JPH025871A - コクシジウム症ワクチンとして有用な組換え及び天然ａ、ｃ、ｆ及びｈ群アイメリア・テネラ免疫原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症は、原生動物門の一分類である多数のコ
クシジウム種の１以上による感染によって’ＪＥしる疾
患である。コクシジウムは、多種の宿主に感染してヒツ
ジ、ヤギ、ウシ、ブタ及び軍書産業に重大な経済的損害
を与えつる細胞内寄生虫である。実際にも、アイメリア
（εｉｍｅｒｉａ１種による感染から生じるコクシジウ
ム症は家禽産業に対して経済的に壊滅的な損害を生じさ
せた。家禽とは、卵又は肉源として用いられかう商業的
に重要な種類として鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホ
ロホロ鳥、キジ、ハト及びクジャクを含む飼ｎ鳥として
本明細書では定義される。飼育鳥の中では、鶏の生産物
がコクシジウム症による経済的損害を最もうけ易いが、
但し損害は七面鳥、ガチョウ、アヒル及びホロホロ烏の
場合にも発生しつる。コクシジウム症は、捕獲状態で育
てられたキジ及びウズラの場合にも重大な損害を与える
。コクシジウム症は急性であってかつ壊滅的な群死Ｃ率
により特徴付けられるか、又はその疾患は慢性的であっ
てかつ体重増加の欠如により特徴付けられる。

家禽は、成長期の寄生虫、即ち胞子形成嚢胞体１ｏｏｃ
ｙｓｔ、ｌの摂取後にコクシジウムにより感染する。感
染間の挿出１ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）はそれが上皮細胞
中に急速に侵入した場合に放出されるが、しかる後数世
代にわたる急速な細胞内無性増殖（多数分裂）を起こし
１次いで有性的分化及び交配期（有性生殖）に入って未
成熟嚢胞体を形成する。が、これは傭中に排出され、し
かる後細胞外胞子形成過程（伝播生殖）に移行して成熟
嚢胞体を生じる。

いずれかのアイメリア種、即らＥ、アセルブリナ（Ｅ、
　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａｌ　、　Ｅ、　　ミバチ（Ｅ、
　＠１ｖａｔｉｌ　、Ｅ、ミチス（Ｅ、　ａｉｉｔｉｓ
ｌ、　　Ｅ、プラエコックス（Ｅ。

ｐｒａｅｃｏｘｌ、Ｅ、ハガニＩＥ、　ｈａｇａｎｉｌ
　、　Ｅ　、ネカトリックス（Ｅ、　ｎｅｃａｔｒｉｘ
ｌ　、　Ｅ、マキシマ　（Ｅ。

ｍａｘｉｍａｌ　、　　Ｅ、ブルネッテ（［Ｅ、　ｂｒ
ｕｎｅ’ｔｔｉｌ　及びＥ、テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌ
ｌａｌによる低レベル感染の場合には、再感染に対する
保護免疫を生じる。寄生虫の発育に伴い１２もの多くの
異なる細胞タイプが存在しつるが、各々形態学的及び抗
原的に異なる。これらの細胞タイプのうち少な（とも３
種が宿主において保護免疫応答を生じることが明らかに
された［ローズ及びヘスケス、パラサイトロジー、第７
３巻、第２５−３７頁、１９７６年（Ｉｌｏｓａ　ａｎ
ｄ　１ｌｅｓｋｅｔｈ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、
７３：　２５−３７（１９７６）　）　　：マクドナル
ド（ＭｃＤｏｎａｌｄｌら、パラサイトロジー、第９３
巻、第１−７頁、１９８６年：バタシャリ及びロング、
リサーチ・イン・エイビアン・コクシジ才シス、プロシ
ーディング・オプ・ザ・ジョーシア・コクシジウム症・
コンファレンス、アテネ、ジョーシア州、ＵＳＡ、第５
２６−５３４頁、１９．８６年（Ｂｈａｎｕｓｈａｌｉ
　ａｎｄＬｏｎｇ、　Ｉｎ、　ｌ１ｅｓｅａｒｃｈ　ｉ
ｎ　Ａｖｉａｎ　Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｌｈｅ　Ｇｅｏｒｇｉａ
　ＣｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、　Ａ
ｔｈｅｎｓ、　Ｇ＾、　ＵＳＡ、　ｐｐ、　５２６−５
３４＋１９８（Ｉｌｌ　］　、。種虫のみならず第−及
び第二旦代裂虫（ｓｃｈｉｚｏｎｔｌのいずれもが、鶏
において免疫作用を引き出す抗原を含有しているようで
ある。

単一の優性抗原からなるプラスモジウム・）？ルシパラ
ムｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の
ような他の寄生虫の種型表面とは異なりＥサントロら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
２５８巻、第３３４１−３３４５゜１９８３年　（５ａ
ｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５８：
３３４１−３３４５（１９８３）ｌ］。

アイメリア種、特にＥ、テネラ捕虫表面は抗原的に複雑
なようである【ウィッシャー、モレキュラー・アンド・
バイオケミカル・パラサイトロジー、第２１巻、第７−
１５頁、１９８６年（ｉｆｉｓｈｅｒｌＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　ａｎｄ　　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰａｒａｓ
ｉｔｏｌｏｇｙ、　２１　：　７−１５（１９８６１）
　］　、種挿出階では生体外で培養されず、しかも多量
の挿出物質が慣用的生化学分析及びサブユニットワクチ
ン評価のために必要であることから、これら抗原の精製
が問題を提起した１本明細書で用いられているサブユニ
ットワクチンは、いずれかのアイメリア種の生育期の１
以上から単離されるか又は組換えＤＮＡ技術によって産
生され、しかも単独で又は他のかかるペプチド、ポリペ
プチドもしくはタンパク質との組合せでワクチン接種後
に家禽において保護免疫を生じさせるようなペプチド、
ポリペプチド又はタンパク質として定義される０組換え
抗原又は免疫原は、１以上の生育期のアイメリアから単
離されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と同一
であるか又は類似している。免疫原は、微生物に対して
免疫を生じるワクチンの使用のような１体内に導入され
た場合に自然的な保護である免疫応答を刺激する物質と
して定義される７免疫は、外来生物の侵襲もしくは病原
作用又は外米生物産生物の毒性作用に対する非感受性と
して定義される。保護免疫は、体液性又は細胞性免疫の
いずれであってもよい０体液性免疫は、身体の血漿、リ
ンパ液及び組織液中に存在しかつ細胞に付着しつる抗体
によって媒介される特異的免疫として定Ａされる。細胞
性免疫は、Ｔリンパ球によって媒介される特異的免疫と
して定義される。抗原は、特異的抗体と特異的に結合し
つる物質を表わすために本明細書では用いられている。

完全（インタクト）Ｅ、テネラ捕虫に対して作られたモ
ノクローナル抗体によって確認される可溶化Ｅ、テネラ
種挿出ンパク質は、感染性嚢胞体による侵襲から鶏を保
護しうろことが示された［ジエンケル（Ｓｃｈｅｎｋｅ
ｌ）ら、欧州特許出願第１３５．７１２号明細書１．同
様の結果は、同様の技術で作られたＥ、テネラ嫡出（ａ
ｅｒｏｚｏｉｔｅｌからも得られた（ジエンケルら、欧
州特許出願第１３５．０７３号明細書）、免疫原ポリペ
プチドはＥ、テネラ捕虫から単離された［マレ−ＩＭｕ
ｒｒａｙｌ及びガルスカ１Ｇａｌｕｓｋａｌ　、米国特
許第４，６３９．３７２号１．しかしながら、いずれの
個別的ポリペプチドがＥ、テネラ侵襲から鶏を保護して
いるのかについて、指摘はなかった。

組換えＤＮＡ技術によれば、免疫原アイメリアポリペプ
チドの確認及びワクチン開発に十分な看のポリペプチド
の産生が可能であった。二１−マン（Ｎｅｗｍａｎ）ら
は欧州特許出願第１６４，１７６号において、それぞれ
１７，０００及び８，０００ダルトンの２つのサブユニ
ットから構成されるＥ、テネラ由来の２５，０００ダル
トンポリペプチドのｍ雌について記載している。２５，
０００タルトンポリペプチドはゲノムＤＮＡクローンを
用いた組換えＤＮＡ技術によって産生され、Ｅ。

テネラによりもたらされるコクシジウム症から鶏を保護
することが示された。もう１つの免疫原Ｅ　テネラポリ
ペプチドは、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎｌ及びマ
クカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓｌにより特許協力
条約出願ＷＯ第８６１０　Ｏ５２８号で開示されている
。このペプチドは配列決定されたが、２８０のアミノ酸
から構成されており、嚢胞体ゲノムＩ）　Ｎ　Ａクロー
ン及び全嚢胞体ｍＲＮＡから（ｌ離されるクローンの双
方を用いた＃ｌ換えＤＮＡ技術によって産生され、コク
シジウム症から鶏を保護する。最近、クラーク（Ｃ１ａ
ｒｋｌ　ら、モレキ１ラー・アンド・バイオケミカル・
パラサイトロジー、第２２巻、第７９−８７頁、１９８
７年では、発現ベクターＬａｍｐ３を用いた大腸菌中で
のＥ、テネラ白米ゲノムＤＮＡ発現ライブラリの作成に
ついて開示した。Ｅ　テネラ免疫原を発現するクローン
が検出されたが、但しいずれのペプチドも免疫原活性に
ついて試験されなかった。アイメリア・テネラ種虫の表
面膜は、有効な表面免疫原を特徴付けるために様々な技
術によって標識化された（ライラシャ−、モレキュラー
・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー１Ｗｉｓ
ｈｅｒ、　Ｍｏ１．　Ｏｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉ
ｔｌ第２１巻、第７−１５頁、１９８６年）、抗Ｅ、テ
ネラ抗体と反応した主な表面ポリペプチドは、下記範囲
内。

即ち１１３−９６ＫＤ、７３−６７ＫＤ、５４−４２Ｋ
Ｄ、３７−３２ＫＤ及び１８−１４ＫＤであった。

新規Ａ、Ｃ，Ｆ及び８群アイメリア・テネラタンパク質
免疫原についてコードする遺伝子は単離されて、新規発
現ベクター中に挿入され、しかる後適切な宿主を形質転
換させるために用いられた。形質転換宿主細胞は、鶏に
おいてコクシジウム症に対する免疫を生じさせうる組換
え群Ｅ、テネラタンパク質を産生ずる０組換えタンパク
質免疫原に対して産生された抗体は、破壊されたＥ。

テネラ胞子形成嚢胞体から天然タンパク質を単離しかつ
同定するために用いられる。

したがって、本発明の目的はコクシジウム症に対して鶏
を免疫するために用いることができるアイメリア・テネ
ラの新規タンパク質を提供することである。本発明の他
の目的は、胞子形成嚢胞体及び挿出に特に係わる免疫原
タンパク質を提供することである１本発明のさらに他の
目的は、免疫原タンパク質の推定アミノ酸配列を提供す
ることである０本発明のさらに他の目的は、特異的タン
パク質免疫原についてコードする遺伝子を単離すること
及び適切な発現ベクター中に遺伝子を組込むことである
。本発明のさらに他の目的は、適切な宿主を各々の組換
えベクターで形質転換し、特定コクシジウム遺伝子の発
現を誘導し、かつ純粋な免疫原を単離することである１
本発明のさらに他の目的は、特異的コクシジウムタンパ
ク質発現用の新規発現ベクターを製造することである０
本発明のさらに他の目的は、免疫原タンパク質に対して
反応する単一特異性抗体を製造することである。

本発明は、アイメリア・テネラの胞子形成嚢胞体１種型
、裂虫、嫡出に係わるタンパク質の天然もしくは組換え
精製タンパク質免疫原及びいずれかの微異質（ｍｉｃｒ
ｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）もしくはサブユニット
免疫原を基礎にしたコクシジウム症ワクチンに関する６
本明細書で用いられている天然タンパク質とは、寄生虫
の適切なアイメリア遺伝子により産生される完全な鎖長
を有するタンパク質に関する６組換えとは、所望クンバ
ク質用遺伝子の単離及び所望タンパク質を過剰産生ずる
細菌を作り出すためのかかる精製遺伝子の使用に関する
。

サブユニット免疫原は、天然免疫原部分よりも少ないア
ミノ酸を有するが但し免疫原の免疫原性部位を含んだ免
疫原タンパク質又はポリペプチド部分として定義される
１本明細書で用いられる微異質体とは、翻訳後横道的に
修正された単一遺伝子産物、即ちＤＮＡの単一遺伝子ユ
ニットから産生されるタンパク質に関する。しかしなが
ら、これらの構造修正によって、タンパク質免疫原活性
のいかなる有意的変化も生じない、修正は、寄生虫の体
内で又は＠離及び精製過程中に生じる。生体内修正の結
果、格別限定されないが、Ｎ末端のアセチル化、タンパ
ク質分解、グリコジル化又はホスホリル化が生じる。タ
ンパク質分解としては。

１以上の末端アミノ酸が連続的、酸素的に開裂されて原
逍伝子産物よりも少ないアミノ酸数の微異質体を生じる
細胞外タンパク質分解がある。タンパク質分解には、ア
ミノ酸配列中の特定箇所でペプチドを開裂するエンドプ
ロテアーゼの作用によって生じる細胞内タンパク質分解
修正も含む、同様の修正は精製過程中でも起こり、その
結果微異質体を生じる。精製中に起きる最も一般的な修
正は、プロテア−アゼ阻害剤の使用によって通常最小限
に保持されるタンパク質分解である。

更に本発明は１個々のタンパク質に関する遺伝情報の単
離及び精製、並びに対応免疫原タンパク質の発現方法に
関する。本明細書で用いられるボフベプチド又はタンパ
ク質は、アミド結合で互いに結合したアミノ酸の直鎖ポ
リマーに関する。

鎖中のアミノ酸配列は、タンパク質又はポリベプチドの
生物学的機能に関して極めて重要である。

ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書においてＴｉ
、＋９的に用いられる６本明細書で用いられる免疫原と
は、動物体内に導入された場合に、天然のままで機能的
である体液性及び／又は細胞性免疫応答、即ち特定感染
症から動物を保護しつる免疫を促進する分子又は大分子
に関する１本ケースにおいて、免疫原は体液性、細胞性
のいずれか又は双方の免疫応答を生じさせて、コクシジ
ウム症を起こすアイメリア種による感染から家禽を保護
する。

アイメリア・テネラ嚢胞体は４〜１０日前、好ましくは
７０前に感染した鶏の盲ｆｌｕ内容物から単離され、一
方Ｅ　アセルブリナ嚢胞体は５〜６日前に感染した鶏の
糞及び腸内古物から単離される。盲腸内容物及び糞はそ
れぞれウェアリング・ブレングーｉＷａｒｉｎｇ　Ｂｌ
ｅｎｄｅｒｌ内でそれぞれ蒸留水中で物理的に粉砕され
、タンパク質分解酵素、好ましくはペプシンで分解され
る。破壊屑及びペプシンは蒸留水中での遠心により除去
される。

部分的に純粋な嚢胞体分画は約２．２Ｍススクロス中の
ｉ１Ｍ化により集められ［ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ
ｌ　、バラサイトロジー、第５４巻、第８７９３頁、１
９６４年１、史に約４°Ｃで約１０分間水中約５〜約６
％、好ましくは５．２５％の濃度の次亜塩素酸ナトリウ
ム中におけるインキュベートによって処理される。次亜
塩素酸ナトリウムは、精製された無菌嚢胞体を得るため
に、約ｐＨ７，６の無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）での数
回の洗浄により除去される。嚢胞体は約２０℃で約４８
時間にわたり振盪水浴中で胞子形成せしめられる［エド
ガー、トランサクションズ・才ブ・アメリカン・マイク
ロオーガニズム・ソサエテ第６２巻、第２３７−２４２
頁、１９５４年（Ｅｄｇａｒ、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ
ｓ　　ｏｆ　　ＡｍｅｒｉｃａｎＭｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｎ＋　　５ｏｃｉｅｔ、ｙ、６２：２３７−２４２
（１９５４１）ｌ。

胞子１［ヨ成嚢胞体はＰ１３Ｓに懸濁され、プランソニ
ック（ｌｌｒａｎｓｏｎｉｃｌ細胞破壊器［ブランソン
（Ｂｒａｎ８ｏｎｌ　ｌ巾約Ｏ″Ｃで先細プローブによ
り破壊される。超音波処理は過熱を防止するために約３
０秒間のショー！−バースト［５ｈｏｒｔ　ｂｕｒｓｔ
、ｌで行われ、９０％の破壊が約５〜約２０分間で生じ
る。界面活性剤、好ましくは約０．１ｗ／ｖ％のツビッ
タージエント３−１２　（Ｚｗｉｔｔ、ｅｒｇｅｎｔ。

３−１２１　　［カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
ｌ　］が超音波処理液に加えられ、混合物は約４℃で約
１８時間攪拌される。界面活性剤処理された胞子形成嚢
胞体は約２７，０００ｘｇで約３０分間遠心分離され、
上澄液が集められる。

捕虫は、バラトン、サイエンス、第１５０巻。

第７６７−７６９頁、１９６５年［Ｐａｔｔｏｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　１５０　　：　　７６７−７［ｉ９　
（１９６５１］の操作に従い、ゆるめた乳棒装備の組織
ホモゲナイザー中約４℃約５００ｒｐｍで約５分間にわ
たり約■）１１７．６のＰＢＳ中約５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　
／　ｍ　！２の精製胞子形成嚢胞体懸濁物をすりつぶす
ことにより得られる６破壊された物質は遠心分離により
集められる。Ｅ、テネラペレットは非破壊嚢胞体、スポ
ロシスト１ｓｐｏｒｏｅｙｓｔｌ及び嚢胞体外波からな
り、ハンクス１ｌｌａｎｋｓｌ　＋−衡塩溶液（ｐ）１
７．４）のような緩ｉΦｊ液中約０．２５％（ｗ／ｖ）
トリプシンおよび約４％（ｗ　／　ｖ　）タウロデオキ
シコール酸［シグマ（Ｓ　ｉｇｍａｌ　］含有税暁光溶
液中に再懸濁される。Ｅ、アセルブリナペレットも非破
壊嚢胞体、スポロシスト及び嚢胞体外波からなり、ハン
クス平衡塩溶液（ｐＨ７，４）のような緩衝液巾約０．
１２５％（ｗ／Ｖ）トリプシン（１２５０）及び約１．
０％タウロデオキシコール酸含有脱暁光溶液中にｉＴ￥
懸濁される。再懸濁されたペレットは約５％Ｃ０２含有
雰囲気中約４１℃でインキュベートされる。暁光化はＥ
　アセルブリナの場合的０５時間及びＥ、テネラの場合
約１時間続けられ、しかる後溶液が遠心分離で除去され
る。　１４虫は、シュマッツら、ジャーナル・才ブ・プ
ロトズーロジー、第３１巻、第１８１−１８３頁、１９
８４年［Ｓｃｈｍａｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆＰｒｏｔｏｚｏｏｌｏｇｙ　：ｌｌ　：　１
８１−１８３　ｆ１９８４１］の方法に従いＤＥ−５２
アニオン交換カラムを用いて単離される。精製されたｆ
！！！虫は、少なくとも３回の凍結及び解凍によって破
壊されるが、破壊されるまで約１　ｍ　Ｍフェニルメチ
ルスルホニルフルオリド有税ＰＢＳ中で超音波処理され
る。

胞子形成嚢胞体及び種型細胞の双方を含有していない調
製物は、ｐ［１約７．２の約５０ｍＭＮａｚｌｌＰＯ４
−Ｎａ１ｌｚＰＯａ及び約０．１％ツビツタジェント３
−１２含有の分離用緩衝液中におけるゲル浸透クロマト
グラフィー、好ましくはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘｌ　Ｓ　−２００［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａｌ　］により分離される。各調製物は約８Ｘ４４ｃ
ｍのカラムに加えられ１分離用緩衝液で溶離される。溶
出は２３０ｎｍの吸光度によってモニターされ、約１４
ｍ１２７両分の両分が集められる。画分は直線勾配ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析され、画分
けこれらの特徴に従いプールされる。プールされた両分
は炭酸水素塩緩衝液に対して透析され、感染性Ｅ　テネ
ラ胞子形成嚢胞体の侵襲から鶏を保護しつるそれらの能
力について試験される。２日令ブロイラー鶏は、ＰＢＳ
中無胞子形成嚢胞嚢胞は無神虫細胞免疫原タンパク質約
５μｇ〜約５０μｇのプール画分で筋肉内に免疫注射さ
れる。無細胞免疫原は、約０．１２ｍＱ／用量／烏の総
容徹中ミョウバン（最終濃度的０．４％）と沈降する。

ミョウバン−免疫原沈降複合体は、ウェア、実験免疫学
ハンドブック、ブラックウェル・サイエンティフィック
・パブリケーションズ、ロンドン、第Ａ３．１１頁、’
１９７８年（１１ｅｉｒ。

１ｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｂｌａｃｋｗｅ−１１５ｅ
ｉｅｎｌ：１ｆｉｃ）Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏ
ｎｄｏｎ、　ｐｇ、　Ａ３゜１１　（１９７８）　］の
技術によって製造される。免疫処理は９日目及び１６６
日目繰返されたが、鳥は最終免疫後７日目の２３３日目
感染性Ｅ、テネラ胞子形成嚢嚢胞で侵Ｉされる。各調製
物からの単一画分が種型侵襲から鶏を保護した。これら
の両分は同様の溶出及び電気泳動特性を有していたこと
から、ポリペプチドが類似であることを示唆している。

胞子形成嚢胞体から単離された最も活性な免疫原画分は
カラム画分８４−９４でみられ、画分Ｖと命名されてい
る。

抗血清は、アイメリア・テネラの胞子形成嚢胞体（画分
Ｖ）、種虫、超音波処理非胞子形成嚢胞体、第二世代製
型及びＥ　アセルブリナの超音波処理種型の免疫保護画
分に対して作られる６Ｅテネラ裂虫は、ジェームス（Ｊ
ａｍｅｓｌ　、パラナイトロジー、第８０巻、第３０１
−３１２頁、１９８０年のプロトコールに従い感染後約
４日間で鶏脂細胞から得られる。血液は免疫操作開始前
に抗体産生動物、好ましくはウサギから集められ、免疫
前血清が単離されて、コントロール目的用に貯蔵される
。ウサギは、上記のうち１つの免疫原タンパク質約２０
〜約８０μｇ／免疫でＷ！数回の免疫注射をうける。初
回の免疫は、許容されるアジュバントと共に通常等量の
免疫原及びアジュバントで行われる。許容されるアジュ
バントとしては、フロイント完全液、フロイント不完全
液、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム・パルブム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍｌ及
びしＲＮＡ含有油中水型エマルジョンがあるが、フロイ
ント完全アジｌバントが初回免疫用として好ましい。フ
ロイント不完全アジュバントはすべての追加免疫用とし
て好ましい。初回免疫は、・ウサギ背中の複数皮下部位
におけるエマルジョン約１ｍβの投与からなる。等量の
免疫原を用いる追加免疫は約１か目間隔で行われ、七分
量の抗体が個々のウサギ血清中にｌｉ：在するまで続け
られる。血液は集められて、血清が当業界で公知の方法
により単離される。抗コクシジウム抗血清は、血清学的
分析、好ましくは非胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢胞体、
種型及び製型から得られる抗原を用いたウェスターンプ
ロット分析によって特徴付けられる０本明細書で用いら
れる抗原は、抗体と結合しつるいずれかの物質として定
義される。上記のような免疫原は、特異的抗体を特徴付
けるために用いられる場合には抗原とみなされる。

上記のようなウェスターンプロット分析に用いられる約
５０μｇの寄生虫免疫原は、約ｐｉ−＋６８の約０．１
Ｍｌ−リスＨＣβ、約４％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
Ｄ’Ｓ）、約２０％（ｖ／ｖｌグリセロール、約１０％
（ｖ／ｖ）２−メルカブトエタノール及び約０．００２
％（ｖ／ｖ）ブロモフェノールブルーからなる約２倍濃
縮サンプル緩衝液とほぼ等量で混合される。サンプルは
、レムリ、ネーチャー、第２２７巻、第６８０−６８４
頁、１９・７０年［Ｌａｅｆｆｉｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　２２７　：　［１８０６８４（１９７０）　］の方
法により、約３分間煮沸され、ＳＤＳ含有ポリアクリル
アミドゲル（ＰＡＧＥ）の５〜２０％直線勾配上で電気
泳動に付される。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質はトービ
ンら、プロシーディング・才ブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンスＬＪＳＡ、第７６巻、第４３５０
−４３５４頁、１９７９年［Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅ　　ＵＳＡ
　　　７６：　　４：１５０−４：１５４（１９７９）
　］の方法により電気泳動的にニトロセルロースに移動
し、ニトロセルロースは約ｐ　Ｈ７，４のリン酸緩衝液
中０．５％ゼラチンでブロックされる。ブロックされた
ニトロセルロースは、約０．２５％ゼラチン及び０，０
５％トリト：／Ｘ−１００含有ＴＥＮ緩衝液（約ｐＨ７
，４の約５０ｍＭトリス−ＨＣＲ、約１５０ｍＭＮａＣ
Ｒ及び約５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）巾
約ｌ：５〜ｌ：４００で希釈された適切な抗血清約２０
ｍｊ２中において室温で一夜インキユベートされる。結
合抗体は１２５■−タンパク質への添加によって検出さ
れる。

免疫を生じる上記コクシジウムポリペプチドのいずれも
が公知の分離又は精製法によって均質に事Ｉ！ｌ　’Ａ
されえなし）ことから１個々のポリペプチドのアミノ酸
組成を明らかにすることは不可能であった。したがって
、様々なアイメリア抗原に対する抗体が１組換えＤＮＡ
技術で（４られる保護コクシジウム免疫原ポリベブヂド
を免疫学的方法により確認するために用いられる。組換
えＤＮＡ技術は、異なる細胞１通常穴なる生物白米の遺
伝情報ＤＮＡセグメントをそのＤＮＡが得られる生物体
外で端部間で結合させかつ原ＤＮＡがコードするタンパ
ク質について産生ずべき細胞中にこのハイブリッドＤＮ
Ａを組込むための技術として、本明細書では定義される
。遺伝情報ＤＮＡ又はｍＲＮＡは胞子形成嚢胞体又は捕
虫から単離され、適切なりローニングベクターに組込ま
れ、適切な宿主細胞中に導入されて、宿主細胞の産物は
抗Ｅ、テネラ抗体と結合するポリペプチドの産主に関し
てスクリーニングされる。免疫反応性ポリペプチドを発
現することが確認された遺伝子は。

適切な発現ベクター中に組込まれ、Ｊ１１切な宿主細胞
系中で発現せしめられる。

本明細書で用いられるクローニングベクターは、特定の
実験的外来ＤＮＡの組込みが可能であって、しかも安定
状態で存在しかつ実験的ＤＮＡで指示されたタンパク質
を発現しつる宿主細胞中に結合ＤＮＡが導入されるため
のＤＮＡ配列として定義される。ベクターＤＮＡと結合
した外来ＤＮＡは、組換え技術で得られる組換えＤＮＡ
分子を構成する。クローニングベクターとしては、プラ
スミド、バクテリオファージ、ウィルス及びコスミドが
ある。いずれのクローニングベクターも新規アイメリア
免疫原ＤＮＡ配列を複製するために使用可能であると解
されるが、ラムタｇシｌｌが好ましい６通常、クローニ
ング、ＤＮＡプロセッシング及び初期発現用の宿主細胞
としては細菌がある。好ましいクローニング用宿主は大
腸菌である０発現ベクターは、適切な宿主中における遺
伝子複製コピーの転写及びそれらｍｎＮＡの翻訳のため
に必要なりＮＡ配列として本明細書では定義される。こ
のようなベクターは、細菌、藍藻ｈａ物、酵母細胞、昆
虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主中で原核細胞又
は真核細胞いずれかの遺伝子を発現させるために使用す
ることができる。

免疫原は、いくつかのウィルス系中でも発現しつる。特
別にデザインされたベクターは、細菌−酵母又は細菌−
動物細胞間におけるＤＮＡのシャトル化（ｓｈｕｔｔｌ
　ｉｎｇｌ　を可能にする。適切に構成された発現ベク
ターは、宿主細胞中での自律的複製用の複装源、選択マ
ーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数及び
強いプロモーターを含んでいるべきである。プロモータ
ーは、ｎＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ
合成を開始させろためのＤＮＡ配列として定義される。

強ブロモーターとは、高頻度でｍＲＮＡが開始せしめら
れるようなものをいう０発現ベクターとしては、格別限
定されないが、クローニングベクタ、修正クローニング
ベクター、特別デザインプラスミド又はウィルスがある
。

本発明の独特な免疫原タンパク質は、格別限定されない
が、アイメリアの規定遺伝子により特定化される完全タ
ンパク質、即ち天然タンパク質として又はそのいずれ、
かのフラグメントもしくはサブユニットとして、又は完
全タンパク質、そのフラグメントもしくはサブユニット
のハイブリッドとして仔在しつる０本明細書で用いられ
る完全タンパク質とは、適切なアイメリア遺伝子から得
られる完全鎖長ポリペプチドに関する。完全タンパク質
は、適切なアイメリア種からの精製により、又は対応組
１負え遺伝子産物の適切な発現ベクタにおける発現によ
り得られる。タンパク質フラグメント又はサブユニット
とは、完全タンパク質よりも少ないアミノ酸数であって
かつ抗コクシジウム免疫を導きつる能力を留めたいずれ
がのタンパク質部分に関する。ハイブリッドタンパク質
としては、格別限定されないが、発現ベクター内の複数
遺伝子の発現から得られるタンパク質又は融合タンパク
質がある。融合タンパク質は、発現ベクターによりコー
ドされた限定数のアミノ酸が発現せしめられて、発現の
結果特異的免疫原ポリペプチドにそれらが結合している
ようなものとして定義される。ＰＭ数遺伝子から得られ
るタンパク質としては、免疫反応性を高める第二ポリペ
プチド又はペプチドにペプチド結合で結合せしめられた
特異的免疫原ポリペプチドがある。高めるポリペプチド
部分は、コクシジウム免疫原に対する免疫応答性を増加
させつる能力を有している。

適切なコクシジウムＤＮＡは、遺伝子由来タンパク質を
抗画分Ｖ及び抗挿出抗体と反応させることにより単離か
つ確認される０組換えコクシジウムポリペプチドは、ゲ
ノムＤＮＡ又はｃＤＮＡいずれかの天然ｉｆｆ伝子４ク
ローニングすることにより得られる。ゲノムＤＮＡは、
特異的遺伝子を得る好ましい方法であるが、約０．５％
ＳＯ５及び約１５ｍＭ　　ＥＤＴＡによる処理で約１．
５×ｌＯａの寄生虫を破壊することによりスポロシスト
又は捕虫から抽出される。放出されたＤＮＡは、約５０
℃で約３時間約１００μｇ／ｍβのタンパク質分解酵素
、好ましくはプロテイナーゼにでの分解によって可溶化
される。ゲノムＤＮＡは、フェノールによる約２回の抽
出、フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコー
ル（約２５＋２４：ｌ）の混合物による約２回の抽出、
クロロホルム及びイソアミルアルコール（約２４：ｌ）
による約２回の抽出、並びに酢酸ナトリウム／エタノー
ルによる約２回の連続的沈降によって精製される。ＤＮ
Ａは、約７０％エタノールで２回洗浄され、約５ＸｌＯ
”寄生虫相当数／ｍＩ２のおよその濃度でトリスＨＣｌ
２、約１０ｍＭ。

Ｅ　Ｄ　ＴＡ、約１ｍＭ（ＴＥ）中に再懸濁される。

いずれの関連ＲＮＡも、約３７℃で約６０分間約５０μ
ｇ　／　ｍ　Ｑの濃度でＲＮアーゼ、好ましくは熱不活
性化ＲＮアーゼＡでの分解により選択的に除去される。

ＲＮＮアーゼ及びＩＩ！！のいずれの残留タンパク質も
、約５０℃で約３時間約０．５％ＳＤＳ／１５ｍＭ　　
ＥＤＴＡ中におけるブロテイナーゼＫによる二次分解に
よって除去される０次いで、ゲノムＤＮＡは有機溶媒で
抽出され、エタノールで沈降され、約７０％エタノール
で洗浄され、遠心分離により集められる。ゲノムＤＮＡ
ペレットは約２〜３ＸＩＯ’種虫相当数／　ｍ　１２の
濃度でＴＨに懸濁され、２６’Ｏｎｍでの吸光度により
定量される。コクシジウムＤＮＡは、高分子量ＤＮＡの
物理的［オールド及びプライムロース。

遺伝子操作の原理、第２版、カリフォルニア大学出版、
第２０頁、　１９８１年（Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒ
ｏｓｅ。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ、　２ｎｄ　Ｅｄ、。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　ｏｆ　　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ
ａ　　Ｐｒｅｓｓ、　　ｐ、２０（１９８１１１又は化
学的［スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓｌら、サイエンス
、第２０２巻、第１２８４−１２８９頁、１９７８年１
いずれかの断片化によってクローニング用に製造される
。次いで、ゲノムＤＮＡは適切なりローニングベクター
、即ち下記ｃＤＮＡ用クローニングベクター中に組込ま
れる。クローニングベクターは宿主細胞中に導入され、
ヒユーインら、”　Ｄ　Ｎ　Ａクローニング：実務的ア
ブロチ−１第■巻、グローバー編集、ＩＩＩＬプレス、
オックスフォード、第４９−７８頁、１９８５年［１１
ｕｙｎｈ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｉｎ“ＤＮＡ　　ｃｌｏ
ｎｉＢ　：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ
　−、Ｖｏｌ、Ｉ　、　ＧｌｏｖｅｒＥｄ、、　ＩＩＩ
Ｌ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　ｐｐ、４９−７８
１１’１８５１　］の場合と同様の操作によってスクリ
ーニングされる。陽性クローンは、所望の免疫原タンパ
ク質の多量産生用に工学的処理された発現ベクターに移
される。下記発現ベクターは、免疫原タンパク質産生用
に適した下記宿主細胞中に導入されて形質転換させる。

コクシジウム免疫原ポリブチチド産生用の遺伝情報を得
るための最も好ましい方法は、特定タンパク質について
コードするｍｒｌＮＡの１３１である。全ＲＮＡは、約
７時間胞子形成された嚢胞体及び神虫からチャーブウィ
ンら、バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４−５
２９９頁、１９７９年［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ
、、　［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８　：　５２！Ｊ
４−５２９９　ｆ１９７９１１のグアニジニラムチオシ
アイ、−ト法を用いてｔＢ離される。ポリアデニル化Ｒ
Ｎ△は、オリゴ（ｄ　Ｔ）−セルロースクロマトグラフ
ィーにより選択される［アビブ（Ａｖｉｖｌ及びレーダ
ー（Ｌｅｄｅｒｌ　、プロシープインク・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵ　　Ｓ　　Ａ　
　（Ａｖｉｖ　　ａｎｄ　　Ｌｅｄｅｒ、　　Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　［＋９１、第６９巻、第１４０８−１４１２頁
、１９７２年１゜約６〜約９μｇのポリアデニル化Ｉｔ
　Ｎ　Ａを用いる場合、−次及び二次ｃＤＮΔ鎖反応は
ガブラー及びホフマン、ジーン、第２５巻、第２６：１
３−２６９頁、１９８３年［Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄｌｌ
ｏｆｆｍａｎ、　Ｇｃｎｅ　２５　：　２６３−２［ｉ
９１１９８３１］に記載された操作に従い、ＡＭＶリバ
ーストランスクリブターゼのようなリバーストランスク
リブターゼ、ＩＮＮアーゼ［ＩのようなＲＮン′−ゼ及
びＤＮＡポリメラーゼＩのようなりＮＡポリメラーゼを
用いて行われる。ｃＤＮＡはＥｃｏ　　Ｒ１メチラーゼ
のようなメチラーゼでメチル化され、Ｔ４ＤＮＡポＪメ
ラーゼのようなポリメラーゼでプラント末端化され、”
「４　Ｄ　Ｎ　ＡリガーゼのようなりＮＡリガーゼによ
ってＥｃｏＲＩデキサヌクレオチドリンカーのようなホ
スホリル化オリゴヌクレオチドリンカーに結合せしめら
れる。リンカ−結合ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩのような制限
酵素で完全に切断され、切断されたリンカ−は２Ｍ酢酸
アンモニウムから無水エタノールによる繰返し沈降によ
って除去されるＥオカヤマ及びバーブ、モレキュラー・
セル・バイオロジー、第２巻、第１６１−１７０頁、１
９８２年（Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂａｒｇ、　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ　［ｌｉｏｌｏｇｙ　２　：　
１６１−１７０　（１９８２１］　、　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
はエルチップ−ｄ　（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄｉカラム［シュ
ライヒャー＆シェル（Ｓｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　＆　５ｃ
ｈｅｌｌｌｌでｆ！に精製される。制限酵素又は制限エ
ンドヌクレアーゼとは、二本鎖ＤＮＡ中の特定ヌクレオ
チド塩基配列を認識しかつ認識配列中の特定位置におい
て２本の鎖を開裂する酵素である。約１００〜約５００
　ｎ　ｇ　、好ましくは３００頁ｇのＭ５２ｃｏｓＡは
、約７，５μｇの市販Ｅ　ｃ　ｏ　ｒ（Ｉ切断アルカリ
ホスファターゼ処理えｇｔｌ　１ベクターＤＮＡ中に結
合せしめられ、製造者の指示［アマ−ジャムｉＡ＋＊ｅ
ｒｓｈａｍｌ　Ｊに従い市販パッケージ化抽出物により
生体外でパッケージ化される。他の許容されるベクター
も使用可能であるが、えｇｔｌ　ｌが好ましく、その理
由はそれが大腸菌中でβ−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質としてアイメリア抗原の発現を誘導しつるからであ
る。パッケージ化ファージの一部は大腸菌宿主Ｙ　ｌ　
０Ｂ８株に導入され、これらは約６００μｇ／ｍｇ　　
Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
ｆｌ−Ｄ−ガラクトピラノシド）及び約１６ｍＭイソプ
ロピル−〇−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰ’「Ｇ
）含有ＬＢ軟質寒天約２．５ｒｒ＋１２を用いてルリア
ーバータニ（Ｌｕｒｉａ−［１ｅｒｔａｎｉｌ　（Ｌ　
Ｂ）培地寒天プレート上におかれる。

約ｌＸｌ０’の独立組換えファージクローンからなるｃ
ＤＮＡライブラリーが得られる。非組換えバックグラウ
ンドは、Ｘ　−Ｈ）ｌ　Ｉ　／　Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇプレー
ト上での増殖性から決定した場合、約１３％であると評
価される。

ｃ　ＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ヒエ−イ
ンら、゛ＤＮＡクローニング：実務的アプローチ°′、
第■巻、グローバー編集、ＩＲＬブレス、オ・ンクスフ
オード、第４９−７８頁、１９８５年の方法によって行
われる。非増幅ｃＤＮＡライブラリーからパッケージ化
されたファージは上記しューイン記載の大腸菌Ｙ１０９
０株中に導入され、約ロ、５〜約１０　ＸＩＯ’プラー
ク形成単位（ｐｆｕ）／プレートの適切な密度でプレー
ト培養される。プレートは約４２℃で約３時間インキュ
ベートされ、約１０ｍＭ　　ＩＰＴＧ中に予め浸漬され
たニトロセルロースフィルターで覆われ、約３７℃で一
夜再インキユベートされる。

フィルターは除去され、約０．０５％ツイーン（ｒｗｅ
ｅｎｌ　２０　（１’　Ｆ３　Ｓ　Ｔ　）含有トリス緩
衝液（’ｒＵＳ）（約５０ｍｋｌ）リスＮＣＲ１約１５
０ｍＭＮａＣｊｌ！、　　ρ２（約８．Ｏ）のような許
容される緩衝液中約２０％牛脂児血清でブロックされ、
約２０％牛脂児血清含有ＴＢＳＴ中約１：１００希釈さ
れた適切な抗体、通常ウサギ抗挿出抗体又はウサギ抗画
分Ｖ抗体と共に適切な時間にわたりインキュベートされ
る。すべての抗血清はラムタｇｙｔｔ溶原ＢＮＮ９３の
濃溶難物で完全に事前吸査される。抗体結合部位は、フ
ィルターを２８１−タンパク質へと接触させることによ
り検出される。陽性プラークは、各クローンが純粋プラ
ークであることが示されるまで、取出され、再プレート
培養されかつ再スクリーニングされる。

ウサギ抗挿出抗体による約ｌＸｌ０’独立組損え体の胞
子形成嚢胞体ライブラリーの初回スクリーニングでは、
約５７の抗原発現ファージが（１１離される。二次及び
三次の再スクリーニングでは、初回に確認されたクロー
ンの２９％以１が陽性のままであることを示す。

交差スクリーニングでは、前記のように誘導された組換
え融合タンパク質と共に大腸菌Ｙ１０９０細胞の区画上
に各プラーク精製クローンのファージ溶離物的Ｉ　ＨＬ
Ｑをスポ・ソトすることが必要である。タンパク質はニ
トロセルロースに移動し、上記のように免疫プロットさ
れる。交差スクリーニング用抗血清としては、ウサギ抗
Ｅ、テネラ非胞子形成嚢胞体抗体、ウサギ抗Ｅ、テネラ
神虫抗体、ウサギ抗画分Ｖ及びウサギ抗Ｅ、テネラ製型
抗体がある。すべての抗血清はλｇｔ、ｌ　ｌ溶原ＢＮ
Ｎ９３の濃溶雌物で完全に事前吸着される。

組換え体及び野生型λｇｊｌｌファージは、約ＩＯの多
重度で大腸菌宿主Ｙ１０８９株中に１原として導入され
る。溶原化クローンは、約５０μｇ　／　ｍ　Ｑアンピ
シリン補充ルリアーバータニ（ＬＢ）培地約１０　ｍ　
１２中約３２℃で、６００百ｍの光学密度が０．２５に
達するまで増殖せしめられる。ファージｍ製は約２０分
間にわたる約４５℃への温度シフトによって誘導され、
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の合成が約１０ｍ
Ｍ　　ＩＰＴＧの培地添加によって誘導される。

細胞はインキュベートされ、遠心分離により集められ、
ペレットがｐ１１約７．５の約５０ｍＭ）リスＨＣｆｆ
　、約１５０ｍＭ　　ＮａＣｊ２．約５　ｍ　Ｍ　エチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有ＮＥＴ緩衝液約２
５０μｇ中約２％ＳＤＳと共に再懸濁される。細胞は煮
沸により溶離され、細菌ＤＮＡが遠心分離により除去さ
れる。上澄液は変性条件下で約５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上
において分析される。２つの同一ゲルが用いられるが、
１つは銀染料［バイオラッド１Ｂｉｏｒａｄ）　］で染
色され、他はトービンら、プロシープインク・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・ナイエンスＬＪＳＡ、第
７６巻、第４３５０−４３５４頁、１９７９年の方法に
よって免疫プロットされる。

組換え免疫原の各々に対する単一特異性抗体は、ホール
（！Ｉａｌｌｌら、ネーチャー、第３１１巻、第３７９
−３８２百、１９８４年の方法の修正法により多行異性
１ｐｏＬｙｓｐｅｃｉｆｉｃｌ抗血清からアフィニテ、
ｔ−Ｗ４”’Ｈされるか、前記のようなウサギを下記の
ような精賀組換えＥ　テネラタンパク質で免疫処理する
ことにより得られるか、又はコーラ−（にｏｌ＋１ｅｒ
ｌ及びミルスタイン１ｉｌｉｌｓｔｅ／ｊｎｌ　、ネー
チャー、第２５６巻、第４９５−４９７頁、１９７５年
の技術を用いてモノクローナル抗体として得られる。本
明細書で用いられる単一特異性抗体は、関連抗原との均
質的結合特性があるｍ−抗体槽又は多抗体種として定電
される１本明細書で用いられる均質的結合とは、特異的
な天然又は組換えＥ、テネラ群免疫原と関連した特異的
抗原又はエピトープと結合しつる抗体槽の能力に関する
。ポリクローナル抗血清から単一特異性抗体を（１６ホ
ールの技術では、スクリーニング用に必要とされるＭ製
組換えクローンからのフィルタープラークリフト（Ｌｉ
ｆｔｌの製造を必要とする。約２×ｌＯ５のプラーク形
成単位が、３７°Ｃのインキュベート時間の最後で半融
合溶菌状態に近づくようにプレート培養される。ニトロ
セルロースはプレートから取除かれ、’ｒ　Ｂ　Ｓ　Ｔ
中で約４時間約２０％牛脂児血清でブロックされ、約０
，０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３含有ＴＢＳＴ中約２０％牛脂児
血清で約１：２０Ｇ希釈された事前吸着多特異性血清約
２０　ｍ　Ｑと共に一夜インキユベートされる。フィル
ターは、少なくとも２０分間約５０ｍｇＴＢＳＴで少な
くとも５回並びに約０．１５ｍＭ　　ＮａＣβ及び約０
．０５％ツイーン２０で１回洗浄される。抗体は、ｐ＋
１約２．８で約３０分間約０．２Ｍグリシン−ＨＣｆｆ
　、約０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１２及び約０．０５％
ツイーン２０のような許容される溶離剤で溶離される。

ｐ　Ｉ−１は約８．０に調節され、抗体は貯蔵される。

組換えＥ、テネラ群免疫原、抗原又はエピトープの各々
に対して反応性のモノクローナル抗体は、近交系マウス
、好ましくはＢａβｂ　／　ｃを適切な組換えタンパク
質で免疫処理することにより得られろ。マウスは１等量
の許容しつるアジュバント中０．５ｍＱにつき約１００
μｇ〜約ｌＯμｇ、好ましくは約１μｇの組換え免疫原
で腹腔内に免疫注口・↑される。このような許容しつる
アジュバントとしては、格別限定されないが、フロ・イ
ンド完全液、フロイント不完全液、ミョウバン沈降物、
コリネバクテリウム・パルブム及びｔＲＮＡ含有曲中水
型エマルジョンがある。マウスには、初回免疫後約１４
．２１及び６３日目にアジュバントなしで算機の組換え
免疫原の静注追加免疫が行ねれる。最終追加免疫後約３
日目に、個々のマウスは抗組換え免疫原抗体に関して血
清学的に試験される。抗体産生マウスから肺臓細胞が単
離され、当業界で公知の技術によりＳＰ−２１０等のよ
うなマウスミエローマ細胞と融合せしめられる（コーラ
−及びミルスタイン、ネーチャー第２５６巻、第４９５
−４９７頁、１９７５年参ｊＱ）、ハイブリドーマ細胞
はダルベツコ修正イグル培地（ＤＭＥＭ）のような適切
な細胞培地中ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテ
リン存在下での増殖により選択される。抗体産生ハ・ｒ
ブリドーマは、好ましくはマクファーソン、軟寒天技術
、組織培養法及び応用、クルーズ及びバタン編集、アカ
デミツクプレス、第２７６頁、１９７３年　［ｕａｃＰ
ｈｅｒｓｏｎ、　　５ｏｒＬ　　Ａｇａｒ　　’ｒｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ。

ｉｎ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄ　　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

にｒｕｓｅ　　ａｎｄ　　ＰａＬｅｒｓｎｎ、　　Ｅｄ
ｓ、　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ。

ｐｙ２７［Ｉ＋１９７：ｌ）　］の軟寒天技術を用いて
クローニングされる。別々のコロニーが適切な培地中で
の培養用に培養プレートのｈウェルに移される。抗体産
生細胞は、適切なＥ、テネラ組換え免疫原でスクリーニ
ングすることにより確認される。免疫原陽性ハイブリド
ーマ細胞は、当業界で公知の技術により維持される。特
異的抗組換えＥ、テネラモノクローナル抗体は、生体外
でバイブリドーマを培養するか又は当業界で公知の操作
によりハイブリドーマ注射後マウス体内で腹水を作り出
すことにより得られる。

寄生虫抗原は、前記ウェスターンプロット分析により分
析される。対象クローンは、発現ポリペプチドと上記抗
血清との反応性に応じて４つの抗原Ｊｆｆに分けられる
（第１表参照）、同−群の異なるクローンは、下記のよ
うに、抗体反応性。

ＤＮＡ交差ハイブリッド形成及び制限エンドヌクレアー
ゼ地図作成から判断した場合に、同一ポリペプチドの各
部分を発現する。

箸−上一入 ｌ゛離ツクローン産物　疫反応 ＋ ＋ ＋ ｎ、　ｄ。

ｎ、　ｄ。

ｎ、　ｄ。

ｎ、　ｄ。

Ｅ、ｔ、はアイメリア・テネラな示し、一方Ｅ、ａ、は
アイメリア・アセルブリナを示す。

（＋）は抗体が特異的組換え誘導タンパク質と反応する
ことを示し、一方（−）はかかる応答性の欠如を示し、
ｎ、ｄ、は実施せず（ｎｏｔ　ｄｏｎｅ）を意味する。

λｇｌ；ｌ　ｌクローンからのｃＤＮＡインサート（ｉ
ｎｓｅｒｔｌの精製は、約ｐＨ７，５の約５０ｍＭＮａ
ＣＪ２／約１００ｍＭトリスＨ（１２、約５ｍＭＭ　Ｈ
ＣＱ　２からなる反応緩衝液中約５倍過剰の酵素Ｅｃｏ
ＲＩで組換えファージＤＮＡを完全に切断することによ
り行われる。反応生成物は約１／Ｉ　Ｏ量の３Ｍ　（ｐ
Ｈ５，６＞貯蔵溶ｉ４Ｍの添加によって約０．３Ｍ酢酸
ナトリウムに講習され、エタノールで沈降され、冷却さ
れ、遠心分離によって集められる。ベレットをＴＥに懸
濁後、１）　Ｎ　Ａは臭化エチジウム含有アガロース中
で電気泳動に付され、ファージアーム（ａｒｍｌからイ
ンサートを分離させる。

インサートの分別化は、紫外線下での視覚化により確か
められる。インサートはＮＡ−４５（シュレ〜チャー＆
シュエル）膜上で電気泳動に付され、かかる後膜から溶
離される。不溶性粒子は遠心分離により除去され、可溶
性物質はフェノール、フェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール及びクロロホルム／イソアミルアルコ
ールで抽出される。ＤＮＡは酢酸ナトリウム／エタノー
ルで沈降され、エタノールで洗浄され、風乾される。各
ＤＮＡの一部が確認用分析アガロースゲル上で分析され
る。

保護コクシジウム免疫原についてコードする遺伝子の発
現は、様々なプロモーター発現系をもついくつかの異な
る宿主細胞中で行われる。宿主細胞としては、細菌、酵
母、昆虫及び哺乳動物細胞がある。抗原はいくつかのウ
ィルス系でも発現可能である。遺伝子は多数の原核生物
細胞及び様々な真核生物細胞中で発現しつるが、最・も
好ま゛しい宿主細胞は大腸菌である。保護免疫原の発現
用に使用可能な発現ベクターとしては格別限定されずｐ
ＢＲ３２２、ＰＰＬａ２３１１．ｐＫｃ３０゜ｐ　ｊａ
ｃ　　ｌ　２．　　λｇｔ　ｌ　　１．　　ｐＡＳ　１
．　　ｐＬｃ２４、ｐＳＩ３２２６、ｐ　ＲＩ　’「２
　Ｔ及びＳＶ４０があるが、ｐＪＣ２６４と命名された
ＣｈｅＹ−ｐＬＩｃ由来ベクターが好ましい、天然タン
パク質もしくはそのフラグメント、組換えタンパク質も
しくはそのフラグメント又はアイメリアペプチド免疫原
性を高めるかもしくは高めない他のタンパク質と結合し
た融合タンパク質であるアイメリア・テネラ免疫原の使
用が本発明に含まれることは望ましいしかつその意図で
もある。融合免疫原は、免疫原発現タンパク質が発現プ
ラスミドでコードされた付加ポリペプチド部分又は付加
ＤＮＡ塩基配列の導入によって遺伝子に加えられた付加
ペプチド部分を含有するようにデザインされる。　ｒ＋
Ｊｃ２６４プラスミドは、様々なアイメリア・テネラペ
プチドに結合又は融合した５つのリンカ−アミノ酸に機
能可能に結合せしめられた大Ｉｌｌ菌ＣｈｃＹタンパク
質の８８アミノ酸部分の発現を含むようにデザインされ
る０機能可能に結合せしめられたとは、所望のタンパク
質が機能可能に結合した遺伝子、セグメント又はリンカ
−をもつ発現ベクターを含んだ細胞によって産生されつ
るようなヌクレオチドセグメント、リンカ−又は遺伝子
の適切な連続的配列を意味する。ＣｈｅＹ遺伝子のヌク
レオチド配列及びその遺伝子から（」１られるアミノ酸
配列は下記表で示されている。

東−スー去 １０　　　　　　２０　　　　　　　３０　　　　　　
　４０　　　　　　　ＳＯＡ’ｒＧ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　
ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　’ｎＴ　ＴＴＧσ口
’　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣｍ　ＴＣＣＡＣＣＡ’ｒＧ
　ＣＣＡＭＥＴ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　１．Ｙｓ　ＧＬＵ　
１．ＥＵ　ＬＹＳ　ＰＩＩＥ　ＬＥＬＩ　ＶＡＬ　ＶＡ
Ｌ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＰＩＩＥ　ＳＥＲηＩＲＭＥｒ　
ＡＲＧＣＧ（：　ＡＴＡ　Ｇ’ｒＧ　ＣＧＴ　ＡＡに　
ＣｒＧ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　Ｔ
ＴＣＡＡＴ　ＡＡＴ　ＧＴｒ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＧ
ＡＩＩＧＩＬＥＶＡｌ、ＡＲＧＡＳＮＬＥＤＬＥＤＬＹ
ＳＧＬＬＩＬＥＬＩＧＬＹＰＩＩＥＡＳＮＡＳＮＶＡＬ
ＧＬＬＩＧＬｕＡＬＡ１１０　　　　　　１２０　　　
　　　１：１０　　　　　　１４０　　　　　　１５０
　　　　　　　＋６０ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＣＧＴＣＧ
ＡＣＧＣＴ　ＣＴＣＡＡＴ　ＡＡＧ　ＴｒＧ　ＣＡＧ　
ＧＣＡ　ＧＧＣＧＧＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ｍ　ＧＥＴＧ
ＬＩＩ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＡＳＩ’　Ａ１．Ａ
　ＬＥＩＪ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＬＥＩＩ　ＧＬＮ　ＡＬ
Ａ　Ｇ１．Ｙ　ＧＬＹ　’ＩＹＲＧＬＹ　ＰＩＩＥ　Ｖ
ＡＬＡ’ｒＣＴＣＣＧＡＣ’ｒＧＧ　ＡＡＣＡ’ｒ（’
、　ＣＣＣＡＡＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＣＣＴＧ　ＧＡ
Ａ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴＩＬＥ　
５ｉｌｌ　ＡＳＰ丁ｎＰ　ＡＳＮ　ＭＥＴ　１１１１０
　ＡＳＮ　ＭＦｒ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＬＥＤ　ＧＬｕ　
ＬＥＤ　１．ＥＵ　［、ＹＳηＩＲＩＬεＣＧＴ　ＧＣ
Ｇ　ＧＡＴ　ＧＧＣＧＣＧ　ＡＴＧ　ＴＣＧ　ＧＣＡ　
ＴｒＧ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＴＡ　ＡＴＧ　ＧＴＧ　Ａ
ＣＴ　ＧＣＡＡＩＩＧ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＡＬ
Ａ　ＭＥ’ｒ　ＳＥＲＡＬＡ　ＬＥＤ　ＰＲＯＶＡＬ　
ＬＥＬＩ　ＭＥＴ　ＶＡＬηＩｌｌ　ＡＬＡリンカ−ア
ミノ酸は、天然タンパク質を産生ずる前記のＥ、テネラ
遺伝子を融合タンパク質に結合させるために用いられる
アミノ酸として本明細書では定義される。いずれのアミ
ノ酸又はアミノ酸群もリンカ−として使用可能であるが
、しかしながらＣ＋］ｅ　Ｙタンパク質をＥ、テネラタ
ンパク質に結合しつるタンパク質の好ましいアミノ酸配
列及びヌクレオチド配列は以下のとおりである＝５°Ｇ
ＣＣＣＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＧＮ　３ＡＬＡ　ＧＬＮ
　ＧＬＵ　ＰＩＩＥ　Ｇ１．Ｙ３°末端ＮはｃＤＮＡの
第一ヌクレオチドを構成し、（すられるアミノ酸がいつ
もグリシンであればいずれのヌクレオチドも表わす。

好ましいプラスミドｐＪＣ２６４はプラスミドｐ　、Ｊ
　Ｃ２２０から得られるが、これは大腸菌走化性遺伝子
ＣｈｅＹ及びラット動脈性ナトリウム利尿ファクター（
ＡＮＦ）の遺伝子の部分を含ノυだ構造体から得られる
。ＣｈｅＹ−ＡＮＦプラスミドは、マツムラら、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー、第１６０巻、第３６−
４１頁、１９８４年［ＭａＬｓｕｍｕｒａ　ｅＬ　ａｌ
、、　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　！’ｌａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ１６０　：　３６−４１　（１９８４１］に
記載されたＣｏｌ２Ｅ１由来プラスミドｐＬｃ１−２８
から作成される。

ＣｈｅＢａ伝Ｔの３°部分並びにＣｈｅＹ及びＣｈ　ｅ
　Ｚ遺伝子を含むＣｈｅオペロンフラグメントはＢａｍ
ＨＩ−Ｈｉ　ｎｄｌｌｌフラグメントとしてｐ　Ｉ−Ｃ
Ｉ　−２８プラスミドから取出され、ＢａｍＨＩ　−Ｈ
ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ切断ｐＵｃ　ｌ　３プラスミド［Ｐ
Ｌバイオケミカルズ（ＰＬ　Ｂｉｏｃｌ＋ｃｍｉｃａｌ
ｓｌ　］に組込まれてサブクローニングされ、　　ｐＵ
ｃ　ｌ　３−（：ｈｅＹ−Ｃｈ　ｅ　Ｚプラスミドを生
じる。Ｔａ１ｃ　ｌ　３−Ｃｈ　ｅ　Ｙ　−Ｃｈ　ｅ　
Ｚで形質転換された大腸菌ＪＭ１０５クローンは、ｐＵ
Ｃ１３ベクターの影響をうけるｌａｃプロモーターを除
き、Ｃｂ　ｅ　Ｙ及びＣｈｅＺポリペプチドを発現する
［デービスら。

分子生物学における基本的方法、エルスピア、ニューヨ
ーク、ニューヨーク、第３０頁、１９８６年（Ｄａｖｉ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ１ａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ口ｉｏｌｏｇｙ、　　Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　　Ｎｅｗ　　
Ｙｏｒｋ、　　ｐｇ、３０（１！１８６１　）　］　、
　　ｐＵＣ１３−ＣｈｅＹ−ＣｈｅＺプラスミドは、Ｃ
ｂ　ｅ　Ｙコード領域内部の唯一のＰｓｔＩ部位（前記
マツモトら参照）及び挿入ＣｈｅＤＮＡの３°側のｐＵ
Ｃ１３ポリリンカー内の唯一のＳｍａ１部位で切断され
る。　ｐ［ＪＣ１３ベクター及びＣｈｅＹのＮ末端１０
０残基についてコードするＤＮＡを含んだ、得られる３
ｋｂ　　Ｐｓｔｌ−５ｍａｌフラグメントは、Ｍｅｔ−
（ラットＡＮＦ−２６）配列についてコードしかつＡＮ
Ｆペプチドの末端コドンの３°側に非翻訳ＲＡＳ　ｌ配
列５ｏｂｐを有するｐＳＣＮ　ｌ　−（ラットＡＮＦ−
２６）の１６０ｂｐ　　Ｐｓｔｌ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　！Ｉ
＋フラグメントと再結合される。この発現ベクターはＣ
ｈｅＹ−ＡＮＦベクターと呼ばれる。ｐＳＣＮｌ−（ラ
ットＡＮＦ−２６）融合プラスミドは、酵母ＲＡＳ　ｌ
タンパク質５ＣＩＮのＮ末端１６５アミノ酸を発現する
ｐＳＣＮ　ｌプラスミドから作成される［テミール（Ｔ
ｅｍｅｌｅｌら、ネーチャー、第３１３巻、第７００−
７０３頁、１９８５年１゜プラスミドｐｓｃ　ｌ　Ｎは
Ａｃｅ　１で完全に分解され、末端は大腸菌ＤＮＡポリ
メラ１４１大フラグメント（クレノウボリメラーゼ）で
補足される１合成ＡＮＦ遺伝子はｐｓｃ　Ｉ　Ｎに結合
されて、コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｌ大腸閑、
Ｉ　Ｍ　Ｉ　Ｏ５細胞を形質転換させるために用いられ
る。Ｃｈ　ｅ　Ｙフラグメントの前のＥ　ｃ　ｏ　１１
１制限部位から最初のＬｌ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ制限部
位までのＣｈｅＹ−ＡＮＦプラスミドのヌクレオチド配
列は、ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｂ−Ｐｅｒｒ
ｏｎｌ　ら、ジーン、第３３巻、第１０３−１１９頁、
１９８５年テｐＵｃ１９に関して示されたものと同一で
ある。

ｐＪＣ２６４発現プラスミドは丸ｇｔｌ　１ＥｃｏＲ１
部位として同一の読取り枠で唯一のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部
位を有しており、えｇｔｔｔ発現ライブラリーからのＥ
　ｃ　ｏ　Ｆ＜　１フラグメントの容易なサブクローニ
ング及び発現を可能にしている。

（１られる融合タンパク質中におけるＣｈｅＹ遺伝子産
物部分の取込みは、タンパク質の安定化を促進しかつタ
ンパク質の精製度を高める。β−ガラクトシダーゼのよ
うな他の融合キャリアと比較してサイズの小さなＣｈｅ
Ｙタンパク質の場合には、所定質量の融合タンパク質に
おいて対象タンパク質のモル収率をより好ましいものに
する。

ＣｈｅＹ含有プ有税ミドｐＪＣ２６４は、アミノ末端の
最初の９３アミノ酸が大腸菌ＣｈｅＹタンパク質及びリ
ンカ−に由来する融合タンパク質を高レベルで発現する
。上記のように、ｐＪＣ２６４プラスミドは第７図で示
されているようにＣｈｅＹ−ＡＮＦプラスミドから得ら
れる。

Ｃｂ　ｅ　Ｙ　−Ａ　Ｎ　Ｆは）Ｉ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ
Ｉで部分的に切断され、約０．７％ジ−プラーク（Ｓｅ
ａｐｌａｑｕｅｌ　アガロスゲル中で電気泳動に付され
る。完全鎖長直鎖ＤＮＡはｉ械的に摘出され、溶融によ
りゲルから除かれ、ＮＡＣＳカラム（ＵＲＬ）で精製さ
れ。

エタノール沈降により回収される。ＤＮＡフラグメント
はＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント［ベー
リンガー・マンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒｌＪａｎ
ｎｂｅｉｍ）　］でＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１末端を補足す
ることによりプラント化され、フェノール抽出され、エ
タノール沈降に供される。５°位でホスホリル化された
Ｂａｍ１ｌｌリンカ−は精製ＤＮＡに結合され、大腸菌
１−Ｉ　Ｂ　１０１は結合混合体で直接形質転換される
。アンピシリン耐性形質転換体コロニはＢａｍＨＩリン
カ−用に制限地図化される。

ｐ　Ｊ　Ｃ２２０と命名されたコロニーはプロモータ隣
接Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位にＢａｍ１ｌｌリンカ−を
有している。プラスミドはその場合にＣｂ　ｅ　Ｙコー
ド領域の３°宋端にＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位を有して
おり、したがって独特である。プラスミドｐＪＣ２２０
はＩｆ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断され、４塩基突出部
ｉｏｖｅｒｈａｎｇｌのうち２塩基はｄ　Ａ　−１”　
Ｐ及びｄ　Ｇ　Ｔ　ｌ）の存在下ＤＮＡポリメラーゼｌ
のフレノウフラグメントで補足される。突出部のうち残
り２塩基はＳｔヌクレアーゼで除去され、プラント末端
を与える。次いで、ＤＮＡはＥｃｏＲＩで切断され、ｄ
　Ａ　Ｔ　Ｐ及びｄ　Ｔ　”「Ｐの存在下ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのフレノウフラグメントで補足される。プラス
ミドはＴ４ＤＮＡリガーゼによるプラント末端結合でｎ
ｆ　ｆＭ化されてｐ　Ｊ　Ｃ２６４を生じるが、これは
Ｃｂ　ｅ　Ｙコード領域の３°宋端側に唯一のＩＥ　ｃ
　ｏ　１１１部位をイ■している。今′「のＥｃｏＲＩ
部位はえｇｔｌｌＯ）ＥｃｏＲ１部位として同一の読取
り枠内に存在するため、えｇｌｌ、ｌ　ｌライブラリー
中発現により確認される抗原のＣｈｅＹ融合タンパク質
として直接的サブクローニング及び発現が可能になる。

ｐＪｃ２６４制限地図は第８図で小されている。

組換ええｇｔｌ　ｌバクテリオファージのミニブレブｆ
ｍｉｎｉｐｒｅｐｌが製造され、ファージＤＮＡが単離
される。各抗原用の遺伝子インサートはＥ　ｃ　ｏ　Ｒ
Ｉ　／Ｉ！ｉ化で除去され、アガロースゲル電気泳動に
よりファージアームから分別化される。次いで遺伝子は
、唯一のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位で直鎖化されかつホスフ
ァターゼ処理されて自律結合能を低下させたプラスミド
ｐＪＣ２６４中に挿入される。次いで、結合生成物は当
業界で公知の標準的Ｃａ　ＣＩ２ｘ法を用いて細菌宿主
大腸菌ＪＭ８３中に組込まれて形質感染されｆｔｒａｎ
ｓｆｅｃｊ）、形質転換体はアンピシリンプレート上で
選択される。アンピシリン耐性コロニーは、Ｅ、デネラ
免疫原に対して得られるポリクローナル抗血清を用いて
。

インサートの存在について調べ、細菌プロモータに関す
る外来ＤＮＡの向きについて調べ、かつウェスターンプ
ロット分析により細菌融合タンパク質の発現について調
べるために１分析的スケールで増殖せしめられる。

ＤＮＡインサートは上記で確認された様々な免疫原群の
代表的ファージクローンから単離され、かつＣｈｅＹベ
クターｐＪＣ２６４に関して前記されたｐＵＣｌ　８プ
ラスミド−ベクターに組込まれてサブクローニングされ
る。各群の構成物の制限エンドヌクレアーゼ地図が作成
される。制限エンドヌクレアーゼとしては、格別限定さ
れず、下記のものがある。

ＡｌｕＩ　　　　　　　　　　ｌｌ１ｎｄＩＩＩ　　　
　　　　　　　５ａｉｌＡｐａｆ　　　　　　　旧ｎａ
ｉｌ　　　　　　　５ａｕ３ａＡｖａｌ　　　　　　　
　　　ｔ（ｉｎｆｌ　　　　　　　　　　　５ｓｔｌＡ
ｖａｌ　Ｉ　　　　　　　　ｌ１ｐａＩ　Ｉ　　　　　
　　　　　　５ｓｔｌ　Ｉ［１ａｍｌｌｌ　　　　　　
Ｋｐｎｌ　　　　　　　　Ｔａｑｌｒｌｇｌ　Ｉ　　　
　　　　　　Ｎｃｏｌ　　　　　　　　　　　ＸｂａＩ
ＣｌａＩ　　　　　　　　　　Ｐｓｔｌ　　　　　　　
　　　　　ＸｈｏｌｌｉａｅｌＩＩ　　　　　　　　Ｐ
ｖｕｌ　　　　　　　　　　　　　ＸｈｏｌｌＩｌｈａ
ｒ　　　　　　　　　　ＰｖｕＩＩ上記のすべてが市販
されている。下記表は、群、各群に属するクローンの名
称及びクローンインサート内で切断不可能な制限エンド
ヌクレアーゼについて示している。

第３表 命名されたクローンに存在しない 制　エンドヌクレアーゼ部位 一群一 ２旦二２各称 ３０６゛ ＰＩ Ｏ９ ＳＯ７゛ ＯＩ Ｐ５４ ３口３１１ 制限エンドヌクレアーゼ １１ａｍ旧、　　ｌｌ１ｎｄｌＩ１．　　Ｋｐｎｌ、　
　Ｎｃｏｌ。

Ａｖａｌ、　Ｃ１ａ１．　Ｘｈｏｌ、　５ａｉｌＳｓｔ
１．５ｓｔ１１．　Ｘｂａｌ、　Ｂｇｌｌ。

口ａｍＨ１，１ｌｉｎｅ１１．　　Ｋｐｎｌ。

Ｎｃｏｌ、Ｃ１ａｌ、　　５ａ１１．　５ｓｔｌ。

Ｘｂａｌ Ｂａｍｌｌｌ、　Ｋｐｎｌ、　ｌ１ｉｎｃｌｌ。

Ｎｃｏｌ、　　Ｃ１ａ１．　　Ｐｖｕｌｌ。

Ｘｈｏｌ、　　５ａｌｌ　　Ｓｓｔ、１．　５ｓｔＩＩ
。

Ｘｂａｌ、　　ＢｇＩＩ。

１１ａｍ旧、　ＨｉｎｄＩＩｌ、にｐｎｌ。

ＡｖａＩＩ、　Ａｐａｌ、　Ｎｃｏｌ。

ＡｖａＩ、　　Ｃ１ａ１．Ｐｓｔｆ、　　Ｘｈｏｌ。

Ｓａｌ［、５ｓｔＩ１．　　Ｘｂａｌ Ａｐａｌ、　　Ａｖａｌ、　　Ａｖａｉｌ、　　ロａｍ
ｌｌｌ。

［１ｇ１１．Ｃ１ａｌ、＋ｌ１ｎｃｒ１．Ｎｃｏｌ。

１’ｓｔ［、ＰｖｕＩｌ、　　５ａｉ１．　５ｓｔｌ。

５ｓｔ１１．Ｘｂａｌ、Ｘｈｏｌ 一部の制限エンドヌクレアーゼは、すべてのクローンで
はないが、群中の１以上のクローンを開裂することがで
きる。Ｂ群において、４つのクローンのうち少なくとも
１つを開裂する他の制限エンドヌクレアーゼとしてはＡ
　ｖ　ａ　’［、Ｐｓｔｌ、Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉｆがある。

これらの部位は地図に示されなかった。Ｈ群において、
制限エンドヌクレアーゼ５ｓｔＩは３つのクローンすべ
てを開裂しないが、但しその部位は地図にまだ示されて
いなしＸ。

上記情報は、ＬＢブイヨン中ミニ調裂物としてｐ　Ｕ　
Ｃ１８組換えプラスミドを増殖させかつ下記アルカリ溶
菌法を用いてＤＮＡを単離することにより決定される。

ＤＮＡは約２０ｕｇ／＋ｎＪ２ＤＮアーゼ−フリー膵臓
ＲＮアーゼ含有約１０ｍＭトリス−１１Ｃｆｆ（約ｐｉ
−１８，０）、約１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（約ｐＨ８，０）
を含有したＴＥ緩衝液のような分解用緩衝液中に再懸濁
され、ポルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ、渦巻式）ミキサー
で簡単に混合される１次いで、ＤＮＡサンプルはｃＤＮ
Ａインサートを開裂しつる能力をもつか否かを決定する
ために様々な制限エンドヌクレアーゼ［ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（ｌｌｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ市販］で分解され
る。地図作成分析は、インサート／プラスミドの単一及
び二重分解をするために行われる。ＤＮＡフラグメント
は約１％アガロースゲル上で電気泳動分離され、同一ゲ
ルで同時に操作されたＤＮＡマーカーと比較してサイズ
分けされる。地図は、フラグメントサイズデータ及び公
知のベクター制限部位をインテリジエネティクス制限地
図作成プログラムＩＩｎｔｃｌｌｉｇｅｎｅＬｉｃｓ　
　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　　Ｍａｐ　　Ｇｅｎｅｒａ
ｔｏｒｐｒｎｇｒａｍｌ　　［Ｍ　Ａ　Ｐ、インテリジ
ェネティクス社（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、　
Ｉｎｃ、ｌ］に加えることによって谷クローンから作成
される。ヌクレオチド配列に沿って導かれる酵素切断部
位の位置は約±ｌＯ％のレベルで正確である。Ａ群の制
限地図は第１図に示されている。８０６遺伝子は、下記
塩基位置に制限部位を有する鎖長的１８８６のヌクレオ
チド（ｎｔ）である：　ｌ　１Ｂ　（ＡｐａＩ）、２８
４　　（ＰｓｔＩ）、２９３　　（Ｐｖｕｒｌ）。

５９７　　（Ｐｓｔｌ）、　　１２８３　　（ＰｓｔＩ
）。

１８２０　（［（ｉ　ｎｃｌり及び１８３７　（Ａｖａ
ｌｏ。ＳＰＩ遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する
約１４０４ｎｔである：２１３（Ｐｓｊｌ）、８８９　
（ＰｓｔＩ）、１３８６　（Ｈｉｎｃｌｌ）及びｌ　３
９８　（Ａｖａｉｌ）、　８０６７遺伝子は下記塩基位
置に制限部位を有する鎖長８２２　ｎｔである：１０Ｂ
　（Ｐｓｔｌ）及び８１６（Ｈｉｎｃｌｌ　）。

８群クローンの制限地図は第２図で示されている。ＳＯ
９遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的１０
７１ｎｔである：２９７（Ｐｕｖｌｌ）、３８１　（Ｂ
ｇＩ２Ｉ）、５７０　（Ａｐａ　Ｉ）、７５０（８ｇＩ
２１）、７８９　（Ｘｈｏｌ）及び９００（Ｐｖｕｌｌ
）、　５０２４遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有す
る鎖長的１１０８ｎｔである＝２４３　（Ｐｖｕｌｌ）
、２７８　（ＢｇＪ２　Ｉ）、４Ｂ２　（Ａｐａり、６
４６　（８ｇＩ２１）。

６９４　（Ａｐａｌ）、７１８　（ＸｈｏＩ）、７４３
　（Ａ　ｖ　ａ　ＩＩ　）　、　８４５　（Ｐ　ｖ　ｕ
　ＩＩ　）及び９Ｂ２　（Ａｐａｌ）、　ＳＯ７遺伝子
は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的９８０ｎｔで
ある＝１１５　（Ｐｖｕｌｌ）　、　　ｌ　５０　（Ｂ
ｇｊ２１）　。

３６１　（Ａｐａｌ）、５１８　（８ｇＩ２１）。

５６１　　（Ｘｈｏ　Ｎ　、５６４　（Ａｖａｉｌ）、
７１７　（Ｐｖｕ［目及び８６１　（Ａｐａｌ）。

Ｓｏｌ遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的
３３７ｎｔである：　７５　（Ａｐａ　Ｉ）、２３６　
（ＢｇｆｆＩ）、２６１　（ＸｈｏｌＪ及び２７５（Ａ
ｖａｉｌ）。

０群クローンの制限地図は第３図で示されている。ＳＰ
５４遺伝子は下記塩基位置に制限部位を・有する鎖長的
６８７ｎｔである：１８７　（ＡｖａＩ）、２７３　（
Ａｐａｌ）’、５５９’（ＰｓｔＩ）及び６２７　（Ｈ
ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　）　、　Ｓ　Ｐ　５９遺伝子は下
記塩基位置に制限部位を有する鎖長的１０１７ｎｔであ
る：２２２　（Ａｖａｌｌ）、２５０　（Ａｖａｌ）、
５００　（Ａｖａｌ）、６０３　（Ａｐａｌ）、６８２
　（Ａｐａｌ）、８８９　（ＰｓｔＩ）及び９４７　　
（Ｉｆ　　ｉ　　ｎｄｌｌ＋）　　。

１１群クローンの制限地図は第４図で示されてい６、Ｓ
Ｏ：３１１又はｓＯ３１１−２９Ｉａ伝子ｉｆ下記塩基
位置に制限部位を有する鎖長的６８４ｎ　ｔである：　
ｌ　５４　（Ｈｉ　ｎｃ　Ｉｆ）　、　２６２　（Ｂｇ
Ｉ２■）及び４００　（Ｐｖｕｌｌ）、ＳＯ２２７遺伝
子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長６３１ｎｔで
ある：　２５７　（Ｈｉ　ｎｃｌｌ）、３６９　（Ｂｇ
ｆｆＩ）及び５３７　（ＰｖｕｌＩ）、　５０２３１遺
伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長６３２　ｎ
　ｔである：２５５　（Ｈｉｎｃｌｌ）、３８２　（Ｂ
ｇｆｆＩ）及び５１４（Ｐｖｕｌｌ）。

Ｆ群りローンの制限地図は第５図で示されている。８０
２１６遺伝子は下記塩基位置に制限部位を有する鎖長的
４８７　ｎ　ｔ、である：４９（ＨｐａＩＩ）、９７　
（ＨｈａＩ）、１３２　（ＫｐｎＩ）、１３９　（Ｓａ
ｕ３Ａ）、１７６　（ＡｌｕＩ）、２００　（Ｓａｕ３
Ａ）、２２８　（ＡｌｕＩ）、２３７　（Ｈａｅｌｌｌ
）、２９６　（Ｔａｑ　Ｉ）。

３３５　（Ｈｉｎｆｌ）、３４１　　（ＴａｑＩ）、４
０２　　（Ｈｉｎｄｌｌｌ）、　　４０４　　（Ａｌｕ
ｌ）。

４１５　　（Ｉｌｈａｌ）、　　４３２　　（Ｔａｑｌ
）。

４　：３５　　（Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉｆ　）　　、　　４３
５　　（Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ　）　　、４５５　（Ｉｔ
　ｉ　ｎ　ｆ’　Ｉ）及び４７７　（ＡｌｕＩ）。

最初の８つのｎｊ及び最後の８つのｎｔはリンカ−のｎ
ｔを表わし、Ｅ、テネラＦ群遺伝子の一部ではない。

組換え免疫原コクシジウムタンパク質、組換え融合タン
パク質及び組換えＣｈｅＹ融合タ融合タンパ上質しくは
組換えＣｈ　ｅ　Ｙ融合タンパク質の産生は、単一コロ
ニーから単離された選択組換え細菌の、アンピシリン含
有２ＸＹＴ培地中におけるｍｍの培養によって行われる
。−夜経過培養物は約５００ｒｒ＋４２の２　Ｘ　Ｙ　
’「＋アンピシリンに接Ｔｆｆｉするために用いられる
。培養物は中間対数的増殖用が（すられるまで曝気下約
３７℃で増殖せしめられ、その時点でＩＰＴＧが最終濃
度的１００μＭまで加えられる。細胞は更に約３〜４時
間インキュベートされ、永めされ、遠心分離により集め
られる。細胞は洗浄され、遠心分離により集めらｒｔ、
ｐＨ約８０の約３０　ｍ　Ｍ　トリスＨＣＲ，約５．０
ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び約１ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオリドからなる緩衝液ＡＰＪ１０ｍＱ中に再懸濁
される。細胞懸濁液は、ブランソン（叶ａｎｓｏｎ）細
胞破壊器モデル３５０を用いて水浴中３分間のバースト
で維持しながら超行波処理される。超音波処理液は、約
４℃で約４５分間約２７．０００ｘｇの遠心分離によっ
て清澄化されろ。これは最−刀の上澄液である。ペレッ
ト（Ｐｌ）はＯ，１ｗ／ｖ％トリトンＸ−１００含有緩
衝液Ａ約１０ｍＩ２中水浴内で約３０分間洗浄され、再
遠心分離される。上澄液は集められ、第二の上澄とする
。ペレット（Ｐ２）は同じ緩衝ｌ痩である緩衝液へで２
回洗浄される。洗液は捨てられる。

次いで、洗浄されたペレットＰ２は約１００ｍＭジチオ
スレイトール含有の約６Ｍグアニジン−１１０２約１．
ＯｍＱに再懸濁され、懸濁液は約５０℃で（約２時間）
インキュベートされる。懸濁液は約７Ｍ尿素でｌ　Ｏｒ
ｒ＋４２に希釈され、約４℃で約４５分間約２７，００
０ｘｇの遠心分離により清澄化されるが、この上澄液が
第三の上澄みである。各種融合タンパク質のＣ８解性の
差異に基づき、一部は第一の上清中に見られ、一部は第
二の上清中に見られ、一部は第三の上清中にみられる０
例えば、免疫原Ａ＃ＳＯ６−ＣｈｅＹからの代表的クロ
ーンタンパク質は、第一、第二及び第三の上清中に存在
した。Ｂ群（５０７）、ＣＩｔ＃　（ＳＰ５４）、０群
（ＳＯ３１１）及びＦ群（８０２１６）のクローンから
の代表的タンパク質は、第三の上清中に存在した。ＳＯ
７−ＣｈｅＹ及びＳＰ５４−ＣｈｅＹ双方の融合タンパ
ク質は、ヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィ
ーにより遅れて溶出することはなかった６ＳＯ３１１−
ＣｈｅＹ融合タ融合タンパ上質ロキシアパタイトと結合
し、１６０ｍＭリン酸緩衝液で溶出させることができた
。第三の上澄液からのＳＯ６−ＣｈｅＹ融合タ融合タン
パ上質サクリルＭ−ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより
更に精製された。

代表的アイメリア免疫原クローンは、３つの標準的技術
のうち１以上で各々の特定遺伝子のヌクレオチド゛配列
を決定するためにアッセイされる。

一部の場合においては、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は
マキサム及びギルバート、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー、第６５巻（第１部）、第４９．７−５５９頁、
１９８０年［Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５　
（ｐａｒｔｌｙ：４９７−５５９１１９８０）　］の化
学的分解方法を用いて決定される。更にルーチンには、
ヌクレオチド配列はハラトリ及びサカキ、アナライティ
カル・バイオケミストリー、第１５２巻、第２３２−２
３８頁、１９８６年［１１ａｔｔｏｒｉ　ａｎｄ　５ａ
ｋａｋｉ、　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＲｉｏｃｌ＋ｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　１５２：２３２−２：ｉｌｌ　（１９８６
１］で記載されているように変性プラスミド鋳型（アイ
メリアｃＤＮＡの類型化サブ配列を含むプラスミドｐＵ
Ｃ１８）を用いたジデオキシ鎖末端化技術によって決定
される。最後に、一部のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ
インサート又はその一部をバクテリオファージｍｐ１８
に組込んでサブクローニングしかつメッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇｌ、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１
０１巻、第２０−７８頁、１９８３年の標牟的ジデオキ
シ鎖末端化配列決定法を用いて分泌された一本鎖組換え
ファージ鋳をを配列決定することにより決定される。

ＡＭＶリバーストランスクリブターゼ及びＤＮＡポリメ
ラーゼ■のフレノウフラグメントに加えて、修正Ｔ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼが用いられた［テーパー（１’ａｂｏ
ｒｌ及びリチャードソン（ｌｌｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンスＵＳＡ、第８４巻、第４７６７−４７７
１頁、１９８７年参照１゜ アミノ酸配列は、下記情報を組合せることにより決定さ
れたヌクレオチド配列から導き出される。ファージ発現
ベクターんｇｌ；ｌ　Ｉ中の各々のｃＤＮＡは、β−ガ
ラクトシダーゼと共に融合タンパク質として発現された
場合に、ポリクローナル抗血清を用いて確認される。β
−ガラクトシダーゼと免疫原間の融合結合は、リンカ−
領域内で、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端を免
疫原のＮ末端におけるＰｈｅ残基と結合させたＧｌｙ残
基からなる。ＥｃｏＲＩ制限酵素は、５゛側から３°側
に読んだ場合にＧｌｕコドンの第−及び第二ヌクレオチ
ド間を開裂する。

ＥｃｏＲＩ開裂部位におけるこの結合（及び読取り枠、
クローニング部位）は、サブクローニングベクターｐＵ
ｃ１Ｂ、ｍｐｌＢ又はｐＪＣ２６４の有無に係わらず完
全ｃＤＮＡを要する各々の後のクローニング時に再生さ
れる。その結果、読取り枠は明確に確認することができ
、これら３つのベクター中におけるインサートの方法が
決定されると直ちにヌクレオチド配列が翻訳される。プ
ラスミドｐＵｃｌＢ及びｐＪＣ２６４又はファージｍｐ
１Ｂのベクター中におけるｃＤＮＡインサートの方向決
定は、当業界で公知の制限酵素地図作成によって行われ
る。非対称制限酵素認識配列がｃＤＮＡインサート内で
確認されると、インサート方向及び転写方向は認識配列
がヌクレオチド配列から同様に予測される場合において
明確に決定される１本明細書で示されたすべてのアミノ
酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて読
取られる。

Ａ群りローンのヌクレオチド配列及び得られるＡ群免疫
原アミノ酸配列は、代表的クローン８０６７及びＳＯ６
で例示される。このクローンはＳＯ６クローンの中に完
全に含まれる。このクローンにおける約８７０ヌクレオ
チドのうり、５゜末端から始まる最初の１６２ヌクレオ
チドが配列決定された。転写方向及びひいては正確な読
取り枠は、ＣｈｅＹ−８，０６７組換えプラスミドの制
限酵素地図作成から予測される制限酵素認識配列のヌク
レオチド配列中の位置に基づき明確に導き出すことがで
きる。ヌクレオチド配列及び得られる５３アミノ酸配列
は第６表で示されている。更に２２＋のヌクレオチド配
列は、第７表で示されているように、クローンの３゛末
端から得られたが、但し読取り枠は導き出されなかった
。

Ａ群りローン８０６７は、クローンＳＯ６内で隣接した
形では含まれていない、第６表におけるクローン５０６
７の４位のヌクレオチドは、第８人におけるクローンＳ
Ｏ６の１６６位のヌクレオチドに相当する。この相同性
は、クローン５０６７の９１位のヌクレオチド及びクロ
ーン８０６の２５１位のヌクレオチドまで続いている。

これらＡ群りローンの３°末端にも有意レベルの相同性
が存在する。第９表におけるクローンＳＯ６の３゛ヌク
レオチド配は、第７表におけるクローン５０６７の３゛
ヌクレオチド配の逆相補鎖に相当する。詳しくは、第７
表におけるクローン８０６７の１位のヌクレオチドは第
９表におけるクローンＳＯ６の１１７９位のヌクレオチ
ドと相補的である。この相補性は、クローンＳＯ６の９
５８位のヌクレオチドに相当するクローン８０６７の２
２１位のヌクレオチドまで続いている。

Ｂ群りローンメクレオチドｙ列及び得られるＢ群免疫原
アミノ酸配列は、代表的クローンＳＯ７で例示される。

このクローンにおける９５７ヌクレオチドのすべてが配
列決定された。読取り枠は、ｃＤＮＡ内で非対称的に存
在する制限酵素部位の位置をヌクレオチド配列分析から
予測されるそれら各々の認識配列の位置と対比させるこ
とによって明確に導き出すことができる。ヌクレオチド
配列及びアミノ酸配列は第１Ｏ表で示されている。

Ｃ群りローンヌクレオチド配列及び得られるＣ群免疫原
アミノ配列列は１代表的クローンＳＰ５４で例示される
。このクローンはＳＰ５９クローン内に完全に含まれる
。ＳＰ５４クローン中における約７００ヌクレオチドの
うち、５°宋端で始まる最初の１５７ヌクレオチドが配
列決定された。転写方向及びひいては適切な読取り枠は
、ヌクレオチド配列中の制限酵素認識配列をＣｈｅＹ−
ＳＰ５４及びＣｈ　ｅ　Ｙ　−Ｓ　Ｐ　５９組換えプラ
スミドの制限酵素地図作成から予ｍ１１されるそれらの
非対称位置と対比させることによって明確に導き出すこ
とができる。ＳＰ５４の５゛末端のヌクレオチド配列及
び得られる５２アミノ酸配列は第１１表で示されている
。ＳＰ５９クローンのヌクレオチド配列及び得られる２
２８アミノ酸配列は第１２表で示されている。ＳＰ５４
の配列はヌクレオチド２７７で始まりヌクレオチド９５
７で終わるが、これはアミノ酸残基９３〜２２８を含ん
でいる。

Ｆ群りローンヌクレオチド配列及び得られるＦ群免疫原
アミノ酸配列は、代表的クローンＳＯ２１６及びＳＯ２
１６−２で例示される。実施例９ｇ照、読取り枠は、ｃ
ＤＮＡ内で非対称に存在する制限酵素部位の位置をヌク
レオチド配列分析から予測されるそれら各々の認識配列
の位置と対比させることにより明確に導き出すことがで
きる。クローン５０２１６−２の５６０ヌクレオチドす
べてが配列決定された。ヌクレオチド配列及び得られる
５３アミノ酸配列は第１４表で示されている。Ｆ群りロ
ーンＳＯ２１６−２は、クローン８０２１６と比較した
場合に、５゛末端で更に７つのヌクレオチドを有してい
る。ヌクレオチド８から始まるクローン５０２１６及び
５０２１６−２のヌクレオチド配列は５０２１６−２の
ヌクレオチド２４２まで完全に一致し、双方のクローン
は同一のアミノ酸配列であると予ｉｆ！Ｉｔされる。ク
ローン８０２１６−２は、ヌクレオチド２４２から始ま
り又ヌクレオチド３２３まで続（クローンＳＯ２１６中
に存在しない配列を更に含んでいる。

Ｈ群りローンヌクレオチド配列及び得られる１１群免疫
原アミノ酸配列は、代表的クローン５０３１１−２９で
例示される。このクローン中の８７８ヌクレオチドすべ
てが配列決定された。転写り向及びひいては適切な読取
り枠は、ヌクレオチド配列中の制限酵素認識配列を制限
酵素地図作成から予測されるそれらの非対称位置と対比
させることにより明確に導き出すことができる。ヌクレ
オチド配列及び得られる２３８アミノ酸配列は第１３表
で示される。

上記ｃＤＮＡでコードされる一次翻訳産物の分子量は、
適切なｍ　ＲＮ　Ａ群の生体外翻訳によって決定される
。非胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢胞体及び＋１虫から抽
出されるｍＲＮＡの生体外翻訳は、組込まれるインジケ
ーターアイソトープとしての３５８−メチオニン又は３
日−ロイシンいずれかと共に、ウサギ無網状赤血球細胞
翻訳系を用いて行われた。特異的生体外翻訳産物は、実
施例６で記載のように単一特異性抗体を用いて免疫沈降
せしめられた。生体外翻訳用のプロトコールは。

（製造者の指示に従う）プロメガ・バイオテ・ンク１Ｐ
ｒｏｎ＋ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｌの技術誌に記載されて
いるとおりであって、テーラ−ら、モレキュラー・バイ
オケミカル・バラ、サイトロジー、第１０巻、第３０５
−３１８頁、１９８３年の場合と同様の免疫沈降法に関
するものであった。クローン８０６及び５０６７で１例
示される４群抗原に対して特異的な抗体により免疫沈降
せしめられた生体外翻訳産物は、約２４キロドルトン（
ＫＤ）の分子量を有する。クローンＳＯ７で例示される
ＢＩ！￥抗原に対して特異的な抗体により免疫沈降せし
められた生体外翻訳産物は約２８ＫＤの分子量を有する
が、一方副次的な免疫原は約１７０．２４．２２．１６
及び１２ＫＤの分子量を有する。他の副次的な特異的免
疫沈降性生体外翻訳産物は。

３Ｈ＝ロイシンが標品前駆体アミノ酸として用いられた
場合に検出可能である。１７０及び２２ＫＤの副次的免
疫原も：１ｌｔＳ−メチオニンで検出可能である。主な
２８ＫＤ免疫原は、３［−１−ロイシンが前駆体アミノ
酸として用いられた場合にのみ検出可能である。クロー
ンＳＰ５４及びＳＰ５９で例示される０群抗原に対して
特異的な抗体により免疫沈降せしめられた生体外翻訳産
物は調べられなかった。クローンＳＯ３１１で例示され
るＨ群抗原に対して特異的な抗体により免疫沈降せしめ
られた生体外翻訳産物は約２８ＫＤの分子量を有し、一
方副次的免疫原は４８．３Ｂ、３３゜１６．１３．１２
及びｌ　ＯＫＤの分子量を有する。他の副次的な特異的
免疫沈降性生体外翻訳産物は、３ＳＳ−メチオニンが標
識前駆体アミノ酸として用いられた場合に検出可能であ
る。主な２８ＫＤ免疫原は、３６８−メチオニン及び”
Ｈ−ロイシンの双方が用いられた場合に検出可能である
。

Ｅ、テネラの胞子形成嚢胞体及び／又は神虫から抽出さ
れた特異的ｍＲＮＡは、マニアティスら１分子クローニ
ング、実験マニュアル、コールド・・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−
、ニューヨーク、第２０２頁、１９８２年［＆１ａｎｉ
ａｔｉｓ　ｅ＊　ａｔ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　（：ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　
ｐｇ、２０２１１９８２１１の方法及びＳ＆Ｓ固体支持
相への核酸の移入及び固定１Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ
　１ｍｓ＋ｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｅｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ　ｔｏ　Ｓ＆Ｓ　５ｏｌｉｄ　５ｕｐｐ
ｏｒｔｓ１．シュジーチャー及びシュニル社（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｉｎｃ、１発
行、第１６−１９頁、１９８７年に記載された方法に従
い、］ずンプロット分析でサイズ分けされた。クローン
ＳＯ６及び８０６７で例示されるＡ免疫原についてコー
ドするｍＲＮＡは、鎖長２．１５±０．１３キロ塩基（
ＫＢ）である、クローンＳＯ７で例示されるＢ免疫原に
ついてコードするｍＲＮＡは鎖長１．２３±０．２２Ｋ
Ｂである。クローンＳＰ５４及びＳＰ５９で例示される
Ｃ免疫原についてコードするｍＲＮＡは鎖長１．１２±
０．０８ＫＢである。クローンＳＯ３１１で例示される
ト１免疫原についてコードするｍＲＮＡは鎖長０．９８
±０．０７ＫＩ（である。

天然免疫原Ｂ及びＣは、ゲル濾過及び特異的抗ＣｈｅＹ
免疫原抗体による同定又は特異的抗Ｃｈ　ｅ　、Ｙ免疫
原抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィー
のいずれかによってＥ、テネラから単離される。約ｌＸ
ｌ０’のアイメリア・テネラ胞子形成嚢胞体は、水浴巾
約２．５分間バーストで、約１０分間緩衝液、好ましく
は約０．１ｍＭ　　ＰＭＳＦ含有リ有税すＪ衝液中で超
音波処理される。破壊された胞子形成嚢胞体は、４℃で
３０分間２７，０００ｘｇの遠心分離により集められる
。ペレットは約０．１ｍＭ　　ＰＭＳＦ含有Ｐ有税約４
０ｍｇで約３回洗浄され、上記のように遠心分離で回収
される。洗浄されたペレットはｐｔ−＋約８．６の約４
００ｍｇジチオスレイトール含有約５Ｍグアニジ：／　
ＨＣＱ　／約０．５Ｍトリス１１Ｃ２約６０ｍ、９に再
懸濁される。１元は、中度の撹拌ド２０°Ｃで約３時間
行われる。還元されかつ可溶化された免疫原は、Ｌ：ｉ
Ｇ液の遠心分離及び収集によって得られる。免疫原は好
ましくは限外濾過により約２０ｍ２に濃縮され、ヨード
酢酸約４００ｍｇの添加によってカルボキシメチル化さ
れる。ｐＨは３Ｍ１−リス塩基の添加で約８．６に調節
され、反応は暗所巾約２０℃で約６０分間続けられる。

グアニジンＮ　ＣＲは約０、０５Ｍ　　Ｎ１１４１１（
：０３、約０．１ｍＭ　　ＰＭＳＦ及び約０．０２％ア
ジ化ナトリウムに対する約４８時間の透析によって除去
される。すべての不溶性物質は遠心分離によって除去さ
れる。上澄液は限外濾過により濃縮され、ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより分離される。サンプルは約０．０
５Ｍ　　Ｎｌ（、ＨＣＯ，、約０．１％ツビッタージェ
ント３−１２及び約０，０２％アジ化ナトリウムで平衡
化された約８７Ｘ２．５ｃｍのセファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌｌ　Ｓ　−２００のカラムに供される。約４
．５ｍｆｆの両分は約２５　ｍ　１２　／　ｈ　ｒの流
速で集められ、約２８０ｎｍでモニターされる。Ｅ　テ
ネラ免疫原の存在は、ウェスターンプロット法により、
ウサギ抗挿出抗血清及び特異的Ｅ、テネラ組換え融合免
疫原に対して産生された抗体で調べられる。天然免疫原
は、コクシジウム感染から鶏を保護することができる。

天然Ｅ　テネラ免疫原Ａ、Ｂ、Ｃ１■及びＦは、特胃的
融合免疫原に対して産生きれた抗体を用いた免疫アフィ
ニディークロマトグラフイーにより胞子形成嚢胞体から
）Ｂ　ｉｔされかつ精製される。アフィニティーカラム
は、前免疫血清及び特異的・融合免疫原血清を用いて調
製される。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）画分は、コーチ
ャーら、ジャーナル・才ブ・イムノロ・メソ、第６６巻
、第７５−７９頁、１９８４年［Ｃｏｒｔｈｉｅｒ　ｅ
ｔ　ａｔ、。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｓｈ、　６６：７５−７
９　ｆｌ！１８４１　］の方法又はバーン（Ｉｌｅａｒ
ｎｌら、ジャーナル・才ブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５４巻、第２５７２−２５７４頁、１９７９
年のカルボニルジイミダジド法によって得られる。Ｉｇ
Ｇ約１５ｍｇは、シュナイタート（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
ｔｌら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５７巻、第１０７６６−１０７６９頁、１９
８２年のｈ法を用いてセファロ−スタンバク質Ａ（シグ
マ）０５ｇに結合せしめられる。ｐＨ８，１の約０．５
Ｍ　　ＮａＣｌ２．約００２％アジ化ナトリウム及び約
０．１ｍＭ　　ＰＭＳＦ含有約０．　１Ｍホウ酸緩衝液
中上記のように製造されたＥ、テネラ胞子形成嚢胞体の
還元カルボキシメチル化抽出物約５ｍｇは、同一緩衝液
で嘔衡化された曲溶出カラムに供される。前溶出カラム
はカラム緩衝液３　ｍ　Ｑで洗浄され、合わせたカラム
溶出液及び洗浄は同一緩衝液でモ衡化された抗Ｅ、テネ
ラ融合免疫原カラムに供される。カラムはカラム緩衝成
約１０ｍ！で洗浄され、天然免疫原は約３Ｍチオシアネ
ートナトリウムで溶離される１個々の天然免疫原は、コ
クシジウム感染から鶏を保護することができる。

アイメリア免疫原の分子量及び等電点も調べられた６分
子量は、Ｅ　テネラの胞子形成嚢胞体及び／又は捕虫か
ら得られたサンプルの分析ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、
ｌ、かる後ニトロセルロース移動及び前記ウェスターン
プロット法による免疫検出によって調べられた。ａ切な
分子量コントロールも含まれている０等電点はオーファ
レル（０°Ｆ＋１ｒｒｅｌｌ）、ジャーナル・オブーバ
イオロジカル・ケミストリー、第２５０巻、第４００７
−４０２１頁、１９７５年の操作に従い二次元ゲルラン
（ｒｕ口）のウェスターンプロット法により調べられた
。両操作用の抗体は上記のように（りられる。免疫原Ａ
は、分子量２４キロドルトン（ＫＤ）の単一バンドとし
て分離された。主なり免疫原は５ＤＳ−ＰＡＧ、Ｅ上２
７−２８ＫＤの拡散タブレットとして特徴付けられ、−
万態次的免疫原は微弱バンドとして現われることから、
Ｅ。

テネラ内で抗原決定基が一部重複していることを示唆し
ている。副次的バンドは、２２．１９．１８．１４．１
２，９及び６ＫＤの分子量を有している。２７−２８ダ
ブレツトは、ｐＨ５，１及び６ＫＤ間の範囲内で等電点
フォーカシング（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）時多数のスポット
を生じる。ウェスターンプロット法で検出された他の微
弱バンドのｐ　Ｉ（は測定されなかった。免疫原Ｃも分
子ｆｉｔ２１−２２ＫＤのタブレットとして移動する。

免疫原Ｈは、分子量２８及びｌ　８ＫＤの２つの異なる
主タンパク質並びに分子量２７．２４．２３．１７．１
４．１２及び９ＫＤの７つの副次的タンパク質として分
１Ｉｉｉ−する。Ｆ群免疫原は約２６−２９ＫＤの分子
量を有する。免疫原Ａの等電点は３６５で、ｐｔ−ｔは
６．６５である。Ｃ及びＦの等電点は測定されなかった
。

家禽には、前記組換えアイメリア・テネラ免疫原の１以
上の免疫化容量が投与される。Ｌ８への免疫原投与は経
口でも非経口経路であってもよく、鶏胚は卵殻を介して
接種される。これらいずれかの経路による免疫原の投与
は、免疫原単独としてでも又は生理学上許容される媒体
との溶液もしくは懸濁液としてであってもよい、このよ
うな生理学上許容される媒体としては、格別限定されな
いが、生理塩水、リン酸縁衝液、リンｆｆｔ縁衝液、グ
ルコース緩衝液等がある。非経口投与としては。

特にＥ、テネラ免疫原の筋肉内、腹腔内、皮−Ｆ及び静
脈内注射又は放出がある。経口投与される免疫原は水性
溶液又は懸濁液の形である。懸濁液は、例えばゼラチン
又はアルギネートからなるゲル中に免疫原を含んでいる
。経口投与される免疫原は飼料中に含有されていてもよ
い、胚有税卵は、１以上のアイメリア免疫原の免疫原性
用量の注射によって免疫処理される。筋肉内及び皮下予
防接種用免疫原は、許容しつるアジュバントと共に投与
されてもよい。許容しつるアジュバントとしては、格別
限定されず、フロイント完全液、フロイント不完全液、
二重上マルジョン、無水油。

ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム・パルプム及び
ｔ、ＲＮＡ含有油中水型エマルジョンがある。好ましい
アジュバントは、免疫原がアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄ
ｒｏｇｅｌ”）のような水酸化アルミニウムで沈降せし
められたミョウバン沈降物である０組換＾Ｅ、テネラ免
疫原による鶏の免疫処理の結果、コクシジウム症に対す
る免疫が生じる。

保護免疫は、約１．Ｏｎｇ〜約１００μｇ、好ましくは
約１００ｎｇ〜約１０ｕｇの投与によって獲得される。

下記実施例は本発明を説明しているが、本発明はそれら
に限定されるものではない。

１巖盟ユ 嚢胞体、胞子形成嚢胞体、＄１虫及び製型並びに対応免
疫　及び　原の調製 アイメリア・テネラ嚢胞体を７日前に感染した鶏の盲腸
コア（嚢胞体の合体物）から単離した。

アイメリア・アセルプリナ嚢胞体を５〜６日前に感染し
た鶏の糞及び腸内古物から単離した。Ｑｌ！１された盲
腸コア及び糞をウェアリング・ブレンダ内（蒸留水中）
で別々に破壊し、３９℃ｐ　Ｈ２，０で１時間ペプシン
（２ｍ　ｇ　／　ｍ　１２　）により分解した。大ｌの
破壊屑及びペプシンを蒸留水中で遠心分離（１０００ｘ
ｇ）後ペレット物質から除去した０部分的純粋嚢胞体画
分を２．２Ｍスクロース中での浮遊化によりベレットか
ら単離しくジャクソン、パラ勺イトロジー、第５４巻、
第８７−９３頁、１９６４年）、この粗製物質を冷りロ
ロツクス（５，２５％次亜塩素酸ナトリウム、４℃）中
で１０分間インキュベートすることにより更に処理した
０次亜塩素酸ナトリウムをｐｌ（７，６の無菌リン酸緩
衝液（ＰＬＩＳ）中数回の洗浄で除去し、精製された無
菌嚢胞体を得た。

嚢胞体を２０℃で４８時間振盪水浴中で胞子形成させた
（エドガー、トランザクションズ・才ブ・アメリカン・
マイクロバイオロジー・ソサエテ、第６２巻、第２３７
−２４２頁、１９５４年）。胞子形成嚢胞体を４°Ｃで
Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，６）中において貯蔵した。

十分に胞子形成した嚢胞体をプランソニック細胞破壊器
内の氷上で先細プローブにより超音波処理した。超音波
処理は、過熱を防止するために３０秒間オン／オフフサ
イクルで行われた。この操作により、９０％破壊を１０
〜１５分間で行なった。界面活性剤（ツビッタージェン
ト３−１２、カルビオケム、０．ｉ％ｗ　／　ｖ　）を
加え。

混合物を４℃で１８時間撹拌した。２７，０００ｘｇで
３０分間遠心分離後、上ｉｆｆをセファデックスＳ−２
００（ファルマシア）のゲル浸透クロマトグラフィーに
供した。

セファデックスＳ−２００カラム（８Ｘ４４ｃｍ）を４
℃においてｐｌ（７，２の５０ｍＭＮａｇ　ＩＩ！”０
４−　Ｎａ１ｌｉＰＯ＜及び０１％ツビッタージェント
３−１２で平衡化させた。超音波処理物をカラムに施し
、同一緩衝液で？ｆｌｉＩ＋１シ、両分を集め（１４ｍ
Ｉ２）、２３０頁ｍの吸光度によりモニターした。両分
を５ＤＳ−ＰＡＧＥ特性に従いプールした。プールされ
た両分を４℃で１週間にわたり緩１！ｉ液を３回交換し
て１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム８リツトルに対して透
析し、しかる後凍結乾燥した。凍結乾燥画分をガラス蒸
留水に溶解し、生体内鶏保護活性について試験した。生
体内活性は、画分８４−９４間でルーチン的に見出され
た。保護アイメリア・テネラ画分をプールし、画分Ｖと
命名した。一部のバッチの場合には。

Ｓ−２００クロマトグラフイーをｐＨ７，７の００５％
ツビンタージエント含有５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム
中で行なった。これは溶出特性又は生体内効力に関して
効果を有していなかった。

第二叶代製型を、ジームス、パラサイトロジＩＪａｍｅ
ｓ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｌ、第８０巻、第３０１−３
１２１．１９８０年のプロトコールに従い感染後４日目
に鶏１１Ｊ細胞から得た。

抗体産生用の免疫原を下記のようにして得た。

精製された胞子形成嚢胞体の懸濁液２ｍε（５×１０’
／ｍｆｆＰＢｓ、ｐＨ７，６）をゆるめた乳り４装備組
織ボモゲナイザー中４°Ｃ１５００ｒｐｍで５分間粉砕
しくパラトン、サイエンス、第１５０巻、第７６７−７
６０頁、１９６５年）、嚢胞体破壊物から得られる上澄
液を遠心分離（６００ｘｇで１０分間）後除去した。非
破壊嚢胞体、スポロシスト及び嚢胞体外被からなるＥ　
テネラペレットをハンクス平衡塩溶液（ｐ　ｌ−１７゜
４）中０．２５％（Ｗ／ｖｌ　ｌ−リプシン（１：２５
０）及び４０％（Ｗ　／　Ｖ　）タウロデオキシコリン
酸（シグマ）含有暁光用溶液に再懸濁し、５％Ｃ０２中
４１℃でインキュベートした（バラトンら、ジャーナル
・オブ・パラサイトロジー、第６５巻。

第５２６−５３０頁、１９７９年）、同様に非破壊嚢胞
体、スポロシスト及び嚢胞体外被からなるＥ、アセルブ
リナペレットもハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７，４）中０
．１２５％（ｗ／ｖ）トリプシン（１：２５０）及び１
．０％タウロデオキシコリン酸含有税暁光溶液に再懸濁
した。ペレットを５％ＣＯ２含有雰囲気中４１”Ｃでイ
ンキエベトした。暁光処理をＥ、アセルブリナの場合０
．５時間及びＥ、テネラの場合１時間続け、しかる後暁
光用溶液を遠心分離により除去し、寄生虫物質をｐＨ８
，０イオン強度０．１４５の１％グルシース含有リン酸
緩衝塩／グルコース（ＰｎＳＧ）緩衝液で２回洗浄した
（シュマッッら、ジャーナル・才ブ・プロテアーゼ（、
Ｊ、　Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌｌ　、第３１巻、第１８１−
１８３頁、１９８４年）。寄生虫混合物をＰＢＳＧで平
衡化されたＤＥ５２アニオン交換カラムに供したが、精
製された種型は放出分について遅滞することなく溶出し
た（シュマッツら、上記）。

抑型を（ドライアイスル室温で）３回凍結−解凍させ、
プロテアーゼ１徂害剤としての１ｍＭフェニルメチルス
ルホニルフルオリド含有有税Ｓ中破壊されるまで超音波
処理し１種型抗原を得た。タンパク′α淵度をローリ−
ら、ジャーナル・才ブ・バイオロジカル・ケミストリー
、第１９３巻、第２６５〜２７５頁、１９５１年の方法
により測定し、抗原を液体窒素中で貯蔵した。

実施例２ 抗アイメリア・テネラの非胞子形成嚢胞体、胞子形成嚢
胞体１種型、製型、抗画分Ｖ及び抗アイメリア・アセル
ブリナ　虫　　の産生 ウサギ［ニューシーラントホワイト （Ｎｅｗ　Ｚｃａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌ　、雌性］を
実施例１に記載された様々な免疫原のうち１つで複数回
免疫処理した。各免疫用量はタンパク質５０μｇを含有
していた。初回免疫は、フロイント完全アジュバントで
行なった。後の免疫はフロイント不完全アシュバントで
行なった。抗原アジュバント混合物は、Ｐ　Ｂ　Ｓ中タ
ンパク質５０μｇ含有抗原０．５ｍ１ｌをアジュバント
０．５ｍＩ２で乳化させることにより調製した。次いで
、エマルジョンＩｎβをウサギ背中の刺毛面上の？Ｉ数
部位に皮下注射した。二次追加免疫は、−次免疫後約１
か月間隔で行なった。動物な放血させ、免疫スケジュー
ル開始後６週開目から始めて約１か月間隔で免疫血清を
調製した。免疫活性及び特異性は、実施例１の特異的抽
出抗原及びトービンら、プロシープインク・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・才ブ・サイエンスｔＪｓＡ、、第
７６巻、第４　：３５０−４３５４頁、１９７９年の技
術を用いてウェスターンプロット分析により測定した。

各抗体はその対応免疫原、即ち抗原に対して特異的であ
った。

実施例３ 画分Ｖ免疫原によるコクシジウム症に対しての２日令鶏
の ブロイラー鶏を実施例１に記載の画分Ｖ免疫原で免疫し
た。用量はローリ−ら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、第１９３巻、第２６５〜２７５頁
、１９５１年の方法で測定した場合のタンパク質含有量
に基づ（ものであるが、これをふ化機２，９及び１６日
日目筋注した。実験用及びコントロール用量を最終免疫
後１週間目に５ｘｌＯ’Ｅ、テネラ嚢胞体の経口接種に
より侵鴬させた。侵襲後６８目に鶏を殺し、盲腸内にお
ける障害の重篤度をジョンソン及びレイド、エクスペリ
メンタル・パラサイトロジー、第２８巻、第３０−３６
頁、１９７０年［Ｊｏｂｎｓｏｎａｎｄ　Ｒｅ１ｄ、　
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
　２８　：　３０：３６　＋１９７０）］の方法に従い
測定した。

下記結果が得られた。

画分Ｖ　　　４０．０　　　　８　　　　　１．０画分
Ｖ　　　　１．０　　　　８　　　　　１．６画分Ｖ　
　　　Ｏ，１０８２，９ なし　　　　−８３，４ これらの結果は１画分Ｖ免疫原が２日令鶏を免疫するた
めに使用しうることを示している。筋肉的接種は、通常
の毒性感染後免疫鳥における重度障害発生の非存在から
示されるように、疾患に対して高レベルの保護を与える
。

実施例１の精製アイメリア・テネラ種型を種型１．５Ｘ
ｌｏ’／ｍＱの濃度でＴＥ培地（ｐ１４７．５のｌＯｍ
Ｍ）リスＩ（Ｃｆｆ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した
６次いで、種型の希懸濁液をＳＤＳ　（２０％ＳＤＳ貯
蔵液から）中０．５％及びＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０の０
．５Ｍ貯蔵液から）中１５ｍＭに調節し、原形質膜及び
核膜の双方を溶解させた。核溶解後のゲノムＤＮ／ｌ！
出は、溶液粘度の明白な増加によって確認される。

可溶化を助けるために、溶液をプラットホーム（Ｐｌａ
ｔｆｏｒｍｌ上５０℃で３０〜６０分間穏やかに揺動し
、しかる後５０℃で３時間１００μｇ／　ｍｆｆの濃度
のプロテイナーゼにで分解させる。ゲノムＤＮＡを、フ
ェノールによる２回の抽出、フェノール、クロロホルム
及びイソアミルアルコール（２５：　２４　：　ｌ）の
混合物による２回の抽出、クロロホルム及びイソアミル
アルコール（２４：１）による２回の抽出、・■びに実
施例８で記載のような酢酸ナトリウム／エタノールによ
る２回の連続的沈降によって精製した。核酸ベレットを
７０％エタノールで２回洗浄し、５Ｘ１０”種型相当数
／　ｍ　Ｑのおよその濃度で゛「Ｅに懸濁させる。核酸
のＲＮＡ成分を３７℃で６０分間濃度５０μｇ　／　ｍ
　１２の熟年活性化ＲＮアーゼＡによる分解によって選
択的に除去する。ＲＮアーゼＡ及び他の残留タンパク質
を上記のように５０℃で３時間０．５％Ｓ　ｌ）　Ｓ及
び１５ｍＭ　　ＥＤＴＡ中でのプロテイナーゼＫによる
二次分解によって除去した６次いで、ゲノムＤＮＡを有
機溶媒で連続的に抽出し、エタノールで２回沈降させ、
しかる後７０％エタノールで２回洗浄した。ゲノムＤＮ
Ａペレットを２〜３Ｘ１０９種虫相当数／ｍＩ２の濃度
でＴＨに懸濁し、２６０ｎｍの吸光度から定量した１次
いで、非分解ゲノムＤＮＡを分析用ゲルで分別化し、（
１）分光測定濃度、（ｉｉｌ残留ＲＮ　Ａの非存在及び
（ｉｉｉｌその高分子量保全性（ｉｒ＋Ｌｅｇｒｉｔｙ
ｌについて確認した。

実施例５ ｃＤＮＡ　　　ライブラリーの　成 ７時間胞子形成されたＥ、テネラ嚢胞体及び種型を前記
のようにして得た［シュマッツら、上記：ワンｆＷａｎ
ｇｌ及びストティッシ、　（Ｓｊ（Ｉｔｉｓｈｌ。

ジャーナル・才ブ・プロトズーロジー、第２２巻、第４
３８−４４８頁、１９７５年］、全ＲＮＡを、チャーク
ラインらの方法（バイオケミストリー、第１８巻、第５
２９４−５２９９頁、１９７９年）により、単離直後（
即ち、種型）又は液体窒素で凍結され一８０℃で貯蔵さ
れた細胞ベレッｌ−（即ち、７時間胞子形成嚢胞体）か
ら各段階で単離した。細胞壁が存在するため、嚢胞体サ
ンプルを４倍遣の４Ｍグアニジウムチオシアネート溶液
（細胞ペレット量と比較した溶液量）に再０濁し、ブラ
ンソン（［Ｉｒａｎｓｏｎｌ超音波器［ヒー上音波器テ
ム・ウルトラソニクス団ｅａＬＳｙｓｔｅｍｌＪＩＬｒ
ａｓｏｎｉｃｓｌ　］により２０Ｗ、５０％サイクルで
全部で３０分間超音波処理した０種型はグアニジウムチ
オシアネート貯蔵？ａ液（４Ｍグアニジウムチオシアネ
ート、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、ｐＨ７，０
の２５ｍＭクエン酸ナトリウム及びＯ，１Ｍ２−メルカ
プトエタノール）の添加により溶解したことから、超音
波処理は不要であった６次いで、溶解した細胞をベック
マンｆｌｌｅｃｋｍａｎｎｌ　Ｊ　Ｓ　−１３０一ター
中ｌＯ℃、　８００１１ｒｐｍで１０分間遠心分離し、
粒状の細胞破壊屑を沈降させた。上澄を清潔なフラスコ
中にデカン１−Ｌ、、１Ｍ酢酸０．０２５倍容遣及び無
水エタノル０７５５倍容量と混合した。フラスコを十分
に振盪し、−２０°Ｃで一夜放置して、核酸を沈降させ
た。翌日、ＲＮＡをベックマンＪＳ−１３０ター中ｉｏ
℃、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により集めた
。管から放液させて、細胞ペレットを緩衝化された塩酸
グアニジン貯蔵溶液（７，５Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ７
，０の０．［１２５Ｍクエン酸ナトリウム及び５ｍＭジ
チオスレイトール）０．５倍容量に再懸濁した。塩酸グ
アニジン貯蔵溶液の容Ｉは、先に使用されたグアニジニ
ウムチオシアネート１液の容量と比較したものである。

１Ｍ酢酸０．０２５倍容量及び無水エラノル０．５倍容
量を加えることによって、ＲＮＡを沈降させた。溶液を
一２０℃に一夜保ち、ＲＮＡをもう一度遠心分離によっ
て集めた。先の沈降で用いられた容量の半分の塩酸グア
ニジン貯蔵ｆｄ液を用いて、塩酸グアニジン沈降を繰返
した。再沈降ＲＮＡを９５％エタノールで洗浄し、乾燥
し、無菌水に再懸濁した。この物質を１０℃、１０．０
００ｒｐｍ（ベックマンＪＳ−１３０−ター）で３０分
間遠心分離した。上澄液を除去し、ペレットを無菌水に
再懸濁した。遠心分離工程を繰返した。

上ｉｆｆ　ｉ＆を合わせ、ｐ）１５の２Ｍ酢酸カリウム
０．１倍容量及び無水エタノール２倍容１と混合し、−
２０℃で一夜放置して沈降させた。ＤＮＡペレットを１
０，０００ｒｐｍ　（ベックマンＪＳ−１３０−ター）
で３０分間の遠心分離により集め、乾燥し、無菌水に再
！Ａ濁した。ＲＮＡの４度を分光１１１１１定により調
べた。

ポリアデニル化ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースク
ロマトグラフィーにより選択した（アビブ及びレーダー
、プロシープインク・オブ・ナショナル・アカデミ−・
才ブ・ナイエンスＵＳＡ。

第６９巻、第１４０８−１４１２頁、１９７２年）。１
ｍλカラムを用意するために、オリゴ（ｄ　ｉ’　）−
セルロース（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、Ｂ
ＲＬ）０．３ｇをｔ容離用緩ｉ析Ｉ夜（１０ｍＭ）リス
ＨＣ１２、ｐ　Ｈ７、５）に再！！濁し、パスツールピ
ペット中に注いだ。使用前、カラムを結合用緩衝＝（ｏ
、ｓＭ塩化リチウム０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、
ｐＨ７，５の１０ｍＭトリスＨＣＲ及び１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸）ｌＯ（金層容量で洗浄した。

無菌水に溶解されたＲＮＡ　（０，５ｍｇ）を６８℃で
分間加熱し、水で室温まで冷却した０等容量の２×結合
用緩衝液を加え、十分に混合し、サンプルをカラムに供
した。カラムを結合用緩衝液５０＋ｎＪ２で洗浄後、ポ
リ（Ａ＋）−ＲＮＡを溶離用緩衝液１０ｍβで溶出させ
た。１０のＬｍＱ画分を集め、各々のＲＮ　Ａ　６度を
波長２６０　ｎ　ｍで分光ｉｆ！ＩＩ定により調べた。

最も高い吸光度の両分をプールし、ｐｌ−１５，０の２
Ｍ酢酢酸カリウム量１容量及び無水エタノール２倍容量
を加えることによりＤＮＡを沈降させた。サンプルを一
２０℃で一夜放置し、ＲＮＡを上記のような遠心分離に
より集めた。沈降後、サンプルを無菌水に＋ｌ’ｉ懸濁
し、各々の１度を分光測定により再度調べた。

ポリ（Ａ　十）　−ＲＮ　Ａ　７　、５　ｔｉ　ｇから
開始するため、第−及び、第二鎮ｃＤＮＡ反応をガブラ
ー（Ｇｕｂｌｅｒ）及びホフマン（ｌｌｏｆｆｍａｎｌ
　　（ジーン、第２５巻、第２６３−２６９頁、１９８
３年）により記載されているように行った。ｃＤＮＡの
第−鎖の合成は、ｐｌ−１８，３の５０　ｍ　Ｍ　トリ
スＨＣＲ。

１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ２ｚ　、　　１０ｍＭ　　ＤＴＴ
、４ｍＭビロリン酸ナトリウム、１．２５ｍＭ　　ｄ　
Ｇ　Ｔ　Ｐ　。

１．２５ｍＭ　　ｄＡＴＰ、１．２５ｍＭ　　Ｔ　Ｔ　
Ｐ、０．５ｍＭ　　ｄＣＴＰ、　　Ｅａ−”Ｐｌ　ｄＣ
ＴＰｌ　５ｕＣｉ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｅ）、オリ
ゴ（ｄＴＩ２−１８　）ｌ　ＯＣＪｕｇ／ｍＱ、ＡＭＶ
リバーストランスクリブターゼ３０００単位／ｍｆ２［
ビアード（口ｃａｒｄｌ　、ライフサイエンシスｆ１．
ｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓｌ　、セントビーターズバー
グ、フロリダ州Ｊ含有反応Ｍ　４０　ｍ　１２中４２℃
で３０分間行なった。生成物をフェノール／クロロホル
ムテ抽出し、２Ｍ　　Ｎ１−１．−アセテートから無水
エタノールで沈降させた（オカヤマ及びバーブ、モレキ
ュラー・アンド・セル・バイオロジー、第２巻、第１６
１−１７０頁、１９８２年）、ベレットを７０％エタノ
ールで洗浄し、乾燥し、無菌水４０μβに再懸濁した。

第二鎖合成の場合には、−重鎖ｃＤＮＡ５００ｎｇ（即
ち、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッド１ｕｇ）をｐＨ７
，５の２０　ｍ　Ｍ　）リスト＋ｃｇ、５ｍＭ　　　Ｍ
ｇＣｌ２　２　、　　　ｌ　　ＯｍＭ　　（Ｎｌ１４１
ｘ　　ＳＯ４、１００ｍＭ　　Ｋ　ＣＥ　、　１１．１
５ｍＭ　　β−ＮＡＤ、Ｂ５Ａ３０　ｕ　ｇ／ｍ　１２
、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ各４０各
間０μ （ファルマシアＰーＬバイオケミカルズ社）８．５単位
／　ｍ　１２及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ファ
ルマシアＰーＬバイオケミカルズ社）２３０単位／ｍβ
の１００μβに再懸濁した．インキュベートを１２℃で
６０分間及び２２℃で６０分間連続的に行った．ＥＤＴ
Ａを２０ｍＭまで加えて反応を停由させ、生成物をフェ
ノール／クロロホルムで２回抽出した．二本鎖ｃＤＮＡ
を前記のように２ＭＮｌ−１．−アセテートから無水エ
タノール２倍容量で沈降させた。

次いで．ｃＤＮＡ　（５００頁ｇ＝ｌｕｇ）をｐｌ−１
７．５の５０ｍＭトリストｌｃｇ．１ｍＭＥ　ｌ）　Ｔ
　Ａ　、　５　ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ及びｌｏμＭ　　
Ｓ−アデノシルメチオニン含有ＩＸＥｃｏｌｌｌメチラ
ーゼＦｉｉ衝液２０ｕβ中でメチル化した６反応をＥｃ
ｏＲＩメチラーゼにューイングランド・バイオロジー）
２０Ｕの添加後２０℃で２０分間行った。反応を終了さ
せるために，酵素を７０℃で１５分間かけて熱不活性化
させた．サンプルを水冷し．ｃＤＮＡを下記のようにし
てプラント末端化させた．、Ｅｃｏ１１１メチル化ｃＤ
ＮＡ２　１　ｕｆｆ含ｆｉ　ｆ　ｘ−ブに、０．１Ｍ　
　ＭｇＣＲ．２．５ｕＱ．０．２ｍＭ　　ｄ　　（Ａ．
Ｃ．Ｇ．Ｔ）ＴＰ２、　５ｕｊ２及びｒ’　４　Ｄ　Ｎ
　Ａポリメラーゼ（Ｈ肛）５単位を加えた０反応を２０
〜２２℃で１０分間行い、最終濃度１　５ｍＭまでのＥ
ＤＴＡ添加により終了させた。反応生成物をフェノール
／クロロホルムで２回抽出し、上記のようにエタノール
で沈降させた。

前記反応からのベレットをｐＨ７．６の７０ｍＭトリス
ＨＣｆｆ、ｌ　Ｏ　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ　（ｌ　ｚ　
　、　　５ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭ　　ＡＴＰ含有緩衝液
中１００μｇＺｍβキナーゼ処理ＥｃｏＲＩデキサヌク
レオチドリンカー（ＢＲＬ）４、５　ｕ　Ｒに再懸濁し
た．Ｔ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド・バイオロ
ジー．２００Ｕ１０．５μりを加え、反応混合物を１２
℃で一夜インキユベートした０次いで、リンカ−結合ｃ
ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ＢＲＬ）で完全に切断した．−夜
インキュペートＨｙ５．ｓμｔｚに、ＥｃｏＲＩ修正緩
衝液（ｐ）ｌ７．５の５０ｍＭｔ−リスＨＣｌ２、ｌ　
Ｏｍ　Ｍ　　ｕｇｓｏ４゜２００ｍＭ　　ＮａＣｎ）５
μｇを加えた。混合物を７０℃で１０分間加熱し、リガ
ーゼを不活性化させた１反応混合物の容量をｐＨ７，５
の１００ｍＭトリスｆ（Ｃｆｆ、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ
２及び１０ｍＭ　　ＭｇＣＪ２．で２倍（２０ｕｊ２）
に増加させ、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（１６
単位／μｌ２）２μβを加えた。切断を３７℃で１時間
続け、しかる後酵素を６５℃で２０分間熱不活性化させ
た。生成物を上記のようにして沈降させた。

反応混合物から切断されたリンカ−を除去するために、
ｃＤＮＡをエルチップ＝ｄカラム（シュジーチャー及び
シュエル）で更に精製した。最後に、ｃＤＮＡ　（３０
０ｎｇ）を市販品のＥｃｏＲ１切断されたアルカリホス
ファターゼ処理えｇｔｌｌベクターＤＮＡ　［プロメガ
・バイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｌ　］　？
、５μｇに結合させた。結合混合物中のベクタ一対ドナ
ーのモル比はｌ：ｌであり。

ＤＮＡの最終濃度は約２００μｇ　／　ｍ　ｐ、であっ
た、結合反応なｐ　Ｉ！　７．５の１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ２゜１０ｍＭ　　ＭｇＣｆｆ、中で行った。えベクタ
ーの付着端なアニーリングするために、混合物を最初に
４２℃で１５分間インキュベートした１次いで、それを
１ｍＭ　　ＡＴＰ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ及びＴ４ＤＮＡ
リガーゼにューイングランド°バイオラプス）４０，０
００単位１ｍβで補足した０反応液を１４℃で一夜イン
キユベートした。

えベクターハイブリッドを製造者の指示（アマジャム）
に従い市販のパッケージ化用抽出物で生体外においてパ
ッケージ化した。パッケージ化ファージの少量を大腸菌
宿主Ｙ　ｌ　０８８株（ヒュインら、”ＤＮＡ　　クロ
ーニング：実務的アプローチ°°、第１巻、グローバー
、Ｄ編集、Ｉ　Ｒｌ。

プレス、オックスフォード、第４９−７８頁、１９８５
年）中に形質導入し、これらをＸ　−ｇａ１６００　ｇ
　ｇ　／　ｍ　Ｑ及び１６ｍＭ　　ＩＰＴＧ含有Ｌ含有
バクトドリブトン１Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅｌ　　
ｌ　Ｏｇ／β、バクトー酵母エキス５ｇ／ｇ、Ｎａｃβ
１０ｇ／Ｉ２、ＰＨ７，５］軟寒天２．５ｍｆｆを用い
てＬＢプレジー上で培養した。各々約ＩＸＩＧ’の独立
組換えファージクローンからなる２つのｃＤＮＡライブ
ラリーを得た。Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧプレート増殖から
測定した場合、非組換えバックグラウンドは１３％であ
ると評価された。

実施例２の抗画分Ｖ抗体又は抗挿出抗体いずれかによる
実施例５のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、
前記ヒエ−インらによる記載のとおりに実質上行われた
。非増幅ｃＤＮＡライブラリーからのパッケージ化ファ
ージを大腸菌Ｙ　１０９０株中に形質導入し、０，５〜
１．０ＸＩＯ’プラ一ク形成単位（ｐｒｕ）／プレート
の密度で１５０ｍｍプレート上において培養した。プレ
ートを４２℃で３，５時間インキュベートし、ＩＯ’ｍ
ＭＩＰＴＧ中で事前浸漬された乾燥ニトロセルロースフ
ィルターで覆い、３７℃で一夜インキュベートした。フ
ィルターを取除き、０．０５％ツイーン２０（１’ＢＳ
Ｔ）含有トリス緩衝液（ＴＢＳ：ｐＨ８，０の５０　ｍ
　Ｍ　トリスＨＣｌ２／１５０ｍＭＮａＣｌ２）中の２
０％生胎児血清で１時間ブロックし、しかる後相当時間
にわたり適切な抗体と共にインキュベートした。抗体結
合部位を［”Ｊｌｌ標識タンバクＡで検出した。陽性プ
ラクを取出し、再プレート培養し、各クローンが純粋プ
ラークであると判明するまで再スクリーニングした。

交差スクリーニング実験のために、各プラーク精製クロ
ーンのファージ溶解物１ｕＩ；！を大腸菌Ｙ１０９０細
胞区画上にスポットした０組換え融合タンパク質を誘導
し、ニトロセルロースに移し。

下記のように免疫プロットした。様々な抗血清によるス
クリーニング及び交差スクリーニングでは、第１表にお
ける５群のクローンを示した。免疫プロットに用いられ
たすべての抗血清をえｇし１１（ｓ原註ＮＮ９３の濃溶
解物に完全に事前吸着させた。事前吸着後、それらを゛
ｒＢＳＴ中１：１００渭釈し、必要時まで４℃で貯蔵し
た。

組換えファージの各々に対する単一特異性抗体を、ホー
ルらの方法（ネーチャー、第３１１巻、第３７９−３８
２頁、１９８４年）の蜂正法により及び実施例２記抜の
ようにウサギを実施例１３記載の精製された組換えＥ、
テネラＣｈｅＹ融合タンパク質で免疫することにより、
実施例２の多情異性抗血清からアフィニティー精製した
。融合タンパク質としては、Ａ群の５０６７−ＣｈｅＹ
：８群の５０７−ＣｈｅＹ　：　Ｃ群のＳＰ５４−Ｃｒ
ｌｅ　Ｙ　：　８群の８０３１　ｌ−２９−ＣｈｅＹ　
：及びＦ群のＳＯ２１６−ＣｈｅＹがあった。フィルタ
ープラークリフトをスクリーニングに用いられる稍袈組
換えクローンから作成した。約２×１０’ｐｆｕを１５
０ｍｍプレート毎に培養して、３７℃インキュベート時
間の最後に半融合溶解状態に近づけた。次いで、ニトロ
セルロースを取除き、４時間にわたりＴＢＳＴ中２０％
牛脂児血清でブロックし、（０，０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ
含有゛ｒＢＳＴ中２０％牛脂児血清でｌ：２００希釈さ
れた）事前吸着量特異性血清２０　ｍ　１２と共に一夜
インキュベートした。すべてのインキュベートを一定の
撹拌上室温で行った６次いで、フィルターを谷々２０分
間１’　Ｂ　Ｓ　Ｔ５０　ｍ　Ｑで５回及び０．１５Ｍ
ＮａＣｆｆ１０．０５％ツイーン２０で１回洗浄した。

抗体をｐＨ２，８の０．２Ｍグリシン−ＨＣＱｌｏ、１
５Ｍ　　ＮａＣｆｆ１０．０５％ツイーン２０　１０ｍ
βで３０分間にわたり各々のフィルターから溶出させた
。各溶出物のｐＨをトリス塩基で８．０に戻し、組換え
溶出抗体（旺Ａ）を必要時まで一２０℃で貯蔵した。

寄生虫抗原を、実施例１記載のプロテアーゼ阻害剤とし
て１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）含有のＮ　Ｅ　Ｔ緩衝液（ｐＨ７５の５０　ｍ　Ｍ
　トリスＨＣｆｆ、１５０ｍＭＮａＣｌ２．５ｍＭ　　
ＥＤＴＡＪ中で非胞子形成嚢胞体、胞子ＪＦｇ成嚢胞体
及びＤＥ−５２精製種虫を超ひ液処理することにより得
た。各サンプルのタンパク質濃度を上記ローリ−らの方
法によって測定した。３ＸｌＯ’非胞子形成／胞子形成
嚢胞体からの抗原収量は約５０ｕｇであって、一方向量
の抗原は約２　ｘ　ｌＯ’　１１虫から得られた。サン
プルを使用準備ができるまで一２０℃に保持した。

寄生虫抗原のプロットのために、各々の超音波処理サン
プル５０μｇを等量の２×サンプル緩衝液（ｐＨ６，８
の０．１２５ＭトリスＨＣｌ２．４ｗ／ｖ％ＳＤＳ、ｌ
Ｏｖ／ｖ％２−メルカプトエタノール、２０％グリセロ
ール及び０．００２５％ブロモフェノールブルー）と混
合し、３分間煮沸し、１５％ＳＯ５−ポリアクリルアミ
ドゲル又は５〜２０％ＳＯ５−ポリアクリルアミド勾配
ゲル上のいずれかで電気泳動に付した（レムリ、ネーチ
ャー、第２２７巻、第６８０−６８４頁、１９７０年）
。

一方、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１−１０フエナン
トロリン２　ｍ　ｇ　／　ｍβ、ベンズアミジン２ｍｇ
／ｍｇ、ＰＭＳＦ０．００２ｍｇ／ｍＪ２、シグマ大豆
トリプシン阻害剤０．０４８ｍｇ／ｍ１２、アプロチニ
ン０．０４８ｍｇ／ｒｒ＋４２．ロ、イベプチン０．０
２ｍｇ／ｍｇ）含有ＮＥＴ緩衝液中に１度５　Ｘ　ｌ　
Ｏ’　／　ｍ　Ｑの嚢胞体及び濃度５ｘ１０Ｆ／ｍβの
抑型を再懸濁させることにより抗原を得た。その時、サ
ンプルをブロモフェノールブルーのない等量の２×サン
プル緩衝液と混合し、サンプルを３分間煮沸し、完全に
破壊されるまで超音波処理し、再度３分間煮沸した。ブ
ロモフェノールブルーを０．００２５％まで加え、サン
プルを使用準備ができるまで一２０℃で貯蔵した。免疫
プロットのために、嚢胞体又は捕虫抗原をのせて、上記
のような電気泳動に付した。

ＳＯ５−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を。

トービンら、プロシーディング・才ブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ、第７６巻、第４
３５０−４３５４頁、１９７９年の技術により電気法動
的にニトロセルロースに移動させた６次いで、ニトロセ
ルロースを４時間ＴＢＳＴ中２０％牛脂児血清でブロッ
クした。

ブロック後、ニトロセルロースを０．０２％ＮａＮ５含
有Ｔ　Ｂ　Ｓ　Ｔ中２０％牛脂児血清で希釈された抗体
２ＯｍＲ中において室温で一夜インキユベートした。多
情異性抗血清はｌ：１００〜ｌ　：　２００希釈し、単
一特異性組換え溶出抗血清は１：１０希釈した。特異的
抗体との接触後、フィルターをＴＢＳ７２００ｍ！２で
３同各ノ１５分間にわたり洗浄した。結合抗体を最終濃
度２ＸｌＯ’カウント／ｍｉｎ／ｍｊ２まで’Ｉ”　Ｂ
　Ｓ　Ｔ　２０　ｍ　１２で希釈された・１２１＋１−
タンパク質Ａにより検出した。放射線標識タンパク質Ａ
とのインキュベートを室温で１時間行い、しかる後フィ
ルターを’「Ｂ　Ｓ　Ｔ　２００ｍＩ２で３回５分間に
わたり再度洗浄し、風乾し。

コダックＸ−オマットＡ　Ｒ（Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ｏｍａ
ｔ　Ａ１１）フィルムに露出させた。

一方、ニトロセルロースを３回の２００ｍＲ洗浄により
１時間にねたりｐＨ７，４のリン酸緩衝液中０．５％ゼ
ラチンでプロ・シフし、しかる後１時間にわたりｐｏ７
．４の５０ｍＭトリストＩＣＲ１１５０ｍＭ　　ＮａＣ
ｇ、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有゛含有Ｎ緩衝液中０．２５
％ゼラチンで二次ブロックし、前記のように洗浄した。

ブロック後、ニトロセルロースを０．２５％ゼラチン及
び０．０５％トリト：／Ｘ−１００含有ＴＥＮ緩衝液テ
ｌ　：　１００〜ｌ：２００希釈された抗体２０　ｍ　
Ｑ中室諷で夜インキュベートした。フィルターを０．２
５％ゼラチン含有’「１４　Ｎ　２００　ｍ　１２で各
／ｚ　５回２０分間にわたり洗浄した。結合抗体を最終
濃度２×１０’ｃｐｍ／ｒｎｎまで０２５％ゼラチン、
０．０５％トリトン含有含有Ｎ２０ｍ、２で希釈された
“２Ｊ−タンパク質Ａにより検出した。放射線標識タン
パク質Ａとのインキュベートを室温で１時間行い、しか
る後フィルターを１５分間にわたり０．２５％ゼラチン
、０．０５％トリトン含有含有Ｅ　Ｎ　２００　ｍ　１
２．で２回及び１５分間にわたりＴＥＮ２００ｍＱで４
回洗浄した。洗浄後、フィルターを風乾し、コダックＸ
−オマットＡｌｌフィルムに露出させた。

実施例７ ファージＤＮＡの調製 実施例６の組換え及び野生型えｇｔｌｌファージを多重
度１０で大腸菌宿主Ｙ１０８９株（ヒュー不ンら、前記
）中に清涼として導入した。清涼を単一コロニー単離用
としてアンピシリン１００μｇ　／　ｍ　Ｉ２含有Ｌ［
ｌプレート上に画線的に接種し、３０〜３２℃で一夜イ
ンキユベートした。いくつかのコロニーの増殖性を３２
℃及び４２℃で調べた。４２℃で増殖しなかった３２°
Ｃプレート培養物から１つのコロニーを選別し、−夜の
培養をアンピシリン５０　ｍ　ｇ　／　Ｉ２含有Ｌ［ｌ
ブイヨン中で行った。

次いで、清涼処理クローンを、０．３〜０．５の６００
ｎｍ吸光度に達するまで、３２゛Ｃでアンピシリン５０
μｇ　／　ｍ　１２含有ＬＢブイヨン５０ｍｅ中−夜培
養物から増殖させた。ファージ切出し及びル製を２０分
間にわたる４５°Ｃへの温度シフトによって誘導した６
ｗ１続的フアージ複袈は、細胞溶解の徴候が見えるまで
、３７℃で２〜３時間培養物を増殖させ続けることによ
り保証される。培養物が完全に溶解しない場合には、ク
ロロホルム０．１ｍβを各々に加え、培養物を３７℃で
重に１０分間攪拌した。これらの条件下、細胞の溶解は
数分間後に生じる。この時点で、細胞破壊屑をベックマ
ンＪＳ−１３０−ター中７．０００ｒｐｍで５分間の遠
心分離によりルーチン的に除去した。ファージ上澄液を
最終濃度０．０１ＭまでのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４添加後４℃
で一夜貯蔵し、ファージ頭部を溶解させた。

ファージ上？ａ液を室温に戻した後、ｌ　Ｏｍｇ／ｒｎ
　Ｑ　Ｄ　Ｎアーゼｔ５ｏｕｇ及び１０　ｍ　ｇ／　ｍ
　ＱＲＮアーゼＡ２５μｅを各サンプルに加えた。これ
らを３０℃で最低１時間インキュベートし、しかるｖｉ
Ｎａｃｆｆｌ、４６ｇを加え、各々に完全に溶解させた
。ｌ澄液を最低３０分間水Ｊ−で史にインキュベートし
た。次いで、残留細胞破壊屑をベックマン、Ｊ　Ｓ　−
１３０−クー中１０．００Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分
離により集めた。上澄を谷サンプルから集め、各トｔσ
液にカルボワックス（Ｃ；ｉｒｂｏｗａｘｌ　Ｐ　Ｅ　
Ｇ　８０００　［ポリエチレングリコール２０００、フ
ィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｂｅｒ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、ｌ　］　３　、５　ｇを溶
解させた。Ｉ）　ＩＥ　Ｇ存在下、ファージ頭部を４℃
で−ｉ放置して沈降させた。翌日、ファージ頭部を遠心
分離により集めた。４二澄液を４゛Ｃに維持されたベッ
クマンＪＳ−１３０−ター中１０，０００■・ｐｍで１
０分間遠心分離した。上澄液を慎重に排出し、廃棄した
。ペレットを０．１Ｍｌ−リス−ＨＣｌ２（ｐｉ−１７
，９）、０．３Ｍ　ＮａＣｌ２及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
２５０ｕＩ２に再懸濁し、しかる後０．５Ｍ　　ＥＤＴ
Ａ１２．５μβを加えて、サンプル中に残留するすべて
の遊１１Ｍｇ″をキレート化させた。ファージ頭部を上
記緩衝液中６７℃で１０分間インキュベートした。イン
キュベート後、１０％ＳＯ５５μβを各サンプルに加え
、サンプルを渦巻型ミキサー中で混合した。加熱して、
ファージタンパク質を変性させた。ＳＤＳで変性工程を
終了させ、ファージ頭部からＤＮＡを放出させる。

次いで、ファージから放出されたＤＮＡをフェノールで
２回、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：ｌ
）で３回抽出し、ｌ／’１０容“量の３Ｍ　　Ｎａ０Ａ
ｃ　（ｐ）置７．５）及び２倍容量の無水エタノールの
添加により沈降させた。サン・プルを一２０℃で一夜放
置して沈降させた。翌日。

ＤＮＡを小型遠心機で２０分間の遠心分離により集めた
。沈降ＤＮＡを０．３Ｍ　　ＫＯＡｃ　　３００μｅに
再溶解し、無水エタノール２倍容量の添加により再沈降
させた。サンプルを一８０℃で１０分間インキュベート
し、ＤＮＡを上記のような遠心分離によって集めた。Ｄ
ＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ｌ
ｏｍＭ）リス−ＨＣｆｆ　（ｐＨ７，６）、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）含有ＴＥＭＩ術液１００μβ
に再懸濁した。各サンプル中におけるＤＮＡ濃度を波長
２６０ｎｍでの分光測定により調べた。

実施例８ えｇｔｌｌクローンからのｃＤＮＡインサートのＩＩ袈 実施例７のえｇｔｌ１組換えファージ１０〜２０ｕｇ（
最終ＤＮＡｒ１１度０．２ｕｇ／ｕＱ）を５０ｍＭ　Ｎ
ａＣｌ２／１００ｍＭトリスＨＣｊ２（ｐＨ７，５）１
５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．からなる反応緩衝液中ＥｃｏＲ
Ｉ　（８０Ｕ／ｕｇ：ベーリンガー・マンハイム）で完
全に切断した６反応を５倍過剰量の酵素を用いて３７℃
で４時間行った。

反応生成物を３Ｍ　（ｐＨ５，６）貯蔵溶液Ｌ／ｌＯ容
量の添加によって０．３Ｍ酢酸ナトリウムに調節し、エ
タノール２．５倍容量で沈降させ、−７０℃で２０分間
冷却し、４℃で１５分間１５．０００ｘｇの遠心分離に
より集めた。ベレットをＴＥ　（ｐＨ７，５のｌＯｍＭ
）リスＨＣｌｌ１０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）３０ｕρに
懸濁し、臭化エチジウム含有プレパジーティブ１％アガ
ロース平面ゲル上においた。インサートを一夜の電気泳
動（１５ｈｒ／６０ｍＡ）によりファージアームから分
離した。

インサートの分別化を紫外線下での視覚化により確認し
た。アガロースゲルをｃＤＮＡインサートの両端でスラ
イスし、ＮＡ−４５膜片（シュジーチャー及びシュエル
）をゲル中に挿入して、ｃＤＮＡインサートを“サンド
イッチ”ｔｓａｎｄｗｉｃｈｉｎｇ）　した０次いで、
インサートをＮＡ−４５膜上で電気泳動に付した。終了
後、１１２をゲルから取除き、小片に裁断し、５０ｍＭ
アルギニン（遊ｓｉｔ塩基）、１ＭＮａＣ氾からなる溶
液２５０ｔｉｇと共にエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ）管に入れた。ＤＮＡを７０℃で３時間かけて膜か
ら溶出させ、水溶液を除去し、新鮮溶離液２５０μｅを
用いて溶出プロセスを繰返した。２つの溶離液（金工５
００μＩ２）を合わせ、４℃に冷却した。不（容性粒子
を４℃で１０分間にわたる１５．０００ｘｇの遠心分離
により集めた６次いで、可溶性物質をフェノールで２回
、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（
２５：　２４　：　Ｌ）で２回及びクロロホルム／イソ
アミルアルコール（２４：ｌ）で２回抽出した。ＤＮＡ
を上記のように０．３Ｍ酢酸ナトリウム／　Ｅ　ｔ　Ｏ
Ｈで沈降させ、７０％Ｅ仁ＯＨで２回洗浄し、風乾し、
ＴＥ２５μｅに懸濁し、２６０ｎｍの吸光度から定量し
た。次いで、ＤＮＡの一部をｌｉｌ！認のために分析用
アガロースゲル上で分析した。

１胤■ユ えＨｔｔｔライブラリーから単離されたｃＤＮＡクロー
ンの地　　成 実施例８の１）ＮＡインサートを、Ａ１洋（Ｓ。

６′、ＳＰｌ、ＳＯ６７）、Ｂ群（ＳＯ９，Ｓ。

２４．５０７’　、Ｓｏｌ’　）、Ｃ群（Ｓ　Ｐ　５４
．５ｔ）５９）、Ｈ群（ＳＯ３１１．５０２２７゜ＳＯ
２３１，５０３１１−２９）及びＨ群（ＳＯ２１６、Ｓ
Ｏ２１６−２）の代表的ファージクローンから単離した
。ファージインサートをベセスダ・リサーチ・ラボ市販
のプラスミドベクタｐｕｃ　１　Ｂ中に組込んでサブク
ローニングした。

インサートの単離及びサブクローニングのメｙ方を実施
例１２でＣｈｅＹベクターｐＪＣ２６４に関して記載し
たように行った。プラスミドをＬＩ３ブイヨン培養培養
物５中ｅ中ミニ調製物て増殖させ、実施例１２２故のア
ルカリン容菌法を用いてＤＮＡを各々から単離した。ｌ
ＯｍＭ）リスＮ　ＣＲ（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ　（ｐＨ８，０）の無ＤＮアーゼ膵臓ＲＮアーゼ（
２０μｇ／ｍｇ、）含有ＴＥ緩衝液５０μβ中筒単な渦
巻式混合により再懸濁した０次いで、ＤＮＡサンプルを
、ｃＤＮＡインサートのカッター（ｃｕｔｔｅｒｌ又は
非カッ−ターであるか否かを調べるために、様々な制限
エンドヌクレアーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズを含む多（の業者から市販されている）で切断した
。制限酵素切断は、常に製造者の指示に従い行われた。

通常５種のカッターを各クローンについて選択し、地図
作成分析を各組換えプラスミドの一重及び二重切断によ
り行った。生じるＤＮＡフラグメントを１％アガロース
ゲル上で電気泳動分離し、同一ゲル−ヒで同時に操作さ
れるＤＮＡマーカーとの比較によりサイズ分けした。地
図は、フラグメントサイズデータ及び公知のベクター制
限部位をインテリジエネティクス制限地図作成プログラ
ム（ＭＡＰインテリジエネティクス社）中に入れること
により、各クローンについて作成した。各場合において
、すべてのブタと最も適合する地図は第１〜５図に示さ
れている。

融合ポリペプチド５ＣＩＮ−（ラットＡＮＦ−２６）用
の発現プラスミドをｐｓｃＮｌプラスミドから得た。ｐ
ｓｃＮｌプラスミドは酵母ＲＡＳｌタンパク質５ＣＩＮ
のＮ末端１６５アミノ酸用の細菌発現プラスミドであっ
て、テメルズら、ネーチャー、第３１３巻、第７００−
７０３頁、１９８５年に記載されている。プラスミドｐ
ＳＣＩ　Ｎ　（ｌ　ｕｇ）をＡｃｃ　Ｉで完全に切断し
、末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■大フラグメント（
クレノウボリメラーゼ）で補足した０合成ＡＮＦ遺伝子
をＤｄｅＩ及びＩ−１ｉ　ｎ　ｃ　１１によるｐＡＮＦ
−１切断によって切出した。クレノウボノメラーゼでＤ
ｄｅ　Ｉ末端を補足後、１０４ｂｐフラグメントを単離
した０次いで、ＡＮＦ遺伝子フラグメントを上記のよう
に処理されたｐｓｃ　ＩＮに結合させ、コンピテントＪ
Ｍ１０５細胞を形質転換させるために用いた。アンピシ
リン耐性コロニーを適切なオリゴヌクレオチドでスクリ
ーニングした。ハイブリッド形成陽性コロニーのＳＯ５
抽出物を１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動に付し、し
かる後クマシーブルー染色又はタンパク質プロット分析
のいずれかによって融合クンバク質の発現について調べ
た。

ＡＮＦ遺伝子をｐｓｃＮ］プラスミドからｐ　Ｌ　Ｃ１
−２８プラスミドに移した。プラスミドｐＬｃｌ−２８
は完全Ｃｈｅオペロンを含んだｃｏ、ｅＥ１由来プラス
ミドであって、マツムラら、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー、第１６０巻、第３６−４１頁、１９８５年
に記載されている。ＣｈｅＹ及びＣＨＥＺ遺伝子含有Ｃ
含有オペロンフラグメントをｐＬｃｌ−２８からＢ　ａ
　ｍ　ＨＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１フラグメントとし
て切出し、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＴ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ
切断ｐＵＣｌ　３（ＰＬパイオケミカルズ）中に組込ん
でサブクロニングし、ｐＵｃｌ　３−ＣｈｅＹ−Ｃｈｅ
Ｚを得た。ｐＵＣ１３−ＣｈｅＹ−ＣｈｅＺで形質転換
された大腸菌ＪＭ１０５クローンは、ｐｕｃ１３ベクタ
ーのｉ［を受けたＩａｃプロモーターによってＣｈｅＹ
及びＣｈｅＺポリペプチドを発現した。ＣｈｅＹ−（ラ
ットＡＮＦ−２６）融合用に発現プラスミドを作成する
ため、ｐＬＪＣ１３−Ｃｈ　ｅ　Ｙ　−Ｃｈ　ｅ　Ｚを
ＣｈｅＹコード領域内部の唯一のｐｓｔｒ部位及び挿入
Ｃ：ｈｅＤＮＡの３″側のｐＵＣ１３ポリリンカー中の
唯一のＳｍａ１部位において切断した。ｐｌＪＣ１３ベ
クター及びＣｈｅＹのＮ末端１００残基に１いてコード
するＤＮＡを含んだ、得られる３ｋｂ　　ＰｓｔＩ　−
３ｍａ　ＩフラグメントをｐＳＣＮｌ−（ラットＡＮＦ
−２６）の１６０’ｂｐ　　Ｐｓｔｌ−旧ｎ　ｄ　ＩＩ
Ｉフラグメントと再結合させたが、これはＭｅｔ−（ラ
ットＡＮＦ−２６）についてコードしておりかつＡＮＦ
ペプチドの末端コドンの３′側の非翻訳ＲＡＳ　ｌ配列
５ｏｂｐを含んでいる。第６図参照、大１１１１ｍＪＭ
１０５を−Ｆ記２つのフラグメント含有結合混合体で一
形質転換させた。ＤＮＡをアンピシリン耐性クローンか
ら（ミニ調製物として）ｍ離した。所望のクローンはＥ
ｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ切断で１６０ｂｐ遺伝子フラグメン
トを放出するものとして確認された。これらのクローン
は、抗ＡＮＦ抗血清を用いた全細胞タンパク質のつ工ス
クーンプロット分析によりＡＮＦペプチドを発現するこ
とが示された。

実施例１０からのＣｈｅＹ−ＡＮＦプラスミドをプラス
ミドｐ　、Ｉ　Ｃ２２０に変換し、それを順々に修正し
た独特なｐＪＣ２６４プラスミドを作成した。ＣｈｅＹ
−ＡＮＦをｐＪｃ２２０に変換するため、ＣｈｅＹ−Ａ
ＮＦプラスミドＤＮＡ４０μｇを最終容！２００ｕｆｆ
（７）ｐＨ７，８１７）２５ｍＭトリスＨＣ９，５０ｍ
Ｍ　　ＮａＣｆｆ、　　１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２ｚ、１
ｍＭジチオスレイトール及び１１００ｕ／ｍＩ２牛血清
アルブミン中Ｈｉ　ｎ　ｄｌｌｌ（インターナショナル
・バイオチクノロシーズ社）２０単位と共に３７℃でイ
ンキュベートした。１５分間隔で、５０μβ部分をｐｔ
＋ｓ、ｏの０．５Ｍ　　Ｎａ−ＥＤＴＡ２＋ｕｆｆ含有
管に移して、切断を伴出させた。各サンプルｌ　５０ｎ
ｇを８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ　（ＴＨＥ）及び０．５ｕｇ／ｍＩ２臭化エチジウ
ム含有０．７％（Ｗ／Ｖ）ジ−プラークアガロース（Ｆ
ＭＣ）ゲルの各隣接列において電気泳動に付した。直鎖
化されたプラスミドは、３６５ｎｍ光で目視した場合に
Ｘｈｏ　Ｉ切断ＣｈｅＹ−ＡＮＦと同時に移動するバン
ドとして確認された。このバンドを１５．３０．４５及
び６０分間の切断に対応する各列からレーザー刃でゲル
より切出し、６５℃で溶融させ、３７℃の０．２ＭＮａ
ＣＪ１１．ｐＨ７，２のｌｏｍＭトリスＨＣｇ。

１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）１０倍容量で希釈し
た。ＤＮＡを重力流（ｇｒａｖｉｔｙ　ｆｌｏｗｌによ
りＮＡＣＳプレパック（Ｐｒｅｐａｃｌカートリッジ（
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）ＢＲＬに結合さ
せ、Ｍ衝液Ａｌ０ｍβで洗浄し、重力流により緩衝液Ｄ
　（２Ｍ　　ＮａＣｌ２．ｐｌ（７，２のｌ　ＯｍＭト
リスＨＣｇ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）０．５ｍｎで溶出さ
せた。無水エタノール１ｍｇをカラム溶出液に加えた。

サンプルを混合し、ドライアイス上で１０分間インキュ
ベートし、４℃１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離し
た。上澄液をデカントし、沈降物を７０％エタノール０
．５ｍＪ２で洗浄し、減圧乾燥した。ＴＥ　（ｐＨ７，
４の１０ｍＭトリス−ＨＣ１２，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）
中にペレットを溶解後、ＤＮＡ含有量を臭化エチジウム
スポット試験、即ちアガロースプレート法により測定し
た（マニアナイスら１分子クローニング：実験マニュア
ル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１
１９８２年、第４６８−４６９頁）。

直鎖プラスミドＤＮＡの末端を、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ及びＴＴＰ各２０ｕＭ、６０ｍＭ　　ＮａＣｌ
２、ｐｏ’７．ｓの６ｍＭ）リスＩｌｌ、６ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｆｆａ、１ｍＭジチオ・スレイトール並びにＤＮＡ
ポリメラーゼＩ大（フレノウ）フラグメント２２．５単
位（ベーリンガーマンハイム）含有反応混合物２５μβ
中１５℃で２時間３０ｎｇをインキュベートすることに
よりプラント化させた。反応を終了させ、ＤＮＡをフェ
ノール／クロロホルム抽出（マニアナイスら、前記、第
４５８−４５９頁）及びエタノール沈降（マニアティス
ら、前記、第４６１頁）により精製した。

ＢａｍＨＩリンカ−（ｄ−ＧＧＧＡＴＣＣＣ、ベーリン
ガーーマンハイム）１２．５μｇをｐＨ７，４の５０　
ｍ　Ｍ　トリスＨＣｌ２．　　ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｆｆ
２５ｍＭジチオスレイトール、５００ＬＩＭ　　ＡＴＰ
及び４０μＣ１のγ−”Ｐ−ＡＴＰ　（アマ−ジャム、
５００口Ｃｉ／ｍｍｏＩ２．ｌｏｍｃｉ／ｍｅ）含有反
応混合物４０μβ中３７℃で３０分間Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（ファルマシア）４０単位によりホスホリ
ル化した０反応を、７０℃で５分間インキュベートする
ことにより停止させ、リンカ−を使用時まで一２０℃で
貯蔵した。

プラント末端化直鎖プラスミドＤＮＡを水６６μｅに溶
解し、ホスホリル化ＢａｍＨＩリンカ１２５ｎｇ、ｐｔ
（７，５の６．６ｍＭトリス１−Ｉ　Ｃｆｆ、６　、　
６　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｘ　、　　１　ｍ　Ｍ　
　Ａ　ＴＰ、１０ｍＭジチオスレイトール及びＴ　４　
Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼにューイングランドバイオラブズ）
０．００２５単位含有最終容量１０ｔ、ｔβに調節した
。４℃で１８時間インキュベート後、この混合物５μ２
をコンピテント大腸菌ＨＢ　ｌ　０１細胞（ＵＲＬ）１
００μｅに加えた。細胞の形質転換を１３　ＲＬ発案法
に従い行った。１１のアンピシリン耐性コロニーをラン
ダムに選択し、各々をアンピシリン１００μｇ　／　ｍ
　（２含有ＬＢブイヨンｆｂｒｏｔｈｌ液体培地（マニ
アナイスら、前記）５ｍＩ２に接種するために用いた。

３７°Ｃで一夜増殖後、プラスミドミニ調製物をアイシ
ューホロビクッ及びパーク、ヌクレイツク・アシッズリ
サーチ、第９巻、第２９８９−２９９８頁、１９８１年
　［１ｓｈ−１１ｏｒｏｗｉｃｚ　　ａｎｄ　　Ｂｕｒ
ｋｅ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ１１ｃｓｅａ
ｒｃ＋＋　９　：　２９８９−２９９８　（１９８１）
　］で記載されているように作成した。

制限酵素地図作成及びアガロースゲル分析により、ｐＪ
Ｃ２２０と命名された１つのプラスミドはプロモーター
隣接Ｉｆ　ｉ　ｎ　ｄ　１１１部位にＢ　ａ　ｍ　）Ｉ
　Ｉリンカ−を有していることが判明した。このプラス
ミドは、ＣｈｅＹコード領域の３′末端側にＨｉ　ｎ　
ｄ　ＩＩＩ部位（今度は唯一）を保有していることも判
明した。

ｐＪｃ２２０プラスミドを５０ｍＭＮａＣｌ２、ｐＨ７
，４のｌＯｍＭ）リス−ＨＣＲ，１０ｍＭＭ　ｇ　Ｓ　
０４及び１ｍＭジチオスレイトール含有溶液５０μβ中
３７℃で１時間にわたるＨｉ　ｎ　ｄｍ　（ベーリンガ
ーーマンハイム）５０４１位でのｐＪｃ２２０ＤＮＡ　
１０μｇの切断によってｐＪ０２６４プラスミドに変換
した。酢酸アンモニウムを最終濃度２．５Ｍまで加え、
ＤＮＡをエタノール２倍容量での沈降により回収した６
次いで。

Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ切断ＤＮＡをｄＡＴＰ及びｄＧＴ
Ｐ各２０　ｕ　Ｍ　、　６０　ｍ　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｇ
　、　ｐ　Ｈ７、５の６ｍＭ）リス−Ｈ（１２，６ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２２並びに１ｍＭジチオスレイトール含有
含有ｉ２０μβ中ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメン
ト（ベーリンガーーマンハイム）５単位で部分的に補足
し。

室温で３０分間インキュベートした。サンプルをフェノ
ール／クロロホルムで抽出し、マニアナイスら、分子ク
ローニング、実験マユ１アル、コールド　スプリング　
ハーバ−ラボラトリ１９８２年で記載のようにエタノー
ル沈降によって回収した。

ＤＮＡを水に溶解し、最終容量２０μβ中０．３Ｍ　　
ＮａＣｊ２．ｐＨ４，６の３０ｍＭ酢酸ナトリウム及び
４　、５　ｍ　Ｍ　　Ｚ　ｎ　ＣＩ２２に調節した。

Ｓ’ｌヌクレアーゼ（ＵＲＬ）５単位を加え、混合物を
３７℃で３０分間インキュベートした。切断をｐＨ８，
０の０．５Ｍ　　ＥＤＴＡＩｔＬｆｆ添加によって停止
させ、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈降させた。５１ヌクレアーゼ処理ＤＮＡを、ｌ
　００ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃｇ、ｐＨ７，４の５０ｍＭト
リス−Ｈ（１２及び１０ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４含
有Ｍｆｔｉｆｉ５０　ｕ　１２中３７℃で３０分間Ｅｃ
ｏＲＩにューイングランドバイオラブズ）８０ｍ位で切
断した。ＤＮＡを上記のように酢酸アンモニウム中での
エタノール沈降によって回収した。ＥｃｏＲＩ末端を上
記のように。

但しｄＡＴＰ及び′ｒＴＰの存在下かつｄＧＴＰ及びｒ
ｉ　ＣＴ　Ｐの非存在下でＤＮＡポリメラーゼ■の大フ
ラグメントにより補足した。ＤＮＡをフエノ−ル／クロ
ロホルムで抽出し、エタノール沈降により回収した。

このＤＤＮＡｌｏｏｎをｐＨ７，５の６６ｍＭトリス−
ＨＣｆｆ、６　、６　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１２ｔ、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　　Ａ’ｒＰ及びＴ４
ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラブズ）４０
０単位含有溶液ｌＯμａ中４℃で２４時間かけて結合さ
せた。結合混合体２μｅを用いて、業者の標準操作法に
従いコンピテント大腸菌ＪＭＩ０９細胞［ストラタジェ
ンｌｓｔｒａｔａｇｅｎｌ　］１００μ２を形質転損さ
せた。アンピシリン耐性形質転換株は、メーソン（Ｍａ
ｓｏｎｌ及びウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｌ、゛核
酸ハイブリッド形成：実務的アプローチ゛’、Ｂ、Ｄ、
バーメス（Ｂ、　Ｄ、　Ｉｌａｍｅｓｌ及びＳ、Ｊ、ヒ
ゲンズ（Ｓ、　Ｊ、　ｌｌｉｇｇｅｎｓ１編集。

ＩＲＬブレス（１９８５年）、第１１３−１３７頁の標
準的方法を用い、プローブとして５′”Ｐ−標識合成オ
リゴヌクレオチドｄ　（ＣＣＣＡＡ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　
Ｔ　ＣＡ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ　）を用いてコロニーハイブリ
ッド形成によりスクリーニングした。ｐＪＣ２６４と命
名された１つのハイブリッド形成コロニーは、制限地図
作成によると、ＣｈｅＹ遺伝子の３゛末端側に唯一のＥ
ｃｏＲＩ部位を再び組入れている１：とが判明した。

Ｃｂ　ｅ　Ｙ　−Ａ　Ｎ　ＦからのｐＪｃ２８４の作成
法は第７図で略図化して示されており。

ＰＪＣ２［１４の制限地図は第８図で示されている。

実１１引Ｖス ｃＤＮＡ挿入体のｐ　Ｊ　Ｃ２６４ヘのサブクローニン
グ 実施例１１で得られたｐＪＣ２６４２０μｇを実施例８
で記載した反応条件を使用してＥｃｏＲＩで直線状にし
た。反応生成物を沈澱させ７０％ＥｔＯ１（で２回洗浄
し、蒸留水４３μβ及び１ＯＸＣＩＰ緩衝液（０，５Ｍ
トリス−ＨＣβ、ｐＨ９，０，１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ２
ａ、ｌ　ｍ　Ｍ　ｚｎｃＱ　ｍ、１１０１ｎスペルミジ
ン）５μβに懸濁させた。

ＥｃｏＲＩ末端の５′−リン酸基を仔つシ腸アルカリ性
ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍｌで除去した。酵素（１９ＬＩ／μｆｆ）ｌｕＩ２
を加え反応を３７℃で３０分間開始させた後２番目のｌ
μβを同じ時間加えた。蒸留水４２．５μ！、２０％ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）２．５ｕ（１，１Ｏｘ
ｓＴＥ　（ｌｏｏｍＭ）す、２．−１１Ｃｆｆ、ｐＨ８
，０／ＩＭ　　ＮａＣｊ２／１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）ｌ
Ｏμｅを加えることにより反応を停止させ、６８℃で１
５分間加熱した０次いで反応混合液をフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（４Ｂ　：　４８　：
　２）で２回、クロロホルム／イソアミルアルコール（
２４：ｌ）で２回抽出し。

最後に室温で５分間１０００ｘｇで遠心分離によりＴＥ
で平衡にしたセファデックスＧ−２５（媒質）のｌＣＣ
カラム床に通過させた（スピンカラム）０次いで前述の
ように沈澱させ、７０％Ｅ　ｔＯＨで２回洗浄し、ＴＥ
５０μｉに懸濁させ、吸光度２６０ｎｍで定量した。

ｐＪＣ２６４を直線状にし、ホスファターゼ処理したＥ
ｃｏＲＩ約１１００ｎをさらに６６ｍＭトリス−ＨＣｆ
ｆ、ｐＨ７，６，５ｍＭ　　ｕｇｌ、。

５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰからなる
反応混合液２０ｕ１２中で同モル量のゲル精製アイメリ
ア　テネラｃＤＮＡ挿入体と混合した。

ｉ”　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼにューイングランドバイ
オラプス、２００〜４００Ｕ／μβ）を添加することに
より反応を開始し、１４℃で１２〜１６時間続けた。

予め決められた容量（形質転喚反応当り３ｍｇ）０）２
ＸＹＴ細菌倍地（Ｉｆｆ当りペクト８９１８２１６ｇ／
酵母エキスｌ　Ｏｇ／　ＮａＣｆｆ　５　ｇｉを大腸菌
ＪＭ８３の単一コロニーと装置し、６０Ｏｎｍに於ける
光学密度０．６に達するまで３７℃で激しく撹拌しなが
ら増殖させた。細菌を１１００Ｏｘの遠心分離に４℃で
５分間かけることにより集め、５０ｍＭ滅菌Ｃａ　ＣＩ
２＊を含む原培養の１７２容量・に緩やかに懸濁させた
。懸濁液を氷で２０分間維持し、細菌細胞を上述の通り
遠心分離により集めた。次いで沈降物を５０ｍＭ滅菌Ｃ
ａＣｇ□の１／ｌＯ容量に緩やかに懸濁させた。次いで
細菌懸濁液を４℃で１６〜２４時間維持した。

連結反応混合液２０μβを滅菌ＴＥ８０μシを加えて１
００μｅに希釈し、５μ！及び９５μ！アリコートをポ
リプロピレン滅菌管に分配した。

コンピテント細菌的２００μβを連結反応物（並びに適
当な連結及び形質転換対照）を含む各々の管に加え、４
０分間氷上に置いた。この後、４２℃で９０秒間温諷置
て細菌を“熱ショック“処理した６次いでプラスミドを
保護する細菌の選択及びプラスミド維持のために５０　
ｍ　ｇ　／　１２の濃度でアンピシリンを含む２ＸＹＴ
寒天平板に各々の形質転換反応管を覆った。平板を逆に
して３７℃で一晩装置した。

プラスミドを収容する細菌クローンを薬剤選択の存在下
で平板の増殖能により同定した。２×ＹＴ／ＡＭＰ　（
即ちアンピシリンを５０ｍｇ／βで含む２ＸＹＴ借地）
５ｍｇを接種するために・単一コロニーを使用し、これ
らの培養菌を３７℃で一晩激しく振盪しながら増殖させ
た。培養菌的１．５ｍｇをエッペンドルフ管に注ぎエッ
ペンドルフ遠心機で少なくとも１分間遠心分離して集め
、培養菌の残りを４℃で貯蔵し、遺伝子保存として使用
した。細菌沈降物上の培地を吸引し沈降物を５０ｍＭグ
ルコース、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス−Ｎ
ＣＲ（ｐＨ８，０）、４ｍｇ　　ｍｌｌリゾチームの新
しく調製した冷却溶液１００μ２に旋回させて懸濁させ
た。この混合液を室温で５分間１置した１次いで０．２
Ｎ　　ＮａＯＨ及び１％ＳＤＳからなる新しく調製した
冷却溶液２００μβを各々の管に加え、逆にして緩やか
に混合し、水に５分装置いた。この混合液に５Ｍ酢酸カ
リウム６ｍｇ、氷酢酸・１．１５ｒｎＪ２．蒸留水２．
８５ｍＩ２を含む新しく調’ｌした冷却溶液１５０μβ
を加えた。内容物を渦巻き混合で緩やかに混合し、この
混合液を水で５分間貯蔵した。エッペンドルフ遠心機で
４℃で１０分間遠心分離することによって細胞片を集め
、上澄液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２５：２４：１）で１回抽出した。プラスミド
ＤＮＡ及び細胞性ＲＮＡを室温の１００％エタノール２
容Ｉを加えた最終の水相から沈澱させた。沈降物を室温
で５分間遠心分離して集め、沈降物を７０％エタノール
で１回洗浄した後、簡単に乾燥した０次いで核酸沈降物
を１ｒｎＪ２当りＤＮａｓｅ−遊ｆｉＲＮａｓｅ２０ｕ
ｇを含むＴＥ５０ｕｆｆに懸濁させ、３７℃で１５〜３
０分間温置して装胞性ＲＮＡを量的に除去した１次いで
ｌ　０ｕ１２のアリコートを５０ｍＭ　　　ＮａＣｆｆ
、ｌｏｏｍＭ）リス−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，５）、５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｇ　ｚからなる緩衝液中３７℃６０分間Ｅ
ｃｏＲＩ　　（約２０ユニツト）で完全に切断した。制
限酵素反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分
画して適当な挿入体を含むプラスミドを同定した６次い
で予測したＥｃｏＲＩ挿入体を含む組換え体プラスミド
を第２制限酵素（通常Ｐｓｔｌ）で切断して（ｉ）挿入
体の単一複写のみがプラスミド内に含まれることが実証
され（ｉｉ）細菌ブロモ−クーに関して挿入体ＤＮＡの
配向が記録された。これはＲＮａｓｅ　−消化された細
菌核酸の残りの４０μβから２番目のｌＯμ！アリコー
トを除去し、Ｐｓｔｌ約２０ユニットを含むｌｏＯｍＭ
　　ＮａＣｌ２．１０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐ　Ｈ７
、５）及び１０ｍＭＭ　ｇ　Ｃ２＊からなる緩衝液中３
７°Ｃで６０分間切断した。制限酵素消化物をアガロー
スゲル電気泳動によって分解した。

ブイヨン５ｍβに細菌の単一コロニーを接種して選択組
換え体細菌の一夜培養を調製した。培地はアンピシリン
（５０ＪＬ　ｇ　７ｍ　Ｅ　）を含む２ＸＹ１’（Ｉｇ
当りトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣ２１
０ｇ）で−あった。アンピシリンを含む２ＸＹＴ５００
ｍｆｆを接種するために一夜培養を使用した。培養を３
７℃で通気しながら中間対数増殖が（Ａ５５０’０．５
）に達するまで増殖させ、この点でｌ　ＰＴＧを最終濃
度１１００ｕまで加えた。培養を３７℃で更に３〜４時
間増殖させ氷で冷却し、４゛°Ｃで１５分間遠心分離し
た。

細胞をＰＢＳで１回洗浄した後細菌を遠心分離で集め、
必要になるまで一７０℃で凍結貯蔵した。

必要としだ際細菌沈降物を解凍し、３０ｍＭトリス−１
１Ｃｆｆ、ｐ）１８゜０．５０ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び１
ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（緩衝液Ａ）
１０ｍＩ２に懸濁させた。懸濁液を氷、Ｌでプランリン
セルディスラブターモデル３５０（デユーティサイクル
３０、出力コントロール４）を使用して各回３分間で２
回超音波処理した。超音波処理物を２７０００ｘｇで４
５分間４℃で遠心分離して清澄化した。上澄み液は第１
上澄み液を構成した。不溶性物質の沈降物をＯ１％ｗ／
ｖトリトンＸ１００を含む緩神内夜Ａｌ０ｍ２で洗浄し
た。懸濁液を水浴中で３０分間攪拌した後２７．ＯＯＯ
ｘｇで４５分間４℃で遠心分離した。上澄み液は第２上
澄み液と呼ばれる。次いで沈降物（β２）を緩衝液Ａで
２回洗浄し、洗液を捨てた。沈降物（β２）を１００ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む６Ｍグアニジン−ＨＣβ１
．０ｍｌに懸濁させ、懸濁液を５０℃で２時間装置した
。懸濁液を７Ｍ尿素でｌ　Ｏｍｊｌ！に希釈し、２７０
００ｘｇで４５分間４℃で遠心分離して清澄化した。上
澄み液は第３上澄み液を構成した。

異種融合タンパク質は異なった溶解度特性を示し、主に
第１上澄み液に見い出され、そして第２上澄み液及び第
３上澄み液に（最も共通的に）見い出された。

５０６−ＣｈｅＹ抗原（組換え体Ａ抗原）は第１、第２
及び第３上澄み液で見い出された。生体内試験に対する
物質は、イオン交換クロマトグラフィによって第３上澄
み液から調製された。

０．０２５Ｍ１−リス−１量ＣＱ、ｐＨ８，５，８Ｍ尿
素で平衡にしたトリスアクリルＭ−ＤＥＡＥ（Ｌ　Ｋ　
Ｂ　）カラム（５ｍｊ２）を調製した。第３上澄み液か
らタンパク質１２ｍｇを含む２ｍＱ試料を上記緩衝液１
００ｍ！２に対して透析した後、カラムに適用した。カ
ラムをカラム緩衝液の１カラム容量で洗浄した後、００
５Ｍ、０，１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、
０．３Ｍ、０．３５Ｍ又は０．４Ｍ　　ＮａＣ，ｅを含
むカラム緩衝液で段階的に溶離した。各々の溶離を２カ
ラム容徹で行なった。溶出液をウサギ抗フラクションＶ
を使用して５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンブロッテ
ィングにより組損え体タンパク質の存在を試験した。Ｓ
Ｏ６／ＣｈｅＹタンパク質が０．１５Ｍ及び０．２０Ｍ
　　ＮａＣｆｆ画分に溶離することを見い出した６画分
をプールし、５０ｍ　Ｍ　　Ｎ　８４ＣＯ３に対して透
析し、凍結乾燥した。５００ｒｒ＋Ｊ２培養からの蛋白
質の収量は約３ｍｇである。

ＳＯ７−ＣｈｅＹ融合タンパク質（組換え体Ｂ抗原）は
第３１澄み液に見い出された。更に水酸化リン灰石によ
るクロマトグラフィで精製した。

水酸化リン灰石（来賓ｆ１６　ｍρ、バイオラドラプス
、ＨＰＴグレード）を７Ｍ尿素で平衡にし、第３上澄み
液をカラムに適用した。カラムを７Ｍ尿素の１床容量で
洗浄した後、流動液及び先液を合わせ、アミコン透過膜
ＹＭＩＯでｌｏｍＱに濃縮し、５０ｍＭ　　ＮＨ，ＨＣ
Ｏ，に対して透析し。

凍結乾燥した（生成したいかなる沈降物も包含する）、
５００ｍｇ培養からの収量は約３５ｍｇタンパク質であ
った。

またＳＰ５４−ＣｈｅＹ融合タンパク質（組換え体Ｃ抗
原）は第３上澄み液に見い出された。インビボ試験用に
は、更に精製する必要はなかった。５００ｍＩ２培養か
らの第３上澄み液中のタンパク質の収量は約１７０ｍｇ
であった。

ＳＯ３１　ｌ−２９−ＣｈｅＹ融合タンパク質（組換え
体Ｈ抗原）もまた第３上澄み液中に見い出された。更に
水酸化リン灰石によるクロマトグラフィで精製された。

カラムを上述の通り調製し、第３上澄み液を適用した。

カラムを７Ｍ尿素の２床容量１次に１０ｍＭ、２０ｍＭ
、４０ｍＭ、　　８０ｍＭ、１６０ｍＭ又は３２０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐ）Ｉｆ３．５を含む７Ｍ尿
素の２床容１で展開した。カラム溶出液をウサギ抗−フ
ラクションＶ、ウザギ抗−スボロゾイト血清又は組換え
体溶離抗体を使用してＳＯ５−ＰＡＧＥ及びウェスター
ンブロッティングにより組換え体タンパク質の存在に対
して試験した。ＳＯ３１ｌ−２９−ＣｈｅＹタンパク質
が４０ｍＭ、８０ｍＭ及び１６０ｍＭ溶出液に見い出さ
れた。

これらの溶出液を上述の通り正確にプールし、濃縮し、
透析し、凍結乾燥した。５００ｍｊ２培養液からの収量
は約５ｍｇタンパク質であった。

また５０２１６−ＣｈｅＹ融合タンパク質（組換え体Ｆ
抗原）が第３上澄み液に見い出された。

生体内試験に対して精製は必要とじなかった。

５００ｍＩ２培養液からの収量は約３０ｍｇタンパク質
であった。

実施例９で得られた代表的なＥ、テネラ免疫徐クローン
を３標準方法の１又は２を利用してヌクレオチド配列分
析にかけた。いくつかの配列分析はマクサム及びギルバ
ート、メソッズ　イン　エンザイモロジー、第６５巻（
１部）４９７〜５５９頁＋１９８０年）の化学的減成１
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ１方法を使用して決定される。

更に一般的にはハラトリ及びサカキ、Ａｎａｌｙｌ、　
［ｌｉｏｃｈｅｍ、第１５２巻、２３２〜２３８頁（１
９８６年）に記載される変性プラスミド鋳型（Ｅ、テネ
ラｃＤＮＡの同類配列を含むプラスミドｐ［ＪＣｌ　８
）を使用するジデオキシ鎖終結技術により決定される。

ヌクレオチド配列決定の第３方法は、メッシング、メソ
ッズイン　エンザイモロジー第１０１巻、２０〜７８頁
（１９８３年）のジデオキシ鎖終結配列標準方法を使用
するｃＤＮＡ挿人体又はその一部をバクテリオファージ
ｍｐ１８にサブクローンし。

分泌−重鎮組換え体ファージ鋳型を配列することによっ
て達成される。更にＡＭＶ逆転写及びＤＮＡポリメラー
ゼ■、変性Ｔ　７　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼのフレノウ
フラグメントが使用される。タボ−及びリチャードソン
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ第８４巻、４７６７〜４７７Ｉ頁（１９８７年）参照
。

アミノ配列夕１１は以下の情報を組合わせることにより
決定ヌクレオチド配列から推定された。ファージ発現ベ
クターえｇし１１中ｃＤＮＡ、実施例８参照の各々はβ
−ガラクトシダーゼで融合タンパク質として発現された
場合ポリクローナル抗血清、実施例２参照、によって同
定された。この融合タンパク質の共有付加の性質を次の
表に示す。

表　　５ ５°　　　　ＧＣＧ　　　ＧＡＡ　　　ＴＴＣ３Ａｌａ
　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　ＰｈｅＥｃｏＲＩ開裂部
位に於けるこの結合（及び読取り枠、クローニング部位
）は、サブクロニングベクターｐＵＣ１８、ｍｐ１８又
はｐ　、Ｊ　Ｃ２６４に関係なく全ｃＤＮＡを含んでい
る次の各々のクローニングで再生される。従って読取り
枠は明白に同定され、これらの３種のベクター中の挿入
体の配向が確在されればヌクレオチド配列が翻訳される
。プラスミド、ｐＵＣ１８及びｐ　；Ｉ　Ｃ２６４又は
ファージｍｐ４Ｂ、ベクター中のｃＤＮＡ挿入体の配向
は制限酵素マツピングにより達成される。実施例９参！
！へ、非対称制限酵素認識配列がｃＤＮＡＤＮＡ白人体
内されれば挿入体配向及び転写配向は認識配列がヌクレ
オチド配列によって同様に予測される場合明白に指定す
ることができる。

Ａ型クローンヌクレオチド配列及び得られたＡ型免疫原
アミノ酸配列は代表的なりローン８０６７で例示される
。このクローンはＳＯ６クローン内に完全に含まれる実
施例９参明。このクローンには約８７０ヌクレオチドの
うち５′末端で開始するｆｆ＆？刀の１６２ヌクレオヂ
ドが配列されている。転写配向、従って正確な読取り枠
はＣｈｅＹ−３Ｏ６７組換え体プラスミドの制限酵素マ
ツピングによって予ｄ１１１される制限酵素認識配列の
ヌクレオチド配列中の位置に基づいて明白に推定するこ
とができる。ヌクレオチド配列及び得られた５３Ｎ−末
端アミノ酸配列を以下の表に示す。

青−一旦 史に２２１ヌクレオチド配列はクローンの３末端から得
られる、以下の表７参照、が読取り枠はｆｉｔ定されて
いない。

丁ＴＴＡ　ＴＴＣＣＩＴＣＧＡ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＣＧ
　ＧＣＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣＡＴＣＡＴＧ　ＴＴＣＡ’ｒ
ＣＡＣＧ　ＡＧＧ　ＣＧＣＣＴｒ　ＣＴＧＬａｕ　Ｉ’
ｈｅ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ
　Ｔｂｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　１．ｅｕ　ＬｅｕＣ’ｒＧ
　ＣＴＧ　ＣＧＡ　Ｔ’ｒＣＡＣＣＧ口’　ＣＣＴ　Ａ
ＣＣＧＴＧ　ＣＴｒ　ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡｔ；
ＣＡＧＣＡＮＧ　ＴＧＣＴＣＧｌ、１！ＩＩ　ｌｅｕ＾
ｒｇ　ｌ’ｈｅ　ｌ’ｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　’ｌ’ｈ
ｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ
　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　ＸＸＸ　Ｃｙｓ　５ｅｒＴＣＧ　Ａ
ＮＧ　ＮＡＧ　ＡＧＣＧＣＣＧＧＧ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　
ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　Ｇ
ＣＴ　ＣＧＳｏｒ　ＸＸＸ　ＸＸＸ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ＾Ｉａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌｎ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ａｌａ＾１ａ４０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５Ｇ人−−ヱ Ａ望免疫原ＳＯＩｉ７０）　３　’　ヌクレオチドＧＡ
ＧＧＣＧＧＡＧＡ　［７ＣｒＧＣＧＧＣＡ　ＧＧＣＧ（
ｒｒＧＧ’ｌＴ；　ＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧ　ＣＡ’Ｊク
ローン５０６７はＳＯ６クローン内に含まれるが、隣接
して含まれていない。クローンＳＯ６７の４位のヌクレ
オチド、表６はクローンＳ　Ｏ６０）　１６６位のヌク
レオチド、表８に相当する。この相同性はクローン５０
６７の９１位のヌクレオチドとクローンＳＯ６の２５１
位のヌクレオチドまで拡大する。これらのＡ型クローン
の３′末端に於いて相同性の著しいレベルがある。

クローンＳＯ６の３′ヌクレオチド配列、表９はクロー
ン５０６７の３′　ヌクレオチド配列、表７参！１αの
逆相補性に相当する。詳細には、クローンＳＯ６７の１
位に於けるヌクレオチド表７は、クローン８０６の１１
７９位に於けるヌクレオチド表９に相補的である。この
相補性は、クローン８０６の９５８位のヌクレオチドに
相当するクローン８０６７の２２１位のヌクレオチドま
で拡大する。アミノ末端ヌクレオチド配列及び得られた
アミノ酸配列を以下の表に示す。

Ａ型免 表　　８ Ｓｎ２のＮ一端ヌクレオチド及び推定アミノ酸配列ＡＧ
ＴＧＧＣＧＴＴＴｒＡＡＧＡＧＡＡ１〜−−−−−−−
−÷−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−÷−−−
−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−５１ＰｈｅＰｈ
ｅＶａ　ｌＰｈｅＰｈｅＰｈｅＰｈｅＰｈｅＡｒｇｃｙ
ｓＶａ　１ｓｅｒＧ　ｌ　ｙＶａｌ　１．ｅｕＡｒｇＧ
　ｌ　ｕＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴｒＧＴＧＧＧＡＧＡＣ
ＡＡＡ（：ＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡ
ＡＡＧＡＡＡ５２−−−−−−−一÷−−−−−−−−
−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−
−−−−−一÷−−１０２Ｇ　ｌ　ｙＡｒｇＡｒｇＶａ
　Ｉ　Ｖａ　ＩＧ　１ｙＡｓ　ｐＬｙｓＡｒｇＧ　ｌｙ
　ＰｒｏＡ　ｒｇＳｅｒＳｅｒ　ＬｙｓＬｙｓ　ｌｙｓ
重に１２５８ヌクレオチド配列がクローンの３′末端か
ら得られた、以下の表９参照、が読取り枠は推定されて
いない。

１０３　−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−
−−−−−−÷−−−−−−−−−＋−−−−−−−−
−＋−−−１５３ＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｙＰｒｏＧｌ
ｎＧ１ｙＧｌｙＰｒｏＰｒｏＰｈｅＳｅｒＡｒｇＧｌｙ
ＧｌｙＰｒｏＧ１ｎ　−ＧＧＧＧ　ＣＣＣＣＣＣＴＣＴ
ＴＣＣＴＴＣＧ　ＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＧＧＣＧＩＴＧＴ
ＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡ１５４　−−−−−−
＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−
−−−一−＋−−−−−−−−−＋−−−−２０４Ｇ　
ｌ　ｙＡ　ｌ　ａＰｒ　ｏＬｅｕ　Ｐｂ　ｅＬｅｕＡｒ
ｇｓ　ｅｒＴｒ　ｐＡ　ｒｇＡｒｇ（：ｙｓＳｅｒＳｅ
ｒ（’：ｙｓｓｅｒｓ　ｅｒＴＩ’ＣＡＣＣＧＴＴＣＣ
ＴＡＣＣＧＴＧＣ丁口’ＧＣＣＴＧＣ２０５−−−−−
＋−−−−−−−−−＋−一−−−−−−−＋−−−−
−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−２５５Ａ
ｒｇＧ　ｌ　ｙＡ　Ｉ　ａＰｈｅＣｙｓＣｙｓＣｙｓＡ
ｓｐＳ　ｅｒ　Ｐ　ｒｏ　Ｐｈ　ｅＬｅｕＰｒ　ｏｃｙ
ｓＰｈｅＡ　ｌ　ａＣｙｓＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡ
ＡＣＴＧＣ２５６−−−−＋−−−−−−−−−÷−−
−−−−−−−＋−−−−−−−−一÷−−−−−−−
−−＋−−−−−−３０６：１０７−−−÷−一−−−
−−−−÷−−−−−−−−−＋−−−−−−−−一＋
−−−−−４−一−÷−−＝−−−３５７Ｐｈ　ｅＰｈ
ｅＡｓｎＬｅｕＴｈｒｌｌ　ｉｓＡ　ｌ　ａＬｅｕＡｒ
ｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＧ　ｌ　ｎＧ　ｌ　ｎＣｙｓＳｅ
ｒＴｈｒ３５８−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−
−−−−＋−−−−−−一−−÷−−−−−−３９６Ａ
ｌａＬｅｕ１．ｅｕＡｌａＰｒｏ＾ｒｇＴｈｒＣｙｓＧ
ｌｙＣｙｓＣｙｓＣｙｓＡｒｇ表　　９ Ａを　　原ＳＯ６の３′ヌクレオチド配ＣＣＣＡＴＧＡ
ＴＡＡＡ　ＧＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ　ＡＧＴ
ＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＴＧ　ＣＡＴＣＡＧＣ５５１−
−−−−−−〜−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−
−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋　
６００’ｍＡ　ＣＴＴＧＴＴｒＣ’［ＣＡＴＣＡＴＣＡ
ＴＡＴＡ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＡ　ＣＣＡ　（：　ＣＡ
　ＣＣＡ　ＣｍＣＧＣＴ６０１　−−−−−−−−−＋
−−−−−−−−−＋−−−−−一−−−＋−−−−−
−−−−÷−−一−−−−−−＋　　６５０ＣＡＧＡ　
ＣＡＡ　ＣＡ’ｒＡ　ＣＧＡ　ＧＣＣＧＧＡＡ　ＧＣＡ
ＴＡＡ　Ａ　ＧＴＧＴＡ　ＡＡ　ＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧ
ＣＣＴＡ　Ａ１−−−−−−−−−＋−−−−−−−−
−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−÷−−−
−−−−−−＋　５０ＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣ
ＡＣＡＴＩ’ＡＡ５１−−−−−−一−−＋−−−−−
−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋
−−−−−−−−−＋　ＩＱＱＧＴＣＧＧＧＡ　ＡＡ　
ＣＣＴＧＴ（：ＧＴＧＣＣＡ　ＧＣＴＧ　ＣＡＴｒＡＡ
ＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡ　ＣＧＣＧＣＧＧｌｏｌ　−
−−−−−−−−＋−一−−−−−−−÷−−−−−−
−−−＋−−−−−−−−−＋−−一−−−−−−＋　
１５０ＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＴＡＡａＴＡＴＡ
ＴＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡ゛汀ＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＡ
ＴｒＡ１５１　−−−−−−一一−÷−−−−−一−−
−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−
−−−−−−＋　　２００ＴＡＴＡ　ＡＴＡＴＡＴＡＩ
ＴＡＴＡＣＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡｍＡＴＡ
ＴＴＡＴＧＧＴＡＴＡＴ２０１−−−−−−−−一÷−
−−−−−−−−÷−−−−−−−−−÷−−−−−−
−−−＋−−−−−−−−−＋　２５０ＡＴＡＴＡＡＧ
ＴＣＡＴＡＴＡＡＡＩＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡ
ＡＧＣＴＧＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＡＧ２５１−−
−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−一−−−
−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋　３
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ＧＡＧＡＡ　ＡＩＴＧＴＡ　ＣＡＴＧＧＡ　Ａ　ＧｍＧ
ＣＴＧＣＴＧＣ３０１−−−−−−−−−÷−−−−−
−−−−＋−−−−−−−一−＋−−−−−−−−−＋
−−−−−−−−−＋　　３５０３５１−−−−−−一
−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−÷−−
−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋　４００ＴｒＣ
ＡＧＣＡ　ＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧＴＡ　ＣＡＧＡ　ＣＡ
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Ｇ４０１　−−−−−−−−−÷−−−−−−−−−÷
−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−
−−−−＋　　４５０ＡＣａＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴ
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ＣＣＡＣＩＴＣＴＧＣＴ４５１−−−−−−−−−＋−
−−−−−−−−）−−−−−−−−−＋−−−−−−
−−−＋−−−−−−−−−＋　５００ＴＧＧＡＡＧＣ
Ｔ ＳＯｔ　　−−一−−−−−−＋−−−−−−−−−棄
−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−
−−−−＋　　５５０６５１−−−−−−−−−＋−−
−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−
−−＋−−−−−−−−−＋　７００ＴＧＣ’ｒＧＣＡ
Ｇ（：ＡＣ’ＣＡＧＡＡ　ＧＣＣＴＣＣＣＴ　ＧＧＴＡ
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−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−
＋　７５０ＡＧＣＴＧＩＴＧＴＧＡＧＡＧＣＡ　　　　
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−−−−−＋−−−−−−−−−）−−−−−一−−−
＋−−−−−−−−−÷−−−−−−−−−＋　　８０
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−−−−−−−−−÷−−−−−−−−−＋−−−−−
−−−−＋−−−−−−−−−＋　　１１１５０丁ｒＧ
Ｔ１ＴＩＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＣＧＣＣＡＣＡＴＣＡＴ
ＡＧ丁ローｒＧＧＴｃＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡ８５１
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−−−−−＋−−−−−−−−−÷−−−−−−−−−
＋　　９００Ｇ’ｒＣＣＣ丁ｍＧＡＣＴｒＣＧＧＣＧＡ
Ｇ（：ＴｒＧＴＡＣＩＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴ
ＡＧＡＣＧＣ９Ｑｌ　　−−−−−−−−−＋−−−−
−−−−−＋−−−−−−−−−十−−−−−−−−−
＋−−−−−−−−−＋　　９５０（：ＣＧＣＣＴＧＣ
ＣＧＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴ９５１　−−
−−−−−−−＋−−−−−−−−−÷−−−−−−−
−−＋−−−−−−−−−＋−−−一−−−−−＋　　
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−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−
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−−−−＋　１１００ＴＧＣＴＣＣＧＡＡＧＡＧＣＣＧ
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−−−−−−＋−−−−−−−−−＋　　１１５０ＡＧ
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１１５＋　−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋
−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−
−−−−＋　１２００ＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣ’ｒＴＣ
ＴＣＣＣＡ’ｎ−ｒＴＧｃＡＡＡＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡ
ＡＡＴＡＡ’ｍＧＧＡＡ＋２１１１　−−−−−−−−
一÷−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−
−−−−−−＋−−−−−−−−−＋　　１２５０八Ａ
ＡＡＡＡＡＡ Ｂをクローンヌクレオチド配列及び得られたＢ型免疫原
アミノ酸配列は、代表的なりローンＳＯ７で例示される
。読取り枠はヌクレオチド配列分析により予測される通
りｃＤＮＡ内に非対称に位置する制限酵素部位の位置を
各々の認識配列の位置と関係付けることによって明白に
推定することができる。このクローンには９５７ヌクレ
オチド全てが配列されている。ヌクレオチド配列と塩基
７１３に於ける末端コドンまでのアミノ酸配列を以下の
表に示す。

表　　１Ｏ Ｂｊ−のヌクレオチド　　　　アミノ １０　　　　　４０　　　　　３０　　　　　’４０　
　　　’、５０Ｔ　ＣＴＣＧＣＣＣＣＡ　ＡＣＴ　ｍ　
ＴＣＣＣＣＣＧＣＧ　ＣＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ
ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＬｅｕ　Ａｌａ
　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｔ６０　　　　　　
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ＣＡ　ＧＡＣＣＴＣＴｒＣＡＧＣＧＧＡ　ＣＴＣＧＴＧ
　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴ　ＧＴｒ　Ｇ
ｃＴＳｅｒ　１．ｙｓ　Ｍｅｔ＾Ｉｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ
　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａ
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　ＧＡＧ　ＧＧＣＧＡＧ　ＡＧＧ　ＧＣＣＣＣＣＣＧＣ
ＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＣＴ　ＧＣＣ＾１ａ　Ａｌ
ａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｕ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ＾ｌａ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＡｌａＴＧＧ　ＡＣＴ　Ｔ
ＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡ
Ａ　ＧＧＧ　ＧＣＣＣＧＣＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　Ｇ
ＧＴ　ｍ　ＧＴＧ丁ｒｐ　　Ｔｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　１．ｙｓ　　１．ｅｕ　　
Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　Ｖａ１２３０　　　
　　　２４０　　　　　　２５０　　　　　　　２６０
　　　　　　２７０　　　　　　２８ＧＣＡＧ　ＣＡＧ
　ＣＴＧ　ＡＧＴ　ｍ　ＧＴｒ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＡＡ
Ｇ　ＣＴＧ　ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣ’ｒＧ　ＣＧＧ　Ｇ
ＴＧ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＡＧＧｌｎ　Ｇｌｎ　１．ｅ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｘｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ
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ａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＧｌｕＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣ
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Ｔ　ＴｒＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＡＧ　ＡＧＣＡ
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ａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ＾ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｌｙｓ　Ａｓｐ＋６０　　　　　　’　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１７０２９０　　　　　　　：
１００　　　　　　３１０　　　　　　　　：１２０　
　　　　　３３０　　　　　　３４０ＣＡＧ　ＣＴＧ　
ＧＣＧ　ＣＧＣＴＧＣＧＣＴ　ＧＣＩ；　ＣＡＧ　ＧＧ
Ｇ　ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣ＾ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ
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ｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ
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Ｓｅｒ　５ｅｒｔｏｏ　　　　　　　　　　　　　　　
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Ｓｅｒ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　１ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　
Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　（ｉｌ、ｎ　Ａｌａ
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０３９０４００１’ＧＣＴＧＣＧＣＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ
　ＣＡＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＡｌｌｉ　ＣＡＧ　ＧＡＣ
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ＧＣＣｙｓ　ＣｙｓＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　１．ｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ｓｃｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ＾Ｉａ　Ｇｌ
ｙＩＴｃ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＧＧＣＴＡＣＣＡＧ　ＧＧ
Ｇ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＴＣＴ
　ＣＴＧ　ＧＧＣＴＡＣＧＧＧ　ＧＣＣＣＣＴＰｌ＋ｅ
　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ＾
ｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒ。

４１０　　　　　　４２０　　　　　　４：ｌ１１　　
　　　　　４４０　　　　　　４ｆ＋０＾ＡＧ　ＣＡＧ
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　ＡＧＣＡＧＣＡＡＡ　ＣＴＧ　ＧＣＣＣＴＣＧＡＧ　
ＧＣＣＣＴＣＣＴＣＬｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　１．ｅｕ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ
　１．ｅｕ　Ｌａｕ６：＋０　　　　　　１ｉ４Ｇ　　
　　　　　　６５０　　　　　　６６０　　　　　　６
７０　　　　　　　６８ＧＧ（：Ｔ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　
ＴＡＣＧＧＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣ
ＡＧＣ＾ＧＣＴＡＣＧＧＧ　ＧＣ（ｉ　ＣＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＴＣＣ＾１ａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓ
ｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　５ａｒ６９０　　　　　　７００　　　　　　　７
１０　　　　　　７２Ｇ　　　　　　　７：１０　　　
　　　　７４０＾ＧＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣＴＣＣＧ
ＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧ　ＴＡＧ　ＣＣＣＴＧＣＡＧＣ
ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ３ｅｒＧｌｎＧ
ｉｎＰｒｏＳｅｒＧＬｙＰｈｅＰｈｅＴｒｐ７５０　　
　　　　７１ｉ０　　　　　　　７７０　　　　　　７
１１０　　　　　　７９０ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧ
ＣＧ　ＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣ１５ＧＣＣＧＧ
Ｇ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ
ｌｌｏｏ　　　　　　　８１０　　　　　　８２０　　
　　　　８３０　　　　　８４０　　　　　　８５０Ｃ
ＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧ　ｎｎｎ　ＣＧＧ　ＣＴＡ　ＧＣ
Ｇ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＡＧＣＡＣＴ　Ｃ１１ｉＣＡにＧ
　ＧＡＡ　ＣＴＣＣＡＣＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＧＧ８６Ｇ
　　　　　　＋１７０　　　　　８６０　　　　　８９
０　　　　　９０１１　　　　　９１０ＧＡＧ　ＡＧＣ
ＡＧＣＡＧＧ　ＧＡＣＧＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣ
ＡＴＧ　ＴＡＧ　ＣＧＣＡＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧ
ＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧＣ型クロ一ンヌクレオヂド配
列及び得られたＣ型免疫原アミノ酸配列は、代表的なり
ローンＳＰ５４で例示される、実施例９参照、このクロ
ーンはＳＰ５９クローン内に完全に含まれる、実施例９
参照、このクローンには約７００ヌクレオチドのうち５
′末端で開始する最初の１５７ヌクレオチドが配列され
ている。転写配向従って適当な読取り枠はヌクレオチド
配列中の制限酵素認識配列をＣｈｅＹ−ＳＰ５４組換え
プラスミドの制限酵素マツピンクによって予測される非
対称位置と関係づけることによって明白に推定すること
ができる。ヌクレオチド配列及び得られた５２個のアミ
ノ酸配列を以ドの人に示す。

ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　Ｃ
ＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＴＧ
　ＣＡＣＣ０表　　１１ ＣＧＣＧ　ＧＡＡ　ＴＣＣＧＣＡ　ＧＡＣＡＣＴ　ＧＣ
Ｔ　ＧＡＧ　ＡＴＣＣＧＣＧＴＧ　ＣＣＣＧＴＧ　ＧＧ
Ｇ　ＧＣＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧＡｌａ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　［ｌｅ＾ｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａ１ＧＯ７０１１０
９０１００１１０ ＣＧＧ　ＣＴｒ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧｒｒ　ＧＧＧ　ＧＧ
ＣＴＡＣＡＧＧ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　’ｒＴＧ　ＧＴＧ　
ＡＧＴ　ＧＣＣＣＡＧ　ＡＧＴ　ＧＧＧ　ＧＣＴＡｒｇ
　　１．ａｕ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｇｌｙ　　丁ｙｒ　　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ
　　１．ｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｎ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　ＡｌａＧＴＧ　ＧＧＣＣＴ
ＣＴＣＣＧＡＧ　ＣＴｒ　ＴＣＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣ
ＣＣＣＣＡＧＴ　ＴＣＧ　ＧＣＣＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ５゛末端で
開始するＳＰ５９クローン中に約９７３ヌクレオチド全
てが配列されている。転写配向従って適当な読取り枠は
ヌクレオチド配列中制限酵素認識配列をＣｈｅＹ−３Ｐ
５９組換えプラスミドの制限酵素マツピンクによって予
測される非対称位置と関係づけることによって明白に推
定することができる。ＳＰ５４の配列は、ヌクレオチド
２７７で始まり、ヌクレオチド９５７で終わり、これは
アミノ酸残基９３〜２２８を含む。

クローンＳＰ５４及びＳＰ５９に対するヌクレオチド配
列及び得られたアミノ酸配列を以下の表に小し、ＳＰ５
４配列はヌクレオチド２７７で始まり、ヌクレオチド９
５７で終わり、これは、アミノ酸残基９３〜２２８を含
む。

１［１２０３０４０５０ ＣＣＧＴ　　ＣＣＧ　　ＣＣＴ　　ＧＣＴ　　ＧＣＣＴ
ＣＣＣＴＣＣＣＴ　　ＧＣＴ　ＧＧＧ　　１’ＧＣＣＧ
Ｔ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＣＴＡｒｇＰ
ｒｏ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　１．ｅｕ　Ｐｒ
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ｒ　Ｓｅｒ　ＡｌａＧＡＧ　ＧＧＣＴＧＴ　ＴＧＧ　Ｃ
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ｌｕＧｌｙＣｙｓ’ｒｒｐ１．ｅｕｌｌｅＡＳＩ）Ｃｙ
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５０　　　　　　　１６０ＡＡＣＡＧＡ　ＣＧＣＡＡＡ
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Ｇ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＣＣＴＡ　ＴｒＣＧＣＡ　Ｇ
ＴＣ＾ｓｎ　Ａｒｇ＾ｒｇＬｙｓ　Ｍ＋ルＧｌｎ　Ｌｃ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｌ’ｈｅ　Ａｌｎ　ＶａｔＧＧＴ　
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ＣＣＣＧＧＣＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＧ
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Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓ
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ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴｒ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　Ｔ
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ｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ９Ｇ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０Ｇ３３Ｇ　　　　　
　　　：１４０　　　　　　　　３５０　　　　　　　
３６０　　　　　　　　：１７ＧＡＣＴ　Ｇ’ｒＧ　Ｇ
ＴＧ　ＧＴＧ　ＣＧＧ　ＣＴｒ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＴＴ
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Ｇ　ＧＴＧ　Ａｔ；ＴＴｌ＋ｒＶｎｌＶａｌＶａｌＡｒ
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ＰｒｏＶｎｌＬｅｕＶ（１１ＳｅｒＧＣＣＣＡＧ　ＡＧ
Ｔ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＧＣＣＴＣＴＣＣＧＡ
Ｇ　ＣＴｒ　ＴＣＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＣＣＣＣＡＧ
Ｔ　ＴＣＧ＾１ａ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｖ
ａｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　５ｅｒ
４４０　　　　　　　４５０　　　　　　　４６０　　
　　　　　４７０　　　　　　　４８ＧＧＣＣ，ＧＡＡ
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ＣＣＧＡＧ　　ＧＧＴ　ＣＴＧ＾１ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ
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　　　　　５３０ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＣ
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Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐ
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Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＭｅＬ　Ｇｌｙ５４０　　　
　　　　５５Ｇ　　　　　　　　　５６０　　　　　　
　５７［１５１１０５９０ＣＴＣＡＴｌｌｉ　ＧＧＧ　
ＧＣＣＣＣＣＧＴＣＣＣＧ　ｍ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＧＴ
Ａ　ＡＴＣＣＧＧ　ＧＣＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　
ＧＧＣｌ、ｃｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖ
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　　　＋９０＾ＣＣＴＡＣＴＣＴ　　ＣＴＧ　　＾６＾
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ＣＴＧＧ　ＧＣＣＣＣＴ　ＴＣＡ　　ＧＡＴ　ＧＧＣＡ
ＣＴ”Ｔｂｒ　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ
　Ｔｙｒ　　＾Ｂｐ　　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　
Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　＾４．
ｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ２Ｇ０　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２１Ｇ６５０　　　　　　
　６６０　　　　　　　６７０　　　　　　　　　ｆｉ
ｌｌｏ　　　　　　　　６９０　　　　　　　７００Ｃ
＾＾ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣＣＡＣＧＴ
Ｇ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＴＣＣＴＧＡ　ＡＣＧ　ＴＧＣＧ
ＧＣＧＧＧ　ＣＣＧ　ＴＴＧＧｌｎ　Ｐｈｅ　１．ｅｕ
　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　１ｌｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ
　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　　。

７１０　　　　　　　７２０　　　　　　　７３０　　
　　　　　７４０　　　　　　　７ｆＪ＾＾Ｇ　ＧＣＣ
ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　Ｇ
ＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＣＡ
Ｇ　ＣＡＧ　ＣＴＣＡＧＧ７６０　　　　　　　７７０
　　　　　　　７８０　　　　　　　７９０　　　　　
　　１１０ＧＧＧＣＴＡＧ　Ａ’ｆＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ
　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴ
ＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＡ　ＡＣＡＵｎ　　　　　
　　ｌ１２ａ　　　　　　　　ｇ３０　　　　　　１１
４０　　　　　　３！ｉ０　　　　　　　　＋１６１１
ＣＴＡ　ＡＧＧ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　［；ＧＡ　ＧＧＣＣ
ＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧ　ＣＧＧ　Ａ（ｉＣＧＡＡ　Ｇ
ＧＴ　ＡＧＡ　ＧＡＣＡＧＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＴＡＴ　
ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＧＣＴＡＣＣＧＡ　ＡＧＣＴＧＴ　
ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＧＣＣＧＣＣＴＡＡ　ＡＧＣｍ　ＡＣ
Ｔ　ＡＡＣ！１２０　　　　　　９３０　　　　　　９
４０　　　　　　　９ＦＩ０　　　　　　９１ｉ０　　
　　　　９７０ｒＡＧ　ＡＧＧ　ＣＣＣＧＡＡ　ＧＴＧ
　ＣＴＴ　’ｒＧＴ　ＧＧＧ　ＡＡＣＣ＾ＡＣ’ｎ゛゛
口′＾ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　Ｇ’ｒＣＡＡＡ　ＡＡ
Ａ　ＡＡＡ１−１をクローンヌクレオチド配列及び得ら
れたＨ型免疫原アミノ酸配置／１１は代表的なりローン
ＳＯ３１１−２９によって例示される、実施例９参！Ｉ
／（。転写配向従って適当な読取り枠は、ヌクレオチド
配列中の制限認工配列を制限酵素マツピングにより予測
される非対称位置と関係付けることによって明白に推定
することができる。ヌクレオチド配列及び得られた２３
８アミノ酸配列を以下の表に示す。

表−−１旦 ’ｔＴ　ｍ　ＴＡＡ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＣＡＴＣＡ
ＡＣＡＧＴ　ＴｒＣＴＣＡ　ＴＣＣＡＴｒ　Ｔｌ了ＡＴ
ｒ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＣＣＣＡＧＴ　ＡＣＣ５ｏ　　　
　　　　　７０　　　　　　　８０　　　　　　　　９
Ｇ　　　　　　’１００　　　　　　１１０ＣＴＣＡＣ
Ｇ　　ＣＡＴ　ＣＴｒ　ＣＡＴ　ｍ　ＣＡＣＣＡＡ　１
丁ＣＧＣＧ　ＡＡ＾　ＡＴＣＴＡＣＧＧＣＣＡＧ　　Ｇ
ＡＧ　ＧＡＧ　　ＡＣＴ　ｍＭａｔ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　
Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＧＣＡ　ＡＧ
Ｇ　ＡＧＣｍ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＣＴＧＴ　ＴＣＴ　
ＧＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡ　ＧＴｒ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　
ＧＴＡ　ＡＧＣＣＴＧ＾１ｎ＾ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　
Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｃ
ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌｅ　Ａｌｎ　Ｖａ
ｌ　Ｓｃｒ　Ｌｃｕ１８０　　　　　　　１９０　　　
　　　　２００　　　　　　　２１０　　　　　　２２
０　　　　　　２：１０ＧＣＣＡＣＡ　ＧＧＧ　ＣＴＣ
ＣＴＧ　ＴｒＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧ　ＴＧＣＧＡ
ＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　
ＣＡＣ＾１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　
　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　
　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　Ｓ
ｅｒ　　Ｇｌｕ　丁ｒｐ　　１ｌｉｓ２４０　　　　　
　２５０　　　　　　２Ｇ０　　　　　　２７０　　　
　　　２１１０ＡＴｒ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　１ｌｉｃＡ　
ＡＴｒ　ＣＴＧ　ＴＧＣＧＧＧ　ＴＣＴ　ＣＴｒ　ＧＣ
Ｇ　ＧＣＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡＣＩＴＣＧＣＣＡＣＧ
　ＡＡＡＨＩ！Ｖａｌ　Ａｓｎ＾ｌａ　ＩＩｓ　Ｌｃｕ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ＾Ｉｎ　Ａｌａ　Ａ
ｌａ　Ａｌａ　１ｌｉｓ　Ｐｈｅ＾Ｉａ　Ｔｈｒ　Ｌｙ
ｓ４１ｉ０　　　　　　４７０　　　　　　　４８０　
　　　　　４９０　　　　　　５００　　　　　　　５
１０ＡＴＣＴｌ１ｉＣＧＣＧ　ＧＡＩ；　ＴＣＴ　ＴＣ
Ａ　ＣＣＣＡＴＧ　ＴｒＣＴＴＣＧＣＧ　ＡＴＣＴＣＣ
ＴＴＧ　ＴＣＣＧＴＧ＾ＴＧ　ＴｒＧ　ＧＣＴｌｌｅ　
Ｃｙｓ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅ
ｔ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ＾ｌａ　ｌｉｅ　Ｓｃｒ　Ｌｅｕ　
Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｌ２９０　　　　
　　　３００　　　　　　３１０　　　　　　　：１２
０　　　　　　　　：ｌ：１０　　　　　　３４０ＧＴ
ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＧＣ
Ｔ　ＧＧＡ　ＴｒＣＡＧＡ　ＧＴＡ　ＴＡＣＡＡＧ　Ｇ
ＣＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＡＴＧＶａｌ＾ｓｎ　Ｉ
’ｒｏ　Ａｒｇ＾Ｉａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ＾ｌａ　Ｇｌｙ
　Ｐｌ＋ｅ　ＡｒｇＶａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｙｇ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＭｅｔＧＡＡ　ＧＣＣＧＣＡ
　ＧＣＴ　ＣＴｒ　ＧＴＣＴｒＣＧＴＡ　ＧＴｒ　ＧＧ
ＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＧＣ
ＴＡＴ　ＴＣＴＧｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅ
ｕ　Ｖａｔ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ｍａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ
　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　
Ｔｙｒ　５ｅｒ１５０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１１ｉｎ：１５０　　　　　　　３１ｉ
０　　　　　　３７０　　　　　　３８０　　　　　　
　３！１０　　　　　　４００ＣＧＣＧＡＧ　ＣＴＣＡ
ＴＧ　ＡＧＣＧＡＡ　ＧＧＴ　ＣＴＣＣＴＣＴＣＣＧＣ
Ｔ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧ
　ＧＴＣＧＣＣ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｓａ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｃｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ＾ｌａ　
Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖ
ａｌ　Ａｌ１１５８０　　　　　　５９０　　　　　　
　６００　　　　　　６１０　　　　　　１ｉ２０ＣＴ
ｒ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＣＧＣ
ＣＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＴＣＣＡＧＡ　ＧＴ
ＣＡＧＧ　ＧＡＣＡ’ｒＡ　ＧＣＴＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｌ
ｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ｌ１ｉｓ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｕ　Ｍａｔ　Ｌｅｕ　１．ｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖ
ａｌ　Ａｒｇ　ＡＳＩＩ　［１ｅ　Ａｌａ４１０　　　
　　　　４２０　　　　　　　４：１０　　　　　　４
４０　　　　　　　４５０ＴＧＣＣＣＧ　ＧＣＡｃ口°
ＣＴｒ　ＣＴＣＴｒＣＴＧＧ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＣＧＣ
ＧＧＡ　ｍ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＧＴＧ
　ＧＧＡＣｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌ
ａｕ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ
　Ｇｌｙｌｌｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１２０６３０　　　　　１ｉ４０　
　　　　　６５０１ｉ６Ｇ　　　　　　６７０　　　　
　６８ＧＴＣＣＧＡＣＴＧＧ　ＡＧＣＡＧＧ　ＡＡＴ　
ＧＧＣＴＡＴ　ＣＡＴ　ＴＡＣＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＧＣ
ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＧＴＣＡＴＣＳｅｒ
　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　
Ｔｙｒ　ｌ１ｉｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　１ｉｅＣＣ
Ａ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＡＴＡ
　ＣＡＣＴＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＧＡＡ＾ＴＣＣＴＧ　Ｃ
ＡＣＣＧＴ　ＣＴＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧＰｒｏ　Ｔｈｒ　
Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｉｌ＠１ｌｉｓ　Ｓ
ｉｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　１ｌ
ｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ２（ＩＱ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
１０ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＡＴＧ
　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＴＣＣＴＡＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＧＧ
ＣＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　ＴＡＣＣＴＣＧｌ
ｎ＾「ｇ　ｒ’ｒｏ＾ｒｇ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　
Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＦを免
疫原のＦ型クローンヌクレオチド配列は代表的なりロー
ン８０２１６によって例示される。実施例９参照、各末
端に８個のリンカ−ヌクレオチドを含む約４８７ヌクレ
オチドを配列している。配列を以下の表に示す。

Ｃ丁ＣＣＧＣ丁ＡＡ　　ＡＴＣＡＧＡ　　ＣＧＴ　　Ｃ
ＣＡ　　ＣＣＧ　　ＴＧＡ　ＴＧＴ　Ｇｌｌ；Ａ　　Ｔ
ＡＡ　　ＡＣＴ　ｎｃ　ＴＡＴ　　ＡＣＡ　　ＧＡＣＴ
ＡＴ　ＡＣＴＬｃｕ＾ｒｇ　−−− ８５０δ７０ ＣＴＧ　　ＡＡＡ　Ｇ（Ｔ　ＡＡ丁ＣＧＴ　ｍ　ＡＡＡ
人−１４ Ｆを １６のヌクレオチド ト°型クローンヌクレオチド配列及び得られたＦ型免疫
原アミノ酸配列は代表的なりローンＳＯ２１ｆ３−２に
よって例示される、実施例９参照。

読取り枠は、ｃＤＮＡ内に非対称に位置する制限酵素部
位の位置をヌクレオチド配列分析によって予測される通
り各々の認識配列の位置と関係付けることにより明白に
推定することができるにのクローン中に５６０ヌクレオ
チド全てが配列されている。ヌクレオチド配列及び得ら
れた５３アミノ酸配列を以下の表に示す。

４８１　　ＣＧ八Ａ’ｌＴＣ 表　　１５ Ｆ　、　　　　　＋６−２のヌクレオチド　　　び推定
アミノ１１１　　　　　　　２１１　　　　　　　　：
１０　　　　　　　４０　　　　　　　５ｆｌＴＴ　’
ｍ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＴｒ　ＡＣＴ
　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＣＧＧ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　
ＧＴＣＴＣＧ　ＣＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＴｒＡ１’ｈ
ｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｌ＋ｒ　ｌｉｅ　Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ
　Ｖａｌ　ＳＩ！ｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＧ
Ｏ７０８０９１１１００１１＋１ ＡＧＣＧＡＡＣＧＧＡＣＴＧＡ’ｒ’ｎ’ＧＧＡＡＡＴ
ＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣ’Ｉ’ＧＣＧＣＡＡＡＣＧＡＡＴ
ＧＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　’ｒ
ｈｒ＾ｓｐ　１．ｅｕ　Ｇｌｕ　ＩＩＣＧｌｙ　Ｓｅｒ
　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ＾Ｉａ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ２０　　　　　　　１：１０　　
　　　　　１４（１１５０１ＧＯ１７０ｈ’ｒＣＬ：Ｃ
ＡＡＡＧＣＧＧ’ｒＡＣＣＧＣＧＡ’ｒＧＧＡＴＣＡＧ
ＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＧＡ
ＴＡＧＧＩＩ！　Ｐｒｏ　１．ｙｓ　Ａｒｇ’ｒｙｒ　
ＡｒｇＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓ１！ｒ＾Ｉａ　ＡｒｇＬｙｓ
　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＩδ０　　　　　　　１’１
０　　　　　　　２００　　　　　　　２１０　　　　
　　　２２０　　　　　　　２］０ＡＧＣ’ｒＧＡ　Ｔ
ＧＣＣＧＡ　ＡＧＴ　ＣＣＧ　ＣＡＣＡＧＣＡ’ｒＧ　
ＡＴＣＴＡＴ　ＧＴＣＴＣＡ　ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ
　ＡＧＴ　ＴＡＧ　ＣＴＡＣＴＧ　　ＡＧＧ　ＣＣＡ　
　ＣＡＣＴＧ丁ＧＣＧ　ＴＣＡ　　ＣＴＧ　ＡＡＣＣＧ
Ｔ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＴＡ
Ａ　　ＣＴＴ　ＧＡＡ　　ＡＣＣ２９０３００３１０３
２（１：１３０　　　　　　　：１４０ＧＴｒ　ＴＴＣ
ＣＧＧ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＣＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣ
Ａ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＴＡＣＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　
ＴＧＣＴ口’　ＡＧＴ　ＴＧＴ３５０　　　　　　　　
’ＩＧＱ　　　　　　　３？Ｑ　　　　　　　３８０　
　　　　　　３！ＩＱ　　　　　　　４００＾ＧＴＴＣ
Ｔ丁ＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＴＡＣＧＧＣＡＴ
ＡＧＴＣＧＡＴｆｌ；ＣＴＡＧＧＧＡＡＡＣＧ＾＾ＣＡ
ＡＧＡＧらＧＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＧＡＣＴＣＧＴ
ＣＧＡＴＧＴＣ＾ＧＣＡＴＧＧ＾＾ＧＣＣＡＧＣＡＧＣ
ＣＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＧ　ＴＣＡ　ＡＧＧ　ＣＡ
Ａ　ＣＧＡ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＴＡ　ＡＡＧ　ＣＴＴ
　ＣＡＡ　’ｒＧＧ　ＣＧＣＴＧＴ　ＣＴＴ　１’Ｇに
　’ｒＧＡ　ＣＴＴ　ＴＣＧ５２０　　　　　　　５３
０　　　　　　　５４０　　　　　　　　Ｓ５Ｇ　　　
　　　　　５６０ＡＧＡ　ＴＣＣＡＧＧ　ＡＧＧ　ＴＣ
Ｔ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＣＧＣＴＧＡ　ＣＧＧ　
ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧＣＴＦ型クローンＳＯ２１
６−２はクローン５０２１６と比較した場合５゛末端に
更に７ヌクレオチドを含んでいろ。ヌクレオチド８で始
まるクローン５０２１６及び５０２１６−２のヌクレオ
チド配列は８０２１６−２のヌクレオチド２４２まで完
全に一致しており、両クローンは同じアミノ酸配列を予
測する。クローンＳＯ２１６−２はヌクレオチド２４２
で始まりそしてヌクレオチド３２３まで続くクローン５
０２１６に見い出されない別の配列を含んでいる６ 免疫原Δ、Ｂ、Ｃ及び１１に特異的なｍＲＮＡによって
生じた試験管内−次翻訳生産物の分子量を定！７ｔ　Ｌ
、た。胞子ＪＦニ成されないオオシスト、胞子形成オオ
シスト及びスポロゾイトから抽出されたｍ　ｒ（Ｎ　Ａ
の試験管内翻訳はウサギ網状赤血球細胞を含まない翻訳
系を使用し、結合）目示同位元素として３″Ｓ−メチオ
ニン或はＪＩＩ−ロイシンを用いて行なった。特異的試
験管内翻訳生産物は実施例〔ｊで記載した通り調製した
単一特異性抗体を使用して化１ａ沈澱させた。試験管内
翻訳に対するプロトコールはプロメガバイオチック（製
造者の指導による）の技術報告に記載される通りであり
、免疫沈澱に対するプロトコールはティラー等、　Ｍｏ
ｌ口ｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　　第１Ｏ
巻、３０５−３１８頁（１９８３年）の通りである。単
一特ｎ性抗体によって認識されたＡ型−次翻訳生産物は
、分子量２４キロドルトン（ＫＤ）を有する。クローン
ＳＯ７からの優位量のＢ型免疫原は分子量２８ＫＤを有
し、一方力量の免疫原は分子ｆｉ１７０゜２４．２２．
１６及びｌ　２ＫＤを有する。史に力量の特異的に免疫
沈殿可能な試験管内翻訳生産物は、３Ｈ−ロイシンを標
識前駆体アミノ酸として使用した場合、検出することが
できた。また１　７０ＫＤと２２ＫＤ（７）劣ｆｉｌ（
７）免疫原も”ｓ−メチオニンで検出することができた
。優位量の２８ＫＤ免疫原は、”　Ｈ−ロイシンを前駆
体アミノ酸として使用した場合のみ検出することができ
た。

Ｃ型免疫原に対する分子量は測定されなかった。

クローン５０３１１−２９又は８０３１１からの優位量
のＨ型免疫原は分子１２８ＫＤを有し、方、力量の免疫
原は分子量４８．３８．３３．１６．１３、Ｉ２、ｌ　
ＯＫ　Ｉ）を有する。更に力量の特異的に免疫沈澱可能
な試験管内翻訳生産物はＪ５メチオニンを標識前駆体ア
ミノ酸として使用した場合に検出することができた。優
位量の２８ＫＤ免疫原は３５−メチオニン及び３Ｈ−ロ
イシンの両方を使用した場合に検出することができた。

実施例５のＥ、テネラの非胞子形成及び胞子形成オオシ
スト及び／又はスポロゾイトから抽出された特異的ｍＲ
ＮＡはマニアチス等、モレキュラクローニング、ラボラ
トリ−、マニュアル。

コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドス
プリングハーバ−、ニューヨーク２０２頁［１９８２年
）の方法によるノザンプロット法ｆＮｏｒＬｈｅｒｎ　
ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）及びＳｃｈ　ｌ　ｅ　ｉ
　ｃｈｅｖ及び５ｃｈｕｅ１１社　１６〜１９頁（’１
９８７年）によって発表されたトランスファ　アンド　
イムノビリゼーション　才ブ　ヌクレイツク　アシッズ
トゥ　Ｓ＆Ｓソリッド　サポートに記載された方法によ
って分類した一Ａ’４クローン５０６７に相補的なｍＲ
ＮＡは２．１５±０．１３キロベース（ｋｂ）であり、
Ｂ型クローンＳＯ７には１．２３±０．２２ｋｂであり
、Ｃ型クローンＳＰ５４及びＳＰ５９には１．１２±０
．０８ｋｂであり、そしてＨ型クローンＳＯ３１１又は
ＳＯ３１１−２９には０．９８±０．０７ｋｂであった
。

またＥ、テネラ免疫原の分子量及び等電点を測定した０
分子量は、Ｅ、テネラの胞子形成オオシスト及び／又は
スポロゾイトから調製した試ｌ）の分析用ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）した後実施例６で記載した通りニトロセル
ロースに移し、そして実施例６で記載した通りのウェス
ターンブロッティングによる免疫検出によって定量した
。

等電点は、上述した試料の２次元ゲルのウェスターンブ
ロッティングにより測定した０次元ゲルはＯ’Ｆａｒｒ
ｅ１１．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第２５０巻、
４００７〜４０２１頁（１９７５年）の操作によって行
なった０両方の操作に対する抗体は、実施例２及び６で
述べた通り調製した。結果を以下天妖のＥ、テネラ 原の 凰及び等　占 パリ クローン ＫＤｌ Δ ＳＯ６ＳＯ６７ ３，６５ ５、１−６，３ ２２，１９，１８，１４゜ １２、　９．　６ ＳＰ５４．’　　ＳＰ５９ ｎ、　ｄ。

Ｉ１ ＳＯ３１１ ２８、１８ ６，６５ ２７、２４，２３，１７ １４、１２，９ ｒ： １、ｄ。

優勢なり免疫原は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に２７〜２８Ｋ
Ｄの拡散二重線として特徴を表わし、劣勢な免疫原は、
Ｅ、テネラ内の抗原決定基が分割していると思われる弱
いバンドとして現われる。

２７〜２８の二重線はｐＨ５，１〜６．３の範囲で等電
集束により多重スポットを生じる。更にウェスターンプ
ロ・ンティングにより検出された微弱バンドのｐＩは測
定されなかった。

支巖盟工１ 組換え体由来Ｅ、テネラ免疫原によるＩＥ　、テネラで
の攻　に対する防　誘発 ブロイラー用ひな鶏にミョウバンに吸引させたリン酸塩
緩衝食塩水中実施例１３で得た特Ｗ的組換え体融合免疫
原ＩＯμｇを含む試料、最終濃度０．４％を１羽当りｌ
投与債につき全ｆｆ１Ｏ，１２ｍ１２で生後２．９．１
６日目に筋肉的経路により３回免疫した。免疫原−ミョ
ウバン複合体はウニイル、ハンドブットオプイクスベリ
メンタルイムノロジー、ブラックウェルサイエンティフ
ィックバブリケーションズロンドン　Ａ３１１ＮＩ（１
！１７８年）の操作により調製した。実験用及び対昭用
の鶏を、最終免疫の７日後の２３日目に、生後二３０口
に非免疫対称に少なくとも２．５の平均病変スコアを生
じるのに十分な量を５〜３０Ｘ１０３の胞子形成すオシ
ストの経口接種で攻撃した６攻撃の７日後鶏を殺し、盲
腸の病変の重篤度をジョンソン及びレイド、Ｅｘｐ、　
ＰａｒａｓｉＬｏ１第２８巻３０〜３６頁（１９７０年
）の方法により決定した０代表例の結果を表１７〜２１
に示す６ 表　　１７ Ａ　！！ｌ１４免疫原ＳＯ６７−ＣｈｅＹを用いたコク
シジウム症に鶏の対する防御 攻撃投与量　　　　　免疫　　　　　非免疫ｉ　Ｘ　１
Ｏ−３）　　　　感染　　　　　感染衣−−し旦 Ｂ型免疫原ＳＯ７−（Ｊ＋ｅＹを用いたコクシジウム症
に対する鶏の 攻撃投与量 （ｘｌＯ−３１ 免疫 感染 非免疫 感染 １．４！ １．２８ １．３４ ３．０口 ３゜４３ ３．３８ 表　　１９ Ｃ’ｌ免疫原ＳＰ５４−ＣｂｅＹを用いたコクシジウム
症にする　の 攻撃投与量 （ＸＩＯ−３１ 免疫 感染 非免疫 感染 ２．１８ １．７８ ３．４１ ３．５７ ３．４４ ・ １．７１ １．６８ １．９３ ３．３８ ３．０１＋ ３．２２ 表　　２０ １１３＋ｊ免疫原ＳＯ：１ｌＩ−ＣＩ＋ｅＹを用いたコ
クシジウム症にする鶏の防 攻撃投与量 （ｘｌＯ−３１ 免疫 感染 非免疫 感染 ２、口３ ２．００ ２．９７ ３．３２ これらの結果は、組換え体Ｅ、テネラ免疫原Ａ、Ｂ、Ｃ
，Ｈ及びＦが生後２日の鶏をコクシジウム症に対して免
疫にするために使用することができることを示す、３回
の筋肉内接種は、標準的ビルレント感染後免疫鶏に重篤
な病変が現われないことによって示されるように疾病に
対して高レベルの防御を与える。

表　　２１ １？　Ｉｆｆ免疫原ＳＯ２１６−ＣｂｅＹを用いたコク
シジウム症に対する鶏の　１卸 攻撃投与量 （ｘ　１０−”１ 免疫 感染 非免疫 感染 １．５０ １．３０ １．２５ ２．１６ ２．７２ ２．８９ ０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭ
ＳＦ）を含むリン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＩ３Ｓ）２
０ｍ、ｇ中Ｅ、テネラのｌＸｌ０’胞子形成オオシスト
の懸濁液をプランリン　ソニック　パワー化のソニフィ
ア　セル　デイスラブター３５０（デユーティサイクル
３０％出力コントロール４）を使用する２、５分破裂で
合計１０分間水浴中で超計波処理した。超音波処理物を
４℃で３０分間２７，０００ｘｇで遠心分離した。ペレ
ットを４０ｍ１２ＰＢＳ１０．１ｍＭ　　ＰＭＳＦで３
回洗浄し、上述の通り遠心分離して回収した。洗浄した
ペレットを６０ｒｒ＋１２の５Ｍグアニジン−ＨＣｇ７
０．５　Ｍ　＋−リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，６及びジチオ
スレイトール４００　ｍｇに再懸濁させた。

２０°Ｃで３時間緩かに撹拌しながら還元を進行させて
おいた。不溶性破片を上述の通り遠心分離で除去した。

還元及び可溶化Ｂ抗原を含む上澄み液を限外濾過（ウル
トラフィルターＰ　Ｍ　−１０，アミコン社）によって
２０ｍ　ｇに濃縮し、ヨード酢酸（４００ｍｇ　）を加
えた。３Ｍトリス塩基を加えてｐＨ８，６に再調節し、
２０℃で６０分間暗所でカルボキシメヂル化を進行させ
てた０次いで反応混合液を０．０５Ｍ　ＮＩｌ、１ＩＣ
０３１０，１ｍＭ　　ＰＭＳＦｌｏ、０２％アジ化ナト
リウムに対して４８時間透析した。グアニジン−Ｉｌｌ
を除去していくらかの不溶性物質が生成し、その後上述
の通り遠心分離により除去した。

次いで透明な上澄み液を上述の通り限外濾過により１２
ｍ　Ｑまで濃縮した。次いで濃縮物を０．０５ＭＮ１１
．ＩＩＧＯｌ、　０．１％ツイッタージェント（Ｚｗｉ
ｔＬｅｒｇｅｎｔｌ　　３−１２　（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ）　、　０．０２％アジ化ナトリウムで平衡させた
七フアクリル１ｓｅｐｈａｃｒｙｌｌ　、　Ｓ−２００
の定寸のカラム（８７×２．５ｃｍ）に適用した。流速
２５ｍ１２／時間で合計１２０ｘ４．５ｍｇ画分を集め
た。流出液画分を２８０ｎｍでモニターし、Ｂ免疫原の
溶離を始めにウサギ抗スポロゾイト抗血清次にＳＯ７／
ＣｈｅＹタンパク質に対するウサギ抗血清を使用するウ
ェスターンプロッティングによりモニターした。Ｂ抗原
を含む両分（４７〜５７）をプールし、１０ｍ１に濃縮
し、再びカラムに適用した。カラムを溶離し、前述のよ
うにモニターした。プールした両分を約０．５ｍｇタン
パク質／　ｍ　１２を含む容量に濃縮した。全収量は５
．８ｍｇであった。

ＳＯＳゲル分析は、３０ＫＤ±３ＫＤの単一の均質に純
粋なタンパク質であり、ウェスターンプロット分析によ
りウサギ抗スポロゾイト抗血清及びウサギ抗−８０７−
ＣｈｅＹの両方と反応性であった。

Ｅ、テネラから精製したＢ抗原の本試料の免疫原性活性
を実施例１５に記載した通り測定した。

生後２日のブロイラー用ひな鶏をミョウバンに吸収させ
た精製した天然Ｂ免疫原ＩＯμｇを含む試料（最終濃度
０４％）で２．９及び１６日目に筋肉内経路により３回
免疫した。免疫原−ミョウバン複合体をウニイル、ハン
ドブック　才ブ　イクスペリメンタル　イムノロジー、
ブラックウェル　サイエンティフィック　バブリケーシ
ョン。

ロンドン、Ａ３−１１頁（１９７８年）の操作により調
製した。実験用及び対照用鶏を最終免疫の７日後の２３
日目に、５〜１５ｘｌＯ’胞子形成オオシストの経口接
種で攻撃した。攻撃７日後、鶏を殺し、盲腸の病変の重
篤度をジョンソン及びレイド、Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓｉ
ｔｏ１第２８巻、３０〜３６頁（１９７０年）の方法に
従って決定した。結果は８羽群に対する平均盲腸病変ス
コアとして表わし、以下の表に示す。

表　　２２ 天然Ｂ型免疫原を用いた鶏のコクシジウム症にする チャレンジ投与量　　　免疫　　　　非免疫ｆＸ１０−
”ｌ　　　　　感染　　　　感染５　　　　　　　　　
　　１．３６　　　　　　　　３．４１１０　　　　　
　　　　　　　１．６４　　　　　　　　３．５７１５
　　　　　　　　　　　１．５４　　　　　　　　３．
４４Ｅ、テネラ由来のＢ型免疫原を精製する別の方法は
５０７−ＣｈｅＹタンパク質に対する抗体を使用するア
フィニティークロマトグラフィによる。この目的のため
に２本の親和性カラムを調製し、１本はＳ　Ｏ７−Ｃｈ
　ｅ　Ｙ抗原で免疫する前に除去したウサギの血清（プ
レブリードカラム）（ｐｒｅｂｌｅｅｄ　ｃｏｌｕｍｎ
ｌ　を使用し、１本は実施例２で記載した免疫法を用い
て・ＳＯ７−ＣｈｅＹ抗原で免疫にした同じウサギから
の抗血清を使用した。

５０７−ＣｈｅＹ免疫原を実施例１３で記載した通り調
製した。免疫グロブリンＩｇＧ分画を（コ−ティア−等
、ジエー　イムツル　メト）（Ｃｏｒｔｈｉｅｒ　ｅＬ
　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｌＪ＋！ｔ、ｌ第
６６巻、７５〜７９ｆｉ　＋１９８４年）の方法を使用
して各１［１１清４ｒｒ＋ｊ２から調製した。各カラム
に対してＩｇＧ１５ｍｇをシュネイダート等、ジェー　
パイオルケム（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔ　ａｔ　ａｌ、　
Ｊ、口ｉｏ１．　（：ｈｅ＋ｍ、ｌ第２５７６．１０７
６６〜１０７６９頁（１９８２年）の方法を使用してセ
ファロ−スープロチインＡ（シグマ）０．５ｇに結合し
た。カップリング会１１率は７５〜９５％であった。イ
ムノアフィニディー精製については、０．１Ｍホウ酸塩
緩衝液、ｐｔ＋８．１．０．５Ｍ　　ＮａＣｆｆ、００
２％ＮａＮ　、、０　、　１　ｍ　Ｍ　　Ｐ　Ｍ　Ｓ　
Ｆにおいて上述した通り調製した（ゲル濾過による精製
は用いない）瓜元カルボキシメチル化抽出成約５　ｍ　
ｇを同じ緩衝液で平衡させたブレブリードカラムに適用
した。カラムをカラム緩衝液３ｍＱで洗浄し１次いで合
わせたカラム流動液と洗液を同じ緩衝液でｉ四！ｉさせ
た。抗−ＳＯ７／　Ｃｈ　ｅ　Ｙに適用した。

カラムをカラム緩衝液１０　ｍ　Ｑで洗浄した後３ＭＮ
ａ５ＣＮで？８１ｉ＋１シた。溶出液を０．０５ＭＮ１
１４１１ＧＯ，に対して４８時間透析した後凍結した。

合計的５０μｇの蛋白質を最終溶出液中に回収した。

このＥ、テネラ由来親和性精製Ｂ抗原の免疫原性活性を
実施例１５に記載した通り試験した。生後２日のブロイ
ラーひな鶏にミョウバンに吸収させたイムノアフィニテ
ィー精製Ｂ型免疫原約０．３μｇを含む試料（最終１度
０．４％）を２．呵］及び１６日目に筋肉内経路により
３回免疫した。免疫原−ミョウバン複合体をウニイル　
ハンドブック　オブ　イクスベリメンタル　イムノロジ
−ブラックウェル　サイエンティフィック　パブリケー
ション（１ｌａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎＬａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　　［ｌｌａｃ
ｋｗｅｌＬ　　　５ｃｉｅｎし１ｆｉｅ　　　ｌ’ｕｂ
ｌｉｅａｔｉｏｎｓ　ｌロンドンＡ３−１１頁（１９７
８年）の操作によって調製した。実験用及び対照用を最
終免疫の７日後の２３日目に１Ｏ−３０ｘｌＯ３胞子形
成嚢胞体の経口投与でチャレンジした。チャレンジ７日
後、鶏を殺し、盲腸の病変の重篤度をジョンソン及びレ
イドｆ、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ｄｌ、エクス
ボ、バラシトール（Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ）第
２８巻。

３０〜３６αの方法により決定した。結果を８羽１１￥
に対するモ均盲腸病変スコアとして表わし、以下の表に
示す。

表　　２３ 天然）］　ｊｌＪ免疫原を用いた鶏のコクシジウム症に
対する チャレンジ投与量　　　免疫　　　　非免疫ｌｘ　１０
−”）　＊胞体　　　感染　　　　感染Ｉｌｌ　　　　
　　　　　　　　　１．４１　　　　　　　　３．００
２０　　　　　　　　　　　　１．４４　　　　　　　
　３．４３：１０　　　　　　　　　　　　１．５！ｌ
　　　　　　　　　：１．：＋８Ｆｉｐ々のＥ、テネラ
免疫原についてのＤＮＡを含む発現ベクターｐ　Ｊ　Ｃ
２６４の試料はアメリカンタイプ　力ルチュア　コレク
ション（ＡＴＣＣ）１２３０＋　　バークラウン　ドラ
イブ　ロックビル、マリ−ランド（Ｐａｒｋｌａｗｎ　
Ｄｒｉｖｅ、　ｌ１ｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）　２０８５２アメリ力合衆国のブタ
ペスト条約のもとに宿主大腸菌がＪＭ８３又はＪＭ１０
９として寄託されている。１９８７年１１月４日にクロ
ーンＳＯ７、ＳＯ６，ＳＰ５４及び５０３１１を含む発
現ベクターの試料を寄託し、各々受託番号６７５７７．
６７５５９．６７５５６及び６７５５８が示された。１
９８７年１２月１９日にクローンＳＰ５９を含む発現ベ
クターの試料を寄託し、受託番号６７５９４が示された
。１９８８年１月８日にクローン８０２１６を含む発現
ベクターの試料を寄託し、受託番号６７６００が示され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡ群りローンの制限地図である。 第２図は８群クローンの制限地図である。 第３図は０群クローンの制限地図である。 第４図は８群クローンの制限地図である。 第５図はＦＤクローンの制限地図である。 第６図はｐｓｃ　ｌ　Ｎプラスミドの図である。 第７図はＣｈｅＹ−ＡＮＦＮプラスミドｐＪＣ２６４プ
ラスミドへの変換について図示している。 第８図はｐＪＣ２６４プラスミドの制限地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クローンＳＯ６、ＳＰ１又はＳＯ６７からなる群か
   ら選択されるアイメリアテネラのＡ型免疫原をコードす
   るヌクレオチド配列の全部又は一部に実質的に相当する
   ヌクレオチド配列を包含している組換え体ＤＮＡ分子。 ２、クローンＳＰ５４又はＳＰ５９からなる群から選択
   されるアイメリアテネラのＣ型免疫原をコードするヌク
   レオチド配列の全部又は一部に実質的に相当するヌクレ
   オチド配列を包含している組換え体ＤＮＡ分子。 ３、クローンＳＯ２１６又はＳＯ２１６−２からなる群
   から選択されるアイメリアテネラのＦ型免疫原をコード
   するヌクレオチド配列の全部又は一部に実質的に相当す
   るヌクレオチド配列を包含している組換え体ＤＮＡ分子
   。 ４、Ｈ型免疫原をコードするヌクレオチド配列の全部又
   は一部に実質的に相当するヌクレオチド配列を包含して
   いる組換え体ＤＮＡ分子。 ５、ＤＮＡ配列が第２ＤＮＡヌクレオチド配列によって
   直線に続き実際に付加されて融合ＤＮＡ分子が生じる請
   求項１〜４記載のいずれかの組換え体ＤＮＡ。 ６、ＤＮＡ配列がＣｈｅＹタンパク質及びリンキングヌ
   クレオチドの生成物を発現する請求項５記載の第２ＤＮ
   Ａ配列。 ７、ＤＮＡ配列が宿主細胞に組込まれる場合免疫原ＤＮ
   Ａの全部又は一部を発現することができる発現ベクター
   に含まれる請求項１〜６記載のいずれかの組換え分子。 ８、クローンＳＯ６、ＳＰ１、ＳＯ６７、ＳＰ５４、Ｓ
   Ｐ５９、ＳＯ２１６、ＳＯ２１６−２又はＳＯ３１１−
   ２９からなる群から選択されるＤＮＡ分子によって発現
   されるアミノ酸配列を包含している組み換え体アイメリ
   アテネラタンパク質免疫原及びそのミクロ不均質又はサ
   ブユニット免疫原形態。 ９、免疫原タンパク質が第２アミノ酸配列によって直線
   に続き、実際に付加されて融合タンパク質が生じる請求
   項第８記載の組換え体タンパク質免疫原及びそのミクロ
   不均質又はサブユニット免疫原形態。 １０、少なくとも以下のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を包含しているＡ型アイメリアテネラタンパク質免疫原
   及びそのミクロ不均質又はサブユニット免疫原形態。 １１、少なくとも以下のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を包含しているＡ型アイメリアテネラタンパク質免疫原
   及びそのミクロ不均質又はサブユニット免疫原形態。 １２、少なくとも以下のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を包含しているＣ型アイメリアテネラタンパク質免疫原
   及びそのミクロ不均質又はサブユニット免疫原形態。 １３、少なくとも以下のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を包含しているＦ型アイメリアテネラタンパク質免疫原
   及びそのミクロ不均質又はサブユニット免疫原形態。 １４、少なくとも以下のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 を包含しているＨ型アイメリアテネラタンパク質免疫原
   及びそのミクロ不均質又はサブユニット免疫原形態。 １５、タンパク質が第２アミノ酸配列によって直線に続
   き実際に付加されて融合タンパク質が生じる請求項１０
   〜１４記載のいずれかのアイメリアテネラタンパク質免
   疫原及びそのミクロ不均質又はサブユニット免疫原形態
   。 １６、ａ、タンパク質をコードするＤＮＡ分子を得、 ｂ、ＤＮＡ分子を適当な発現ベクターに挿入し、 ｃ、発現ベクターを適当な宿主細胞に組込み、 ｄ、ＤＮＡを発現させタンパク質を産生させる条件下で
   発現ベクターを有する宿主細胞を増殖させ、 ｅ、タンパク質を回収する 請求項８又は９記載のいずれかのタンパク質免疫原の製
   造方法。 １７、ａ、プロテアーゼインヒビターの存在下、アイメ
   リアテネラ胞子形成オオシストを破壊し、 ｂ、破壊されたアイメリアテネラ胞子形成オオシストを
   還元剤と接触させ、 ｃ、還元された可溶化胞子形成オオシスト物質をカルボ
   キシメチル化し、 ｄ、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって
   タンパク質免疫原を単独で回収する請求項１０〜１４記
   載のいずれかのタンパク質免疫原の製造方法。 １８、生理学的に使用し得る媒質中請求項８〜１５記載
   のいずれかの免疫原の免疫学的有効量を包含しているア
   イメリアテネラ免疫原組成物。 １９、生理学的に使用し得る媒質中請求項８〜１５記載
   のいずれかの免疫原又はＢ型免疫原の１種以上の免疫学
   的有効量を包含しているアイメリアテネラ免疫原組成物
   。 ２０、請求項８〜１５記載のいずれかの免疫原組成物の
   免疫学的に有効な服用量を投与することを特徴とするア
   イメリアテネラ誘発コクシジウム症に対して家禽を免疫
   する方法。２１、請求項８〜１５記載のいずれかのタン
   パク質免疫原と反応する単一特異性抗体。