−３ａｌ　Ｉ断片を実施
例１１の方法に従い、アクリルアミドゲルから単離した
。

プラスミドＰＬＩＩＯＡがファージｐＬ１１０Ｂに置き
換えられている外は、同一条件下でプラスミドｐＬ１１
０ＡＤＮＡをＮｈｅｌおよび５ａｌＩで消化した。プラ
スミドｐＬｌｌＯＡの〜５．１ｋｂＮ　ｈｅｌ　−Ｓ　
ａｌ　Ｉ制限断片をアがロースから精製また。

ｐｔ、　１１０Δ（〜６．１ｋｂ）およびｐＬｌｌｏＢ
（〜４２２ｂｐ）各々のＮｈｅｌ−３ａｌＩ断片各１１
００ｎを常法通りライゲートし、所望のプラスミドｐＬ
１１ＯＣを構築した。プラスミドｐＬ１１０ｃの制限部
位および機能地図を第１３図に示す。所望のプラスミド
ｐＬｌｌＯｃは、大腸菌に、ＩＯμｇ／ｍ１のテトラサ
イクリンに対する耐性を付与するが、テトラサイクリン
耐性付与遺伝子内にあるＢａｍＨ１部位を喪失している
。

実施例１１　　大腸菌Ｋ１２　ＲＶ３０８／ｐＧＡＧ１
３１７の構築 Ａ、　プラスミドｐΔＧ９３２の〜２００ｂｐＥｃ。

Ｒ［−３ｓｔｌｌＩ断片の単離 大腸菌に１２　　ＤＨ５／ｐＡＧ９３２は、ＮＲＲＬか
ら、凍結乾燥品として、または受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−
１８２６６（寄託日、１９８７年１１月２０日）の下、
入手することができる。ｐＡＧ９３２の制限部位および
機能地図を第１４図に示す。

インキュベーション温度が３７°Ｃであることを除き、
実質上、実施例１記載の方法に従い、培養物からプラス
ミドＤＮＡを抽出する。

プラスミドｐＡＧ９３２　約１０μ９をＩＱＸｓｓｔ１
１バッファー（５００１＋１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ８゜０、ｌ　ＯＯｍＭ　ＭｇＣｌｙおよび５００ｍＭ
　ＮａＣ１）２０μＱ、　　Ｉ　ｎ＋９／７！Ｂ　Ｓ　
Ａ　２０ｕ（１，制限酵素Ｓｓｔ■　５μＱ（〜５０５
０℃および水１５５μＱに溶かし、得られた反応混合物
を３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、１Ｏ
ＸＥｃｏＲＩバツフアー２０ｐＱと制限酵素ＥｃｏＲ１
５μＱ（〜５０５０℃を加え、反応混合物を３７°Ｃで
２時間放置した。ＤＮＡを沈澱させて再懸濁し、マニア
ティスら（１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉ
ｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ　
ａｂｏｒａｔｏｒｙ））の教示に従って３．５％ポリア
クリルアミドゲルに適用した。臭化エチジウム染色によ
ってＤＮＡを観察し、〜２０５ｂｐ　Ｅｃ。

Ｒ１−ＳｓｔＩＩ断片をゲルから切除し、破砕し、０゜
５Ｍ酢酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０
．１％ＳＤＳ、および１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ＰＨ８，０の
混合物３００μσ中で３７℃において一夜放置した。試
料を１０．　ＯＯＯｖで１０分遠心し、上清を集めてグ
ラスウールのプラグに通した。上清に２容量の１００％
冷エタノールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。まず、ペレ
ットをＴＥ２００μＱと３Ｍ酢酸ナトリウム２５μＱに
溶解し、次いで１００％エタノール６００μＱを加えた
。−７０°Ｃで１０分間放置した後、１５．０００ｙで
１５分間ＤＮＡを遠心分離した。上清を除き、ペレット
を風乾した後、ＴＥＩＯμｅに再懸濁した。

Ｂ、プラスミドｐＡＧ１３３８の〜１１００ｂｐｓｓｔ
■−ＢｇｌＵ断片の単離 大腸菌に１２　　ＤＨ５／ｐＡＧ１３３８は、ＮＲＲＬ
から、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８２６５（寄託臼、
１９８７年１１月２０日）の下、凍結乾燥品として人手
することができる。ｐＡＧ１３３８の制限部位および機
能地図を第１５図に示す。

インキュベーション温度が３７°Ｃであることを除き、
実質上、実施例１記載の方法に従い、培養物からプラス
ミドＤＮＡを抽出する。

プラスミドｐＡＧ１３３８約１０．ｌＺ９をＳｓｔ■バ
ッフｙ−２０μｃ、１ｍ９／ｍ１２ＢｓＡ　　２０１ｔ
（１゜制限酵素５ｓｔｌ［５μｅ（〜５０５０℃、制限
酵素ＢｇＩＩＩ５μ１２（〜５０５０℃および水１５０
μｇに溶かした。得られた反応混合物を３７℃で２時間
インキュベートした後、反応混合物を１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけたく１ＯＯｖで〜２時間）。

ゲルを臭化エチジウムの希薄溶液中で染色し、長波長Ｕ
Ｖ光照射によって観察し、所望の〜１１１１ｂｐ　Ｓｓ
ｔＩＩ−Ｂｇｌ■断片を小さいセグメントとして切り取
り、エッペンドルフチューブに入れ、等容量のバッファ
ー飽和フェノールと混合し、充分にポルテックス処理し
、−７０°Ｃで１０分間放置した。４°Ｃで１０分間遠
心した後、水層をさらに等容量のバッファー飽和フェノ
ールで２回、等容量のクロロホルムで２回抽出した。所
望のＳｓｔＩＩ−Ｂｇｌｌｌ　　ＤＮＡ断片をエタノー
ルで沈澱させ、ＴＥＩＯμｇに再懸濁した。

Ｃ，プラスミドｐＡＧ１３１７の構築 プラスミドｐｃ　Ｅ　Ｍ”−４をプロメガバイオチク（
Ｐ　ｒｏＩＩｌｅｇａ　Ｂ　１ｏｔｅｃ）（２８０ＯＳ
、　Ｆ　ｉｓｈ　Ｈａｔｃｈｅｒｙ　Ｒｏａｄ、　Ｍａ
ｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　５３７１１　）か
ら購入した。プラスミドｐＧＥＭ”−４の制限部位およ
び機能地図を第１６図に示す。約ｌμａのプラスミドｐ
ｃＥＭ”−４を、制限酵素ＥｃｏＲＩ〜５０単位と１Ｏ
ＸＥｃｏＲＩバツフアー（ＩＭ　Ｔｒｉｓ−Ｉｔ　Ｃｌ
、ｐｆ（７，５，１００ｍＭ　ＭｇＣＩｔおよび５００
ｍＭ　ＮａＣＩ）を用いる外は実質上、実施例２記載の
方法に従って消化した。３７℃で２時間経過後、制限酵
素ＢａｍＨＩ３μ＆、　１０　ｘ　ＢａｍＨ［バッフｙ
−（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ％ｐＨ８，０，１０
０ｍＭ　ＭｇＣＩ、およびＩＭＮａＣｌ）を加え、反応
混合物を３７℃でさらに２時間放置した。反応を止め、
実質上、実施例１１Ｂの記載に従い、ゲルから大きいベ
クター断片を単離した。この断片をＴＥ１０μＱに再懸
濁した。

実質上、実施例２記載の方法に従い、ライゲージｆｆ７
反応混合物にｐｃ　Ｅ　ＭＴＭ−４のＥｃｏＲＴ−Ｂａ
ｍＨＩ切断ベクター約２ｔｔ（ｌＳｐＡＧ９３２の〜２
００ｂｐ　ＥｃｏＲｌ−３ｓｔＩＩ断片３μｇ、ｐΔＧ
１３３８の〜１１００ｂｐ　Ｓｓｔ［Ｉ−Ｂｇｌ［Ｉ断
片３ｕＱ、リガーゼバッフｙ−２，５μｇ、１ｍｇ／ａ
ｔ！Ｂ５Ａ２．５μｅ、５ｍＭ　ＡＴＰ７μｃ、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ２．５ｕＱ、　　１０ｍＭスペルミジ７２
．５ｔｔ（ｌおよび水８μｇを混合した。得られたプラ
スミドをプラスミドＰＧＡＧ１３１７と命名した。次い
で、実質上、実施例３記載の方法に従い、このプラスミ
ドを大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８ｉ［１１胞に導入した。

プラスミドｐＧＡＧ１３１７の制限部位および機能地図
を第１７図に示す。

実施例１２　大腸菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐｌ−ＫＳ
Ａの構築 実質上、実施例１の教示に従ってプラスミドｐＧＡＧ１
３１７を単離した。制限酵素Ａｐａｌおよび１ＯＸＡｐ
ａＩバツフｙ　−（６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ
７，４，６０ｍＭＮａＣ１および６０ｍＭＭｇＣ１，）
を用いた外は実質上、実施例２の方法に従い、プラスミ
ドｐＧＡＧ１３１７約１０μｅを消化シタ。３７°Ｃで
２時間インキュベートした後、反応を止め、エタ／−ル
沈澱に付した後、ｌＯＸウシ腸アルカリホスファターゼ
バッファー（Ｃ［ＡＰ）（５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ９，０，１０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭ　Ｚｎ
Ｃｌ２．１００ｍＭスペルミジン）５μｆ２．水４４　
ｔｔ（ｌ、　ＣＥ　ＡＰ　ｌ　μ＆（〜７７単）に再懸
濁した。この反応混合物を３７°Ｃで１５分間、次いで
５６°Ｃで１５分間インキュベートした。ＣＩＡＰをさ
らに１μＱ加え、反応ａ合物を３７°Ｃで１５分間、次
いで、５６°Ｃで１５分間インキュベートした。反応を
止め、実質上、実施例２の方法に従い、ＤＮＡベクター
を調製した。

実質上、実施例４の教示に従い、ＡｐａＩ末端とＸｂａ
［末端とを有するＤＮＡリンカ−を合成した。

このリンカ−は、式。

で示される配列を有する。このリンカ−を実質上、実施
例２の方法に従い、Ａｐａｌ消化プラスミドｐＧΔＧ１
３１７にライゲートした。得られたライゲーション反応
混合物を４°Ｃで一夜インキコベートした。ライゲージ
コン反応の後、反応混合物をＸｂａｌバッファー組成を
有するよう、調整した（６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１％　
ｐＨ７，４，１００ｍＭ　ＮａＣ１゜および６　ｍＭ　
ＭｇＣｌｙ）。制限酵素Ｘｂａｌ　約１０μｍ２（１０
０単位）を反応混合物に加え、３７°Ｃで２時間インキ
ュベートした。

実質上、実施例１１Ｃの教示に従い、反応を終了させ、
Ｘｂａｌ消化ＤＮＡを沈澱させ、再懸濁した後、制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化した。３７°Ｃで２時間経過後、反
応混合物を沈澱させ、実質上、実施例１１Ａの方法に従
い、ポリアクリルアミドゲルに適用し、〜５００ｂｐ　
Ｘｂａｌ　−ＥｃｏＲＩ断片を単離し、溶離して精製し
た。

プラスミドｐＬ１１０ｃ（実施例ＩＯ記載）約１μ９を
、実質上、実施例１１Ｃ記載の方法に従って制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化した。３７°Ｃで１時間経過後、１ＯＸ
Ｘｂａｒバツフアー２０μｅと制限酵素Ｘｂａｌ　５μ
ｅとを反応混合物に加え、３７°Ｃでさらに１時間イン
キュベートした。反応を止め、実質上、実施例１１Ｂ記
載の方法に従ってＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にか
け、大きいベクターバンドを単離した。上記のごとくに
して単離したＥｃｏＲＩ−Ａｐａｌ／Ｘｂａ［断片を次
いで、Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１消化ｐＬ１１０ｃにライゲ
ートさせ、実質上、実施例２および３記載の方法に従い
、得られたプラスミドで大腸菌に１２　　ＲＶ３０８を
形質転換した。得られたプラスミドをｐＬＫＳＡＢと命
名した。プラスミドｐＬＫＳＡ−Ｂの制限部位および機
能地図を第１８図に示す。

実質上、実施例２記載の方法に従って単離したプラスミ
ドｐＬＫＳΔ−ＢＩＯμりを、実質上、実施例１１Ｃ記
載の方法に従って制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、実質上
、実施例１２記載の方法に従って脱りん酸化した。次い
で、Ｄ　Ｎ　Ａを沈澱させ、実質上、実施例２記載の方
法に従い、Ｔ　Ｅ　５μＱに再懸濁した。実質上、実施
例２記載の方法に従い、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩリン
カ−の５°−３′鎖約６００ｐＭをキナーゼ処理した。

これらのリンカ−は、以下の構造を有する。

５°−ＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＡＡ
ＡＴＡＡＧ−３’ ３７°Ｃで１時間インキュベートした後、反応混合物を
９０℃で１０分間処理してキナーゼを熱で不活化した。

この反応混合物に、ＥｃｏＲＩ消化、りん酸化ｐＬＫＳ
Ａ−Ｂを、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩリンカ−のりん酸
化されていない相補鎖と一緒に加えた。この鎖は式： ％式％ で示される構造を有する。この反応混合物を室温まで徐
々に放冷することにより全を目補鎖をアニールさせた。

この結果、式： で示される構造を有するリンカ−が得られた。このリン
カ−においてりん酸化されている唯一の塩基は５°末端
のアデニルである。次いで、実質上、実施例２記載の方
法に従い、全リンカ−を−緒にライゲートした。ライゲ
ーション反応の後、反応混合物を、高塩バッファーの組
成を有するように調節した。制限酵素Ｘｂａｌ　　約１
０μｍ２（１００単位）を混合物に加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。実質上
、実施例１１Ａ記載の方法に従い、ＤＮＡをポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、〜５００ｂｐＸｂａｌ−
ＥｃｏＲＩ　／ＢａｍＨＩ断片を単離し、精製した。

プラスミドｐＬｌｌＯｃ約１μ９を実質上、実施例２記
載の方法に従い、高塩バッファー中で制限酵素Ｘｂａｌ
およびＢａｍＨｌで消化した。ＤＮＡを単離し、実質上
、実施例１１Ｂ記載の方法に従ってアガロースゲルによ
って、大きいベクター断片を精製した。次いで、ｐＬＫ
ＳＡ−ＢのＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩ断片
をＸｂａｌ　−ＢａｍＨＩ消化ｐＬ１１０ｃにライゲー
トさせた。得られたプラスミドをｐＬＫＳＡと命名した
。プラスミドｐＬＫＳＡの制限部位および機能地図を第
１９図に示す。

プラスミドｐＬ、　Ｋ　Ｓ　Ａを実質上、実施例２およ
び３記載の方法に従って大腸菌に１２　　ＲＶ３０８に
導入した。１個のコロニーを１５ｄｇ／＋１１２のテト
ラサイクリンを含有するＬＢＢａス５０ｒｎ１中、３０
°Ｃで一夜培養した。次いで、温度を４２℃にし、イン
キュベーター中で培養物をさらに３時間振盪した。次い
で、細胞をペレット化し、ＬＢブロス４部とライシス（
溶菌）ミックス１部に再懸濁した。ライシスミックスは
、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０゜１７　ｍ９７ｍ１リゾチーム
、および６μｇ／７！ＤＮＡ水溶液からなる。培養物を
氷上に１時間放置した後、７０’Ｃで凍結、３７°Ｃで
解凍を交互に行った。

この凍結−解凍処方をさらに２回繰り返した後、ｔｓ胞
ｔｔ片／ＫＳＡをニトロセルロース上にブロッティング
した。ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞から単離したＫＳＡに対して
惹起されたポリクローナル抗体は、組換え体ＫＳＡを発
現する培養物と特異的に反応する。

実施例１３　８にウィルスＤＮＡの調製ＢＫウィルスは
ＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣＶＲ−８３７の下、入手
可能である。ウィルスは、凍結乾燥品として供給される
ので、それをハング（Ｈｕｎｋ’　ｓ）の均衡塩類溶液
（Ｇｉｂｃｏ、　　３１７５Ｓｔａｌｅｙ　Ｒｏａｄ、
　Ｇｒａｎｄ　Ｉ　５ｌａｎｄ、　ＮＹ　　ｌ　４０７
２）に、約１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｆｆ
の力価になるように再懸濁した。ＢＫウィルスＤＮＡの
調製において最も好ましい宿主は、フローラボラトリー
（Ｆ　ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉ　ｎ
ｃ、＋　　７６５５０１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ　
Ｒｏａｄ、　ＭｃＬｅａｎ＋　　ＶＡ　　２２１０１）
からカタログ番号０−１００の下、またはバイオプロダ
クツ（Ｍ、　Ａ　、　Ｂ　１ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）から
カタログ番号７０−１５１の下で入手可能なヒト胚性腎
（ｒ’ＨＥＫ）細胞である。

全面成長した約ＩＱ＠ＰＨＥＫ細胞を含有する７５ｍｍ
”ポリスチレンンフラスコ５個程度を用いてウィルスを
調製する。各フラスコに力価１０’ｐｆｕ／ＩＩｄ２の
ＢＫウィルス約１ｍ１２を加えた後、３７℃で１時間イ
ンキュベートし、新しい培養培地（ダルベツコの改良イ
ーグル培地、Ｇｉｂｃｏ、　　１０％ウシ胎児面清を補
充）を加え、感染した細胞を３７°Ｃで１０−１４日間
、またはウィルスの細胞毒性効果が完全に現れるまでイ
ンキュベートする。細胞毒性効果は、細胞系統ごとに、
また、ウィルスごとに異なるが、一般に細胞のラウンデ
ィング、クランピング、および培養皿からの離反を伴う
。

３回の凍結−解凍サイクルによって細胞からウィルスを
遊離させ、細胞破片を５０００Ｘｇにおける遠心分離に
より除去する。上清１１２中に、ＰＥＧ−６００（ｌ　
Ｏ０ｇ）を加え、４°Ｃで２４時間インキュベートし、
５０００Ｘ９で２０分間遠心することによってウィルス
を沈澱させ、収集する。

ペレットをＱ、１ｘｓｓｃバｙ７ｙ−（ＩＸｓｓｃ／＜
　７７７−は、Ｏ，ｌ　５Ｍ　ＮａＣ１とＯ，０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７を含む）に、元の容量の１
／１００になるように溶解する。ウィルス懸濁液をチュ
ーブに入れた飽和ＫＢｒ１５ｍｌに虫ね、７′５，００
０ｘ９で３時間遠心する。遠心後、ＫＢｒ溶液中に２本
のＤＮＡバンドが認められた。

完全なピリオンを含有する低い方のバンドを収集し、Ｓ
　ｅｐｈａｄｅｘＲＧ　−５０カラム（シグマ・ケミカ
ルＣｏ、、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　１４５０８．　ＳＬ、Ｌ
ｏｕｉｓ。

ＭＯ６３１７８）にかけ、ＴＥ（ｌ　ＱｍＭ　Ｔｒｉ３
１１ｃＬ　ｐＨ７，８，１ｍＭＥＤＴＡ）を溶離バッフ
１−として用い、脱塩処理する。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をカラムから得た精
製ピリオンの溶液に１％濃度で加えた後、プロナーゼを
濃度１００μ９／ｍ（ｌとなるように加えて得られた溶
液を３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、塩
化セシウムを密度１．５６９／ｍ１２となるように加え
、臭化エチジウムを終濃度がｌＯＯμ９／ｒｄとなるよ
うに加えた。溶液をソーボール（Ｓｏｒｖａ目）（Ｄｕ
ｐｏｎｔ　　ｒ　ｎｓｔ、　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　　Ｎｅｗ
ｔｏｎ、　ＣＴ　０６４７０）８６５０−ターまたは同
様の縦型ローターで遠心する（２６０，０００Ｘ９．２
４時間）。遠心後、ウィルスＤＮＡのバンドを単離し、
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４を飽和した
イソアミルアルコールで５回抽出する。次いで、ＢＫウ
ィルスＤＮＡの溶液を、ＤＮＡの吸光度比２６０　ｎｍ
／２８０ｎｍが１．７５から１．９０の間になるまでＴ
Ｅバッファーに対して透析する。ＮａＣ１濃度を０．１
５Ｍにし、２容量のエタノールを加え、溶液を一７０℃
で少なくとも２時間インキュベートすることによりＤＮ
Ａを沈澱させ、１２．０００×９で１０分間遠心した。

得られたＢＫウィルスＤＮＡのペレットを濃度１ｍ９／
−でＴＥバッファーに懸濁する。

実施例１４　プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎ
ｅｏ２の構築 大腸菌Ｋ　１２　ＨＢ　１０１／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎ
ｅｏ細胞は、ＡＴＣＣから、受託番号ＡＴＣＣ３７２２
４の下、凍結乾燥品として入手可能である。

凍結細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍ（ｌを含有す
るし一寒天プレートに置き、単一コロニー単離体が得ら
れるまで３７°Ｃでインキュベートする。

アンピシリン５０μｇ／ｄを含有するＬブロス（トリプ
ト７１０９、ＮａＣｌｌ０ＩＦ、および酵母エキス　５
９／の　ｌ１２に大腸菌に１２　ＨＢＩＱＩ／ｐｄＢ　
Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴ　ｎｅｏのコロニーを接種し、空気振
盪機により、３７°ＣでＯ，Ｄ、５．。が〜１吸収単位
になるまでインキュベートシ、その時点でクロラムフェ
ニコール１５０ｍ９を培養物に加えた。約１６時間イン
キュベーションを続けた。クロラムフェニコールを加え
ると、タンパク質合成が阻害されるので以後の細胞分裂
は阻止されるが、プラスミドは複製する。

次いで、実質上、実施例１記戦の方法に従い、プラスミ
ドＤＮＡをこの培養物から単離することにより、プラス
ミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴ　ｎｅｏＤ　Ｎ　Ａ約１ｍ
ｇを得、ＴＥバッファー１ｄに懸濁し、−２０′Ｃで保
存した。

上記で調製したプラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴ　
ｎｅｏＤＮＡ約５μｇ（５μのおよび実施例１３で調製
したＢＫウィルスＤＮＡ５μｇ（５μσ）を、それぞれ
、ｌＯＸ１０ＸＢａバッフｙ−（６０ｍＭ　ＴｒｉｓＨ
ＣＩ、ｐＨ７，９，６０ｍＭ　ＭｇＣＬ、１．５ＭＮａ
Ｃ１および１ｍｇ／ｍｌ！Ｂ　Ｓ　Ａ）２１ｔ（１、制
限酵素ＢａｍＨＩ　１μＱおよび水７μＱを含有する溶
液中で３７°Ｃにおいて２時間消化した。等容量のフェ
ノール抽出によって反応を止めた後、クロロホルムで２
回抽出した。次いで、それぞれのＢａｍＨＴ消化ＤＮＡ
を沈澱させ、遠心して収集し、水５μｅに再懸濁した。

ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ−ＭＭＴｎｅ
。

（１μＱ）およびＢａｍＨＩ消化ＢＫウィルスＤＮＡ（
ｌμＩ２）の混合物にｔＯＸリガーゼバッファーｌμｇ
を加えた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（〜１０００単位
）と水６μｅをＤＮＡ混合物に加え、得られた反応混合
物を１６°Ｃで一夜インキユベートした。ライゲートし
たＤＮＡは、ＢＫウィルスＤＮＡの方向性のみが異なる
、所望のプラスミドｐＢＫ　ｎｅｏ　１およびｐＢＫｎ
ｅｏ２を構成していた。プラスミ　ドｐＢＫｎｅｏｌは
〜２．ｌｋｂ　　Ｓａｌ　Ｅ　−ＨｌｎｄＩ［Ｉ制限断
片を含有している。

大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩ細胞は、ＮＲＲＬから受託番
号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５６２６（寄託日、１９８３年９月
２８日）の下、凍結乾燥品として入手可能である。大腸
菌に１２　　ＨＢＩＯＩ細胞を培養して形質転換受容細
胞とし、実質上、実施例３記載の方法に従って上で調製
したライゲートしたＤＮＡで形質転換した。形質転換し
た細胞を１００μｙ／ｄアンピシリンを含有するし一寒
天プレートに載せた。大腸菌Ｋ　１２　　ＨＢ　１０１
／ｐＢＫｎｅｏｌおよび大腸菌Ｋ　１２　　ＨＢ　１０
１／ｐＢＫｎｅ。

２形質転換体をそのアンピシリン耐性表現型およびその
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。

実施例１５　プラスミドｐＢＬｃａｔの構築Ａ、中間体
プラスミドｐＬＰｃａｔの構築アデノウィルス２（Ａｄ
２）のピリオンＤＮＡは、サイズ約３５．９４ｋｂの二
本鎖線状分子である。

このＡｄ２の後期プロモーターは、Ａｄ２ゲノムの〜０
．３１６ｋｂ　ＡｃｃＩ−Ｐｖｕｌｌ制限断片制限単離
し得る。この〜０．３２ｋｂ制限断片はＡ制限ゲノムの
ヌクレオチド番号５７５５〜６０７１の配列に相当する
。所望の〜０．３２ｋｂ　Ａｃｃ　Ｉ　−ＰｖｕＩ［制
限断片を単離するために、まず、Ａｄ２　ＤＮＡを制限
酵素Ｂａ１ｌで消化し、〜０．３２ｋｂ　ＡｃｃＩ　−
Ｐｖｕ■制限断片の全配列を含有する〜２．４ｋｂＢａ
ｌｌ制限断片を単離する制限いで、〜２．４ｋｂＢａｌ
ｌ制限断片をＡｃｃｌ制限びＰｖｕＩｒで消化し、所望
の断片を得る。

Ａｄ２　ＤＮＡ（ＢＲＬまたはＡＴＣＣＶＲ−２から入
手可能）約５０μ２を水８０μＱ１およびＩＱＸＢａｌ
ｌバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ７，６，１２０ｍＭ　ＭｇＣ１，、ｌｏｏｍＭＤＴ
Ｔｌおよびｌ　ｕ／ｘ（ＩＢ　Ｓ　Ａ）　１０　ａ（Ｉ
ニ溶かす。Ａｄ２　　ＤＮＡ溶液に制限酵素Ｂａ１Ｉ約
ｌＯμｅ（〜２０単位）を加え、得られた反応混合物を
３７℃で４時間インキュベートする。

Ｂａ１ｌ消化ＤＮＡをアガロースゲルに適用し、制限断
片が充分に分離するまで電気泳動させる。

ゲルを臭化エチジウムの希溶液（０，５μ９／ＲＱ）に
よって染色し、長波長紫外線（ＵＶ）を照射することに
より、電気泳動したＤＮＡを観察する。アガロースから
のＤＮＡの単離法の１例を以下に示す。

所望の断片の前方に小さなスリットを入れ、各スリット
にＮＡ−４５ＤＥＡＥメンプラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒおよびＳ　ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎ、　Ｎ　Ｈ０３
４３Ｌ　）の小片を入れる。電気泳動を続けると、ＤＮ
ＡがＤＥＡＥメンプランと非共有結合的に結合する。所
望の断片がＤＥＡＥメンプランと結合した後、メンプラ
ンを取り出し、低塩バッファー（１００ｍＭＫＣＩ、Ｏ
，１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび２ＱｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ
、ｐＨ８）によって洗浄する。次いで、メンプランを小
さい管に入れ、高塩バッファー（ＩＭ　ＮａＣ１，０，
１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　
ｐＨ８）に浸漬した後、６５℃で１時間インキュベート
し、ＤＥＡＥペーパーカラＤＮＡを除（。６５°Ｃでの
インキュベーションの後、インキュベーションバッファ
ーを集め、メンプランを高塩バッファーで洗浄する。高
塩−洗浄液を、高塩インキュベーションバッファーと一
緒に分取する。

ＤＮＡの高塩バッファー溶液をＮａＣ１濃度が０゜２５
Ｍとなるように調節した後、溶液に冷却した無水エタノ
ールを３容量加える。得られた溶液を混合し、−７０℃
でｔｏ−２０分間放置する。次いで、この溶液を１５．
　ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心する。もう−度沈澱させ
て残存塩を除去した後、ＤＮＡペレットをエタノール沈
澱に付し、乾燥し、ＴＥバッファー２０μσに再懸濁す
ると、Ａｄ２の所望の制限断片的３μ２が構成される。

得られた精製断片をＴＥバッファーＩＯμｇに溶かす。

Ａｄ２の〜２．４ｋｂ　Ｂａ１ｌ制限断制限溶液にＩＱ
ＸＡｃｃＩバッファー（６０１１１Ｍ　ＮａＣＬ　６０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，５，６０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ　２．６０ｍＭＤＴＴおよびｌ　ｕ／ｘＱＢ　Ｓ　
Ａ）２　μＱと水約６μＱを加える。このＤＮＡ溶液に
制限酵素ＡｃｃＩ約２μＱ（〜１０単位）を加えた後、
反応混合物を３７℃で２時間インキュベートする。Ａｃ
ｃｌ消化の後、エタノール沈澱によりＤＮＡを集めて水
１６ｕＱおよび１ＱＸＰｖｕ１１バツフアー（６００１
１１Ｍ　ＮａＣｌ、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ
７，５，６０ｍＭ　ＭｇＣＩ、、６０ｍＭＤＴＴおよび
Ｌａｙ／ｙＱＢＳＡ）２μｅに再懸濁する。制限酵素Ｐ
ｖｕｌＩ約２μＱ（約ＩＯ単位）をＤＮＡ溶液に加えた
後、反応混合物を３７℃で２時間インキュベートする。

Ａｃｃ　Ｉ　−ＰｖｕＩ［消化したＡｄ２の〜２．４ｋ
ｂＢａＩＩ制限断片を〜６％ポ制限クリルアミドゲル上
におき、Ａｄ２後期プロモーターを含有するＡｃｃｌ−
ＰＶＬＩＩ［制限断片を他の消化産物から分離する。

ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光の下で観察して
〜０．３２ｋｂ　ＡｃｃＩ−ＰｖｕｌＩ制限断片を含有
するゲルのセグメントをゲルから分離し、破砕し、抽出
バッファー（５００ｍＭ　ＮＨ，ＯＡｃ、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＯＡｃ、ｌｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡおよび０．１％５ＤＳ）
〜２５０μＱ中、室温で一夜浸漬する。翌朝、混合物を
遠心し、ベレットを捨てる。上清中のＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、所望の断片が完全に沈澱したことを確認
するためにｔＲＮＡ約２μ９を加える。〜０．３２ｋｂ
　Ａｃｃｌ　−ＰｖｕＩＩ制限断片約０．２μ９を得、
水７μｇに懸濁する。

実質上、実施例２記戦の方法に従って、キナーゼ処理し
ておいたＢａ１ｌリンカ−（５’−ＣＴＧＡＴ　ＣＡ　
Ｇ　−３°、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
から入手可）約０．２５μｇ（０，５μσ中）を〜０．
３２ｋｂＡｃｃｌ−Ｐｖｕ■制限断片の溶液に加え、次
いで、制限ＤＮＡ溶液にＴ４ＤＮＡリガーゼｌμ１２（
〜１０００単位）とＩＯＸリガーゼバッファー１μＱを
加え、得られた反応混合物を１６°Ｃで一夜インキュベ
ートした。Ｂａ１ｌリンカ−はＡｃｃｌ　−Ｐｖｕ［制
限断片のＰｖｕＩ［末端とのみライゲートした。後のＤ
ＮＡ配列決定により、４個のＢａ１ｌリンカ−がＡｃｅ
　Ｉ　−ＰｖｕＩＩ制限断片のＰｖｕＩＩ末端に付加さ
れていることが分かった。これらの余分のＢｅｌｌリン
カ−は、Ｂｃｌｌ？ｆ’ｌ化によって除去できるが、こ
れら余分のリンカ−を含有するベクターの適切な機能性
はこれらリンカ−によって妨害されないので、除去せず
においた。

大腸菌Ｋ　１２　ＨＢ　１０１／ｐＳＶ２ｃａｔ細胞は
、受託番号ＡＴＣＣ３７１５５の下、ＡＴＣＣから凍結
乾燥品として入手可能である。該細胞から実施例１記載
の方法に従ってプラスミドｐＳ　ｖ　２ｃａｔＤＮＡを
単離した。プラスミドｐｓＶ２ｃａｔＤＮＡ約１１９を
得、これをＴＥバッファー１ｍＱに溶解した。プラスミ
ドｐＳＶ２　ｃａｔ　ＤＮＡ約３μｇ（３μＱ）を１Ｑ
ＸＡｃｃｌバツフア　　２ｔｔＱおよび水１６μσに加
えた後、ｐＳＶ２　ｃａｔ　ＤＮＡ溶液に制限酵素Ａｃ
ｃ１３μＱ（約９単位）を加え、得られた反応混合物を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、Ａｃｃ
Ｉ消化プラスミドｐＳ　ｖ　２ｃａｔを、１ＱＸｓｔｕ
ｌバツフアー（１，ＯＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＬ　ｐＨ８，ｏ、１００ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　
２．６０ｍＭ　　ＤＴＴおよびＩｎ／＋ＱＢＳＡ）３μ
ρ、水５μρおよび制限酵素５ｔｕｌ約２μａ（約１０
単位）を加えて、５ｔｕｌ消化した。反応混合物を３７
℃で２時間インキュベートした。反応混合物をフェノー
ルで１回、次いでクロロホルムで２回抽出して反応を止
めた。所望の断片約０．５μ９を得、これをＴＥバッフ
ァー２０μσに溶かした。

Ａｃｃｌ−３ｔｕｒ−消化プラスミドｐｓＶ２ｃａｔＤ
ＮＡ約４μσをＡｄ２の〜０．３２ｋｂ　ＡｃｃＩ−Ｐ
ＶＬＩＩＩ制限断片（Ｂｅｌｌリンカ−が付加されたも
の）約７μＱと混合し、ｌＯＸリガーゼバッファー３ｔ
ｔＱ、水１５μ（２およびＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ２μｅ
（約１０００単位）を加えた後、ライゲーション混合物
を１６°Ｃで一夜インキユベートした。ライゲートした
ＤＮＡは所望のプラスミドｐＬＰｃａｔ。

クロラムフェニコール・アセチルトランスフエラ−ゼ遺
伝子を転写させ、発現させる位置にＡｄ２後期プロモー
ターを含有するプラスミドを構成していた。

ライゲートしたＤＮＡを用い、実質上、実施例３記載の
方法に従い、大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ（ＮＲＲＬ　Ｂ
１５６２６．１９８３年９月２８日寄託）細胞を形質転
換した。形質転換した細胞を５０μ９／ｌｕ１！アンピ
シリンを含有するし一寒天プレートに載せた。プラスミ
ドＤＮＡの制限酵素分析により大腸菌Ｋ　１２　ＨＢ　
１０１／ｐＬＰｃａｔ形質転換体を同定した。以後の構
築のために、実質上、実施例１記載のプラスミドＤＮＡ
単離法に従って形質転換体からプラスミドｐＬＰｃａｔ
をＩ離した。

Ｂ、　プラスミドｐＢＬｃａｔの最終構築ＴＥバッファ
ー５０μＱ中のプラスミドｐＢＫｎｅｏＩＤＮＡ約８８
μ２を１ＯＸＡｃｃｌバッフ７−７゜５μＱ、水３０．
ｃｌおよび制限酵素Ａｃｃｌ　　Ｌ５ａ（１（約７５単
位）に加え、得られた反応混合物を３７℃で２時間イン
キュベートした。Ａｃｃｌ消化ＢＫウィルスＤＮＡをア
ガロースゲルに適用し、ＢＫエンハンサ−を含有する〜
１．４ｋｂ断片を他の消化産物から分離した。次いで、
〜１．４ｋｂ断片を実質上、実施例１５Ａ記載の方法に
従って単離した。この断片〜５μ９を１ＯＸＰｖｕｌＩ
バツフアー５μ（１，水４５．ｃｌ、および制限酵素Ｐ
　ｖｕ　ＩＩ　　５　μ（２（〜２５単位）に再懸濁し
、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュベート
した。次いで、実質上、実施例１５Ａに記載のごとくに
してＰｖｕｎ消化ＤＮＡを単離し、ライゲーションに備
えた。所望の〜１．２８ｋｂ　Ａｃｃ［−Ｐｖｕ■断片
〜２μ９を得、ＴＥバッファー５μｇに溶解した。

プラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡ約１μ９を１０ＸＡｃｃ
ｌバツフアー５μＱおよび水４０μｅに溶解した。

制限酵素Ａｃｃ１〜５μρ（〜２５単位）を加え、得ら
れた反応混合物を３７°Ｃでインキュベートした。

Ａｃｃｌ消化プラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡをエタノー
ル沈澱に付し、次いで１ＯＸｓｔｕｌバッフ１−５μＱ
１水４０μｇおよび制限酵素５ｔｕ１　５μｅ（約２５
単位）に再懸濁し、得られた反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。ＡｃｃＩ　−８ｔｕ■消化プ
ラスミドｐＬＰｃａｔＤＮＡを数回エタノール沈澱に付
して大腸菌の複製起源とＡｄ２後期プロモーターを含有
する約４．８１ｋｂ制限断片を、サイズ約１６ｂｐの他
の消化産物から精製した。所望の〜４．８１ｋｂ制限断
片約１制限を得、ＴＥバッファー２０μｅに溶解した。

プラスミドｐＬＰｃａｔの約４．８１ｋｂ　Ａｃｃｌ　
−３ｔｕ［制限断片５μｉ２をＢＫウィルスの約１．２
８ｋｂＡｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限断片５μＱに加えた。

ＩＯＸリガーゼバッファー３μＱ１水１５μｅ、および
ＤＮＡリガーゼ２μＱ（約１０００単位）を上記ＤＮＡ
混合物に加えた後、得られたライゲーション混合物を１
６℃で一夜インキユベートした。ライゲートシたＤＮＡ
は所望のプラスミドｐＢＬｃａｔを構成していた。

ライゲートしたＤＮＡを用い、実質上、実施例３記載の
方法に従い、大腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯＩ／ｐＢＬｃａｔ
ＤＮＡ形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によって同定した。実質上、実施例３記載の方法に
従い、プラスミドｐＢＬｃａｔを調製した。

実施例１６　プラスミドｐＬ　１３３の構築Ａ、中間体
プラスミドｐｓＶ２−ＨＦＯ２の構築プラスミド９８Ｃ
７はヒトプロティンＣをコードするＤＮＡを含有してい
る。１５μ９／ｒｎ（ｌのテトラサイクリンを含有する
しブロスＩＱに大腸菌に１２　　ＲＲＩ／ｐＨＣ７（Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１５９２６、寄託日、１９８５年１月２
９日）培養物を接種し、実質上、実施例１記載の方法に
従ってプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを単離、精製した。こ
の工程でプラスミドｐＨＣ７約１　ｍ９を得、ＴＥバッ
ファー１ｍｌに懸濁し、−２０℃で保存した。

プラスミドｐＨｃ７ＤＮＡ５０ｆｆ＋１２を制限酵素Ｂ
ａｎ■　５μＱ（〜５０単位）、１０ＸＢａｎｌ制限バ
ツフアー（１，５Ｍ　ＮａＣ１，６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐＨ７，９，６０ｍＭ　Ｍ　ｇＣＩ　Ｉｓおよ
びｌ　ｍ９ｈｌｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ）ｌＯμｅおよび３５μ
Ｑ水と混合し、消化が完了するまでインキュベートした
。次いで、Ｂａｎ１消化プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを３
．５％ポリアクリルアミドケル（２９：ｌアクリルアミ
ド：ビスアクリルアミド）電気泳動にかけ、〜１．２５
ｋｂＢａｎｌ制限断片が他の消化産制限域分離されるま
で、泳動させた。

〜１．２５ｋｂＢａｎｌ制限断片を含有するゲ制限域を
切除し、試験管に入れ、小さい断片に破砕した。

この断片を含有する試験管に抽出バッファー（５００ｍ
Ｍ　ＮＨ，ＯＡｃ、１０ｍＭ　ＭｇＯＡｃ、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、１％ＳＤＳ、１０ｍ９／ｍｌ　ｔＲＮＡ）１−を
加え、試験管を３７°Ｃで一夜放置した。遠心によって
破片をペレット化し、上清を新しい試験管に移した。抽
出バッファー２００μσで１回破片を洗浄し、洗浄上清
を一夜培養物から得た第一上清と一緒にした。上清をガ
ラスウールのプラグを通して濾過し、上清に２容量のエ
タノールを加えて混合した。得られた溶液をドライアイ
スエタノール浴に〜１０分間放置した後、遠心してＤＮ
Ａをペレット化した。

この工程で〜１．２５ｋｂＢａｎＩ制限断片約８μ９が
得制限た。精製断片をＴＥバッファー１０μＱに懸濁し
、−２０°Ｃで保存した。プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ
Ｂを構築するためにはＢａｎ１制限断片にリンカ−を付
加して補正する必要がある。

リンカ−の各−本積５００ｐＭをＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ１５単位（〜０．５μＱ）、１０Ｘリガーゼバ
ツフアー２μσ、５００μＭ　ＡＴＰ。

水７．５μＱを含有する反応バッファー２０μσ中でキ
ナーゼ処理した。キナーゼ反応混合物を３７°Ｃで３０
分間インキュベートし、１００°Ｃで１０分間インキュ
ベートして反応を止めた。キナーゼ処理の完了を確かめ
るために、反応混合物を水上で冷却し、反応混合物に０
．２Ｍジチオスレイトール２μ（！、５ｍＭΔＴＰ２．
５μＱおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１５単位を
加え、混合し、得られた反応混合物を３７°Ｃでさらに
３０分間インキュベートした。１００°Ｃで１０分間イ
ンキュベートして反応を止め、氷上で冷却した。

別個にキナーゼ処理した２本の一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪ
ンカーをキナーゼ処理の後、混合した。鎖をアニーリン
グするために、本釣１５０ｍ１２を含有する水浴中でキ
ナーゼ反応混合物を１００°Ｃで１０分間インキュベー
トした。このインキュベーションの後、水浴を閉鎖し、
室温まで放冷した（約３時間を要する）。キナーゼ処理
したＤＮＡを含有したままの試験管を入れた水浴をさら
に４℃で一夜インキユベートした。この工程によって一
本鎖をアニーリングした。

構築されたリンカ−は、式： ％式％ で示される配列を有する。このリンカ−を使用するまで
一２０°Ｃで保存した。

〜１．２５ｋｂ　Ｂａｎ１断片〜８μ９をリンカ−〜５
０μｅ（〜５００ｐＭ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（
〜５００単位）、１０ｘリガーゼバ・ソファ−１ＯμＱ
、および水２９μＱに加え、得られたライゲーション反
応混合物を４℃で一夜インキユベートした。６５℃で１
０分間インキュベーションすることによりライゲーショ
ン反応を止めた。溶液にＮａ０Ａｃを終濃度０．３Ｍま
で加え、さらにエタノール２容量を加えてドライアイス
−エタノール浴中で冷却し、遠心することにより、ＤＮ
Ａをペレット化した。

ＤＮＡペレットを１０　Ｘ　Ａｐａ　Ｉ　制限バッファ
ー（６０ｍＭ　ＮａＣ１，６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
、ｐＨ７，４，６０ｍＭ　ＭｇＣＩｓ、および６０ｍＭ
２−メルカプトエタノール）ｌＯμσ、制限酵素Ａｐａ
Ｉ５μＱ（〜５０単位）および水８５μρに溶かし、反
応混合物を３７°Ｃで２時間放置した。次いで、反応を
止め、上記の如くにＤＮＡをペレット化した。

このＤＮＡペレットをｌ　Ｑ　Ｘ　Ｈ１ｎｄＩＩ［制限
／”ッファー１０ｔｔＱ、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ　５
μＩ２（〜５０単位）および水８５μＱに加え、３７°
Ｃで２時間、反応させた。ＨｉｎｄｌＩ［消化の後、反
応混合物を３．５％ポリアクリルアミドゲルに適用し、
実質上、実施例１５Ａ記載の方法に従い、所望の〜１．
２３ｋｂ［（１ｎｄＩＩ［−Ａ　ｐａ　Ｉ制限断片を単
離した。所望の断片約５μ９を得、ＴＥバッファーｌＯ
μＱに懸濁して一２０°Ｃで保存した。

プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ５０μＱを制限酵素Ｐｓｔ■
　５μｇ（〜５０単位）、１０ＸＰｓｔＩ反応バッファ
ー（１，ＯＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＬ
ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＭｇＣＩｔおよび１即／祿Ｂ
ＳＡ）１０μＱおよび水３５μＱと混合し、３７°Ｃで
２時間インキュベートした。次いで、Ｐｓｔｌ消化プラ
スミドｐＨＣ７ＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、実質上、上記の方法と同様にして所
望の〜０．８８ｋｂ断片を精製した。所望の断片約５μ
Ｖを得、ＴＥバッファー１０μｇに懸濁し、−２０°Ｃ
で保存した。

〜０．８８ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ断片〜５μ９を、自動ＤＮ
Ａ合成装置により構築した。式： ％式％ で示されるリンカ−〜５０μｅと混合した。このＤＮＡ
混合物にＴＥＤＮＡリガーゼ約ｌμＱ（〜ｌＯ単位）、
ＩＯＸリガーゼバッファー１０μＱおよび水２９μρを
加え、得られたライゲーション反応混合物を４℃で一部
インキユベートした。

６５°Ｃで１０分間インキュベートしてライゲーション
反応を止めた。ライゲートしたＤＮＡを沈澱させた後、
ＤＮＡペレットを１０ＸＡｐａ１反応バッフｙ−１０ａ
Ｑ、制限酵素Ａｐａ１５　μｅ（〜５０単位）、水８５
μｇに溶解し、反応混合物を３７°Ｃで２時間放置した
。次いで、反応を止め、再度、ＤＮＡをペレット化した
。このＤＮＡペレットをｌＱＸＢｇｌＩＩ反応バッファ
ー（ＩＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　
ｐＨ７，４，１００ｎ＋ＭＭｇＣｔ、、１００ｍＭ　２
−メルカプトエタノール、１ｍ９／ｍ１２Ｂ　Ｓ　Ａ）
　１０　μ（１、制限酵素Ｂｇｌ［Ｉ　　５μｇ（〜５
０単位）および水８５μＱに溶かし、得られた反応混合
物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。

Ｂｇｌｌｌ消化の後、反応混合物を３．５％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、実質上、上記と同様にし
て所望の〜０．１９ｋｂ　Ａｐａｌ−Ｂｇｌｌｌ制限断
片を単離した。所望の断片約１μ９を得、ＴＥバッファ
ー１０μａに懸濁して一２０℃で保存した。

ブラｙ、ミＦｐＳＶｇｐｔＤＮＡ（ＡＴＣＣ３７１４５
）約１０μ９をＩＱｘＨｉｎｄＩ［［バッフｙ−１０μ
（！、制限酵素Ｈｉｎｄｌ１１５μσ（〜５０単位）お
よび水８５μｅに溶かし、得られた反応混合物を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。次いで反応混合物をＮ
ａ０Ａｃ、０．２５Ｍに調節し、２容量のエタノールを
加えてドライアイス−エタノール洛中でインキュベート
した後、遠心してＤＮＡをペレット化した。このＤＮＡ
ペレットをｌＱＸＢｇｌＩＩバッファー１０μσ、制限
酵素Ｂｇｌｎ　　５μ１２（〜５０単位）および水８５
μθに溶かし、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。Ｂｇｌｎ消化の後、反応混合物を
１％アガロースゲル電気泳動にかけ、断片を分離させた
。ゲルを臭化エチジウム染色し、紫外線照射下で観察し
、所望の〜５、１９ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［−ＢｇｌＩＩ断
片をゲルから切り取り、透析チューブに入れ、ＤＮＡが
アガロースから放出されるまで電気泳動を続けた。煽折
チューブから得たＤＮＡを含有するバッファーをフェノ
ールおよびクロロホルムで抽出し、ＤＮＡを析出させた
。ペレットをＴＥバッファー１０μσに再懸濁すると、
所望の、プラスミドｐｓＶｇｐｔの〜５、　ｌｋｂ　Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ　　Ｂｇｌｌ［制限断片を構成していた。

〜１．２３ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌ制限断片２
μｅ。

〜０．１９　ｋｂ　Ｈ１ｎｄＩＩＩ−Ａｐａｌ制限断片
３μσ、および〜５．１　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｇ
ｌＩＩ制限断片２μＱを合し、１０×リガーゼバツフア
ー１０μＱ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｅ（〜５００単位
）および水８２μＱと一緒に１６°Ｃで一部インキユベ
ートした。

ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＳＶ２−Ｈ
，ＰＣ８を構成していた。

実質上、実施例３記載の方法に従い、大腸菌に１２　Ｒ
ＲＩ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５２１０、寄託日：　１９８
２年１０月１９日）細胞を形質転換受容菌とした。上記
のごとくにした調製した、ライゲートしたＤＮＡを用い
て細胞を形質転換し、形質転換混合物の一部を１００μ
ｇ／ｒａｎアンピシリンを含有するし一寒天プレートに
載せた。プレートを３７℃でインキュベートした。大腸
菌に１２ＲＲ１／ｐＳＶ２−ＨＰＣ８形質転換体をソノ
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認した。

Ｂ、プラスミドｐＬ１３３の最終構築 プラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣＢの５０μ９を１０ＸＨｉ
ｎｄＩＩ［バッフｙ−１０μσ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ５μＱ（〜５０単位）および水８５μσに溶かし、得
られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートし
た。Ｈｉｎｄ［［消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、ＤＮＡ
ペレットを１０ＸＳａｌ１反応バッファー（１，５Ｍ　
ＮａＣ１，６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，９，
６０ｍＭ　ＭｇＣｌｚ、６０ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール、１　ｍｇ／ｍＩＢ　Ｓ　Ａ）　１０　ｔｔ（１、
制限酵素５ａ１１５μＱ（〜５０単位）および水８５μ
ρに溶かした。得られた５ａｉｌ反応混合物を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。Ｈ１ｎｄｌＩＩ　−Ｓ　
ａｌ　Ｉ消化ブラスミＦｐＳＶ２　　ＨＰＯ３を３．５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の〜０
．２９ｋｂＨ１ｎｄｌｌ　−Ｓ　ａｌ　Ｉ制限断片が他
の反応産物から分離するまで泳動させた。所望の断片を
ゲルから単離し、断片約２μ９を得、ＴＥバッファー１
０μＱに懸濁した。

プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の５０μ９を１０ｘＢｇ
Ｉ１１バッファー１０μＮ、制限酵素ＢｇｌＩＩ　　５
μσ（５０単位）および水８５μρに溶かし、得られた
反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。Ｂ
ｇｌ■消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、ＤＮＡベレットを
１０ＸＳａｌ１反応バッファー１０μσ、制限酵素５ａ
ｌ１５μＱ（〜５０単位）および水８５μＣに溶かした
。得られた５ａｉｌ反応混合物を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。５ａｉｌ　−Ｂｇｌ■消化プラスミｔ
’ｐｓＶ２−ＨＰＯ３を３，５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、所望の〜１、１５ｋｂ　５ａｌｔ　
−ＢｇｌＩ［制限断片が他の反応産物から分離するまで
泳動させた。−１，１５ｋｂｓａｌｌ−Ｂｇｌ■制限断
片をゲルから単離し、断片約８μ９を得、ＴＥバッファ
ー１０μＱに懸濁した。

プラスミドｐＳ　ｖ　２−β−グロビンＤＮＡ（ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１５９２８，１９８５年１月２９日寄託）約１
０μ９を１０ｘＨｉｎｄｌバッフｙ−ＩＱμＣ１制限酵
素Ｈ１ｎｄＩＩＩ５　ＩＩ　Ｃ（〜５０単位）および水
８５μσに溶かし、得られた反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。次いで反応混合物をＮａ０Ａ
ｃ、０．２５Ｍに調節し、２容量のエタノールを加えて
ドライアイス−エタノール浴中でインキュベートした後
、遠心してＤＮＡをペレット化した。ＨｉｎｄｌＩｌ消
化プラスミドｐｓｖ２−β−グロヒンＤＮＡヲｌ　ＯＸ
　ＢｇｌＩＩハッ７７−１０　ａ（１゜制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩ　　５μｇ（〜５０単位）および水８５μＣに溶か
し、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベ
ートした。ＢｇｌＩＩ消化の後、反応混合物を１％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、断片を分離させた。所望の
〜４．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ［−Ｂｇ１■制限断片をゲ
ルから単離した。所望の断片約５μ９を得、ＴＥバッフ
ァー１０μＱに懸濁した。

プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣ３の〜０．２９ｋｂＨｉｎ
ｄＩ［ｌ−３ａｉｌ断片２ｔｔＱ、プラスミドプラスミ
ドｐＳＶ２−ＨＰＯ３の〜１．１５ｋｂ　　５ａｉｌ　
−Ｂｇ１■断片２μＱ１およびプラスミドｐｓｖ２〜β
−グロビンの〜４．２ｋｂ　ＨｉｎｄｎＩ−ＢｇｌＩＩ
断片２μσを合し、実質上、実施例１６Ａ記載の方法に
従ってライゲートさせた。ライゲートしたＤＮＡは所望
のプラスミドｐＬ１３３を構成していた。プラスミドｐ
ＳＶ２−ＨＰＣ３ではなくプラスミドｐＬ１３３を形質
転換用プラスミドとして用いるほかは実質上、実施例１
６Ａの方法に従って所望の大腸菌Ｋ１２　　ＲＲＩ／ｐ
Ｌ１３３形質転換体を構築した。

実施例１７　プラスミドｐｔ、ｐｃの構築プラスミドｐ
ＢＬｃａｔＤＮＡ約２０μ９をＩＯＸ［（ｉｎｄｎｌバ
ッファー１０μａおよび水８０μａに溶かした。このプ
ラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡの溶液に制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌＩｒ約１０．ｃｌ（〜１００単位）を加え、得られた
反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートシた。Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡをアガ
ロースゲルに適用し、ＢＫエンハンサ−とＡＤ２後期プ
ロモーターとを含有する〜０．８７　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｎ
ｌ制限断片制限の消化産物から分離するまで電気泳動さ
せた。次いで、〜０．８７ｋｂ断片を実質上、実施例１
５Ａ記載の方法に従って単離し、ライゲーション用に調
製した。所望の断片約２μ９をＴＥバッファー５μＱに
溶かした。

プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡ約１．５μ９をｌ０Ｘ）１
ｉｎｄＩＩＩバツフアー２μＱおよび水１６μｇに溶解
した。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ約１μ
ｅ（〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応混合物を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。次いで、実質上、実施
例１２の方法に従い、ＤＮＡをＴＥバッファー１００μ
ｇで希釈した後、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理
した。ＨｉｎｄｎＩ消化プラスミドｐＬ１３３ＤＮＡを
フェノールで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノ
ール沈澱に付し、ＴＥバッファーｌＯμｇに懸濁した。

プラスミドｐＢＬｃａｔの〜０．８７ｋｂＨｉｎｄｌｌ
ｌ制限断片約５ｕＱを［（ｉｎ制限［Ｉ消化プラスミド
ルＬ　１３３１．５μＱに加え、次いで、１０×リガー
ゼバツフアーｌμＱ、水１．５μＱ、およびＴ４ＤＮＡ
リガーゼｌμｅ（約１０００単位）をこのＤＮＡ溶液に
加え、得られた反応混合物を１６℃で一部インキユベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐｔ
、ｐｃを構成していた。

ライゲートしたＤＮＡを用い、実質上、実施例３記載の
方法に従い、大腸菌に１２　ＨＢＩＯＩを形質転換した
。形質転換した細胞をアンピシリン含有し寒天プレート
上で平板培養し、大腸菌に１２　　Ｉ−ＩＢＩＯＩ／ｐ
ＬＰＣを同定するために、アンピシリン耐性形質転換体
をプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、調べた。Ｂ
Ｋエンハンサ−とＡＤ２後期プロモーターとを含有する
〜０，８７ｋｂＨｉｎｄｌＩＩ制限断片はＨｉｎｄｌｌ
ｌ消化プラスミドｐＬ１３３に２方向の内、いずれの方
向でも挿入可能であり、〜１．Ｏｋｂ　Ｎｄｅｌ−３ｔ
ｕＩ断片を含有する構築物のみがｐＬＰＣを与える。

実施例１８　プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　１および
ｐＬＰＣｈｙｇ２の構築 大腸菌Ｋ　１２　　ＲＲｌ／ｐＳＶ２ｈｙｇは受託番号
ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８０３９の下、ＮＲＲ，Ｌに寄託（
寄託日：　１９８６年２月１１日）されている。

実質上、実施例１記載の方法に従ってプラスミドｐＳ　
Ｖ　２ｈｙｇＤＮＡを細胞から得た。

プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇ約ＩＯμｇ（Ｔ　Ｅバ
ッファー１ｏｔｔＱ中）を１０Ｘ１０ＸＢａバッフｙ−
２ａＱおよび水６μρに加えた。制限酵素ＢａｍＨＩ約
２μｉ２（約２０単位）をこのＤＮＡ溶液に加え、３７
°Ｃで２時間インキュベートした。反応混合物をまス、
フェノール抽出した後、スクロロホルムで２回抽出した
。このＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＳ　ｖ　２ｈｙｇＤ
ＮＡをアガロースゲルに適用し、実質上、実施例１５Ａ
記載の方法に従ってハイグロマイシン耐性遺伝子を含有
する〜２．５ｋｂ制限断片を制限した。

Ｂ　ａｍＨＩ　？ｉ！ｌ化プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇＤ
ＮＡの溶液にＩＯ×クレノウバッファ−（４種類のｄＮ
ＴＰ各０．２ｍＭ、　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｐ
Ｈ７，８，５０ｍＭ　ＭｇＣＩ２、Ｏ，１Ｍ２−メルカ
プトエタノール、１００　ｕ９／　ｍ１２ＢＳ　Ａ）約
５μσおよび水３５μｇを加えた後、フレノウ酵素約２
５単位（約５μＣ，ＢＲＬ供給）をＤＮＡ溶液に加え、
得られた反応混合物を１６°Ｃで３０分間インキュベー
トした。フレノウ処理したＢａｍＨＩ消化プラスミドｐ
ＳＶ２ｈｙｇＤＮＡをフェノールで１回、次いでクロロ
ホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。所望の
断片約２μりを得、ＴＥバッファー５μＱに懸濁した。

プラスミドｐＬＰＣＤＮＡ約ｌＯμｇ（ｔｏμｇ）を１
０ＸＳｔｕｌバツフアー２μｅおよび水６μｅに加えた
。このＤＮＡ溶液に制限酵素５ｔｕｌ約２μＱ（〜ｌＯ
単位）を加入、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。Ｓｔｕ、Ｉ消化プラスミドｐＬＰ
ＣＤＮＡをエタノール沈澱に付し、遠心して収集し、１
ＯＸＮｄｅｌバツフアー（１，５ＭＮａＣ１，０，５Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，８，７０ｍＭ　Ｍ　ｇ　
Ｃｌ　ｔ、６０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍ９
／ｍ１２Ｂ　Ｓ　Ａ）２　μＱおよび水１．６μ＆に再
懸濁した。この５ｔｕｌ消化ＤＮＡに制限酵素Ｎｄｅｌ
約２μｅ（〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応混合物を
３７℃で２時間インキュベートした。

Ｎｄｅ［−３ｔｕｌ消化プラスミドｐＬＰＣＤＮＡをエ
タ／−ルで沈澱させ、遠心して収集し、ｌＯ×タレノウ
バッファー５μａおよび水４０μＣに再懸濁した。この
ＤＮＡ溶液にフレノウ酵素約５μｅ（〜２５単位）を加
え、得られた反応混合物を１６°Ｃで３０分間インキュ
ベートした。フレノウ反応の後、反応混合物をアガロー
スゲルに適用し、〜５．８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ−８ｔｕｌ
制限酵素断片をゲルから単離した。所望の断片約５μ９
を得、ＴＥバ、。

ファー５μｅに懸濁した。

プラスミドｐＳＶ２ｈｙｇのフレノウ処理した〜２゜５
ｋｂ　ＢａｍＨＥ制限断片約２μＱをプラスミドｐＬＰ
Ｃのフレ／つ処理した〜５．８２ｋｂ　Ｎｄｅｌ　−３
ｔｕｌ制限断制限１ＩＬＩ２と混合し、ＩＯＸリガーゼ
バッファー約３μｇ、水１４μρ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
２μＱ（〜１０００単位）およびＴ４ＲＲＮＡリガーゼ
ｌμＱ（〜ｌ単位）をこのＤＮＡ溶液に加えた。得られ
た反応混合物を１６℃で一夜インキユベートした。ライ
ゲートしたＤＮＡは、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｈｙｇ
の〜２．５ｋｂクレノウ処理ＢａｍＨＩ制限断片の方向
性のみが異なる、所望のプラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌお
よびｐＬＰＣｈｙｇ２を構成していた。ライゲートした
ＤＮＡを用い、実質上、実施例３記載の方法に従い、大
腸菌Ｋ１２　ＨＢＩＯｌを形質転換した。所望の形質転
換体、大腸ｍＫ１２　ＨＢＩＯＩ／ｐＬＰｃｈｙｇｌお
よび大腸菌に１２　ＨＢ　１０１／ｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ
２をアンピシリン含有し寒天プレート上で平板培養し、
そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した
。

実施例１９　プラスミドｐＢＷ３２の構築プラスミドｐ
ＴＰＡ１０２はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（
ＴＰＡ）の暗号配列をコードしている。プラスミドｐＴ
ＰＡ１０２は、大腸菌に１２　ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ１
０２（ＮＲＲＬから受託番号ＮＰＰＬ　Ｂ−１５８３４
に１９８４年８月１０日に寄託された菌株であり、受託
番号ＮＰＰＬＢ−１５８３４の下、入手可能である）か
ら単離される。実質上、実施例１記載の方法に従い、大
腸菌に１２　ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ１０２からプラスミ
ドｐＴＰΔ１０２を単離した。

プラスミドｐＴＰＡ１０２約５０μ９（Ｔ　Ｅバッファ
ー約５０μσ中）を、ＩＯＸ　　Ｔｔｈｌｌｌｌバッフ
ｙ　　（０，５Ｍ　ＮａＣＬ　　８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐ）（７，４，８０ｍＭ　ＭｇＣＩ、、８０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールおよびｌ　ｍｇ／ｍＱＢ　
Ｓ　Ａ）　１０　ｔｌＱ。

および水８０μｅに加えた。このＤＮ、Ａ溶液に制限酵
素Ｔ　ｔｈｌｌｌ　Ｉ約ｌＯμＱ（〜５０単位）を加え
、得られた反応混合物を６５°Ｃで２時間インキュベー
トした。反応混合物をアガロースゲルに適用し、ＴＰＡ
暗号領域を含む〜４．４　ｋｂ　Ｔｔｈｌｌｌ　ｌ制限
断片をゲルから単離した。他の消化産物である３゜ｌｋ
ｂ制限断片およびＱ、５ｋｂ制限制限を捨てた。

所望の〜４．４ｋｂ　Ｔｔｈｌｌｌｌ制限断片を得、Ｔ
Ｅバッファー１０μｇに懸濁Ｌ　タ。

１０Ｘクレノウバツフア−約５　ｔｔＱと水３０μ（！
を〜４　、４　ｋｂ　′ｒＬｈｌｌｌ　ｌ制限断片を含
有する溶液に加え、さらにフレノウ酵素約５μｍ２（〜
５単位）を加えた後、反応混合物を１６°Ｃで３０分間
、インキュベートした。フレ／つ反応の後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱させ、１０Ｘリガーゼバッフ１−３μＱと
水１４μσに再懸濁した。

式： ％式％ で示される配列式を有するＢａｍＨＩリンカ−（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を以下の方法でキ
ナーゼ処理し、ライゲーションに備えた。リンカ−４μ
Ｑ（〜２μ９）を水２０．１５μＱおよびＩＯＸキナー
ゼバッファー（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ
７゜６および１００　ｍＭ　ＭｇＣＬ）　５μＱに溶か
し、９０°Ｃで２分間インキュベートした後、室温まで
冷却した。この混合物にγ−”Ｐ−ＡＴＰ５μｍ２（〜
２０μＣｉ）、ＩＭ　ＤＴＴ　　２．５μＱおよびポリ
ヌクレオチドキナーゼ５μｆ２１〜１０単位）を加え、
３７°Ｃで３０分間インキュベートした。次いで、０．
０１Ｍ　ＡＴＰ３．３５μＱおよびキナーゼ５μρを加
え、３７°Ｃでさらに３０分間反応を継続した。リンカ
−が標的ＤＮＡと結合したか否かを調べるのに、放射活
性なＡＴＰが有用である。

キナーゼ処理したＢ、ａｍＨＩリンカ−約１０μＱを〜
４．４ｋｂＴｔｈｌＩＩ制限断片に加え、Ｔ４Ｄ制限リ
ガーゼ２μｅ（〜１０００単位）およびＴ４ＲＮＡリガ
ーゼｌμσ（〜２単位）を加えた後、ライゲーション反
応混合物を４°Ｃで一夜、インキュベートした。ライゲ
ートしたＤＮＡをエタノール沈澱に付し、１０　Ｘ　Ｉ
Ｉ　１ｎｄｌｌＩバツフアー５ｕＱおよび水４０μσに
再懸濁した。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉ
約５μＱ（〜５０単位）を加え、得られた反応混合物を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。

Ｈｉｎｄｎｌ消化ＤＮＡをエタノール沈澱に付し、１０
Ｘ！３ａｍＨＩバッフ７−１０μ＆および水９０μＱに
再懸濁した。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＢａｍＨ［約１
０μＱ（〜ｌＯＯ単位）を加え、３７℃で２時間インキ
ュベートした。ＢａｍＨ１消化の後、反応混合物をアガ
ロースゲルに適用し、〜２．Ｏｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｈ
１ｎｄｌｌｌ制限断片を制限から単離した。所望の断片
約４μりを得、ＴＥバッファー約５μρに懸濁した。

プラスミドｐＴＰＡ１０３を構築するために、プラスミ
ドｐＴＰＡ１０２由来の〜２．ＯｋｂＢａｍＨＩ　−Ｈ
１ｎｄＩ［制限断片をＢ　ａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌＩｌ
消化プラスミドｐＲＣに挿入した。プラスミドｐＲＣは
、大腸菌用オペロンのプロモーターおよびオペレーター
（■ＰＯ）配列を含有する〜２８８ｂｐＥｃ。

Ｒ１−Ｃ１ａｌ制限断片をＥｃｏＲ［−ＣＩａｌ消化プ
ロモーターｐＫＣ７に挿入することにより構築された。

プラスミドｐＫＣ７は、ＡＴＣＣから、受託番号ＡＴＣ
Ｃ３７０８４の下、大腸菌に１２Ｎ１００／ｐＫＣ７中
に得ることができる。ｔｒｐＰＯを含有する〜２８８ｂ
ｐ　ＥｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ制限断片は、大腸菌Ｋ１２　
ＭＭ２９４／ｐＴＰＡｌ。

２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５８３４）から単離されるプラ
スミドｐＴＰＡ１０２から得られた。プラスミドｐＫＣ
７およびプラスミドｐＴＰＡ１０２は上記の細胞系統か
ら、実質上、実施例１記載の方法に従って得ることがで
きる。プラスミドｐＴＰＡ１０２の〜０．２９ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲｌ−Ｃ１ａｌ制限断片は、大腸１Ｗｔｒｐ遺伝子
の転写活性化配列および大部分の翻訳活性化配列を含有
しており、式；で示される配列を有する。

プラスミドｐＲＣを溝築するために、ＴＥバッファー１
０μρ中に入れたプラスミドｐＫＣ７約２μ９を１ＯＸ
ｃｌａｌバツフアー（０，５Ｍ　ＮａＣ１゜６０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｐＨ７，９，６０ｍＭ　ＭｇＣ１，
，１ｍｆＩ／ｍ１２Ｂ　Ｓ　Ａ）２μＣおよび水６μＱ
に加えた。このプラスミドｐＫＣ７ＤＮＡ溶液に制限酵
素Ｃ１ａＩ約２μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。Ｃｌａ
　Ｉ　ｉ肖化プラスミドｐＫＣ７ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、１ＯＸＥｃｏＲＩバッフ１−２Ｍ ＴＴ Ｃ ＴＧ Ｍｇおよび水１６μσに再懸濁した。このＣ１ａｌ消化
プラスミドｐＫＣ７ＤＮＡ溶液に制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１約２μＱ（〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応混合
物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。

ＥｃｏＲ１−Ｃ１ａｌ消化プラスミドｐＫＣ７ＤＮＡを
フェノールで１回、クロロホルムで２回抽出した。次い
で、ＤＮＡをエタノール沈澱に付し、１０×リガ一ゼバ
ツフアー３μｇと水２０μｇに再懸濁した。プラスミド
ｐＫＣ７の制限部位および機能地図１′ｉ、マニアティ
スらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂａｔｏｒｙ、　
１９８２）から知ることができる。

ＴＥバッファー約２０ｔｔ（ｌ中に入れたプラスミドｐ
ＴＰΔ１０２約２０μ２を１ＯＸｃｌａｌバツフアー１
０μＱ’Ｊ３よび水６０μｇに加えた。このプラスミド
ｐＴＰＡ１０２ＤＮＡ溶液に制限酵素Ｃ１ａｌ約ｌＯμ
ｅ（〜５０単位）を加え、得られた反応混合物を３７°
Ｃで２時間インキュベートした。Ｃ１ａＩ消化プラスミ
ドｐＴＰＡ１０２ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１Ｏ
ＸＥｃｏＲＩバッファー１０μＱおよび水８０μｅに再
懸濁した。このＣ１ａ！消化プラスミドｐＴＰＡ１０２
ＤＮＡ溶液に制限酵素ＥｃｏＲＩ！’７１０　μｇ（〜
５０単位）を加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。

ＥｃｏＲ［−Ｃ１ａ［消化プラスミドｐＴＰＡｌ。

２ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、７％ポリアクリル
アミドゲルに適用し、ｔｒｐＰｏを含有する〜２８８ｂ
ｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＣｌａＩ制限断片を他の消化産物か
ら分離した。〜２８８ｂｐ　ＥｃｏＲｒ　−Ｃ１ａｌ制
限制限をゲルから単離し、所望の断片約１μ９を得、Ｔ
Ｅバッファー５μＱに懸濁し、上で調製したＥｃｏＲｌ
−Ｃ１ａｌ消化プラスミドｐＫＣ７ＤＮＡ溶液に加えた
。次いでこのＤＮＡ混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ約２μ
Ｑ（〜１０００単位）を加え、得られたライゲーション
反応混合物を１６℃で２時間インキュベートした。ライ
ゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＲＣＤＮＡを構
成していた。

実質上、実施例２記載の方法に従い、ライゲートしたＤ
ＮＡで大腸菌Ｋ１２ＨＢ１０１コンピテント細胞を形質
転換した。形質転換細胞を１００μｙ／ｍｆ１アンピシ
リンを含有するし寒天プレートにより平板培養し、アン
ピシリン耐性形質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によリスクリーニングし、所望の大腸菌Ｋ１
２ＨＢ１０１／ｐＲＣコロニーを同定した。実質上、実
施例１記載の方法に従い、大腸菌Ｋ１２’ＨＢ１０１／
ｐＲＣ形質転換体からプラスミドｐＲＣＤＮΔを得た。

′ＦＥバッファー２μσ中のプラスミドｐＲＣＤ　ＮＡ
約２μ９をｌ□　ｘ　Ｈ１ｎｄｌｌバッフｙ−２ｔｔ（
ｌおよび水１６μＱに加えた。このプラスミドｐＲＣＤ
ＮＡ溶液に制限酵素Ｈｉｎｄｌｆｆ約２μｅ（〜１０単
位）を加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間イ
ンキュベートした。Ｈｉｎｄ［消化プラスミドｐＲＣＤ
ＮＡをエタノールで沈澱させ、ＬＯＸＢａｍＨＩバッフ
ァー２μＱおよび水１６μｅに再懸濁した。このＨｉｎ
ｄＩＩＩ消化プラスミドｐＲＣＤＮＡ溶液に制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ約２μＱ（〜１０単位）を加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。

Ｂ　ａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ消化プラスミドｐＲＣＤ
　Ｎ　Ａをフェノールで１回、クロロホルムで２回抽出
した。

ＤＮＡエタノール沈澱に付し、１０Ｘリガーゼバツフア
ー３μＱと水２０μＱに再懸濁した。次いで、このＢ　
ａｍＨ［−Ｈ１ｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐＲＣＤＮＡ
の溶液に、プラスミドｐＴＰＡ１０２の〜２０ｋｂ　Ｈ
１ｎｄｌｌｌ−Ｂ　ａｍＨＩ制限断片〜４μ９（ＴＥバ
ッファー〜５μσ中）を加えた。このＤＮＡｆ１合物に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ約２μＱ（〜１０００単位）を加え
、得られたライゲーション反応混合物を１６００で２時
間インキュベートした。ライゲートしたＤＮＡは所望の
プラスミドｐＴＰΔ１Ｑ３ＤＮＡを構成していた。

望ましくない形質転換体を減少するために、ライゲート
したＤＮＡを、ｐＴＰＡ１０３を切断しないがｐＲＣを
切断する制限酵素Ｎｃｏ［で消化した。線状ＤＮＡの大
腸菌形質転換開度は閉環された、環状ＤＮＡのそれより
も低いので、ライゲートしたＤＮＡのＮ　ｃｏ　Ｉ　ｉ
ＩＡ化によって、望ましくない形質転換か減少されるこ
とになる。ライゲートしたＤＮＡをｔ白化するには、ま
ず、ＤＮＡをエタノール沈澱に付し、１ＯＸＮｃｏ［バ
ッファー（１５Ｍ　ＮａＣ！、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＬ　ｐＨ７，８，６０ｍＭ　ＭｇＣＩ、、１ｍｇ／ｍ
１２ＢＳＡ）２１１Ｑおよび水１６μσに再懸濁した。

このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｎｃｏｌ約２μＱ（〜１０単
位）を加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間イ
ンキュベートした。

ライゲートした１表、Ｎ　ｃｏ　Ｔ　消化したＩＩＪＡ
で大腸菌に１２　　ＲＶ３０８（ＮＲＲＬ　　１３〜１
５６２４．１９８３年９月２８日寄託）を形質転換した
。

実質上、実施例３記戦の方法に従い、大腸菌に１２　　
ＲＶ３０８細胞をコンピテントｆａｌ＋胞にし、形質転
換した。形質転換混合物を１００μｇ／−アンピシリン
を倉イ１゛するし寒天プレートにより平板培養した。プ
ラスミドｐＲＣはカナマインン耐性を付与するが、プラ
スミドｐＴＰＡ１０３は付与しないので、アンビンリン
耐性形質転換体を、そのカナマイシンに対する感受性に
関して試験した。

次いで、アンピシリン耐性でカナマイシン感受性の形質
転換体を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、そのプラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析することにより大腸菌に１２
　　ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ１０３形質転換体を同定した
。大腸菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ１０３細胞か
ら、実質上、実施例１記載の方法に従い、プラスミドｐ
ＴＰＡ１０３ＤＮＡを単離した。

Ｂ、中間体プラスミドｐＢＷ２５の構築ＴＥバッファー
ｌμρ中のプラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮλ約１μ９を
ｌＱＸＢｇｌＩｒバッファー２μＱおよび水１６μＱに
加えた。このプラスミドｐＴＰΔ１０３ＤＮΔ溶液に制
限酵素Ｂｇｌｌｌ約ｌμＱ（〜５単位）を加え、得られ
た反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。

ＢｇｌＩＩ消化プラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、１０×タレノウバツフア一５μｇお
よび水４４μσに再懸濁した。このＢｇｌｌｌ消化プラ
スミドｐ、ＴＰＡ１０３ＤＮＡ溶液にフレノウ酵素約ｌ
μｅ（〜ｌ単位）を加え、得られた反応混合物を１６０
０で２時間インキュベートした。フレノウ処理した、Ｂ
ｇｌＩＩ消化プラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、ＩＯ×リガーゼバッファー３μＱおよ
び水２２μＱに再懸濁した。

フレノウ処理した、ＢｇｌｔＩ消化プラスミドｐＴＰＡ
１０３ＤＮＡ溶液に、式： で示されるキナーゼ処理されていないＮｄｅｌリンカ−
約２μｍ２（０，２μ９）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２μＱ
（〜１０００単位）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼｌμＱ（〜２
１位）を加え、得られたライゲーション反応混合物を４
°Ｃで一部インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡ
は、実゛質上、プラスミドｐＴＰＡＩＯと同一のプラス
ミドであるｐＴ　Ｐ　Ａ　Ｉ　Ｏ３ｄｅｒＮｄｅＩを構
成していた。プラスミドｐＴＰＡ１０３はＢｇｌＩ［認
識配列を有するがプラスミドｐＴＰＡ１０３　ｄｅｒＮ
ｄｅ　ｆはＮｄｅｌ認識配列を有する。

ライゲートしたＤＮＡを用い、実質上、実施例２記戦の
方法に従い、大腸菌に１２　　ＲＶ３０８コンピテント
細胞を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン含有
し寒天プレートにより平板培養し、プラスミドＤＮＡの
制限酵素分析によって大腸菌に１２　　ＲＶ３０８／ｐ
ＴＰΔ１０３ｄｅｒＮｄｅｌ形質転換体を同定した。プ
ラスミドｐＴＰＡ１０３　ｄｅｒＮ　ｄｅ　Ｉを、以後
の構築に用いるために、実質上、実施例１記戦の方法に
従い、形質転換体から単離した。

ＴＥバッファー１０μｅ中に入れたプラスミドｐＴ　Ｐ
Ａ　１０３ｄｅｒＮｄｅＩ　ＤＮΔ約１０μ９を１０×
ΔｖａＩＩバッフ−ｒ−（０，６Ｍ　ＮａＣ１，６０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，６０１Ｍ２−メル
カプトエタノール、１ｍｇ／ｍ１２Ｂ　Ｓ　Ａ）２　ｐ
Ｑおよび水６μｇに加えた。このＤＮＡに制限酵素Ａｖ
ａＩＩ約２μＱ（〜ｌＯ単位）を加え、得られた反応混
合物を３７００で２時間インキュベートした。

ＡｖａＩ［消化ＤＮＡをアガロースゲルに適用し、〜１
．４ｋｂ制限断片が制限消化産物から分離されるまで電
気泳動させた。ゲルからプラスミドｐＴＰ　Ａ　Ｉ　Ｏ
３ｄｅｒＮｄｅｌの〜１．４　ｋｂＡｖａＩＩ制限断片
を単離した。所望の断片約２μ９を得、ＴＥバッファー
５μＱに懸濁した。

ＩＯ×クレノウバッファー約５μ＋２．水３５μＱ１お
よびフレノウ酵素５μ１２（約５単位）を〜１．４ｋｂ
Ａｖａｉｌ制限断片溶液に加え、制限れた反応混合物を
１６°Ｃで３０分間インキュベートした。フレノウ処理
したＤＮＡをエタノール沈殿に付し、ＩＱｘリガーゼバ
ッファー３μＱと水１４μＱに再懸濁した。

式： で示されるＨ　ｐａ　Ｉリンカ−〜２μ９を、実質上、
実施例１０Ａ記載の方法に従ってキナーゼ処理した。キ
ナーゼ処理したリンカ−約１０μＱを、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ２μＱ（〜ｔｏｏｏ単位）、Ｔ４ＲＮＡリガーゼｌ
μＱ（〜ｌ単位）と−緒に、フレノウ処理したプラスミ
ドｐＴ　Ｐ　Ａ　Ｉ　Ｏ３ｄｅｒＮｄｅｌの〜１．４ｋ
ｂＡｖａｎ制限断片の溶液に加制限得られた反応混合物
を１６°Ｃで一夜インキユベートした。

ライゲートしたＤＮＡをフェノールで１回、クロロホル
ムで２回抽出し、エタノール沈殿に付したのち、１０Ｘ
ＥｃｏＲＩバツフアー２μＱと水１６μＱに再懸濁した
。制限酵素ＥｃｏＲＩ〜２μＱ（〜ｌＯ単位）をＤＮＡ
溶液に加え、得られた反応混合物を３７℃で２時間イン
キュベートした。

ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡをフェノールで１回、クロロホル
ムで２回抽出し、エタノール沈殿に付したのち、１０×
リガーゼバツフアー３μＱと水２０μＱに再懸濁した。

このようにした調製された、大きさ〜７７０ｂｐで卿Ｏ
とＴＰＡのアミノ末端をコードするこの断片は、−個の
ＥｃｏＲＩ適合性の末端と一個の平滑末端とを有してお
り、これをＥｃ。

Ｒ１−３ｍａｌ消化プラスミドｐＵｃ１９にライケート
シてプラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥを構築した。

プラスミドｐＵｃ１９（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リ−から入手可能）約２μＱを１０×ＳｍａＩバッフｙ
−（０，２Ｍ　ＫＣＬ　６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８，０１６０ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、６０ｍＭ２−メル
カプトエタノール、１ｍｇ／ｍｉ’ＢｓＡ）２．１１お
よび水１６μＱに加えた。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｓ
　ｍａ　ｒ約２μ１２（〜１０単位）を加え、得られた
反応混合物を２５°Ｃで２時間インキュベートした。Ｓ
　ｍａ　Ｉ消化プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、遠心して集め、ｌ０ＸＥｃｏＲＩバツフ
アー２μＱおよび水１６μＱに再懸濁した。このＳ　ｍ
ａ　Ｉ　？Ｉ肖白化プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ溶液に
制限酵素ＥｃｏＲ［約２μＱ（〜１０単位）を加え、得
られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートし
た。ＥｃｏＲｒ−３ｍａｌ消化プラスミドｐＵｃ１９Ｄ
Ｎ八をフェノールで１回、クロロホルムで２回抽出し、
ＴＥバッファー５μＱに再懸濁した。

ＥｃｏＲＩ−３ｍａ１１肖化プラスミドｐＵｃ１９ＤＮ
Ａを、プラスミドｐＴＰＡ　ｌ　０３ｄｅｒＮｄｅｌか
ら導かれた〜７７０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ平滑末端制限断片
を含有する溶液に加えた。このＤＮＡ混合物にＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ約２μＱ（〜１０００単位）を加え、得られ
た反応混合物を１６°Ｃで一夜インキユベートした。ラ
イゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＵｃ１９ＴＰ
ＡＦＥを構成していた。

プラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥの構築に利用したＥｃ
ｏＲ１認識配列とＳ　ｍａ　［認識配列を含む、プラス
ミドｐＵｃ１９の慢数のクローニング部位は１ａｃＺα
断片の暗号配列の中に位置している。１ａｃＺΔＭ１５
突然変異（β−ガラクトシダーゼをコードする１ａｃＺ
遺伝子における突然変′Ａ）を有する細胞内でｌａｃ　
Ｚα断片が発現すると、機能的なβ−ガラクトンターゼ
分子が発現されるので、そのような細胞は、無色の化合
物であるＸ　−ｇａｌ（５ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄガラクトピラ／ジッド）を加水分解し
てインンゴ色の加水分解産物とすることができる。プラ
スミドｐＵｃ１９のｍ数のクローニング部位にＤＮＡを
挿入すると、１ａｃＺα断片の暗号配列か中断され、そ
のようなプラスミドの宿主である１ａｃＺΔＭ１５突然
変異を有する細胞はＸ　−ｇａｌを加水分解し得ない。

プラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥを構成するライケート
したＤＮＡを用い、実質上、実施例３記載の方法に従い
、形質転換にコンピテントな大腸菌Ｋ１２　　ＲＲＩ△
Ｍ１５（ＮＲＲＬＢ−１５４４０，１９８３年３月２７
日寄託）細胞を形質転換した。

形質転換細胞を１００　ｔｔｇ／ｍＱアンピシリン、４
０　μ９／１１（ｌ　Ｘ−ｇａｌ、および１ｍＭＩＰＴ
Ｇを念イイするｌ７−）゛ロスにより、平（反培養した
。４７７３色を呈しなかったコロニーを継代培養し、プ
ラスミドＤＮＡの調製に用いた。プラスミドＤＮＡの制
限酵素分析によって大腸菌ＫＩ２ＲＲ１ΔＭ１５／ｐＵ
ｃ１９ＴＰＡＦＥ形質転換体を同定した。以後の構築に
備えて、実質上、実施例１記載の方法に従い、大腸菌に
１２　　ＲＲＩ△Ｍ１５／ｐＵｃ　ｌ　９ＴＰＡＦＥ細
胞からプラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥＤＮＡを単離し
た。

ＴＥバッファー２０μσ中に入れたプラスミドｐＵＣ１
９ＴＰＡＦＥ約７μ９を１ＯＸＨｐａｌバ・７フアー（
０，２Ｍ　ＫＣＩ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ
７，４、Ｏ、］　Ｍ　ＭｇＣｌ　２）　ｌ　ＯμＱおよ
び水７０μｇに加えた。このプラスミドｐＵｃ１９ＴＰ
ＡＦＥ　ＤＮＡ１８ｉ（ＪＥに制限酵素Ｈｐａｌ約３μ
１２（〜６単位）を加え、得られた反応混合物を３７°
Ｃで２０分間インキュベートした。Ｈｐａ１部分消化を
行うために反応時間を短（した。反応混合物をＩＸＢａ
ｍＨ［バッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，１０ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、
ＩＩ　ｐａ　Ｉを不活化するために塩濃度を高めた）１
５０μＱに調節した。この部分的）（ｐａ　Ｉ消化プラ
スミドｐＵＣｌ　９ＴＰＡＦＥ　　ＤＮＡの溶液に、制
限酵素Ｈｐａ’ｌ　　約ｌμｇ（約１６単位）を加え、
得られた反応混合物を３７℃で９０分間インキュベート
した。

ＢａｍＨＩ一部分的Ｈｐａｌルミｌ消化プラスミド１９
ＴＰΔＦＥ　　ＤＮＡをエタノール沈澱によって濃縮し
、１．５％アガロースゲルに適用し、レプリコン、β−
ラクタマーゼ遺伝子およびプラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡ
ＦＥのＴＰＡをコードするＤＮＡ全部を含有する〜３．
４２ｋｂ　Ｈｐａｌ　−ＢａｍＨ１制限断片を、所望の
断片を含有するセグメントをゲルから切り取り、該セグ
メントを凍結し、セグメントから液体を絞り取ることに
より、ゲルから単離した。エタノール沈殿によってＤＮ
Ａを液体から沈殿させた。所望の断片約１μ９を得、Ｔ
Ｅバッファー２０μσに懸濁した。

ＴＥバッファー１０μρ中に入れたプラスミドｐＴＰＡ
Ｉ０３　約１０ｔｔｑを１ＯＸｓｃａｌバツフアー（１
，ＯＭ　ＮａＣ１１６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐｆ
（７，４，６０ｍＭ　ＭｇＣＩ７、ｌｏｍＭ　ＤＴＴ、
ｌａｇ／ｍＱＢ　Ｓ　Ａ）　　ｌ　ＯＩｄｌおよび水８
０．ｃｌに加えた。

このプラスミドｐＴＰＡ１０３　ＤＮＡ溶液に制限酵素
５ｃａｌ約３μＩ２（〜Ｉ８単位）を加え、得られた反
応混合物を３７°Ｃで９０分間インキュベートした。反
応容量をｌＸＢａｍＨＩバッファー１５０ｕＱに調節し
、制限酵素ＢａｍＨＩ約１μＱ（〜１６単位）をこの混
合物に加え、３７°Ｃで９０分間インキュベートした。

ＤＮＡをエタノール沈殿に付し、遠心して集め、電気泳
動用の調製物に再懸濁した。Ｓｃａｌ−ＢａｍＨＩ消化
プラスミドｐＴＰＡ１０３ＤＮ八を１．５％アガロース
ゲルに適用し、〜１．０１５ｋｂ　５ｃａｌ　−Ｂａｍ
ＨＩ制限断片を、他の消化産物から１１１離した。プラ
スミドｐＴＰＡ１０３の′ｒＰΔカルボキ／末端をコー
ドするＤＮＡを含有する〜１．Ｏ１５ｋｂ　５ｅａｌ　
−Ｂａｉｔ（Ｉ制限断片をゲルからｔ４ａ離した。所望
の断片約０．５μ９を得、ガラス−蒸留水２０μｇに溶
解した。

プラスミドｐＵｃ１９ＴＰＡＦＥの〜３．４２ｋｂ　Ｂ
ａｍＨ［−１（ｐａｌ制限断片約２μσを、１０×Ｊガ
ーセバッファ−２μＱおよびＴ４ＤＮＡリガーセ１μＱ
（〜ｌワイス（Ｗｅｉｓｓ）単位、プロメガ・バイオチ
ク、２８００　Ｓ、　Ｆ　ｉｓｈ　Ｉｆａｔｃｈｅｒｙ
　Ｒｏａｄ。

Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗ　Ｉ　５３７１１　）と−緒に加
え、得られた反応混合物を１６℃で一部インキユベート
した。ライゲートシたＤＮＡは所望のプラスミドｐＢＷ
２５を構成していた。

ライゲートしたＤＮＡを用い、工程に５０ｍＭＣａ　Ｃ
ｌ　ｔを用いる外は、実質上、実施例３記載の方法に従
い、大腸菌Ｋ１２　　ＪＭ１０５（ＢＲＬから人手可能
）を形質転換した。形質転換細り包を１００ｕｙ／ｍＱ
アンピシリンを含有するＢＨＩ（ＤｉｆＣＯラボラ！・
リー、デトロイト、Ｍｌ）により平板培養し、大腸菌Ｋ
１２　　ＪＭ１０５／ｐＢＷ２５形質転換体を、そのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。制限
酵素ＥｃｏＲＩでプラスミドｐＢＷ２５を消化すると、
〜３．３８ｋｂおよび〜１．０８ｋｂの制限断片が得ら
れる。以後の構築に用いるために、実質上、実施例１記
載の方法に従い、プラスミドｐＢＷ２５を調製した。

Ｃ，ＴＰＡコード化領域の部位特異的突然変異誘発およ
びプラスミドｐＢＷ２８の構築 ガラス蒸留水ｌＯμＱ中のプラスミドｐＢＷ２５約５μ
９をＩＱｘＨｉｎｄｌｎ反応バッファー約１０μＱおよ
び水８０μｇに加えた。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ約ｌμ
ｅ（〜２０単位）をプラスミドｐＢＷ２５の溶液に加え
、得られた反応混合物を３７°Ｃで９０分間インキュベ
ートした。制限酵素ＥｃｏＲ［約３μＱ（〜２４単位）
およびｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　、　ｐＨ７６を［ｌ
１ｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐＢＷ２５ＤＮＡ７８液に
加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで９０分間インキ
ュベートした。Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ消化プ
ラスミドｐＢＷ２５ＤＮＡをエタノール沈殿によって濃
縮し、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、〜８１
０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ制限断片を制限
消化産物から単離した。〜８１０ｂｐ　ＥｃｏＲＩＨｉ
ｎｄ［［制限断片をゲルから単離し、ライゲーション用
に調製し、ガラス蒸留水２０μＱに再懸濁した。

ガラス蒸留水３５μρ中の複製型（ＲＦ）のＭ１３ｍｐ
８ＤＮＡにュー・イングランド・パイラボから入手可能
）約４．５μ９を１０　ｘ　Ｈ１ｎｄｌｌｌバツフアー
１０μＱおよび水５５μ夕に加えた。制限酵素１１ｉｎ
ｄ１１１約ｌμＱ、（〜２０単位）をＭ１３ｍｐ８ＤＮ
Ａ溶液に加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで１時間
インキュベートした。制限酵素ＥｃｏＲＩ約３μｍ：〜
２４単位）とＬＭ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ、ｐＨ７，６約
ＬＯμＱをＨｉｎｄ［消化Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡ溶液に加
え、得られた反応混合物を３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。Ｈ１ｎｄｌＩＩ　−Ｅ　ｃｏＲＩ消化Ｍ１３
ｍｐ８ＤＮＡをエタノール沈殿によって収集し、アガロ
ースゲル電気泳動用調製物に再懸濁し、ゲル電気泳動に
よって大きい制限断片を単離した。

Ｍ１３ｍｐ８の大きいＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ
制限断片約制限ｇを得、ガラス蒸留水２０μσに懸濁し
た。

Ｍ１３ｍｐ３の大きいＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ
制限断片約制限Ｑ、１０×リガーゼバツフアー２μσ、
水１２μＱおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ〜１μＱ（〜ｌワ
イス単位）をプラスミドｐＢＷ２５の〜８１ＯｂｐＥ　
ｃｏＲｌ　−Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ制限断片に加え、得られた
ライゲーション反応混合物を１６°Ｃで一部インキユベ
ートした。

大腸菌ＪＭ１０３細胞（ＢＲＬから入手可能）をコンピ
テント細胞とし、トランスフェクション当たりのＤＮＡ
使用量が異なる外は、実質上、ＢＲＬ　Ｍ１３クローニ
ング／“ジデオキシ′配列決定法の手引き（Ｂ　ＲＬ　
Ｍ　１３　　Ｃｌｏｎｉｎｇ／　’Ｄ　１ｄｅｏｘｙ’
　Ｓ　ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　　ｒ　ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ　Ｍａｎｕａｌ）に従って、ライゲーション混合物で
トランスフェクトした。

β−ガラクトシダーゼα−断片−コード化遺伝子の挿入
による不活化（それによってＸ　−ｇａｌ開裂能力を失
い、インジゴ色した開裂産物を与えることができなくな
る）に基づいて、組換え体プラークを同定した。配列決
定用に、６個の白色プラークをＬブロス２．５ｍ（２に
拾いあげ、ｐｒｏＡ　Ｂを担持するＦエピソームの維持
を保証するために最小培地ストック中で培養された、対
数増殖期の大腸菌に１２　　ＪＭＩ０３（０，４ｍｆ２
）を加えた。プラーク含有溶液を空気振盪機により３７
°Ｃで８時間インキュベートした。１．５ｍｆ２づつを
とり、その細胞をペレット化し、実質上、バーンボイム
とドーリ−のアルカリ性ミニスクリーン法（Ｎｕｃ、Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７：１５１３．１９７９年）に従い、ＤＮＡを単離した
。各培養物の残りはストック用として４°Ｃで保存した
。所望のファージ（ｐＭ８ＢＷ２６と命名）は、Ｍ１３
ｍｐ８の〜７．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ
制限断片にラ制限−トしたプラスミドｐＢＷ２５の〜８
１０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄ［ＩＩ制限断片を
含有していた。

対数増殖期の大腸菌ＪＭ１０３約５０ｍ（２をｐＢＷ２
６でトランスフェクトし、空気振盪機によって３７°Ｃ
で１８時間インキュベートした。低速遠心によってトラ
ンスフェクトした細胞をペレット化し、教示手引書に示
された規模を拡大し、培養上清から一本鎖ｐＢＷ２６Ｄ
ＮＡを調製した。室温で３０分間、３７°Ｃで６０分間
、次いで、ｌＯｏＣで１８８時間フレノウ応を行う外は
、実質上、アデルマンら（Ａｄｅｒｍａｎ）（１９８３
、ＤＮＡ２（３）：　１８３−１９３）の方法に従い、
−本漬ｐＢＷ２６を突然変異させた。さらに、２０°Ｃ
でＳｌ処理を行い、バッファーの塩濃度を業者の指示濃
度の１／２とし、Ｍ１３配列決定プライマー（Ｂ　ＲＬ
）を用いた。固有のＴＰＡのアミノ酸残基８７から２６
１までをコードする配列を欠失するために用いられた合
成オリゴデオキシヌクレオチドプライマーは、式： ％式％ 実質上、上記の感染法に従い、得られた突然変異反応混
合物を用いて大腸菌に１２　　ＪＭ１０３をトランスフ
ェクトした。ＲＦ　　ＤＮＡの制限酵素分析とマキシム
（Ｍａｘｉｍ）およびギルバート（Ｇｉ＋ｂｅｒｔ）の
ＤＮＡ配列決定法により、所望の突然変異体を同定した
。固有のＴＰＡのアミノ酸残基８７−２６１を欠失した
配列を有する所望の突然変異体を９Ｍ８ＢＷ２７と命名
した。

プラスミドＰＢＷ２８の構築には、様々なりＮＡ断片が
必要であった。これらの断片の第１を得るために、ガラ
ス蒸留水２０μａ中のＲＦｐＭ８ＢＷ２７ＤＮＡ　〜２
０１１９を１０ＸＮｄｅｌバツフアーｔｏｌｔ（ｌと水
６０μＱに加えた。このプラスミドｐＭ８ＢＷ２７ＤＮ
Ａの混合物に制限酵素Ｎｄｅｌ約１０μ゛σ（〜５０単
位）を加え、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間イ
ンキュベートした。ＮｄｅＩ消化プラスミドｐＭ８ＢＷ
２７ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心して収集し、
１０ＸＥｃｏＲＩバツフアー１０μＱと水９０μｅに再
懸濁した。

Ｎｄｅ［消化プラスミドｐＭ８ＢＷ２７ＤＮＡ溶液に制
限酵素ＥｃｏＲＩ約１０μＱ（〜５０単位）を加え、得
られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートし
た。ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ消化プラスミドｐＭ８ＢＷ２
７ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＴＰＡ暗号
配列の欠矢部泣の配列を包含する部分を含有する〜５６
０ｂｐ　Ｎｄｅｌ　−ＥｃｏＲＩ制限断片を他の消化産
物から分離した。ゲルから〜５６０ｂｐＮｄｅｌ　−Ｅ
ｃｏＲＩ制限断片を単離し、所望の断片約０．５μ９を
得、ガラス蒸留水２０μｅに懸濁した。

プラスミドＰＢＷ２８の構築に必要な第２の断片は、自
動ＤＮＡ合成機で合成された際には一本鎖である。ハイ
ブリダイズされてＸｂａｌおよびＮｄｅｌオーバーラツ
プを有する二本鎖ＤＮＡセグメントを形成する相捕的な
２本の鎖を、実質上、実施例２の方法に従い、キナーゼ
処理し、アニーリングする。該リンカ−は、式： で示される配列を有する。

プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な第３の断片は、Ｔ
Ｅバッファー２０μｌ中に入れたプラスミドルＴＲＡ１
０３約２０μ２をｌＯＸ１０ＸＢａバッｄｅＩ ファー１０μＱおよび水６０μＱに加えて調製した。

プラスミドｐＴＲＡ１０３ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ約１０ｕＱ（〜５０単位）を加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。Ｂａｍ
ＨＩ消化プラスミドｐＴＲＡ１０３ＤＮＡをエタノール
沈殿させ、遠心して集め、ｌＯ×ｒシｃｏＲＩバッファ
ー１０μＱと水８０１１Ｑに再懸濁した。ＢａｍｔＩＩ
消化プラスミドｐＴＲＡ１０３ＤＮへの溶液に制限酵素
ＥｃｏＲＩ約１０μＱ（〜５０単位）を加え、得られた
反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベートした。Ｂ
ａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩメ白化プラスミドｐＴＲΔ１０
３　ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＴＰＡの
カルボキシ末端をコードする配列を含有する〜６８９ｂ
ｐＥｃｏＲＩ　　ＢａｍＨＩ制限断片を他の消化産物か
ら分離した。ゲルから〜６８９ｂｐ断片約０．５μ９を
単離し、ガラス蒸留水ｌＯμＱに懸濁した。

プラスミドｐＢＷ２８の構築に必要な最後の断片は、プ
ラスミｊ’ｐＬ　ｌ　ｔｏ（実施例９に構築方法が記載
されている）から単離された。ＴＥバッファー２５μρ
中に入れたプラスミドｐＬ　１１０約２５μ９を１０Ｘ
Ｘｂａｌバツフアー（０，５Ｍ　ＮａＣ１゜６０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，９，６０ｍＭＭｇＣｌ、、
１　ｍｇ／ｍＩＢ　Ｓ　Ａ）　ｌ　Ｏｕ（ｌおよび水５
５μＣに加えた。このＤＮＡに制限酵素Ｘｂａｌ　　約
ｌＯμｍ２（〜５０単位）を加え、得られた反応混合物
を３７°Ｃで２時間インキュベートした。Ｘｂａ［消化
プラスミドｐＬ１１０ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、
遠心して収集し、１０Ｘ１０ＸＢａバツフアーｌＯ／、
ｔｇおよび水８９μｇに再懸濁した。このＸｂａ［消化
プラスミドｐＬ１１０ＤＮＡ溶液に制限酵素ＢａｍＨＩ
約１μＱ（〜５単位）を加え、得られた反応混合物を３
７°Ｃで３０分間インキュベートし、ＢａｍＨＩで部分
消化した。Ｘｂａｌ一部分的ＢａｍＨＩ消化プラスミド
ｐＬ１１０ＤＮＡをアガロースゲルに適用し、〜６．Ｏ
ｋｂ　ＸｂａＩ　−ＢａｍＨＩ断片が他の消化産物から
明確に分離されるまで電気泳動させた。ゲルから〜６．
Ｏｋｂ制限断片を制限した。〜６．Ｏｋｂ　Ｘｂａｌ　
−Ｉ３ａｍＨＩ制限断片約０．５μ９を得、ガラス蒸留
本釣４０μＱにＱｉｌした。この〜６．Ｏｋｂ　Ｘｂａ
ｌ　−ＢａｍＨ［制限断片はＥ　Ｋ　−Ｂ　Ｇ　Ｉ（を
コードするＤＮＡ以外の全プラスミドｐＬ１１０を含有
している。

プラスミドｐＢＷ２８の構築のために、以下の断片を混
合した。プラスミドｐＬ１１０の〜６．Ｏｋｂ　Ｂａｍ
Ｈ１−Ｘｂａｌ制限断片約０．１Ｍｇ（〜８μＱ）、プ
ラスミドｐＭ８［３Ｗ２７の〜５６０ｂｐ　Ｎｄｅｌ−
ＥｃｏＲＩ制限断片約０．０５μ９（〜２μＱ、）、プ
ラスミドｐＴＲＡ１０３の〜６８９ｂｐ　ＥｃｏＲｒＢ
ａｍＨＩ制限断片約０．１μ９（〜２μＱ）および〜４
５ｂｐ　ＸｂａＩ　−ＮｄｅＩ　合成リンカ−約０．０
２μ９（〜１μＱ）。このＤＮＡ混合物に１０×リガー
セパノフアー約２μＱおよび’Ｆ４ＤＮＡリガーゼ１μ
ａ（〜ｌワイス単位）を加え、得られたライゲーンジン
反応混合物を４°Ｃで一部インキユベートした。ライゲ
ートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＢＷ２８を構成し
ていた。

ライゲートしたＤＮＡを用い、工程に５０ｍＭＣａＣ１
，を用いる外は、実質上、実施例３記載の方法に従い、
コンピテント細胞とした大腸菌に１２　　ＭＭ２９４（
ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５６２５，１９８３年９月２８日寄
託）を形質転換した。プラスミドｐＢＷ２８上にはラム
ダｐＬプロモーターと温度感受性のラムタｐＬリプレッ
サーをコードする遺伝子が存在することにより、形質転
換工程および形質転換体の培養はやや異なっていた。形
質転換工程の間およびその後の培養期間中、細胞を３２
°Ｃ以」二の温度にさらすことはなかった。所望の大腸
菌Ｋ　ｌ　２　ＭＭ２９４／ｐＢＷ２８形質転換細胞を
テトラサイクリン耐性、アンピシリン感受性表現型およ
びそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定し
た。

Ｄ、プラスミドｐＢＷ３２の最終構築 プラスミドｐＳ　ｖ　２−β−グロビンＤＮＡ（ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１５９２８，１９８５年１月２９日寄託）約１
０μ９をＩＱｘＨｉｎｄｌｌＩ反応バッファー１Ｏｔｔ
Ｑ、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ　５　ｕ　（（〜５０単位
）および水８５μ夕に溶かし、得られた反応混合物を３
７℃で２時間インキュベートした。次いで反応混合物を
ＬｉＣ１，０，１，５Ｍに調節し、２．５容量のエタノ
ールを加えてドライアイス−エタノール浴中でインキュ
ベートした後、遠心してＤＮＡをペレット化した。

ＤＮＡペレットをｌＱＸＢｇｌＩ［バッファー１０μＱ
、制限酵素Ｂｇ１１１　５μｇ（〜５０単位）および水
８５μｅに溶かし、得られた反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。Ｂｇｌｌｌ消化の後、反応混
合物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、断片を分離
させた。臭化エチジウム染色し、紫外線照射下に観察し
、所望の〜４　、２　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩＢｇｌｌＴ
制限断片を前記のごとくゲルから単離した。

ペレットを水１０μＱに再懸濁すると、プラスミドｐｓ
ｖ２−β−グロビンの〜４　、２　ｋｂ　ＨｉｎｄｎＴ
−ＢａｍＨＩ制限断片制限μ９を構成していた。ＴＰＡ
をコードするプラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２゜Ｏｋｂ
Ｈ１ｎｄｒｌＩ−Ｂ　ａｍＨＩ制限断片を実質上、既述
の方法に従ってプラスミドｐＴＰＡ１０３から単離した
。プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２．０ｋｂＩＩ　１ｎ
ｄｌＴＩ　−Ｂ　ａｍＨｌ制限断片約５μりを得、水１
０μＱに懸濁し、−２０’Ｃで保存した。

プラスミドｐＳ　Ｖ　２−β−グロビンの〜４．２ｋｂ
Ｈｉｎｄ［ＩＩ　−Ｂ　ｇ側断片２ｕ（１，プラスミド
ｐ’ｒ　Ｐ　ＡｌＯ３の〜２　、　ＯｋｂＨ１ｎｄｌＩ
［−Ｂ　ａｍＨＩ断片４μσを合し、１０×リガーゼバ
ツフアー２μσ、水１１μＱ、およびＴ４．ＤＮＡリガ
ーゼ１Ｍｇ（〜５００単位）と−緒に４°Ｃで一部イン
キュベートシタ。

ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドｐＴＰＡ３０
１を構成していた。ライゲートシたＤＮＡを用いて実質
上、実施例３記載のごとくにしてコンピテント細胞とし
た大腸菌に１２　　ＲＲＩ細胞（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５２
１０）を形質転換した。実施例１記載の方法に従い、プ
ラスミドＤＮＡを大腸菌Ｋ　１２　　ＲＲｌ／ｐＴＰＡ
　ｌ　０３から得た。

プラスミドｐＳ　Ｖ　２　　ｄｈｆｒは形質転換された
真核性細胞の選択およびｄｈｆｒ遺伝子と共有結合的に
結合したＤＮＡの増幅に有用である。プラスミドｐＳ　
Ｖ　２−ｄｈｆｒ（大腸菌に１２　ＨＢ　１０１．／ｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒ、　ＡＴＣＣ３７１４６から単離）を
１０ｘＰｖｕ［［バッフ−ｔ−１ＯａＱ、　ＰｖｕｌＩ
制限酵素２μＱ（〜２Ｑ単位）および水８８μＱと混合
し、得られた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキュベ
ートした。フェノールおよびクロロホルム抽出によって
反応を止め、ＰｖｕＩＩ消化プラスミドｐＳ　Ｖ　２−
ｄｈｆｒＤＮＡを沈殿させ、遠心して収集した。

以下の工程に従ってＢａｍＨＩリンカ−（５°−ＣＧＧ
ＡＴＣＣＣＧ−３°）をキナーゼ処理し、以下のごとく
にライゲーションに備えた。水５μσ中のリンカ−１μ
９に、５Ｘキナーゼ塩（３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐｔ１７．８．５０　ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、２５ｍＭ　Ｄ
　Ｔ　ＴＮ　ＯｔｔＱ、５ｍＭＡＴＰ５μ＆、１ｍ！／
／ｍＱＢ　Ｓ　Ａ　５　ｔｔＱ、　　ｌ　０ｍＭスペル
ミジン５ｕＱ。

水１９μｇ、およびｌＯ単位／μＱポリヌクレオチドキ
ナーゼ１ｔｔＱを加えた。次いで、この反応混合物を３
７°Ｃで６０分間インキユヘートした後、２０℃で保存
した。Ｐ　ｖｕ　Ｕ　ｉｌ！４化プラスミドｐＳＶ　２
−ｄｈｒｒ５μσ（〜５μｇ）およびキナーゼ処理した
ＢａｍＨ［リンカ−１２ｕ、Ｑ＜　〜、　２５μｇ）を
混合し、水１１μＱ、１０×リガーゼバツフアー２μσ
、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（〜１０００単位）
と−緒に１６℃で一部インキユベートした。

１、ＯＸＢａｍＨ［反応バッフｙ−１０１ｔ（１，Ｂａ
ｎＨ１制限酵素１０μｅ（〜５０単位）、および水４８
μＱをこのライゲーション反応混合物に加え、３７℃で
３時間インキュベートした。反応混合物を１％アガロー
スゲルに適用し、ｄｈｆｒ遺伝子を含有する所望の〜１
．９ｋｂ断片をゲルから単離した。

本明細書記載の全実施例におけるリンカ−の付加反応で
は、最終ベクター中に複数のリンカ−配列が存在する可
能性を減するために、常に、アカロースゲルによる精製
を行った。断片〜３μ９を得、ＴＥバッファー１０μρ
に懸濁した。

次いで、プラスミドｐ、ＴＰＡ３０１約１５μｍ２（〜
ｌμ９）を、上記のごとく、制限酵素Ｂａｍ１−１１で
消化した。プラスミドｐＴＰＡ３０１は唯一のＢａｎ［
Ｉ［部位を含有するので、この消化によって線状プラス
ミドｐＴＰＡ３０１ＤＮ八が生成される。

ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＴＰＡ３０１をエタノール
沈殿に付し、水９４μＱに再懸濁し、ウシ腸アルカリホ
スファターゼ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ
ａｃｈ、　　Ｉ　ｎｃ、、　　ｌ　２８　　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　５ｔｒｅｅｔ、　　Ｌｅｘｉｎｇｔ。

ｎ、　ＭＡ　０２１７３）ｌｕＱ、および１ＭＴｒｉｓ
ＨＣｌ、　ｐＨ９，０（５μｇ）を用い、６５℃で４５
分間りん酸化処理した。ＤＮＡをフェノール：クロロホ
ルム抽出、次いで、クロロホルム：イソアミイルアルコ
ール抽出の後、エタノール沈澱に付し、水２０μＱに懸
濁した。りん酸化プラスミドｐＴＰΔ３０１（１０μＣ
，〜０．２５μｇ）をＢａｍＨＩ、ｄｈｆｒ遺伝子含有
制限断片５　μ＆（〜１．５　μｇ）、１０Ｘリガーゼ
バツフアー３μＱ１水９μＱ１およびＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼ３μＱ（約１５００単位）に加えた。得られたライ
ゲーション反応混合物を１５℃で一部インキュベートシ
た。ライゲートしたＤＮＡは所望のプラスミドＰＴＰＡ
３０３ＤＮＡを構成していた。

プラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　３０３を用い、大腸菌に１
２　　ＲＲＩ（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５２１０，１９８２
年１０月１９日寄託）を形質転換し、得られた大腸菌Ｋ
　１２　ＲＲ１／ｐＴＰＡ３０３形質転換体をそのアン
ピシリン耐性表現型とプラスミドＤＮＡの制限酵素分析
により、同定した。実質上、実施例１記載の方法に従っ
て形質転換体からプラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　３０３を
単離した。

ｐＢ　Ｒ３２２レプリコンとβ−ラクタマーゼ遺伝子を
コードする〜２．７　ｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ
制限断片をプラスミドｐＴＰＡ３０１から単離するため
に、プラスミドｐＴＰＡ３０１約ｌＯμ９を全反応容量
を４００μｅとし、ＩＸＢｇｌ■バッファー中、制限酵
素ＢｇｌＩ１２０単位で３７°Ｃにおいて完全消化した
。ＢｇｌＩＩ消化の後、Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣｌ濃度を１
１０ｍＭに調節し、このＢｇｌｌＩ消化ＤＮＡにＥｃｏ
ＲＩ制限酵素２０単位を加えた。３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。ＥｃｏＲＥ　−ＢｇｌｌＩ消化ＤＮＡ
をアガロースゲルに適用し、所望の〜２゜７　ｋｂＥｃ
ｏＲＩ　−Ｂｇｌｎ制限断片が他の消化産物から分離す
るまで電気泳動させ、〜２．７ｋｂ制限断片を制限し、
ライゲーションに備えた。

ｄｈｆｒ遺伝子を含有する制限断片を単離するために、
プラスミドｐ’ｒ　Ｐ　Ａ　３０３をＨｉｎｄＩＩｌお
よびＥｃｏＲＩ制限酵素で２重消化し、ｄｈｆｒ遺伝子
を含有する〜２３４０ｂｐＥｃｏＲＩ　−［（ｉｎｄｌ
制限断片を単離し、回収した。

ＴＰＡのカルボキシ末端と５Ｖ４Ｑプロモーターをコー
ドする領域を含有するプラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２
　ｋｂ　Ｈｉｎｄ［［−３ｓｔｌ制限断片を単離するた
めに、プラスミドｐＴＰＡ３０３を、ＩＸＨｉｎｄ［Ｉ
バッファー中、ＨｉｎｄＩＩ［および５ｓｔｌ制限酵素
により、完全消化した。ゲルから〜１．７ｋｂ断片を単
離し、ライゲーションに備えた。

改変されたＴＰＡのアミン末端をコードする領域を含む
、プラスミドｐＢＷ２８の〜６８０ｂｐＸｈｏｆ（Ｂｇ
ｌＩＩオーバーラツプとのライゲーションに適合性を有
する）　−Ｓ　ｓｔ　Ｉ制限断片を単離するために、プ
ラスミドｐＢＷ２８約１０μｙを１ＸＸｈ。

■バッフｙ　　（０，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ［（
８，０，０、Ｉ　Ｍ　ＭｇＣＩ２、Ｏ，ＩＭ　Ｔｒｉｔ
ｏｎ　Ｘ−１００、およびｌ　ＩＲｇ／ｒｎＱ　Ｂ　Ｓ
　Ａ）中、制限酵素ＸｈｏＩ［で完全消化した。Ｘｈｏ
ＩＩ消化ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収した後、
Ｓｓ口酵素で完全消化した。

ＸｈｏＩＩ　　５ｓｔｌ消化ＤＮＡをアクリルアミドゲ
ルに適用し、所望の断片をゲルから単離し、ライゲーシ
ョンに備えた。

上記各断片約０．１μ９づつ、即ち、プラスミドｐＴＰ
Ａ３０１の〜２．７　ｋ、ｂ　ＥｃｏＲ，Ｉ　−Ｂｇｌ
　ＩＩ制限断片、プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２．３
４ｋｂＥ　ｃｏＲｒ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ制限断片、制限
スミドｐＴＰＡ３０３の〜１．７　ｋｂ　Ｓ　ｓｔ　Ｉ
　−Ｈ１ｎｄｌｌＩ制限断片、制限びプラスミドｐＢＷ
２８の〜０．６８　ｋｂ　Ｓ　５ｔ１−Ｘｈｏｌｌ制限
断片をライゲートし、プラスミドｐＢＷ３２を構築した
。ライゲーション混合物を用い、工程にＣａＣ１＝を用
いる外は、実質上、実施例３記載の方法に従って大腸菌
に１２ＭＭ２９４を形質転換した。形質転換体をそのア
ンピシリン耐性表現型とプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析により、同定した。実質上、実施例１記載の方法に従
って大腸菌Ｋ　ｌ　２　ＭＭ２９４／ｐＢＷ３２形質転
換体からプラスミドｐＢＷ３２ＤＮＡを単離した。

実施例２０　プラスミドｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣ
ｈｄ２の構築 プラスミドｐＢＷ３２約２０μ９（Ｔ　Ｅバッファー２
０ｕｒｌ中）をｌＯＸ１０ＸＢａバッファー１０μｇお
よび水６０μＱに加えた。制限酵素ＢａｍＨＩ約１０μ
ｇ（約５０単位）をこのプラスミドｐＢＷ３２ＤＮＡ溶
液に加え、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートした。ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＢＷ３２を
エタノール沈殿に付し、遠心して収集し、１０Ｘタレノ
ウバツフアー５μＱ１水４５μＱおよびフレノウ酵素約
２μσ（〜１００単位）に再懸濁した。反応混合物を１
６°Ｃで３０分間インキュベートした後、反応混合物を
アガロースケル電気泳動にかけ、消化産物が明瞭に分離
するまで泳動させた。フレノウ処理した、ｄｈｆｒ遺伝
子を含有するプラスミドｐＢＷ３２の〜１．９ｋｂＢａ
ｍＨＩ制限断片をゲル７！りら単離し、実質上、実施例
１５Ａ記載の方法に従い、ライゲーションに０ｉｉｉえ
た。所望の断片約４μ９を得、ＴＥバッファー５μＱに
懸濁した。

′ＦＥバッファアー１００μρ中のプラスミドｐＬＰ　
Ｃｈｙｇ　１　約２００μｙを１ＯＸＥｃｏＲＩバ’）
＋７７−１５μＣおよび水３０μＱに加えた。このプラ
スミドｐＬＰｃｈｙｇｌＤＮＡ反応溶液に制限酵素Ｅｃ
ＯＲＩ　約５μｅ（〜５０単位）を加え、得られた反応
混合物を３７°Ｃで約３０分間インキュベートした。

この短い反応時間は、ＥｃｏＲＩによる部分消化のため
に算出された。プラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　ｌは２
個のＥｃｏＲＩ制限部位を有し、その１個はハイグロマ
イシン耐性付与（ＨｍＲ）遺伝子内にある。プラスミド
ｐＬＰｃｈｙｇｌのＨｍＲ遺伝子以外の部分に存在する
ＥｃｏＲ１部位にｄｈｆｒ遺伝子含有制限断片を挿入す
ることが望ましい。ＥｃｏＲＩで部分消化したプラスミ
ドｐＬＰＣｈｙｇｌ　ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動
にかけ、単一箇所で切断されたプラスミドｐＬＰｃｈｙ
ｇｌが、未切断のものや、他の消化産物から分離するま
で泳動させた。単一箇所で切断されたＤＮＡをゲルから
単離し、実質上、実施例１５Ａ記載の方法に従い、ライ
ゲーションに備えた。単一のＥｃｏＲ１部位で切断され
たプラスミドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｙｇ　ｌ約２μりを得、Ｔ
Ｅバッファー２５μＱに懸濁した。この試料にフレノウ
酵素約５μ０．（〜２５単位）、ＩＯ×クレノウバッフ
ァ−５μＱ１水４０μＱを加え、得られた反応混合物を
１６℃で６０分間インキュベートした。次いで、フレノ
ウ処理した部分的ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡをフェノールで
１回、クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、ＴＥバッファー２５μｇに再懸濁した。

プラスミドｐＢＷ３２のフレノウ処理した〜ｌ。

９　ｋｂＢ　ａｍＨＩ制限断片約５μｇおよび単一箇所
でＥｃｏＲＩ切断された、プラスミドｐＬＰｃｈｙｇｌ
ＤＮＡ約５μＱを混合し、このＤＮＡ混合物に１０×リ
ガ一ゼバツフアー１μａ１水５μｍ２ＳＴ４ＤＮＡリガ
ーゼｌμＱ（〜５００単位）、およびＴ４ＲＮΔリガー
ゼ１μｍ２（〜１単位）を加え、得られた反応混合物を
１６℃で一部インキユベートした。

ライゲートしたＤＮＡはｄｈｌ’ｒ遺伝子を含有する〜
１．９ｋｂ断片の方向性のみが異なる所望のプラスミド
ｐＬＰｃｈｄｌおよびｐＬＰＣｈｄ２を構成していた。

ライゲートしたＤＮＡを用いて実質上、実施例３記載の
ごとくにして形質転換コンピテント細胞とした大腸菌Ｋ
１２　ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換した。形質転換細胞を
１００μｇ／ｍ（ｌアンピシリン含有し寒天プレートに
より平板培養し、アンピシリン耐性形質転換体をそのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析に委ね、大腸菌に１２　
ＨＢＩＯＩ／ｐＬＰｃｈｄｌおよび大腸菌Ｋ１２ＨＢ１
０１／ｐＬＰＣｈｄ２形質転換体を同定した。本明細書
の開示の目的に従い、プラスミドｐＬＰｃｈｄｌをプラ
スミドｐＬＰＣｂｄと命名した。プラスミドｐＬＰＣｈ
ｄの制限部位および機能地図を第２０図に示す。

実質上、実施例１記載方法に従い、適当な形質転換体か
らプラスミドｐ［、Ｉ）ＣｈｄｌＤＮΔおよびプラスミ
ドｐＬＰＣｈｄ２ＤＮＡを単離した。

実施例２１　発現ベクターｐＡＬＰＫＳＡの構築 制限酵素Ｂｓ５ＨＩＩおよび１０ＸＢｓｓＨＩＩバツフ
アー（２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ、　ｐＨ７，４、および６０　ｍＭ　ＭｇＣＩりを
用いる外は、実質上、実施例２記載の方法に従い、プラ
スミドｐＧＡＧ１３１７（１０μ９）を消化した。次い
で、実質上、実施例５記載の方法に従い、フレノウを用
いてこの制限部位の５゛オーバーラツプを充填した。反
応を停止Ｊ二し、ＤＮＡを沈澱させた。次いで、制限酵
素ｒ（ｉｎｃｌｌおよびｌ　ＯＸ　［−１ｉｎｃ［バッ
ファー（ＩＭ　ＮａＣＬ　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ、　ｐＨ７，４、および７０　ｍＭ　ＭｇＣＩりを用
いる外は、実質上、実施例２記載の方法に従い、ＤＮＡ
を消化した。３７°Ｃで２時間経過後、ＤＮＡを沈澱さ
せた後、アガロースゲルに適用し、実質上、実施例１１
Ｂ記載の方法に従い、〜ｌ　２００ｂｐ　［（ｉｎｃｌ
ｌ−ＢｓｓＨＩＩ切断し、充填した断片を単離、精製し
た。

制限酵素Ｂｃｌｌおよび１ＱＸＢｃｌｌバツフアー（７
５０＋＋＋Ｍ　ＫＣＩ、６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
ｐＨ７゜４、および１００　ｍＭ　ＭｇＣＩ、）を用い
る外は、実質上、実施例２記械の方法に従い、プラスミ
ドｐＬ　Ｐ　Ｃｈｄ約ｌＯμ９を消化した。３７°Ｃで
２時間経過後、実質」〕、実施例５記載の方法に従い、
フレノウを用いてこの制限部位の５”オーバーラツプを
充填した。反応を停止し、ＤＮＡを沈澱させた。次いで
、このＤＮＡを実質上、実施例１２記戦の方法に従い、
ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。次に、ＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動にかけ、大きいＢｃｌ　［
−Ｂｃｌ　Ｉベクター断片を単離し、実質上、実施例１
１Ｂ記載の方法に従い、精製した。

Ｈｉｎｃ　［１−Ｂ　ｓｓＨＩＩ溶切断、充填したプラ
スミドｐＧＡＧ１３１７の〜１２００ｂｐ断片を実質上
、実施例２記載の方法に従い、ｐＬＰＣｈｄのＢｃｌｌ
切断ベクターにライゲートさせる。次いで、得られたプ
ラスミドを用い、実質上、実施例３記載の方法に従い、
大腸菌ＫＩ２　　ＲＶ３０８を形質転換する。このラー
ゲーションにより、抗原の方向性のみが異なる２種類の
プラスミドが得られる。

ｐＬＰＣｈｄの後期プロモーターによって誘導される抗
原断片を含有する所望のプラスミドｐＡＬＰＫＳＡの制
限部位および機能地図を第２１図に示す。

実施例２２　発現ベクターｐＡ　Ｌ　Ｐ　Ｋ　Ｓ　Ａの
真核性宿主細胞形質転換体の構築 発現ベクターｐＡＬＰＫＳΔは、米国特許Ｎｏ。

０７／１２９，０２８に開示されたＢＫエンハンサ−を
含有している。ＢＫエンハンサ−は、ＥＩＡ遺伝子産物
の存在下、遺伝子の発現を刺激する。

２９３細胞は構成的にＥＩＡ遺伝子産物を発現するので
、２９３細胞は、本発明の真核性発現ベクターの宿主細
胞として好適である。２９３細胞は、５型アデノウイル
ス（注：本発明の方法に用いるＥｌΔ遺伝子産物は、特
定の型のアデノウィルスによって供給されるものではな
い）によって形質転換されたヒト胚性腎細胞であって、
ＡＴＣＣから、受託番号ＣＲＬＩ５７３の下、入手可能
である。しかしながら、本発明の発現ベクターは、たと
えＣＩＡ遺伝子産物の非存在下でも、広範な宿主細胞内
で機能的である。また、ＥＩＡ遺伝子産物を、ＥＩＡ遺
ｆｉ子を含有するベクター、または分断したアデノウィ
ルスＤＮＡによる形質転換、あるいはアデノウィルスに
よる感染のいずれかにより、非−ＥＩＡ産生細胞系統に
導入してもよい。

下記の形質転換工程は２９３細胞を宿主細胞系統とする
ものであるが、該工程は、大多数の真核性細胞系統に一
般的に適用される。２９３細胞をＡＴＣＣから、受託番
号ＣＲＬ１５７３の下、２５ｍｍ２のフラスコに、１０
％熱不活化ウマ血清を含有するＥａｇｌｅの最少必須培
地中、約５．５８１０６細胞からなる単層の全面培養物
として入手可能である。フラスコを３７°Ｃで培養し、
培地を１週間に２回づつ交換する。培地を捨て、ノ＼ン
ク（Ｈｕｎｋ）の均衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し
、１２分間０．２５％トリプシンを加え、新鮮な培地で
洗浄し、吸引し、継代培養比１：５または１：１０で新
しいフラスコに分散することにより、継代培養する。

形質転換の１日前に細胞を０．７Ｘ１０’細胞／皿の割
合で撒く。形質転換の４時間前に培地を交換する。ＴＥ
バッファーに溶解した、滅菌し、エタノール沈殿させた
プラスミドＤＮＡを用いて４０　ｕ９／ｍＱＤ　Ｎ　Ａ
と２５０ｍＭ　ＣａＣ１，を含有する２　Ｘ　Ｄ　Ｎ　
Ａ　　ＣａＣＩｓ温溶液調製する。２８０ｍＭＮ　ａＣ
１％　５０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓおよび１．５ｍＭりん酸
ナトリウムを含有させ、ｐＨ７，０５−７，１５に調節
して２ｘ　Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｓを調製する。２ＸＤＮＡ−Ｃ
ａＣＬ溶液を、等量の滅菌した２ＸＨＢＳに滴下する。

綿栓を有するＩｍ（！の滅菌したプラスチック製ピペッ
トを、２　Ｘ　ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｓを入れた混合チューブに
挿入し、ＤＮＡを添加する間中、空気を吹き込んで泡を
生じさせる。撹拌しないで、室温で３０４５分間放置し
、りん酸カルシウムーＤＮＡ沈殿物を形成させる。

次いて、プラスチック懲りピペットで沈殿を静かにピペ
、ティングして混合し、沈殿１ｍσ（プレート当たり）
を、受容細胞を覆っている増殖培地１０ｍｇに直接加え
る。３７°Ｃで４時間インキュベートシた後、ｌＯ％ウ
シ胎仔血清を含んだＤＭＥＭで培地を交換し、さらに細
胞を７２時間インキユヘートした後、選択圧をかける。

真核性細胞内で機能的な選択マーカーを含有していない
プラスミドの場合には、形質転換工程にプラスミド混合
物（選択マーカーを欠く発現ベクターと、真核性細胞内
で機能的な選択マーカーを含有する発現ベクター）を用
いる。この同時形質転換法により、両方の形質転換プラ
スミドを含有する細胞が同定される。

ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有するプラスミド
でトランスフェクトされた細胞の場合には、終濃度が約
２００−４００　ｕＩ７／ｍ（ｌとなるようにハイグロ
マイシンを増殖培地に加える。次いで、３−４目間隔で
培地交換を行いながら細胞を３７℃で２−４週間インキ
ュベートする。得られたハイグロマイシン耐性コロニー
を特性化するために別個の培養フラスコに移す。ネオマ
イシン１耐性コロニー（ネオマイシンの代わりに６４１
８をも用いる）の選択は、ハイグロマイシンではなく、
ネオマイシンを終濃度４００μｇ／ｌ１（ｌとなるよう
に加える外は、実質上、ハイグロマイシン耐性細胞の選
択と同様に行われる。２９３細胞はｄｈｒｒ陽性なので
、ｄｈｒｒ遺伝子を含有するプラスミドを含んだ２９３
形質転換体は、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠く培
地での増殖能力である、ｄｈｆｒ陽性表現型のみに基い
て選択することはできない。

機能的なｄｈｆｒ遺伝子を欠如しており、ｄｈ［’ｒ含
有プラスミドで形質転換された細胞系統であれば、ｄｈ
「ｒ十表現型に基いて選択し得る。

ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を欠如する細
胞系統に遺伝子またはプラスミドを導入するための選択
マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を用い、次いで、メトト
レキセートを用いてプラスミドのコピー数を増幅するこ
とは文献中に確立されている。

ｄｈｒｒ産生細胞でのｄｈｆｒの選択および増幅マーカ
ーとしての使用は充分に研究されていないが、ｄｈｆｒ
を、ｄｈｒｒ産生細胞における選択マーカーおよび遺伝
子の増幅に用い得ることは、文献の事実から示唆されて
いる。本発明の用途は用いる選択マーカーによって限定
されるものではない。メタロチオナイン遺伝子、アデノ
シンンデアミナーゼ遺伝子、またはｐ−グリコプロティ
ン（ｐ−糖タンパク質）のようなマルチジーン・レジス
タンス・ファミリー（複数耐性遺伝子類）等の増幅可能
なマーカー類を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＫＣ２８３の制限部位および機能
地図、第２図はプラスミドｐＫＣ２８３Ｐｘの制限部位
および機能地図、第３図はプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌ
の制限部位および機能地図、第４図はプラスミドｐＫＣ
２８３−ＬＢの制限部位および機能地図、第５図はプラ
スミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の制限部位および機能地図、
第６図はプラスミドｐＬ３２の制限部位および機能地図
、第７図はプラスミドｐＮＭ７８９の制限部位および機
能地図、第８図はプラスミド１２０の制限部位および機
能地図、第９図はプラスミドｐＬ４７の制限部位および
機能地図、第１０図はプラスミドｐＰＲ１２の制限部位
および機能地図、第１１図はｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部
位および機能地図、第１２図はプラスミドｐＬ１１０の
制限部位および機能地図、第１３図はプラスミドｐＬ１
１０ｃの構築模式図およびその制限部位および機能地図
、第１４図はプラスミドｐＡＧ９３２の制限部位および
機能地図、第１５図はプラスミドｐＡＧ１３３８の制限
部位および機能地図、第１６図はプラスミドｐＧＥＭ”
の制限部位および機能地図、第１７図はプラスミドｐＣ
，ＡＧ１３１７の制限部位および機能地図、第１８図は
プラスミドｐＬＫｓＡ−Ｂの制限部位および機能地図、
第１９図はプラスミドｐｔ、　Ｋ　Ｓ　Ａの制限部位お
よび機能地図、第２０図はプラスミドｐＬＰＣｈｄの制
限部位および機能地図、第２１図はプラスミドｐＡ　Ｌ
　Ｐ　Ｋ　ＳＡの制限部位および機能地図。 ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、ＡＬＡはアラニン残基、ＡＲＧはアルギニン残
   基、ＡＳＮはアスパラギン残基、ＡＳＰはアスパラギン
   酸残基、ＣＹＳはシステイン残基、ＧＬＮはグルタミン
   残基、ＧＬＵはグルタミン酸残基、ＧＬＹグリシン残基
   、ＨＩＳはヒスチジン残基、ＩＬＥはイソロイシン残基
   、ＬＥＵはロイシン残基、ＬＹＳはリシン残基、ＭＥＴ
   はメチオニン残基、ＰＨＥはフェニルアラニン残基、Ｐ
   ＲＯはプロリン残基、ＳＥＲはセリン残基、ＴＨＲはス
   レオニン残基、ＴＲＰはトリプトファン残基、ＴＹＲは
   チロシン残基、ＶＡＬはバリン残基を表す） で示されるアミノ酸残基配列を有するタンパク質をコー
   ドしているＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ化合物。 ２、暗号鎖が、式： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
   、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表す） で示されるものである請求項１記載の組換えＤＮＡ化合
   物。 ３、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、各記号は上記定義に従う） で示されるアミノ酸残基配列の末端アルギニン残基が請
   求項１記載の配列の最初のアラニン残基に結合すること
   により、さらに、該アミノ酸残基配列をコードしている
   ＤＮＡをも含有する請求項１記載のＤＮＡ化合物。 ４、暗号鎖が、式： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （式中、各記号は上記定義に従う） で示される請求項３記載のＤＮＡ化合物。 ５、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、各記号は上記定義に従う） で示されるアミノ酸残基配列の末端アラニン残基が請求
   項３記載の配列の最初のアラニン残基に結合することに
   より、さらに、該アミノ酸残基配列をコードしているＤ
   ＮＡをも含有する請求項３記載のＤＮＡ化合物。 ６、暗号鎖が、式： 【遺伝子配列があります】 （式中、各記号は上記定義に従う） で示される請求項５記載の組換えＤＮＡ化合物。 ７、請求項２、４または６のいずれかに記載のＤＮＡ化
   合物を含有する組換えＤＮＡベクター。 ８、プラスミドｐＧＡＧ１３１７である請求項７記載の
   組換えＤＮＡベクター。 ９、プラスミドｐＡＧ９３２、ｐＡＧ１３３８、ｐＬＫ
   ＳＡ−ＢまたはｐＬＫＳＡからなる群から選択されるも
   のである組換えＤＮＡベクター。 １０、組換え宿主細胞内でＫＳＡを発現させる方法であ
   って、 （１）該宿主細胞を、 （ａ）該宿主細胞内で機能的なプロモーターおよび翻訳
   活性化配列、および （ｂ）ＫＳＡをコードしており、該プロモーターによっ
   て発現される位置にあるＤＮＡ配列を含有する組換えＤ
   ＮＡ発現ベクターで形質転換し、 （２）工程（１）で形質転換された宿主細胞をＫＳＡの
   発現に適した条件下で培養することからなる方法。 １１、該組換え宿主細胞が大腸菌細胞および２９３細胞
   からなる群から選択されるものである請求項１０記載の
   方法。 １２、工程（２）における組換え宿主細胞が大腸菌Ｋ１
   ２ＲＶ３０８／ｐＬＫＳＡである請求項１１記載の方法
   。