JPH025872A - 新規化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃ　ｉ
４１ｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｉ＋５−ｉｓ）　　　ノテ
ルターｘントト’ｒシン活性部分の新規突然変異体を提
供する。またこの発明は、先端を切り取り、または完全
な鎖長を有するデルタ−エンドトキシンの形のバチルス
・チューリンゲンシス・エンドトキシン様活性を産生ず
るのに有効な突然変異株を提供する。またこの発明は、
バチルス・チューリンゲンシス・デルタ−エンドトキシ
ンの殺虫活性を、高める突然変異を提供する。

［従来の技術］ バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ、ｔ、）は成長の増
殖期末期に蛋白質結晶デルタ−エンドトキシン（δ−エ
ンドトキシン）を産生ずる胞子形成細菌である。このδ
−エンドトキシンはある種の昆虫に摂取されると、摂餌
の停止、消化器障害、脱水などを起こし、結局光に至ら
しめる毒性効果を生じる。−最にδ−エンド１−キシン
は、プラスミド伝達源から１３００００〜１４００００
ダルトンの分子量を有する不活性前駆物質もしくはプロ
トキシン形態として産生されるしカラブリース、カナジ
アン・リサーチｌし・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃ
ａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、２６巻、（１
９８０年）、１００６頁］０通常、腸−の蛋白分解酵素
作用の結果、その（：末端のおよそ半分および多分その
Ｎ末端の数個のアミノ酸を除去する蛋白質分解ｆ１・用
によるＩＪｊ＠が昆虫の腸で起こり、この分解作用が（
Ｊ　５　（ｌ　ＯＯ〜７０　（ｌ　ＯＯダルトンの分子
量をｈ゛する活性トキシンを産生ずるのに必要である［
タイトルら、ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ
、　ＢａｅｔＬ−Ｉ−ｉｕｌｏｇｙ）、　１４５巻（１
９８１年）、１０５２１頁ｊ。

多数のＢ、ｔ、亜種が同定されている。これらの大部分
は鱗翅目（ＬｅｐｉｄｏｐＬｅ＋−ａ）昆虫類に−１【
り特異的なもしくは増大した毒性を示すが、限られた数
の池の分類に属する昆虫に対しても毒性が証明されてい
る３例えばＢ、ｔ、イスラエレンシス（Ｒ，ｔ。

１ｓｒａｅｌｃｎｓｉｓ）は双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）
幼虫類（蚊およびツユ）に対して毒性を示し、また最近
はがの二つの亜種が鞘翅目（ＣｏｌｅｏＩ辻ピ１−ａ）
幼虫類に対して毒性を示すことが確かめられた［ホフテ
ら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａ
ｃｉ＋Ｊ。

Ｒｔ・ｓ、）、１５巻、（１７）、（１９８７年）、７
１８３頁」。

短縮したトキシンおよびこれらと暗号化している構造遺
伝子の生産のために多数の研究がなされているが、エン
ドトキシン配列の活性部分または毒性部分内の点突然変
異に対するＢ、ｔ、δ−エンドトキシンの抵抗能および
そのような突然変異のトキシン分子活性に対する効果に
関してはまだ匠かしか知られていないようである。

［発明の記載］ この発明の目的は、Ｂ、ｔ、δ−エントドキシ〉゛活性
部分の新規突然変異体を提供することにある。

この発明のもう一つの目的は、先端を切り取った、およ
び完全な鎖長を持ったδ−エンドトキシン形態の双方の
Ｂ、ｔ、エンドトキシン様活性を産生ずるのに有効な突
然変異を起こすことにある。

この発明のもう一つの目的は、Ｂ、ｔ、δ−工〉・トド
キシン構造の殺虫活性を高める突然変異な提供すること
にある。

この発明において１発明者らは、鱗翅目に対して殺虫活
性を有する代表的なり　ｔ、エンドトキシン活性部分の
大きい断片を暗号化している多数のＤＮＡ鎖において単
一点突然変異および多重突然変異を無作為に起こしたの
ち、野生型Ｂ、ｔ、δ−エンドトキシンが本来有する鱗
翅目に対する特徴的な殺虫活性を示した数挿のＢ、ｔ、
δ−エンドトキシン突然変異体を組換え技術によって単
離し、生産した。またこれらの発見された点突然変異に
際して、活性エントド什ン蛋白質を生産するために他の
任意の天然アミノ酸を暗号化したコドンで置き換え得る
ことが判明した。また多数の任意突然変異が一層高水準
の殺虫活性を生じることが判明した。

そのような活性は、例えば後述するオオクバコガの幼虫
［ベリオシス・ヴイレッセンス（ｌｌｅｉｏｔｈｉｓｖ
ｉｒｅｓｃｅｎｓ）　］による検定あるいは１〜リコプ
ルシア二［（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）、イラ
クサキンウワバ］による検定により証明でき、多くの場
合、この活性増大は少なくとも元のエンドトキシン蛋白
質も２ないし数倍の活性に達することにより極めてｍ著
であった。また多重突然変異（通常、１変異ＤＮＡ鎖当
たり２または３個のアミノ酸）も個々に、およびさまざ
まに組み合わせて評価し、−層有効な突然変異おびその
組み合わせの幾つかを確認した。またこの発明の突然変
異は、一つの例外を除き、多数の野生型Ｂ、ｔ、δ−エ
ンドトキシン間に高度に保存されているアミノ酸配列断
片内に存在することが判明し、したがってそのように保
存されている領域が殺虫性Ｂ、ｔ、エンドトキシンを提
供するような、この発明の提供する突然変異をさまざま
なエンドトキシン構造に広く適用し得ることが明白とな
った。

より詳細に表Ａのアミノ酸配列およびその番号表示［後
出、位置番号１のメチオニン（Ｍ　Ｅ　Ｔ　）で始まり
代表的な鱗翅目活性エンドトキシンの正常Ｎ末端までを
示す〕を説明すれば、他の点では。

天然ｎ、ｔ・エンピト什ンのように鱗翅目昆虫類に対し
て殺虫活性を示す　　Ｂ、ｔ、エンドトキシン蛋白質で
は、１１６個のアミノｌＩ′！２残基配列において、９
０の位置から２０５の位置まで（アミノ酸位置で示せば
＋ｎ−１からｍ−１１６まで）に示された１１６個のア
ミノ酸残基配列に対して、表Ａに示されるアミノ酸残基
配列と同一または実質的相同性を有するアミノ酸残基配
列を活性部分内に含んでおれば、ここに示しまたはそれ
と同等の相同位置に１またはそれ以上の下記のアミノ酸
残基を有してもよい（括弧内のｍ番号は１１６アミノＰ
ｉ残基配列を表ず）：（ａ）９４の位置（１１６アミノ
酸配列のｍ−５の位置）にＡｓｎ以外の任意の天然アミ
ノ酸を暗号化した遺伝コード、（ｂ）９５の位Ｃ（１１
６アミノ配列列のｍ−６の位置）にＧｉｎ以外の任意の
天然アミノ酸を暗号化した遺伝コード、（Ｃ）１０’ｌ
の位置（１１６アミノ酸配列のｍ−１２の位置）にＧｌ
ｕ以外の任意の天然アミノ酸を暗号化した遺伝コード、
（ｄ）１０５の位Ｔ！（１１６残基配列のｍ−１６の位
置）にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ酸を暗号化した遺
伝コード、（ｅ）１１６の位置（１１６残基配列のｍ−
２７の位置）にＧｌｕ以外の任意の天然アミノ酸を暗号
化した遺伝コード、（ｆ）１１９の位置（１１６残基配
列のｍ−３０の位置）にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
酸を暗号化した遺伝コード、（ｇ）１２２の位置（１１
６残基配列のｍ−３３の位置）にＴｈｒ以外の任意の天
然アミノ酸を暗号化した遺伝コード、（ｈ）１２３の位
！（１１６残基配列のｍ−３４）の位置にＡｓｎ以外の
任意の天然アミノ酸を暗号化した遺伝コード、（ｉ）１
２５の位！　（’１１６残基配列のｍ−３６の位置）に
Ａ！ａ以外の任意の天然アミノ酸を暗号化した遺伝コー
ド、（ｊ）１３０の位置（１１６残基配列のｍ−４１の
位置）にＭｅｔ以外の任意の天然アミノ酸を暗号化した
遺伝コード、（ｋ　）　１８４　ｉの位置（１１６残基
配列のｍ−９５の位置）にＰｈｅ以外の任意の天然アミ
ノ酸を暗号化した遺伝コード、（１）１８７の位置（１
１６残基配列のｍ−９８の位置）にＡｌａ以外の任意の
天然アミノ酸を暗号化した遺伝コード、（ｍ）１８８の
位置（１１６残基配列のｍ−９９の位置）にＴｈｒ以外
の任意の天然アミノ酸を暗号化した遺伝コード、（ｎ）
１９４の位置（１１６′！１基配列のｍ−１０５の位置
）にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ酸を暗号化した遺伝
コード、（ｏ）２０１の位置（１１６残基配列のｍ−１
１２の位置）にａｎｙ以外の任意の天然アミノ酸を暗号
化した遺伝コード。

さらに表Ａに示したアミノ酸残基配列の番号に基づき　
　　再度説明を加えれば、この発明はアミノ酸位置の４
のアミノ酸Ａｓｎを任意の他の天然アミノ酸を暗号化し
ている遺伝コードによって変えることを含む。

この発明によって提供した１１６残基配列内のアミノ酸
残基に関し、この発明では、表Ａに掲げた全成熟配列（
即ちその１１６残基配列）について、さらに　　　　　
　　　示された位置で下記の１またはそれ以上のアミノ
酸によって特徴付けられることが好ましい：（ａ）９４
の位置（１１６残基配列の５の位置）にしｙｓ、（ｂ）
９５の位！（１１６残基配列の６の位置）にＬｙｓ、（
Ｃ）１０１の位置（１１６残基配列の１２の位置）にＬ
ｙｓ、（ｄ）１０５の位置（１１６残基配列の１６の位
置）にＴｙｒ、（ｅ）１１６の位置（１１６残基配列の
２７の位置）にＬｙｓまたはＡｒｇ、−層好ましくはＡ
ｒｇ、（ｆ）１１９の位置（１１６残基配列の３０の位
置）にＴｈｒ（ｇ）１２２の位置（１１６残基配列の３
３の位置）にＩ　ｌ　ｅ、（ｈ）１２３の位置（１１６
残基配列の３４の位Ｗ）にＴｙｒ、（ｉ）１２５の位置
（１１６残基配列の３６の位置）にＶａｌ、（ｊ＞１３
０の位置（１１６残基配列の４１の位置）にＩｌｅ、（
ｋ）１８４の位置（１１６残基配列の９５の位１）にＩ
ｌｅ、（１）１８７の位置（１１６残基配列の９８の位
Ｔ！、）にＴｈｒ、（ｍ）１８８の位！（１１６残基配
列の９９の位置）に５ｅｒｕｎ）１９４の位Ｗ（１１６
残基配列の１０５の位置）にＬｙｓ、および（ｏ）２０
１の位置（１１６残基配列の１１２の位置）にＡｓｐ０
４の位置のアミノ１Ａｓｎを変更する場合は、Ｔｙ＋−
に変えることが好ましい。

本明細書の末尾近くに掲げた表Ａは天然Ｂ、ｔ。

δ−エンドトキシン生産物に関連するヌクレオチド配列
およびそれから推論されるアミノ酸配列を示したもので
ある。一つの例外を除き、このヌクレオチド配列はＢ、
ｔ、ウハネンシス（Ｂ、　ｔ、　ｗｕｈａｎｅｎｓｉｓ
）で発見されたδ−エンドトキシン産生プラスミドから
得られた。特に完全な構造遺伝子（実際にエンドトキシ
ンそのものを暗号化した）はＢ。

ｔ、ウハネンシスから由来し、一つの例外は、構造遺伝
子の始まるメチオニン（Ｍｅｔ）に先行する配列がＢ、
ｔ、クルスタキ（Ｂ、　ｔ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ　）　
ＨＤ−１（所謂ＨＤ−１の５．３　Ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄｕ
１級プラスミド）で発見されたエンドトキシン産生遺伝
子に由来したもので、そのような上流配列にはＢ、ｔ、
クルスタキエンドトキシンＨＤ−１産生プラスミド由来
の天然リポソーム結合部位（ＲＢＳ）を含んでいる。Ｂ
、ｔ、ウハネンシスに見られるような天然リポソーム結
合部位を含んだ上流配列は表Ａに示したＢ、ｔ、クルス
タキのものとは少し異なり、その差異については本明細
書の後段に示す、然し対象とするＢ、ｔ、ウハネンシス
およびＢ、ｔ、クルスタキＨＤ−１ｔ１４造遺伝子のヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列は、エンドトキシン
配列の最初からその活性部分全体にわたって少なくとも
表Ａで示したＫｐｎ　１部位まで何れも同一であって、
このＫｐｎ　１部位はプロトキシン部分である。したが
って昆虫による摂取後の開裂によって生成する活性トキ
シン部分はこれらＢ、ｔ、ウハネンシスおよびＢ、ｔ、
クルスタキＨＤ−１エンドトキシンの何れの場合とも同
一となる筈である０表Ａにおいて、ｔｉｌｆ　３ｎ遺伝
子発現によって生産されるエンドトキシン蛋白質のアミ
ノ酸は、アミノ酸の下段に１から１１８１までのプラス
の数字で括弧内に示した。

１−Ｍｅｔより上流の翻訳されない領域に含まれるアミ
ノ酸は逆方向、即ち上流方向へ向かって負の数字で示し
た（アミノ酸位置で数えて）、構造３ｎｌ云子中のヌク
レオチドはそれらが並んでいる列の上段に番号を付け（
括弧を付けず）、その番号に当るヌクレオチドの真上に
番号の最後の数字が並ぶように揃えて示した。リポソー
ム結合部位を含んだ翻訳されない領域のヌクレオチドは
開始ＡＴＧコドン（１−Ｍｅｔ）から逆方向へ数えてマ
イナスの数字で示した。上記の番号配列のうち、その一
部は、この発明によって提供された殆どの突然変異がそ
の部分に局在していることが判明した高度に保存されて
いる領域を一暦詳しく示すため、これらとは別にアミノ
酸に１１−１〜ｍ−１１６，アミノ酸に対応するヌクレ
オチドにｎ−１〜ｎ−３４８の副番号を付けた０表Ａの
ヌクレオチド配列に関連する二、三のｆｌ＋ｌ＋限酵素
切断部位は該制限酵素部位に含まれるヌクレオチドの上
段に線で示し。

その特別の部位については脚注を付して示した。

当該技術上認められている表Ａに示されたエントドキシ
〉′の毒性部分は、アミノ酸位置１（Ｍｅｔ）を起点と
してアミノ部位’１６１０　（Ｔｈ　ｒ　）にまたがる
アミノ酸配列を含んでいる０表Ａに示した全ＤＮＡ配列
の性質を考慮し、また以下の説明の理解を一層容易にす
るため、本明細書では表Ａの１列目の翻訳されない部分
で始まり約７２４〜７２５のアミノ酸位置にあるＫｐｎ
１部位にまたがって、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列お
よびその部分をＢ、ｔ、クルスタキＨＤ−１（５，３Ｋ
ｂ　）ＩｉｎｄＩ級の１ラスミド）から誘導したものと
して引用することができるので、そのようにする。

［図面の簡単な説明］ 第１図は、この発明に関連する穏々の段階で使用される
、Ｆｌ、ｔ、クルスタキＨＤ−１から誘導さ、れ先端を
切り取っ・たＢ、ｔ　、エンドトキシンを暗号化したＤ
ＮＡを含有し、鱗翅目に対して殺虫活性な有する混作用
型プラスミドｐ　ｒ　Ａ　Ｋおよびｐ　１−ＡＫ−３の
地図である。

第２図は、ｐ　ｒ　Ａ　Ｋを暗号化したものより若干鎖
長の長い先端を切り取ったＢ、ｔ、エンドトキシン蛋白
質を暗号化しているＤＮＡを含み、同様にＦｌ、ｔ、ク
ル、スタキＨＤ　−１がら２六導され鱗翅目に対し″Ｃ
殺虫活性を有するプラスミドｐ　Ｂ　８　ｒ　Ｉｔの地
図を示す。

第３ａ図および第３ｂ図は、所望１フコトン・スビ〉実
験を実施するなめに合成され、Ｂ、ｔ、エンドトキシン
ＤＮＡ暗号配列へ所望の突然変異を都合よく導入するの
に有用な二つの代表的な２重鎮ＤＮＡ前を示す。

第・ｔａは、Ｂ、ｔ、ウハネンシスに由来する完全鎖長
の天然エンドトキシンを暗号化したＤＮＡを含んでいる
１ラスミドｐ、　Ｂ　Ｔ　２１０の地図を示したもので
、ここでそのエントドキシ〉′はｐ　ｒ　Ａ　Ｋおよび
ｐＢ８ｒｌ＋に暗号化されているＢ、ｔ、クルスタキＨ
ｒ）−１由来のエンドトキシンと同一のアミノ酸配列を
その活性部分に有している。

第５図は、その部分断片の拡大図を併記して示したプラ
スミドｐｒＡＫ−９の省略地図であり、このｐｒＡＫ−
９はそれ以外はプラスミドｐｒＡＫ−３と細部に至るま
で同一であるが、環プラスミドの該切片およびさらに細
分した切片はコドン・スピン実験を実施し、あるいはこ
の発明によって提供される突然変異を都合よく導入する
のに有用である。

１ラスミドｐｒＡＫは、１９８８年２月１９日にアグリ
カルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ、ｔｉｏｎ）、（ＮＲＲＬ）、ペ
オリア（ｅｅｏｒｉａ）、イリノイズ（ｌｌｌｉｎｏｉ
ｓ）に寄託してエシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　
Ｊ　Ｍ　１０３に保存され、保存番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１８３２９のらとに受理された。

プラスミドｐＢ８ｒｌｌは１９８８年２月１９日にアグ
リ力ルチュラｌし・リサーチ・カルチャー・コレクショ
ン（Ｎ　ＲＲＬ　＞、ペオリア、イリノイズに寄託して
エシェリキア・コリ　ＪＭ１０３に保存され、保存番号
ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８３３１のらとに受理された。

プラスミドｐＢＴ２１０は１９８８年２月１９日にアグ
リカルチュラル ・コレクション（ＮＲＲＬ）、ベオリア、イリノイズに
寄託してエシェリキア・コリ　ＪＭ１０３に保存され、
保存番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３３０７７）もとに受理さ
れた。

本質的にこの発明の点突然変異は、バチルス・チューリ
ンゲンシス種およびその亜をによって産生されるエンド
トキシン蛋白質配列に適用でき、その配列が上記１１６
アミノ酸からなる保存配列またはそれと高度に相同ない
しは本質的に等価である配列であれば、天然の完全鎖長
型または実質的に完全鎖長である蛋白エンドトキシン配
列、および下流プロトキシンまたはその不活性部分の全
部または一部を取り除くことによって先端を切り取られ
た配列，および正常Ｃ末端上流およびエントドキシ〉活
性部分にまでさかグ）は′って切り取られた配列な含ん
でいる場合でさえ、切翅目幼虫に対し殺虫的に活性であ
る。Ｐ！１に明らかなように、Ｂ、ｔ、クルスタキおよ
び［３，ｔ　ウハネ〉゛シス由来のエンドトキシンはと
もに同一の１１６アミノ酸（”Ａ　Ｔｆ顕域を有してお
り、それ以外のものでもこれと同じ１１６アミノ酸配列
らしくはそれと極めて相同性の高い等ｇｉ物金含有、あ
るいは有していることが期待し得る９例えばＢ　ｔ、ソ
フト（Ｂ、ｔ。

ｓ＋：＋ｔｔｕ）　、　Ｂ　、　ｔ　　クルスタキ　Ｈ
Ｄ、−７３（株）およびＢ、ｔ　　ガレリアエ（Ｂ、Ｔ
、　Ｇａ１ｌｅｒｉａｅ）は、それらの幾つかでは、少
なくともある程度そして極端な例ではエントドキシ〉の
毒性部分の残りおよびグＩ７トキシ〉切片の双方を異に
している場合であっても同一の１１６アミノ酸配列を有
するエンドトキシンを産生することが既に知られている
。

Ｂ　、　ｔ、　、クルスタキ　）（Ｄ　−１ジベル（Ｄ
ｉｐｅｌ）　（商業的な亜株）のような（ｌμの株では
、上記の１１６アミノ酸配列において１アミノ酸の変化
（ｍ〜５９がＴ　Ｔ　Ｕて・暗号化されているＬｅｕ）
およびそれ以外の配列部分にその他の変化／′欠失／付
加と有している。この株およびその池の株の場合でも、
甲、−または多重変化を有していても、前記１１６アミ
ノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸相同性
を有することが知られている株では、ことに変化すべき
アミノ酸がその両側にそれぞれ１１６アミノ酸配列と一
致して対応する他のアミノ酸３２個、好ましくは４個を
′４ｆする場合、前記の１１６アミノ酸の非変異配列中
のアミノ酸と一致して対応する配列内にアミノ酸を生じ
さぜる１またはそれ以上のこの発明の突然変異体変化を
起こし９“）る。またこの発明の突然変異によって、配
列そのものが、示された１１６アミノ酸配列より短くま
たは長くなるよう主として欠失または付加を＆んだ相同
系列に、対応するアミノ酸を作成しｒ）ることか１用待
される。そのような場合、変化させるべき配列内に生じ
た欠失は実際は存在しているように数え、また変化させ
るべき配列に加えたイ４加は単に数えないようにして参
照とする１１６アミノ酸配夕＋ｌに用いた番号を維持す
る。したがつてアミノ酸配置のｈｌｍはそのような配列
にある欠失または付加とは無関係に実施されるべきであ
ると言い得る。

この発明の突然変異体変化を直換し得る相同アミノ酸配
列は、好ましくは突然変異を加えるべき相同配列が９照
とする前記１１６アミノ酸配列のアミノ酸に対応するア
ミノ酸を有し、参考配列における対応アミノ酸と同一の
コドンによって暗号（ヒされている場合、表Ａのｎ−１
の位置で始まりｎ−３４８の位置にまたがるＤＮＡのセ
ンス鎮またはアンチセンス鎖の何れかくまたは２本鎖）
を緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成させ
るＤＮＡによって暗号化された配列である。

そのような連結されたハイブリッド形成プローブの調製
方法は当業界で既知の方法である。緊縮ハイブリッド形
成の条件は、２．５Ｘ食塩水クエン酸＜５ＳＣ）ｔｙＪ
所ビｙ中で６０℃でハイブリッ）；形成を行い、生じた
ハイブリッド形成に影響を与えないように希釈した１１
度の桜街液で３７℃ですすぐことによって実施される。

好ましくは１１６アミノ酸参考配列に対して。

７′ミノ酸差異が１．２または３個を超えないアミノ配
列η１１で突Ｓノサ変異を実施し、最も好ましくは参考
配列と同一である配列で実施する。

１１６アミノ酸参考配列　　　　は、 鱗翅目幼虫に対して殺虫活性を有するエントドキシ〉蛋
白質配列を実質上修飾しまたはそれと（１シの点で異な
ったものの部分を形成し得ることは当該技術上皿に明示
されており、　参考配列外のその他の修飾についてはｊ
ｉｎかれた技術知識としてｖＯ：実に明らかにされるて
いる筈である。したがって１１６アミノ酸参考部分と類
似した必要な変異を加えた配列部分と接する配列はかな
りの程度変化させてよく、例えばオオタベコガ幼虫に対
する殺虫活性によって証明し得る殺虫活性エンドトキシ
ン蛋白質を充分に提１ルし得ることだけが必要である。

したがって突然変異を加えた部分より上流のアミノ酸配
列は、表Ａに示した配列と比べて短縮ないし伸長してよ
くあるいはそれ自体突然変異させてもよいが、ただし一
般にメチオンエンで始まり、好ましくは所望により４位
にこの発明によって提供された好ましい突然変異を含み
得ることは明らかであるが、最も好ましくは表Ａに示し
た配列と高度に相同（７０９６）または同一であること
である。同様に必要な突然変異を加えた配列部分より下
流部分は幅広く変化させ、昆虫の腸で開裂する点までの
表Ａに示したその残部　　と比べて短縮または伸長して
もよく、言うまでもなく昆虫の腸で開裂を受は殺虫活性
蛋白質トキシンを提供するプロトキシンまたは不活性部
分を形成するまでさらに伸長させ、または伸長させなく
てもよい。

この発明によって提供される突然変異体エンドトキシン
を暗号化した配列を含むＤＮＡは、好適な調節配列の制
御下にプラスミドへ導入され、細胞へ形質転換またはト
ランスフェクトされてエンドトキシンを産生する発現ベ
クターを形成する。

これに反し１例えばそのような技術で薬物を生産する組
換え生物工学技術によるエンドトキシン生産では、エン
ドトキシンｔａ製を意図した処理を殆とまたは全く含ん
でいない、エンドトキシンを生産した細胞を溶解し得る
が、これは過去にＢ、ｔ、エントドキシ 業界で既知の低温噴霧乾燥のような慣用的手段で乾燥し
た後，単に目的生産物の生産に使用した培養または発酵
系の全内容物を使用する．生産物によっては生産物安定
性を改善するため既知の種々の！ｌＩＪＩｒｌを添加し
てもよく、発酵系に充分な．Ｊｌが存在しない場合は、
これもまた既知のように例えば大豆ｎ末または脱脂大豆
粉末のような蛋白質ｖＡ物質を独立的に添加して安定性
を向上することができる。

種々の形質転換またはトランスフェクトを施した細胞系
で生物工学的にエンドトキシンを生産することができる
が，ダラム陰性またはダラム陽性何れかの型の細菌細胞
を形質転換またはトランスフェクトすることが一般に好
ましい．ダラム陰性Ｉｌ菌の好ましい一つの型は、かな
りの生物工学的経験が既に達成されており、それについ
て好適で繰作上ＩＩ！能的な多数の１ラスミドおよび伝
達発現ベクター系がよく知られ、かつ入手可能なエシェ
リキア・コリである．シュードモナス・フルオレッ七〉
・ス（ｅｓｅｕｄｏｍｏｕａｓ　ｒｌｕｏｒＩ−ｓｃｅ
ｎｓ）はエンドトキシン配列を保有しているプラスミド
を導入したグラノ、陰性細菌のもう一つの型を代表する
．既に述べたようにエンドトキシン産生遺伝子は，エシ
ェリキア・コリのような本来ｎ　ｆｌｕの［［胞への発
現のなめに導入したとき、Ｂ．ｔ．にその起源を有する
特にリボンーノ、結合部位配列のような調節配列をｆヶ
み得る．バチルスｍ細菌はこの発明の突然変異体エンド
トキシンに一層自然に近い環境を提供するので、この事
実は、特にこの発明の範囲内にあ１）、それによってこ
の発明の突然変異体エンドトキシンを暗号化したＤＮＡ
を含む発現ベクターでバチルス型細菌を形質転換または
トランスフェクトすることが期待される．特に興味深い
そのようなバチルス細胞を例示すれば，Ｂａｔ．細胞、
バチルス・セレウス（Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ）　＃Ｈ胞お
よびバチルス・ズブチリス（Ｂ．　ｓｕｌ＋ｔｉｌｔｓ
）細胞があげられる。

バチルス細胞、ことにＢ．ｔ．細胞を形質転換する著し
く改良された方法が最近発見され、現在出願中の英国特
許出願第８７２９７２６号に報告された，この１０七ス
による形質転換に好適な相思型は，プラスミドを保有し
ない既知のＢ．ｔ．クルスタキ・フライ（Ｌｔ．　ｋｕ
ｒｓｔａｋｉ　ｃｒｙ）　Ｂ細胞のようなフライ・マイ
ナス型およびエンド１ヘキシン産生１ラスミドを保有す
る天然Ｂ．ｔ．細胞のような野生型バチルス細胞である
，Ｂ．ｔＪＩＩ胞のようなバチルス細胞への導入に好適
なプラスミドとしては、例えば通常の組換え技術を用い
、または用いることによって修飾するこの発明の突然変
異体エンドトキシン暗号配列を保有するようになし得る
プラスミドｐＢｃ１６．１［クレットら、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｕｌｅｃ
．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　）、１９７８年、１６２
巻、５９頁］およびその親プラスミドが知られている。

当業界で既知のように、バチルス細胞は胞子形成期にの
みエンドトキシンの所望量を特徴的に産生するので、殺
虫剤として有用な生産物を最もよく入手するなめそのよ
うな胞子形成期へと成育される．しがってこの発明によ
って提供され，突然変１°２休エンドトキシンＤＮＡを
保有するプラスミドまたは発現ベクターは、工〉・トド
キシン産生プラスミドを欠如しているか、もしくは既に
そのようなプラスミドを１またはそれ以上含んでいる何
れのバチルス細胞へ導入してもよい、この発明の突然変
異体エンドトキシンは鱗翅目゛に対して特徴的に活性を
有するが、その他の綱の昆虫に対するエンドトキシン活
性でも突然変異前の親エントドキシ〉にそれが存在して
いるか、あるいは別の許容し得る配列変１ヒの結果獲得
させることが可能であるか、何れにせよ、胞子形成期に
一層広範囲の殺虫活性提供にエンド１−キシンを結合さ
せるため、鱗翅目に対して実質上有効でないエンドトキ
シンを暗号化したプラスミドを保有する、細胞の場合で
もこの発明の鱗翅目毒性エンドトキシン産生プラスミド
でバチルス細胞分形質転換する発明の範囲に包３される
０例えば突然変異を行ったエンドトキシン暗号化配列を
保有しているプラスミドを、鱗翅目に対して実質上側々
には有効でないＢ　ｔ。

イスラエリエンシス（Ｂ、ｔ、　１ｓｒａｅｌｉｅｎｓ
ｉｓ）またはＢ、ｔ、テネブリオニス（Ｂ、ｔ、　ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）の形質転換に使用し得る。

この発明は先端切除型および完全鎖長型天然エンドトキ
シン蛋白質について説明してきたが、上記のように突然
変異体エンドトキシンを直接殺虫剤として使用する場合
、完全鎖長配列を使用しまたは生産することが一層に好
ましく、このような完全鎖長配列は、少なくと６天然型
のエンドトキシン蛋白質の折りたたみ能力と類似した折
りたたみ能力または改善された充全鎖長折りたたみ効果
を達成する怠味で天然型と同じであるかまたはそれによ
く似せることができる。

この発明の突然変異体ＤＮＡはまたｉｒｉ物ゲノムへ挿
入することができる。そのような場合、完全鎖長配列も
好適であるが先端切除型の突然変異配列を使用するのが
好ましい、エンドトキシン配列を宿主植物ゲノムへ挿入
するには任意の好適な方法を都合よく使用でき、例えば
アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅ＋−ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ−ｅｎｓ）のＴｉ
プラスミドを介し、エレクトロポレーション、エレクト
ロ）・ラン′スフォーメーション、マイクロインジェク
ション、ウィルス・トランスフェクションまたは遊離Ｄ
　Ｎ　Ａの取り込みを誘導しまたは増大させる化学物質
の使用等のような方法を採用し得る。そのような方法お
よび植物の形質転換におけるそのような使用は、この技
術に熟練した専門家の周知していることである。好まし
くは突然変異体エンドトキシンを暗号化したＤＮＡ配列
は、１直物中で１戊能してその全部を発現型ベクターノ
＼挿入し得る、例えばオペレーターおよび３−調節配列
のような好適な調節配列と結合させる。そのような植物
細胞の形質転換をした後、＋Ｊ胞増殖念全植物へ再生さ
せることにより、有糸分スおよび減数分裂を経て突然変
異体エンドトキシンＤＮＡを一世代から次の世代へ伝え
、発現によって昆虫毒性蛋白質を生じ、ＶＬ物に遺伝的
昆虫抵抗性を付与し得るような植物ゲノムの安定で永続
的な部分とすることができる。

突然変異のためのＢ、ｔ、δ−エンドトキシン配列の供
給源として、またＢ、ｔ、エンドＩ・キシン突然変異体
を生産および評価するための担体を提供するため、この
発明の研究では二つの極めて類似したベクター（ｐｒＡ
ＫおよびｐｒＡＫ−３）を使用した。プラスミドｐｒＡ
ＫおよびｐｒＡＫ−３について、第１図にｐ　ｒ　Ａ　
Ｋに関連する細部を図示し、ｐｒＡＫ−３に存在してい
る（’Ａかな変異を示した。プラスミドｐｒＡＫおよび
ｐｒＡ、に−３は、基本的にはエシェリキア・コリに対
する完全コンピテント発現ベクターであり、これらはそ
れぞれアンピシリン耐性遺伝子、エシェリキア・コツプ
ロモーターを含んだ複製およびオペレーター配列の起源
を有している。第１図に濃い太線および四角い枠をもっ
て示したように、ベクターｐ　１−ＡＫは、プロモータ
ーと好適なリーディング・フレーム協調に野生型Ｂ、ｔ
　、クルスタキ株ＨＤ−１で見出されるＤＮＡ配列を含
んでいる。濃い太線部分は、表Ａのアミノ部位Ｈ１（Ｍ
ｅｔ＞から６１０のＩｊｌＨ（Ｔ　ｈ　ｒ　）にまたが
り、さらにアミノ酸７２３（Ｌｅｕ）で終わる１０トキ
シン部分にまで伸長した先端を切り取った天然型Ｂ、ｔ
　　δ−エントドキシ〉′を暗号化するために短縮した
成熟配列を表している。第１図の太線部分の下流末端に
太線で囲んだ四角い枠で示した小部分は７２３−Ｌｅｕ
を暗号化したトリプル塩基対に続き、それ自体直ちに停
止信号につながる５４塩基対からなる短いＤＮＡ配列を
表す、全長５７塩基対（停止信号を含み）からなるこの
配列は、ρｒ　Ａ　Ｋの組立てに使用した周知のプラス
ミドｐＢＲ３２２をその起源としている。したがって発
現ベクター１）　Ｉ−Ａ　Ｋは、天然プロトキシン部分
の６１０個のアミノ酸とｐＢＲ３２２に由来する１８個
のアミノ酸からなる、本質的に合計７４１個のアミノ酸
を有する先端を切り取ったＢ、ｔ、δ−エンド１−キシ
〉′融合蛋白質を暗号化し、これ分エシェリキア・コリ
に生産する。この先端を切り収ったＢ、ｔ。

エンドトキシン融合蛋白質は高い殺虫活性水２（１を有
し、この発明の朔究で生産したその突然変異体を評価す
る目的に使用した。この活性は活性１〜キシ〉・（表Ａ
の１から６１０までのアミン１１１Ｆ）の６１０個のア
ミノ酸だけを含んだ完全に先端を切り取ったＢ、ｔ、δ
−エンドトキシン蛋白質から未質的に区別し得なかった
。

先端を切り取ったＢ、ｔ　、エンドトキシン融合蛋白質
を暗号化した配列の大部分を表している濃い太線部分は
、第１図のその上流末端で、Ｂ、ｔ、リポソーム結合部
位（ＲＢ　Ｓ　）を含んだ配列を表す塗りつぶした四角
い囲みと連結される。ＲＢＳを含んだこの部分（表Ａの
１列目および２列目）は。

Ｂａｎ　Ｈ１部位（この部分をエシェリキア・コリのプ
ロモータ一部分（第１図、矢印で示す）と連結するため
先行プラスミドに挿入）で始まるその上流末端起点の前
方に約４７個のヌクレオチドを有する。プロモーターお
よびＲ８３部分はエンドトキシン暗号化配列と好適なリ
ーディングフレーム協調に配列され、連結している。し
たがって濃い太線部分および二つの囲みはともにＢ、ｔ
、クルスタキＨＤ−１に起源を有するＤＮＡを表してい
る。

第１図に示したその他の多数の制限酵素部位は突然変異
実験のため、通常のＤＮＡ切片の除去および再挿入を行
うためのストラテジーに関連するものである。これらそ
の他の制限酵素部位はＮｓｉ宜部位（エンドトキシン暗
号配列起点から約２６ヌクレオチドだけ後方から始まる
）、２個のＸｂａ１部位（後出、ただしｐｒＡＫ−３に
関連）、Ｓｓｔ　１部位およびＨｉｎｄｌ１部位である
。

先に示したようにｐｒＡＫ−３は、ただ１ケ所のごく僅
かの点だけでｐｒＡＫと異なっている。

この違いは、ｔ！Ａａｔ的な手技を用いて表Ａの２９２
〜２９７のヌクレオチド位置でＸｂａ　１部位（ＴＣ”
！’　ＡＧＡ）’：ＴＣＧ　ＣＧＡに変えたもので、そ
れによってＮｒｕ１部位を規定している。暗号化したア
ミノ酸配列には、この変化から何ら変化を生じない、ｐ
ｒＡＫ−３の生産については実施ＰＡｌの段階（ａ）で
報告する。またρｒＡＫ−３は他のプラスミドｐｒＡＫ
−７およびｐｒＡＫ−９を生産する際の最初の中間体で
ある。

通常の方法、例えばクレイク［バイオテクニックス（１
１ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１月／２月号（１９８
５年）、１２〜１９頁、［ユーズ・オブ・オリゴヌクレ
オタイズ・フォア・サイト−スペシフィック・ムタゲネ
シス（Ｕｓｅ　ｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ　ｆｏｒＳｉｔｅ−３ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）］に報告されたような方法で突然変異させ
たｐｒＡＫおよびｐ　ｒ　Ａ　Ｋ−３からの異なった鎖
長の一本鎖ＤＮＡ切片（センス鎖およびアンチセンス鎖
の双方を含む）から誘導されたＤＮＡ切片を、便宜上、
Ｍ−１およびＭ−２として示し、Ｍ−１はｐｒＡＫの２
個のＸｂａ１部位間の３７５塩基対切片、Ｍ−２はρｒ
ＡＫ−３のＢａ…Ｈ＋およびＸｂａ　１部位間の切片と
定義する（第１図参照）。

２つのＸｂａ　１部位間に見られるこの発明の突然変異
は、本明りｌ書に開示されたプラスミドｐｒＡＫ−７、
ｐ　ｒ　Ａ　Ｋ−８またはｐｒＡＫ−９および実施例２
に記載した方法と同様にして組立てた合成２本鎖オリゴ
ヌクレオチドを使用して容易に得ることができる。

突然変異のあと、変異した１本鎖部分を通常の手段によ
って２本鎖とする０Ｍ−１変異体の場合はｐｒＡＫを突
然変異伝播体として使用し、生じた２本鎖変異体プラス
ミドをエシェリキア・コリ、ＪＭ］０３’＼導入し、５
０μｇ／ｍｌのアンビシリ〉を３有するＹＴ寒天に接種
して一夜インキュベー１・し、突然変異以外はｐ　ｒＡ
Ｋと同じである多数の異なった突然変異をプラスミドに
有する複数のコロニー群を得た。

Ｍ−２突然変異の場合は、突然変異伝播体のＢ）ｍ旧お
よびＸＬ＋ａ　１部位の間の突然変異した２本鎖領域を
Ｂ）ｍ１目およびＸｌ）ａ’ｌ制限エンドヌクレアーゼ
３使用してそれぞれ切断し、同じ二つの酵素で消化した
ｐｒＡＫ−３ベクターへこれをライゲーションした。生
じたＭ−２領域突然変異体を含有するｐｒＡＫ−３プラ
スミドをエシェリキアコリＪＭ１０３へ導入し、５０Ｊ
ｉｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＹＴ寒天に接種し
て一夜インキュベートシ、多数の異なった突然変異を含
んだ別の複数のコロニー群を得た。

突然変異を行ったエンドトキシン配列の活性を証明する
ための試験は、例えばエシェリキア・コリＪ　Ｍ　１０
３またはエシェリキア・コリＳＧ４０４４〔この菌はア
グリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクショ
ン（ＮＲＲＬ、）、ベオリア、イリノイズから保存番号
Ｂ−１５９６９のちとに誰でも入手し得る］に含まれて
いるＤＮＡから発現して、実施例Ａに報告したようにオ
オタバコガの幼虫（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｂｕｄｗｏｒｍ、
　Ｔ　Ｂ　Ｗ　）検定またはトリコブルシア・二［Ｔ、
ｎｉ、イラクサキンウワバ］検定の一つまたは双方を用
いて実施した。

標準の非変異体エンドトキシンよりも活性増大を示した
突然変異体のＤＮＡは、ＤＮＡおよびそれに伴なう蛋白
質配列における突然変異を決定するため突然変異関連領
域の配列を決定した。このようにしてＭ−１またはＭ−
２の何れかの突然変異切片を含んだプラスミドと有する
６０００以上の異なったコロニーを評価し、それぞれの
突然変異実験で一最に１〜３個のアミノ酸変化が起こっ
ていた。

下記の表Ｂは、突然変異実験の結果、直接回収した上位
変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔｓ）を表Ａで帰仄した位置
番号と照合して、各突然変異の起こったアミノ酸位置、
各変異体で変異したコドン、およびコドン変化の結果と
して示された位にで生じたアミノ酸変化を同定したもの
である。

表Ｂにおいて、マイナス即ち負のアミノ酸位置番号は、
　Ｂ）ｍ１ｌ　１部位およびエントドキシ〉・配列の起
点である１位のＭｅｔとの間の変化を示したもので、し
たがってそのような変化は突然変異体配列によって暗号
化されたエンドトキシン配列に影響を手えない。

表Ｂで同定した突然変異体はＴＢＷ検定のすべての３相
で検定し、次の表Ｂ−１に得られた成績を報告した。ま
たこれら各種の突然変異体をＴｎｉ検定で評価し、その
成績を次の表Ｂ−２に示した。

［表Ｂ］ 突然変異 Ｍ−１ｐ２６−３ Ｍ〜１ ４８ａ１４ ４８ｃ５ Ｍ−■ ３６ａ６５ ９５ａ７６ ｐ９５ａ８ら ９８ｃ１ １）９９Ｃ６２ ”’２　　１）＋０７Ｃ２２ １１唱−２ｐ１０７ｃ２５ Ｍ　−２ｐｌ　＋４ａ３０ アミノ酸の エンド）〜キシン領域の変化 ｎ９ ＋０１ ｎ６ ＋２５ ＋２３ ＯＣＡ−ＡＣＡ ＡＴＧ　−ＡＴＡ ＧＧＣ−ＧＡＣ ＧＡＡ　→ＡＡＡ ＧＡＧ　−ＡＡＧ ＣＧＴ→ＣＡＴ ＧＡＧ　−ＡＡＧ ＧＣＧ　−ＡＣＧ ＡＣＴ→Ａ゛口” ＧＣＡ　−ＧＴＡ Ｔ−ＴＡＴ ＡＣＴ→ＴＣＴ ＡＣＴ→ＴＣＴ Ｍ猶→ＡＣＴ ＡＡＴ　−ＴＡＴ ＡＡＴ　→ＴＡＴ ＡＡＴ　−ＡＡＡ ＡＡＣ−ＡＡＡ ｍ→Ａ゛口パ 口’Ｃｉ　−ＴＡＧ ＣＡＡ　−ＩＡＡＡ ＴＡＴ　−ＴＡＡ Ａｌａ−Ｔｈｒ 八づｅｔ　→　ｌ１ｅ Ｇ１ｙ→Ａｓｐ Ｇｌｕ→Ｌｙｓ Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ Ａｒｇ　−＊　Ｈｉｓ Ｇｌｕ→Ｌｙｓ Ａｌａ　−”　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　”　１ｌｅ Ａｌａ　−Ｖａｌ 触１１→Ｔｙｒ Ｔｌｎ−−→Ｓｅｒ η＋ｒ　−５ｅｒ Ｔｂｒ　−Ｔｌｎ− Ａｓｎ→Ｔｙｒ Ａｓｎ　−Ｔｙｒ ｋｓｎ−Ｌｙｓ 触ｎ→Ｌｙｓ Ｐｈｅ−→１ｉｅ Ｇｉｎ→Ｌｙｓ Ｆ記の表Ｂ−１のみ性欄において毒性評点の低いほど活
性水準が一層高いことを示している（実施例Ａの毒性評
価点の説明参照）、対照にはプラスミドで形質転換しな
かったエシェリキア・コリＪＭ１０３１１胞およびエシ
ェリキア・コリＳＧ４０４４ｍ胞の等量を含んでいる。

プラスミドｐ　ｒＡＫを含んだ細胞の等量によって生産
された先端を切断した天然エンドトキシンよりも、すべ
ての突然変異体が実質上高い活性を示している点が注目
される。

［人Ｂ−１３ 表Ｂに示した突然変異体 Ｉｌｌ　２６−３ １）　４８　ａ　１４ ４８ｃ５ ｐ　３　（）　ａ　６５ ｐ　９５　ａ　７６ ９５ａ８６ ）１１９８ｃ　１ ９９ｃ６２ 毒性評点（平均毒性） ２．７５ ２．２５ ２．６３ １．５０ ２．５０ １．３０ １．３３ １．８３ １）　１０７　ｃ　２２ ｐ　１　１４　ａ　３０ 対照（ＪＭ１０３細胞） ρｒ　Ａ　Ｋ 対ｆｆ１（ＳＧ４０４４４ａ胞） ［表Ｂ−２］ 表Ｂに示した突然変異体 ρ３６ａ６５ ９５ａ７６ ｐ１０７ｃ２２ ｐＨ４ａ３０ 対照（ＳＡＮ４１５） ｐ、ＢＴ３０１ １．４２ ２．００ ４．６８ ３．３５ ４．１２ 上記の表Ｂ−２においては、標準のｐＢ７３０１のＬＤ
、。を活性比１００とした（−層完全な説明は実施例Ａ
を参照）、シたがって、これよりも高い活性比の値は何
れも突然変異によって生じた毒性の増加を示している。

この発明はさらに、上記の表Ｂに示した多重突然変異を
含んだ一定の突然変異体ＤＮＡを分析し、そのような多
重変異したセグメントにおける個々の変異および対にな
った変異の効果を測定した。

標的とした多重突然変異断片を単離し、ついで断片内側
の制限酵素部位で切断することを含むストラテジーを用
いて、そのような個々の変異および対になった変異のサ
ブクローニングを実施し、突然変異した２つのコドンの
間にその位置をつきとめた。ついでその２つの半分、即
ち２つの断片セグメントをゲル単離し、それらをＰｒＡ
ｋからの同じ断片を同様に切断して得られた非突９然変
異体の相補的な半分、即ち断片セグメ〉′トとそれぞれ
混合した。ついでｐｒＡＫベクターを切断して大きい相
補的な断片を単離し、このベクターを前述の２つを混合
した相補的な半分と混合し、全部で３個のＤＮＡセグメ
ントを互いにライゲーションして１点突然変異体または
多重突然変異体クローンに由来する断片の半分に存在し
ている突然変異を含んだ修飾ｐｒＡＫアラスミドを作成
した。より詳細には、全体の突然変異体セグメント中の
突然変異の総数より少ない変異を有する断片の単離を可
能とするように、制限酵素エンドヌクレアーゼＸｈｏ　
ｌに対する部位を一定の多重突然変異セグメントの範囲
に戦略的に限定した。ただ１つの点突然変異を有する断
片および２つの突然変異を有する別の断片を得る目的の
ため１表Ｂに挙げた多数の多重突然変異セグメントにエ
ンドヌクレアーゼＸｈｏ　Ｉの使用生適用し得ることは
明白であろう。

したがって、まず多重突然変異体プラスミドを制限エン
ドヌクレアーゼＮ５ｉｌおよび５ｓｔｌで処理し、得ら
れた１４３０塩基対の断片をゲル単離によって分離した
。ついでそれぞれ１４３０ｂｐのそのような断片を制限
エンドヌクレアーゼＸ１１０　ｍで処理し、得られた３
３０ｂＰ（Ｎｓｉｌ／Ｘｈｏｌ）および１１００　ｂ　
ｐ　（Ｘｈｏｌ　／５ｓｔｌ　）の断片を各多重突然変
異体毎にゲル単離した。ついで３３０ｂｐおよび１１０
０ｂｐの片方の非突然変異体断片およびそれよりも大き
い約４ＫｂのｐｒＡＫのＮ５ｉ１　／Ｓｓｔ　ｌ断片を
同様に得た。より詳細には、太きい方のセグメントの少
）ｔを、突然変異した３３０１）　ｐの断片および非突
然変異ｐｒＡＫの１１００ｂ　ｐ断片と混りして、得ら
れた混合物をライゲーシヨンし、ｐ＋−Ａ　ｌ＜の一連
のハイブリッド突然変’Ａ　Ｉｌｋグラスミドを作成し
た。これと同様の方法でそのような大きい方のｐｌ−八
にセグメントの多忙と非突然変ｒ４１１ｒＡＫの３００
１）　Ｉ）　ＩｔＩ７片および突然変異１本の１１（１
０ｂｐＨＪｉ片と混合し、これらのＤ　ＮＡをライゲー
シヨンして別の一連のハイブリッド突然′ＪＳ：ｕ体１
ラスミドを作成した。上記のストラテジーから得られた
ハイブリッド突然変Ｖ４体）゛ラスミドまたはクローン
′体をＦ記の表Ｃにまとめた０尺Ｃは、３つのセグメン
トを結合して得られた１ラスミド中の突然変毀をプラス
ミドｐｒＡＫと比較したものである。

ｒ表Ｃ］ 新規に作 成された １）　ｒ　Ａ　Ｋ コλｚ十 ベクター セグメント および イｇ給源 賜１／　　勤■／ Ｘｌ＋ｏ［ｌ断片あ１＋断片 （分）Ｉや）の　（＋＋００ｂｐ）の 供給源　　供給源 突然変異アミノ酸 の位置 ｐｒＡＫＮｓｉｌ／　　ｐ４８ａ１４　　　ｐｒＡＫＳ
ｓｔ＋　　＜４にｂ） Ｇｌｕ−４Ｌｙｓ　（１０１） Ｇｌｕ−ｋＬｙｓ　（１１６） Ｂ　　　　　　　　　　ｐ２６−３　　　ｐｒＡＫ　　
　Ａｌａ　−＝　Ｔｈｒ　（１１９）Ｃｐ４８ｃ５　　
　ｐｒＡＫ　　　Ｇｌｕ−１Ｌｙｓ　（１１６）Ｄ　　
　　　　　　　　ｐｒＡＫ　　　ｐ４８ａ１４　　Ａｒ
ｇ−Ｈｉｓ　（２１７）ＥｐｒＡＫｐ２６−３ｈうｅｔ
−１ｉｅ（１３０）Ｇｌｙ　−Ａｓｐ　（２０＋） Ｆ　　　　　　　　　　ｐｒＡＫ　　　ｐ４８ｃ５　　
　Ａｌａ　−＝　Ｔｏｌｒ（１８７）表０のクローン作
成に適用したのと同様な方法をさらにもう一度経つ返す
２回目のハイブリッド突然変異体クローンの作成計画で
は、ｐ　ｒＡＫとＮ５ｉｌおよび５ｓｔｌで消化して得
られた巨大セグメンｌ−（およそ４Ｋｂ）、表Ｂのクロ
ーン体の一つから得られた３３０ｂρのＮｓｉ　Ｉ　／
Ｘｈｏｌｌ断片および表Ｂの別のクローンから得られた
１１００ｂＰのＸｈｏ　［１／Ｓｓｔ　Ｉ　断片からな
る３つのセグメント組合わせによって一連の混合組合わ
せ突然変異体プラスミドを作成した。この２回目の実験
がら得られたハイブリッド突然変異体クローン群を下記
の表りに示す、この２回目の計画から、親ｐｒ’ＡＫプ
ラスミドと比べて４個のアミノ酸変化を含んだ２つのプ
ラスミドを生じたことが判明した。

［表Ｄ］ 新規に１ヤ　ベクター・　　　Ｎ５ｉｌ／　　　刈υ■
／成された　セグメント　Ｘ１ｎ１１断片５ｓｔｌ断片
ｐｒＡＫ−Ｊ　ｐｒＡＫ　Ｎｓ目　ｐ４８ａ１４　　ｐ
２６−３／Ｓｓｔ　Ｉ　４Ｋｂ Ｇｌｕ−４Ｌｙｓ　（１０１） Ｇｌｕ　→Ｌｙｓ　（１１６） Ｍｅｔ　−１１ｅ　（１３０） Ｇｌｙ　→Ａｓｐ　（２０１） ｐｒＡＫ−Ｋ ｐ４８ａ１４　　ｐ４８ｃ５ Ｇｌｕ　−＋　Ｌｙｓ　（１０１） Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　（１１６） Ａｌａ　−ｐ　Ｔｈｒ　（１Ｂ７） ｐｒＡＫ−Ｌ ４８ｃ５ Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　（ｎ６） Ｍｅｔ　−１１ｅ　（１３０） Ｇｌｙ　→Ａｓｐ　（２０１） ｐｒＡＫ−Ｍ ｐ４８ａ１４　　Ａｌａ　→Ｔｈｒ　（１１９）Ａｒｇ
−４８ｉｓ　（２１７） ［表りつづき］ ｐｒＡＫ−Ｎ ｐｒＡＫ−０ ｐ＋−ＡＫ−Ｐ ｐｒＡＫ−Ｑ ｐｒＡＫ−Ｒ ｐｒＡＫ−３ ｐｌ・ＡＫ−Ｔ ｐｒＡＫ−Ｕ ｐｒＡＫ−５３ ｐｒＡＫ−６８ ３４８Ｃ５ ４８ｃ５ ４８ａ１４ ４８ｃ５ り４８ａ１４ ９９ｃ６２ ９９ｃ６２ ４８ｃ５ Ａｌａ　＝ηｌｒ　（１１９） Ａｌａ　−−Ｔｈｒ　（１８７） ４８ａ１４ ３６ａ６５ Ｇｌｕ　　−＝　　Ｌｙｓ　　（１１６）Ａｒｇ−ＩＨ
ｉｓ　（２１７） Ａｌａ−ηｌｒ　（１１９） η１１−→Ｉｌｅ　（１２２） Ａｌａ　→Ｖａｌ　（＋２５） ３６ａ６５ Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　（１１６） η１ｒ→ｌｉｅ　（＋２２＞ Ａｌａ　→Ｖａｌ　　（１２５） ３６ａ６５ Ｇｌｕ−ｐＬｙｓ　（１０１） Ｇｌｕ　　→　しｙｓ　　（ｎ６）Ｔ ｈｒ　−１１ｅ　（１２２） Ａｌａ　＝　Ｖａｌ　　（１２５） ９５ａ８６ Ａｌａ　−Ｔｈｒ　（ｎ９） Ｔｌｔｒ　−ｐ　Ｓｅｒ　（１８８） ９５ａ８６ Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　（１１６） Ｔｈｒ　−＋　Ｓｅｒ　（ｌＥ１８） ９５ａ８６ Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　（１０１） Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　（ｎ６＋ Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　（１８８） ｐ１０７ｃ２５　　Ａｓｎ−１Ｔｙｒ　（１０５）Ｐｈ
ｅ　→ｌｉｅ　（＋８４） Ａｓｎ　−Ｔｙｒ　（１０５） 恥七→Ｉｌｅ　（１３０） Ｇｌｙ−４Ａｓｐ　（２０１） ［表１〕つづき］ ｐｒＡＫ−７０ｎ ｐ２６−３　　　ｐ１０７ｃ２５　　Ａｌａ　−Ｔｈｒ
　（１１９）Ｐｈｅ　→ｌｌｅ　（１８４） １＋ｒＡＫ−３９ ＩＩ　　　　ｐ９９ｃ６２　　ｐ９８ｃｌ　　　ＡＳＩ
Ｉ　−Ｔｙｒ　（１０５）［表Ｅ］ 表（シおよびＤに示した多数のハイブリッド突然変異体
を実施例Ａのオオタバコガ幼虫（Ｔ　Ｂ　Ｗ　）検定で
評１１〜ことに表Ｂの初めの突然変異体から木質的に１
または２つの突然変異を欠失または除去した効果の比較
のため表Ｂの突然変異体クローンをこれに加えた。これ
らの毒性、即ち殺虫活性１［（西の成績を表Ｅに報告し
た０表Ｅで、（１）毒性間で毒性評点が低いほど活性水
準の増大を示しており（実施Ｐｉ４Ａの評点の説明５：
参照＞１２）対照としてはプラスミドで形質転換しなか
った３Ｍ１０３ａｌ胞および５Ｇ４０４４細胞の等量を
加え、すべてではないが殆どの突然変異体をそのような
両タイプのエシェリキア・コリ細胞で評価し、これら両
対照を参照した表の突然変異体の結果を二つの型の細胞
から発現された突然変異体の結果の平均として示してい
ることに注目すべきである。

さらにこの発明は、最初の任意ＤＮＡ突然変異によって
アミノ酸変化が起こったアミノ酸位置における一般的な
アミノ酸置き換えの可能性を証明し、それによって広く
多種にわたる新規殺虫活性Ｂ、ｔ、エンドトキシン蛋白
質を提供することを含む、この可能性は、ｉ＆初の突然
変異変化に含まれた選ばれたコドンを他の天然アミノ酸
に対するコドンへと変化させる所謂「コドン−スピン」
実験によって比較的容易に証明される。これらの新しい
突然変異体はオオタバコガ幼虫に対する殺虫活性を有す
るエンドトキシン蛋白質を発現する。そのような研究を
一層効率的に実施するため、実施例１に記載したように
本質的にｐｒＡＫから出発して、さらにｐｒＡＫ−３、
ｐｒＡＫ−４、ｐｒＡｌ（−５およびｐｒＡＫ−６の順
に逐次生産されたその他の中間体プラスミドを生産し、
プラスミドｐｒＡＫ−７に到達して一連のｐｒＡＫ型の
独自なプラスミドを生産した。第２図に示したプラスミ
ドｐＢ８ｒｌｌは、ｐ　ｒＡＫによって暗号化されてい
るエンドトキシンより若干鎖長の長い先端を切り取った
エンドトキシンを暗号化したＤＮＡを含んでおり、また
先端を切り取ったエンドトキシン構造遺伝子ＤＮＡの下
流末端に対するそのライゲーション領域で親プラスミド
に加えられた些細な修飾以外は、あらゆる点でプラスミ
ドｐ　ｒＡＫと一致しているが、第２図に示したように
この構造遺伝子は天然遺伝子中にＫｐｎ　１部位が示さ
れており、一方ｐｒＡＫではこの部位が欠失して、ｐｒ
ＡＫ構造遺伝子の末端はほぼこの部位の位置に相当する
。プラスミドｐｒＡＫ−７はプラスミドｐｒＡＫと同じ
エンドトキシンアミノ酸配列を発現するように設計され
ているが、そのＤＮＡ配列の修飾は、ｐｒＡＫ−３のＮ
ｒｕ　１部位を含むだけではな（、Ｈｉｎｄ璽＝Ｍｓｔ
ｌｌおよびＢｓ５Ｈ１１部位を含んでおり、さらに本来
ｐｒＡＫに存在していた）ｆｉｎｄ厘部位が好ましく除
かれている。実施例１に一層詳細に示したように、ｐｒ
ＡＫからｐｒＡＫ−７を生産する順序および各段階にお
ける部位の付加または欠失は、下記のように ｐｒＡＫ　　　−＋　　ｐｒＡＫ−３（Ｎｒｕｌを付加
）ｐ　ｒＡＫ−３ｐ　ｒＡＫ−４（旧ｎｄｍを付加）ｐ
　ｒ　Ａ　Ｋ−４−−ｐ　ｒ　Ａ　Ｋ−５（Ｍｓｔｎ　
Ｅ付加）ｐｒＡＫ−５−ｐｒＡＫ−６（Ｂｓｓｔ（ｌ＋
を付加）ｐｒＡＫ−６ｐｒＡＫ−７（もとの　１ｌｉｎ
ｄｌｌを欠失） としてまとめられる。

上に示した部位は、ｐｒＡＫ−７と２つの関連制限酵素
で切断した際にｐｒＡＫ−７内に生じる制限酵素部位残
基と相補的な残基を表すヌクレオチドでそれらの両末端
が終わる短い２本積Ｄ　Ｎ　Ａ断片を、ＤＮＡ自動合成
装置を使って有効に作成し得るように離して約４０塩基
対を導入する。したがってそのような断片は標準的な切
断およびライゲーション操作によって容易にｐｒＡＫ−
７内へ置き換えることができ（実施例Ｐ参照）、実施１
列２で例示したように、ｐｒＡＫ−７内でｐｒＡＫ−７
の対応する断片と置換した合成断片によって暗号化され
たアミノ酸変化以外はｐｒＡＫエンドトキシンと同じで
あるエンドトキシン蛋白質の発現が可能なプラスミドを
提供することができる。

第３Ａ図および第３Ｂ図は、ｐｒＡＫ−７内の旧口ｄ頂
／Ｍｓｔ■部分へ置換するため、上記のコドンスビンー
スｌ−ラテジーと一致させて（’Ｐ成した２つの短い２
重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ断片を示す、第３Ａ図に示した２本鎖断
片は、遺伝コードに一致させてＸＸＸコドンを好適に選
ぶことにより、ｐ　ｒＡＫプラスミドで発現させた先端
と切り取ったＢ、ｔ。エンドトキシンのアミノ酸位置１
１６に任意のアミノ酸を１ヤ成するよう設計されている
。同様に第３Ｂ図に示した２本鎖断片は、この断片にＸ
ＸＸコドンを好適に選ぶことにより、ｐｒＡＫプラスミ
ドによって先端３切り取−）たＢ、ｔ、エンド１−キシ
ンのアミノ酸位置１１９にアミノ酸と作成するよう設計
されている０以上から明らかなように、ｐｒＡＫ−７内
のＳｐｅ　Ｉ　／Ｎｒｕ　＋位置（ＤＮＡ自動合成装置
で作成可能な約１１５塩基対鎮長の断片）　、Ｎｒｕ１
／１ｉｎｄ１位万およびＭｓｔ　［１／Ｂｓ５）Ｉ　１
１位置への置換に必要なその他の２本鎖断片およびこれ
らの切片内に見出されるあらゆる突然変異点におけるす
べてのアミノ酸を暗号化するよう設計された２本鎖断片
を同様な標準的方法によって作成することが可能である
。したがってｐｒＡＫ−７のＮｒｕ＋およびＢｓ５ｌｌ
■部位の間の各突然変異点で、１９個の天然アミノ酸の
残りの１８個を変化させまたは突然変異させることは、
プラスミドｐｒＡＫ−７を使用することによって容易に
達成し得る。

１１６アミノ酸が関連する配列内で関連コドンを都合よ
くスピンエングする突然変異点をすべて網羅するには、
実施例１で記載したように、プラスミドｐｒＡ、に−７
を使用してプラスミドｐ　ｒ　ＡＫ−８を作成し、つい
で究極的にはそのｐ　ｒＡＫ８を使用してｐｒＡＫ−９
を作成してもよい、第５図は、ｐｒＡＫ−９内に究極的
に蓄積されたすべての関連制限酵素部位を、ｐｒＡＫ−
９の一部を取り出して引き伸ばした断面図で示したもの
である。また第５図に示したＳｐｅ　１部位もｐｒＡＫ
、ｐｒＡＫ３等に既有する独自の部位である。また自明
のように、プラスミドｐｒＡＫ７、ｐｒＡＫ−８および
ｐｒＡＫ−９を使用して、任意の１対の制限酵素部位間
の多重突然変異変化を導入しそして／または少なくとも
１つの変化を暗号化したＤＮＡを２またはそれ以上のそ
のような位置に１ヤ成することにより、この発明で発見
された本来の突然変異点を包含する多数の多重突然変異
の組合わせを組立てて、さまざまな新規殺虫活性Ｂ。

ｔ、エンドトキシン蛋白質を生産することができる。

また自明のように、プラスミドｐｒＡＫ７、ｐｒＡＫ−
８およびｐｒＡＫ、−９のようなプラスミドは、これら
のプラスミドに提供された制限酵素部位対の間の任意の
位置に存在する任意の１またはそれ以上のコドンを変化
させることが完全に可能なプラスミドである。１または
２つくただし３つ以下）のそのような位置で変化を所望
する場合、ｐｒＡＫ−４またはｐｒＡＫ−５のようなプ
ラスミドが所望の変化位置を包含しているならば、好ま
しくはｐ　ｒＡＫにある本来のＨｉｎｄ１部位を除去し
た後、それらのプラスミドを使用してもよく、もしその
ようなプラスミドが好適でないならば、ｐｒＡＫ−９を
作成するｐｒＡＫの修飾に使用される制限酵素部位対の
導入に対する還択を変更または限定することによって、
通常のように任意の１またはそれ以上のそのような位置
を含んだｐｒＡＫ型のプラスミドを作成してもよいこと
は自明のことである。したがってこの発明はまた。この
発明の突然変異および突然変異の組合わせの生産に有用
で、究極的にｐｒＡＫ−９内に任意の１またはそれ以上
の制限酵素部位を含んだ多数の新規プラスミドを提供す
る。

また自明のように、任意の１またはそれ以上のそのよう
な制限酵素部位対を含んだＤＮＡは、この発明の１、ま
たはそれ以上の突然変異を含んだ修飾を加える前または
後に、所望の突然変異領域外にあるＢ、ｔ　、エンドト
キシンのためのもう一つのプラスミドに対応して見出さ
れる制限酵素部位を切断することによってｐｒＡＫ型プ
ラスミドから切り出し、ついで切り出したＤＮＡ切片を
、同様に切断したそのような別のＢ、ｔ、エンドトキシ
ン・プラスミドへ挿入（ａ準的な手段によりライゲーシ
ョンする）することによって、そのような他のプラスミ
ドを都合よく修飾でき、またはこの発明の突然変異へ直
接挿入する目的を可能とする。

この発明によって提供される突然変異を完全鎖長のエン
ドトキシン暗号化配列へ挿入するには。

便宜上および随時に容易に入手可能なり、ｔ、ウハネン
シス・δ−エンドトキシンのＤＮＡ構造遺伝子を挿入し
たプラスミドを使用する。このプラスミドｐＢＴ２１０
を第４図に示す、第４図の濃い太線で示したように、プ
ラスミドｐＢＴ２１０はＢ、ｔ、ウハネンシスに由来す
る完全鎖長のエンドトキシン構造遺伝子を含んでおり、
また第１図との類推によってＢ、ｔ、ウハネンシスから
得られたＢ、ｔ　、リポソーム結合部位を含む配列を該
構造遺伝子と一緒に含んでいる（第４図の黒く塗りつぶ
した四角い囲みで示す）、第４図に示したように１ラス
ミドｐＢＴ２１０は、ｐｒＡＫプラスミドとして同じエ
シェリキア・コリ・プロモーター系、エシェリキア・コ
リの複製起源（図には示していない）およびクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を含んだ完全コンピテント・エシ
ェリキア・コリ発現ベクターである。第４図の矢印はエ
シェリキア・コリプロモーターおよびクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子の制御下のＢ、ｔ、ウハネンシス遺伝子
の読み取り方向を表す０発明者らの所有する配列情報に
基づき、完全オペロン（構造遺伝子、Ｂ。

ｔ、由来のリポソーム結合配列部分およびエシェリキア
・コリ発現プロモーター／オペレーター配列）は、プラ
スミドｐｒＡＫのオペロンと意味のない差異があるだけ
で極めてよく類似している。

ことにＢ、ｔ　、エンドトキシンの活性部分の６１０ア
ミノ酸（表Ａ）およびｐ　Ｂｒ３１０について第４図に
示した少なくともほぼＫｐｎ　１部位にまで達する１０
トキシン領域を暗号化したＤＮＡは、プラスミドｐｒＡ
Ｋの対応するＤＮＡ配列と一致している。ｐＢＴ２１０
のＢ、ｔ　、構造遺伝子のＫｐｎ１部位からその構造遺
伝子の末端に至るＤＮＡ領域下流には、ｐｒＡＫを作成
するのに先端を切り取ったＢ、ｔ、クルスタキＨＤ−１
遺伝子の対応する部分と比較して未知ではあるが、ごく
憔かな違いがある。これらの違いを制限エンドヌクレア
ーゼ地図によって示した０表Ａに示したようにプラスミ
ドｐＢＴ２１０は、完全鎖長のエンドトキシンを暗号化
しており、活性部分（少なくともｐｒＡＫクローンおよ
びｐＢ８ｒｌにおけるＢ、ｔ、クルスタキＨＤ−１から
のδ−エンドトキシンに対しそのＫｐｎ　１部位までに
対して生産されたアミノ酸まで）は完全に相同であり、
そして１０トキシン部分のバランスは実質上相同性を有
する。最後にｐＢＴ２１０のリポソーム結合部位はｐ　
ｒＡＫのそれと同一であり、リポソーム結合部位（ＲＢ
　Ｓ　）を含んで起点Ｍｅｔの１度前からＢ）ｍ８１部
位を通ってプロモータ一部分に結合している上流に伸長
したＤＮＡ全体は、ｐＢＴ２１０およびｐｒＡＫで、Ｂ
）ｍ８１部位置後にある２個のヌクレオチド変化を除い
て同じであり（ｐｒＡＫではＧＴである代わりにＣＣ）
、そのような２個のヌクレオチドの直後でｐｒＡＫで見
られる３個のヌクレオチド（Ｔ　Ｔ　Ｔ　）がｐＢｔ２
１０では欠失しており、これらの相違は単にＲ８３部分
をＢ、ｔ　、からエシェリキア・コリプロモータ一部分
へＢ）ｍ８１部位を介して結合する異なったライゲーシ
ョン・ストラテジーの結果から生じたことである。プラ
スミドｐＢ７２１０は、この発明によって提供される任
意の１またはそれ以上のアミノ酸変化？有する完全鎖長
の突然変異体Ｂ、ｔ、δ−エンドトキシン蛋白質と生産
するのに使用し得る。ｐＢＴ２１０について第４図に示
したＮ５ｉ１部位、２つのＸｂａ１部位、Ｓｓｔ　１部
位および下流に最初に現れる１（団ｄ璽部位はρｒＡＫ
について第１図に示した同じ部位と対応している（上に
示したようにこの領域における二つのプラスミドに対す
るＤＮＡは同一である）。

し実施例］ 実施例Ａ １　トリコブルシア・二（Ｔ、ｎｉ）検定試験は第２齢
幼虫で実施した。試験期間を通じて、すべての幼虫は温
度、湿度等の標準粂件下の気候室に保管し、標準的な人
工餌で飼育した。試＠物質は餌と一緒にして昆虫に与え
、試験物質の各濃度毎に２０匹の昆虫を１群として投与
した。

処置後、昆虫を７日間観察し、その期間後、昆虫のＬＤ
、。を検定した。試験対象の５０％に死亡を生じるのに
要する物質の投与量からＬ　Ｄ　ｓｏを算定できる。ｆ
＆終終結果登下記の活性比で示す。

上記の手法を用い、標準より高い活性比の値がすべて標
準より活性が高いことを示すように結果の解釈がｌ！Ｉ
革にできるＩ−Ｄ　ｓ。の絶対値を提供できる。さらに
活性比は１例えば４００である物質は１００の標鵡と比
較すると標嘔より４倍高い活性となる。

上記の試験で活性比１００を示ずｔｌはプラスミドｐｒ
３Ｔ３０１であり、このプラスミドは完全鎖長の野生型
δ−エンドトキシン配列を含んでおり、２つのエシェリ
キア・コリプロモーター（これらは何れも個々にｐＢＴ
２１０に含まれているらのと同一である）を含んでいる
以外、ｐＢＴ２１０に含まれているものと同一である。

上記の試験に使用した対照は （ａ）ＣＡＧ６２９−δ−エンドトキシン産生プラスミ
ドを含まず、それ自体殺虫活性を持たないエシェリキア
・コリ株［ＣＡ　グロス、デパートメント・オブ・バク
テリオロジ−（１）ｅｐ３１−ｊｍｅｎｔ　ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｉ（ｙ）、ユニバージティー　オブ　ラ
イスコンシン（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ）がら噌られた］。

（ｂ）ＳＡＮ　　４１５−商業的に入手可能なり。

し　殺虫剤「ジャベリン（ＪＡＶＥＬＩＮ）の商標名で
入手］。

２１）オオタバコガ幼虫検定（Ｔ　Ｂ　Ｗ検定）ＴＢＷ
検定は基本的にダルメージらが報告した方法［ジャーナ
ル・オプ・インバーチプレート・バソロジー（Ｊ、　　
Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ、　Ｐａｔｈ、）、１８巻く１９７
１年）、２４０〜２４５頁］を用い、試料毎に１オンス
の清潔なプラスチック製スフレ・コンブ３個ずつを用意
し５コツプ１個毎に第２齢のＴＢＷ幼虫（４〜５日齢、
平均ｆｆ１ｉ１．６ｇｍ＞各１匹ずつと試料とともに加
えた。試料はダルメージの記載のように［ＵＳＤＡ　テ
クニカル・ビュレティン（ＵＳＤＡ　Ｔｅｃｈｎｉ−ｃ
ａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、１４２８号、１〜５頁（１
９７６年）１．１５ｍ１の餌（栄養剤粉末、ビタミン粉
末、寒天、その他の成分を含有）と混合した。半時間放
冷したのち餌なコツプ３個に均等に分配した。各コツプ
にＴＢＷＩ匹ずつを加え（サイズ００のキャメル・ヘア
ブラシ使用〉、蓋を固く締めた。これらの試料を２７℃
、５０％の相対湿度のインキュベーター内に４〜５日間
置いた０重量範囲に対応するＴＢＷ毒性検定評価に用い
たグループ数の大きさと下表に示す。

グループ・サイズ　　重量範囲　　　平均重量１．０　
　　　　　　　１．３ １．５　　　　　　　　２．７ ２．０　　　　　　　５．５ ２．５　　　　　　　１１．７ ３．０　　　　　　　１７．３ ３．５　　　　　　　３０．８ ４．０　　　　　　　５０．１ ４．５　　　　　　　７６．６ ５．０　　　　　　１１９．９ ６．０　　　　　　　　＋、１９．８ 〜　１゜９　　　　１．６ 〜　３．１　　　　　２．８ 〜　６．３　　　　　５．８ 〜１２．３　　　　　１２．０ 〜２２．２　　　　　１９．６ 〜３４，２　　　　　３２．８ 〜５２．４　　　　　５１．１ 〜９４，３　　　　８４．８ 〜１１４．７　　　　１１．３．５ 〜１３４．３　　　　＞１４０．０ 上記の「グループ・サイズ」は、ここで報告する毒性評
点とそのまま等しい、したがって各試験後の幼虫重量を
測定し、その重量があてはまる重量範囲と対応する群に
等しい毒性評点を付ける。

以下、特に記載しない限り死亡した幼虫はすべて１グル
ープ・サイズしとて扱い、毒性評点は０とした。繰り返
したすべての結果からの毒性評点を平均し、得られた結
果をここに報告する。原則としてすべての成績は少なく
とも３０回繰り返した結果に基づいている。

ＴＢＷがそれぞれのサイズ範囲にあてはまってからコツ
プ、を開いた。これらのＴＢＷは、１匹のＴＢＷが何れ
かの重量範囲にあてはまるまで計量した。ついで与えら
れた重量範囲のＴＢＷを含んだ試料コツプに対応するグ
ループ・サイズ番号を標識した。これらのコツプを番号
の低い順から実験室の棚に並べた。ついで計量した試料
ＴＢＷと残りの試料を視覚的に比較することによって採
点し、そのグループ番号を採点表に記入した。死亡した
幼虫は「十ノで記録し、０の評点を付けた。

明るいピンク色または液化したように見える死亡幼虫は
δ−工ントドキシンと無関係の原因で死亡したことが疑
われる。これらの幼虫は′”１を付けて採点し、成績に
は加えなかった。

ｐ　ｒ　Ａ　Ｋ培Ｗ　１　ｍ　ｌの標準試料サイズを３
個のコツプに分けると毒性評点範囲の中間に発育遅延を
生じた。したがってこの検定は、毒性がその親非突然変
異体と同等または低下したものと、毒性を増加したクロ
ーンとを区別するのに有用であった。検定は検定に添加
しなｐｒＡＫ培養量に依存した用量反応を生じた。した
がって試料に添加したｐ　ｒ　Ａ　Ｋ含有菌址が多いは
どＴＢＷに対する毒性程度の増大が観察された。ｐｒＡ
Ｋの用量−反応曲線は、クローンがその親非突然変異体
よりも毒性が強い毒性程度を評価するのに有用であった
。

下記の表はｐ　ｒＡＫ含有！Ｉ菌の用量−反応を示した
ものである。

添加しな静置培養 ｒＡＫ−１ 毒性評点 ｍ１ ０．２５ 上記の評価をもとにして、標準としたｐｒＡＫ（および
その池の非突然変異体プラスミド）と比べて、得られた
グループサイズに関してその試料範囲の活性が大きいか
小さいかを確かめるため、ｌ　ｍ　ｌ培養を使用してす
べての培貢を検定した。

′ｒＢＷ検定に使用した栄養剤粉末は下記のダラム！Ｉ
ＴＪｌ比で混合した：大豆細粉１１０３．４ｇ、小麦胚
芽４２９．４ｇ、ウエツリン塩混合￥＠２９２．４ｇ、
スクロース１６４．２ｇ、バラ安息香酸メチル２４．６
ｇ、ソルビン酸１４．８ｇ。

ＴＢＷ検定に使用したビタミン′扮末は下記のグラム重
穢比で混合した：バントテン酸カルシウム１２．０ｇ、
ニコチンアミド６、Ｏｇ、リボフラビン３．０ｇ、葉１
ｉ！３．０ｇ、塩酸チアミン１．５ｇ、塩酸ピリドキシ
ン１．５ｇ、ビオチン０．１２ｇ、ビタミンＢ＋ｚ６．
０ｇ。

以下の三つの”ｌ”ＢＷ検定スクリーニング（１次。

２次、および希釈系列）は評価の各段階で実施したもの
であって１本明細書の説明のために引用した。

一次検定：１８時間培養した別の二つのクローン培貢か
らアリコート１　ｍ　ｌととり、５　Ｑ　ｍ　ｌの円＃
Ｉ遠心チューブでＴＢＷ食餌と混合し、３個のコツ１に
均等に分けた（１コツ１当りＩＴＢＷ）。

これらの試料を、野生型ｐ　ｒＡＫまたはｐＢＴ２１Ｏ
形質転損細胞および同様の方法で調製した未形質転換細
胞の対照と比較した。

二次検定ニー次検定においてＴＢＷに対し増大した毒性
を示した試料を二次検定でスクリーニングした。！ｔば
れた突然変胃体コロニーをライブラリー平板からＹＴ／
Ａｍｐプロスへ接種した（１培養当り１コロニー）、１
ｍｌ試料１０１！Ｉを好適な肘！１ζＩと一緒に評価し
た。ＴＢＷに対して増大した毒性分有するクローンを「
可能性ある上位突然変−′シ体」と名付け、第３回目の
評価をした。第３回［１でも同様に「上位」表現型を再
現した試料は「に位突然変胃体」として確定し、野生型
親と比べて向上した活性をさらに正確に測定するため希
釈系列検定を実施した。

一品釈系列検定：非突然変異体組立て体に対して［１０
位１表現型であることを確かめた突然変異体と、１８時
間発育させたｐｒＡＫまたはｐ　Ｂ　７２１０クローン
から得た、突然変異体もしくは野生型トキシンの何れか
金含有する凍結乾燥則菌則胞（、ＩＪ！結乾燥する前に
細胞をベレット化）の希釈系列Ｔ　Ｂ　Ｗ検定によりス
クリーニングを行った（乾燥重量細胞孕とじて）、試料
を３段階の希釈系列（１６７／１ｇ、６７μｇ、３３μ
ｇ）で最終ン農度がそれぞれ１５ｒｎｌとなるようにし
た。これらの突然変異体から得た蛋白質を５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびウェスタン（免疫プロッティング）分析に掛
けたく原則としてル−ン当り乾燥重量細胞７５μｇ）、
希釈系列検定の結果は本質的にこれまでの検定結果を確
認し、本明細書では報告しないかまたは生物学的な結果
を報告した本明細書の表に平均値として示した。

実施例Ｐ（一般操作法） 下記の付番した実施例およびその他の明細書部分におい
ては、特にことわらない限り、引用した部分またはその
他必要ある場合に、下記の一般または標準実験操作法を
用いた。

実施例Ｐ−１ （細菌株およびファージ株の保存と増殖）エノエリヒア
・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）のＳ　Ｇ　４．０４４および
ＪＭＩ０３株を、全てのプラスミド構築で１ｎ主として
用いた。エンエリヒア・コリ（Ｅ。

Ｃｏ１１）Ｊ　Ｍ　ｌ　０３株並びにファージＭＩ８お
よびＭＰＩ９は、ニュー・イングランド・バイオラプス
から人手した。これらの細菌株はＹＴ培地（５ｇ／ａ酵
母抽出物、ＩＯｇ／Ｑバクトドリブトン、５乙／ＱＮａ
Ｃ０，）で増殖させた。培地には、ＰｒΔＫまたはこの
プラスミドの誘導体を含む細胞の増殖の場合５０ｍｇ／
ｆ２のアンピノリンを添加し、ＰＢＴ２ＩＯまたはこの
プラスミドの誘導体を含む細胞の場合２０　ｍｇ／　ｍ
Ｑのクロラムフェニコールを添加した。

実施例Ｐ−２ （ファージＤＮＡの増殖および分離） Ｍ１３由来組換え体ファージストックの製造、およびフ
ァージＤＮＡの分離は、既に報告されている方法［メソ
ング（１９８３年）、メンッズ・イン・エンザイモロノ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、月０１巻２０
−７８頁コを用いて行った。

実施例Ｐ−３ （合成オリゴヌクレオチドの製造） 合成オリゴヌクレオチドは、アプライド・パイオンステ
ムズ（フォスター・シティ、カリフォルニア）の３８０
Ａ−ＤＮＡ合成機による自動合成により製造した。

サイクル完了後の精製工程は次の通りである。

等容量の水酸化アンモニウムを加え、５５°Ｃで一夜イ
ンキスベートすることにより、合成オリゴヌクレオチド
を脱保護した。急速遠心と蒸留水への再懸濁の連続回転
により水酸化アンモニウムを除去した後、尿素・ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（尿素・Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅ　
）によりオリゴヌクレオヂドをさらに精製した。バンド
を可視化するため、ゲルをサラン（商標）ラップで覆っ
た２層クロマトグラフィープレート上に置き、オリゴヌ
クレオチドを短波長紫外線で照射した。ゲルのオリゴヌ
クレオチド含有部分をレーザーブレードで切断後、ゲル
からオリゴヌクレオチドを０．５Ｍ酢酸アンモニウム、
１ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）と３７℃で一夜撹拌す
ることにより溶出させた。−夜溶出後、ゲルフラグメン
トをＪＡ２０ローター中６０００ｒｔＰＭでペレット化
し、溶出したオリゴヌクレオチドを含む上清を別の管に
とった。エタノール沈澱によりオリゴヌクレオチドを濃
縮し、０Ｄ２６０の吸収により定量した。２００ピコモ
ルのオリゴヌクレオチドを２単位のＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼと０．０５ｍＭＡＴＰの４０μＱ反応液でキ
ナーゼ処理した。

実施例Ｐ−４ （エシェリヒア・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）細胞のＤＮＡ
転換） Ａ）ＤＮＡ転換適格エシェリヒア・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１
）Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ３または５Ｇ４０４４を、既報の一般
法にしたがって調製したしニーヘン、チヤツクおよびフ
ス（１９７２年）、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニス
エイ（ｅｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）６９巻２１１０−２１１４頁］。部
位指向性オリゴヌクレオチド突然変異誘発実験のため、
ヘテロ２本鎖組換え体ファージ（Ｍ１３）ＤＮＡ（６０
ｎｇ）を適格細胞０．２ｍ１２に加え、０℃に１５分間
保った。ついで、細胞を４２℃に２分間保ち、この混合
物３０μｇを０．７％バクトアガー含有ＹＴブロス３ｍ
Ｑ（固化防止のため４２℃に推持）およびＪＭ１０３ま
たは５Ｇ４０４４の新鮮な一夜培養物０．２１に加えた
。混合物を直ちにＹＴアガープレート（ＹＴブロスｎ．
５％バクトアガー）上に分散し、プレート（倒置）を３
７℃で一夜インキユベートした。

Ｂ）突然変異誘発実験またはその他の本書記載ｐｒＡＫ
もしくはｐＢＴ２１０ベクターを用いる結紮実験で得た
プラスミドＤＮＡ（ｌ　ＯＯｎｇ）を適格細胞（ＪＭ１
０３または５Ｇ４０４４）０．２ｍ１２Ｅ加え、０℃に
３０分間保った。ついで、細胞を４２℃に２分間保ち、
水浴に移した。２μｍ２−２００μｇの量を５０μｇ／
ｍＱアンピシリン含有Ｙ　Ｔ　（ｐｒＡＫを基礎とする
クローンの場合）および２０μｇ／ｍＱクロラムフェニ
コール含有ＹＴ（ｐＢＴ２１０を基礎とするクローンの
場合）上に置き、３７℃で一夜インキユベートした。

実施例Ｐ−５ （制限酵素消化） 制限酵素はすべて、ベテスタ・リサーチ・ラプス（ゲザ
ースバーグ、メリーランド）または二ニー・イングラン
ド・バイオラプスから購入した。インキュベーション条
件は製造者の指示にしたがった。

実施例Ｐ−６ （ＤＮＡフラグメントの結紮） Δ）ＤＮＡ結紮反応物（２０μＱ）には、６（ｌａＭト
リス・ＨＣＱ（１）１１７．５）、ｌｏｍＭ　　ＭｇＣ
（！ｔ、１ｍＭジチオトレイタール、５０ｍＭ−ＡＴＰ
、２ＯｎＭ−ＤＮＡ末端および２０単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（二ニー・イングランド・バイオラプス）を含ま
せた。インキュベーションは１４℃で４時間行った。

Ｂ）　　３つの７ラグメントの結紮を、２０μＱの反応
容量中にｌ：ｌ二１のモル比、各０．０４ピコモルの濃
度で存在するフラグメントを用いて行った。

インキュベーションは、粘着末端のみの結紮の場合（例
、Ｘｈｏｌｌ内部部位）１６℃４時間、または平滑末端
がある場合（例、ＦｎｕＤ２部位）同じく一夜とした。

ニュー・イングランド・バイオラプス（ＮＥＢ）Ｔ４リ
ガーゼをＩＯ単位（ＮＥＢ基準）／μＱ反応容積の濃度
で用いた。

実施例Ｐ−７ （ＤＮＡ配列決定） デルタ・エンドトキシン遺伝子およびその誘導体のＤＮ
Ａ配列決定は、ハイデツカ−等の読経り法［ハイデツカ
−、メシングおよびグロネンボーン（１９８０年）、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）１０巻６８−７３頁コにより行った。

実施例１ （ベクターｐｒＡＫ−３、ｐｒＡＫ−４、ｐｒＡに−５
、ｐｒＡＫ−６およびｐｒＡＫ−７の製造）段階ａ）ｐ
ｒＡ　Ｋ　−３の製造 ！ｌ１ｇのプラスミドｐＢ８ｒＩＩ（第２図に図示、お
上びＦ−述）並びに周知のＭ１３クローニングベクター
ＭＰ＋８およびＭＰ！９から得たＤＮＡ復製形を、制限
酵素Ｂ）ｍ［ｌ！（８単位）およびＫｐｎｌ（１０単位
）を用いて、６ｍＭ）リス・ＩＣ（（ｐＨ７９）、６ｍ
Ｍ　　ＭｇＣＱｖ、ｌ　ＯＯμｇ／ｍＱうし血清アルブ
ミンを含む１００ｍＭ緩衝食塩水中、３７゛Ｃで６０分
分間時消化した。得られたＤＮＡ混合物からの目的フラ
グメントは、総混合物を１％分取用アガロースゲル上で
移動させてサイズにより分離することにより精製した。

バンドは、エチジウムプロミドで染色し長波長紫外線で
照射して可視化した。目的ＤＮＡを含むゲルフラグメン
Ｉ・を切断し、ＤＮＡを透析管中で電気泳動して溶出し
た。

ｐＢ８ｒ［ｌからのＢ）ｍｔｌ　Ｉ　／Ｋｐｎ　ｌフラ
グメントを、ｍｐｌ８およびｍｐｌ　９Ｂ）ｍＨＩＫｐ
ｎｌ切断・ゲル精製ベクターに、６０　ｍＭ　ｌ・リス
・ＨＣ４（ｐＨ７、５）、ｌ　ＯｍＭ　　ＭｇＣｆ２２
．１ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ−ＡＴＰ、２０
μＭ−ＤＮＡ末端を含む総容量２０リットル中、１４℃
でインキュベートすることにより結紮した。得られるＤ
ＮＡを、ＹＴプレートがイソプロピルチオガラクトノド
（ｌＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−Ｄ−ガラクトノド（Ｘガル）（共にノグマ・ケ
ミカル・カンパニーから人手）を含む以外実施例Ｐ−４
と同様に適格エシェリヒア・コリ（ＥＣｏｌｉ）Ｊ　Ｍ
　ｌ　０３に形質転換した。組換え体ファージ（ｐＢ８
ｒｌｌからのＩ）ＮＡインサート切断物を含む）はこの
条件下で透明プラークを作り、Ｍ２Ｓお上びＭＩ９は青
色プラークを作るので、透明プラークをＹＴジブロス中
エシェリヒア・コリ（ｌＥＣｏｌｉ）ＪＭ１０３（２ｍ
＆）に加え、３７°Ｃで一夜インキユベートし、ファー
ジから１本鎖ＤＮＡをメシング、メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
）（１９８３年）１０１巻２０７８頁の方法にしたがっ
て製造した。これらの目的とするｐＬ３８ｒ１１山来大
形１本鎖ＤＮＡインサーｈ含何クローンを、ｍｐｌ８ま
たはｍｐｌ９に比較して移動が遅いことに基づきアガロ
ースゲル電気泳動を用いて確認した。これらのクローン
におけろエンドトキシンＤＮＡ含有部分のノブオキシ読
込り（ｃｈａｉｎ　　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法によ
る配列決定によりエントドキノンＤＮＡの存在が確認さ
れ、これによりｍｐｌ８がアンチセンス鎖を獲得したこ
とおよびｍｐｌ９がセンス鎖を獲得したこと（これらは
）（に採取された）を示した。配列 ５’ＧＴＣＣＴＴ　ＣＴＡ　ＡＴＣＧＣＧ　ＡＡＡ　Ｔ
ＧＧ　ＣＴＴ　ＧＧ　３゜をｆ了４−る２６塩基のアン
ヂセンスオリゴヌクレオヂトを自動１）　Ｎ　Ａ合成機
中で固相合成により調製し、Ｔ４ポリヌクレオヂドキナ
ーゼおよびＡＴＰを用いて、マニアデス等、モレキユラ
ー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇＸＩ　９８２年）・ア・ラボラトリ−マニュアル（
Ａ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）（コ
ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コール
ド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）の報告にし
たかいキナーゼ化した。０゜４μｇのエンドトキシンの
アンチセンス鎖を含む組換え体ファージｍｐ１９．２０
ｍＭ１・リス−Ｉ−ＩＣ（！（ｐｉ（７、５）、７　ｍ
Ｍ　−ＭｇＣＱｔ、　　Ｉ　ｍＭジチオトレイクール、
５０ｍＭ塩化ナトリウムおよびｌＯｎｇの２６塩基アン
チセンスオリゴヌクレオチドを含む総容量６０μＱの混
合物を６８℃で１５分間、ついで３７℃で１０分間加熱
し、０℃にした。得られた突然変異誘発オリゴアニール
ｍｐ１９組換え体ＤＮＡ含有混合物を、各０．２ｍＭ−
ｄＡＴＰ。

ｄｃＴＩ）、ｄ　Ｔ　Ｔ　ＰおよびｄＧ　Ｔ　Ｐ、　　
ｌ　ｍＭ　−Ａ　Ｔ　Ｐ。

４単位のＤＮＡポリメラーゼエクレナウフラグメントに
ュー・イングランド・バイオラプス）、０゜５μｇのエ
シェリヒア・つり（Ｅ、　Ｃｏ１１）１本鎖結合蛋白質
（ファルマシア、ビス力タウェイ、ニニージャージー）
および２０単位のＴ４ＤＮΔリガーゼにュー・イングラ
ンド・バイオラプス）で処理した。得られる混合物を１
４°Ｃで４時間インキュベートして重合および結紮し、
生成する環状２本鎖のへテロ２本鎖ＤＮＡをエシェリヒ
ア・コリ（ＥＣｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ３に形質転換し
、実施例Ｐ−・１記載のように置いた。ついで２０個の
個別プラークを選択し、マニアチス等（前掲）記載の方
法でファージから１本ｉｎ　Ｄ　Ｎ　Ａを分離した。各
２０個のプラークのファージのＤＮＡを、５０ｍＭ）リ
ス・ＨＣｌ！（ｐｌ−１８、０’）、５０ｍＭ−ＫＣＬ
　　１０ｍＭＭｇＣ（ｈ、Ｉ　Ｏｎｇの上記アンチセン
ス２６塩基オリゴヌクレオチドおよび０．２μｇの別の
環状１本鎖ファージＩ）　Ｎ　Ａ分子を含む総容量２０
リツトル中、６８℃で１５分間加熱し、３７℃にｌＯ分
間装いた。各生成混合物に制限エンドヌクレアーゼＮｒ
ｕｌ（８単位）を加え、３７℃のインキュベーションを
１時間続けた。混合物を、０．８％アガロースゲルで電
気泳動した。試料の約ｌＯ％が直線ＤＮＡとして泳動す
るＤＮＡを含んでおり、それにより目的とするＮｒｕ１
部位クローンはエシェリヒア・コリ（Ｅ　、　Ｃｏ１１
）Ｊ　Ｍ　ｌ　０３に形質転換して精製を確実にした。

陽性クローン中のＢａｗｌ−１１部位およびＸ　ｂａ　
１部位間のＤＮＡを、両部位に対するエンドヌクレアー
ゼで同時切断することにより（Ｎｒｕｒオリゴについて
前述のように、ｍｌ　３アニール、オリゴ配列化および
重合で２本鎖化後に）切り出し、同一の２種の制限酵素
で同時にｐｒＡＫを完全消化後に得てゲル精製した大形
フラグメント（約５００４塩基対で、ｐｒＡＫのＢ）ｍ
ＨＩ部位および第２Ｘｂａ１部位間の約７４９ｂｐを欠
失する）と結紮（実施例Ｐ　−６Ａ）Ｌ（これらは何れ
も常法で行う）、プラスミドｐｒＡＫ−３を形成した。

段階ｂ）　　ｐｒΔに−４の製造 上記段階ａ）に類似する本質的全製造法に従い、段階ａ
）で得られた一重鎖ファージＤＮＡを表Ａのヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド位置番号３２７および３５！の間
のＨｉｎｄ［部位を導入するためにデザインした配列 ５　　　ＣＣＡＣＴＣＴＣＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＣ
ＧＴＡＡ３゜をａする２５塩基合成アンチセンスヌクレ
オチドにアニールした。所望のＮｒｕｌおよびｌｌｉｎ
ｄＩｌｌ部位の両方を有する陽性クローンは、ヌクレア
ーゼ１１ｉｎｄｌｌｌによる開裂評価により約６．６％
の頻度で同定され、段階ａ）と同様にｐｒＡＫから５０
０４塩基対犬フラグメントに新しい部位をらつＢ）ｍ１
１１／Ｘｂａｌフラグメントを連結することにより、ｐ
ｒＡＫ−４を製造するのに用いた。

段階ｃ）ｐｒＡＫ−５の製造 上記段階ａ）に類似する本質的全製造法に従い、段階ａ
）で得られた一重鎖ファージＤＮＡを表へのヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド位置番号３６Ｇおよび３９１の間
のＭｓｔ１１部位を導入するためにデザインした配列 ５°　ＧＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧ
ＡＴＴ八、。

を有する２６塩基合成アンチセンスヌクレオチドにアニ
ールした。所望のＮｒｕｌ、ＨｉｎｄｌＩ［およびＭｓ
Ｌ１１部位の全部で３つを有する陽性クローンは、制限
酵素Ｍｓｔ■による開裂評価により約９１％の頻度で同
定され、ｐｒＡＫ−５の製造に使用された。

段階ｄ）ｐｒＡＫ−６の製造 上記段階ａ）に類似する本質的全製造法に従い、段階Ｃ
）からの陽性二本鎖ファージクローンを一重鎖ファージ
ＤＮＡに変換し、表Ａのヌクレオチド配列のヌクレオチ
ド位置番号４０６および４３１の間のＢｓ５Ｈ［１部位
を導入するためにデザインした配列 ５’　ＧＣＧＧＴＴＧＴＡＡＧＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡ
ＴＧＴＣｊ。

を有する２６塩基合成アンチセンスヌクレオチドにアニ
ールした。ｐｒＡＫ−７に最終的に望まれる全部で４つ
の部位を有する陽性クローンは、酵素Ｂｓ５１４■によ
る開裂評価により約１２．５％の頻度で同定され、ｐｒ
ＡＫ 段階ｃ）　　ｐｒＡに−７の製造 ｌ−記段階ａ）に類似する本質的全製造法に従い、段階
ｄ）で得られた陽性−重鎖ファーノＤ　Ｎ　Ａを表Ａの
ヌクレオチド配列のヌクレオチド位置番号１６８２およ
び１７０７の間のｆｌｉｎｄｌ１１部位を脱離さＵｏる
ためにデザインした配列 ５　　　ＴＡＣ八ＧへＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡ
ＣＴＧＴＡ３を（Ｔする２６塩基合成アンチセンスヌク
レオチドにアニールした。ｐｒ　Ａ　Ｋ−７に最終的に
望まれる全配列を表す陽性り〔ｌ−ンは、ヌクレオチド
１６８２および１７０７の間のＩＩ　ｉ　Ｔｌ＋Ｉ　Ｉ
Ｉの欠失のために組換え体ファージＩ）　Ｎ　Ａの復製
型（二本討１）の制限エンドヌクレアーゼスクリーニン
グにより約２８％の頻度で同定された。変異株からｒＩ
ｉ離した二本ｇ１１１）　Ｎ　ＡはｐｒＡＫ−７の製造
に使用された。

２つのＸｂａ１部位の間の池の変異点でのコドンスピン
実験を行なうに適当にユニークで雌れた制限部位を何す
るプラスミド（ｐｒＡＫ−９）の供給を完全にずろため
に、ｐｒＡＫ系プラスミドの開発は６の製造に使用され
た。

以下の段階ｆ）およびｇ）に示すようなプラスミドｐｒ
ＡＫ−８およびそれからのｐｒＡＫ−９を製造する次の
ような段階と同様につづけることができる。

段階ｒ）ｐｒＡＫ−８の製造 上記段階ａ）に類似する本質的全製造法に従い、段階ｅ
）で得られた一重鎖ファージＤＮＡを表へのヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド位置番号約５３４でＢａ１ｌ制限
部位を導入するためにデザインした配列 ５’　　ＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＡＣＡＣ
ＴＧＡＡＡＣ３゜を仔する２７塩基合成アンチセンスオ
リゴマーにアニールした。所望のＮｒｕｌ、　Ｈｉｎｄ
ｌ■、ＭｓＬ［、Ｂｓ５ｌ−（１１および１３ａｌ１部
位の全部で５つをｆｉ’ＬｐｒＡＫ−７製造時に除去し
たｌｌ１ｎｄｌｌＴを欠失する陽性クローン（ｐｒＡ　
Ｋ　−８）は、上記段階ａ）の方法で同定された。

段階ｇ）ｐｒＡＫ−９の製造 上記段階ａ）に類似する本質的全製造法に従い、段階ｒ
）で得られた一重鎖ファーノＤＮＡを表へのヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド位置番号５８８および５９５の間
でＭｌｕｌ制限部位を導入するためにデザインした配列 ５’　ＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＡＧＡＣＧＣＧＴＴＡＡＡ
ＴＣＡＴＴＡＴＡ３を（ｆする３０塩Ｊ舌合成アンチセ
ンスオリゴマーにアニールした。所望のＮｒｕｌ、ｌ１
ｉｎｄｌｌＬ　ＭｓＬＩＩ、１３ｓｓ　ＩＩ　ＩＩ　、
　Ｂａｌ　ＩおよびＭｌｕｌ制限部位の全部て６つを￥
１ＬｐｒＡＫ−７形成時に除去したｔｌｉｎｄＩＩを欠
失する陽性クローンは、上記段階ａ）の方法で同定され
、プラスミドｐｒＡＫ−９と命名された。

明白であるように、ｐｒＡＫ−９のＢａ１ｌとＭｌｕｌ
部（ｑの間の置換に適したカセツトＤＮＡは、変異した
アミノ酸位置！８／Ｉ、１８７、＋８８および１９４て
、−４′へての可能なコドンおよびアミノ酸変化を誘導
４゛るために適当に暗号化ずろことができる。

同様な方法で、Ｍｌｕｌおよび第２Ｘｂａ１部位の間の
置換に適したカセッｌ−Ｄ　Ｎ　Ａは、変異したアミノ
酸位置２０１および２０４で、ずへての可能なコドンお
よびアミノ酸変化を誘導するために適当に暗号化するこ
とができる。

第５図はｐｒＡＫ（ここではｐｒＡＫ−９の第１のこの
ＸｂａｌｆｌＥ位はＮｒｕ１部位である）にみられる２
つの元のＸｂａ［部位の間に導入され得る特有の制限部
位の図である。

実施例２の様々な段階で」二足に示したアンヂセンスオ
リゴヌクレオチドのアンダーラインは、変化または導入
すべき変化を示す。

実施例２ コドンのスピン試験 Δ）第３Ａ図で示した各々の埴土の各々のＸ位にヌクレ
オチドＡ、Ｔ、ＣおよびＧの全部をランダムに挿入する
ようプログラムされたＤＮＡ合成機を用いて、実施例Ｐ
−３に記載したように、第３Ａ図および第３Ｂ図で示し
た２つの鎖の各々の配列を持つ単鎖オリゴヌクレオチド
類を製造した。

上記単鎖（６鎖のＸ位を除いては一致するオリゴヌクレ
オヂドのファミリーに相当する）を機械に掛けた各々の
乙の由来の総量的２０　、Ｏｕｇ（精製後）のＤＮＡを
、上記方法によって製造した。各コドンスピンに対して
センスおよびアンチセンスのｌＯピコモルの６鎖を６８
℃で１０分間、その後３７℃で１０分間加熱し、室温に
冷却しさらに水上に置くことによってひとまとめに結合
しアニールした。第３Δ図に示したＤＮＡに一致する、
得られる２本鎖オリゴマーのマスはＸＸＸ位（アミノ酸
位置ｌｌ６）に停止信号および２０の天然アミノ酸と停
止信号のそれぞれに対する多対であるが種々の数のコド
ンを含む遺伝子暗号によって可能となる各組合わせを含
有すると判定した。その後、２ピコモルのこれらの２本
鎖オリゴマーまたはカセットをニューイングランド・パ
イオラブズ由来のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てりん酸化し、！００ミリモルＮａＣ１，１０ミリモル
のトリス１−Ｉ　ＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ミリモルＭ
ｇＣＩ！、１０ミリモルの２−メルカプトエタノールお
よび１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中で制限エンドヌクレア
ーゼｌ−１ｉｎｄｌＩＩおよびＭｓｔｌｌを用いてプラ
スミドｐｒＡＫ−７を同時に開裂させた後、ゲル分離に
よって得られた（１０倍以下のモル濃度で存在する）よ
り大きなフラグメントといっしょに混合して、得られる
混合物を実施例Ｐ　−６（Ａ）によって連結させた。適
ｆｆ１（５μりの得られる連結混合物を使用して実施例
Ｐ　−４（Ｂ）の条件下でエッシェリヒア・コリＪＭ１
０３を形質転換させた。得られる幾らか（２００）の形
質転換細胞を個々にＴＢＷおよびティー・二のアッセイ
に掛け（ＸＸＸのどんなコドンがどんな特定クローンに
あるかを前もって知らずに）、全ての種々の異なった変
異体が少なくともほとんど調節切断エンドトキシンの活
性と同じ活性を有する殺虫剤的に活性な蛋白質生成物を
生ずることをよく示し、鮮明なアップ変異体（５×対照
）も示す活性水準を誘導することが分かった。この前に
、実施例ｐ−ｔのように形質転換由来の無作為の細胞を
選択し、平板培養し、コロニーを育成して、Ｂａａ＋　
　）［１／Ｘｂａフラグメントを、同様の酵素を用いて
切断したシーケンスベクターｍｐ１８およびｍｐ１９に
クローン化することによってＤＮＡ配列分析のためのプ
ラスミドＤＮＡを単離した。１１の上記位置−１１６変
異および同定アップ変異体の各々の領域でのＤＮＡは、
その１１６位で暗号化されたアミノ酸を決定するため配
列決定された。２つの内の■つのアップ変異体は、原種
の変異体であることが分かった（１１６−Ｌｙｓ１ΔＡ
Ａによって暗号化された）。他のアップ変異体は、ＣＯ
Ｔによって暗号化された１１６−Ａｒｇであることが分
かった。他のクローンの内の１つは、天然のｌ　ｌ　６
−Ｇｌｕ（ＧＡＡによって暗号化された）であることが
分かった。他の軽度異体の内の７つは、１１６−１１ｅ
（ＡＴＴ）、１１６Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、ｌ　ｌ　６−Ｌ
ｅｕ（ＣＴＣ）、ｎ６Ａｓｐ（ＧＡＴ）、　　ｌ　　Ｉ
　　６　−Ａｓｎ（ＡＡＣ）、　　１１６−１１ｅ（Ａ
ＴＴ）およびｒ　１６−Ｇｌｙ（ＧＧＡ）であった。新
規１１６−１１ｅ（ＡＴＴ）を除いた全ての特性は、２
つのクローンによって示された。最終クローンは１１６
−停止（ＴＧＡ）を暗号化した。

Ｂ）アミノ酸の位置−１１９について、第３Ｂ図に示し
たＤＮＡを使用してこの実施例２のＡ）の部分の方法を
繰り返した。さらに、大量の得られるクローンの無作為
の評価は、ＴＢＷおよびティー・二のアッセイで、プー
ル内の全変異体クローンが活性であることをよく示す活
性水準を呈示した。（不活性分子の％は、ＸＸＸ位での
ヌクレオチドの機械による無作為挿入から期待される停
止コドンＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡの頻度とおおよそ
等しい）。無作為に選択した７つの個々のクローンは、
互いにｐｒＡＫによって生じた端切形天然配列のエンド
トキシンの活性水準と少なくとも同等な活性水堕を佇ず
ろことか示されたが、我々の任αの基４４．１１に、に
るアップ変異体はなかった。７つの個々のクローンの配
列決定は以下のようにそれらか全て５１４なっており特
異的であることを示しノこ。　　ｌ　　ｆ　　９　−　
Ｌ、ｅｕ（ＣＴＡ）、　　Ｉ　　１　９　−Ｔｙｒ（Ｔ
　ＡＣ）、Ｉ　ｌ　９−Ａ５ｐ（ＧＡＴ）、Ｉ　Ｉ　９
−１ｒｉｓ（Ｃ，Ａ。

′１゛）、ｌ　ｌ　９−Ｐｒｏ（ＣＣＡ）、ｌ　Ｉ　９
−１１ｅ（ＡＴ′１゛）およびｌ　Ｉ　９−９ｅｒ（Ｔ
ＣＴ）。

実施例３ （変５〜体全長バチルス・チ、−リンゲンノス・エント
トギンノ１ 制限エンドヌクレアーゼ＋３）ｍ　　＋−（１（８中位
）」ｊよびＳｓＬ　　Ｉ（８ｊ、ｎ位）を用いて、６ミ
リモルのトリスＩＩＣＩ（ｐｌ＋７．９）、６ミリモル
のＭ　ｇ　Ｃ！　２お、］；びｌＯＯμｇ／ｍｌのうし
血清アルブミンを合釘する１００ミリモル塩化ナトリウ
ム緩衝溶液中で６０分間、プラスミドｐＩ３Ｔ２１０（
１８ｇ）を同１寺に切断した。ヘクターとしての用途の
ために約７１８０塩基対のより大きなフラグメントをゲ
ル精製した。その後、Ａ　ｌａ−”Ｔｈｒ（１１９番目
）、Ｍｅｔ−Ｉｌｅ（１３０番目）およびｃｒｙ−Δ５
ｐ（２０１番目）の変異を包含する１８ｇのプラスミド
ｐｒＡＫ２６−３も同時に６ミリモルのトリスＨＣＩ（
ｐＨ７，９）、６ミリモルのＭｇＣｌ、および１００μ
ｇ／ｍｌのうし血清アルブミンを含有する１００ミリモ
ル塩化ナトリウム緩衝溶液中で制限エンドヌクレアーゼ
Ｂａｎ　　Ｈｌ（８単位）およびＳｓｔ　　Ｉ（８単位
）を用いて切断した。変異およびＢｔＲＩ３Ｓ部分を含
む約１４２８塩基対のより小さなフラグメントをゲル精
製し、１−３己フラグメントを」二５己で得られた０、
０２ピコモルの７１８０塩基対ヘクターフラグメントと
連結するために混合し、６０ミリモルのトリスＨＣ１（
ｐｔ！　７　、　９　）、１０ミリモルのＭｇＣ１ｔ、
１ミリモルノヂオスレイト−ル、５０　　ＭＡＴＰ、お
よび２０単位のＴ４ＤＮΔリガーゼを含有する２０Ｑの
連結溶媒と一諸にし、生じる混合物を４時間、１４°Ｃ
でインキュベートした。得られたｐＢｔ２Ｂ−３と称す
るプラスミドを、５μｌの上記連結混合物を０．２ｍｌ
の適格エッシエリヒア・コリに加え、最初０℃で３０分
間、さらに４２°Ｃで２分間脈動してから水に戻すこと
によって、エノノエリヒア・コリＪＭ１０３に形質転換
させた。種々の（２μｍ、２０　Ｉｔ　Ｉおよび１８０
μｍ）の生じろ混合物を、２０ｇｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコールを有するＹＴ寒天平板に直ぐに広アてから、
平板を３７℃で一夜インキユベートした。クロラムフェ
ニコール耐性を何する形質転換細胞のみが、これらの平
板で成育し得る。フロラＪ、フェニコール耐性コロニー
を液体培地で一夜、３７℃で育成し、プラスミドＩ）　
Ｎ　ＡをＩΣｃｏｒｔ　Ｉ試薬での制限分解と部分変異
の存在を実際に決定するＩ）Ｎへ配り１１決定用に製造
した。プラスミドｐ　ｌ−３Ｔ２６−３を＊　ｆＴ　’
４−る侵れた形質転換物を’ｒ１３Ｗおよびティー・二
のアッセイで評価した。

上記実施例３に類似する方法で、以下に示す別の全長変
異株エンドトキンンを製造し、′Ｉ’　１３　Ｗおよび
ティー・二のアッセイで評価した。以下の第１ン表は、
製造した別の全長女５１＋！体エノドトキンン産生プラ
スミド／細胞系と、Ｔ１３Ｗアツセイでのそれらの評価
のおおよその結果と上記実施例３の生成物、エッシエリ
ヒア・コリＪＭＩ０３が産生ずるバチルス・チューリン
ゲンノス・ウハネンソス天然エンドトキシンおよび非形
質転換ＪＭＩ０３細胞による対照についての同様なアッ
セイのおおよその結果を示している。

第１Ｓ表 第Ｆ表 実施例４ １別の全長夜ｙ６体バヂルス・チューリンゲンシス・エ
ンドトギシン］ プラスミドｐｆＪ’ｌ’２１０（ｌμｇ）を制限エンド
トキンンＩｌ）ｍ　　ＩＩＩ（８単位）およびＳｓ口（
８単位）で同時に分解し、生じる７１８０ｂｐ大型フラ
グメントをゲル単離した。一連の分離試験で、制限エン
ドヌクレアーゼｒ３ａｔａ　　ＩＩＩ（８単位）および
５ｓｔ１（８１Ｔｉ位）を用いて各（１μｇ）のプラス
ミドｐｒＡ１（、ｐｒＡＫ−Ｆ、、ｐ２６−３、ｐ３６
ａ６５およびｐ９５ａ８６ら同時に分解し、エンドトキ
シン暗号第Ｆ表 化配列の部分から成る各々の生じた１４２８ｂｐフラグ
メントをゲル単離した。制限エンドヌクレアーゼＦｎｕ
　　Ｄ２（６ミリモルＮａＣ１，６ミリモルのトリスＨ
Ｃ１（９ｈ７　、４　）、６ミリモルＭｇＣ１ｔ、６ミ
リモル２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌう
し血清アルブミン中４単位）を用いて各々の量のこれら
の１４２８ｂｐフラグメントを別々に分解した。制限エ
ンドヌクレアーゼＦｎｕ　　Ｄ２（Ａｃｃ２としても既
知）は、種々のｌ　４２８ｂｐＢ）ｍＬｌ　ｒ　／　Ｓ
　ｓロフラグメントの各々を一度だけ切断し、６４０ｂ
ｐＢ）ｍ　　Ｈ［／Ｆｎｕ　　Ｄ２フラグメントおよび
７８８ｂ９Ｆｎｕ　　Ｄ２／５ｓｔｌフラグメントにす
る。各試験側由来の異なるフラグメントをアガロース・
ゲル・クロマトグラフィーによって精製した。

こうして、一連の異なる６４０ｂｐＩ３）ｍ　　Ｈ１／
Ｆｒ＋ｕＤ２フラグメントおよび一連の異なる７８８ｂ
ｐＦｎｕ　　Ｄ２／５ｓｔｌフラグメントが得られた。

これら２つのシリーズの各々から１つのフラグメントを
選択し、ｐＢＴ２１０から得られた７１８Ｏｂｐの大型
フラグメントと連結することによって、異なる全長変異
体バヂルス・チューリンゲンシス・エンドトキシン遺伝
子を潜ませている大量の新規プラスミドが得られた。実
施例Ｐ−４（Ａ）の方法により、以下の第６表で示す、
得られた新規プラスミドを使用してエッソエリヒア・コ
リＪＭＩ０３を形質転換させ、実施例ＡのＴＢＷアッセ
イによって、生じる細胞をバヂルス・チューリンゲンシ
ス・エンドトキシンの産生について評価した。

」二足アッセイで得られたおおよその結果も以下の第６
表で報告した。第ＦおよびＧ表に記述したようなプラス
ミドを含む種々の形質転換細胞らティー・二のアゾセイ
で評価し、その結果を以下の第１Ｉ表で示した。

第６表 −Ｅ −Ｆ １０日 ｐｒＡＫ　　　　　　ｐ２６−３ ｐｒｕ−Ｂ　　　　　ｐｒＡＫ 須Ｉ＋表 ＢＴＡ ＢＴＣ ＢＴ６６ ｐＢＴ１０７ｃ２５ ＢＴＰ ＢＴＳ ｐＢ↑６７ ＢＴ１０６ ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐＢＴ３０１ ｃｏｎｔｒｏｌ　５ＡＮ４１５ ｃｏｎｔｒｏｌ　ＣＡＧ６２９ ２０１−Ａ即 ３０Ｊｌｅ 実施例５ 変異体エンドトキシン配列を暗号化するＤＮＡを用い、
公知および標阜的条件下で、形質転換した細胞を発酵層
で育成した。細胞成育の終点および採取の直ＯｒＩに、
発酵層の全量を約７０〜８０℃まで温度に」−Ｈさせた
。この温度を１０分間保持してから冷却したが、この温
度は、エンドトキシン蛋白質の生物学的活性に影響を与
えることなく組換え体微生物を不活性化するのに十分で
ある。

発酵層内容物を加圧下で蒸発させ、当初の３分の１の！
ｎに濃縮し、加熱向流空気フローを使用して、人口温度
１４０〜１６０９Ｃ１出口温度２０〜５０°Ｃて、生し
ろ濃厚物を挿入圧約２０００ｐｓｉで噴霧乾燥した。生
じる粉剤を脱脂大豆のような担体と混合して湿潤濃厚物
を得た。上記の好適な比率は、例えば最終生成物の所望
の強度に依有するが、例えば６０４０部（重量で）の扮
剤対担体比であってらよい。胞子またはエントドキノン
蛋白質に関して、得られる濃厚物は、０．４から１０％
、好ましくは０．８から８％の仔効成分を含ａするのが
好ましい。散布用途に関しては、当業界で公知なように
、湿潤粉剤は水を用いて希釈するのが適当である。

第Ａ人 ＣＣＡ　ＧＡＡ　Ｔ’ＴＣＡｃＴ？Ｍ’　ＣＣＧ　Ｃｒ
Ａ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＡＴＯＧＧＡ　ＡＡ？　
ＧＣＡ　ＧＩＪＰｒｏ　ＧＬｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　？ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ
　ＧＬｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ＾１ａＩＬｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅ
ｒ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　Ｉｌ＊　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｅｌｓ
　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓａｔ　ＴｈｒＡ
Ａ’ｌ’　　ＣＴＴ　ＧＧＣＴＣＴ　　ＧＧＡ　ＡＣＴ
　　ＴＩＣ’！’　　ＧＴＣＧＴＴ　　ＡＭ　ＧＧＡ　
　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＴＴ’戟f　　ＡＣＡ Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＧＬｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓ
ｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｈｓ　ＴｈｒＧＬＹ　　Ｓ＋ＩＩｒ　　Ｌｅｕ　
　Ｔｒｐ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　ｓ＠ｒ　　ＡＬａ　
　Ｉ’ｒＯＳａｔ　　Ｐｒｏ　　工１＠　６五ｙ@　Ｌ
Ｉｙｓ　　ｃｙｓ Ｐｎ＋ｌＩ　　ＴＭ　　Ｔｎｒ　　ｐｒｏ　　Ｐｈ＠　
Ａｓｎ　　ｐｈｅ　　ｓｉｒ　　Ａｓｎ　　ＧＡＹ　　
５ｔｌｒ　　Ｓｉｒ　　Ｖａk　　ＰＨ＠　Ｔｎｒ １１（ａ）ｆ月（＋＋ｍｌｌ　ｌ　ｉ！ｌ：侍（ｌ＋）
１１　Ｓ　ｌｉ＋・１、）ζ（Ｓｌ（ｃ）はＸ　ｈｒ＋
　ｉ！ｌ　ｊＩ”／（（１）はＸ　ｈａ　Ｉ　部（＋７ （（りはＫ　ｐｎ　Ｉ　　ｒｉａｌ−ンこの発明のさら
に好ましい変異は位置ｎ６（ＬｙｓまたはＡｒｇ）、１
１９　（′ｒｈｒ）、１３０（ｌｉｅ）および！　、８
８　（Ｓ　ｅｒ）でのらのを含み、組合わせは、ｐｌ’
３Ｔ２　Ｇ　−３、ｐ［（’ｆ’−１０６、ｐＢＴ−６
８、ｐｌ（Ｔ　−Ｃ、ｐ＋’３　′Ｆ−６７およびｐＢ
Ｔ−７０（これらのあるらのは第６表で見られる）に見
られるような１つまたはそれ以」−のらのから成る。特
に端部切断エノドトキンンについての、ｐ３６ａ６５中
での個別お上び組合Ｕ−変毀らまた好ましくイイ↓１！
である。

それらが、エントトギノンのプレトキノンまたはブ〔月
・キノン部分を形成し、腸でプロテアーゼｌｊ秒すされ
て活性エノトトギソノまたは活性が高いエツトｌ・キノ
ンを形成すると仮定される２５のアミノ酸（第Ａ表で位
１１１１から２５）の部分に含まイ１ろので、この発明
によって発見され許容されるアミノ酸位置４での変異は
興味深い。それ故、位置・１で許容された変異は、上記
２５アミノ酸から成るエンドトキノノ配列かよたはそれ
と実質的な（少なくと６７０％）相同性を打ケるらのに
適切であり、および特に位置４の変異以前に、厳しい条
件下で、第Ａ表に見られるＤＮＡに、ヌクレオチド位置
Ｉからヌクレオチド位置７５までを含めて広がるヌクレ
オチド（４置に関して、欠失および添加に関係なくＤＮ
ＡとハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、上
記領域について暗号化されたそれらのエンドトキンンに
関連していることを、保＃、１１６アミノ酸配列領域と
関連して先に検討したような対応アミノ酸の均等コード
によるエンドトキンノに適切なことを示す。

我々の研究によってアミノ酸位置２１７で明らかにされ
、上記第１３表に記載し、さらに本書中に見られるよう
に評価された変異は、全ての天然に暗号化されたアミノ
酸が、第Ａ表で示したのと同等の配列を持ち、１１６の
アミノ酸の標準配列の終端からアミノ酸位置２１７まで
を含めて広がる活性エントドキノン中のこの位置に存在
し得ることを示すと判定させる。従って、上記の配列ま
たその均等物での位置２＋７のアミノ酸が、Ａｒｇを除
いて天然に暗号化された任意のアミノ酸である状態は、
この発明の範囲に包含されろ。しかしながら、位置２１
７での指示変異は興味の少ない結果を生じるので、それ
はここで記載した他の変異との組合わせとして興味をひ
かれるものであり、さらに位置２＋７は、Ａｒｇがこの
位置で自然に生じるエンドトキシンで変化し得ることを
示ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に関連する種々の段階で使用される
。Ｆｌ、ｔ、クルスタキ１１【）・１から誘導され先端
を切り取ったＢ、ｔ　、エンドトキシンを暗号化したＬ
ＩＮＡと含有し、鱗翅目に対して殺虫活性を有する混作
用型プラスミドｐ　ｒ　Ａ　Ｋおよびｐ「ＡＫ−３の地
図である。 第２０は、ｐ　ｒ　Ａ　Ｋを暗号化したものより若干鎖
長の長い先端を切り取ったＢ、ｔ、エンドトキシン蛋白
質を暗号化しているＤＮＡを含み、同様にＢ、ｔ、クル
スタキＨＤ−１から誘導され鱗翅目に対して殺虫活性を
有する１ラスミドｐ　Ｂ　８　ｒ　ｌの地図を示す。 第３ａ図および第３ｂ図は、所謂コドン・・スビ〉実験
を実施するために合成され、Ｂ、ｔ、エンドトキシンＤ
ＮＡ暗号配列へ所望の突然変異を都合よく導入するのに
有用な二つの代表的な２本１１１ＤＮＡ鎖を示す。 第４１：２１は、Ｂ、ｔ、ウハネンシスに由来する完全
鎖長の天然エンドトキシンを暗号化したＤＮＡを含んで
いるプラスミドｐＢ７２１０の地図を示す。 第５図は、その部分断片の拡大図を併記して示したプラ
スミドｎ「Δ１り−９の省略図である。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 特１．′１出願人　ザンド・アクヂエンゲゼルシャフト
代理人　フＦＩ’ｌ！　１：１す山葆　はか１名′１１
ｓｒ　１ 図面の浄書（内容に変更なし） 第２図 図面の浄書（内容に変更なし） 第４図 Ｓｒ ｃｏ　Ｒ１ 図面の浄書（内容に変更なし） 第３Ａ図 １Ｇ瞳でのオリゴ 第３Ｂｌ；Ｊ ９イ立でのイリ］ ５’Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ Ｍｓｔｌ１ 」」６ ’＋Ｊ４ ５８ソ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）昆虫に対して毒性活性を有するエンドトキシン蛋
   白質を暗号化したＤＮＡを含有し、そのＤＮＡが表Ａに
   おけるｍ−１の位置を起点としてｍ−１１６の位置にま
   たがる１１６個のアミノ酸配列との相同性を実質的に示
   すアミノ酸配 列を暗号化した部分を含んでおり、そのなかにあり得る
   欠失または付加とは無関係に相同配列にその位置番号を
   適用し、示されたアミノ酸参照位置において （ａ）ｍ−５の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ酸 （ｂ）ｍ−６の位置にＧｌｎ以外の任意の天然アミノ酸 （ｃ）ｍ−１２の位置にＧｌｕ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｄ）ｍ−１６の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｅ）ｍ−２７の位置にＧｌｕ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｆ）ｍ−３０の位置にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｇ）ｍ−３３の位置にＴｈｒ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｈ）ｍ−３４の位置にＡｓｒ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｉ）ｍ−３６の位置にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｊ）ｍ−４１の位置にＭｅｔ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｋ）ｍ−９５の位置にＰｈｅ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｌ）ｍ−９８の位置にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｍ）ｍ−９９の位置にＴｈｒ以外の任意の天然アミノ
   酸 （ｎ）ｍ−１０５の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミ
   ノ酸、および （ｏ）ｍ−１１２の位置にＧｌｙ以外の任意の天然アミ
   ノ酸 からなる任意の１またはそれ以上のアミノ酸を暗号化さ
   せるよう該ＤＮＡを修飾して含有する構造遺伝子。
2. （２）該構造遺伝子ＤＮＡの一部によって暗号化された
   アミノ酸配列と、表Ａに示したｍ−１の位置を起点とし
   てｍ−１１６の位置にまたがる１１６個のアミノ酸配列
   と相同性が少なくとも７０％である特許請求の範囲第１
   項記載の構造遺伝子。
3. （３）示された配列参照位置において、ＤＮＡが （ａ）ｍ−５の位置にＬｙｓ （ｂ）ｍ−６の位置にＬｙｓ （ｃ）ｍ−１２の位置にＬｙｓ （ｄ）ｍ−１６の位置にＴｙｒ （ｅ）ｍ−２７の位置にＬｙｓまたはＡｒｇ （ｆ）ｍ−３０の位置にＴｈｒ （ｇ）ｍ−３３の位置にＩｌｅ （ｈ）ｍ−３４の位置にＴｙｒ （ｉ）ｍ−３６の位置にＶａｌ （ｊ）ｍ−４１の位置にＩｌｅ （ｋ）ｍ−９５の位置にＩｌｅ （ｌ）ｍ−９８の位置にＴｈｒ （ｍ）ｍ−９９の位置にＳｅｒ （ｎ）ｍ−１０５の位置にＬｙｓ、および （ｏ）ｍ−１１２の位置にＡｓｐ からなる任意の１またはそれ以上のアミノ酸を暗号化さ
   せるよう修飾された特許請求の範囲第１または２項の何
   れか１項記載の構造遺伝子。
4. （４）ＤＮＡが、そのアミノ酸参照位置ｍ−２７および
   ｍ−３０の一方または双方における変化を組み込んで修
   飾された特許請求の範囲第３項記載の構造遺伝子。
5. （５）特許請求の範囲第１〜４項の何れか１項に記載し
   た何れの修飾も有さないＤＮＡ部分を緊縮ハイブリッド
   形成条件下にハイブリッド形成し、表Ａのｎ−１の位置
   を起点としてｎ−３４８の位置にまたがるヌクレオチド
   配列を有する３４８個のヌクレオチドオリゴマーとする
   特許請求の範囲第１〜４項の何れか１項記載の構造遺伝
   子。
6. （６）特許請求の範囲第１〜４項の何れか１項に記載し
   た修飾を施す前に、ＤＮＡが表Ａのｍ−１の位置を起点
   としてｍ−１１６の位置にまたがる１１６個のアミノ酸
   を暗号化している特許請求の範囲第５項記載の構造遺伝
   子。
7. （７）エンドトキシンを暗号化しているＤＮＡが、表Ａ
   のアミノ酸位置の１を起点としてアミノ酸位置の２０５
   にまたがるアミノ酸配列を暗号化しているＤＮＡを含む
   特許請求の範囲第５項記載の構造遺伝子。
8. （８）昆虫に対する毒性活性を有するエンドトキシン蛋
   白質を暗号化したＤＮＡであって、そのＤＮＡが、表Ａ
   のアミノ酸位置の１を起点としてアミノ酸位置の２０５
   にまたがる２０５個のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸
   相同性を示す アミノ酸配列を暗号化している部分を有し、その４位の
   アミノ酸がＡｓｎ以外の任意のアミノ酸である構造遺伝
   子。
9. （９）４の位置のアミノ酸がＴｙｒである特許請求の範
   囲第８項記載の構造遺伝子。
10. （１０）ＤＮＡの調節下に作動して細菌宿主に該構造遺
    伝子の発現を起こし得る特許請求の範囲第１〜９項の何
    れか１項記載の構造遺伝子を含有している発現ベクター
    。
11. （１１）ＤＮＡの調節下に遺伝子を作動してエシェリキ
    ア・コリに該遺伝子の発現を起こし得る特許請求の範囲
    第１０項記載の発現ベクター。
12. （１２）ＤＮＡの調節下に遺伝子を作動してバチルス・
    チューリンゲンシスに該遺伝子の発現を起こし得る特許
    請求の範囲第１０項記載の発現ベクター。
13. （１３）昆虫に対する毒性活性を有するエンドトキシン
    蛋白質であって、その蛋白質が、表Ａにおけるｍ−１の
    位置を起点としてｍ−１１６の位置にまたがる１１６個
    のアミノ酸配列との相同性を実質的に示すアミノ酸配列
    を暗号化した部分を含んでおり、そのなかにあり得る欠
    失または付加とは無関係に相同的な配列にその位置番号
    を適用して、示されたアミノ酸基準位置において （ａ）ｍ−５の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ酸 （ｂ）ｍ−６の位置にＧｌｎ以外の任意の天然アミノ酸 （ｃ）ｍ−１２の位置にＧｌｕ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｄ）ｍ−１６の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｅ）ｍ−２７の位置にＧｌｕ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｆ）ｍ−３０の位置にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｇ）ｍ−３３の位置にＴｈｒ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｈ）ｍ−３４の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｉ）ｍ−３６の位置にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｊ）ｍ−４１の位置にＭｅｔ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｋ）ｍ−９５の位置にＰｈｅ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｌ）ｍ−９８の位置にＡｌａ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｍ）ｍ−９９の位置にＴｈｒ以外の任意の天然アミノ
    酸 （ｎ）ｍ−１０５の位置にＡｓｎ以外の任意の天然アミ
    ノ酸 （ｏ）ｍ−１１２の位置にＧｌｙ以外の任意の天然アミ
    ノ酸 からなる任意の１またはそれ以上のアミノ酸が存在する
    アミノ酸配列部分を含んだエンドトキシン蛋白質。
14. （１４）そのアミノ酸配列部分と、表Ａのｍ−１の位置
    を起点としてｍ−１１６にまたがる１１６個のアミノ酸
    配列との相同性が少なくとも７０％である特許請求の範
    囲第１３項記載のエンドトキシン蛋白質。
15. （１５）示された配列参照位置において （ａ）ｍ−５の位置にＬｙｓ （ｂ）ｍ−６の位置にＬｙｓ （ｃ）ｍ−１２の位置にＬｙｓ （ｄ）ｍ−１６の位置にＴｙｒ （ｅ）ｍ−２７の位置にＬｙｓまたはＡｒｇ （ｆ）ｍ−３０の位置にＴｈｒ （ｇ）ｍ−３３の位置にＩｌｅ （ｈ）ｍ−３４の位置にＴｙｒ （ｉ）ｍ−３６の位置にＶａｌ （ｊ）ｍ−４１の位置にＩｌｅ （ｋ）ｍ−９５の位置にＩｌｅ （ｌ）ｍ−９８の位置にＴｈｒ （ｍ）ｍ−９９の位置にＳｅｒ （ｎ）ｍ−１０５の位置にＬｙｓ、および （ｏ）ｍ−１１２の位置にＡｓｐ からなる任意の１またはそれ以上のアミの酸を暗号化し
    ている特許請求の範囲第１３または１４項の何れか１項
    記載のエンドトキシン蛋白質。
16. （１６）参照位置のｍ−２７およびｍ−３０のアミノ酸
    の一方または双方を変化させた特許請求の範囲第１５項
    記載のエンドトキシン蛋白質。
17. （１７）特許請求の範囲第８または９項の何れか１項記
    載の遺伝子から生産されたエンドトキシン蛋白質。
18. （１８）特許請求の範囲第８〜１１項の何れか１項記載
    の発現ベクターで細胞を形質転換またはトランスフェク
    ションし、得られた細胞を培養して目的のエンドトキシ
    ンを生産させることからなるエンドトキシン蛋白質の生
    産方法。
19. （１９）形質転換またはトランスフェクションされる細
    胞が植物細胞である特許請求の範囲第１８項記載の方法
    。
20. （２０）形質転換またはトランスフェクションされる細
    胞が細胞細胞である特許請求の範囲第１８項記載の方法
    。
21. （２１）特許請求の範囲第１〜９項の何れか１項記載の
    構造遺伝子を含有する細胞を含んでいる植物。
22. （２２）特許請求の範囲第１０〜１２項の何れか１項記
    載の発現ベクターを含有する細菌細胞。
23. （２３）表Ａのヌクレオチド位置ｎ−１からヌクレオチ
    ド位置ｎ−３４８にまたがる配列またはその突然変異変
    化を有し、ＨｉｎｄIII、ＭｓｔII，ＢｓｓｈII、Ｂａ
    ｌ I およびＭｌｕ I からなる群から選ばれた１または
    それ以上の離れて配置された制限酵素部位を有するＤＮ
    Ａを含んでおり、それらの部位は、それらＤＮＡが暗号
    化しているアミノ酸配列を変化させないＤＮＡ配列。
24. （２４）特許請求の範囲第１〜９項の何れか１項記載の
    ＤＮＡから生産された蛋白質の殺虫有効量および農業的
    に許容し得る担体をともに含有してなる殺虫組成物。
25. （２５）特許請求の範囲第１３〜１７項の何れか１項記
    載の蛋白質の殺虫有効量および農業的に許容し得る担体
    をともに含有してなる殺虫組成物。