JPH0258917B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0258917B2 JPH0258917B2 JP59005512A JP551284A JPH0258917B2 JP H0258917 B2 JPH0258917 B2 JP H0258917B2 JP 59005512 A JP59005512 A JP 59005512A JP 551284 A JP551284 A JP 551284A JP H0258917 B2 JPH0258917 B2 JP H0258917B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- wild
- region
- type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は組換え分子、その調製法、植物細胞へ
のその導入法、およびゲノム中に外来DNA配列
を含んでいる植物細胞またはその植物に関する。
更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で
発現されるDNA配列に関する。本発明に係る組
換えDNA分子は、植物の成長、栄養物としての
その品質の改良、または有用な代謝物（例えばア
ルカロイドあるいはステロイドの前駆体）の生
産、に有用なアミノ酸やポリペプチドの如き生産
物を暗号化している配列を有することをその特徴
としている。 以下に本明細書で使用する用語について説明す
る。 bomサイト 特異的にmob機能体が相互作用して
自律的DNA転移移動を開始させるDNA領域 境界配列 Ｔ−DNAの末端を含むDNA配列 広範囲宿主レプリコン 多種多様の宿主細胞に転
移（トランスフアー）され、保持され得る
DNA分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塊 クローニング 無性生殖により、１個の生物また
はDNA配列から一群の該生物またはDNA配列
を得る操作過程、または、よりわかり易く言え
ば、特定の生物またはその一部を分離し、その
サブフラクシヨンを均質な集団として増殖させ
る操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラ
スミド、フアージDNAまたはその他のDNA配
列であつて、そのDNA配列は、例えば複製、
外殻蛋白質の生産など、そのDNAの必須の生
物学的機能、あるいはプロモーターまたは結合
部位を付随的に失なうことなく、その場所で正
確にその配列を切断することのできる１個また
は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持つて
おり、また、それが導入された細胞（形質転換
された細胞）を同定確認するのに有用なマーカ
ー（例えばテトラサイクリン耐性あるいはアン
ピシリン耐性）を持つていることで特徴づけら
れる。クローニング媒体は、しばしばベクター
とも呼ばれる。 暗号配列 ポリペプチドアミノ酸配列を決定する
DNA配列 相互組込み体（コインテグレート） ２個の環状
DNA分子間の単一交叉により得られる構造体 トランス相補性 他のレプリコンに物理的に結合
していないDNA分子（レプリコン）が、その
結合していない他のレプリコンにとつて必要か
つ欠落している拡散性物質を供給することがで
きる過程 接合（コンジユゲーシヨン） 細胞同志の接触に
より、１つのタイプの細菌から他のタイプの細
菌にDNAが転移すること 乗換え 相同なDNA配列間で遺伝物質が交換す
ること 欠損置換 １個のDNA配列が除去され、その代
りとして異なつたDNA配列で置換されること 分化 ある細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得
し、更にそれを維持すること DNA配列またはDNAセグメント 隣接するペン
トースの3′位と5′位の炭素間の燐酸ジエステル
結合により互いに連結したヌクレオチド群の一
直線の配列 二重乗換 相互組込み（コインテグレート）構造
が２個の環状DNA分子に分解する過程。この
過程は遺伝情報を交換するのに利用される。こ
のDNA環状体の一方は、それによつて組換え
が生じ得る標的DNAと相同な２つの領域を持
つており、この２つの領域は、標的DNAと交
換される非相同DNA配列をはさんでいる。も
し１回目の交叉と２回目の交叉が同じDNA領
域で起ると、もとのDNA環状体が生成する。
この２回目の交叉が第２の相同領域で起ると、
２つの環状体の間で遺伝子の交換が起ることに
なる。 発現 構造遺伝子によりポリペプチドが生産され
る過程。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有
効に結合された場合、それらの構造遺伝子の発
現を調節し、統制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはfertility（生殖
力））を持つたプラスミドであつて、Ｆ因子を
持たない宿主に該プラスミドのコピーを移入す
ることのできるプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち(1)遺伝子生産物のため
の暗号配列および(2)その遺伝子が発現されるか
どうかを調節しているプロモーター領域内の配
列、から構成されているDNA配列 ゲノム 細胞またはウイルスの全DNA。これは、
まずポリペプチドを暗号化している構造遺伝
子、更にオペレーター、プロモーター、リボゾ
ームの結合配列および相互作用配列（たとえば
Shine−Dalgarno配列）を含んでいる。 遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全
て 相同的（性）組換え 相同配列を含んでいる
DNA上の２つ領域間の組換え Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グループ
の一群の自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧（selective pressure）がない
と、同一の細胞に２個のDNAが共存し得ない
こと 挿入 あるDNA配列を、別の分子のDNA配列内
に付加すること リーダー配列 5′未満から最初の構造遺伝子の先
端に至るまでのmRNA上の領域。これには構
造遺伝子の暗号配列の翻訳を開始するのに重要
な部位が含まれている。 減数分裂 はじめ4n個の染色体が、２回の連続
した分裂により生成した４個の細胞のそれぞれ
に1n個ずつ分布するようになる過程。この過
程は有性生殖に於いて重要である。 mob（授動機能体） tra機能体との組合せに於い
てのみDNAの転移を促す一連の生成物。mob
はbomサイトを含んでいるプラスミドの移動を
促すことができる。 授動（モビリゼーシヨン） 別の細胞へ転移する
ことのできないDNA分子が、他のDNA分子の
助けを借りて転移する過程 授動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持つ
ていない、別の宿主細胞へ転移するための拡散
性生成物を供給することができるプラスミド 非接合性組換えプラスミド 細胞同志の接触によ
り、それ自体では、もとの宿主細胞から他の宿
主細胞へ転移することができないDNA分子。
転移するには、他のDNA、例えばヘルパープ
ラスミドによつて供給される機能体が必要とな
る。 ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エス
テルおよび含窒素異項環塩基から構成されてい
るDNAまたはRNAの単量体単位。この塩基は
糖部分とグリコシド結合で連結しており（ペン
トースの1′位の炭素）、この塩基と糖とが結合
したものがヌクレオシドである。ヌクレオチド
の特性はこの塩基によつて決まる。DNAの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン
（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン
（“Ｔ”）である。RNAの４個の塩基はＡ、Ｇ、
Ｃおよびウラシル（“Ｕ”）である。 表現形質 発育環境と遺伝子形質との相互関係に
よつて生成する個体の観察し得る特性 プラスミド それ自体が宿主細胞中で複製され
る、完全な（無傷の）レプリコンからなる非染
色体性の２本鎖DNA配列。このプラスミドを
単細胞生物に入れると、そのプラスミドの
DNAによつて、その生物の性質が変る、即ち
形質転換される。例えば、テトラサイクリン耐
性（TcR）のための遺伝子を持つたプラスミド
により、本来はテトラサイクリンに感受性のあ
る細胞が耐性のある細胞に形質転換される。プ
ラスミドによつて形質転換された細胞を形質転
換体と呼ぶ。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−ア
ミノ基とカルボキシル基とのペプチド結合によ
り互いに連結した線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制してい
る、暗号配列の開始点より上流のDNA配列 プロモーター配列 RNAポリメラーゼが結合す
る配列であり、ポリメラーゼはそれより下流の
配列の忠実な転写を促進する。 組換えDNA分子または雑種（ハイブリツド）
DNA 少なくとも２個のヌクレオチド配列から
なり、その一方の配列は、自然界では通常第２
の配列と共存しない、その様な配列からなる雑
種のDNA配列 組換え DNA分子またはDNA分子の一部分の新
しい結合体を創製すること 相同領域 DNA別の領域に於ける配列と同じ
DNA配列を持つているDNA領域 レプリコン DNAの複製開始サイトおよび複製
を支配するのに必要な機能を指定している遺伝
子を持つた自己複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的DNA配列を認識
する酵素による２本鎖開裂によつて生じる
DNA分子 RNAポリメラーゼ DNAのRNAへの転写をつ
かさどる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるDNA配列であ
つて、それがある細胞内で発現された時、その
DNA配列を含んでいない細胞より増殖しやす
い有利性をその細胞に与えるDNA配列。細胞
を適当な選択的増殖培地に置くと、この２つの
タイプの細胞を区別することができる。通常使
用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物質
耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状DNA分子を組換えて、相
互組込みされた大きい環状体を形成させる操作
過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝
子 Ｔ−DNA 植物細胞ゲノムに安定に組込まれる
ことが見い出されているTiプラスミドの部分 Ｔ−領域 植物細胞ゲノムへ転移するDNA配列
を含んでいるTiプラスミドの部分 Tiプラスミド 感受性植物に腫瘍（クラウンガ
ル）を誘発させるための遺伝情報を含んでいる
Agrobacterium tumefaciens株に存在する大
きいプラスミド TL−DNAおよびTR−DNA オクトピンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−DNA配列、即ち
左Ｔ−DNA（TL−DNA）および右Ｔ−DNA
（TR−DNA）を含有し得る。TL−DNAはノ
パリン腫瘍細胞のＴ−DNAと共通している配
列を持つているがTR−DNAは持つていない。 tra（転移機能（体）） プラスミドに暗号化され
ている拡散性の生成物、および細胞間のDNA
転移の際に利用される作用部位の両者を指す。
例えば２つの細胞の間に橋を作るのに必要な生
成物およびDNA転移が開始する部位。 転写 構造遺伝子からmRNAが生産される過程、
または、塩基対（ベースペア）の形成により、
DNAに含まれている遺伝情報に基きそれに相
補的な塩基配列をもつRNA鎖が形成される過
程 形質転換 細胞のDNA補体（complement）に
外来性DNAが導入されることによつて生じる
遺伝的修飾 翻訳 mRNAからポリペプチドが生産される過
程、あるいは、mRNA分子に存在する遺伝情
報が、ポリペプチド合成において特定のアミノ
酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組
織中の細胞の外観が均一であること ベクター 異なつた宿主細胞間を転移するように
設計されたDNA分子 組換えDNA技術の進歩によつて、微生物の遺
伝子工学に新たな展望が開けた。もし１個の体細
胞から、完全な生物を再生することができたら、
これらの技術は多細胞真核生物にまで広がるであ
ろう。ある種の高等植物の細胞は、優れた再生能
力を有し、従つて高等生物の遺伝子工学にとつて
かつこうの材料となる。 植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外来性
DNAを植物ゲノムに導入する為の系の利用性に
ある。この様な系には、グラム陰性土壌細菌の
Agrobacterium tumefaciensが持つている腫瘍
誘起（Ti）プラスミドがある。この微生物は、
広範囲の双子葉植物の損傷組織に、クラウンガル
（crowngall、冠状コブ）と呼ばれる腫瘍性形質
転換を引き起す原因となることがわかつている。
この増殖性の腫瘍は、オパイン（opines）と呼ば
れるTiに特異な新しい代謝物を合成する。この
形質転換は、分子レベルでみると、Tiプラスミ
ドの実体のはつきりわかつているＴ−DNA（転移
DNA）フラグメントが植物細胞ゲノムに転移し
て安定に組込まれたことによつて起る。換言すれ
ば、クラウンガル腫瘍は、その染色体DNAに、
腫脹セルラインをもたらしたTiプラスミド中の
DNA配列と相同のＴ−DNAと呼ばれるDNAセ
グメントを含んでいる。あらゆる場合に於いて、
このＴ−DNAは、連続した一連のTiプラスミド
DNAに相当しており、また、これと共直線性で
ある。従つてこれはＴ−領域と呼ばれる。 Tiプラスミドはクラウンガル細胞で合成され
たオパインのタイプによつて分類される。クラウ
ンガル細胞でノパリン［Ｎ−α−（１，３−ジカ
ルボキシプロピル）−Ｌ−アルギニン］の合成を
惹起させるAgrobacterium株はノパリン株と呼
ばれ、オクトピン［Ｎ−α−（Ｎ−１−カルボキ
シエチル）−Ｌ−アルギニン］を合成するものは
オクトピン株と呼ばれる。これらが最も普通に用
いられるAgrobacterium株である。 植物の遺伝手術にＴ−DNAをベクターとして
使用する試みがモデル実験で行なわれた。この実
験では、インビボにおいて、Agrobacterium
T37株のTiプラスミドからのＴ−DNAの右側境
界部の近くに14kb細菌性トランスポゾン
（transposon）Tn7が挿入された。すると、この
Tiプラスミドを持つているアグロバクテリアに
よつて惹起される腫瘍中のノパリン合成が消滅し
た。更に、サザーン・ブロツテイング・ハイブリ
デイゼーシヨンの結果、その様な挿入を行なわな
ければ正常であるＴ−DNA配列の一部分として、
この腫瘍の染色体DNA中に全Tn7が存在するこ
とがわかつた（Hernalsteensら、Nature287
（1980）、654−656；Holstersら、Mol.Gen.
Genet.185（1982）、283−289）。この様に、23kbT
−DNAに14kbDNAフラグメントを導入しても、
23kbT−DNAの植物細胞ゲノムへの転移能力に
変化は見られなかつた。 ノパリン株、Agrobacterium T37のTiプラス
ミドのＴ−DNAの境界部は非常に正確に調べら
れている。これは全ノパリンTiプラスミドの極
く一部、約23kbに過ぎない。更に、このＴ−
DNAの境界部は知られている：即ち、このＴ−
DNAの境界部を決めているヌクレオチド配列が
調べられ、ノパリンTiプラスミドの同じ領域と
比較された（Zambryski、Science209（1980）、
1385−1391；Zambryskiら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1982）、361−370）。このＴ−領域の境界部が、
Ｔ−DNAの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関
係している様である。 DNAを植物細胞へ転移させる為のベクターと
してTiプラスミドを使用するには、転移した
DNAの境界部を決めているＴ−DNA配列を知る
ことが基本的に必要である。そうすれば、外来性
DNAをこの境界内に挿入し、確実に植物細胞ゲ
ノムへ転移させることができる。更に、この系を
利用しようとすれば、形質転換された植物細胞
が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、
正常であるということが重要である。Ｔ−DNA
転移の後、正常細胞を生産するには、Ｔ−DNA
自体によつて暗号化されている機能を知る必要が
ある。従つて、どの領域が腫瘍表現形質に関係し
ているか調べるために、TiプラスミドのＴ−領
域の撤底的な遺伝子分析が行なわれた。 Ｔ−DNAは、クラウンガル表現形質の原因と
なる機能体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ
−DNAの特定の領域に局在化している
（Leemansら、EMBO J.1（1982）、147−152；
Willmitzerら、EMBO J.1（1982）、139−146）。
一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質を支配
している少なくとも４つの遺伝子が存在してい
る。これらの遺伝子の突然変異体（ミユータン
ト）は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転
換組織を形成させることができる。この後者の成
果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織中で発現さ
せる為にDNAを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。 最近、完全な正常植物に再生することができる
形質転換新芽を誘導するTiプラスミド変異体が
みつかつた。これらの植物は繁殖力が旺盛であ
り、減数分裂によつてＴ−DNA特異配列を伝達
することさえした：即ち、子孫の植物もＴ−
DNA特異配列を含んでいた（Ottenら、Mol.
Gen.Genet.183（1981）、209−213）。しかし、こ
の形質転換植物組織は、その染色体DNA中に、
腫瘍表現形質を支配しているＴ−DNA領域が除
去される大がかりな欠損が発生したことにより、
著しく小さくなつたＴ−DNAを含んでいた。こ
の欠損が当初の形質転換時に起つたのか、新芽の
形成をもたらすその後の過程で起つたのかは不明
である。 Tiプラスミドは大きく（200kb）、そのTiプラ
スミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子
が植物の形質転換に関係している。従つて、Ｔ−
領域内の適切な場合に特殊なエンドヌクレアーゼ
認識サイトを有し、Ｔ−DNAを植物細胞ゲノム
に転移させて安定に挿入するのに必要な全ての機
能を持つたTiプラスミド由来の小型のクローニ
ングベクターを組み立てることは不可能である。
所望のDNAフラグメントをTiプラスミドのＴ−
領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為の
既知の方法の１つは、Escherichia coli（大腸菌）
におけると同様、Agrobacteriumにおいても複
製することができ、Ｔ−DNAの所望の制限フラ
グメントを含んでいるクローニングプラスミドを
組み立てることである。この様なクローニングベ
クターは「中間ベクター」と命名された。この様
な中間ベクターは、Ｔ−領域によつて暗号化され
ている機能を分析するのに使用された
（Leemansら、J.Mol.Appln.Genet.1（1981）、149
−164）。 本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノム
へ導入する方法に関するものである。本発明の１
つの目的は所望のあらゆる遺伝子（群）を導入す
ることのできる改良されたアクセプターTiプラ
スミドを提供することにある。導入される所望の
遺伝子（群）は、そのアクセプターTiプラスミ
ドの相当する領域と相同の領域を持つた新規な中
間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発
明の目的の１つである。 所望の遺伝子（群）のアクセプターTiプラス
ミドへの導入は、Agrobacteriumに保持されて
いるアクセプターTiプラスミドと中間クローニ
ングベクターの２つの相同DNAセグメントの間
で起る単一乗換えによつて達成される。この中間
クローニングベクターは、ヘルパープラスミドを
使つて、それが増殖するEscherichia coliから
Agrobacteriumに授動される。この様なヘルパ
ープラスミドおよび授動のための機能は知られて
いる（Fibbeganら、Mol.Gen.Genet.185（1982）、
344−351；Figurskiら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA76（1979）；Dittaら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA77（1980）、7347）。 Agrobacteriumでの単一乗換えの結果、ハイ
ブリツドTiプラスミドベクターが得られる。こ
の様なハイブリツドTiプラスミドも本発明の目
的の１つである。 Agrobacteriumに保持されたこのハイブリツ
ドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物と
いう）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所
望の遺伝子生成物の発現についてスクリーニング
する。植物細胞をベクター組成物で感染させて形
質転換植物細胞を調製するこの方法、その形質転
換された植物細胞、およびそれから発生した植物
を提供することも本発明の目的である。この技法
はAgrobacteriumの植物転移性のプラスミド全
てに適用することができる。 以下に添付の図面について詳細に説明する。 第１図は、境界配列１および２を除き、Ｔ−領
域の内部部分を除去して得られる本発明のアクセ
プターTiプラスミドの１態様を示している。こ
の境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込
むのに必須である。境界配列１と２の間の領域３
が、植物に転移されるであろうDNAセグメント
である。このアクセプターTiプラスミドは、中
間クローニングベクターを単一乗換えによつて組
込ますことを可能にしている中間クローニングベ
クター内のDNA配列の少なくとも一部と相同の
DNA配列を持つたDNAセグメント３を含んでい
る。Tiプラスミド領域４は、Agrobacteriumに
よつてＴ−領域が植物細胞ゲノムに転移するのに
必要な機能を暗号化している。この領域は、vir
−領域と呼ばれる。 第２図は、単一乗換えによつて第１図のアクセ
プターTiプラスミドに挿入される本発明の中間
クローニングベクターを示している。このベクタ
ーは、所望の単一乗換えを可能にするアクセプタ
ーTiプラスミドのDNAセグメント３の少なくと
も一部と相同なDNA配列を持つたクローニング
媒体DNAセグメント３′を含んでいる。更に、こ
の中間クローニングベクターは、その天然のプロ
モーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群５
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に
植物の遺伝子を使用することができる。それは、
他のものに比較して発現され易いと思われるから
である。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝
子を挿入することができる。この中間クローニン
グベクターは選択マーカー遺伝子６を含んでいて
もよい。この遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子
の発現を可能にするプロモーター配列を含んでい
なければならない。このマーカー遺伝子を含んで
いる植物細胞は、それを含んでいない細胞より、
成長の選択有利性を持つていなければならない。
何故なら、この様にして、このマーカー遺伝子を
含んでいるDNAによつて形質転換された植物細
胞を、非形質転換細胞と区別することができるか
らである。 第３図は、第２図の中間クローニングベクター
と類似の、第１図のアクセプターTiプラスミド
に単一乗換えによつて挿入される本発明に係る中
間クローニングベクターのもう１つの態様を示し
ている。これは、クローニング媒体DNAセグメ
ント３′、所望の遺伝子の統制のとれた発現を可
能にする外来性プロモーター配列８、および、所
望により、マーカー遺伝子６を含んでいる。 第４図は、第１図のアクセプターTiプラスミ
ドおよび第２図並びに第３図の中間クローニング
ベクターからの、単一乗換えによる本発明に係る
ハイブリツドTiプラスミドベクターの調製を示
す模式図である。 第５図は、E.coliからアクセプターTiプラスミ
ドを含んでいるAgrobacteriumへの、中間クロ
ーニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程を
概略したものである。第１段階は、中間クローニ
ングベクターを含んでいるE.coli株(1)と、その後
のAgrobacteriumとの接合の為の２つのヘルパ
ープラスミドを含んでいるもう１つのE.coli株と
の接合である。１方のヘルパープラスミドはプラ
スミド転移に重要なDNA配列（tra）を含んでお
り、他方のヘルパープラスミドは授動に重要な配
列（mob）を含んでいる。接合によつてこれらの
ヘルパープラスミドがE.coli株(1)に導入される
と、そこに含まれている中間クローニングベクタ
ーが他の細菌株へ転移することができる様にな
る。traおよびmobヘルパープラスミドは、中間
クローニングベクターが持つている抗生物質耐性
マーカー（Abr1）とは異なるマーカー、Abr2お
よびAbr3をそれぞれ持つている。従つて、全て
のプラスミドが存在するかどうかを選択培地上で
モニターすることができる。こうして授動株(3)が
得られる。この授動株(3)を、第１図アクセプター
Tiプラスミドを含んでいるA.tumefaciens株(4)と
接合させ、中間クローニングベクターの抗生物質
耐性マーカーで選択する。中間クローニングベク
ターはAgrobacterium中で複製できないので、
受容アクセプターTiプラスミドと相互組込み体
を形成した場合にのみ、保持されることができ
る。Agrobacterium中のこの相互組込み構造体
(5)が、DNAを植物細胞ゲノムに転移させるのに
使用される最終的なハイブリツドTiプラスミド
である。 第６図は、第１図に示したものと同類のモデル
アクセプターTiプラスミド（タイプＡ）の組み
立てを示している。ここでは、Tiプラスミドと、
このものとTiプラスミドの一部と置き換わる
DNA配列を含んでいる別のプラスミドとの間で、
二重乗換えが起る。より具体的に述べると、小さ
い方のプラスミドはクローニング媒体３の中にＴ
−領域の境界配列１，２を含んでいる。二重乗換
えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去され、代
つてクローニング媒体で置き換えられる。得られ
たアクセプターTiプラスミドＡは、境界配列１，
２の間に含まれているDNAを植物細胞ゲノムに
転移させることができる。得られた、形質転換さ
れたDNAは、TiプラスミドＡでは腫瘍の増殖を
支配している遺伝子が除去されているので腫瘍性
のクラウンガル組織をつくらない。Tiプラスミ
ドＡは、クローニング媒体３と相同性を有するあ
らゆる中間クローニングベクター用の極めて普遍
的なアクセプターTiプラスミドである。このク
ローニング媒体３は通常のプラスミドでよく、例
えばpBR322またはその誘導体などによつて置き
換えることができる。 第７図は、中間クローニングベクターをE.coli
宿主細胞中で組みたてる工程を模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトR1に
囲まれた所望の遺伝子５および制限エンドヌクレ
アーゼサイトR2で囲まれた選択し得るマーカー
遺伝子６を、酵素R1およびR2の為のそれぞれ１
つの制限サイトを含んでいるクローニング媒体
３′に挿入する。３つの分子を全て制限酵素R1お
よび／またはR2で消化し、DNAリガーゼを用い
てライゲーシヨン（結紮）して中間クローニング
ベクターを形成させる。このクローニング媒体
３′は、細菌遺伝子学の選択マーカーとして使用
する抗生物質耐性（Abr1）を暗号化しているも
う１つのDNA配列を含んでいなければならない。
所望の遺伝子５はその天然のプロモーターまたは
第２図および第３図に概説した外来性プロモータ
ーの支配下にある。 第８図は本発明に係るアクセプターTiプラス
ミド（タイプＢ）のもう１つの具体的態様を組み
立てるための模式図である。この態様では、境界
配例１および２のすぐ外側のTi配列に相同の、
それぞれDNA配列９および１０を含んでいるク
ローニング媒体とTiプラスミドとの間で二重乗
換えが起る。この二重乗換えによつて、境界配列
１および２を含んでいるＴ−領域Ｔ全体が削除さ
れ、それがクローニング媒体３で置き換えられ
る。TiプラスミドＢは、境界配列１および２の
間にクローンされた所望の遺伝子を含有している
中間クローニングベクターのためのアクセプター
である（第９図参照）。 第９図は、第８図のアクセプターTiプラスミ
ドＢに単一乗換えによつて挿入される本発明の中
間クローニングベクターを例示している。これ
は、所望の遺伝子５の両端に位置する境界配列１
および２を含んでいる。これはまた、２つのプラ
スミド間の相同的組換えを可能にするため、アク
セプターTiプラスミドＢ中のクローニング媒体
配列と少なくとも一部が相同であるクローニング
媒体配列３′をも含んでいる。 第１０図は、第８図のアクセプターTiプラス
ミドおよびそれに対応する第９図の中間クローニ
ングベクターから、本発明のハイブリツドTiプ
ラスミドベクターの組み立てを示す模式図であ
る。単一乗換えによつて第９図の中間クローニン
グベクターが第８図のアクセプターTiプラスミ
ドＢに導入される。 第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例
示するものである。 第１１図は、5.2kb HindフラグメントAcgB
のpBR322への挿入を示している（Zambryski
ら、Science209（1980）、1385−1391）。このフラ
グメントAcgBはノパリンTiプラスミドの左右の
境界領域を含んでいる。このクローンpAcgBは、
第６図に示した「Ａ−タイプ」のアクセプタープ
ラスミド、pGV３８５０の組み立てに使用され
る。野生型Tiプラスミドの左右の境界領域を含
んでいるこのクローンされた制限フラグメントを
使つて、クローンpAcgBと類似のクローンを得
ることができることは、当業者には容易に理解さ
れるはずである。 第１２図はノパリンTiプラスミドpGV３８３
９のＴ−領域を示している。Hind制限エンド
ヌクレアーゼサイトはＨで示してある。変異した
Hindフラグメント１９は（１９′）で示してあ
る。カナマイシンまたはネオマイシン耐性を付与
するアセチルホスホトランスフエラーゼ遺伝子は
aptで表わし、これは黒くぬりつぶした部分に存
在している。Ｔ領域の境界は矢印で示してある。
ノパリンシンターゼ（synthase）遺伝子はnosで
表わした。数値は、Depickerら（plasmid、３
（1980）、193−211）の方法による制限フラグメン
トの大きさを表わしている。TiプラスミドpGV
３８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの
文献に従つて組み立てることができる。 第１３図は、アクセプターTiプラスミドpGV
３８５０の組み立てを示している。プラスミド
pBR３２２−pAcgB（第１１図）は、線状化した
形で描いてある。pBR３２２の配列は斜線を入
れた領域で示し、pBR３２２のアンピシリン耐
性遺伝子はApRで示した。第１２図に示したpGV
３８３９のＴ−領域の一部がここに描かれてい
る：pAcgBとの相同的組換えに関与するHind
フラグメント10および23およびapt遺伝子が含ま
れている。二重乗換えによつてpGV３８５０お
よび失われたapt遺伝子を含むもう１つのレプリ
コンが組み立てられる。 第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間ク
ローニングベクターpGV７００の組み立てを模
式的に示したものである。制限エンドヌクレアー
ゼサイトを示すのに以下の略号を用いた：Ｂ＝
BamH、Bg＝Bgl、Ｅ＝EcoR、Ｈ＝Hind
、Ｓ＝Sal、Sm＝Sma。抗生物質耐性を
示すのに以下の略号を用いた：Ap＝アンピシリ
ン、Cm＝クロラムフエニコール、Sm＝ストレ
プトマイシン、Tc＝テトラサイクリン。TL−
DNAで示した図の下部の数値は、この領域の
RNA転写体を示している（Willmitzerら、
EMBOJ.1（1982）、139−146）。 第１５図は中間クローニングベクターpGV７
５０の構造を示している。その組み立ては実施例
２に記載した。制限エンドヌクレアーゼサイト
は、キロ塩基対（kb）の数で表わしたその相対
的位置で示した。Pstサイトは示していないが
KmR／NmR領域に３つ、CbR遺伝子に１つ存在す
る。左右の境界領域も示してある。pGV７５０
の組み立てに使用されたBgl／BamHサイト
およびHpa／Smaサイトが示されているが、
これはpGV７５０には存在しない。影をつけた
領域はTL−DNAに、黒い領域はKmR／NmR領
域に、白ぬき部分は隣接するTiプラスミド配列
に、そして線はクローニング媒体pBR３２５に
それぞれ相当する。その他の略号は以下の意味を
有する：Ocs＝オクトピンシンターゼ、CmR＝ク
ロラムフエニコール耐性、CbR＝カルベニシリン
（アンピシリン類似体）耐性、KmR／NmR＝カナ
マイシン耐性／ネオマイシン耐性。 第１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベク
ターpGV７４５の組み立てを示している。pGV
７４５は、第８図に示した「Ｂタイプ」アクセプ
タープラスミド、pGV２２６０の組み立てに使
用される。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下
の略号で示した：Ｂ＝BamH、Ｈ＝Hind、
Ｒ＝EcoR。アンピシリン耐性遺伝子は、ApR
で示した。斜線を施した領域はオクトピンTiプ
ラスミドのＴ−DNA領域の左側と相同のDNA
を、白ぬき領域はオクトピンTiプラスミドのＴ
−DNA領域の右側と相同のDNAを示している。
出発物質であるプラスミドpGV０２１９および
pGV０１２０についての物理的位置および記述
は、De VosらのPlasmid6（1981）、249−253にみ
られる。 第１７図はアクセプタープラスミドpGV２２
６０の組み立てを示している。pGV２２１７中
の欠損置換が、ネオマイシンとカナマイシンに対
する耐性を付与するアセチルホスホトランスフエ
ラーゼ遺伝子（aptで表わしてある）を含んでい
る黒色部分で示してある。中間ベクターpGV７
４５（第１６図参照）は線状化して描いてある。
これは第１６図に示したpGV７４５のHindサ
イトで開裂したものである。pBR３２２の配列
は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性遺
伝子はApRで示してある。二重乗換えによつて、
pGV２２６０が組み立てられ、apt遺伝子が失わ
れる。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略
号で示した：Ｂ＝BamH、Ｈ＝Hind、Ｒ＝
EcoR。 第１８図は、ノパリンシンターゼ遺伝子
（nos）のプロモーターの下流の遺伝子を発現す
るためのプラスミドpLGV２３８１の組み立てを
示している。５′および３′はそれぞれ転写開始と
転写終了を意味し、ATGおよびTAAは翻訳開始
および翻訳終了に使われるコドンを表わしてい
る。太線はnosプロモーター領域、白ぬき部分は
nos暗号領域を示している。ApRはアンピシリン
耐性、KmRはカナマイシン耐性を示している。 第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ
（ocs）暗号配列を含んでいるプラスミドpAGV４
０の組み立て、およびプラスミドpLGV２３８１
（第１８図参照）中nosプロモーターの後部への
その挿入を示している。太線はプロモーター領
域、白ぬき部分はocs暗号領域を示している。そ
の他の記号は第１８図と同じである。 第２０図は、ノパリンシンターゼ（nos）遺伝
子のプロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列
およびオクトピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融
合した後の同じ領域の周囲のヌクレオチド配例を
示している。融合点は星印（＊）で示した。いく
つかの制限エンドヌクレアーゼサイト、即ち、
BamH、Hind、およびSacも示してある。
５′および３′は転写開始および終了を意味する。
ATGは翻訳に使われる最切のコドン、TAAは翻
訳に使われる終了コドンを表わしている。白ぬき
の大きい矢印はノパリン遺伝子の暗号化領域、縞
の入つた矢印はオクトピン遺伝子を表わしてい
る。 以下に本発明を詳細に説明する。 第１図にアクセプターTiプラスミドを簡単に
図式化して示した。このアクセプターTiプラス
ミドは、野生型腫瘍誘起Tiプラスミドの２つの
境界配列１，２または領域を含んでいる。この境
界配列は、TiプラスミドのＴ−領域を植物細胞
ゲノムへ組込むのに必須である。換言すれば、あ
らゆるDNA配列３またはＴ−領域を、これらの
配列間に存在している植物細胞ゲノムに組込むの
にこの境界配列が絶対に必要である。 このアクセプターTiプラスミドDNA配列３に
は、第２図および第３図に示した中間クローニン
グベクターのDNA配列３′の少なくとも１部と相
同のDNAセグメントが含まれている。この相同
性は、中間クローニングベクターとアクセプター
Tiプラスミドが単一乗換え（相同性組換え）に
よつて相互組込みするのに必要である。相互組込
み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の長
さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、
通常１〜14kbの領域が使われる（Leemansら、
J.Mol.Appl.Genet.1（1981）、149−164）。 アクセプターTiプラスミドは更に、
AgrobacteriumによつてTiプラスミドのＴ−領
域が植物細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列４
を含んでいる。 この様なアクセプターTiプラスミドの組み立
ておよび第２図および第３図に示した中間クロー
ニングベクターとのその相互組込みについて、第
４図を参照しながら以下に詳述する。 第２図および第３図に、発現しようとする、即
ち、植物細胞中でプロモーターの支配下に転写さ
れ、翻訳される所望の原核性または真核性遺伝子
をクローンするための中間クローニングベクター
を簡略化した図で示した。これらの中間クローニ
ングベクターは、アクセプターTiプラスミドの
DNAセグメント３の少なくとも一部と相同であ
り、従つて単一乗換えを可能にするDNA配列を
含んでいるクローニング媒体からのDNAセグメ
ント３′を含んでいる。さらに、この中間クロー
ニングベクターは、その天然のあるいは外来性の
プロモーター配列を含む少なくとも１つの所望の
遺伝子５，７を含んでいる。このプロモーター配
列によつて、挿入された遺伝子配列の発現が可能
である。所望の挿入遺伝子（群）の発現を調整す
るために、外来性のプロモーター配列（仕立て上
げたプロモーター）を使うことも可能である。 調整の各種の例として、以下のものを挙げるこ
とができる：(i)組織に特異な発現、即ち、葉、
根、茎、花など、(ii)発現レベル、即ち、発現の強
弱、(iii)誘導性発現、即ち、温度、光または添加さ
れた化学的因子による発現など。 中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の
例としては、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成
をコントロールして植物の栄養価や成長を改良す
る遺伝情報を持つたDNAフラグメントまたは配
列、外部から病原物質に対する保護、例えば病原
生物またはストレスとなる環境因子に対する耐
性、を付与する生産物の合成をコントロールする
遺伝情報を持つたDNAフラグメントまたは配列、
遺伝子工学によつて改良しようとする植物の基本
的な過程に情報を与える生産物の合成をコントロ
ールする遺伝情報を持つたDNAフラグメントま
たは配列など。 第２図および第３図は、選択可能なマーカー遺
伝子６を含んでいることもある中間クローニング
ベクターを表わしている。選択可能なマーカー遺
伝子としては、例えば抗生物質または有毒な類似
物質（例えばアミノ酸類縁体）を暗号化している
遺伝子、受容宿主細胞の欠損を補う遺伝子などが
挙げられる。 第４図は、ハイブリツドTiプラスミドベクタ
ーの組み立てに関与する構成を示しており、第５
図は、そのハイブリツドTiプラスミドベクター
を保持しているAgrobacteriumの分離に関与す
る実際の接合工程を表わしている。この工程は、
中間クローニングベクターがE.coli中で組み立て
られるので、この中間クローニングベクターを
Agrobacterium中のアクセプタープラスミドに
転移させるのに必要である。 Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されて
いる改良Tiプラスミドを調製するのに用いられ
る既知の転移手法は多数の工程からなつている。
通常、大抵のDNA組換え操作は、特別に設計さ
れたクローニング媒体、例えばpBR３２２
（Boliver、Gene2（1977）、75−93）中で行なわれ
る。しかしこのクローニング媒体は、それ自体
Agrobacteriumに移動することができない。こ
の問題は、既知の方法では次の様にして解決され
ている： (a) Agrobacterium中でも複製し得る別の広範
囲宿主用クローニング媒体、例えばmini−Sa
プラスミド（Leemansら、Gene19（1982）、361
−364）でpBRクローニング媒体配列を置換す
る。この操作はE.coli中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。 (b) 所望のDNAを含有している中間クローニン
グベクターを保持したE.coli株と、
Agrobacterium中では複製できないがそれ自
体および他のDNAのAgrobacteriumへの転移
を仲介することのできるヘルパープラスミドを
保持した別のE.coli株との接合。 (c) 工程(b)で得られるE.coliとTiプラスミドを含
んでいるAgrobacteriumの接合。ヘルパープ
ラスミドは失われる。 (d) 中間クローニングベクターは、独立したレプ
リコンとしてAgrobacterium中で複製し、存
在することができるので、工程(c)で得られた接
合体は、中間クローニングベクターとTiプラ
スミドとの相互組込み体を含んでいる細胞、ま
たは中間クローニングベクターおよび相互組込
みが起らなかつたTiプラスミドを含んでいる
別の細胞の混合物である。相互組込み体だけを
特異的に分離する為に、Tiプラスミドのない
別のAgrobacterium株との接合をもう一度行
なわなければならない。この転移は、Tiプラ
スミド自体によつて暗号化されている機能によ
つて仲介される。この第２のAgrobacterium
株への中間クローニングベクターの転移は、
Tiプラスミドとの相互組込み体の形でのみ行
なわれる。 (e) 所望の置換を行なつた最終的な改良Tiプラ
スミドを得るために、第２回目の乗換えが行な
われる（Leemansら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1981）、149−164）。 僅かにもう一つの既知の方法は、上記工程(d)に
おいて、中間クローニングベクターと適合しない
別のプラスミドをAgrobacteriumに導入するこ
とを除けば、上の方法と基本的に同じである。こ
の場合、独立したレプリコンのままでいる中間ク
ローニングベクターは全て失われるので、相互組
込み（単一乗換え）を選択することができる
（Matzkeら、J.Mol.Appl.Genet.1（1981）、39−
49）。 ここに本発明者らは、Agrobacteriumのアク
セプターTiプラスミドに中間クローニングベク
ターを導入する為の、新規な非常に簡素化された
方法を提供するものである。簡単に言えば、この
方法は、多くの通常使用されているクローニング
プラスミド（例えばpBR３２２）を直接
Agrobacteriumに転移させるのに、E.coliのヘル
パープラスミドが役立つということを見い出した
事実に基づいている。これらのプラスミドは、い
づれもAgrobacterium中では複製できないので、
アクセプターTiプラスミドと相互組込みし得る
ものだけが保持されることになる。さらに、本発
明者らは、Agrobacterium中のこの相互組込み
体を、植物細胞への感染の為の直接のベクター組
成物として使用するのである。この様にして、本
発明者らは前記の工程(d)および(e)を省略した。こ
れによつて、改良ハイブリツドTiプラスミドを
組み立てるのに要する時間が減少し、可能な組み
立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞ゲノ
ムへDNAを転移させる為のベクターとしてこの
アクセプターTiプラスミドを使用できる可能性
が著しく高まつたのである。 即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプタ
ーTiプラスミドへの中間クローニングベクター
の導入は２工程で行なわれる。先づ、中間クロー
ニングベクターを持つたE.coli株(1)を、この中間
クローニングベクターのAgrobacteriumへの授
動を促す２つのプラスミドを持つた別のE.coli株
(2)と接合させる。これらのヘルパープラスミドの
代表的な、そして好ましい例は、mob機能を含ん
だＲ６４drd１１およびtra機能を含んだpG２８
である（Finneganら、Mol.Gen.Genet.185
（1982）、344−351）。中間クローニングベクター
のクローニング媒体上のbomサイト（Warrenら、
Nature274（1978）、259−261）が他の２つのプラ
スミドによつて暗号化されている機能体によつて
認識され、転移できる様になる。全てのプラスミ
ドは、その存在を検出するために抗生物質耐性マ
ーカーを含んでいるのが好ましい。次いで、得ら
れたE.coli株、即ち３つのプラスミド全てを保持
している授動株(3)を、中間クローニングベクター
と相同の領域を持つたアクセプターTiプラスミ
ドを保持しているAgrobacteriumと接合させる。
中間クローニングベクターとアクセプターTiプ
ラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどうか
は、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マ
ーカーについての選択によつて検出できる。 第６図は、第１図のアクセプターTiプラスミ
ドの組み立てに用いられたDNA分子を模式的に
示したものである。本明細書では、このプラスミ
ドをアクセプターTiプラスミド（タイプＡ）と
呼び、他のアクセプターTiプラスミド（タイプ
Ｂ）と区別することにする（第８図参照）。この
組み立てには、Tiプラスミドと、クローニング
媒体３中に境界配列１および２を持つているもう
１つのプラスミドとの間に二重乗換えが起ること
が必要である。図に示した様に、クローニング媒
体配列３は左側の境界配列１と右側の境界配列２
との間にある。このDNA鎖の正しい極性を示す
ために、これを環上に描くことができる。しか
し、二重乗換えに使用される相同領域を示すため
には、この環を開裂させて図示した。これは理解
を助ける為のやり方として重要であり、第８図に
於けるアクセプターTiプラスミドＢの組み立て
に於いても用いられている。即ち、もし境界配列
１および２が、単にクローニング媒体配列３内に
挿入されたのなら、二重乗換えによつて、Ｔ−領
域が削除されてはいるがこの境界配列１および２
の間のクローニング媒体配列のないTiプラスミ
ドが得られることになる。第６図に示した様に、
二重乗換えによつて、境界配列１および２の間に
もとのＴ−領域を持つた環状DNA分子が生成す
る。これはレプリコンではないので消失する運命
にある。この二重乗換えが起つたかどうかは、例
えばTiプラスミドのＴ−領域内に含まれる抗生
物質マーカーの欠落について選択したり、クロー
ニング媒体配列３内の抗生物質耐性マーカーにつ
いて選択したりして、遺伝子学的に選択すること
ができる。 第７図、第２図および第３図の中間クローニン
グベクターの組み立てを示す模式図である。制限
エンドヌクレアーゼサイトR1またはR2でそれぞ
れ囲まれた所望の遺伝子５および選択可能なマー
カー遺伝子６が、酵素R1およびR2の為の特異な
制限サイトを含んでいるクローニング媒体配列
３′に、これら全ての分子の消化およびライゲー
シヨンによつて挿入される。得られた組換え
DNA分子は、E.coli宿主細胞を形質転換するの
に使用され、その形質転換体は、クローニング媒
体配列３′の抗生物質耐性マーカー（AbR1）で選
択される。 第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセ
プターTiプラスミドＢを組み立てるのに使用さ
れるDNA分子の模式図である。この場合は、境
界配列１および２のすぐ外側に位置するDNA配
列９および１０の間にクローニング媒体配列３を
含んでいるプラスミドとTiプラスミドとの間で
二重乗換えが起る。乗換えに使用される相同領域
を示す為に、小さい方のプラスミドは開裂してあ
る（第６図と同様）。二重乗換えによる生成物は、
アクセプターTiプラスミドＢと、もとのTiプラ
スミドからのＴ−領域およびDNA配列２，１０，
９および１を含んでいる、消失するもう１つの環
状DNA分子である。遺伝子学的選択は第６図に
ついて記載したものと同様にして行なうことがで
きる。 第９図は、第８図のアクセプターTiプラスミ
ドＢと組み合せて使用される中間クローニングベ
クターの模式図である。ここでは、所望の遺伝子
５は、クローニング媒体配列３′中に含まれてい
る境界配列１および２の間に挿入される。 第１０図は、単一乗換により第９図の中間クロ
ーニングベクターがどの様にしてアクセプター
TiプラスミドＢに挿入されるかを模式的に示し
ている。この場合、中間クローニングベクターの
クローニング媒体配列３′の抗生物質耐性マーカ
ーで選択する。２つのプラスミドの間の相互組込
みの結果としてのハイブリツドTiプラスミドを
確実に見つけることができる。こうして境界配列
１および２内に含まれている所望の遺伝子を持つ
たハイブリツドTiプラスミドが得られる。この
様にして組み立てられたハイブリツドプラスミド
は、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリツ
ドTiプラスミド中の配列３および３′の様な直接
反復の配列を含有しておらず、従つて、分子内組
換えの結果として、ハイブリツドベクターまたは
植物細胞ゲノム中に導入されたDNAが不安定に
なる可能性が避けられる。 本発明者らの研究室で行なつた実験結果から、
第９図の中間ベクターの組み立てには、境界配列
１および２の両者を所有する必要はないことがわ
かつた（未発表）。しかし、所望のDNAを植物ゲ
ノムに組込むには、少なくとも右側の境界配列２
（第１図および第９図参照）を有すことが必要十
分条件である。 AgrobacteriumのTiプラスミド、例えばノパ
リンまたはオクトピンTiプラスミドの制限エン
ドヌクレアーゼ地図についての知見（Depicker
ら、Plasmid3（1980）、193−211；De Vosら、
Plasmid6（1981）、249−253）およびＴ−DNA境
界配列を含んでいる制限フラグメントについての
知見（Zambryskiら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1982）、361−370；De Beuckeleerら、Mol.
Gen.Genet.183（1981）、283−288）から、当業者
であれば誰れでも、本発明方法に従つてアクセプ
ターTiプラスミドを組み立てることができる。
この他、通常の組換えDNA技術および基礎的な
細菌の遺伝子操作を実施できる能力が要求される
に過ぎない。本発明は、ハイブリツドTiプラス
ミドベクターを組み立てるのに有効であることが
わかつた本明細書に記載したアクセプターTiプ
ラスミドを具体的に提案している点でユニークな
ものである。更に、これらのアクセプターTiプ
ラスミドは、遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入する
ための方法の一部を構成する様に設計されたもの
である。 既述したアクセプターTiプラスミド、中間ク
ローニングベクター、ハイブリツドTiプラスミ
ドベクターおよびベクター組成物を更に例示し、
植物細胞ゲノムへ組込まれた外来性遺伝子の発現
を示す形質転換植物細胞および植物を提供するの
にこのベクター組成物が有効であることを例証す
るために、以下に実施例を挙げる。 実施例 １ アクセプターTiプラスミドpGV３８５０（Ａ
タイプ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Agrobacterium tumefaciens（野生型
Agrobacterium由来のリフアピシン耐性株C58C1
およびクロラムフエニコール−エリスロマイシン
耐性株C58C1） Tiプラスミド＝pGV３８３９ 第１１図のプラスミド＝pAcgB TiプラスミドpGV３８３９はノパリンプラス
ミドpTi C58trac（pGV３１００；Holstersら、
Plasmid3（1980）、212−230）から組み立てる。
これはＴ−領域の中央近くに欠失置換突然変異体
（ミユータント）を含んでいる：即ち、Hindフ
ラグメント19の内部のSmaフラグメント24
（Depickerら、Plasmid3（1980）、193−211）は、
Tn5のapt（アセチルホスホトランスフエラーゼ）
遺伝子を含んでいるpKC7のHindフラグメント
（Raoら、Gene7（1979、79−82）で置換されてい
る。この遺伝子はアミノグリコシドネオマイシン
およびカナマイシンに対する耐性を暗号化してい
る。pGV３８３９のＴ−領域の制限地図を第１
２図に示す。 プラスミドpAcgBは、Ｔ−DNAの境界部だけ
を含んでいるpBR３２２中のAcgBの挿入体であ
る（第１１図参照）。この境界部はＴ−DNAの末
端部として定義され、これら領域は、Ｔ−DNA
の植物細胞ゲノムへの安定な組込みに役割を果た
す。このクローンの起源および分析については詳
しく記載されている（Zambryskiら、Science209
（1980）、1385−1391）。このクローンは、形質転
換されたタバコDNAからＴ−DNAの部分を再分
離することにより得られた。pAcgBは、Ｔ−
DNAの左右の境界を含む様に縦列に並んだ２つ
のＴ−DNAコピーの接合点を含んでいる。更に、
pAcgBは、その遺伝子情報が右側Ｔ−DNA境界
のすぐに位置しているという理由でノパリンシン
ターゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミド
pAcgBは、「タイプＡ」アクセプターTiプラスミ
ド、pGV３８５０の組み立てに使用される。第
６図は関与する構造の概略を、第１３図はpGV
３８５０を与える二重乗換えに関与するDNA領
域をより正確に示したものである。 上記のプラスミドpAcgBは、そのpBR３２２
部分にColE1−特異bomサイトを持つており、ヘ
ルパープラスミドＲ６４drd１１およびpGJ２８
を使つてE.coliからAgrobacteriumへ授動するこ
とができる。E.coliに含まれているプラスミドＲ
６４drd１１およびpG２８は、接合により、
pAcgBを持つたE.coli株に導入される。トランス
接合体は、アンピシリン耐性（pAcgBのpBR３
２２配列から）、ストレプトマイシン耐性（Ｒ６
４drd１１から）、およびカナマイシン耐性（pGJ
２８から）コロニーとして選択される。 ３つのプラスミドの全てを保持しているE.coli
株を、リフアンピシン耐性でありTiプラスミド
pGV３８３９を含んでいるAgrobacterium株Ｃ
５８Ｃ１に接合させる。ノパリンTiプラスミド
との最初の単一乗換えを選択するのにpBR３２
２のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン
をAgrobacterium中で安定させることができる
唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域の１
つでpGV３８３９と相同組換えにより乗換えを
することである。他の相同領域での２回目の乗換
えにより、apt遺伝子（カナマイシン耐性）を含
んでいるpGV３８３９のＴ−領域の中央部がク
ローンpAcgBのpBR３２２配列で置換される。
従つて、第２の組換え体はアンピシリン耐性、カ
ナマイシン感受性である。第２の組換え体を分離
する確率を高めるために、最初の組換え体
（pAcgB：：pGV３８３９）を保持しているリフ
アンピシン耐性Agrobacteriumを、Tiプラスミ
ドを持つていない第２のクロラムフエニコール／
エリスロマイシン耐性Agrobacterium株と接合
させる。この様にして、約600コロニー中、１コ
ロニーの割合で、アンピシリン耐性、カナマイシ
ン感受性のクロラムフエニコール／エリエロマイ
シン耐性AgrobacteriumpGV３８５０を得るこ
とができる。 勿論、pGV３８５０タイプのアクセプターTi
プラスミドを組み立てるのに使用することができ
るその他のTiプラスミドもある。Ｔ−領域の中
央近くに選択し得るマーカー遺伝子を持つたTi
プラスミドは全て受容体として使用できる。更
に、左境界フラグメント−pBR３２２−右境界
フラグメントの方向に、左右の境界フラグメント
の中間にpBR配列が位置する様に、pBR３２２
にＴ−領域境界フラグメントを挿入することによ
つてpAcgB様のプラスミドを組み立てることが
できる。例えば、ノパリンTiプラスミドの左お
よび右境界フラグメントはそれぞれHindフラ
グメント１０および２３である（Depickerら、
Plasmid3（1980）、193−211）。 単一乗換えによつて、pBR３２２またはその
誘導体に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターがpGV３８５０の改良
されたＴ−DNA領域に導入される。唯一つ必要
なことは、中間クローニングベクターのE.coliか
らAgrobacteriumへの転移を選択する為の手段
として使用する為に、導入されるDNAが、既に
pBR３２２に存在するものの他にもう１つの耐
性マーカー遺伝子を含んでいるということであ
る。この耐性マーカーは、pBR配列内に含まれ
ていてもよく（例えばpBR３２５のCmR、また
はpKC７のKmR）、植物細胞内で試験される
DNA内に含まれていてもよい。更に、アクセプ
ターTiプラスミドpGV３８５０におけるApR遺
伝子pBR３２２は、KmRの様な別の耐性マーカ
ー遺伝子で置換してもよい。この様にして、ApR
であるpBR３２２含有中間クローニングベクタ
ーですら、このpGV３８５０タイプのアクセプ
ターTiプラスミドに直接授動することができる。 pGV３８５０タイプのアクセプターTiプラス
ミドのもう１つの利点は、形質転換された植物細
胞で腫瘍をつくらないということである。pGV
３８５０の短かくなつたＴ−DNA領域は、依然
としてノパリンシンターゼを暗号化している遺伝
子を含んでいるので、pGV３８５０で形質転換
された細胞は、ノパリンが存在するかどうかを分
析することにより、非形質転換細胞から簡単に選
り分けることができる。勿論、アクセプターTi
プラスミドpGV３８５０に組込まれた中間クロ
ーニングベクターがマーカー遺伝子を含んでいた
ら、それも直接スクリーニング、即ち選別にかけ
ることができる。 pBR３２２配列を含んだ上記の中間クローニ
ングベクターの単一乗換えによるアクセプター
Tiプラスミドへの挿入のほか、このアクセプタ
ーTiプラスミドは、「シヨツトガン」タイプの実
験に於いて、pBR３２２またはその誘導体中の
クローンされたDNAバンクの受容体としても使
用することができる。Agrobacterium中の全て
のハイブリツドプラスミドベクターは、植物細胞
の感染に使用することができ、次いで所望の選択
可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニン
グされる。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏して
いる植物細胞に全バンクを適用することにより、
アミノ酸合成を暗号化している遺伝子について簡
単に選別することができる。 アクセプターTiプラスミドpGV３８５０は、
２つの特徴的な表現形質を持つている：即ち、(i)
腫瘍生成能力がないこと、および(ii)もしＴ−
DNAが植物細胞ゲノム内に転移したら、ノパリ
ン合成能を有すること、である。pGV３８５０
含有Agrobacteriumで感染させた各種の植物組
織のこれらの特徴を調べるために、種々の実験を
行なつた。 (a) ジヤガイモおよびニンジンデイスクを用いた
試験 ジヤガイモおよびニンジンの切片にアクセプ
ターTiプラスミドpGV３８５０を接種すると、
少量の硬結組織が生成する。この組織にノパリ
ンが存在するかどうかを試験した所、陽性であ
ることがわかつた。この突然変異体が少量の硬
結組織を生産し得ることは興味あることでる。
しかし、それは、これらのデイスクを低濃度の
オーキシンおよびサイトキニンの両者を含んで
いる培地で生育させた時だけ得られる。 (b) 全植物をアクセプターTiプラスミドpGV３
８５０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育して
いるタバコおよびペチユニアの苗木にpGV３
８５０を接種する。数カ月後に少量の組織成長
が観察されただけである（通常、２週間後に
「野生型」腫瘍が検出される）。この組織はホル
モンを含まない培地では生育しないが、オーキ
シンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織
培養では、さらに増殖することができる。この
組織もノパリン陽性であることがわかつた。 (c) さらに、pGV３８５０「形質転換」細胞は
腫瘍性ではないので、これらの細胞は、転移し
たDNAセグメントをそのゲノムに依然として
保持している正常な植物に再生することができ
る。この形質転換細胞を通常の再生培地（実施
例５を参照）で培養すると、正常植物が得られ
よう。 pGV３８５０の、アクセプタープラスミドと
しての有用性を証明する為に、以下の実験を行な
つた。pBR３２５中にオクトピンＴ−DNAの腫
瘍機能を含んでいる中間クローニングベクター
を、pGV３８５０を保持している
Agrobacteriumに組み込んだ。単一乗換えによ
つて得られたAgrobacterium中のハイブリツド
Tiプラスミドを、傷つけたタバコ植物に諏種し
た。２週間後に腫瘍組織があらわれた。このこと
は、腫瘍誘導DNAがpGV３８５０に再導入さ
れ、形質転換植物細胞中で適切に発現されたこと
を示している。 実施例 ２ 中間クローニングベクターpGV７０００およ
びpGV７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示し
た。オクトピンTiプラスミドＢ６Ｓ３のTL−
DNAの右側部分であり、pGV０２０１（De
Vosら、Plasmid6（1981）、249−253）中に存在
するHindフラグメント１を、まず、広範囲宿
主性ベクターpGV１１２２（Leemansら、
Gene19（1982）、361−364）のHindサイトに挿
入する。組換えプラスミドpGV０２０１は、多
コピーベクターpBR３２２（Bolivarら、Gene2
（1977）、95−113）の特異なHindサイトに挿入
されたHindフラグメント１を含んでいる。
pGV０２０１およびpGV１１２２DNAは、
Betlachらが記載している方法で調製される
（Fed.Proc.35（1976）、2037−2043）。最終量20μ
中、pGV０２０１DNA2μgを、Hind２単位
（全ての制限酵素はBoehringer Mannheimから
購入した）を用いて、37℃で１時間完全に消化し
た。インキユベーシヨン緩衝液はO′Farrellらに
より記載されている（Mol.Gen.Genet179（1980）、
421−435）。同じ条件下でpGV１１２２DNA2μg
をHindで完全に消化した。 最終量20μ中、T4リガーゼ（Boehringer
Mannheim）0.02単位を用い、0.1μgのHind消
化pGV０２０１をHind消化pGV１１２２とラ
イゲーシヨン（結紮）した。インキユベーシヨン
緩衝液および条件は、製造業者の指示に従つた
（Brochure“T4リガーゼ”、Boehringer
Mannheim、1980年８月、＃10.M.880.486）。ラ
イゲーシヨン混合物のコンピテントE.coli
K514hsr-hsm+細胞（Colsonら、Genetics52
（1965）、1043−1050）への導入（形質転換）は、
DagertおよびEhrlichの方法（Gene6（1980）、23
−28）に従つて行なつた。細胞を、ストレプトマ
イシン（20μg／ml）およびスペクチノマイシン
（50μg／ml）を補足したLB培地（Miller、
Experiments in Molecular Genetics（1972）、
Cold Spring Harbor Laboratory、New
York）に塗抹した。組換えプラスミドを含有し
ている形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗
号化している遺伝子への挿入によるその不活性化
（Leemansら、Gene19（1982）、361−364）に基づ
き、テトラサイクリン感受性（10μg／ml）でス
クリーニング（選り分け）した。ストレプトマイ
シンおよびスペクチノマイシンに耐性を示し、テ
トラサイクリンに感受性を有するクローンを物理
的に同定した。マイクロスケールのDNA調製は
Kleinらの方法（Plasmid3（1980）、88−91）に従
つて実施した。pGV１１２２のHindサイト中
のHindフラグメント１の配向は、Sal消化に
よつて決定した。組換えプラスミドを消化し
（O′Farrellらの条件、Mol.Gen.Genet.179（1980）、
421−435）、アガロースゲル電気泳動にかけると
２個のフラグメントが得られた。α−配向には
0.77kbおよび22.76kbのフラグメント、β−配向
には、10.33kbおよび13.20kbのフラグメントがあ
つた。α−配向の組換えプラスミドをその後のク
ローニングに使用し、これをpGV１１６８と名
付けた。 TL−DNAの左側部分（左の境界配列を含んで
いる）を含有しているBgl−Salフラグメン
トをBgl−Salで開裂したpGV１１６８に導
入する。このフラグメントはベクターpBR３２
２に挿入された、pTiB６Ｓ３のＴ領域からの、
BamHフラグメント８を含んでいる組換えプ
ラスミドpGV０１５３（De Vosら、Plasmid6
（1981）、249−253）から得られる。pGV０１５
３およびpGV１１６８DNAはBetlachらの方法
で調製する（Eed.Proc.35（1976）、2037−2043）．
pGV０１５３DNA10μgを10単位のBglおよび
10単位のSalを用い、最終量100μ中37℃で１
時間、完全に消化した。消化混合物をプレパラテ
イブ0.8％アガロースゲル上、Allingtonらの方法
（Anal.Biochim.85（1978）、188−196）で電気溶
出し、ゲルから2.14kb Blg−Saフラグメン
トを回収した。pGV１１６８DNA2μgを２単位
のBglおよび２単位のSalで完全に消化した。
最終量20μ中、T4DNAリガーゼ0.02単位を用
いてBglSalフラグメントDNA0.1μgを0.02μg
のBgl−Sal消化pGV１１６８とライゲーシヨ
ンした。このライゲーシヨン混合物をコンピテン
トE.coliK514hsr-hsm+細胞（Dagertおよび
Erhlich、Gene6（1980）、23−28）に導入した。
細胞をストレプトマイシン（20μg／ml）および
スペクチノマイシン（50μg／ml）を補足したLB
培地（Miller、Experiments in Molecular
Genetics（1972）、Cold Spring Harbor
Loboratory、New、YorK）に塗抹した。 ストレプトマイシン−およびスペクチノマイシ
ン−耐性形質転換体から、マイクロスケール
DNAプレパレーシヨン（Kleinら、Plasmid3
（1980）、88−91）を行なつた。2.1kb Bgl−
SalフラグメントがBgl−Sal消化pGV１１
６８に挿入されている組換えプラスミドをBgl
−Sal消化により同定した。この消化で2.14kb
および21.82kbの２つのフラグメントが得られた。
これらの分子量（2.14kbおよび21.82kb）に相当
する消化パターンを持つたプラスミドをpGV１
１７１と名付け、さらにクローンするのに用い
た。pGV１１７１からの12.65kbフラグメント
は、左右のTL−DNA境界配列（De Beuckeleer
ら、in Proceedings Vth International
Conference on Plant Pathogenic Bacteria、
M.Ride′（ed.）（1978）、I.N.R.A.、Angres、115
−126）および腫瘍性の増殖を可能にする遺伝子
（Leemansら、EMBO J.（1982）、147−152）を
含んでいる。このHindフラグメントをプラス
ミドpBR３２５に挿入した（Bolivar、Gene4
（1978）、121−136）。pGV１１７１およびpBR３
２５はBetlachらの方法で調製した（Fed.
Proc.35（1976）、2037−2043）。それぞれの
DNA2μgを２単位のHindを用い、37℃で１時
間完全に消化した（インキユベーシヨン緩衝液は
O′Farrellらにより記載されている（Mol.Gen.
Genet.179（1980）、421−435））。0.1μgのHind
消化したpGV１１７１を、Hindで線状化した
0.05μgのpBR３２５と、T4DNAリガーゼ0.02単
位を用いてライゲーシヨンした。ライゲーシヨン
混合物によるコンピテントE.coli K514hsr-hsm+
の形質転換はDagertおよびEhrlichの方法で行な
つた（Gene6（1980）、23−28）。細胞を、カルベ
ニシリン（100μg／ml）を補足したLB培地
（Miller、Experiments in Molecular Genetics
（1972）、Cold Spring Harbor Laboratory、
New York）に塗抹した。カルベニシリン耐性
コロニーを、テトラサイクリン耐性を暗号化して
いる遺伝子に挿入することによるその不活性化に
基づき、テトラサイクリン（10μg／ml）感受性
でスクリーニングした（Bolivar、Gene4（1978）、
121−136）。カルベニシリン耐性、テトラサイク
リン感受性のコロニーを、そのコロニーから調製
したDNAの制限酵素消化により、マイクロスケ
ール技法（Kleinら、Plasmid3（1980）、88−91）
によつて物理的に特性化した。即ち、BamH
消化により、４つのDNAフラグメントが得られ
る：α配向の場合は0.98kb、4.71kb、5.98kbおよ
び7.02kbのフラグメントが得られ、β配向の場合
は0.98kb、4.71kb、1.71kbおよび11.20kbのフラ
グメントが得られる。こうして得られたα配向の
組換えプラスミドはpGV７００と名付けられ、
更にその後の実験に用いられた。 pGV７５０は、pGV７００に挿入されたTL−
領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している
3.49kb Bgl−Smaフラグメントの代わりに、
カナマイシン耐性を暗号化している2.81kb
BamH−Hpaフラグメントを挿入すること
により、pGV７００から誘導される。カナマイ
シン耐性を暗号化しているBamH−Hpaフ
ラグメントはλ：：Tn5（Bergら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA72（1975）、3628−3632）から得ら
れる。λ：：Tn5の調製はMillerにより記載され
ている（Experiments in Molecular Genetics
（1972）、Cold Spring Harbor Laboratory、
New York）。pGV７００DNAはBetlachらの方
法で調製する（Fed.Proc.35（1976）、2037−
2043）。pGV７００DNA2μgを２単位のBglお
よび２単位のSmaで完全に消化した。λ：：
Tn5DNA2μgを２単位のBamHおよび２単位
のHpaで完全に消化した。1μgのBamH−
Hpa消化λ：：Tn5を、最終量10μ中、
T4DNAリガーゼ0.5単位を用いて、0.2μgのBgl
−Sma消化pGV７００とライゲーシヨンし
た（製造業者の指示する条件に従つた）。このラ
イゲーシヨン混合物をコンピテントE.coli
K514hsr-hsm+細胞（DagertおよびErhlich、
Gene6（1980）、23−28）に導入した。細胞を、カ
ルベニシリン（100μg／ml）およびカナマイシン
（25μg／ml）を補足したLB培地（Miller、
Experiments in Molecular Genetics（1972）、
Cold Spring Harbor Laboratory、New
York）上に塗抹した。マイクロスケール技法
（Kleinら、Plasmid3（1980）88−91）に従つて調
製したDNAの制限酵素分析により、CbRおよび
KmRコロニーを物理的に特性化した。このDNA
をBgl／BamHで二重消化すると、3.94kb、
5.89kbおよび8.09kbの３つのフラグメントが、
Hindで消化すると2.68kb、5.99kbおよび
9.25kbの３つのフラグメントが得られる。この消
化パターンを示すプラスミドをpGV７５０と名
付け、第１５図に模式的に示した。 pGV７００とpGV７５０は、オクトピンTiプ
ラスミドpTiB6S3のTL−DNAの左右の境界配
列を含む、２つの相異なる中間クローニングベク
ターである。更に、これら２つのプラスミドでは
Ｔ−領域内の削除の程度が異なつている。pGV
７００は、オクトピンシンターゼ（トランスクリ
プト３）およびその他３つの生成物、即ち４，６
ａおよび６ｂ（Ｔ−領域の生成物については
Willmitzerら、ENBOJ.1（1982）、139−146参照）
のための遺伝情報を持つた縮小Ｔ−領域を含んで
いる。この３つの生成物（４，6aおよび6b）の
組み合せが形質転換された植物の新芽形成を促
す。pGV７５０はもつと小さいＴ−領域、即ち
オクトピンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。
生成物４，6a，および6bの為の情報は、カナマ
イシン（ネオマイシン）耐性を暗号化している抗
生物質耐性マーカー遺伝子によつて置換されてし
まつている。 pGV７００およびpGV７５０は、Ｂタイプの
アクセプターTiプラスミド（第８図および後記
実施例３参照）と共に使用し得る中間クローニン
グベクターの例である。これらのベクターは、そ
れらが所望の遺伝子を含んでいないことを除け
ば、第９図に示したものと部分的に類似してい
る。これらのベクターは、その改良Ｔ−領域内に
クローンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼ
サイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単に
それらのベクターに挿入することができる（第１
４図および第１５図参照）。 実施例 ３ アクセプターTiプラスミドpGV２２６０（タ
イプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Agrobacterium tumefaciens（野生型
Agrobacteriumから誘導される、リフアンピシ
ン耐性株C58C1およびエリスロマイシン−クロラ
ムフエニコール耐性株C58C1） Tiプラスミド＝pGV２２１７ 中間ベクター（第１６図）＝pGV７４５ TiプラスミドpGV２２１７の組み立てについ
ては詳細に記載されている（Leemansら、
FMBO J.1（1982）、147−152）。これは、オタト
ピンTiプラスミドの全TL−領域の欠失置換突然
変異体を含んでいる：即ち、BamHフラグメ
ント８，３０ｂ，２８，１７ａおよびBamH
フラグメント２の左の3.76kbBamH−EcoRIフ
ラグメント（De Vosら、Plasmid6（1981）、249
−253）が、Tn5のapt（アセチルホスホトランス
フエラーゼ）遺伝子を含んでいるpKC７のEcoR
−BamHフラグメント（Rao ＆ Rogers、
Gene7（1979）、79−82）で置き換えられている。
この遺伝子はアミノグリコシド、ネオマイシンお
よびカナマイシンに対する耐性を暗号化してい
る。 中間ベクターpGV７４５の組み立てを第１６
図に模式的に示した。これについて以下に詳述す
る。組換えプラスミドpGV７１３を、α配向で
Hindフラグメント14，18c，22eおよび33cを含
む、オクトピンTiプラスミドサブクローンpGV
０２１９（De Vosら、Plasmid6（1981）、249−
253）から誘導した。pGV０２１９DNAを
BamHで完全に消化し、次いで自己結紮（セ
ルフライゲーシヨン）に有利な条件下でライゲー
シヨンした（ライゲーシヨン混合物中のDNAの
最終濃度＜1μgDNA／ml）。アンピシリン耐性で
形質転換体を選別し、制限酵素による消化で物理
的に特性化した。こうしてpGV０２１９に存在
する6.5kb BamHフラグメントをもはや含ん
でいないクローンを分離し、これをpGV７１３
と名付け、その後のクローニングに使用した（以
下の記載参照）。BamHフラグメント２を含ん
でいる。pGV０１２０（De Vosら、Plasmid6
（1981）、249−253）から組換えプラスミドpGV
７３８を誘導した。pGV０１２０DNAをEcoR
で消化し、pGV７１３の場合と同様にして自
己結紮させた。形質転換体をアンピシリン耐性に
よつて選別し、制限酵素消化により分析した。
EcoRフラグメント20，21およびEcoRフラグ
メント19aの一部とpBV３２２の一部を含んでい
る2.95kb EcoRフラグメントが全て除去された
クローンをpGV７３８と名付け、更にその後の
クローニングに利用した。このプラスミドは、依
然としてBamHフラグメント２の右側部分か
らの5.65kb EcoR−BamHフラグメントを
含んでいる（De Vosら、Plasmid6（1981）、249
−253）。 次いでpGV７１３DNAをHindおよびBamH
で消化し、消化物をプレパラテイブアガロース
ゲルにかけた。電気泳動の後、pGV７１３内に
含まれている2.30kb Hind−BamHフラグメ
ントを電気溶出で純化した（Allingtonら、Anal.
Biochem.85（1975）、188−196）。このフラグメン
トをHindおよびBamHで完全に消化した
pGV７３８とライゲーシヨンした。形質転換後、
アンピシリン耐性コロニーを、制限酵素消化によ
り物理的に特性化する。例えば、EcoR−
BamH消化により、それぞれ3.98kb（＝ベクタ
ー部分）と7.95kb（＝挿入部分）の２つのフラグ
メントが得られるはずである。この特性を持つた
組換えプラスミドはpGV７４５と命名され、ア
クセプターTiプラスミドpGV２２６０を組み立
てるための中間ベクターとして使用された。 プラスミドpGV７４５はpBR３２２部分に
ColE1特異的bomサイトを持つており、実施例１
に記載した様に（アクセプターTiプラスミド
pGV３８５０の組み立てについて）、ヘルパープ
ラスミドＲ６４drd１１およびpGJ２８を使つて
E.coliからAgrobacteriumへ授動させることがで
きる。 pGV７４５を、リフアンピシン耐性でありTi
プラスミドpGV２２１７を含んでいる
Agrobacterium株C58C1に授動させた。最初の乗
り換えは、実施例１（アクセプターTiプラスミド
pGV３８５０の組み立て）に記載した方法と同
じ方法で、pBR３２２のアンピシリン耐性を使
つて選択した。２回目の乗り換えにより、pGV
２２１７に存在する欠失置換突然変異体がプラス
ミドpGV７４５のpBR３２２配列によつて置換
される。pGV７４５のpGV２２１７との相互組
込みの結果得られるアンピシリン耐性トランス接
合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接選別
することにより第２の組換え体を得た。この様に
して、pGV２２６０（アンピシリン耐性、カナ
マイシン感受性）を含んでいるリフアンピシン
Agrobacterium株C58C1を得た。 このTiプラスミドpGV２２６０は、pGV７０
０−またはpGV７５０−タイプの中間クローニ
ングベクター用のアクセプタープラスミド（Ｂタ
イプ）として使用されるものである。これらは、
(i)アンピシリン耐性遺伝子、複製起源および
pBR３２２のbomサイトを持つたDNAフラグメ
ント、(ii)TL−DNAの左右の境界配列のすぐ外側
に位置するDNA配列および、中間クローニング
ベクターのE.coliからAgrobacteriumへの転移並
びにそのアクセプターTiプラスミドpGV２２６
０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、
pBR３２２に既に存在している耐性マーカーと
は別の、もう１つの耐性マーカーを含んでいる
DNAフラグメント、で構成されている。 例えば、本発明者らは、pGV２２６０とpGV
７００との間の相互組込み体を持つている
Agrobacteriumは、所望のDNA配列（Ｔ−DNA
境界の間に含まれている）を植物細胞ゲノムへ転
移させ得ることを立証した。この形質転換された
植物細胞は、もしpG７００が３つの生産物のた
めの遺伝情報（４，６ａ，６ｂ；Willmitzerら、
EMBO J.1（1982）、139−146）を含んでいる場合
は、期待される表現形質、即ち新芽を生じる腫瘍
を示す。この様に、本発明者らは、Ｂタイプのア
クセプターTiプラスミドは、第９図に示し、更
に実施例２に記載したタイプの中間クローニング
ベクターとの相互組込み体として使用すると、
DNAを植物細胞に転移させることができること
を証明した。 実施例 ４ 植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中間
クローニングベクターの組み立て 本発明が完成されるまで、TiプラスミドのＴ
−領域内の、多かれ少なかれでたらめな位置に全
遺伝子を挿入しても、その外来性の配列が植物ゲ
ノムへ転移した後発現されるということはなかつ
た。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子
（群）の暗号領域を、植物細胞中で機能すること
が知られている転写開始および終了信号に連結す
ることができる。この方法の有用性は、ノパリン
シンターゼ遺伝子を暗号化しているDNA配列が
関与する、本発明の実験によつて例証される。こ
の遺伝子の全配列および正確な転写開始および終
了は既知である（Dep−ickerらJ.Mol.Appl.
Genet.1（1982）、561−574）。本発明によれば外来
性遺伝子の蛋白質暗号化領域はnosプロモーター
の隣りに挿入することができる。外来性遺伝子配
列の例として、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗
号領域（De Greve、J.Mol.Appl.Genet.1（1982）、
499−512）をnosプロモーターに隣接させて挿入
する。この構造物はアクセプターTiプラスミド
内に授動され、植物を感染させるのに使用され
る。生成した腫瘍組織にオクトピンが存在するか
どうかを分析した所、陽性であることがわかつ
た。 キメラノパリンプロモーターを含有している中
間クローニングベクターの組み立て：オクトピン
シンターゼ構造遺伝子を第１８図〜第２０図に示
す。 簡単に言えば、nos遺伝子を含んでいる制限フ
ラグメントHind−２３をインビトロで処理し
てnos暗号配列の大部分を除去する一方、制限エ
ンドヌクレアーゼサイトBamHに隣接してい
るnosプロモーターは保持する（第１８図）。
10μgのpGV０４２２（完全なnos遺伝子を含む
Hind−２３フラグメントを持つたpBR３２２
誘導体；Depickerら、Plasmid（1980）、193−
211）をSau 3Aで消化し、nosプロモーターを含
んだ350bpのフラグメントをプレパラテイブ５％
ポリアクリルアミドゲルで分離する。このプロモ
ーターフラグメントを、5′−末端燐接エステル基
を除去するために予め細菌性アルカリホスフアタ
ーゼ（BAP）で処理した、Bg1−切断pKC７
（Raoら、Gene7（1979）、79−82）に結合させる。
得られたプラスミド（pLGV１３）20μgをBgl
で消化し、400μの12mM MgCl2、12mM
CaCl2、0.6M NaCl、1mM EDTAおよび20mM
トリス−HCl（pH8.0）中、30℃でBal31エキソヌ
クレアーゼ（Biolabs、New England）７単位
を用いて４〜10分間処理する。この間、約20〜
50bpのDNAが除去される。このBal31−処理分
子をBamHで消化した後、DNAポリメラーゼ
のKlenowフラグメントと４つのデオキシヌクレ
オシドトリホスフエート（それぞれ10mM）と共
にインキユベートして、その末端を満たす。充填
されたBamH末端とBal31除去末端とのライゲ
ーシヨンから得られる再生BamHサイトを持
つたプラスミドを選別する。いくつかの候補の
BamH−Sacフラグメントのサイズを６％尿
素−ポリアクリルアミドゲル中で見積り、サイズ
が200〜280ヌクレオチドの範囲にある候補のヌク
レオチド配列を決定する。プロモーターを持つた
203bpのSac−BamHフラグメントを含んで
いるクローンpLGV８１を、pGV０４２２のnos
遺伝子中のSac−BamHフラグメントと置換
するのに使用する：この最終プロモーターベクタ
ーはpLGV２３８１と呼ばれる。全ての組換えプ
ラスミドはE.coli株HB101の形質転換により選択
する。 この様に処理したnosプロモータを含んでいる
プラスミドベクターをBamHで消化し、
BamHフラグメントに含まれているocsの暗号
配列をこのサイトに挿入する。このocs暗号配列
も、インビトロで処理し、第１９図に示した様
に、BamH制限エンドヌクレアーゼサイトで
囲まれる様にする。オクトピンTiプラスミド
B6S3のBamHフラグメント１７a10μg（De
Vosら、Plasmid6（1981）、249−253）をBamH
およびSmaで消化し、ocs−暗号配列を含む
フラグメントを１％アガロースゲルから分離し、
pBR３２２の大きいBamH−Pvuフラグメン
トに結合させる；得られたプラスミド、pAGV８
２８（20μg）をBamHで消化し、第１８図に
示した様にエキソヌクレアーゼBal31で処理し、
次いでHindで消化し、末端を充填し、自己結
合させる。Bal31除去体のサイズは６％ポリアク
リルアミドゲル中で見積る。いくつかの候補のヌ
クレオチド配列を決定し、5′−非翻訳リーダー配
列の残り7bpだけを持つた候補を選択して以下の
操作に付す（pOCS△）。ocs配列をBamHサイ
トで囲むために、Cla−Rsaフラグメントを
充填し、pLC２３６（Remautら、Gene15
（1981）、81−93）のBalサイトにサブクローン
する。得られたプラスミド pAG４０をBamHで消化し、ocs配列を持つ
たフラグメントをプレパラテイブ１％アガロース
ゲルから電気溶出により分離し、予めBamH
で消化しBAP（細菌性アルカリホスフアターゼ）
で処理したpLGV２３８１に結合させる。ocs配
列のpLGV２３８１への挿入により、両方の配向
のものが得られる（pNO−１およびpNO−２）。 nos：ocs融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。 更に、処理したnosプロモーターを含有してい
るプラスミドベクターは、酵素ジヒドロフオレー
トレダクターゼを暗号化しているプラスミドＲ６
７からのDNAを挿入するのに使用される。ジヒ
ドロフオレートレダクターゼ遺伝子を含んでいる
暗号配列は、BamHに含まれており（O′Hare
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA78（1981）、1527−
1531）、従つて既述した様に、プロモーター領域
に隣接するBamHサイトを含んでいるnosプロ
モーターベクターに容易に挿入される。この遺伝
子は、発現されると抗生物質メトトレキセートに
対する耐性を付与するので、選択可能なマーカー
遺伝子の１つの例である（第２，３，４，５およ
び７図参照）。この中間クローニングベクターが
野生型ノパリンアクセプターTiプラスミドを含
んでいるAgrobacteriumに授動されると、単一
乗換えが起り、ハイブリツドTiプラスミドベク
ターが得られる。このベクター組成物を、植物の
感染に使用する。得られた腫瘍組織は、0.5μg／
mlのメトトレキセートの存在下で継続して生長し
得ることがわかつた。 ocsおよび上記のnosプロモーターの後のジヒ
ドロフオレートレダクターゼ暗号領域を含んでい
る中間クローニングベクターを組み立て、
AgrobacteriumのTiプラスミドと相互組込みし
た後、形質転換植物細胞に転移、発現させること
により、本発明方法によつて外来性遺伝子を植物
細胞に転移し、発現させることができるというこ
とが証明される。 実施例 ５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を含む植物細胞お
よび植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを
使つて、非腫瘍性アクセプターTiプラスミド誘
導体（例えばpGV３８５０）で形質転換された
植物細胞および全植物を得た。 (1) インボビでの全植物の接種、次いで新芽の再
生が可能な培地上、インビトロでの培養、 (2) 損傷部位で直接新芽の生成を促す他の
Agrobacteria株の存在下、インビボにおける
全植物の相互感染、 (3) インビトロでの単一植物細胞プロトプラスド
の共生培養。 これらの方法について以下に詳述する。 最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもた
らす全植物組織の野生型Agrobacterium株によ
る感染体を得る為に通常使用される方法を改良し
たものである。pGV３８５０は腫瘍を形成しな
いAgrobacterium誘導体であるので、感染部位
において腫瘍の増殖はみられない。しかし感染し
た組織を取り除き、組織培養で増殖させると、形
質転換された組織を容易に得ることができる。初
期培養期間（単に組織の量を増やすため）の後、
損傷部位組織を新芽形成が可能な条件下で増殖さ
せる。非形質転換細胞およびpGV３８５０−形
質転換細胞の両者が新芽を発生する。形質転換新
芽は、ノパリンの存在をみる簡単な分析により容
易に区別することができる。 本発明者らは、次のプロトコールに従つて、
Nicotiana tabacum Wisconsin38の頭部を切断
したタバコの苗木から、pGV３８５０−形質転
換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミナ
ーフローフード中、無菌条件下で行なつた）。 (1) 小さなビン（直径10cm、高さ10cm）の中で、
0.8％の寒天を含む固形のMurashige ＆
Skoog（MS）培地（MurashigeおよびSkoog、
Physiol.Plant.15（1962）、473−497）で生育さ
せた６周令のタバコの苗木を使用する。 (2) 外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取つて
捨てる (3) 選択的条件（例えばTiプラスミドpGV３８
５０を含んでいるリフアンピシン耐性、アンピ
シリン耐性Agrobacterium株の場合は、
100μg／mlのリフアンピシンと100μg／mlのカ
ルベニシリンを含んでいるYEB培地を使用す
る；YEB培地＝５ｇ/Bactoビーフエキス、
１ｇ/Bacto酵母エキス、５ｇ/ペプトン、
５ｇ/シユクロース、２×10-3M MgSO4、
pH7.2、15ｇ/寒天）で増殖させた新鮮な平
板培養からのAgrobacteriumを、スパーテル
またはつまようじで損傷表面に接種する。各
pGV３８５０組み立て物を、少なくとも８本
の苗木に接種する。 (4) ２周間インキユベートする。接種部位にほと
んどあるいは全く反応が表われないはずである
が、時々非常に小さいカルス（calli）が観察
される。 (5) 損傷表面から厚さ１mm以下の薄い切片を切り
取る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキ
ニン（１mg／NAA、0.2mg／BAP）およ
び１％シユクロースを添加したLinsmaier ＆
Skoog（LS）寒天培地（Linsmaier and
Skoog、Physiol.Plant.18（1965）、100−127）
を含む平板上で培養する。 (6) 約６週間後、カルスはその一部をとつてノパ
リンの存在を試験するのに十分なだけの大きさ
になる（少なくとも直径が約５mmになる）。全
ての損傷カルスがノパリンを生産する訳ではな
い。４本の植物の内約１本がノパリン陽性損傷
カルスをつくる。 (7) ノパリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平
板に移す：上記のLS培地＋１％シユクロース
および１mg／BAPサイトキニン (8) 約４〜６週間後に良好なサイズの新芽（高さ
１cm）が出る。更に成長させ、根を形成させる
ために、この新芽を、ホルモンを含まないLS
培地＋１％シユクロースを含有している新しい
寒天平板に移す。 (9) ノパリンの存在を試験するのに、その一部
（１〜２枚の小さな葉）を切り取れる様に、こ
の新芽を１〜２週間成長させる。 (10) ノパリン陽性の新芽を、(1)と同じMS培地を
入れたやや大きい容器（上記と同じ10cmのび
ん）に移し、更に成長させる。 (注) 染させた組織のための全ての植物培養培地
には、pGV３８５０含有Agrobacteriumに
対する選択的毒物として、抗生物質セフオタ
キシム（cefotaxime、ClaforanR、ヘキス
ト）500μg／mlが含まれている。この薬物
は、全てのAgrobacterium（カルベニシリン
耐性のものを含む）の生長をよく阻止する。 本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を
出す組織を得る別の方法が開発された。この方法
は、Agrobacteriumのある種のミユータントTi
プラスミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を
生成させるということを観察したことに基いて開
発された。この様な新芽−誘起（shi）に関する
突然変異は、A.tumefaciensのTiプラスミドのＴ
−DNA（転移DNAセグメント）の特定の領域に
位置している（Leemansら、EMBO J.1（1982）、
147−152；Joosら、Cell32（1983）、1057−1067）。
誘起された新芽は完全に正常な非形質転換細胞で
構成されていることが多い。従つて本発明者ら
は、２つの異なつたAgro−bacteria、即ち１つ
はオクトピンTiプラスミド放出（shooter）ミユ
ータントを持つたもの、もう１つはpGV３８５
０を持つたもの、の混合物で植物を接種した。こ
の様にすることは、オクトピン放出ミユーテーシ
ヨンが、pGV３８５０で形質転換された根を誘
起することが出来るよい機会を与える。Tiプラ
スミドpGV３８５０およびオクトンピン新芽誘
起Tiプラスミドを５：１の割合で含んでいる
Agrobacteriumを植物に接種した。こうするこ
とによつてpGV３８５０−形質転換新芽を得た。
この新芽は、ノパリンの存在について分析するこ
とにより、容易に選別することができる。この方
法は、精功な組織培養法を必要としない。ノパリ
ン陽性新芽を、更に成長させるために、長調節ホ
ルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含んだ培地に移
す。新芽が十分な大きさに達した後、容易に繁殖
の為の土壌に移すことができる。この共感染法
は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を形質転
換するのに特に有用である。従つて、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例え
ば豆科植物、薬用植物および装飾植物を
Agrobacteriumで処置することができよう。 第３の方法は、Nicotiana tabacumプロトプ
ラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−
DNA−形質転換細胞クローンの選択を、そのプ
ロトプラスト−由来細胞と腫瘍性
Agrobacterium株との共培養後に実施得るもの
である。他の優勢な選択マーカー、例えば高等植
物細胞で発現される様に組み立てられた抗生物質
耐性遺伝子を使用すれば（実施例３参照）、形質
転換細胞を選択するのに類似の方法を使用するこ
とができる。しかしこの場合は、それぞれのケー
スについて選択の最適条件をみつける必要がある
（選択剤の濃度、形質転換と選択の間の時間、選
択培地中のプロトプラスト−由来細胞または細胞
コロニーの濃度など）。形質転換細胞の選択がで
きない場合、例えばpGV３８５０またはpGV２
２１７（Leemansら、EMBO J.1（1982）、147−
152）の様な非毒性のＴ−DNAミユータントを用
いたために選択が不可能な場合は、遺伝学的形質
転換の後に細胞をオーキシン−およびサイトキニ
ン−含有培地（例えば２mg／のNAA（α−ナ
フタレン酢酸）および0.3mg／のカイネチンを
含むMurashigeおよびSkoog培地（Murashigeお
よびSkoog、Physiol.Plant15（1962）、473−
497））で培養し、形質転換コロニーをそのオパイ
ン（opine）含有量で同定することができる。こ
の様にして、アグロピン（agropine）およびマ
ノピン（mannopine）合成の電気泳動分析（方
法についてはLeemansら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1981）、149−164参照）の後、約660コロニーが、
pGV２２１７で感染後に得られ、TR−暗号化オ
パイン・マノピン（N2（１−マニチル）−グルタ
ミン）を合成するNicotiana tabacum SR1セル
ラインであることがわかつた。このセルラインの
カルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節剤と
してBAP（６−ベンジルアミノプリン）（１mg／
）を含むMurashige and Skoog培地）上で培
養すると、数多くの新芽が形成した。分析した20
の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成する
ことができた。ホルモンを含まないMurashige
and Skoog培地に移した後、これらの新芽は、
依然としてマノピンを含有し、形態学的に正常な
タバコ植物に成長した。 N.tabacumについて次に記載するプロトプラ
ストの分離および形質転換法は、N.plumbagini
−foliaにも用いることができる。 ２ 実験手法 2.1 新芽培養条件 培養室内の無菌条件下（１日16時間、1500
ルツクスの白色蛍光（“ACEC LF58W／
24300〓 Economy”）、24℃、相対湿度70
％）、250mlのガラスびんに入れたホルモン不
含のMurashige and Skoog培地
（MurashigeおよびSkoog、Physiol.Plant15
（1962）、473−497）上でNicotiana
tabacumの新芽培養を維持する。５週令の新
芽培養をプロトプラストの分離に使用する。 2.2 プロトプラストの分離 プロトプラストの分離および培養における
全ての工程は無菌操作で行なう。混合酵素法
によりプロトプラストを分離する。長さ２cm
以下の非常に若い葉を除く、全ての葉をプロ
トプラストの分離に使用することができる。
鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３mmの
細長い小片に切断する。この葉材料２〜３ｇ
を、酵素混合物50ml中、暗所で、24℃にて18
時間静置培養する。この酵素混合物は、ホル
モン不含のK3培地中、0.5％セルラーゼ
Onozuka Ｒ−10および0.2％マセロザイム
OnozukaR−10からなつている（Nagyおよ
びMaliga、Z.Pflanzenphysiol.78（1976）、
453−455）。この混合物は、0.22μm細孔膜を
通して過減菌し、顕著な活性の低下をきた
すことなく、−20℃で少くとも６カ月間貯蔵
することができる。 2.3 プロトプラスト培養 18時間培養した後、プロトプラストを放出
するために混合物を穏やかに撹拌する。次い
でこの混合物を50μmのふるいを通して過
し、液を10mlの遠心管に移す。振動バケツ
ローターに入れて60〜80ｇで６分間遠心分離
すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バン
ド（帯）を形成する。プロトプラストの下層
の液およびペレツト状の残骸を、蠕動ポンプ
に連結した毛細管を使つて取り除く。プロト
プラストを１つの遠心管に集め、培養培地で
２回洗浄する。この培養培地は、NAA（0.1
mg／）およびカイネチン（0.2mg／）を
成長調節剤として含有するK3培地である
（NagyおよびMaliga、Z.Pflanzenphysiol.78
（1976）、453−455）。この培地はpH5.6に調
節し、0.22μmの過膜を通して減菌する。
２回目の洗浄の後、Thoma血球計算器
（“Assistant”、西ドイツから入手）を用いて
プロトプラストを計測し、最終密度105プロ
トプラスト／mlとなる様に培養培地に懸濁す
る。直径９cmの組織培養用良質ペトリ皿当た
り10mlの容量でプロトプラストを培養する。
このペトリ皿をParafilmRでシールし、24℃
で、暗所次いでかすかな光（500〜1000ルツ
クス）を当てて24時間培養する。 2.4 共生培養による形質転換 分離５日後にプロトプラスト培養株を感染
させる。Agrobacteriumを液体LB培地
（Miller、Experiments in Molecular
Genetics（1972）、Cold Spring Harbor
Laboratory、New York）中で18時間培養
後、２×109細胞／mlの密度となる様にK3培
養培地に再懸濁する。この懸濁液50μを植
物プロトプラスト培養株に加え、ParafilmR
でシールした後、この培養株を2.3.と同じ条
件下で培養する。48時間後に培養株を10mlの
遠心管に移し、振動バケツローターに入れ、
60〜80ｇで６分間遠心分離する。浮遊バンド
およびペレツトを集め、抗生物質（カルベニ
シリン1000μg／mlまたはセフオタキシム
500μg／ml）を補足したK3培地（Nagyおよ
びMaliga、Z.Pflanzen physiol.78（1976）、
453−455）10mlに再懸濁する。 培養２週間後、プロトプラスト−由来マイ
クロカルスを遠心分離し、前記と同濃度の成
長調節剤および抗生物質を含むがシユクロー
ースに関しては0.4Mの代りに0.3M含むK3培
地（NagyおよびMaliga、Z.
Pflanzenphysiol.78（1976）、453−455）に再
懸濁する。この培地の細胞密度は約25×103
マイクロカルス／mlに調節する。同じ条件下
で更に２週間培養した後、カルスを、前記と
同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度のシ
ユクロース（0.2M）と成長調節剤
（NAA0.01mg／、カイネチン0.02mg／）
を含むK3培地に移す。更に２〜３週間培養
後、形質転換体と推定されるものは、その淡
緑色の密な外観、およびより良好な成長度か
ら認識することができる。これらのコロニー
を、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン
500μg／mlまたはセフオタキシム250μg／ml）
を含むがホルモン不含の0.6％寒天固形培地
（LinsmaierおよびSkoog、Physiol.Plant.18
（1965）、100−127）に移す。形質転換体と推
定されるものが直径約３−４mmに達した時、
ホルモン不含の培地で生育しているそれらに
オパイン試験を施すことができる。各コロニ
ーの半分を、オクトピンおよびノパリン
（Aertsら、Plant Sci.Lett.17（1979）、43−
50）またはアグロピンおよびマノピン
（Leemansら、J.Mol.Appl.Genet.1（1981）、
149−164）の検出に使用する。この試験によ
り、ホルモン不含の培地で選択されたコロニ
ーの形質転換された性質を確認することがで
きる。その後、選択されたコロニーを抗生物
質不含の培地で培養することができる。 2.5 ホルモン不含培地上の選択なしの共生培養 形質転換細胞の為の選択ができない（例え
ば無毒性Ｔ−DNAミユータントを使つたた
め）場合、またはそれが必要でない場合（抗
生物質耐性遺伝子の様な優勢な選択し得るマ
ーカーがＴ−DNAに存在している為）、プロ
トプラスト−由来細胞の処理を簡略化するこ
とができる（ホルモン減少工程はもはや必要
でない）。感染段階まで、プロトプラストを
既述した様に処理する。細菌を加えて48時間
後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分離し
（６分、60−80ｇ）、非常に低密度で細胞の成
長を維持することができるAG培地
（Caboche、Planta149（1980）、７−18）に再
懸濁する。Fuchs−Rosenthal計数チエンバ
ー（“Assistant”西ドイツより入手）を使つ
て計測し、以下の操作に必要な密度になる様
に再懸濁する。オパイン試験のためにコロニ
ーを個々に操作しなければならない場合は、
低細胞密度（１ml当たり100プロトプラスト
−由来細胞および細胞コロニー）で植えつけ
ると、１カ月の培養で大きい細胞コロニーが
得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる
場合は、細胞を高密度（103−104／ml）で培
養し、各タイプの選択に最適な時期及び濃度
で、その使用する選択剤を培地に添加する。 2.6 カルス組織から全植物の再生 カルス組織から正常植物を容易に得ること
ができる（例えばプロトプラスト形質転換か
ら、または全植物接種から（2.7参照）得ら
れる）。カルス組織を、１mg／mlのBAPを含
んでいるMurashige and Skoog培地で増殖
させる：この培地は１〜２カ月後に新芽を形
成させる。この新芽をホルモン不含の培地に
移し、根を形成させ、完全な植物をつくらせ
ることができる。 2.7 タバコ苗木への腫瘍の誘導 タバコの種子（例えば裁培品種
Wisconsin38）の表面を70％変性エタノー
ル／H2Oで２分間、次いで10％の市販の標
白剤と0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
で処理して滅菌し、更に滅菌水で５回洗浄す
る。この滅菌した種子を、Murashige and
Skoog（0.7％寒天）培地の塩類を含む大型試
験管（幅25mm、ポリカーボネート製のキツプ
付）にまく。次いでこの試験管を培養室
（12000ルツクス、16時間照射／８時間非照
射、70％相対湿度、24℃）に入れて培養す
る。４〜６週間経つと植物は使用できる状態
になる。少なくともその後１カ月間は最適の
状態を維持する。苗木は少なくとも高さ３cm
になり、４枚またはそれ以上の葉を持つはず
である。新しい外科用メスで植物の最も若い
節間を通して横に頭部を切断する。植物の上
の部分を試験管から取り除き、火にかけたス
パーテルで平板寒天培養から細菌を損傷表面
に塗抹する。野生型の場合は２週間後に、あ
る種の変性ミユータント株の場合はもつと後
に腫瘍が現れる。この方法は、タバコ
（Nicotiana tabacum）、Nicotiana
plumbagini foliaおよびびPetunia hybrida
を接種するのに使われる。 以上述べた如く、本発明は、野生型Tiプラス
ミドのＴ−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブ
リツドTiプラスミドを保持している
Agrobacteriumで、初めて植物を形質転換する
ことを可能ならしめたものである。Tiプラスミ
ドから植物細胞へのDNAの転移に及ぼすＴ−領
域の腫瘍機能の影響は知られていないので、それ
でも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領域の植
物細胞への転移が起ることは驚くべきことであ
る。この転移DNAは植物細胞ゲノムに相互組込
みされ、安定に保持される。更に、選択した所望
の遺伝子は、その遺伝子が適当なプロモーター配
列を含んでいるか、あるいは含む様に組み立てら
れると発現することができる。所望の遺伝子を含
んでいる中間クローニングベクターと、特別に設
計されたアクセプターTiプラスミドとの間で単
一乗換えを行わせるという本発明の概念（アイデ
イア）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリツ
ドTiプラスミドベクターの組み立てを著しく簡
単なものにするものである。この特別に設計され
たアクセプターTiプラスミドは、所望の遺伝子
（これは中間クローニングベクターの一部と同じ
であるかまたはこれに関連しているクローニング
媒体中に挿入されている）が単一乗換えによつて
相互組込み体を形成することができる様に、通常
のクローニング媒体のDNAセグメントを含んで
いる。このクローニング媒体の２つのセグメント
が、組換えの為に必要な相同領域を提供する。 本発明方法によつて調製された微生物、中間ク
ローニングベクター、アクセプターTiプラスミ
ド、およびハイブリツドプラスミドベクターは、
1983年12月21日、German Collection of
Microorganisms（DSM）（Goettingen）に寄託
され、確認された以下の培養株で例示される： (1) Escherichia coli K12HB101中の中間ベク
タープラスミドpAcgB、 (2) カルベニシリン耐性アクセプターTiプラス
ミドpGV３８５０を保有している
Agrobacterium tumefaciens C58C1リフアン
ピシン耐性株 (3) Escherichia coli K12株K514（thr len thi
lac hsdR）中の中間ベクタープラスミドpGV
７００ (4) Escherichia coli K12株514（(3)と同じ）中の
中間ベクタープロトプラストpGV７５０、 (5) カルベニシリン耐性アクセプターTiプラス
ミドpGV２２６０を保有している
Agrobacterium tumefaciens C58C1リフアン
ピシン耐性株、 (6) Escherichia coli K12 HB101中の、ノパリ
ンプロモーター支配下のオクトピンシンターゼ
暗号領域を保有している中間ベクタープラスミ
ドpNO−１、 (7) 中間ベクターのAgrobacteriumへの授動に
使用された株＝授動プラスミドpGJ２８および
Ｒ６４drd１１（Van Hauteら、EMBO J.2
（1983）、411−418）を保有しているGJ23；
GJ23はEscherichia coli K12、JC2926、
AB1157のrecA誘導体である（Howard−
Flandersら、Genetics49（1964）、237−246）。 これらの培養株の受理番号は、それぞれ2792
(1)、2798(2)、2796(3)、2797(4)、2799(5)、2833(6)、
および2793(7)である。 本発明の態様を色々と記述したが、その基本的
な構成を変化させれば本発明に係る方法および組
成物を利用するその他の態様が得られることは言
うまでもない。
のその導入法、およびゲノム中に外来DNA配列
を含んでいる植物細胞またはその植物に関する。
更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で
発現されるDNA配列に関する。本発明に係る組
換えDNA分子は、植物の成長、栄養物としての
その品質の改良、または有用な代謝物（例えばア
ルカロイドあるいはステロイドの前駆体）の生
産、に有用なアミノ酸やポリペプチドの如き生産
物を暗号化している配列を有することをその特徴
としている。 以下に本明細書で使用する用語について説明す
る。 bomサイト 特異的にmob機能体が相互作用して
自律的DNA転移移動を開始させるDNA領域 境界配列 Ｔ−DNAの末端を含むDNA配列 広範囲宿主レプリコン 多種多様の宿主細胞に転
移（トランスフアー）され、保持され得る
DNA分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塊 クローニング 無性生殖により、１個の生物また
はDNA配列から一群の該生物またはDNA配列
を得る操作過程、または、よりわかり易く言え
ば、特定の生物またはその一部を分離し、その
サブフラクシヨンを均質な集団として増殖させ
る操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラ
スミド、フアージDNAまたはその他のDNA配
列であつて、そのDNA配列は、例えば複製、
外殻蛋白質の生産など、そのDNAの必須の生
物学的機能、あるいはプロモーターまたは結合
部位を付随的に失なうことなく、その場所で正
確にその配列を切断することのできる１個また
は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持つて
おり、また、それが導入された細胞（形質転換
された細胞）を同定確認するのに有用なマーカ
ー（例えばテトラサイクリン耐性あるいはアン
ピシリン耐性）を持つていることで特徴づけら
れる。クローニング媒体は、しばしばベクター
とも呼ばれる。 暗号配列 ポリペプチドアミノ酸配列を決定する
DNA配列 相互組込み体（コインテグレート） ２個の環状
DNA分子間の単一交叉により得られる構造体 トランス相補性 他のレプリコンに物理的に結合
していないDNA分子（レプリコン）が、その
結合していない他のレプリコンにとつて必要か
つ欠落している拡散性物質を供給することがで
きる過程 接合（コンジユゲーシヨン） 細胞同志の接触に
より、１つのタイプの細菌から他のタイプの細
菌にDNAが転移すること 乗換え 相同なDNA配列間で遺伝物質が交換す
ること 欠損置換 １個のDNA配列が除去され、その代
りとして異なつたDNA配列で置換されること 分化 ある細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得
し、更にそれを維持すること DNA配列またはDNAセグメント 隣接するペン
トースの3′位と5′位の炭素間の燐酸ジエステル
結合により互いに連結したヌクレオチド群の一
直線の配列 二重乗換 相互組込み（コインテグレート）構造
が２個の環状DNA分子に分解する過程。この
過程は遺伝情報を交換するのに利用される。こ
のDNA環状体の一方は、それによつて組換え
が生じ得る標的DNAと相同な２つの領域を持
つており、この２つの領域は、標的DNAと交
換される非相同DNA配列をはさんでいる。も
し１回目の交叉と２回目の交叉が同じDNA領
域で起ると、もとのDNA環状体が生成する。
この２回目の交叉が第２の相同領域で起ると、
２つの環状体の間で遺伝子の交換が起ることに
なる。 発現 構造遺伝子によりポリペプチドが生産され
る過程。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有
効に結合された場合、それらの構造遺伝子の発
現を調節し、統制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはfertility（生殖
力））を持つたプラスミドであつて、Ｆ因子を
持たない宿主に該プラスミドのコピーを移入す
ることのできるプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち(1)遺伝子生産物のため
の暗号配列および(2)その遺伝子が発現されるか
どうかを調節しているプロモーター領域内の配
列、から構成されているDNA配列 ゲノム 細胞またはウイルスの全DNA。これは、
まずポリペプチドを暗号化している構造遺伝
子、更にオペレーター、プロモーター、リボゾ
ームの結合配列および相互作用配列（たとえば
Shine−Dalgarno配列）を含んでいる。 遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全
て 相同的（性）組換え 相同配列を含んでいる
DNA上の２つ領域間の組換え Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グループ
の一群の自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧（selective pressure）がない
と、同一の細胞に２個のDNAが共存し得ない
こと 挿入 あるDNA配列を、別の分子のDNA配列内
に付加すること リーダー配列 5′未満から最初の構造遺伝子の先
端に至るまでのmRNA上の領域。これには構
造遺伝子の暗号配列の翻訳を開始するのに重要
な部位が含まれている。 減数分裂 はじめ4n個の染色体が、２回の連続
した分裂により生成した４個の細胞のそれぞれ
に1n個ずつ分布するようになる過程。この過
程は有性生殖に於いて重要である。 mob（授動機能体） tra機能体との組合せに於い
てのみDNAの転移を促す一連の生成物。mob
はbomサイトを含んでいるプラスミドの移動を
促すことができる。 授動（モビリゼーシヨン） 別の細胞へ転移する
ことのできないDNA分子が、他のDNA分子の
助けを借りて転移する過程 授動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持つ
ていない、別の宿主細胞へ転移するための拡散
性生成物を供給することができるプラスミド 非接合性組換えプラスミド 細胞同志の接触によ
り、それ自体では、もとの宿主細胞から他の宿
主細胞へ転移することができないDNA分子。
転移するには、他のDNA、例えばヘルパープ
ラスミドによつて供給される機能体が必要とな
る。 ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エス
テルおよび含窒素異項環塩基から構成されてい
るDNAまたはRNAの単量体単位。この塩基は
糖部分とグリコシド結合で連結しており（ペン
トースの1′位の炭素）、この塩基と糖とが結合
したものがヌクレオシドである。ヌクレオチド
の特性はこの塩基によつて決まる。DNAの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン
（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン
（“Ｔ”）である。RNAの４個の塩基はＡ、Ｇ、
Ｃおよびウラシル（“Ｕ”）である。 表現形質 発育環境と遺伝子形質との相互関係に
よつて生成する個体の観察し得る特性 プラスミド それ自体が宿主細胞中で複製され
る、完全な（無傷の）レプリコンからなる非染
色体性の２本鎖DNA配列。このプラスミドを
単細胞生物に入れると、そのプラスミドの
DNAによつて、その生物の性質が変る、即ち
形質転換される。例えば、テトラサイクリン耐
性（TcR）のための遺伝子を持つたプラスミド
により、本来はテトラサイクリンに感受性のあ
る細胞が耐性のある細胞に形質転換される。プ
ラスミドによつて形質転換された細胞を形質転
換体と呼ぶ。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−ア
ミノ基とカルボキシル基とのペプチド結合によ
り互いに連結した線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制してい
る、暗号配列の開始点より上流のDNA配列 プロモーター配列 RNAポリメラーゼが結合す
る配列であり、ポリメラーゼはそれより下流の
配列の忠実な転写を促進する。 組換えDNA分子または雑種（ハイブリツド）
DNA 少なくとも２個のヌクレオチド配列から
なり、その一方の配列は、自然界では通常第２
の配列と共存しない、その様な配列からなる雑
種のDNA配列 組換え DNA分子またはDNA分子の一部分の新
しい結合体を創製すること 相同領域 DNA別の領域に於ける配列と同じ
DNA配列を持つているDNA領域 レプリコン DNAの複製開始サイトおよび複製
を支配するのに必要な機能を指定している遺伝
子を持つた自己複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的DNA配列を認識
する酵素による２本鎖開裂によつて生じる
DNA分子 RNAポリメラーゼ DNAのRNAへの転写をつ
かさどる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるDNA配列であ
つて、それがある細胞内で発現された時、その
DNA配列を含んでいない細胞より増殖しやす
い有利性をその細胞に与えるDNA配列。細胞
を適当な選択的増殖培地に置くと、この２つの
タイプの細胞を区別することができる。通常使
用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物質
耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状DNA分子を組換えて、相
互組込みされた大きい環状体を形成させる操作
過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝
子 Ｔ−DNA 植物細胞ゲノムに安定に組込まれる
ことが見い出されているTiプラスミドの部分 Ｔ−領域 植物細胞ゲノムへ転移するDNA配列
を含んでいるTiプラスミドの部分 Tiプラスミド 感受性植物に腫瘍（クラウンガ
ル）を誘発させるための遺伝情報を含んでいる
Agrobacterium tumefaciens株に存在する大
きいプラスミド TL−DNAおよびTR−DNA オクトピンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−DNA配列、即ち
左Ｔ−DNA（TL−DNA）および右Ｔ−DNA
（TR−DNA）を含有し得る。TL−DNAはノ
パリン腫瘍細胞のＴ−DNAと共通している配
列を持つているがTR−DNAは持つていない。 tra（転移機能（体）） プラスミドに暗号化され
ている拡散性の生成物、および細胞間のDNA
転移の際に利用される作用部位の両者を指す。
例えば２つの細胞の間に橋を作るのに必要な生
成物およびDNA転移が開始する部位。 転写 構造遺伝子からmRNAが生産される過程、
または、塩基対（ベースペア）の形成により、
DNAに含まれている遺伝情報に基きそれに相
補的な塩基配列をもつRNA鎖が形成される過
程 形質転換 細胞のDNA補体（complement）に
外来性DNAが導入されることによつて生じる
遺伝的修飾 翻訳 mRNAからポリペプチドが生産される過
程、あるいは、mRNA分子に存在する遺伝情
報が、ポリペプチド合成において特定のアミノ
酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組
織中の細胞の外観が均一であること ベクター 異なつた宿主細胞間を転移するように
設計されたDNA分子 組換えDNA技術の進歩によつて、微生物の遺
伝子工学に新たな展望が開けた。もし１個の体細
胞から、完全な生物を再生することができたら、
これらの技術は多細胞真核生物にまで広がるであ
ろう。ある種の高等植物の細胞は、優れた再生能
力を有し、従つて高等生物の遺伝子工学にとつて
かつこうの材料となる。 植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外来性
DNAを植物ゲノムに導入する為の系の利用性に
ある。この様な系には、グラム陰性土壌細菌の
Agrobacterium tumefaciensが持つている腫瘍
誘起（Ti）プラスミドがある。この微生物は、
広範囲の双子葉植物の損傷組織に、クラウンガル
（crowngall、冠状コブ）と呼ばれる腫瘍性形質
転換を引き起す原因となることがわかつている。
この増殖性の腫瘍は、オパイン（opines）と呼ば
れるTiに特異な新しい代謝物を合成する。この
形質転換は、分子レベルでみると、Tiプラスミ
ドの実体のはつきりわかつているＴ−DNA（転移
DNA）フラグメントが植物細胞ゲノムに転移し
て安定に組込まれたことによつて起る。換言すれ
ば、クラウンガル腫瘍は、その染色体DNAに、
腫脹セルラインをもたらしたTiプラスミド中の
DNA配列と相同のＴ−DNAと呼ばれるDNAセ
グメントを含んでいる。あらゆる場合に於いて、
このＴ−DNAは、連続した一連のTiプラスミド
DNAに相当しており、また、これと共直線性で
ある。従つてこれはＴ−領域と呼ばれる。 Tiプラスミドはクラウンガル細胞で合成され
たオパインのタイプによつて分類される。クラウ
ンガル細胞でノパリン［Ｎ−α−（１，３−ジカ
ルボキシプロピル）−Ｌ−アルギニン］の合成を
惹起させるAgrobacterium株はノパリン株と呼
ばれ、オクトピン［Ｎ−α−（Ｎ−１−カルボキ
シエチル）−Ｌ−アルギニン］を合成するものは
オクトピン株と呼ばれる。これらが最も普通に用
いられるAgrobacterium株である。 植物の遺伝手術にＴ−DNAをベクターとして
使用する試みがモデル実験で行なわれた。この実
験では、インビボにおいて、Agrobacterium
T37株のTiプラスミドからのＴ−DNAの右側境
界部の近くに14kb細菌性トランスポゾン
（transposon）Tn7が挿入された。すると、この
Tiプラスミドを持つているアグロバクテリアに
よつて惹起される腫瘍中のノパリン合成が消滅し
た。更に、サザーン・ブロツテイング・ハイブリ
デイゼーシヨンの結果、その様な挿入を行なわな
ければ正常であるＴ−DNA配列の一部分として、
この腫瘍の染色体DNA中に全Tn7が存在するこ
とがわかつた（Hernalsteensら、Nature287
（1980）、654−656；Holstersら、Mol.Gen.
Genet.185（1982）、283−289）。この様に、23kbT
−DNAに14kbDNAフラグメントを導入しても、
23kbT−DNAの植物細胞ゲノムへの転移能力に
変化は見られなかつた。 ノパリン株、Agrobacterium T37のTiプラス
ミドのＴ−DNAの境界部は非常に正確に調べら
れている。これは全ノパリンTiプラスミドの極
く一部、約23kbに過ぎない。更に、このＴ−
DNAの境界部は知られている：即ち、このＴ−
DNAの境界部を決めているヌクレオチド配列が
調べられ、ノパリンTiプラスミドの同じ領域と
比較された（Zambryski、Science209（1980）、
1385−1391；Zambryskiら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1982）、361−370）。このＴ−領域の境界部が、
Ｔ−DNAの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関
係している様である。 DNAを植物細胞へ転移させる為のベクターと
してTiプラスミドを使用するには、転移した
DNAの境界部を決めているＴ−DNA配列を知る
ことが基本的に必要である。そうすれば、外来性
DNAをこの境界内に挿入し、確実に植物細胞ゲ
ノムへ転移させることができる。更に、この系を
利用しようとすれば、形質転換された植物細胞
が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、
正常であるということが重要である。Ｔ−DNA
転移の後、正常細胞を生産するには、Ｔ−DNA
自体によつて暗号化されている機能を知る必要が
ある。従つて、どの領域が腫瘍表現形質に関係し
ているか調べるために、TiプラスミドのＴ−領
域の撤底的な遺伝子分析が行なわれた。 Ｔ−DNAは、クラウンガル表現形質の原因と
なる機能体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ
−DNAの特定の領域に局在化している
（Leemansら、EMBO J.1（1982）、147−152；
Willmitzerら、EMBO J.1（1982）、139−146）。
一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質を支配
している少なくとも４つの遺伝子が存在してい
る。これらの遺伝子の突然変異体（ミユータン
ト）は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転
換組織を形成させることができる。この後者の成
果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織中で発現さ
せる為にDNAを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。 最近、完全な正常植物に再生することができる
形質転換新芽を誘導するTiプラスミド変異体が
みつかつた。これらの植物は繁殖力が旺盛であ
り、減数分裂によつてＴ−DNA特異配列を伝達
することさえした：即ち、子孫の植物もＴ−
DNA特異配列を含んでいた（Ottenら、Mol.
Gen.Genet.183（1981）、209−213）。しかし、こ
の形質転換植物組織は、その染色体DNA中に、
腫瘍表現形質を支配しているＴ−DNA領域が除
去される大がかりな欠損が発生したことにより、
著しく小さくなつたＴ−DNAを含んでいた。こ
の欠損が当初の形質転換時に起つたのか、新芽の
形成をもたらすその後の過程で起つたのかは不明
である。 Tiプラスミドは大きく（200kb）、そのTiプラ
スミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子
が植物の形質転換に関係している。従つて、Ｔ−
領域内の適切な場合に特殊なエンドヌクレアーゼ
認識サイトを有し、Ｔ−DNAを植物細胞ゲノム
に転移させて安定に挿入するのに必要な全ての機
能を持つたTiプラスミド由来の小型のクローニ
ングベクターを組み立てることは不可能である。
所望のDNAフラグメントをTiプラスミドのＴ−
領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為の
既知の方法の１つは、Escherichia coli（大腸菌）
におけると同様、Agrobacteriumにおいても複
製することができ、Ｔ−DNAの所望の制限フラ
グメントを含んでいるクローニングプラスミドを
組み立てることである。この様なクローニングベ
クターは「中間ベクター」と命名された。この様
な中間ベクターは、Ｔ−領域によつて暗号化され
ている機能を分析するのに使用された
（Leemansら、J.Mol.Appln.Genet.1（1981）、149
−164）。 本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノム
へ導入する方法に関するものである。本発明の１
つの目的は所望のあらゆる遺伝子（群）を導入す
ることのできる改良されたアクセプターTiプラ
スミドを提供することにある。導入される所望の
遺伝子（群）は、そのアクセプターTiプラスミ
ドの相当する領域と相同の領域を持つた新規な中
間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発
明の目的の１つである。 所望の遺伝子（群）のアクセプターTiプラス
ミドへの導入は、Agrobacteriumに保持されて
いるアクセプターTiプラスミドと中間クローニ
ングベクターの２つの相同DNAセグメントの間
で起る単一乗換えによつて達成される。この中間
クローニングベクターは、ヘルパープラスミドを
使つて、それが増殖するEscherichia coliから
Agrobacteriumに授動される。この様なヘルパ
ープラスミドおよび授動のための機能は知られて
いる（Fibbeganら、Mol.Gen.Genet.185（1982）、
344−351；Figurskiら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA76（1979）；Dittaら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA77（1980）、7347）。 Agrobacteriumでの単一乗換えの結果、ハイ
ブリツドTiプラスミドベクターが得られる。こ
の様なハイブリツドTiプラスミドも本発明の目
的の１つである。 Agrobacteriumに保持されたこのハイブリツ
ドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物と
いう）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所
望の遺伝子生成物の発現についてスクリーニング
する。植物細胞をベクター組成物で感染させて形
質転換植物細胞を調製するこの方法、その形質転
換された植物細胞、およびそれから発生した植物
を提供することも本発明の目的である。この技法
はAgrobacteriumの植物転移性のプラスミド全
てに適用することができる。 以下に添付の図面について詳細に説明する。 第１図は、境界配列１および２を除き、Ｔ−領
域の内部部分を除去して得られる本発明のアクセ
プターTiプラスミドの１態様を示している。こ
の境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込
むのに必須である。境界配列１と２の間の領域３
が、植物に転移されるであろうDNAセグメント
である。このアクセプターTiプラスミドは、中
間クローニングベクターを単一乗換えによつて組
込ますことを可能にしている中間クローニングベ
クター内のDNA配列の少なくとも一部と相同の
DNA配列を持つたDNAセグメント３を含んでい
る。Tiプラスミド領域４は、Agrobacteriumに
よつてＴ−領域が植物細胞ゲノムに転移するのに
必要な機能を暗号化している。この領域は、vir
−領域と呼ばれる。 第２図は、単一乗換えによつて第１図のアクセ
プターTiプラスミドに挿入される本発明の中間
クローニングベクターを示している。このベクタ
ーは、所望の単一乗換えを可能にするアクセプタ
ーTiプラスミドのDNAセグメント３の少なくと
も一部と相同なDNA配列を持つたクローニング
媒体DNAセグメント３′を含んでいる。更に、こ
の中間クローニングベクターは、その天然のプロ
モーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群５
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に
植物の遺伝子を使用することができる。それは、
他のものに比較して発現され易いと思われるから
である。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝
子を挿入することができる。この中間クローニン
グベクターは選択マーカー遺伝子６を含んでいて
もよい。この遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子
の発現を可能にするプロモーター配列を含んでい
なければならない。このマーカー遺伝子を含んで
いる植物細胞は、それを含んでいない細胞より、
成長の選択有利性を持つていなければならない。
何故なら、この様にして、このマーカー遺伝子を
含んでいるDNAによつて形質転換された植物細
胞を、非形質転換細胞と区別することができるか
らである。 第３図は、第２図の中間クローニングベクター
と類似の、第１図のアクセプターTiプラスミド
に単一乗換えによつて挿入される本発明に係る中
間クローニングベクターのもう１つの態様を示し
ている。これは、クローニング媒体DNAセグメ
ント３′、所望の遺伝子の統制のとれた発現を可
能にする外来性プロモーター配列８、および、所
望により、マーカー遺伝子６を含んでいる。 第４図は、第１図のアクセプターTiプラスミ
ドおよび第２図並びに第３図の中間クローニング
ベクターからの、単一乗換えによる本発明に係る
ハイブリツドTiプラスミドベクターの調製を示
す模式図である。 第５図は、E.coliからアクセプターTiプラスミ
ドを含んでいるAgrobacteriumへの、中間クロ
ーニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程を
概略したものである。第１段階は、中間クローニ
ングベクターを含んでいるE.coli株(1)と、その後
のAgrobacteriumとの接合の為の２つのヘルパ
ープラスミドを含んでいるもう１つのE.coli株と
の接合である。１方のヘルパープラスミドはプラ
スミド転移に重要なDNA配列（tra）を含んでお
り、他方のヘルパープラスミドは授動に重要な配
列（mob）を含んでいる。接合によつてこれらの
ヘルパープラスミドがE.coli株(1)に導入される
と、そこに含まれている中間クローニングベクタ
ーが他の細菌株へ転移することができる様にな
る。traおよびmobヘルパープラスミドは、中間
クローニングベクターが持つている抗生物質耐性
マーカー（Abr1）とは異なるマーカー、Abr2お
よびAbr3をそれぞれ持つている。従つて、全て
のプラスミドが存在するかどうかを選択培地上で
モニターすることができる。こうして授動株(3)が
得られる。この授動株(3)を、第１図アクセプター
Tiプラスミドを含んでいるA.tumefaciens株(4)と
接合させ、中間クローニングベクターの抗生物質
耐性マーカーで選択する。中間クローニングベク
ターはAgrobacterium中で複製できないので、
受容アクセプターTiプラスミドと相互組込み体
を形成した場合にのみ、保持されることができ
る。Agrobacterium中のこの相互組込み構造体
(5)が、DNAを植物細胞ゲノムに転移させるのに
使用される最終的なハイブリツドTiプラスミド
である。 第６図は、第１図に示したものと同類のモデル
アクセプターTiプラスミド（タイプＡ）の組み
立てを示している。ここでは、Tiプラスミドと、
このものとTiプラスミドの一部と置き換わる
DNA配列を含んでいる別のプラスミドとの間で、
二重乗換えが起る。より具体的に述べると、小さ
い方のプラスミドはクローニング媒体３の中にＴ
−領域の境界配列１，２を含んでいる。二重乗換
えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去され、代
つてクローニング媒体で置き換えられる。得られ
たアクセプターTiプラスミドＡは、境界配列１，
２の間に含まれているDNAを植物細胞ゲノムに
転移させることができる。得られた、形質転換さ
れたDNAは、TiプラスミドＡでは腫瘍の増殖を
支配している遺伝子が除去されているので腫瘍性
のクラウンガル組織をつくらない。Tiプラスミ
ドＡは、クローニング媒体３と相同性を有するあ
らゆる中間クローニングベクター用の極めて普遍
的なアクセプターTiプラスミドである。このク
ローニング媒体３は通常のプラスミドでよく、例
えばpBR322またはその誘導体などによつて置き
換えることができる。 第７図は、中間クローニングベクターをE.coli
宿主細胞中で組みたてる工程を模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトR1に
囲まれた所望の遺伝子５および制限エンドヌクレ
アーゼサイトR2で囲まれた選択し得るマーカー
遺伝子６を、酵素R1およびR2の為のそれぞれ１
つの制限サイトを含んでいるクローニング媒体
３′に挿入する。３つの分子を全て制限酵素R1お
よび／またはR2で消化し、DNAリガーゼを用い
てライゲーシヨン（結紮）して中間クローニング
ベクターを形成させる。このクローニング媒体
３′は、細菌遺伝子学の選択マーカーとして使用
する抗生物質耐性（Abr1）を暗号化しているも
う１つのDNA配列を含んでいなければならない。
所望の遺伝子５はその天然のプロモーターまたは
第２図および第３図に概説した外来性プロモータ
ーの支配下にある。 第８図は本発明に係るアクセプターTiプラス
ミド（タイプＢ）のもう１つの具体的態様を組み
立てるための模式図である。この態様では、境界
配例１および２のすぐ外側のTi配列に相同の、
それぞれDNA配列９および１０を含んでいるク
ローニング媒体とTiプラスミドとの間で二重乗
換えが起る。この二重乗換えによつて、境界配列
１および２を含んでいるＴ−領域Ｔ全体が削除さ
れ、それがクローニング媒体３で置き換えられ
る。TiプラスミドＢは、境界配列１および２の
間にクローンされた所望の遺伝子を含有している
中間クローニングベクターのためのアクセプター
である（第９図参照）。 第９図は、第８図のアクセプターTiプラスミ
ドＢに単一乗換えによつて挿入される本発明の中
間クローニングベクターを例示している。これ
は、所望の遺伝子５の両端に位置する境界配列１
および２を含んでいる。これはまた、２つのプラ
スミド間の相同的組換えを可能にするため、アク
セプターTiプラスミドＢ中のクローニング媒体
配列と少なくとも一部が相同であるクローニング
媒体配列３′をも含んでいる。 第１０図は、第８図のアクセプターTiプラス
ミドおよびそれに対応する第９図の中間クローニ
ングベクターから、本発明のハイブリツドTiプ
ラスミドベクターの組み立てを示す模式図であ
る。単一乗換えによつて第９図の中間クローニン
グベクターが第８図のアクセプターTiプラスミ
ドＢに導入される。 第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例
示するものである。 第１１図は、5.2kb HindフラグメントAcgB
のpBR322への挿入を示している（Zambryski
ら、Science209（1980）、1385−1391）。このフラ
グメントAcgBはノパリンTiプラスミドの左右の
境界領域を含んでいる。このクローンpAcgBは、
第６図に示した「Ａ−タイプ」のアクセプタープ
ラスミド、pGV３８５０の組み立てに使用され
る。野生型Tiプラスミドの左右の境界領域を含
んでいるこのクローンされた制限フラグメントを
使つて、クローンpAcgBと類似のクローンを得
ることができることは、当業者には容易に理解さ
れるはずである。 第１２図はノパリンTiプラスミドpGV３８３
９のＴ−領域を示している。Hind制限エンド
ヌクレアーゼサイトはＨで示してある。変異した
Hindフラグメント１９は（１９′）で示してあ
る。カナマイシンまたはネオマイシン耐性を付与
するアセチルホスホトランスフエラーゼ遺伝子は
aptで表わし、これは黒くぬりつぶした部分に存
在している。Ｔ領域の境界は矢印で示してある。
ノパリンシンターゼ（synthase）遺伝子はnosで
表わした。数値は、Depickerら（plasmid、３
（1980）、193−211）の方法による制限フラグメン
トの大きさを表わしている。TiプラスミドpGV
３８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの
文献に従つて組み立てることができる。 第１３図は、アクセプターTiプラスミドpGV
３８５０の組み立てを示している。プラスミド
pBR３２２−pAcgB（第１１図）は、線状化した
形で描いてある。pBR３２２の配列は斜線を入
れた領域で示し、pBR３２２のアンピシリン耐
性遺伝子はApRで示した。第１２図に示したpGV
３８３９のＴ−領域の一部がここに描かれてい
る：pAcgBとの相同的組換えに関与するHind
フラグメント10および23およびapt遺伝子が含ま
れている。二重乗換えによつてpGV３８５０お
よび失われたapt遺伝子を含むもう１つのレプリ
コンが組み立てられる。 第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間ク
ローニングベクターpGV７００の組み立てを模
式的に示したものである。制限エンドヌクレアー
ゼサイトを示すのに以下の略号を用いた：Ｂ＝
BamH、Bg＝Bgl、Ｅ＝EcoR、Ｈ＝Hind
、Ｓ＝Sal、Sm＝Sma。抗生物質耐性を
示すのに以下の略号を用いた：Ap＝アンピシリ
ン、Cm＝クロラムフエニコール、Sm＝ストレ
プトマイシン、Tc＝テトラサイクリン。TL−
DNAで示した図の下部の数値は、この領域の
RNA転写体を示している（Willmitzerら、
EMBOJ.1（1982）、139−146）。 第１５図は中間クローニングベクターpGV７
５０の構造を示している。その組み立ては実施例
２に記載した。制限エンドヌクレアーゼサイト
は、キロ塩基対（kb）の数で表わしたその相対
的位置で示した。Pstサイトは示していないが
KmR／NmR領域に３つ、CbR遺伝子に１つ存在す
る。左右の境界領域も示してある。pGV７５０
の組み立てに使用されたBgl／BamHサイト
およびHpa／Smaサイトが示されているが、
これはpGV７５０には存在しない。影をつけた
領域はTL−DNAに、黒い領域はKmR／NmR領
域に、白ぬき部分は隣接するTiプラスミド配列
に、そして線はクローニング媒体pBR３２５に
それぞれ相当する。その他の略号は以下の意味を
有する：Ocs＝オクトピンシンターゼ、CmR＝ク
ロラムフエニコール耐性、CbR＝カルベニシリン
（アンピシリン類似体）耐性、KmR／NmR＝カナ
マイシン耐性／ネオマイシン耐性。 第１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベク
ターpGV７４５の組み立てを示している。pGV
７４５は、第８図に示した「Ｂタイプ」アクセプ
タープラスミド、pGV２２６０の組み立てに使
用される。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下
の略号で示した：Ｂ＝BamH、Ｈ＝Hind、
Ｒ＝EcoR。アンピシリン耐性遺伝子は、ApR
で示した。斜線を施した領域はオクトピンTiプ
ラスミドのＴ−DNA領域の左側と相同のDNA
を、白ぬき領域はオクトピンTiプラスミドのＴ
−DNA領域の右側と相同のDNAを示している。
出発物質であるプラスミドpGV０２１９および
pGV０１２０についての物理的位置および記述
は、De VosらのPlasmid6（1981）、249−253にみ
られる。 第１７図はアクセプタープラスミドpGV２２
６０の組み立てを示している。pGV２２１７中
の欠損置換が、ネオマイシンとカナマイシンに対
する耐性を付与するアセチルホスホトランスフエ
ラーゼ遺伝子（aptで表わしてある）を含んでい
る黒色部分で示してある。中間ベクターpGV７
４５（第１６図参照）は線状化して描いてある。
これは第１６図に示したpGV７４５のHindサ
イトで開裂したものである。pBR３２２の配列
は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性遺
伝子はApRで示してある。二重乗換えによつて、
pGV２２６０が組み立てられ、apt遺伝子が失わ
れる。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略
号で示した：Ｂ＝BamH、Ｈ＝Hind、Ｒ＝
EcoR。 第１８図は、ノパリンシンターゼ遺伝子
（nos）のプロモーターの下流の遺伝子を発現す
るためのプラスミドpLGV２３８１の組み立てを
示している。５′および３′はそれぞれ転写開始と
転写終了を意味し、ATGおよびTAAは翻訳開始
および翻訳終了に使われるコドンを表わしてい
る。太線はnosプロモーター領域、白ぬき部分は
nos暗号領域を示している。ApRはアンピシリン
耐性、KmRはカナマイシン耐性を示している。 第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ
（ocs）暗号配列を含んでいるプラスミドpAGV４
０の組み立て、およびプラスミドpLGV２３８１
（第１８図参照）中nosプロモーターの後部への
その挿入を示している。太線はプロモーター領
域、白ぬき部分はocs暗号領域を示している。そ
の他の記号は第１８図と同じである。 第２０図は、ノパリンシンターゼ（nos）遺伝
子のプロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列
およびオクトピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融
合した後の同じ領域の周囲のヌクレオチド配例を
示している。融合点は星印（＊）で示した。いく
つかの制限エンドヌクレアーゼサイト、即ち、
BamH、Hind、およびSacも示してある。
５′および３′は転写開始および終了を意味する。
ATGは翻訳に使われる最切のコドン、TAAは翻
訳に使われる終了コドンを表わしている。白ぬき
の大きい矢印はノパリン遺伝子の暗号化領域、縞
の入つた矢印はオクトピン遺伝子を表わしてい
る。 以下に本発明を詳細に説明する。 第１図にアクセプターTiプラスミドを簡単に
図式化して示した。このアクセプターTiプラス
ミドは、野生型腫瘍誘起Tiプラスミドの２つの
境界配列１，２または領域を含んでいる。この境
界配列は、TiプラスミドのＴ−領域を植物細胞
ゲノムへ組込むのに必須である。換言すれば、あ
らゆるDNA配列３またはＴ−領域を、これらの
配列間に存在している植物細胞ゲノムに組込むの
にこの境界配列が絶対に必要である。 このアクセプターTiプラスミドDNA配列３に
は、第２図および第３図に示した中間クローニン
グベクターのDNA配列３′の少なくとも１部と相
同のDNAセグメントが含まれている。この相同
性は、中間クローニングベクターとアクセプター
Tiプラスミドが単一乗換え（相同性組換え）に
よつて相互組込みするのに必要である。相互組込
み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の長
さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、
通常１〜14kbの領域が使われる（Leemansら、
J.Mol.Appl.Genet.1（1981）、149−164）。 アクセプターTiプラスミドは更に、
AgrobacteriumによつてTiプラスミドのＴ−領
域が植物細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列４
を含んでいる。 この様なアクセプターTiプラスミドの組み立
ておよび第２図および第３図に示した中間クロー
ニングベクターとのその相互組込みについて、第
４図を参照しながら以下に詳述する。 第２図および第３図に、発現しようとする、即
ち、植物細胞中でプロモーターの支配下に転写さ
れ、翻訳される所望の原核性または真核性遺伝子
をクローンするための中間クローニングベクター
を簡略化した図で示した。これらの中間クローニ
ングベクターは、アクセプターTiプラスミドの
DNAセグメント３の少なくとも一部と相同であ
り、従つて単一乗換えを可能にするDNA配列を
含んでいるクローニング媒体からのDNAセグメ
ント３′を含んでいる。さらに、この中間クロー
ニングベクターは、その天然のあるいは外来性の
プロモーター配列を含む少なくとも１つの所望の
遺伝子５，７を含んでいる。このプロモーター配
列によつて、挿入された遺伝子配列の発現が可能
である。所望の挿入遺伝子（群）の発現を調整す
るために、外来性のプロモーター配列（仕立て上
げたプロモーター）を使うことも可能である。 調整の各種の例として、以下のものを挙げるこ
とができる：(i)組織に特異な発現、即ち、葉、
根、茎、花など、(ii)発現レベル、即ち、発現の強
弱、(iii)誘導性発現、即ち、温度、光または添加さ
れた化学的因子による発現など。 中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の
例としては、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成
をコントロールして植物の栄養価や成長を改良す
る遺伝情報を持つたDNAフラグメントまたは配
列、外部から病原物質に対する保護、例えば病原
生物またはストレスとなる環境因子に対する耐
性、を付与する生産物の合成をコントロールする
遺伝情報を持つたDNAフラグメントまたは配列、
遺伝子工学によつて改良しようとする植物の基本
的な過程に情報を与える生産物の合成をコントロ
ールする遺伝情報を持つたDNAフラグメントま
たは配列など。 第２図および第３図は、選択可能なマーカー遺
伝子６を含んでいることもある中間クローニング
ベクターを表わしている。選択可能なマーカー遺
伝子としては、例えば抗生物質または有毒な類似
物質（例えばアミノ酸類縁体）を暗号化している
遺伝子、受容宿主細胞の欠損を補う遺伝子などが
挙げられる。 第４図は、ハイブリツドTiプラスミドベクタ
ーの組み立てに関与する構成を示しており、第５
図は、そのハイブリツドTiプラスミドベクター
を保持しているAgrobacteriumの分離に関与す
る実際の接合工程を表わしている。この工程は、
中間クローニングベクターがE.coli中で組み立て
られるので、この中間クローニングベクターを
Agrobacterium中のアクセプタープラスミドに
転移させるのに必要である。 Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されて
いる改良Tiプラスミドを調製するのに用いられ
る既知の転移手法は多数の工程からなつている。
通常、大抵のDNA組換え操作は、特別に設計さ
れたクローニング媒体、例えばpBR３２２
（Boliver、Gene2（1977）、75−93）中で行なわれ
る。しかしこのクローニング媒体は、それ自体
Agrobacteriumに移動することができない。こ
の問題は、既知の方法では次の様にして解決され
ている： (a) Agrobacterium中でも複製し得る別の広範
囲宿主用クローニング媒体、例えばmini−Sa
プラスミド（Leemansら、Gene19（1982）、361
−364）でpBRクローニング媒体配列を置換す
る。この操作はE.coli中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。 (b) 所望のDNAを含有している中間クローニン
グベクターを保持したE.coli株と、
Agrobacterium中では複製できないがそれ自
体および他のDNAのAgrobacteriumへの転移
を仲介することのできるヘルパープラスミドを
保持した別のE.coli株との接合。 (c) 工程(b)で得られるE.coliとTiプラスミドを含
んでいるAgrobacteriumの接合。ヘルパープ
ラスミドは失われる。 (d) 中間クローニングベクターは、独立したレプ
リコンとしてAgrobacterium中で複製し、存
在することができるので、工程(c)で得られた接
合体は、中間クローニングベクターとTiプラ
スミドとの相互組込み体を含んでいる細胞、ま
たは中間クローニングベクターおよび相互組込
みが起らなかつたTiプラスミドを含んでいる
別の細胞の混合物である。相互組込み体だけを
特異的に分離する為に、Tiプラスミドのない
別のAgrobacterium株との接合をもう一度行
なわなければならない。この転移は、Tiプラ
スミド自体によつて暗号化されている機能によ
つて仲介される。この第２のAgrobacterium
株への中間クローニングベクターの転移は、
Tiプラスミドとの相互組込み体の形でのみ行
なわれる。 (e) 所望の置換を行なつた最終的な改良Tiプラ
スミドを得るために、第２回目の乗換えが行な
われる（Leemansら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1981）、149−164）。 僅かにもう一つの既知の方法は、上記工程(d)に
おいて、中間クローニングベクターと適合しない
別のプラスミドをAgrobacteriumに導入するこ
とを除けば、上の方法と基本的に同じである。こ
の場合、独立したレプリコンのままでいる中間ク
ローニングベクターは全て失われるので、相互組
込み（単一乗換え）を選択することができる
（Matzkeら、J.Mol.Appl.Genet.1（1981）、39−
49）。 ここに本発明者らは、Agrobacteriumのアク
セプターTiプラスミドに中間クローニングベク
ターを導入する為の、新規な非常に簡素化された
方法を提供するものである。簡単に言えば、この
方法は、多くの通常使用されているクローニング
プラスミド（例えばpBR３２２）を直接
Agrobacteriumに転移させるのに、E.coliのヘル
パープラスミドが役立つということを見い出した
事実に基づいている。これらのプラスミドは、い
づれもAgrobacterium中では複製できないので、
アクセプターTiプラスミドと相互組込みし得る
ものだけが保持されることになる。さらに、本発
明者らは、Agrobacterium中のこの相互組込み
体を、植物細胞への感染の為の直接のベクター組
成物として使用するのである。この様にして、本
発明者らは前記の工程(d)および(e)を省略した。こ
れによつて、改良ハイブリツドTiプラスミドを
組み立てるのに要する時間が減少し、可能な組み
立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞ゲノ
ムへDNAを転移させる為のベクターとしてこの
アクセプターTiプラスミドを使用できる可能性
が著しく高まつたのである。 即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプタ
ーTiプラスミドへの中間クローニングベクター
の導入は２工程で行なわれる。先づ、中間クロー
ニングベクターを持つたE.coli株(1)を、この中間
クローニングベクターのAgrobacteriumへの授
動を促す２つのプラスミドを持つた別のE.coli株
(2)と接合させる。これらのヘルパープラスミドの
代表的な、そして好ましい例は、mob機能を含ん
だＲ６４drd１１およびtra機能を含んだpG２８
である（Finneganら、Mol.Gen.Genet.185
（1982）、344−351）。中間クローニングベクター
のクローニング媒体上のbomサイト（Warrenら、
Nature274（1978）、259−261）が他の２つのプラ
スミドによつて暗号化されている機能体によつて
認識され、転移できる様になる。全てのプラスミ
ドは、その存在を検出するために抗生物質耐性マ
ーカーを含んでいるのが好ましい。次いで、得ら
れたE.coli株、即ち３つのプラスミド全てを保持
している授動株(3)を、中間クローニングベクター
と相同の領域を持つたアクセプターTiプラスミ
ドを保持しているAgrobacteriumと接合させる。
中間クローニングベクターとアクセプターTiプ
ラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどうか
は、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マ
ーカーについての選択によつて検出できる。 第６図は、第１図のアクセプターTiプラスミ
ドの組み立てに用いられたDNA分子を模式的に
示したものである。本明細書では、このプラスミ
ドをアクセプターTiプラスミド（タイプＡ）と
呼び、他のアクセプターTiプラスミド（タイプ
Ｂ）と区別することにする（第８図参照）。この
組み立てには、Tiプラスミドと、クローニング
媒体３中に境界配列１および２を持つているもう
１つのプラスミドとの間に二重乗換えが起ること
が必要である。図に示した様に、クローニング媒
体配列３は左側の境界配列１と右側の境界配列２
との間にある。このDNA鎖の正しい極性を示す
ために、これを環上に描くことができる。しか
し、二重乗換えに使用される相同領域を示すため
には、この環を開裂させて図示した。これは理解
を助ける為のやり方として重要であり、第８図に
於けるアクセプターTiプラスミドＢの組み立て
に於いても用いられている。即ち、もし境界配列
１および２が、単にクローニング媒体配列３内に
挿入されたのなら、二重乗換えによつて、Ｔ−領
域が削除されてはいるがこの境界配列１および２
の間のクローニング媒体配列のないTiプラスミ
ドが得られることになる。第６図に示した様に、
二重乗換えによつて、境界配列１および２の間に
もとのＴ−領域を持つた環状DNA分子が生成す
る。これはレプリコンではないので消失する運命
にある。この二重乗換えが起つたかどうかは、例
えばTiプラスミドのＴ−領域内に含まれる抗生
物質マーカーの欠落について選択したり、クロー
ニング媒体配列３内の抗生物質耐性マーカーにつ
いて選択したりして、遺伝子学的に選択すること
ができる。 第７図、第２図および第３図の中間クローニン
グベクターの組み立てを示す模式図である。制限
エンドヌクレアーゼサイトR1またはR2でそれぞ
れ囲まれた所望の遺伝子５および選択可能なマー
カー遺伝子６が、酵素R1およびR2の為の特異な
制限サイトを含んでいるクローニング媒体配列
３′に、これら全ての分子の消化およびライゲー
シヨンによつて挿入される。得られた組換え
DNA分子は、E.coli宿主細胞を形質転換するの
に使用され、その形質転換体は、クローニング媒
体配列３′の抗生物質耐性マーカー（AbR1）で選
択される。 第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセ
プターTiプラスミドＢを組み立てるのに使用さ
れるDNA分子の模式図である。この場合は、境
界配列１および２のすぐ外側に位置するDNA配
列９および１０の間にクローニング媒体配列３を
含んでいるプラスミドとTiプラスミドとの間で
二重乗換えが起る。乗換えに使用される相同領域
を示す為に、小さい方のプラスミドは開裂してあ
る（第６図と同様）。二重乗換えによる生成物は、
アクセプターTiプラスミドＢと、もとのTiプラ
スミドからのＴ−領域およびDNA配列２，１０，
９および１を含んでいる、消失するもう１つの環
状DNA分子である。遺伝子学的選択は第６図に
ついて記載したものと同様にして行なうことがで
きる。 第９図は、第８図のアクセプターTiプラスミ
ドＢと組み合せて使用される中間クローニングベ
クターの模式図である。ここでは、所望の遺伝子
５は、クローニング媒体配列３′中に含まれてい
る境界配列１および２の間に挿入される。 第１０図は、単一乗換により第９図の中間クロ
ーニングベクターがどの様にしてアクセプター
TiプラスミドＢに挿入されるかを模式的に示し
ている。この場合、中間クローニングベクターの
クローニング媒体配列３′の抗生物質耐性マーカ
ーで選択する。２つのプラスミドの間の相互組込
みの結果としてのハイブリツドTiプラスミドを
確実に見つけることができる。こうして境界配列
１および２内に含まれている所望の遺伝子を持つ
たハイブリツドTiプラスミドが得られる。この
様にして組み立てられたハイブリツドプラスミド
は、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリツ
ドTiプラスミド中の配列３および３′の様な直接
反復の配列を含有しておらず、従つて、分子内組
換えの結果として、ハイブリツドベクターまたは
植物細胞ゲノム中に導入されたDNAが不安定に
なる可能性が避けられる。 本発明者らの研究室で行なつた実験結果から、
第９図の中間ベクターの組み立てには、境界配列
１および２の両者を所有する必要はないことがわ
かつた（未発表）。しかし、所望のDNAを植物ゲ
ノムに組込むには、少なくとも右側の境界配列２
（第１図および第９図参照）を有すことが必要十
分条件である。 AgrobacteriumのTiプラスミド、例えばノパ
リンまたはオクトピンTiプラスミドの制限エン
ドヌクレアーゼ地図についての知見（Depicker
ら、Plasmid3（1980）、193−211；De Vosら、
Plasmid6（1981）、249−253）およびＴ−DNA境
界配列を含んでいる制限フラグメントについての
知見（Zambryskiら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1982）、361−370；De Beuckeleerら、Mol.
Gen.Genet.183（1981）、283−288）から、当業者
であれば誰れでも、本発明方法に従つてアクセプ
ターTiプラスミドを組み立てることができる。
この他、通常の組換えDNA技術および基礎的な
細菌の遺伝子操作を実施できる能力が要求される
に過ぎない。本発明は、ハイブリツドTiプラス
ミドベクターを組み立てるのに有効であることが
わかつた本明細書に記載したアクセプターTiプ
ラスミドを具体的に提案している点でユニークな
ものである。更に、これらのアクセプターTiプ
ラスミドは、遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入する
ための方法の一部を構成する様に設計されたもの
である。 既述したアクセプターTiプラスミド、中間ク
ローニングベクター、ハイブリツドTiプラスミ
ドベクターおよびベクター組成物を更に例示し、
植物細胞ゲノムへ組込まれた外来性遺伝子の発現
を示す形質転換植物細胞および植物を提供するの
にこのベクター組成物が有効であることを例証す
るために、以下に実施例を挙げる。 実施例 １ アクセプターTiプラスミドpGV３８５０（Ａ
タイプ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Agrobacterium tumefaciens（野生型
Agrobacterium由来のリフアピシン耐性株C58C1
およびクロラムフエニコール−エリスロマイシン
耐性株C58C1） Tiプラスミド＝pGV３８３９ 第１１図のプラスミド＝pAcgB TiプラスミドpGV３８３９はノパリンプラス
ミドpTi C58trac（pGV３１００；Holstersら、
Plasmid3（1980）、212−230）から組み立てる。
これはＴ−領域の中央近くに欠失置換突然変異体
（ミユータント）を含んでいる：即ち、Hindフ
ラグメント19の内部のSmaフラグメント24
（Depickerら、Plasmid3（1980）、193−211）は、
Tn5のapt（アセチルホスホトランスフエラーゼ）
遺伝子を含んでいるpKC7のHindフラグメント
（Raoら、Gene7（1979、79−82）で置換されてい
る。この遺伝子はアミノグリコシドネオマイシン
およびカナマイシンに対する耐性を暗号化してい
る。pGV３８３９のＴ−領域の制限地図を第１
２図に示す。 プラスミドpAcgBは、Ｔ−DNAの境界部だけ
を含んでいるpBR３２２中のAcgBの挿入体であ
る（第１１図参照）。この境界部はＴ−DNAの末
端部として定義され、これら領域は、Ｔ−DNA
の植物細胞ゲノムへの安定な組込みに役割を果た
す。このクローンの起源および分析については詳
しく記載されている（Zambryskiら、Science209
（1980）、1385−1391）。このクローンは、形質転
換されたタバコDNAからＴ−DNAの部分を再分
離することにより得られた。pAcgBは、Ｔ−
DNAの左右の境界を含む様に縦列に並んだ２つ
のＴ−DNAコピーの接合点を含んでいる。更に、
pAcgBは、その遺伝子情報が右側Ｔ−DNA境界
のすぐに位置しているという理由でノパリンシン
ターゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミド
pAcgBは、「タイプＡ」アクセプターTiプラスミ
ド、pGV３８５０の組み立てに使用される。第
６図は関与する構造の概略を、第１３図はpGV
３８５０を与える二重乗換えに関与するDNA領
域をより正確に示したものである。 上記のプラスミドpAcgBは、そのpBR３２２
部分にColE1−特異bomサイトを持つており、ヘ
ルパープラスミドＲ６４drd１１およびpGJ２８
を使つてE.coliからAgrobacteriumへ授動するこ
とができる。E.coliに含まれているプラスミドＲ
６４drd１１およびpG２８は、接合により、
pAcgBを持つたE.coli株に導入される。トランス
接合体は、アンピシリン耐性（pAcgBのpBR３
２２配列から）、ストレプトマイシン耐性（Ｒ６
４drd１１から）、およびカナマイシン耐性（pGJ
２８から）コロニーとして選択される。 ３つのプラスミドの全てを保持しているE.coli
株を、リフアンピシン耐性でありTiプラスミド
pGV３８３９を含んでいるAgrobacterium株Ｃ
５８Ｃ１に接合させる。ノパリンTiプラスミド
との最初の単一乗換えを選択するのにpBR３２
２のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン
をAgrobacterium中で安定させることができる
唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域の１
つでpGV３８３９と相同組換えにより乗換えを
することである。他の相同領域での２回目の乗換
えにより、apt遺伝子（カナマイシン耐性）を含
んでいるpGV３８３９のＴ−領域の中央部がク
ローンpAcgBのpBR３２２配列で置換される。
従つて、第２の組換え体はアンピシリン耐性、カ
ナマイシン感受性である。第２の組換え体を分離
する確率を高めるために、最初の組換え体
（pAcgB：：pGV３８３９）を保持しているリフ
アンピシン耐性Agrobacteriumを、Tiプラスミ
ドを持つていない第２のクロラムフエニコール／
エリスロマイシン耐性Agrobacterium株と接合
させる。この様にして、約600コロニー中、１コ
ロニーの割合で、アンピシリン耐性、カナマイシ
ン感受性のクロラムフエニコール／エリエロマイ
シン耐性AgrobacteriumpGV３８５０を得るこ
とができる。 勿論、pGV３８５０タイプのアクセプターTi
プラスミドを組み立てるのに使用することができ
るその他のTiプラスミドもある。Ｔ−領域の中
央近くに選択し得るマーカー遺伝子を持つたTi
プラスミドは全て受容体として使用できる。更
に、左境界フラグメント−pBR３２２−右境界
フラグメントの方向に、左右の境界フラグメント
の中間にpBR配列が位置する様に、pBR３２２
にＴ−領域境界フラグメントを挿入することによ
つてpAcgB様のプラスミドを組み立てることが
できる。例えば、ノパリンTiプラスミドの左お
よび右境界フラグメントはそれぞれHindフラ
グメント１０および２３である（Depickerら、
Plasmid3（1980）、193−211）。 単一乗換えによつて、pBR３２２またはその
誘導体に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターがpGV３８５０の改良
されたＴ−DNA領域に導入される。唯一つ必要
なことは、中間クローニングベクターのE.coliか
らAgrobacteriumへの転移を選択する為の手段
として使用する為に、導入されるDNAが、既に
pBR３２２に存在するものの他にもう１つの耐
性マーカー遺伝子を含んでいるということであ
る。この耐性マーカーは、pBR配列内に含まれ
ていてもよく（例えばpBR３２５のCmR、また
はpKC７のKmR）、植物細胞内で試験される
DNA内に含まれていてもよい。更に、アクセプ
ターTiプラスミドpGV３８５０におけるApR遺
伝子pBR３２２は、KmRの様な別の耐性マーカ
ー遺伝子で置換してもよい。この様にして、ApR
であるpBR３２２含有中間クローニングベクタ
ーですら、このpGV３８５０タイプのアクセプ
ターTiプラスミドに直接授動することができる。 pGV３８５０タイプのアクセプターTiプラス
ミドのもう１つの利点は、形質転換された植物細
胞で腫瘍をつくらないということである。pGV
３８５０の短かくなつたＴ−DNA領域は、依然
としてノパリンシンターゼを暗号化している遺伝
子を含んでいるので、pGV３８５０で形質転換
された細胞は、ノパリンが存在するかどうかを分
析することにより、非形質転換細胞から簡単に選
り分けることができる。勿論、アクセプターTi
プラスミドpGV３８５０に組込まれた中間クロ
ーニングベクターがマーカー遺伝子を含んでいた
ら、それも直接スクリーニング、即ち選別にかけ
ることができる。 pBR３２２配列を含んだ上記の中間クローニ
ングベクターの単一乗換えによるアクセプター
Tiプラスミドへの挿入のほか、このアクセプタ
ーTiプラスミドは、「シヨツトガン」タイプの実
験に於いて、pBR３２２またはその誘導体中の
クローンされたDNAバンクの受容体としても使
用することができる。Agrobacterium中の全て
のハイブリツドプラスミドベクターは、植物細胞
の感染に使用することができ、次いで所望の選択
可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニン
グされる。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏して
いる植物細胞に全バンクを適用することにより、
アミノ酸合成を暗号化している遺伝子について簡
単に選別することができる。 アクセプターTiプラスミドpGV３８５０は、
２つの特徴的な表現形質を持つている：即ち、(i)
腫瘍生成能力がないこと、および(ii)もしＴ−
DNAが植物細胞ゲノム内に転移したら、ノパリ
ン合成能を有すること、である。pGV３８５０
含有Agrobacteriumで感染させた各種の植物組
織のこれらの特徴を調べるために、種々の実験を
行なつた。 (a) ジヤガイモおよびニンジンデイスクを用いた
試験 ジヤガイモおよびニンジンの切片にアクセプ
ターTiプラスミドpGV３８５０を接種すると、
少量の硬結組織が生成する。この組織にノパリ
ンが存在するかどうかを試験した所、陽性であ
ることがわかつた。この突然変異体が少量の硬
結組織を生産し得ることは興味あることでる。
しかし、それは、これらのデイスクを低濃度の
オーキシンおよびサイトキニンの両者を含んで
いる培地で生育させた時だけ得られる。 (b) 全植物をアクセプターTiプラスミドpGV３
８５０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育して
いるタバコおよびペチユニアの苗木にpGV３
８５０を接種する。数カ月後に少量の組織成長
が観察されただけである（通常、２週間後に
「野生型」腫瘍が検出される）。この組織はホル
モンを含まない培地では生育しないが、オーキ
シンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織
培養では、さらに増殖することができる。この
組織もノパリン陽性であることがわかつた。 (c) さらに、pGV３８５０「形質転換」細胞は
腫瘍性ではないので、これらの細胞は、転移し
たDNAセグメントをそのゲノムに依然として
保持している正常な植物に再生することができ
る。この形質転換細胞を通常の再生培地（実施
例５を参照）で培養すると、正常植物が得られ
よう。 pGV３８５０の、アクセプタープラスミドと
しての有用性を証明する為に、以下の実験を行な
つた。pBR３２５中にオクトピンＴ−DNAの腫
瘍機能を含んでいる中間クローニングベクター
を、pGV３８５０を保持している
Agrobacteriumに組み込んだ。単一乗換えによ
つて得られたAgrobacterium中のハイブリツド
Tiプラスミドを、傷つけたタバコ植物に諏種し
た。２週間後に腫瘍組織があらわれた。このこと
は、腫瘍誘導DNAがpGV３８５０に再導入さ
れ、形質転換植物細胞中で適切に発現されたこと
を示している。 実施例 ２ 中間クローニングベクターpGV７０００およ
びpGV７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示し
た。オクトピンTiプラスミドＢ６Ｓ３のTL−
DNAの右側部分であり、pGV０２０１（De
Vosら、Plasmid6（1981）、249−253）中に存在
するHindフラグメント１を、まず、広範囲宿
主性ベクターpGV１１２２（Leemansら、
Gene19（1982）、361−364）のHindサイトに挿
入する。組換えプラスミドpGV０２０１は、多
コピーベクターpBR３２２（Bolivarら、Gene2
（1977）、95−113）の特異なHindサイトに挿入
されたHindフラグメント１を含んでいる。
pGV０２０１およびpGV１１２２DNAは、
Betlachらが記載している方法で調製される
（Fed.Proc.35（1976）、2037−2043）。最終量20μ
中、pGV０２０１DNA2μgを、Hind２単位
（全ての制限酵素はBoehringer Mannheimから
購入した）を用いて、37℃で１時間完全に消化し
た。インキユベーシヨン緩衝液はO′Farrellらに
より記載されている（Mol.Gen.Genet179（1980）、
421−435）。同じ条件下でpGV１１２２DNA2μg
をHindで完全に消化した。 最終量20μ中、T4リガーゼ（Boehringer
Mannheim）0.02単位を用い、0.1μgのHind消
化pGV０２０１をHind消化pGV１１２２とラ
イゲーシヨン（結紮）した。インキユベーシヨン
緩衝液および条件は、製造業者の指示に従つた
（Brochure“T4リガーゼ”、Boehringer
Mannheim、1980年８月、＃10.M.880.486）。ラ
イゲーシヨン混合物のコンピテントE.coli
K514hsr-hsm+細胞（Colsonら、Genetics52
（1965）、1043−1050）への導入（形質転換）は、
DagertおよびEhrlichの方法（Gene6（1980）、23
−28）に従つて行なつた。細胞を、ストレプトマ
イシン（20μg／ml）およびスペクチノマイシン
（50μg／ml）を補足したLB培地（Miller、
Experiments in Molecular Genetics（1972）、
Cold Spring Harbor Laboratory、New
York）に塗抹した。組換えプラスミドを含有し
ている形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗
号化している遺伝子への挿入によるその不活性化
（Leemansら、Gene19（1982）、361−364）に基づ
き、テトラサイクリン感受性（10μg／ml）でス
クリーニング（選り分け）した。ストレプトマイ
シンおよびスペクチノマイシンに耐性を示し、テ
トラサイクリンに感受性を有するクローンを物理
的に同定した。マイクロスケールのDNA調製は
Kleinらの方法（Plasmid3（1980）、88−91）に従
つて実施した。pGV１１２２のHindサイト中
のHindフラグメント１の配向は、Sal消化に
よつて決定した。組換えプラスミドを消化し
（O′Farrellらの条件、Mol.Gen.Genet.179（1980）、
421−435）、アガロースゲル電気泳動にかけると
２個のフラグメントが得られた。α−配向には
0.77kbおよび22.76kbのフラグメント、β−配向
には、10.33kbおよび13.20kbのフラグメントがあ
つた。α−配向の組換えプラスミドをその後のク
ローニングに使用し、これをpGV１１６８と名
付けた。 TL−DNAの左側部分（左の境界配列を含んで
いる）を含有しているBgl−Salフラグメン
トをBgl−Salで開裂したpGV１１６８に導
入する。このフラグメントはベクターpBR３２
２に挿入された、pTiB６Ｓ３のＴ領域からの、
BamHフラグメント８を含んでいる組換えプ
ラスミドpGV０１５３（De Vosら、Plasmid6
（1981）、249−253）から得られる。pGV０１５
３およびpGV１１６８DNAはBetlachらの方法
で調製する（Eed.Proc.35（1976）、2037−2043）．
pGV０１５３DNA10μgを10単位のBglおよび
10単位のSalを用い、最終量100μ中37℃で１
時間、完全に消化した。消化混合物をプレパラテ
イブ0.8％アガロースゲル上、Allingtonらの方法
（Anal.Biochim.85（1978）、188−196）で電気溶
出し、ゲルから2.14kb Blg−Saフラグメン
トを回収した。pGV１１６８DNA2μgを２単位
のBglおよび２単位のSalで完全に消化した。
最終量20μ中、T4DNAリガーゼ0.02単位を用
いてBglSalフラグメントDNA0.1μgを0.02μg
のBgl−Sal消化pGV１１６８とライゲーシヨ
ンした。このライゲーシヨン混合物をコンピテン
トE.coliK514hsr-hsm+細胞（Dagertおよび
Erhlich、Gene6（1980）、23−28）に導入した。
細胞をストレプトマイシン（20μg／ml）および
スペクチノマイシン（50μg／ml）を補足したLB
培地（Miller、Experiments in Molecular
Genetics（1972）、Cold Spring Harbor
Loboratory、New、YorK）に塗抹した。 ストレプトマイシン−およびスペクチノマイシ
ン−耐性形質転換体から、マイクロスケール
DNAプレパレーシヨン（Kleinら、Plasmid3
（1980）、88−91）を行なつた。2.1kb Bgl−
SalフラグメントがBgl−Sal消化pGV１１
６８に挿入されている組換えプラスミドをBgl
−Sal消化により同定した。この消化で2.14kb
および21.82kbの２つのフラグメントが得られた。
これらの分子量（2.14kbおよび21.82kb）に相当
する消化パターンを持つたプラスミドをpGV１
１７１と名付け、さらにクローンするのに用い
た。pGV１１７１からの12.65kbフラグメント
は、左右のTL−DNA境界配列（De Beuckeleer
ら、in Proceedings Vth International
Conference on Plant Pathogenic Bacteria、
M.Ride′（ed.）（1978）、I.N.R.A.、Angres、115
−126）および腫瘍性の増殖を可能にする遺伝子
（Leemansら、EMBO J.（1982）、147−152）を
含んでいる。このHindフラグメントをプラス
ミドpBR３２５に挿入した（Bolivar、Gene4
（1978）、121−136）。pGV１１７１およびpBR３
２５はBetlachらの方法で調製した（Fed.
Proc.35（1976）、2037−2043）。それぞれの
DNA2μgを２単位のHindを用い、37℃で１時
間完全に消化した（インキユベーシヨン緩衝液は
O′Farrellらにより記載されている（Mol.Gen.
Genet.179（1980）、421−435））。0.1μgのHind
消化したpGV１１７１を、Hindで線状化した
0.05μgのpBR３２５と、T4DNAリガーゼ0.02単
位を用いてライゲーシヨンした。ライゲーシヨン
混合物によるコンピテントE.coli K514hsr-hsm+
の形質転換はDagertおよびEhrlichの方法で行な
つた（Gene6（1980）、23−28）。細胞を、カルベ
ニシリン（100μg／ml）を補足したLB培地
（Miller、Experiments in Molecular Genetics
（1972）、Cold Spring Harbor Laboratory、
New York）に塗抹した。カルベニシリン耐性
コロニーを、テトラサイクリン耐性を暗号化して
いる遺伝子に挿入することによるその不活性化に
基づき、テトラサイクリン（10μg／ml）感受性
でスクリーニングした（Bolivar、Gene4（1978）、
121−136）。カルベニシリン耐性、テトラサイク
リン感受性のコロニーを、そのコロニーから調製
したDNAの制限酵素消化により、マイクロスケ
ール技法（Kleinら、Plasmid3（1980）、88−91）
によつて物理的に特性化した。即ち、BamH
消化により、４つのDNAフラグメントが得られ
る：α配向の場合は0.98kb、4.71kb、5.98kbおよ
び7.02kbのフラグメントが得られ、β配向の場合
は0.98kb、4.71kb、1.71kbおよび11.20kbのフラ
グメントが得られる。こうして得られたα配向の
組換えプラスミドはpGV７００と名付けられ、
更にその後の実験に用いられた。 pGV７５０は、pGV７００に挿入されたTL−
領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している
3.49kb Bgl−Smaフラグメントの代わりに、
カナマイシン耐性を暗号化している2.81kb
BamH−Hpaフラグメントを挿入すること
により、pGV７００から誘導される。カナマイ
シン耐性を暗号化しているBamH−Hpaフ
ラグメントはλ：：Tn5（Bergら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA72（1975）、3628−3632）から得ら
れる。λ：：Tn5の調製はMillerにより記載され
ている（Experiments in Molecular Genetics
（1972）、Cold Spring Harbor Laboratory、
New York）。pGV７００DNAはBetlachらの方
法で調製する（Fed.Proc.35（1976）、2037−
2043）。pGV７００DNA2μgを２単位のBglお
よび２単位のSmaで完全に消化した。λ：：
Tn5DNA2μgを２単位のBamHおよび２単位
のHpaで完全に消化した。1μgのBamH−
Hpa消化λ：：Tn5を、最終量10μ中、
T4DNAリガーゼ0.5単位を用いて、0.2μgのBgl
−Sma消化pGV７００とライゲーシヨンし
た（製造業者の指示する条件に従つた）。このラ
イゲーシヨン混合物をコンピテントE.coli
K514hsr-hsm+細胞（DagertおよびErhlich、
Gene6（1980）、23−28）に導入した。細胞を、カ
ルベニシリン（100μg／ml）およびカナマイシン
（25μg／ml）を補足したLB培地（Miller、
Experiments in Molecular Genetics（1972）、
Cold Spring Harbor Laboratory、New
York）上に塗抹した。マイクロスケール技法
（Kleinら、Plasmid3（1980）88−91）に従つて調
製したDNAの制限酵素分析により、CbRおよび
KmRコロニーを物理的に特性化した。このDNA
をBgl／BamHで二重消化すると、3.94kb、
5.89kbおよび8.09kbの３つのフラグメントが、
Hindで消化すると2.68kb、5.99kbおよび
9.25kbの３つのフラグメントが得られる。この消
化パターンを示すプラスミドをpGV７５０と名
付け、第１５図に模式的に示した。 pGV７００とpGV７５０は、オクトピンTiプ
ラスミドpTiB6S3のTL−DNAの左右の境界配
列を含む、２つの相異なる中間クローニングベク
ターである。更に、これら２つのプラスミドでは
Ｔ−領域内の削除の程度が異なつている。pGV
７００は、オクトピンシンターゼ（トランスクリ
プト３）およびその他３つの生成物、即ち４，６
ａおよび６ｂ（Ｔ−領域の生成物については
Willmitzerら、ENBOJ.1（1982）、139−146参照）
のための遺伝情報を持つた縮小Ｔ−領域を含んで
いる。この３つの生成物（４，6aおよび6b）の
組み合せが形質転換された植物の新芽形成を促
す。pGV７５０はもつと小さいＴ−領域、即ち
オクトピンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。
生成物４，6a，および6bの為の情報は、カナマ
イシン（ネオマイシン）耐性を暗号化している抗
生物質耐性マーカー遺伝子によつて置換されてし
まつている。 pGV７００およびpGV７５０は、Ｂタイプの
アクセプターTiプラスミド（第８図および後記
実施例３参照）と共に使用し得る中間クローニン
グベクターの例である。これらのベクターは、そ
れらが所望の遺伝子を含んでいないことを除け
ば、第９図に示したものと部分的に類似してい
る。これらのベクターは、その改良Ｔ−領域内に
クローンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼ
サイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単に
それらのベクターに挿入することができる（第１
４図および第１５図参照）。 実施例 ３ アクセプターTiプラスミドpGV２２６０（タ
イプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Agrobacterium tumefaciens（野生型
Agrobacteriumから誘導される、リフアンピシ
ン耐性株C58C1およびエリスロマイシン−クロラ
ムフエニコール耐性株C58C1） Tiプラスミド＝pGV２２１７ 中間ベクター（第１６図）＝pGV７４５ TiプラスミドpGV２２１７の組み立てについ
ては詳細に記載されている（Leemansら、
FMBO J.1（1982）、147−152）。これは、オタト
ピンTiプラスミドの全TL−領域の欠失置換突然
変異体を含んでいる：即ち、BamHフラグメ
ント８，３０ｂ，２８，１７ａおよびBamH
フラグメント２の左の3.76kbBamH−EcoRIフ
ラグメント（De Vosら、Plasmid6（1981）、249
−253）が、Tn5のapt（アセチルホスホトランス
フエラーゼ）遺伝子を含んでいるpKC７のEcoR
−BamHフラグメント（Rao ＆ Rogers、
Gene7（1979）、79−82）で置き換えられている。
この遺伝子はアミノグリコシド、ネオマイシンお
よびカナマイシンに対する耐性を暗号化してい
る。 中間ベクターpGV７４５の組み立てを第１６
図に模式的に示した。これについて以下に詳述す
る。組換えプラスミドpGV７１３を、α配向で
Hindフラグメント14，18c，22eおよび33cを含
む、オクトピンTiプラスミドサブクローンpGV
０２１９（De Vosら、Plasmid6（1981）、249−
253）から誘導した。pGV０２１９DNAを
BamHで完全に消化し、次いで自己結紮（セ
ルフライゲーシヨン）に有利な条件下でライゲー
シヨンした（ライゲーシヨン混合物中のDNAの
最終濃度＜1μgDNA／ml）。アンピシリン耐性で
形質転換体を選別し、制限酵素による消化で物理
的に特性化した。こうしてpGV０２１９に存在
する6.5kb BamHフラグメントをもはや含ん
でいないクローンを分離し、これをpGV７１３
と名付け、その後のクローニングに使用した（以
下の記載参照）。BamHフラグメント２を含ん
でいる。pGV０１２０（De Vosら、Plasmid6
（1981）、249−253）から組換えプラスミドpGV
７３８を誘導した。pGV０１２０DNAをEcoR
で消化し、pGV７１３の場合と同様にして自
己結紮させた。形質転換体をアンピシリン耐性に
よつて選別し、制限酵素消化により分析した。
EcoRフラグメント20，21およびEcoRフラグ
メント19aの一部とpBV３２２の一部を含んでい
る2.95kb EcoRフラグメントが全て除去された
クローンをpGV７３８と名付け、更にその後の
クローニングに利用した。このプラスミドは、依
然としてBamHフラグメント２の右側部分か
らの5.65kb EcoR−BamHフラグメントを
含んでいる（De Vosら、Plasmid6（1981）、249
−253）。 次いでpGV７１３DNAをHindおよびBamH
で消化し、消化物をプレパラテイブアガロース
ゲルにかけた。電気泳動の後、pGV７１３内に
含まれている2.30kb Hind−BamHフラグメ
ントを電気溶出で純化した（Allingtonら、Anal.
Biochem.85（1975）、188−196）。このフラグメン
トをHindおよびBamHで完全に消化した
pGV７３８とライゲーシヨンした。形質転換後、
アンピシリン耐性コロニーを、制限酵素消化によ
り物理的に特性化する。例えば、EcoR−
BamH消化により、それぞれ3.98kb（＝ベクタ
ー部分）と7.95kb（＝挿入部分）の２つのフラグ
メントが得られるはずである。この特性を持つた
組換えプラスミドはpGV７４５と命名され、ア
クセプターTiプラスミドpGV２２６０を組み立
てるための中間ベクターとして使用された。 プラスミドpGV７４５はpBR３２２部分に
ColE1特異的bomサイトを持つており、実施例１
に記載した様に（アクセプターTiプラスミド
pGV３８５０の組み立てについて）、ヘルパープ
ラスミドＲ６４drd１１およびpGJ２８を使つて
E.coliからAgrobacteriumへ授動させることがで
きる。 pGV７４５を、リフアンピシン耐性でありTi
プラスミドpGV２２１７を含んでいる
Agrobacterium株C58C1に授動させた。最初の乗
り換えは、実施例１（アクセプターTiプラスミド
pGV３８５０の組み立て）に記載した方法と同
じ方法で、pBR３２２のアンピシリン耐性を使
つて選択した。２回目の乗り換えにより、pGV
２２１７に存在する欠失置換突然変異体がプラス
ミドpGV７４５のpBR３２２配列によつて置換
される。pGV７４５のpGV２２１７との相互組
込みの結果得られるアンピシリン耐性トランス接
合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接選別
することにより第２の組換え体を得た。この様に
して、pGV２２６０（アンピシリン耐性、カナ
マイシン感受性）を含んでいるリフアンピシン
Agrobacterium株C58C1を得た。 このTiプラスミドpGV２２６０は、pGV７０
０−またはpGV７５０−タイプの中間クローニ
ングベクター用のアクセプタープラスミド（Ｂタ
イプ）として使用されるものである。これらは、
(i)アンピシリン耐性遺伝子、複製起源および
pBR３２２のbomサイトを持つたDNAフラグメ
ント、(ii)TL−DNAの左右の境界配列のすぐ外側
に位置するDNA配列および、中間クローニング
ベクターのE.coliからAgrobacteriumへの転移並
びにそのアクセプターTiプラスミドpGV２２６
０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、
pBR３２２に既に存在している耐性マーカーと
は別の、もう１つの耐性マーカーを含んでいる
DNAフラグメント、で構成されている。 例えば、本発明者らは、pGV２２６０とpGV
７００との間の相互組込み体を持つている
Agrobacteriumは、所望のDNA配列（Ｔ−DNA
境界の間に含まれている）を植物細胞ゲノムへ転
移させ得ることを立証した。この形質転換された
植物細胞は、もしpG７００が３つの生産物のた
めの遺伝情報（４，６ａ，６ｂ；Willmitzerら、
EMBO J.1（1982）、139−146）を含んでいる場合
は、期待される表現形質、即ち新芽を生じる腫瘍
を示す。この様に、本発明者らは、Ｂタイプのア
クセプターTiプラスミドは、第９図に示し、更
に実施例２に記載したタイプの中間クローニング
ベクターとの相互組込み体として使用すると、
DNAを植物細胞に転移させることができること
を証明した。 実施例 ４ 植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中間
クローニングベクターの組み立て 本発明が完成されるまで、TiプラスミドのＴ
−領域内の、多かれ少なかれでたらめな位置に全
遺伝子を挿入しても、その外来性の配列が植物ゲ
ノムへ転移した後発現されるということはなかつ
た。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子
（群）の暗号領域を、植物細胞中で機能すること
が知られている転写開始および終了信号に連結す
ることができる。この方法の有用性は、ノパリン
シンターゼ遺伝子を暗号化しているDNA配列が
関与する、本発明の実験によつて例証される。こ
の遺伝子の全配列および正確な転写開始および終
了は既知である（Dep−ickerらJ.Mol.Appl.
Genet.1（1982）、561−574）。本発明によれば外来
性遺伝子の蛋白質暗号化領域はnosプロモーター
の隣りに挿入することができる。外来性遺伝子配
列の例として、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗
号領域（De Greve、J.Mol.Appl.Genet.1（1982）、
499−512）をnosプロモーターに隣接させて挿入
する。この構造物はアクセプターTiプラスミド
内に授動され、植物を感染させるのに使用され
る。生成した腫瘍組織にオクトピンが存在するか
どうかを分析した所、陽性であることがわかつ
た。 キメラノパリンプロモーターを含有している中
間クローニングベクターの組み立て：オクトピン
シンターゼ構造遺伝子を第１８図〜第２０図に示
す。 簡単に言えば、nos遺伝子を含んでいる制限フ
ラグメントHind−２３をインビトロで処理し
てnos暗号配列の大部分を除去する一方、制限エ
ンドヌクレアーゼサイトBamHに隣接してい
るnosプロモーターは保持する（第１８図）。
10μgのpGV０４２２（完全なnos遺伝子を含む
Hind−２３フラグメントを持つたpBR３２２
誘導体；Depickerら、Plasmid（1980）、193−
211）をSau 3Aで消化し、nosプロモーターを含
んだ350bpのフラグメントをプレパラテイブ５％
ポリアクリルアミドゲルで分離する。このプロモ
ーターフラグメントを、5′−末端燐接エステル基
を除去するために予め細菌性アルカリホスフアタ
ーゼ（BAP）で処理した、Bg1−切断pKC７
（Raoら、Gene7（1979）、79−82）に結合させる。
得られたプラスミド（pLGV１３）20μgをBgl
で消化し、400μの12mM MgCl2、12mM
CaCl2、0.6M NaCl、1mM EDTAおよび20mM
トリス−HCl（pH8.0）中、30℃でBal31エキソヌ
クレアーゼ（Biolabs、New England）７単位
を用いて４〜10分間処理する。この間、約20〜
50bpのDNAが除去される。このBal31−処理分
子をBamHで消化した後、DNAポリメラーゼ
のKlenowフラグメントと４つのデオキシヌクレ
オシドトリホスフエート（それぞれ10mM）と共
にインキユベートして、その末端を満たす。充填
されたBamH末端とBal31除去末端とのライゲ
ーシヨンから得られる再生BamHサイトを持
つたプラスミドを選別する。いくつかの候補の
BamH−Sacフラグメントのサイズを６％尿
素−ポリアクリルアミドゲル中で見積り、サイズ
が200〜280ヌクレオチドの範囲にある候補のヌク
レオチド配列を決定する。プロモーターを持つた
203bpのSac−BamHフラグメントを含んで
いるクローンpLGV８１を、pGV０４２２のnos
遺伝子中のSac−BamHフラグメントと置換
するのに使用する：この最終プロモーターベクタ
ーはpLGV２３８１と呼ばれる。全ての組換えプ
ラスミドはE.coli株HB101の形質転換により選択
する。 この様に処理したnosプロモータを含んでいる
プラスミドベクターをBamHで消化し、
BamHフラグメントに含まれているocsの暗号
配列をこのサイトに挿入する。このocs暗号配列
も、インビトロで処理し、第１９図に示した様
に、BamH制限エンドヌクレアーゼサイトで
囲まれる様にする。オクトピンTiプラスミド
B6S3のBamHフラグメント１７a10μg（De
Vosら、Plasmid6（1981）、249−253）をBamH
およびSmaで消化し、ocs−暗号配列を含む
フラグメントを１％アガロースゲルから分離し、
pBR３２２の大きいBamH−Pvuフラグメン
トに結合させる；得られたプラスミド、pAGV８
２８（20μg）をBamHで消化し、第１８図に
示した様にエキソヌクレアーゼBal31で処理し、
次いでHindで消化し、末端を充填し、自己結
合させる。Bal31除去体のサイズは６％ポリアク
リルアミドゲル中で見積る。いくつかの候補のヌ
クレオチド配列を決定し、5′−非翻訳リーダー配
列の残り7bpだけを持つた候補を選択して以下の
操作に付す（pOCS△）。ocs配列をBamHサイ
トで囲むために、Cla−Rsaフラグメントを
充填し、pLC２３６（Remautら、Gene15
（1981）、81−93）のBalサイトにサブクローン
する。得られたプラスミド pAG４０をBamHで消化し、ocs配列を持つ
たフラグメントをプレパラテイブ１％アガロース
ゲルから電気溶出により分離し、予めBamH
で消化しBAP（細菌性アルカリホスフアターゼ）
で処理したpLGV２３８１に結合させる。ocs配
列のpLGV２３８１への挿入により、両方の配向
のものが得られる（pNO−１およびpNO−２）。 nos：ocs融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。 更に、処理したnosプロモーターを含有してい
るプラスミドベクターは、酵素ジヒドロフオレー
トレダクターゼを暗号化しているプラスミドＲ６
７からのDNAを挿入するのに使用される。ジヒ
ドロフオレートレダクターゼ遺伝子を含んでいる
暗号配列は、BamHに含まれており（O′Hare
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA78（1981）、1527−
1531）、従つて既述した様に、プロモーター領域
に隣接するBamHサイトを含んでいるnosプロ
モーターベクターに容易に挿入される。この遺伝
子は、発現されると抗生物質メトトレキセートに
対する耐性を付与するので、選択可能なマーカー
遺伝子の１つの例である（第２，３，４，５およ
び７図参照）。この中間クローニングベクターが
野生型ノパリンアクセプターTiプラスミドを含
んでいるAgrobacteriumに授動されると、単一
乗換えが起り、ハイブリツドTiプラスミドベク
ターが得られる。このベクター組成物を、植物の
感染に使用する。得られた腫瘍組織は、0.5μg／
mlのメトトレキセートの存在下で継続して生長し
得ることがわかつた。 ocsおよび上記のnosプロモーターの後のジヒ
ドロフオレートレダクターゼ暗号領域を含んでい
る中間クローニングベクターを組み立て、
AgrobacteriumのTiプラスミドと相互組込みし
た後、形質転換植物細胞に転移、発現させること
により、本発明方法によつて外来性遺伝子を植物
細胞に転移し、発現させることができるというこ
とが証明される。 実施例 ５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を含む植物細胞お
よび植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを
使つて、非腫瘍性アクセプターTiプラスミド誘
導体（例えばpGV３８５０）で形質転換された
植物細胞および全植物を得た。 (1) インボビでの全植物の接種、次いで新芽の再
生が可能な培地上、インビトロでの培養、 (2) 損傷部位で直接新芽の生成を促す他の
Agrobacteria株の存在下、インビボにおける
全植物の相互感染、 (3) インビトロでの単一植物細胞プロトプラスド
の共生培養。 これらの方法について以下に詳述する。 最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもた
らす全植物組織の野生型Agrobacterium株によ
る感染体を得る為に通常使用される方法を改良し
たものである。pGV３８５０は腫瘍を形成しな
いAgrobacterium誘導体であるので、感染部位
において腫瘍の増殖はみられない。しかし感染し
た組織を取り除き、組織培養で増殖させると、形
質転換された組織を容易に得ることができる。初
期培養期間（単に組織の量を増やすため）の後、
損傷部位組織を新芽形成が可能な条件下で増殖さ
せる。非形質転換細胞およびpGV３８５０−形
質転換細胞の両者が新芽を発生する。形質転換新
芽は、ノパリンの存在をみる簡単な分析により容
易に区別することができる。 本発明者らは、次のプロトコールに従つて、
Nicotiana tabacum Wisconsin38の頭部を切断
したタバコの苗木から、pGV３８５０−形質転
換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミナ
ーフローフード中、無菌条件下で行なつた）。 (1) 小さなビン（直径10cm、高さ10cm）の中で、
0.8％の寒天を含む固形のMurashige ＆
Skoog（MS）培地（MurashigeおよびSkoog、
Physiol.Plant.15（1962）、473−497）で生育さ
せた６周令のタバコの苗木を使用する。 (2) 外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取つて
捨てる (3) 選択的条件（例えばTiプラスミドpGV３８
５０を含んでいるリフアンピシン耐性、アンピ
シリン耐性Agrobacterium株の場合は、
100μg／mlのリフアンピシンと100μg／mlのカ
ルベニシリンを含んでいるYEB培地を使用す
る；YEB培地＝５ｇ/Bactoビーフエキス、
１ｇ/Bacto酵母エキス、５ｇ/ペプトン、
５ｇ/シユクロース、２×10-3M MgSO4、
pH7.2、15ｇ/寒天）で増殖させた新鮮な平
板培養からのAgrobacteriumを、スパーテル
またはつまようじで損傷表面に接種する。各
pGV３８５０組み立て物を、少なくとも８本
の苗木に接種する。 (4) ２周間インキユベートする。接種部位にほと
んどあるいは全く反応が表われないはずである
が、時々非常に小さいカルス（calli）が観察
される。 (5) 損傷表面から厚さ１mm以下の薄い切片を切り
取る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキ
ニン（１mg／NAA、0.2mg／BAP）およ
び１％シユクロースを添加したLinsmaier ＆
Skoog（LS）寒天培地（Linsmaier and
Skoog、Physiol.Plant.18（1965）、100−127）
を含む平板上で培養する。 (6) 約６週間後、カルスはその一部をとつてノパ
リンの存在を試験するのに十分なだけの大きさ
になる（少なくとも直径が約５mmになる）。全
ての損傷カルスがノパリンを生産する訳ではな
い。４本の植物の内約１本がノパリン陽性損傷
カルスをつくる。 (7) ノパリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平
板に移す：上記のLS培地＋１％シユクロース
および１mg／BAPサイトキニン (8) 約４〜６週間後に良好なサイズの新芽（高さ
１cm）が出る。更に成長させ、根を形成させる
ために、この新芽を、ホルモンを含まないLS
培地＋１％シユクロースを含有している新しい
寒天平板に移す。 (9) ノパリンの存在を試験するのに、その一部
（１〜２枚の小さな葉）を切り取れる様に、こ
の新芽を１〜２週間成長させる。 (10) ノパリン陽性の新芽を、(1)と同じMS培地を
入れたやや大きい容器（上記と同じ10cmのび
ん）に移し、更に成長させる。 (注) 染させた組織のための全ての植物培養培地
には、pGV３８５０含有Agrobacteriumに
対する選択的毒物として、抗生物質セフオタ
キシム（cefotaxime、ClaforanR、ヘキス
ト）500μg／mlが含まれている。この薬物
は、全てのAgrobacterium（カルベニシリン
耐性のものを含む）の生長をよく阻止する。 本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を
出す組織を得る別の方法が開発された。この方法
は、Agrobacteriumのある種のミユータントTi
プラスミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を
生成させるということを観察したことに基いて開
発された。この様な新芽−誘起（shi）に関する
突然変異は、A.tumefaciensのTiプラスミドのＴ
−DNA（転移DNAセグメント）の特定の領域に
位置している（Leemansら、EMBO J.1（1982）、
147−152；Joosら、Cell32（1983）、1057−1067）。
誘起された新芽は完全に正常な非形質転換細胞で
構成されていることが多い。従つて本発明者ら
は、２つの異なつたAgro−bacteria、即ち１つ
はオクトピンTiプラスミド放出（shooter）ミユ
ータントを持つたもの、もう１つはpGV３８５
０を持つたもの、の混合物で植物を接種した。こ
の様にすることは、オクトピン放出ミユーテーシ
ヨンが、pGV３８５０で形質転換された根を誘
起することが出来るよい機会を与える。Tiプラ
スミドpGV３８５０およびオクトンピン新芽誘
起Tiプラスミドを５：１の割合で含んでいる
Agrobacteriumを植物に接種した。こうするこ
とによつてpGV３８５０−形質転換新芽を得た。
この新芽は、ノパリンの存在について分析するこ
とにより、容易に選別することができる。この方
法は、精功な組織培養法を必要としない。ノパリ
ン陽性新芽を、更に成長させるために、長調節ホ
ルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含んだ培地に移
す。新芽が十分な大きさに達した後、容易に繁殖
の為の土壌に移すことができる。この共感染法
は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を形質転
換するのに特に有用である。従つて、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例え
ば豆科植物、薬用植物および装飾植物を
Agrobacteriumで処置することができよう。 第３の方法は、Nicotiana tabacumプロトプ
ラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−
DNA−形質転換細胞クローンの選択を、そのプ
ロトプラスト−由来細胞と腫瘍性
Agrobacterium株との共培養後に実施得るもの
である。他の優勢な選択マーカー、例えば高等植
物細胞で発現される様に組み立てられた抗生物質
耐性遺伝子を使用すれば（実施例３参照）、形質
転換細胞を選択するのに類似の方法を使用するこ
とができる。しかしこの場合は、それぞれのケー
スについて選択の最適条件をみつける必要がある
（選択剤の濃度、形質転換と選択の間の時間、選
択培地中のプロトプラスト−由来細胞または細胞
コロニーの濃度など）。形質転換細胞の選択がで
きない場合、例えばpGV３８５０またはpGV２
２１７（Leemansら、EMBO J.1（1982）、147−
152）の様な非毒性のＴ−DNAミユータントを用
いたために選択が不可能な場合は、遺伝学的形質
転換の後に細胞をオーキシン−およびサイトキニ
ン−含有培地（例えば２mg／のNAA（α−ナ
フタレン酢酸）および0.3mg／のカイネチンを
含むMurashigeおよびSkoog培地（Murashigeお
よびSkoog、Physiol.Plant15（1962）、473−
497））で培養し、形質転換コロニーをそのオパイ
ン（opine）含有量で同定することができる。こ
の様にして、アグロピン（agropine）およびマ
ノピン（mannopine）合成の電気泳動分析（方
法についてはLeemansら、J.Mol.Appl.Genet.1
（1981）、149−164参照）の後、約660コロニーが、
pGV２２１７で感染後に得られ、TR−暗号化オ
パイン・マノピン（N2（１−マニチル）−グルタ
ミン）を合成するNicotiana tabacum SR1セル
ラインであることがわかつた。このセルラインの
カルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節剤と
してBAP（６−ベンジルアミノプリン）（１mg／
）を含むMurashige and Skoog培地）上で培
養すると、数多くの新芽が形成した。分析した20
の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成する
ことができた。ホルモンを含まないMurashige
and Skoog培地に移した後、これらの新芽は、
依然としてマノピンを含有し、形態学的に正常な
タバコ植物に成長した。 N.tabacumについて次に記載するプロトプラ
ストの分離および形質転換法は、N.plumbagini
−foliaにも用いることができる。 ２ 実験手法 2.1 新芽培養条件 培養室内の無菌条件下（１日16時間、1500
ルツクスの白色蛍光（“ACEC LF58W／
24300〓 Economy”）、24℃、相対湿度70
％）、250mlのガラスびんに入れたホルモン不
含のMurashige and Skoog培地
（MurashigeおよびSkoog、Physiol.Plant15
（1962）、473−497）上でNicotiana
tabacumの新芽培養を維持する。５週令の新
芽培養をプロトプラストの分離に使用する。 2.2 プロトプラストの分離 プロトプラストの分離および培養における
全ての工程は無菌操作で行なう。混合酵素法
によりプロトプラストを分離する。長さ２cm
以下の非常に若い葉を除く、全ての葉をプロ
トプラストの分離に使用することができる。
鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３mmの
細長い小片に切断する。この葉材料２〜３ｇ
を、酵素混合物50ml中、暗所で、24℃にて18
時間静置培養する。この酵素混合物は、ホル
モン不含のK3培地中、0.5％セルラーゼ
Onozuka Ｒ−10および0.2％マセロザイム
OnozukaR−10からなつている（Nagyおよ
びMaliga、Z.Pflanzenphysiol.78（1976）、
453−455）。この混合物は、0.22μm細孔膜を
通して過減菌し、顕著な活性の低下をきた
すことなく、−20℃で少くとも６カ月間貯蔵
することができる。 2.3 プロトプラスト培養 18時間培養した後、プロトプラストを放出
するために混合物を穏やかに撹拌する。次い
でこの混合物を50μmのふるいを通して過
し、液を10mlの遠心管に移す。振動バケツ
ローターに入れて60〜80ｇで６分間遠心分離
すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バン
ド（帯）を形成する。プロトプラストの下層
の液およびペレツト状の残骸を、蠕動ポンプ
に連結した毛細管を使つて取り除く。プロト
プラストを１つの遠心管に集め、培養培地で
２回洗浄する。この培養培地は、NAA（0.1
mg／）およびカイネチン（0.2mg／）を
成長調節剤として含有するK3培地である
（NagyおよびMaliga、Z.Pflanzenphysiol.78
（1976）、453−455）。この培地はpH5.6に調
節し、0.22μmの過膜を通して減菌する。
２回目の洗浄の後、Thoma血球計算器
（“Assistant”、西ドイツから入手）を用いて
プロトプラストを計測し、最終密度105プロ
トプラスト／mlとなる様に培養培地に懸濁す
る。直径９cmの組織培養用良質ペトリ皿当た
り10mlの容量でプロトプラストを培養する。
このペトリ皿をParafilmRでシールし、24℃
で、暗所次いでかすかな光（500〜1000ルツ
クス）を当てて24時間培養する。 2.4 共生培養による形質転換 分離５日後にプロトプラスト培養株を感染
させる。Agrobacteriumを液体LB培地
（Miller、Experiments in Molecular
Genetics（1972）、Cold Spring Harbor
Laboratory、New York）中で18時間培養
後、２×109細胞／mlの密度となる様にK3培
養培地に再懸濁する。この懸濁液50μを植
物プロトプラスト培養株に加え、ParafilmR
でシールした後、この培養株を2.3.と同じ条
件下で培養する。48時間後に培養株を10mlの
遠心管に移し、振動バケツローターに入れ、
60〜80ｇで６分間遠心分離する。浮遊バンド
およびペレツトを集め、抗生物質（カルベニ
シリン1000μg／mlまたはセフオタキシム
500μg／ml）を補足したK3培地（Nagyおよ
びMaliga、Z.Pflanzen physiol.78（1976）、
453−455）10mlに再懸濁する。 培養２週間後、プロトプラスト−由来マイ
クロカルスを遠心分離し、前記と同濃度の成
長調節剤および抗生物質を含むがシユクロー
ースに関しては0.4Mの代りに0.3M含むK3培
地（NagyおよびMaliga、Z.
Pflanzenphysiol.78（1976）、453−455）に再
懸濁する。この培地の細胞密度は約25×103
マイクロカルス／mlに調節する。同じ条件下
で更に２週間培養した後、カルスを、前記と
同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度のシ
ユクロース（0.2M）と成長調節剤
（NAA0.01mg／、カイネチン0.02mg／）
を含むK3培地に移す。更に２〜３週間培養
後、形質転換体と推定されるものは、その淡
緑色の密な外観、およびより良好な成長度か
ら認識することができる。これらのコロニー
を、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン
500μg／mlまたはセフオタキシム250μg／ml）
を含むがホルモン不含の0.6％寒天固形培地
（LinsmaierおよびSkoog、Physiol.Plant.18
（1965）、100−127）に移す。形質転換体と推
定されるものが直径約３−４mmに達した時、
ホルモン不含の培地で生育しているそれらに
オパイン試験を施すことができる。各コロニ
ーの半分を、オクトピンおよびノパリン
（Aertsら、Plant Sci.Lett.17（1979）、43−
50）またはアグロピンおよびマノピン
（Leemansら、J.Mol.Appl.Genet.1（1981）、
149−164）の検出に使用する。この試験によ
り、ホルモン不含の培地で選択されたコロニ
ーの形質転換された性質を確認することがで
きる。その後、選択されたコロニーを抗生物
質不含の培地で培養することができる。 2.5 ホルモン不含培地上の選択なしの共生培養 形質転換細胞の為の選択ができない（例え
ば無毒性Ｔ−DNAミユータントを使つたた
め）場合、またはそれが必要でない場合（抗
生物質耐性遺伝子の様な優勢な選択し得るマ
ーカーがＴ−DNAに存在している為）、プロ
トプラスト−由来細胞の処理を簡略化するこ
とができる（ホルモン減少工程はもはや必要
でない）。感染段階まで、プロトプラストを
既述した様に処理する。細菌を加えて48時間
後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分離し
（６分、60−80ｇ）、非常に低密度で細胞の成
長を維持することができるAG培地
（Caboche、Planta149（1980）、７−18）に再
懸濁する。Fuchs−Rosenthal計数チエンバ
ー（“Assistant”西ドイツより入手）を使つ
て計測し、以下の操作に必要な密度になる様
に再懸濁する。オパイン試験のためにコロニ
ーを個々に操作しなければならない場合は、
低細胞密度（１ml当たり100プロトプラスト
−由来細胞および細胞コロニー）で植えつけ
ると、１カ月の培養で大きい細胞コロニーが
得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる
場合は、細胞を高密度（103−104／ml）で培
養し、各タイプの選択に最適な時期及び濃度
で、その使用する選択剤を培地に添加する。 2.6 カルス組織から全植物の再生 カルス組織から正常植物を容易に得ること
ができる（例えばプロトプラスト形質転換か
ら、または全植物接種から（2.7参照）得ら
れる）。カルス組織を、１mg／mlのBAPを含
んでいるMurashige and Skoog培地で増殖
させる：この培地は１〜２カ月後に新芽を形
成させる。この新芽をホルモン不含の培地に
移し、根を形成させ、完全な植物をつくらせ
ることができる。 2.7 タバコ苗木への腫瘍の誘導 タバコの種子（例えば裁培品種
Wisconsin38）の表面を70％変性エタノー
ル／H2Oで２分間、次いで10％の市販の標
白剤と0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
で処理して滅菌し、更に滅菌水で５回洗浄す
る。この滅菌した種子を、Murashige and
Skoog（0.7％寒天）培地の塩類を含む大型試
験管（幅25mm、ポリカーボネート製のキツプ
付）にまく。次いでこの試験管を培養室
（12000ルツクス、16時間照射／８時間非照
射、70％相対湿度、24℃）に入れて培養す
る。４〜６週間経つと植物は使用できる状態
になる。少なくともその後１カ月間は最適の
状態を維持する。苗木は少なくとも高さ３cm
になり、４枚またはそれ以上の葉を持つはず
である。新しい外科用メスで植物の最も若い
節間を通して横に頭部を切断する。植物の上
の部分を試験管から取り除き、火にかけたス
パーテルで平板寒天培養から細菌を損傷表面
に塗抹する。野生型の場合は２週間後に、あ
る種の変性ミユータント株の場合はもつと後
に腫瘍が現れる。この方法は、タバコ
（Nicotiana tabacum）、Nicotiana
plumbagini foliaおよびびPetunia hybrida
を接種するのに使われる。 以上述べた如く、本発明は、野生型Tiプラス
ミドのＴ−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブ
リツドTiプラスミドを保持している
Agrobacteriumで、初めて植物を形質転換する
ことを可能ならしめたものである。Tiプラスミ
ドから植物細胞へのDNAの転移に及ぼすＴ−領
域の腫瘍機能の影響は知られていないので、それ
でも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領域の植
物細胞への転移が起ることは驚くべきことであ
る。この転移DNAは植物細胞ゲノムに相互組込
みされ、安定に保持される。更に、選択した所望
の遺伝子は、その遺伝子が適当なプロモーター配
列を含んでいるか、あるいは含む様に組み立てら
れると発現することができる。所望の遺伝子を含
んでいる中間クローニングベクターと、特別に設
計されたアクセプターTiプラスミドとの間で単
一乗換えを行わせるという本発明の概念（アイデ
イア）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリツ
ドTiプラスミドベクターの組み立てを著しく簡
単なものにするものである。この特別に設計され
たアクセプターTiプラスミドは、所望の遺伝子
（これは中間クローニングベクターの一部と同じ
であるかまたはこれに関連しているクローニング
媒体中に挿入されている）が単一乗換えによつて
相互組込み体を形成することができる様に、通常
のクローニング媒体のDNAセグメントを含んで
いる。このクローニング媒体の２つのセグメント
が、組換えの為に必要な相同領域を提供する。 本発明方法によつて調製された微生物、中間ク
ローニングベクター、アクセプターTiプラスミ
ド、およびハイブリツドプラスミドベクターは、
1983年12月21日、German Collection of
Microorganisms（DSM）（Goettingen）に寄託
され、確認された以下の培養株で例示される： (1) Escherichia coli K12HB101中の中間ベク
タープラスミドpAcgB、 (2) カルベニシリン耐性アクセプターTiプラス
ミドpGV３８５０を保有している
Agrobacterium tumefaciens C58C1リフアン
ピシン耐性株 (3) Escherichia coli K12株K514（thr len thi
lac hsdR）中の中間ベクタープラスミドpGV
７００ (4) Escherichia coli K12株514（(3)と同じ）中の
中間ベクタープロトプラストpGV７５０、 (5) カルベニシリン耐性アクセプターTiプラス
ミドpGV２２６０を保有している
Agrobacterium tumefaciens C58C1リフアン
ピシン耐性株、 (6) Escherichia coli K12 HB101中の、ノパリ
ンプロモーター支配下のオクトピンシンターゼ
暗号領域を保有している中間ベクタープラスミ
ドpNO−１、 (7) 中間ベクターのAgrobacteriumへの授動に
使用された株＝授動プラスミドpGJ２８および
Ｒ６４drd１１（Van Hauteら、EMBO J.2
（1983）、411−418）を保有しているGJ23；
GJ23はEscherichia coli K12、JC2926、
AB1157のrecA誘導体である（Howard−
Flandersら、Genetics49（1964）、237−246）。 これらの培養株の受理番号は、それぞれ2792
(1)、2798(2)、2796(3)、2797(4)、2799(5)、2833(6)、
および2793(7)である。 本発明の態様を色々と記述したが、その基本的
な構成を変化させれば本発明に係る方法および組
成物を利用するその他の態様が得られることは言
うまでもない。
第１図はアクセプターTiプラスミドの模式図、
第２図および第３図はアクセプターTiプラスミ
ドに挿入される中間クローニングベクターの模式
図、第４図はハイブリツドTiプラスミドベクタ
ーの調製法を示す模式図、第５図は中間クローニ
ングベクターの遺伝子転移過程の概略を示す模式
図、第６図はＡタイプのアクセプターTiプラス
ミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間クロ
ーニングベクターの組み立てを示す模式図、第８
図はＢタイプのアクセプターTiプラスミドの組
み立てを示す模式図、第９図はＢタイプのアクセ
プターTiプラスミドに挿入される中間クローニ
ングベクターの模式図、第１０図はハイブリツド
Tiプラスミドベクターの組み立てを示す模式図、
第１１図は5.2kbHindフラグメントAcgBの
pBR３２２への挿入を示す模式図、第１２図は
ノパリンTiプラスミドpGV３８３９のＴ−領域
を示す模式図、第１３図はアクセプターTiプラ
スミドpGV３８５０の組み立てを示す模式図、
第１４図は中間クローニングベクターpGV７０
０の組み立てを示す模式図、第１５図は中間クロ
ーニングベクターpGV７５０の構造を示す模式
図、第１６図は中間ベクターpGV７４５の組み
立てを示す模式図、第１７図はアクセプタープラ
スミドpGV２２６０の組み立てを示す模式図、
第１８図はプラスミドpLGV２３８１の組み立て
を示す模式図、第１９図はプラスミドpAGV１０
の組み立て、およびその、プラスミドpLGV２３
８１へ挿入を示す模式図、第２０図はオクトピン
シンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後のノ
パリンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の周
囲のヌクレオチド配列を示す模式図である。
第２図および第３図はアクセプターTiプラスミ
ドに挿入される中間クローニングベクターの模式
図、第４図はハイブリツドTiプラスミドベクタ
ーの調製法を示す模式図、第５図は中間クローニ
ングベクターの遺伝子転移過程の概略を示す模式
図、第６図はＡタイプのアクセプターTiプラス
ミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間クロ
ーニングベクターの組み立てを示す模式図、第８
図はＢタイプのアクセプターTiプラスミドの組
み立てを示す模式図、第９図はＢタイプのアクセ
プターTiプラスミドに挿入される中間クローニ
ングベクターの模式図、第１０図はハイブリツド
Tiプラスミドベクターの組み立てを示す模式図、
第１１図は5.2kbHindフラグメントAcgBの
pBR３２２への挿入を示す模式図、第１２図は
ノパリンTiプラスミドpGV３８３９のＴ−領域
を示す模式図、第１３図はアクセプターTiプラ
スミドpGV３８５０の組み立てを示す模式図、
第１４図は中間クローニングベクターpGV７０
０の組み立てを示す模式図、第１５図は中間クロ
ーニングベクターpGV７５０の構造を示す模式
図、第１６図は中間ベクターpGV７４５の組み
立てを示す模式図、第１７図はアクセプタープラ
スミドpGV２２６０の組み立てを示す模式図、
第１８図はプラスミドpLGV２３８１の組み立て
を示す模式図、第１９図はプラスミドpAGV１０
の組み立て、およびその、プラスミドpLGV２３
８１へ挿入を示す模式図、第２０図はオクトピン
シンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後のノ
パリンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の周
囲のヌクレオチド配列を示す模式図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つ
の境界配列１および２、 (b) 単一乗換えが可能な中間クローニングベクタ
ー中のDNA配列の少なくとも一部と相同な
DNA配列を含み、２つの境界配列の間に設置
された、クローニング媒体由来のDNA配列３、
および (c) Agrobacteriumによる、野生型Tiプラスミ
ドのＴ−領域の植物細胞ゲノム中への転移に必
須であるDNA配列を含んでいる野生型Tiプラ
スミドのDNAセグメント４、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの内部Ｔ−DNA配列を実
質的に含まないアクセプターTiプラスミド［こ
こで、中間クローニングベクターとは、 (イ) 植物において遺伝子を発現させることができ
るプロモーターの支配下にある少なくとも１つ
の所望の遺伝子５、および (ロ) 該アクセプターTiプラスミド中のDNA配列
と相同なDNA配列を含んでいるクローニング
媒体セグメント３′、 を含んでいるクローニングベクターをいう］。 ２ 中間クローニングベクターと共に
Agrobacterium内に挿入された特許請求の範囲
第１項記載のアクセプターTiプラスミド。 ３ (a) Ｔ−領域およびＴ−領域の２つの境界配
列を持たない野生型TiプラスミドのDNAセグ
メント４、および (b) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列を含んでいる中間クローニングベクター
のDNA配列の少なくとも１部と相同なクロー
ニング媒体由来のDNA配列３、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの境界配列および内部Ｔ
−DNA配列を含まないアクセプターTiプラスミ
ド［ここで、中間クローニングベクターとは、 (イ) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (ロ) 該アクセプターTiプラスミド中のDNA配列
と相同なDNA配列を含んでいるクローニング
媒体セグメント３′、および (ハ) 植物ゲノム中に組込まれる様に２つの境界配
列の間に設置された、植物において遺伝子を発
現させることができるプロモーターの支配下に
ある少なくとも１つの所望の遺伝子５、 を含んでいるクローニングベクターをいう］。 ４ pGV2260（DSM2799）である特許請求の範
囲第３項記載のアクセプターTiプラスミド。 ５ 中間クローニングベクターと共に
Agrobacterium内に挿入された特許請求の範囲
第３項または第４項記載のアクセプターTiプラ
スミド。 ６ ヘルパープラスミドの存在下で、 (a) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (b) 単一乗換えが可能な下記の中間クローニング
ベクター中のDNA配列の少なくとも１部と相
同なDNA配列を含み、２つの境界配列の間に
設置された、クローニング媒体由来のDNA配
列３、および (c) Agrobacteriumによる、野生型Tiプラスミ
ドのＴ−領域の植物細胞ゲノム中への転移に必
須であるDNA配列を含んでいる野生型Tiプラ
スミドのDNAセグメント４、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの内部Ｔ−DNA配列を実
質的に含まないアクセプターTiプラスミドを含
んでいるAgrobacteriumに、 (イ) 植物において遺伝子を発現させることができ
るプロモーターの支配下にある少なくとも１つ
の所望の遺伝子５、および (ロ) 上記アクセプターTiプラスミド中のDNA配
列と相同なDNA配列を含んでいるクローニン
グ媒体セグメント３′、 を含んでいる中間クローニングベクターを授動せ
しめ、そのアクセプターTiプラスミドと中間ク
ローニングベクターを単一乗換えにより相互組込
みさせることからなるハイブリツドTiプラスミ
ドの調製法。 ７ ヘルパープラスミドの存在下で、 (a) Ｔ−領域およびＴ−領域の２つの境界配列を
持たない野生型TiプラスミドのDNAセグメン
ト４、および (b) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列を含んでいる下記の中間クローニングベ
クターのDNA配列の少なくとも１部と相同な
クローニング媒体由来のDNA配列３、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの境界配列および内部Ｔ
−DNA配列を含まないアクセプターTiプラスミ
ドを含んでいるAgrobacteriumに、 (イ) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (ロ) 上記アクセプターTiプラスミド中のDNA配
列と相同なDNA配列を含んでいるクローニン
グ媒体セグメント３′、および (ハ) 植物ゲノム中に組込まれる様に２つの境界配
列の間に設置された、植物において遺伝子を発
現させることができるプロモーターの支配下に
ある少なくとも１つの所望の遺伝子５、 を含んでいる中間クローニングベクターを授動せ
しめ、そのアクセプターTiプラスミドと中間ク
ローニングベクターを単一乗換えにより相互組込
みさせることからなるハイリツドTiプラスミド
の調製法。 ８ (a) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つ
の境界配列１および２、 (b) 単一乗換えが可能な下記の中間クローニング
ベクターＡ中のDNA配列の少なくとも１部と
相同なDNA配列を含み、２つの境界配列の間
に設置された、クローニング媒体由来のDNA
配列３、および (c) Agrobacteriumによる、野生型Tiプラスミ
ドのＴ−領域の植物細胞ゲノム中への転移に必
須であるDNA配列を含んでいる野生型Tiプラ
スミドのDNAセグメント４、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの内部Ｔ−DNA配列を実
質的に含まないアクセプターTiプラスミドＡと、 (イ) 植物において遺伝子を発現させることができ
るプロモーターの支配下にある少なくとも１つ
の所望の遺伝子５、および (ロ) 上記アクセプターTiプラスミドＡ中のDNA
配列と相同なDNA配列を含んでいるクローニ
ング媒体セグメント３′、 を含んでいる中間クローニングベクターＡとの、
または (a) Ｔ−領域およびＴ−領域の２つの境界配列を
持たない野生型TiプラスミドのDNAセグメン
ト４、および (b) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列を含んでいる下記の中間クローニングベ
クターＢのDNA配列の少なくとも１部と相同
なクローニング媒体由来のDNA配列３、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの境界配列および内部Ｔ
−DNA配列を含まないアクセプターTiプラスミ
ドＢと、 (イ) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (ロ) 上記アクセプターTiプラスミドＢ中のDNA
配列と相同なDNA配列を含んでいるクローニ
ング媒体セグメント３′、および (ハ) 植物ゲノム中に組込まれる様に２つの境界配
列の間に設置された、植物において遺伝子を発
現させることができるプロモーターの支配下に
ある少なくとも１つの所望の遺伝子５、 を含んでいる中間クローニングベクターＢとのハ
イブリツドTiプラスミドベクターであつて、少
なくとも、 (i) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (ii) クローニング媒体由来の非腫瘍性DNA配列
３および３′、 (iii) Agrobacteriumにより、野生型Tiプラスミ
ドのＴ−領域を植物細胞ゲノム中に転移させる
のに必須であるDNA配列を含んでいる野生型
TiプラスミドのDNAセグメント４、および (iv) ２つの境界配列１および２の間に設置され
た、植物において遺伝子を発現させることがで
きるプロモーターの支配下にある少なくとも１
つの所望の遺伝子５、 を含んでいるハイブリツドTiプラスミドベクタ
ー。 ９ 所望の遺伝子５に隣接して、少なくとも１つ
の選択可能なマーカー遺伝子を更に含有している
特許請求の範囲第８項に記載のハイブリツドTi
プラスミドベクター。 １０ 所望の遺伝子５がその天然のプロモーター
の支配下にあることを特徴とする特許請求の範囲
第８項に記載のハイブリツドTiプラスミドベク
ター。 １１ 所望の遺伝子５が該遺伝子に対して外来性
のプロモーターの支配下にあることを特徴とする
特許請求の範囲第８項に記載のハイブリツドTi
プラスミドベクター。 １２ (a) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２
つの境界配列１および２、 (b) 単一乗換えが可能な下記の中間クローニング
ベクターＡ中のDNA配列の少なくとも１部と
相同なDNA配列を含み、２つの境界配列の間
に設置された、クローニング媒体由来のDNA
配列３、および (c) Agrobacteriumによる、野生型Tiプラスミ
ドのＴ−領域の植物細胞ゲノム中への転移に必
須であるDNA配列を含んでいる野生型Tiプラ
スミドのDNAセグメント４、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの内部Ｔ−DNA配列を実
質的に含まないアクセプターTiプラスミドＡと、 (イ) 植物において遺伝子を発現させることができ
るプロモーターの支配下にある少なくとも１つ
の所望の遺伝子５、および (ロ) 上記アクセプターTiプラスミドＡ中のDNA
配列と相同なDNA配列を含んでいるクローニ
ング媒体セグメント３′、 を含んでいる中間クローニングベクターＡとの、
または (a) Ｔ−領域およびＴ−領域の２つの境界配列を
持たない野生型TiプラスミドのDNAセグメン
ト４、および (b) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列を含んでいる下記の中間クローニングベ
クターＢのDNA配列の少なくとも１部と相同
なクローニング媒体由来のDNA配列３、 を含んでいる、植物において腫瘍を誘起せず、か
つ野生型Tiプラスミドの境界配列および内部Ｔ
−DNA配列を含まないアクセプターTiプラスミ
ドＢと、 (イ) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (ロ) 上記アクセプターTiプラスミドＢ中のDNA
配列と相同なDNA配列を含んでいるクローニ
ンク媒体セグメント３′、および (ハ) 植物ゲノム中に組込まれる様に２つの境界配
列の間に設置された、植物において遺伝子を発
現させることができるプロモーターの支配下に
ある少なくとも１つの所望の遺伝子５、 を含んでいる中間クローニングベクターＢとのハ
イブリツドTiプラスミドベクターであつて、少
なくとも、 (i) 野生型TiプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列１および２、 (ii) クローニング媒体由来の非腫瘍性DNA配列
３および３′、 (iii) Agrobacteriumにより、野生型Tiプラスミ
ドのＴ−領域を植物細胞ゲノム中に転移させる
のに必須であるDNA配列を含んでいる野生型
TiプラスミドのDNAセグメント４、および (iv) ２つの境界配列１および２の間に設置され
た、植物において遺伝子を発現させることがで
きるプロモーターの支配下にある少なくとも１
つの所望の遺伝子５、 を含んでいるハイブリツドTiプラスミドベクタ
ーを保持しているAgrobacterium。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP83100255 | 1983-01-13 | ||
| EP83100255.5 | 1983-01-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140885A JPS59140885A (ja) | 1984-08-13 |
| JPH0258917B2 true JPH0258917B2 (ja) | 1990-12-11 |
Family
ID=8190232
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59005512A Granted JPS59140885A (ja) | 1983-01-13 | 1984-01-13 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP63103749A Expired - Fee Related JP2726267B2 (ja) | 1983-01-13 | 1988-04-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2236922A Pending JPH03108478A (ja) | 1983-01-13 | 1990-09-05 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP4261509A Pending JPH06105629A (ja) | 1983-01-13 | 1992-09-30 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Family Applications After (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP63103749A Expired - Fee Related JP2726267B2 (ja) | 1983-01-13 | 1988-04-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2236922A Pending JPH03108478A (ja) | 1983-01-13 | 1990-09-05 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP4261509A Pending JPH06105629A (ja) | 1983-01-13 | 1992-09-30 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (6) | JPS59140885A (ja) |
| AT (2) | ATE255162T1 (ja) |
| AU (1) | AU546542B2 (ja) |
| CA (2) | CA1341419C (ja) |
| DE (3) | DE3382839D1 (ja) |
| DK (1) | DK173104B1 (ja) |
| IL (1) | IL70610A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2154155A2 (en) | 2001-03-15 | 2010-02-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor |
| EP2453018A1 (en) | 2001-10-19 | 2012-05-16 | Sumitomo Chemical Company, Limited | A herbicide metabolizing protein, a gene thereof and use thereof |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE255162T1 (de) * | 1983-01-13 | 2003-12-15 | Max Planck Gesellschaft | Transgene dicotyledone pflanzenzellen und pflanzen |
| EP0131624B1 (en) * | 1983-01-17 | 1992-09-16 | Monsanto Company | Plasmids for transforming plant cells |
| EP0131623B2 (en) * | 1983-01-17 | 1999-07-28 | Monsanto Company | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
| SU1582990A3 (ru) * | 1983-01-17 | 1990-07-30 | Монсанто Компани (Фирма) | Способ получени трасформированных клеток двудольных растений |
| NL8300699A (nl) * | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
| NZ207766A (en) * | 1983-04-15 | 1987-03-06 | Lubrizol Genetics Inc | Plant structural gene expression |
| NZ209338A (en) * | 1983-09-14 | 1988-02-12 | Lubrizol Genetics Inc | Plasmid for the transformation of a plant cell |
| US4658082A (en) * | 1984-07-25 | 1987-04-14 | Atlantic Richfield Company | Method for producing intact plants containing foreign DNA |
| BR8600161A (pt) * | 1985-01-18 | 1986-09-23 | Plant Genetic Systems Nv | Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio |
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| EP0267159A3 (de) * | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
| ATE537257T1 (de) | 1998-06-02 | 2011-12-15 | Univ Nihon | Mit iga-nephropathie assoziierte dns |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| CA2953239A1 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-18 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibody composition-producing cell |
| JP4627601B2 (ja) * | 2001-02-28 | 2011-02-09 | 株式会社パイロットコーポレーション | 筆記具用ペン芯およびそれを用いた筆記具 |
| WO2004058960A1 (ja) | 2002-12-26 | 2004-07-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
| EP1930344A4 (en) | 2005-09-29 | 2008-12-31 | Shionogi & Co | POLYPEPTIDE HAVING ANTI-ANGIOGENIC ACTIVITY |
| EP2011870A4 (en) | 2006-04-14 | 2010-09-15 | Medical & Biol Lab Co Ltd | MUTANT POLYPEPTIDE WITH EFFECTOR FUNCTION |
| WO2008038613A1 (fr) | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Procédé de production de dipeptide |
| AU2008208288B2 (en) | 2007-01-24 | 2014-04-03 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Genetically recombinant antibody composition having enhanced effector activity |
| US20110236374A1 (en) | 2007-01-24 | 2011-09-29 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2 |
| EP2123751A4 (en) | 2007-01-25 | 2010-06-02 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | NEW PEPTIDE |
| JP5550041B2 (ja) | 2007-09-27 | 2014-07-16 | 塩野義製薬株式会社 | チトクロームｐ４５０を用いたアダマンタン水酸化体の製造方法 |
| JP5620106B2 (ja) | 2007-10-24 | 2014-11-05 | 株式会社糖鎖工学研究所 | 増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド |
| EP2311864A4 (en) | 2008-08-13 | 2013-07-31 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | RECOMBINANT PROTEIN-S COMPOSITION |
| US8304249B2 (en) | 2008-10-09 | 2012-11-06 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Fructosyl peptide oxidase |
| ES2602971T3 (es) | 2010-03-02 | 2017-02-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Composición de anticuerpo modificado |
| WO2011118739A1 (ja) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | 協和発酵キリン株式会社 | 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント |
| JP5058332B2 (ja) | 2010-07-14 | 2012-10-24 | 住友ゴム工業株式会社 | イソプレンオリゴマー、ポリイソプレン、及びこれらの製造方法、ゴム組成物、並びに空気入りタイヤ |
| WO2015005258A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとその利用 |
| JP6448194B2 (ja) | 2014-01-20 | 2019-01-09 | 住友ゴム工業株式会社 | シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、ＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法 |
| JP6719174B2 (ja) | 2015-02-23 | 2020-07-08 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| JP6557989B2 (ja) | 2015-02-23 | 2019-08-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| JP6557990B2 (ja) | 2015-02-23 | 2019-08-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| MX2019008221A (es) | 2017-01-10 | 2019-12-09 | Univ Yamaguchi | Anticuerpo anti-gpc3. |
| JP2020195326A (ja) | 2019-06-03 | 2020-12-10 | 住友ゴム工業株式会社 | 天然ゴムの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP6923166B2 (ja) | 2019-07-16 | 2021-08-18 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2021080204A (ja) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| WO2021177074A1 (ja) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP7829849B2 (ja) | 2021-09-10 | 2026-03-16 | 住友ゴム工業株式会社 | トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP7799272B2 (ja) | 2022-03-02 | 2026-01-15 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP7799273B2 (ja) | 2022-03-02 | 2026-01-15 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP7799274B2 (ja) | 2022-03-02 | 2026-01-15 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0001929B1 (en) * | 1977-11-08 | 1989-04-19 | Genentech, Inc. | Plasmid for transforming bacterial host to render it capable of polypeptide expression |
| JPS595512A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | 松下電工株式会社 | 接点材料 |
| ATE255162T1 (de) * | 1983-01-13 | 2003-12-15 | Max Planck Gesellschaft | Transgene dicotyledone pflanzenzellen und pflanzen |
| JPS62129585A (ja) * | 1985-11-29 | 1987-06-11 | Kyocera Corp | ポンプ運転装置 |
-
1983
- 1983-12-22 AT AT88105808T patent/ATE255162T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 DE DE3382839T patent/DE3382839D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-22 AT AT89102441T patent/ATE282692T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 DE DE8383112985T patent/DE3381568D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-22 DE DE3382838T patent/DE3382838T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-01-03 IL IL70610A patent/IL70610A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-01-11 CA CA000617136A patent/CA1341419C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-11 CA CA004451015A patent/CA1341524C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-12 DK DK198400136A patent/DK173104B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-01-13 JP JP59005512A patent/JPS59140885A/ja active Granted
- 1984-01-13 AU AU23274/84A patent/AU546542B2/en not_active Expired
-
1987
- 1987-05-25 JP JP62129585A patent/JP2769539B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-04-25 JP JP63103749A patent/JP2726267B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-09-05 JP JP2236922A patent/JPH03108478A/ja active Pending
-
1992
- 1992-09-30 JP JP4261509A patent/JPH06105629A/ja active Pending
-
2000
- 2000-06-21 JP JP2000186437A patent/JP2001029092A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2154155A2 (en) | 2001-03-15 | 2010-02-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor |
| EP2154156A2 (en) | 2001-03-15 | 2010-02-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor |
| EP2453018A1 (en) | 2001-10-19 | 2012-05-16 | Sumitomo Chemical Company, Limited | A herbicide metabolizing protein, a gene thereof and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL70610A (en) | 1992-08-18 |
| JPS6339587A (ja) | 1988-02-20 |
| DE3382839D1 (de) | 2004-12-23 |
| JPS63283587A (ja) | 1988-11-21 |
| JPS59140885A (ja) | 1984-08-13 |
| JP2769539B2 (ja) | 1998-06-25 |
| DK13684A (da) | 1984-07-14 |
| DE3381568D1 (de) | 1990-06-21 |
| JPH06105629A (ja) | 1994-04-19 |
| DK13684D0 (da) | 1984-01-12 |
| JP2726267B2 (ja) | 1998-03-11 |
| CA1341524C (en) | 2007-04-03 |
| JP2001029092A (ja) | 2001-02-06 |
| AU546542B2 (en) | 1985-09-05 |
| JPH03108478A (ja) | 1991-05-08 |
| ATE282692T1 (de) | 2004-12-15 |
| ATE255162T1 (de) | 2003-12-15 |
| DE3382838D1 (de) | 2004-01-08 |
| DE3382838T2 (de) | 2004-04-15 |
| CA1341419C (en) | 2003-02-11 |
| DK173104B1 (da) | 2000-01-17 |
| AU2327484A (en) | 1984-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0258917B2 (ja) | ||
| EP0320500B1 (en) | Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes | |
| US5668298A (en) | Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants | |
| US5463174A (en) | Transformation and foreign gene expression in Brassica species | |
| US5750871A (en) | Transformation and foreign gene expression in Brassica species | |
| JP3102888B2 (ja) | 植物の形質転換方法及びそのためのベクター | |
| JP3038479B2 (ja) | 植物のプロトプラストの形質転換法 | |
| US6376234B1 (en) | Method of inserting viral DNA into plant material | |
| EP0270615B1 (en) | TRANSFORMATION AND FOREIGN GENE EXPRESSION IN $i(BRASSICA) SPECIES | |
| JPWO1995016031A1 (ja) | 植物の形質転換方法及びそのためのベクター | |
| US6365799B1 (en) | Hygromycin-resistant transgenic plants | |
| TW319679B (ja) | ||
| EP1781082A2 (en) | Biological gene transfer system for eukaryotic cells | |
| JPH01160489A (ja) | 植物ゲノム内への遺伝子の指示された組込みを可能にする組換えｄｎａ分子 | |
| JPH04502860A (ja) | 植物ゲノムに対するｄｎａの特定部位組込み法 | |
| PT78415B (en) | Method for genetically modifying a plant cell | |
| DK174310B1 (da) | Intermediær kloningsvektor, bakterie indeholdende denne, fremgangsmåde til transformering af en plantecelle, fremgangsmåde til fremstilling af en plante, transformeret plantecelle og plante af sådanne celler og frø af en sådan plante | |
| Huang | Genetic engineering of Larix decidua: Agrobacterium-mediated gene transfer and regeneration of transgenic plants in European larch | |
| Bond | Transformation as a tool to study the genetics of nodulation in Glycine max | |
| Li et al. | Gene transfer strategy for kiwifruit to obtain pure transgenic plant through inducing adventitious roots in leaf explants with Agrobacterium tumefaciens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |